AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS … · centro de ciÊncias biolÓgicas e da saÚde mestrado em odontologia klÍssia romero felizardo avaliaÇÃo do padrÃo de

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

MESTRADO EM ODONTOLOGIA

KLÍSSIA ROMERO FELIZARDO

AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS SALIVARES LACTOFERRINA E LISOZIMA,

FLUXO SALIVAR, BIOFILME DENTÁRIO E ESTREPTOCOCOS DO GRUPO MUTANS EM CRIANÇAS

COM E SEM CÁRIE DENTÁRIA

Londrina

2009


AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS SALIVARES LACTOFERRINA E LISOZIMA,

FLUXO SALIVAR, BIOFILME DENTÁRIO E ESTREPTOCOCOS DO GRUPO MUTANS EM CRIANÇAS

COM E SEM CÁRIE DENTÁRIA

Dissertação apresentada à Universidade Norte do Paraná como parte integrante dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Odontologia.

Orientadora: Profa. Dr

a. Flaviana Bombarda de

Andrade Ferreira

Londrina 2009

AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Dados Internacionais de catalogação-na-publicação Universidade Norte do Paraná

Biblioteca Central

Setor de Tratamento da Informação

Felizardo, Klissia Romero.

f361a Avaliação do padrão de expressão das proteínas salivares lactoferrina e

lisozima, fluxo salivar, biofilme dentário e presença de estreptococos do

grupo mutans em crianças com e sem cárie dentária/ Klissia Romero

Felizardo. Londrina : [s.n], 2009.

xvi; 109p.

Dissertação (Mestrado). Odontologia. Dentística Preventiva e Restauradora.

Universidade Norte do Paraná.

Orientadora: Profª Drª. Flaviana Bombarda de Andrade Ferreira

1- Odontologia - dissertação de mestrado – UNOPAR 2- Lisozima 3-

Lactoferrina 4- Cárie dentária 5- Saliva 6- Eletroforese em gel de

poliacrilamida I- Ferreira, Flaviana Bombarda de Andrade, orient. II-

Universidade Norte do Paraná.

CDU 616.314-089.27/.28


AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS

PROTEÍNAS SALIVARES LACTOFERRINA E LISOZIMA, FLUXO SALIVAR, BIOFILME DENTÁRIO E

ESTREPTOCOCOS DO GRUPO MUTANS EM CRIANÇAS COM E SEM CÁRIE DENTÁRIA

Dissertação apresentada à Universidade Norte do Paraná como parte integrante dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Odontologia.

COMISSÃO EXAMINADORA

________________________________

Profa. Dra. Flaviana Bombarda de Andrade Ferreira (orientadora)

Universidade Norte do Paraná

_________________________________ Profa. Dra. Cristiane Yumi Koga Ito

Universidade Estadual Paulista

________________________________ Profa. Dra.Leila Maria Cesário Pereira Pinto

Universidade Norte do Paraná

Londrina, 17 de dezembro de 2009.


Filiação Claiton Ferreira Felizardo Sueli Maria Romero Felizardo

Naturalidade Londrina/PR

Nascimento 16 de janeiro de 1978

1996-2000 Graduação em Odontologia pela UNIPAR (Universidade Paranaense) Umuarama/PR

2000-2001 Contratada pela Autarquia Municipal de Saúde de Alvorada do Sul/PR – (PSF)

2001-2002 Curso de Aperfeiçoamento em

Odontologia Estética e Adesiva pela UEL (Universidade Estadual de Londrina/PR)

2002-2004 Curso de Aperfeiçoamento em Odontopediatria

pela (UNESP) Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (Araraquara /SP)

2002-2002 Curso de Especialização em Saúde Pública pela

Universidade Estadual Paulista (UNESP) Araraquara/SP

2004-2005 Curso de Aperfeiçoamento em Diagnóstico Bucal

pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) Araraquara/SP

2005- Indeterminado Contratada pelo Instituto Londrinense de Educação de Surdos (ILES)

2006-2008 Curso de Aperfeiçoamento em Ortodontia e

Ortopedia Facial (NBO- Núcleo Brasileiro de Odontologia) Maringá/PR

2008-2010 Curso de Pós Graduação na área de Dentística,

nível Mestrado, na Universidade Norte do Paraná (UNOPAR/PR)

Dedico...

A DEUS em primeiro lugar, que me permitiu viver este momento. Muito obrigada

por estar sempre ao meu lado tornando-me forte e persistente, em todos os

momentos de minha vida.

Aos meus pais Claiton Ferreria Felizardo e Sueli Maria Romero Felizardo,

pelo apoio incondicional. Por serem meus maiores admiradores, por todo o amor

que sempre me deram e por terem sido meu alicerce. Estou certa de que “não

há nada que cative mais o ser humano do que o bom exemplo” e eu me torno

hoje o que sou, devido ao grande exemplo, apoio e amor de vocês. Vocês

iluminam minha vida, com a certeza de estarem sempre dentro do meu coração

e da minha alma. Amo muito vocês!

Ao meu avô Horácio Antônio Felizardo (In memorian) e à minha tia Venus

Mara Ferreira Felizardo pelo incentivo não só nessa caminhada, mas em toda

a vida. A quem devo gratidão e admiração, pela vossa nobreza, humildade e

generosidade acima de tudo. Hoje não estou, mas estamos concluindo mais

uma jornada. Muito obrigada. Sem vocês não teria alcançado esta vitória.

Aos meus irmãos, Kleber Romero Felizardo, Katia Romero Felizardo,

Claiton Ferreira Felizardo Júnior, Karin Romero Felizardo e Christopher

Romero Felizardo, pelas demonstrações de carinho e felicidade ao

compartilharem comigo minhas conquistas, pelo apoio, pelas palavras sábias

em momentos difíceis e por perceberem a necessidade de mesmo à distância,

sermos um. Vocês completam-me!

Aos meus amados sobrinhos Rodolfo Copel Felizardo e Beatriz Copel

Marzolla, que tornaram meus dias mais felizes com o simples sorriso de

criança. Vocês moram em meu coração!

Aos meus tios, tias, primos, primas, cunhados e cunhadas, por me

incentivarem e fazerem parte da minha vida.

À minha avó Olinda Romero Ochiucci, que mesmo distante está sempre

presente em meus pensamentos. Obrigada, amo você!

AGRADECIMENTOS

Á Universidade Norte do Paraná, UNOPAR, representada pelo chanceler,

Prof. Marco Antônio Laffranchi e pela Reitora, Profa. Elisabeth Bueno

Laffranchi;

À Pró-Reitoria de Pesquisa, e Pós Graduação representada pelo Prof. Dr.

Hélio Hiroshi Suguimoto;

Ao Centro de Ciências Biológica da Saúde representada pelo Prof. Ruy

Moreira da Costa Filho;

À Coordenadoria do Curso de Odontologia, representada pelo Prof. Dr. Luiz

Reynaldo de Figueiredo Walter e Prof. Dr. Fernão Hélio Campos Leite

Junior;

A todos os funcionários da Secretaria, Clínica e Laboratório da Odontologia

da UNOPAR;

À FUNADESP pelo imprescindível apoio financeiro.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

À minha orientadora Profa. Dra. Flaviana Bombarda de Andrade Ferreira

pela orientação e confiança.

À Profa. Dra. Leila Maria Cesário Pereira Pinto, Profa. Dra. Cristiane Yumi

Koga Ito e Profa. Dra. Regina Célia Poli-Frederico por aceitarem participar da

banca examinadora para avaliação deste trabalho, e em especial à Profa. Dra.

Leila Maria Cesário Pereira Pinto pelo auxílio durante o treinamento Kappa,

que com muita experiência foi verdadeira agregadora de conhecimento.

Ao Prof. Dr. Luiz Reynaldo de Figueiredo Walter, coordenador do curso de

Pós-Graduação, pelo apoio.

Ao Prof. Dr. Rafael Gonçalves Braga e Profa. Dra. Waleska Dias Schwarcz

por permitir que parte deste trabalho fosse desenvolvida no Laboratório de

Ciências e Tecnologia do Leite.

Aos laboratórios que foram palco para a realização desse estudo, mas mais do

que aos espaços às pessoas que por eles zelam. Especial agradecimento ao

técnico do Laboratório de Ciências e Tecnologia do Leite, Jorge Moraes

Donato, pela cooperação e apoio durante o período de convivência.

Aos estimados colegas da Pós-Graduação (Turma 2008-2010), pela

amizade, convívio e por tudo que aprendemos juntos. Os levarei no coração na

certeza do reencontro. Obrigada pelo apoio, pela troca de experiências,

materiais didáticos e oportunidades.

“De tudo ficaram três coisas: A certeza de que estamos começando/ A certeza

de que precisamos continuar e a certeza de que podemos ser interrompidos

antes de terminarmos /É necessário fazermos da interrupção um caminho novo/

Da queda um passo de dança/ Do medo, uma escada/ Do sonho, uma ponte/

Da procura, um encontro”. (Fernando Pessoa)

Aos professores da Pós-Graduação (Mestrado em Odontologia), pelo

aprendizado e exemplo como profissionais. Obrigada pelas tantas

oportunidades e incentivos, por tudo o que me permitiram aprender.

“Ser professor não é apenas ensinar técnicas metodológicas. É viver e ensinar a

viver com coerência e com ética. É ensinar que a beleza e o sucesso da vida

estão na valorização dos que nos rodeiam e na nossa própria valorização. É

ensinar que assim como podemos perdoar, poderemos ser perdoados”. (Alma

Catirse)

À Profa. Dra. Sandra Kiss Moura, ao Prof. Dr. Murilo Baena Lopes, e ao Prof.

Dr. Alcides Gonini Júnior, pelas trocas de idéias, carinho e amizade, que

preencheram vários momentos durante essa jornada. Obrigada pela experiência

compartilhada, caminhos ensinados e momentos de descontração. Grandes

pessoas que jamais serão esquecidas. Meus sinceros agradecimentos!

Às Profas. Dras. Terezinha de Jesus Esteves Barata, Sandra Mara Maciel e

Ana Raquel Benetti, pela disposição e generosidade, em todos os momentos.

Aos alunos de Graduação, pela convivência e bons momentos durante e após

o estágio docência.

Aos alunos de Iniciação Científica de Odontologia da Universidade Norte do

Paraná (UNOPAR), Jair Caetano Oliveira e Marjorie Takei Yoshie, Maria

Júlia Moçato Catarino, Daniele Amaral Magalhães, Raissa Rositto Shimizu

e Ariadne Mazieiro pela importante ajuda nos procedimentos laboratoriais e de

pesquisa de campo. Obrigada a todos vocês!

Aos pais e seus respectivos filhos (as) integrantes da pesquisa pela

confiança e fundamental participação.

“Nem tudo é fácil na vida...Mas, com certeza, nada é impossível.” Cecília Meireles

Sumário

i

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................... iii

LISTA DE TABELAS ................................................................................................................................ iv

LISTA DE QUADROS ............................................................................................................................... v

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ......................................................................................................... vi

RESUMO ........................................................................................................................................... viii

ABSTRACT .......................................................................................................................................... ix

CCAAPPÍÍTTUULLOO 11 .....................................................................................................................................1

INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................1

CCAAPPÍÍTTUULLOO 22 .....................................................................................................................................3

REVISÃO DE LITERATURA ...............................................................................................................3

2.1 CÁRIE DENTÁRIA..........................................................................................................................3

2.2 SALIVA .......................................................................................................................................4

2.3 PROTEÍNAS SALIVARES ................................................................................................................9

2.3.1 LISOZIMA (LZ) ............................................................................................................................10

2.3.2 LACTOFERRINA (LF) ....................................................................................................................10

2.4 RELAÇÃO DAS PROTEÍNAS SALIVARES (LACTOFERRINA E LISOZIMA) COM O FLUXO SALIVAR E ÍNDICE DE

CÁRIE (CPO-D) ..............................................................................................................................15

2.5 MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ...........................................................................17

CCAAPPÍÍTTUULLOO 33 ...................................................................................................................................22

PROPOSIÇÃO ..................................................................................................................................22

CCAAPPÍÍTTUULLOO 44 ...................................................................................................................................23

METODOLOGIA ...............................................................................................................................23

4.1 PROCEDIMENTOS ÉTICOS ...........................................................................................................23

4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E POPULAÇÃO DO ESTUDO ...........................................................24

4.3 TREINAMENTO E CALIBRAÇÃO DOS EXAMINADORES ......................................................................25

4.4 COLETA DE DADOS ....................................................................................................................26

4.5 COLETA DAS AMOSTRAS ............................................................................................................26

4.6 AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS SALIVARES DE ESTREPTOCOCOS DO GRUPO MUTANS (EGM) ......................27

4.7 SIALOMETRIA (FLUXO SALIVAR) ..................................................................................................31

4.8 COLETA PARA QUANTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS SALIVARES ...........................................................32

4.9 MÉTODO DE ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) PARA QUANTIFICAÇÃO DAS

PROTEÍNAS SALIVARES (LF E LZ) .....................................................................................................35

4.10 AVALIAÇÃO DO ÍNDICE DE PLACA (IHOS) ...................................................................................42

4.11 AVALIAÇÃO DA EXPERIÊNCIA DE CÁRIE (ÍNDICE CPO-D)..............................................................44

CCAAPPÍÍTTUULLOO 55 .................................................................................................................................47

RESULTADOS..................................................................................................................................47

5.1 ANÁLISE DESCRITIVA DA AMOSTRA..............................................................................................47

5.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................................51


DISCUSSÃO.....................................................................................................................................56

6.1 DISCUSSÃO ..............................................................................................................................56


CONCLUSÕES .................................................................................................................................70

7.1 CONCLUSÕES ...........................................................................................................................70

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................... 69

APÊNDICES......................................................................................................................................... 76

ANEXOS ............................................................................................................................................. 85

Lista de Figuras

ii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – PRINCIPAIS FUNÇÕES ATRIBUÍDAS A LACTOFERRINA SEGUNDO WARD, URIBE-LUNA, CONNEELEY

(2002) .......................................................................................................................................11

FIGURA 2 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA 3D DA LACTOFERRINA BOVINA ........................12

FIGURA 3 – PELÍCULA DE PARAFILM “M” (LABORATORY FILM; AMERICAN NATIONAL CAN. CHICAGO, IL) .......27

FIGURA 4 – COLETA DE AMOSTRAS DE SALIVA COM ESPÁTULA DE MADEIRA ................................................28

FIGURA 5 – IMPRESSÃO DA ESPÁTULA NO ÁGAR MITIS-SALIVARIUS EM AMBOS OS LADOS .............................29

FIGURA 6 – PLACAS DO TIPO RODAC DE 67X15 MM (INLAB-INTERLAB DISTRIBUIDORA DE PRODUTOS

CIENTÍFICOS LTDA, SÃO PAULO/SP) .............................................................................................29

FIGURA 7 – JARRA DE ANAEROBIOSE (PERMUTION, CURITIBA/PR) ............................................................30

FIGURA 8 – CONTADOR DE COLÔNIAS (PHOENIX- CP602) .......................................................................30

FIGURA 9 – EXEMPLOS DE CULTURA DE EGM APÓS INCUBAÇÃO REPRESENTANDO PELO NÚMERO DE COLÔNIAS

BAIXO (A), MÉDIO (B) E ALTO (C) RISCO À CÁRIE, SEGUNDO KÖHLER & BRATTHAL (1979) ...................31

FIGURA 10 – PELÍCULA DE PARAFILME UTILIZADA PARA ESTÍMULO DA SALIVAÇÃO (A) E PROVETA (B) UTILIZADA

PARA A COLETA DA AMOSTRA SALIVAR ...........................................................................................32

FIGURA 11 – COLETA DA SALIVA POR MEIO DE SERINGA PLÁSTICA DESCARTÁVEL (BD, BRASIL, VOLUME DE-3

ML), SENDO AS AMOSTRAS ACONDICIONADAS EM MICROTUBOS ........................................................33

FIGURA 12 – (A) APARELHO LIOFILIZADOR (L 101/LIOBRAS) COM AMOSTRAS DE SALIVA; (B) AMOSTRA DE

SALIVA APÓS CENTRIFUGAÇÃO SENDO LIOFILIZADA DURANTE 48H .....................................................34

FIGURA 13 – AMOSTRAS DE SALIVA COM TAMPÃO DESNATURANTE APÓS FERVURA ....................................34

FIGURA 14 – MOLDAGEM DOS SLOTS APÓS ADIÇÃO DA SOLUÇÃO DE EMPILHAMENTO ..................................37

FIGURA 15 – AMOSTRAS DE SALIVA APLICADAS EM GEL DE POLIACRILAMIDA A 15%, SENDO O PRIMEIRO SLOT

(PRIMEIRA COLUNA DA ESQUERDA PARA A DIREITA) MARCADORES DE PESO MOLECULAR, SLOTS DO MEIO

(SEGUNDA COLUNA À SÉTIMA COLUNA DA ESQUERDA PARA DIREITA) AMOSTRAS DE SALIVA CARIADA E

NÃO CARIADA, E OS DOIS ÚLTIMOS SLOTS (OITAVA E NONA COLUNA DA ESQUERDA PARA A DIREITA)

AMOSTRAS DO PADRÃO DE PESO MOLECULAR DA LZ E LF, RESPECTIVAMENTE ...................................38

FIGURA 16 – GUIA CONECTOR COM O OBJETIVO DE FACILITAR O POSICIONAMENTO CORRETO DA MICRO-

SERINGA, EVITANDO FUROS NOS SLOTS .........................................................................................39

FIGURA 17 – FIXAÇÃO DA CONSTANTE DE VELOCIDADE (V) EM (200 V), E AMPERAGEM (A) EM 23MA ............39

FIGURA 18 – IMAGEM DO GEL DE POLIACRILAMIDA EM A, APÓS ESCANEAMENTO. NA ESQUERDA ESTÃO OS

PESOS MOLECULARES DO MARCADOR E NA DIREITA OS PESOS MOLECULARES DOS PADRÕES DE LISOZIMA

E LACTOFERRINA. EM B E C OBSERVA-SE A IMAGEM APÓS A APLICAÇÃO NO SOFTWARE (L-PIX (H.E) 1D-

L340 (LOCCUS BIOTECNOLOGIA), REFERENTE À LOCALIZAÇÃO DAS BANDAS DAS AMOSTRAS DE SALIVA

DE CRIANÇAS COM DENTES CARIADOS (B) E NÃO CARIADOS (C), EM RELAÇÃO À QUANTIFICAÇÃO DA

PROTEÍNA LF E LZ, DE ACORDO COM A INTENSIDADE E POSICIONAMENTO DOS PIXELS. ........................41

FIGURA 19 – SONDA IPC ....................................................................................................................42

FIGURA 20 – APLICAÇÃO DO CORANTE FUCSINA 2% PARA EVIDENCIAÇÃO DE BIOFILME DENTAL NOS DENTES

21 E 42......................................................................................................................................42

FIGURA 21 – ILUSTRAÇÃO DOS CÓDIGOS DO ÍNDICE DE HIGIENE ORAL SIMPLIFICADO .................................43

FIGURA 22 – INSTRUÇÃO DE HIGIENE ORAL E ESCOVAÇÃO ......................................................................43

FIGURA 23 – SUPERFÍCIE DENTAL SENDO INVESTIGADA COM SONDA EXPLORADORA DE PONTA ROMBA .........44

FIGURA 24 – ESQUEMA REPRESENTATIVO DAS AMOSTRAS DE SALIVA E MARCADORES INSERIDOS NO GEL DE

ELETROFORESE ..........................................................................................................................65

Lista de Tabelas

iii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – FORMULAÇÕES UTILIZADAS NO PREPARO DO GEL DE SEPARAÇÃO (15%) E GEL DE

EMPILHAMENTO (4%) .................................................................................................. 36

TABELA 2 – CRITÉRIOS UTILIZADOS PARA A DETERMINAÇÃO DE CÁRIE...................................... 45

TABELA 3 – CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA EM RELAÇÃO AO GÊNERO .................................... 47

TABELA 4 – DISTRIBUIÇÃO DA AMOSTRA DE ACORDO COM A EXPERIÊNCIA DE CÁRIE .................. 48

TABELA 5 – DISTRIBUIÇÃO DA AMOSTRA DE ACORDO COM A AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS SALIVARES DE

EGM ........................................................................................................................ 48

TABELA 6 – DISTRIBUIÇÃO DA AMOSTRA DE ACORDO COM A AVALIAÇÃO DO FLUXO SALIVAR

(SIALOMETRIA) ........................................................................................................... 49

TABELA 7 – DISTRIBUIÇÃO DE INDIVÍDUOS EM RELAÇÃO À QUANTIDADE DE PLACA BACTERIANA

(IHOS) ..................................................................................................................... 50

TABELA 8 – DISTRIBUIÇÃO DE INDIVÍDUOS EM RELAÇÃO À PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE

LACTOFERRINA .......................................................................................................... 50

TABELA 9 – DISTRIBUIÇÃO DE INDIVÍDUOS EM RELAÇÃO À CONCENTRAÇÃO DE LISOZIMA ............ 50

TABELA 10 – VALORES MÉDIOS DO ÍNDICE CPO-D E SEUS COMPONENTES DISTRIBUÍDOS POR

GÊNERO .................................................................................................................... 51

TABELA 11 – VALORES MÉDIOS DO ÍNDICE CPO-D E SEUS COMPONENTES DISTRIBUÍDOS POR

CONTAGEM DE EGM ................................................................................................... 52

TABELA 12 – VALORES MÉDIOS DO ÍNDICE CPO-D E SEUS COMPONENTES DISTRIBUÍDOS PELA

CLASSIFICAÇÃO DO IHOS ............................................................................................ 52


CLASSIFICAÇÃO DO FLUXO SALIVAR (SIALOMETRIA) ........................................................ 53


PRESENÇA OU AUSÊNCIA DA PROTEÍNA LF ..................................................................... 53


CLASSIFICAÇÃO ATRIBUÍDA À CONCENTRAÇÃO DA PROTEÍNA LZ ....................................... 54

TABELA 16 – RESULTADOS OBTIDOS PARA A CORRELAÇÃO DE PEARSON (R) ENTRE O ÍNDICE CPO-

D E SEUS COMPONENTES E DEMAIS VARIÁVEIS .............................................................. 54

TABELA 17 – CORRELAÇÃO ENTRE TODAS AS VARIÁVEIS E A PROTEÍNA LACTOFERRINA.............. 55

Lista de Quadros

v

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - MÉDIA DE EGM EM UNIDADES FORMADORAS DE COLÔNIAS (UFC) E A

CORRELAÇÃO COM O RISCO DE CÁRIE DENTÁRIA ..................................................... 31

QUADRO 2 - CATEGORIZAÇÃO DO FLUXO SALIVAR ESTIMULADO EM ML/MIN ........................ 32

QUADRO 3 - CÓDIGOS (ESCORES) PARA O ÍNDICE DE PLACA BACTERIANA (ÍNDICE DE HIGIENE

ORAL SIMPLIFICADO – IHOS) ............................................................................... 43

QUADRO 4 – CRITÉRIOS UTILIZADOS PARA O DIAGNÓSTICO DE CÁRIE ............................... 46

Lista de Siglas e Abreviações

vi

LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES

bLf Lactoferrina bovina

CEP Comitê de Ética em Pesquisa CO2 Dióxido de Carbono CPO-D Número de dentes cariados, perdidos e obturados

cm Centímetros cm2 Centímetros ao quadrado

C Escala celsius de temperatura

DDT Dicloro difenil tricloroetano DF Disautonomia familiar

ECC Crianças com cárie precoce EGM Estreptococos do grupo mutans

g Grama (unidade de massa)

H20 Água HIV Vírus da imunodeficiência humana IgA Imunoglobulina tipo A

IgG Imunoglobulina tipo G IgM Imunoglobulina tipo M IHOS Índice de Higiene Oral Simplificado

kDa Kilodalton Lf Lactoferrina LP Lactoperoxidase

LPS Lipopolissacarídeos LZ Lisozima MSB Ágar mitis-salivarius bacitracina

nm Nanômetro mm Mililitro mL/min Mililitro por minuto

mg Miligrama mg/mL Miligrama por mililitro M Molar

mM Milimolar MM Massa molar

Menor

Maior

µL Microlitro µHg Microlitro de mercúrio

OMS Organização Mundial de Saúde p Índice de significância PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida

pH Potencial hidrogeniônico pI Ponto isoelétrico PSA Persulfato de amônio

rpm Rotação por minuto

Lista de Siglas e Abreviações

vi

S. mutans Streptococcus mutans

SDS Dodecil sulfato de sódio

SPSS

Statistical Package for Social Sciences

TEMED Tetra metilenodiamina

tris Tris (hidroximetil) amino-metano tris HCl Solução base tampão de HCl UFC Unidade formadora de colônias

UFC/mL Unidade formadora de colônias por mililitro UNOPAR Universidade Norte do Paraná V Voltagem

v volts W watts de potência

FELIZARDO, Klissia Romero. Avaliação do padrão de expressão das proteínas

salivares lactoferrina e lisozima, fluxo salivar, biofilme dentário e estreptococos do grupo mutans em crianças com e sem cárie dentária. 2009.109 p.

Dissertação (Mestrado em Odontologia) Universidade Norte do Paraná,

Londrina, 2009.

RESUMO

São vários os fatores determinantes da cárie dentária, sendo os de

especial importância relacionados à saliva e à colonização dos microrganismos

no biofilme dental. A saliva contém fatores de defesa adquiridos - componentes específicos (anticorpos) e inatos - componentes não específicos, que são proteínas antimicrobianas capazes de inibir a aderência e a viabilidade dos

microrganismos cariogênicos. Foi avaliada a associação entre fatores salivares (fluxo salivar e o perfil eletroforético das proteínas lactoferrina e lisozima), a experiência/atividade de cárie, pelos parâmetros clínicos como os índices de

cárie e de placa (CPO-D e IHOS); além da avaliação dos níveis salivares, através da contagem de estreptococos do grupo mutans (EGM). A amostra foi

constituída de 80 crianças (escolares) aos 12 anos de idade da Rede Estadual

de Ensino de Londrina/PR, e divididas em dois grupos: Grupo 1- indivíduos que apresentavam CPO-D ≥1 e Grupo 2- indivíduos que não apresentavam dentes cariados (CPO-D=0). Os responsáveis pelos escolares assinaram um termo de

consentimento informado, de acordo com as normas do Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade do Norte do Paraná (UNOPAR) e responderam a um questionário acerca da saúde

bucal e sistêmica das crianças. Foi realizado um exame clínico, para diagnosticar a presença ou ausência da doença cárie através de levantamento do Índice CPO-D (número de dentes cariados, perdidos e restaurados) e

avaliação do Índice de placa (biofilme dentário) através do índice de higiene oral simplificado. A taxa do fluxo salivar foi avaliado por meio de coleta de saliva durante 4 minutos e coletado mais 1 mL de amostra de saliva para análise das

proteínas lactoferrina e lisozima, cujo padrão foi estudado por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Para a avaliação dos níveis salivares de EGM foi realizada a coleta segundo a metodologia da espátula de

KOLHER; BRATTHAL (1979), utilizando o meio seletivo ágar mitis-salivarius, acrescido de sacarose, bacitracina e telurito de potássio. Observou-se que 58,8% das crianças do presente estudo eram cárie-inativas, apesar de 63,3%

possuirem experiência de cárie; não houve relação do fluxo salivar com nenhum dos demais fatores avaliados; o índice CPO-D foi correlacionado com a quantidade de biofilme dentário; dentes cariados foram associados com os níveis salivares de EGM; houve uma tendência da concentração de lisozima se

associar com o CPO-D; a proteína lactoferrina correlacionou-se com o biofilme dentário, CPO-D e dentes restaurados; não houve relação das proteínas

salivares com a contagem de EGM. A quantificação destas proteínas, que possuem potencial antimicrobiano, permitiu observar uma possível associação com os índices de placa e de cárie, favorecendo a uma melhor compreensão do

aspecto biológico e etiológico da cárie dentária.

Palavras-chave: Lisozima; Lactoferrina; Cárie dentária; Saliva; Eletroforese em

gel de poliacrilamida

FELIZARDO, Klissia Romero. Evaluation of the expression pattern of

salivary proteins lactoferrin and lysozyme, salivary flow, dental biofilm and mutans streptococci in children with and without caries. 2009.109 p. Dissertation (Master of Dentistry) University of North Parana, Londrina, 2009.

ABSTRACT

There are several determinants of dental caries, and those of particular importance are related to saliva and the colonization of microorganisms in the

biofilm. The saliva contains protective factors acquired-specific components (antibodies) and innate - non-specific components, which are microbial proteins able to inhibiting the adhesion and viability of cariogenic microorganisms. It was

evaluated the association between salivary factors (salivary flow and electrophoretic pattern of lactoferrin and lysozyme) and experience / caries activity through clinical parameters as indices of caries and plaque (DTMF and SOHI); and evaluation of salivary levels of mutans streptococci. The sample

consisted of 80 children (schoolars) of 12 years old from public schools of Londrina, PR, shared in two groups: Group 1 – children with DMFT ≥1and Group

2 - children who did not show decayed teeth (DMFT=0). The responsible for children signed an informed consent in accordance with the rules of the Ethics in Research Committee Center of Biological Sciences and Health of the University

of North Paraná (UNOPAR) and answered a questionnaire about oral health and systemic children. We conducted a clinical examination for diagnosis of the presence or absence of dental caries by means of the DMF index (number of

decayed, missing and filled/restored teeth) and the evaluation of Plaque Index (dental biofilm) by means of simplified oral hygiene index. The rate of salivary flow was evaluated by collecting saliva samples for 4 minutes and collected more

1 mL of saliva sample for analysis of proteins lactoferrin and lysozyme, whose pattern was studied by means of polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). To evaluate the salivary levels of mutans streptococci, the spatula

technique of KOLHER; BRATTHAL (1979) was used, spreading at the selective medium mitis-salivarius, added of sucrose, bacitracin and potassium telurite. 58,8% of children of this study were caries-inactive, in spite of 63,3% of them

showing caries experience; there was no relation among salivary flow and any other evaluated factors; the DMFT index was correlated with the amount of dental biofilm; decayed teeth were associated with mutans streptococci salivary

levels; there was a tendency of lysozime concentration association with DMFT; the lactoferrin protein correlated with dental biofilm, DMFT and restored teeth; there was no relation between salivary proteins with mutans streptococci counts.

The quantification of these proteins, which have antimicrobial potential, allowed us to observe a possible association with the biofilm and caries index, promoting a better understanding of biological and etiological aspects of dental caries.

Keywords: Lysozyme; Lactoferrin; Dental caries; Saliva; Polyacrylamide gel

electrophoresis.

CCAAPPÍÍTTUULLOO 11

INTRODUÇÃO

s superfícies da cavidade bucal são constantemente colonizadas por

microrganismos. Esses microrganismos constituem uma microbiota muito

complexa que, por si só, não resulta em doença, visto que eles existem em

equilíbrio com o hospedeiro. Essa microbiota está sob influência de componentes

específicos e não específicos do sistema imunológico secretor, cuja função protetora

é limitar a colonização microbiana das superfícies bucais e prevenir a penetração de

substâncias nocivas nestas superfícies. (THYLSTRUP & FEJERSKOV, 1995).

A saliva contém fatores de defesa adquiridos (componentes específicos-

anticorpos) e componentes não-específicos (inatos), que são proteínas

antimicrobianas, não pertencentes às imunoglobulinas, no caso: lisozima (LZ);

lactoperoxidase (LP); lactoferrina (Lf); componentes antimicrobianos poucos

conhecidos; glicoproteínas com alto peso molecular e outros componentes salivares

que podem atuar como aglutininas bacterianas (LEONE & OPPENHEIM, 2001;

FEJERSKOV, 1998; KIDD & FEJERSKOV,2004; FEJERSKOV & KIDD,2006). A

maioria dessas proteínas pode inibir o metabolismo, aderência ou até mesmo a

viabilidade dos microrganismos cariogênicos in vitro.

A função clínica na boca humana, tanto da lisozima (LZ), quanto da

lactoferrina (Lf) não está bem determinada. Todavia, parece que são importantes

para o controle do crescimento microbiano excessivo dentro da boca, mas não se

sabe o quanto são seletivas contra os microrganismos patogênicos, só se sabe que

os fatores não específicos antimicrobianos da saliva podem reduzir o número de

bactérias suscetíveis na placa ou reduzir a colonização, modificando o metabolismo

bacteriano (OHO, MITOMA, KOGA,2002; FRANCESCA et al.,2004).

A eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida na presença de dodeci l

sulfato de sódio (SDS) é um método unidimensional de separação de proteínas

(ROCHA et al. 2005) muito utilizado para análise do padrão de massas moleculares

AA

Introdução

2

e pesos moleculares (WESTERMEIER, 1997) cuja função é separar e tornar visíveis

as proteínas do fluído salivar de acordo com a sua relação carga/massa molecular,

possibilitando assim a resolução de proteínas em bandas. O seu uso mais comum é

para análise qualitativa de misturas complexas de proteínas (WESTERMEIER,

1997). Schwartz et al.(1995) propuseram o uso da eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) como uma metodologia adequada para avaliar o

conteúdo proteico da saliva.

Os estreptococos do grupo mutans (EGM) desempenham um importante

papel na etiologia da cárie dentária (HAMADA, SLADE, 1980). Possuem um

metabolismo predominantemente fermentativo e podem colonizar todas as

superfícies dentárias, inclusive faces lisas de esmalte onde existe maior dificuldade

de se produzir lesões de cárie dentária (DE LORENZO, 2004). Para Ditterich et al.,

(2004) a infância apresenta fatores de risco característicos, dentre eles a

colonização precoce por EGM, que somada à freqüência de ingestão de sacarose,

pode criar um meio favorável para o crescimento dos EGM. De fato, estudos relatam

que a colonização precoce por EGM constitui o principal fator de risco para a cárie

dentária, conforme relatam Alaluusua e Renkonen (1983) que realizaram um estudo

longitudinal sobre a colonização por EGM e cárie em crianças de dois a quatro anos

e observaram que as crianças que apresentavam EGM na placa aos dois anos de

idade apresentaram ceo-s três vezes maior aos quatro anos. Galavitz et al., (2005)

afirmam que apesar da presença isolada dos EGM não determinar a presença de

cárie, sua detecção na saliva é um bom preditor para o risco à cárie.

Desta forma, este trabalho objetivou avaliar as proteínas salivares lisozima

(LZ) e lactoferrina (Lf) e o seu padrão de expressão em crianças aos 12 anos de

idade, utilizando como método a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE),

e correlacionar com o fluxo salivar, os níveis salivares de estreptococos do grupo

mutans e índice de biofilme dentário, em crianças com e sem cárie dentária.


REVISÃO DE LITERATURA

2.1 CÁRIE DENTÁRIA

cárie dentária é uma doença infecciosa, de etiologia multifatorial, resultante

de um desequilíbrio entre os processos de desmineralização e

remineralização do esmalte (FEJERSKOV,1998). Tais processos dependem

da “quantidade e da qualidade” do biofilme bacteriano, a quantidade e freqüência do

consumo de açúcar, fluxo e capacidade tampão da saliva e a presença constante de

flúor na superfície dentária (MALTZ, 2000; THYLSTRUP & FEJERSKOV, 1995).

A doença cárie não representa um processo único, mas uma sucessão de

eventos relacionados diretamente ao comportamento do indivíduo, frente aos seus

hábitos alimentares e de higiene bucal, e do nível de acesso aos recursos e apoios

que viabilizam que esses hábitos sejam desenvolvidos (MALTZ, 2000; THYLSTRUP

& FEJERSKOV, 1995).

As lesões cariosas podem aparecer em um indivíduo se os microrganismos

cariogênicos (AJDIC et al. 2002; CONRADS, 2002) e carboidratos fermentáveis

(BURT & PAI, 2001) estiverem presentes em um hospedeiro suscetível durante um

período de tempo na cavidade bucal (FEATHERSTONE, 2004; NARIYAMA et al.,

2004).

Ao longo dos anos, pesquisas revelaram uma multiplicidade de fatores

biológicos ou determinantes que podem influenciar a cariogenicidade do biofilme

(KIDD & FEJERSKOV, 2004). Uma alta exposição a carboidratos fermentáveis pode

modificar a composição do biofilme, favorecendo sua cariogenicidade (CURY et al.,

2000; NOBRE DOS SANTOS et al., 2002).

A cárie dentária é uma das doenças infecciosas mais comuns em seres

humanos e é um problema de saúde pública significante em vários países. Ainda

que a mesma seja prevenível ou passível de controle, e as medidas sejam

relativamente simples, verifica-se que os objetivos de uma melhor saúde bucal em

AA

Revisão de Literatura

4

nível populacional, não são alcançados. Isso porque a prevalência e a incidência

dessa patologia vêm associadas a condições sociais, econômicas, políticas e

educacionais, e não apenas como resultado de interações biológicas na placa

dentária (FEJERSKOV & KIDD, 2006).

2.2 SALIVA

Com relação aos determinantes salivares, a composição da saliva, bem como

sua disponibilidade, parecem ser fatores relevantes na etiopatogênese e progressão

da cárie (THYLSTRUP & FEJERSKOV, 1995).

O principal componente da saliva é a água e representa 99% de sua

constituição. Os componentes sólidos representados por moléculas orgânicas e

inorgânicas encontram-se dissolvidos no constituinte aquoso e varia amplamente de

um indivíduo para outro e no mesmo indivíduo diversas vezes durante o dia

(BOACKLE, SUDDICK, 1984; EDGAR, 1992).

Os componentes inorgânicos da saliva são representados pelo cloreto,

bicarbonato, cloro, fosfato, iodeto, brometo, fluoreto, sódio, potássio e cálcio

(DOUGLAS, 1998). Enquanto que proteínas, enzimas, lipídios, amilase,

imunoglobulinas, lisozima e lactoferrina constituem os constituintes orgânicos

(ERICSON, MAKINEN, 1988).

A saliva pode ser considerada como específica de cada glândula, coletada

diretamente da parótida, submandibular, sublingual e, glândulas salivares menores.

A saliva total representa uma mistura das secreções das glândulas salivares

acrescida de substâncias oriundas do fluído crevicular gengival, secreções

brônquicas ou nasais, células epiteliais descamadas, restos de alimentos,

microrganismos e os produtos de seu metabolismo (KAUFMAN, LAMSTER, 2002;

ERICSON, MAKINEN, 1988; EPSTEIN, SCULLY, 1992; DOUGLAS, 1998).

A coleta da secreção de uma glândula isoladamente pode ser útil na

avaliação da função dessa glândula em particular. Igualmente, a saliva total é

avaliada com o intuito de elucidar alterações sistêmicas (KAUFMAN, LAMSTER,

2002).


5

A composição e a secreção da saliva parecem influenciar o ambiente

intrabucal, protegendo os tecidos (VAN NIEUW AMERONGEN, BOLSCHER,

VEERMAN, 2004). Um fluxo constante da saliva elimina eficazmente

microrganismos da cavidade bucal e um fluxo reduzido (hipossalivação) leva a uma

proliferação de bactérias, seguida de inflamação gengival (FEJERSKOV, 2004;

ATKINSON, BAUM, 2001; TENOVUO, 2002).

A composição salivar sofre variações em função da velocidade do fluxo salivar, e

este está intimamente relacionado ao tipo, intensidade de duração do estímulo

utilizado na obtenção da amostra. Há também alterações significativas na

composição salivar em diferentes indivíduos e no mesmo indivíduo sob diferentes

circunstâncias (JENKINS, 1978). No entanto, a velocidade do fluxo salivar é

considerada o principal fator que afeta a composição salivar (TENOVUO,

LAGERLÖF, 1995).

Segundo os critérios de KRASSE (1988) os valores de referência para

velocidade do fluxo salivar são:

Velocidade normal do fluxo salivar: 1-3 mL/min.

Velocidade baixa do fluxo salivar: 0,7-0,9 mL/min.

Velocidade muito baixa do fluxo salivar (Hipossalivação): 0,7 mL/min.

A quantidade e a composição da saliva não são constantes e estão

relacionados ao ritmo biológico circadiano. O fluxo salivar atinge seu pico no final da

tarde e é praticamente nulo durante o sono. O ciclo circadiano é fator importante a

ser considerado quando se pretende realizar estudos com a saliva (EDGAR,

O’MULLANE, 1996).

A secreção salivar é menor à noite em relação à secreção diurna. Todavia, a

concentração de proteínas é maior à tarde, enquanto que as concentrações de

eletrólitos, tais como sódio e cloretos são nitidamente maiores pela manhã, enquanto

que o potássio é excretado pela saliva no crepúsculo (DOUGLAS, 1998).

De acordo com o tempo de duração do estímulo pode haver variação no teor

das substâncias da saliva. Caso a estimulação persista por muito tempo, a

concentração das substâncias na saliva tende a diminuir, mas dentre elas, o cálcio e

as proteínas tendem a recuperar-se logo depois de cessado o estímulo

(DOUGLAS,1998).


6

A qualidade da dieta pode interferir na composição salivar. Indivíduos que

ingerem uma dieta rica em carboidratos, o conteúdo da amilase salivar torna-se mais

alto que naqueles que se alimentam com dieta pobre em glicídios (DOUGLAS,

1998).

O esforço físico contribui destacadamente para modificar a composição

eletrolítica e osmolar, bem como o volume salivar. O esforço muscular diminui o teor

de sódio e cloreto, enquanto aumenta o potássio. Isto ocorre devido à ação da

aldosterona do córtex da supra-renal que excita a reabsorção de sódio (DOUGLAS,

1998). Oliveira et al., 2005 relatam que além da atividade aumentada da alfa-amilase

na saliva total, sua concentração na saliva aumenta progressivamente com a

intensidade do exercício.

O ápice da produção salivar ocorre entre os 6 e 14 anos de idade, declinando

a partir dos 20 até os 60 anos, quando a produção total é cerca de 0,025 a 0,034

mL/min. (TOMASSI, LIMA,2002). Entretanto, na literatura científica, há controvérsias

com relação à interferência da idade em relação ao fluxo salivar, pois vários fatores

secundários, tais como: a utilização de próteses, edentulismo total ou parcial,

tonicidade muscular, uso de medicamentos, doenças inerentes aos pacientes

geriátricos, colaboração do paciente em realizar a coleta da saliva, interferem na

velocidade do fluxo salivar e é imprescindível que sejam considerados quando se

avalia epidemiologicamente a velocidade do fluxo salivar (VISSINK et al.,1988;

PANKHURST et al.,1996; ATKINSON, WU,1994).

O uso de determinados medicamentos como antidepressivos tricíclicos, os

antiparkisonianos, as fenotiazinas, as benzodiazepinas, os anticolinérgicos, os

antihipertensivos, os antihistamínicos, os antipsicóticos e os diuréticos reduzem a

velocidade do fluxo salivar (GARCÍA-POLA et al. 1999).

Uma série de funções é atribuída à saliva. No trato digestório tem importante

papel na fisiologia esofageana, na digestão e na proteção das células gástricas. Na

boca participa efetivamente na mastigação, fala, deglutição, sensibilidade gustativa,

lubrificação dos tecidos, proteção das mucosas contra a invasão de diversas

substâncias, atividade antimicrobiana, antibacteriana, antifúngica e antivirótica, na

maturação pós-eruptiva, e regulação do balanço iônico na remineralização do

esmalte, deposição da película adquirida e limitação da difusão de ácidos

(MANDEL,1987; JORGE,1995).


7

A saliva humana possui diversas propriedades reológicas (físico-químicas),

dentre estas, apresenta alta viscosidade, baixa solubilidade, elasticidade e

adesividade, devido às características químicas e estruturais das mucinas,

glicoproteínas de alto peso molecular produzidas pelas glândulas sublingual,

submandibular e palatina (RANTONEN, MEURMAN, 1998).

A ação lubrificante da saliva é reflexa da sua viscosidade que facilita os

movimentos linguais e labiais durante a alimentação, além de ser importante na

articulação das palavras. A variação da viscosidade indica alterações na constituição

salivar, particularmente devido à secreção de glicoproteínas salivares (WATERMAN

et al. 1988).

Entre os fatores protetores da saliva, o efeito limpante (“clearance”) do fluxo

salivar é um dos mais importantes. Sua atuação remove microrganismos endógenos,

exógenos e seus produtos para o intestino. Além disso, uma quantidade constante

do fluido garante a presença de fatores antimicrobianos imunológicos e não

imunológicos na boca (TENOVUO, 1998).

Em relação à coleta da saliva, esta pode ser feita de forma estimulada e não

estimulada. A estimulação da produção de saliva pode ser feita de forma mecânica

(goma de mascar, parafina, látex) ou química (ácido cítrico). A estimulação afeta a

quantidade da saliva produzida, portanto, alguns de seus constituintes também são

alterados (MANDEL, 1987). A coleta não estimulada é feita sem estímulos exógenos

e o fluxo salivar pode ser alterado por estímulos olfatórios, exposição à

luminosidade, posição do corpo e ciclo circadiano (KAUFMAN, LAMSTER, 2002).

Existe diferença na composição salivar quando a mesma é estimulada e não

estimulada em relação às diversas glândulas. A glândula parótida contribui com

aproximadamente 10% de o volume salivar quando em saliva total não estimulada.

No entanto, produz parte significante da saliva estimulada. Dessa forma, a saliva

estimulada é quase que totalmente representativa do tipo de secreção produzida

pelas parótidas. Medidas de variação de fluxo das diferentes glândulas mostram que

a submandibular produz o maior fluxo em condição de repouso, porém, quando o

fluxo é estimulado, a parótida é a mais responsiva que a submandibular (JENKINS,

1978).

Durante muito tempo a saliva foi usada como meio de monitorar o risco de

cárie sendo utilizada como meio biológico útil na medida da capacidade tampão e


8

avaliação microbiológica. Agora, a saliva tem sido objeto de estudos mais

detalhados em relação às suas características funcionais para o diagnóstico de

doenças sistêmicas que afetam a função das glândulas salivares e a composição da

saliva; pelo fato da mesma poder ser facilmente coletada quando comparada à

coleta de sangue (LIMA, 1999; MOURA, 2004).

O valor diagnóstico da saliva vem sendo corroborado por uma série de

estudos que se utilizam desse fluido corporal como meio através do qual se possa

analisar substâncias específicas importantes na elucidação diagnóstica de doenças

(SCHWARTZ, ZHU, SREEBNYL,1995; LAWRENCE, 2002; LÓPEZ et al., 2003;

YARAT et al., 2004).

Determinadas doenças sistêmicas podem comprometer o funcionamento das

glândulas salivares e conseqüentemente a produção de saliva, influenciando tanto

na quantidade de saliva produzida quanto na qualidade desses fluído, uma vez que

pode afetar os constituintes químicos e as propriedades físicas do mesmo. Essas

mudanças podem servir de parâmetro para o diagnóstico de determinadas doenças,

contribuindo assim para que a saliva possa ser considerada válida entre o arsenal

de exames complementares, uma vez que quantidade significativa de bactérias

sobrevive e cresce na saliva (RUDNEY, 2000; PALMER et al. 2001), apesar da

presença de fatores antimicrobianos salivares (TENOVUO, 1998).

Moura et al. (2007) mostraram o valor da saliva como meio de diagnóstico de

doenças orais e sistêmicas, utilizando métodos sialométricos (fluxo salivar) e

sialoquímicos, onde determinadas substâncias podem ser dosadas e assim

contribuir para o diagnóstico de doenças a partir do exame de níveis de elementos

inorgânicos e orgânicos, como dosagens hormonais, pesquisas de agentes

biológicos virais, bacterianos e fúngicos, além de marcadores biológicos úteis no

diagnóstico e prognóstico de doenças. Relataram que a saliva tem sido objeto de

estudo de diversos pesquisadores com o intuito de acrescentar uma possibilidade de

exame complementar.

Dentre as diversas possibilidades de uso da saliva como meio de diagnóstico,

pode-se citar a sua utilização nas medidas de risco de cárie utilizando a mensuração

do fluxo salivar, capacidade tampão, potencial hidrogeniônico (pH) e para contagem

de microorganismos, particularmente o Streptococus mutans, o microrganismo mais

associado com a cárie dentária (HAMADA, SLADE, 1980, DE LORENZO, 2004).


9

Vários estudos utilizando a sialometria e a sialoquímica de doenças

sistêmicas têm sido realizados. STUCHELL, MANDEL, BAURMASH em (1984)

usaram sialometria e sialoquímica em pacientes portadores da Síndrome de Sjögren

e concluíram que a sialoquímica é um método valioso de diagnóstico da doença,

além de servir para acompanhamento longitudinal dos pacientes. Os portadores da

síndrome apresentaram maior concentração de sódio, cloro, proteínas totais,

imunoglobulina G, imunoglobulina A, lactoferrina (Lf) e albumina, além de menores

concentrações de fosfato e amilase. A velocidade do fluxo salivar apresentou-se

diminuída.

2.3 PROTEÍNAS SALIVARES

As proteínas salivares são formadas basicamente nas células acinares e sua

concentração variam de acordo com o fluxo salivar. Na secreção da glândula

parótida detecta-se um teor de proteínas de 3,3 g/L, na glândula submandibular 1,2

g/L, na glândula sublingual 2,6 g/L. Entre elas são detectadas vários tipos de

proteínas como proteínas séricas (IgG, IgM, IgA), enzimas salivares (amilase,

lisozima, fosfatase ácida, lípase, peroxidase , glicoproteínas, mucoproteínas,

lactoferrina, calicreína e hitadina (DOUGLAS,1998).

Quase todas as proteínas salivares são glicoproteínas, as quais contêm

quantidades variadas de carboidratos ligados ao seu núcleo proteico. São

classificadas de acordo com sua origem celular e posteriormente subclassificadas

com base em suas propriedades biomecânicas (FEJERSKOV, 1998).

A maioria dessas proteínas pode inibir o metabolismo, aderência ou até

mesmo a viabilidade dos microrganismos cariogênicos in vitro. Diferentes dos

anticorpos, esses fatores não específicos não apresentam memória imunológica e

não estão sujeitos a estímulos específicos. Entretanto, vários dos fatores

imunológicos não específicos podem interagir com as imunoglobulinas salivares,

resultando em amplificação mútua de suas respectivas atividades (FEJERSKOV,

1998; BROCK, 2002; VAN NIEUW AMERONGEN, BOLSCHER, VEERMAN, 2004).


10

2.3.1 LISOZIMA (LZ)

A lisozima (LZ) provém das glândulas salivares maiores e menores, do fluido

do sulco gengival e dos leucócitos salivares. A sua ação antimicrobiana baseia-se

em sua atividade de muramidase (capacidade de hidrolizar a ligação entre o ácido

N-acetil-murâmico e a N-acetilglicosamina na camada peptidoglicana da parede da

célula bacteriana). Além disso, como é uma proteína catiônica, pode ativar as

“autolisinas” bacterianas, que por sua vez também podem destruir os componentes

da parede celular (ARNOLD, BREWEN, GAUTHIER, 1980).

Atkinson et al. (1989); Atkinson et al. (1990); Kirstila et al. (1994); Mandel,

Barr, Turgeon (1992); Tsang & Samaranayake (1999); Yeh et al. (1988) verificaram

aumento na concentração de lisozima em indivíduos infectados por HIV, com

candidíase oral. Vários estudos (KAMAYA, 1970; LASSITER et al. 1987; MARQUIS

et al. 1982; SAMARANAYAKE et al. 2001; TOBGI, SAMARANAYAKE &

MACFARLANE, 1988) demonstraram a atividade antifúngica in vitro da lisozima

diante de espécies de Candida.

2.3.2 LACTOFERRINA (LF)

A lactoferrina (Lf) é uma glicoproteína ligadora de ferro, pertencente à família

da transferrina, presente em várias secreções como o leite, lágrima e saliva (WARD,

URIBE-LUNA, CONNEELEY, 2002). Ela é um monômero de 76 kDa dividida em dois

lobos, interligados por uma alfa hélice, e possui dois sítios de ligação de ferro

(JENSSEN, HANCOCK,2008).

Muitas funções biológicas são atribuídas a lactoferrina (Lf), como a de

modular a resposta imune contra infecções e possuir atividade antimicrobiana. A

atividade antimicrobiana da (Lf) ocorre basicamente por ligar ferro com grande

afinidade, o que acaba tornando esse íon indisponível para um grande número de

espécies bacterianas. Ela exerce sua atividade antimicrobiana através de outros

mecanismos de ação, como por exemplo, através da interação direta entre a (Lf) e

componentes celulares de bactérias (JENSSEN, HANCOCK, 2008).

Recentemente muitas outras funções foram atribuídas a (Lf), tais como

imunomodulação, regulação do crescimento celular, função antitumoral, atividade


11

antioxidante e antiinflamatória (Figura 1) (WARD, URIBE-LUNA, CONNEELEY,

2002).

Figura 1 – Principais funções atribuídas a lactoferrina segundo Ward, Uribe-Luna, Conneeley (2002)

O leite é a mais abundante fonte de (Lf), sendo que o colostro humano

contém mais de sete g/L desta proteína. A concentração da (Lf) no sangue é

normalmente cerca de 1 μg/mL, embora possa aumentar para mais de 200 μg/mL

durante um processo inflamatório (MASSON, HEREMANS,1971).

O tecido normal humano expressa variada quantidade de lactoferrina (Lf)

(TENG, 2002; LIU et al. 2003) em diferentes órgãos (mucosas, endométrio, epitélio

vaginal, próstata e vesícula seminal), e em diferentes condições fisiológicas

(PANELLA et al. 1991). A maior concentração de lactoferrina é encontrada no

colostro, e em menor quantidade, em fluídos do organismo, como saliva, lágrima,

sêmen, suor, leite e secreções nasais (WARD, CONNEELY, 2004; TENG, 2002;

VAN VEEN et al. 2002).

A estrutura tridimensional da (Lf) foi determinada em 1997 por Moore et al.,

utilizando-se cristalografia por difração de raios-x, como sendo composta por uma

única cadeia polipeptídica de 76 kDa. A molécula possui dois sítios de ligação para o

ferro, sendo a afinidade da (Lf) pelo mesmo 260 vezes maior do que a transferrina,

proteína transportadora de ferro no sangue (BAKER et al. 1994a) (Figura 2).


12

O lobo N e o lobo C são conectados pela α-hélice mostrada em laranja. Em

vermelho estão destacados os aminoácidos que formam o sítio de ligação para o

ferro.

Figura 2 – Representação esquemática da estrutura 3D da lactoferrina bovina

Apesar de a (Lf) ter a capacidade de ligar vários íons metálicos, tais como

Mn3+, Cu2+, Co3+, Zn2+; nenhum deles liga-se a (Lf) com tanta afinidade quanto o

Fe3+ (BAKER, 1994b). Em sua forma apo, ou seja, sem a ligação de Fe3+, o sítio de

ligação permanece em sua conformação mais aberta, enquanto que a ligação do íon

ferro (forma holo) proporciona uma mudança que leva a uma conformação fechada.

A ligação de ferro leva a proteína a uma conformação fechada o que aumenta

sua rigidez e conseqüentemente a estabilidade frente à desnaturação térmica

(GERSTEIN et al. 1993).

A liberação de íons ferro da (Lf) depende da desestabilização da forma

fechada (holo) e esta desestabilização pode ser causada por abaixamento de pH ou

a utilização de agentes quelantes (BALI, AISEN, 1991).

É importante salientar que as mudanças conformacionais que diferenciam a

forma apo da forma holo devem-se simplesmente a pequenas mudanças

N2

C1

C2

N1

C

N


13

conformacionais nos domínios da (Lf). Essas mudanças não interferem, por

exemplo, na maior parte da superfície protéica, ou seja, ela não altera o sítio de

ligação de receptores, bactérias, vírus entre outros (ANDERSON et al. 1990;

GERSTEIN et al. 1993).

Proteínas e peptídeos antimicrobianos são sintetizados por uma grande

variedade de organismos com o objetivo de atuarem como a primeira linha de defesa

contra infecções e são encontrados em diversos fluídos corporais. Das mais

abundantes podemos citar a lisozima, colectina e lactoferrina (JENSSEN,

HANCOCK, 2008). A lactoferrina é considerada como uma importante molécula do

sistema de defesa de recém-natos.

Uma das primeiras atividades antimicrobianas descobertas para a lactoferrina

foi sua habilidade em seqüestrar ferro do meio tornando-o indisponível para as

bactérias (BULLEN, ROGERS, LEIGH, 1972; ARNOLD, COLE, MCGHEE, 1977).

Essa descoberta levou-se acreditar, durante muito tempo, que esse era o único

mecanismo de ação antimicrobiana da (Lf).

Diversos estudos demonstravam que a apo-Lf possuía atividade

antimicrobiana e que essa atividade era reduzida quando a (Lf) era saturada por

ferro (ARNOLD, BREWER, GAUTHIER, 1980; YAMAUCHI et al. 1993). Arnold,

Brewer, Gauthier (1980) verificaram o efeito bactericida da (Lf) sobre o

Streptococcus mutans e a hipótese levantada era que a (Lf) estaria interagindo

diretamente com a superfície celular da bactéria.

Experimentos de cristalografia por difração de raios-x da (Lf) mostraram que a

proteína possui regiões catiônicas em sua superfície o que facilita sua interação com

o lipídeo A, que é um componente dos lipopolissacarídeos (LPS) da membrana de

bactérias Gram-negativas. Essa interação ocasiona dano à parede celular

bacteriana, modificando sua permeabilidade, levando a liberação da porção LPS e o

conseqüente colapso da bactéria (APPELMELK et al. 1994; ELISSON et al. 1988).

Devido a esses danos causados pela (Lf) na membrana da bactéria, a (Lf) é

capaz de aumentar o efeito de drogas comerciais como a rifampicina (ELISSON,

GIEHL, LAFORCE, 1988). Outros estudos combinam a (Lf) a terapias padrão contra

infecções bacterianas a fim de diminuir o tempo de recuperação e minimizar os

efeitos colaterais do tratamento pela diminuição da dosagem dos antibióticos (DE

BORTOLI et al., 2007).


14

Interessante notar que a importância do ferro para o crescimento bacteriano,

combinado com a capacidade de elementos do hospedeiro em seqüestrar esse

ferro, levaram algumas cepas bacterianas a desenvolverem estratégias de anular

esse efeito. Sob condições de privação de ferro, algumas bactérias Gram-negativas

desenvolveram um mecanismo de obter ferro a partir da (Lf) saturada por esse íon.

Esse mecanismo envolve a interação da (Lf) com receptores localizados na

superfície bacteriana (LEWIS et al. 1998).

Além disso, muitos estudos têm mostrado o efeito da (Lf) contra diversos vírus

tais como rotavírus, herpes vírus e HIV. A (Lf) previne a entrada dos vírus na célula

por bloquear os receptores celulares ou pela interação direta com as partículas virais

(HARMSEN et al. 1995; VAN DER STRATE et al. 2001).

Muller et al. (1992) notaram que indivíduos infectados pelo HIV demonstraram

uma redução significativa nas secreções das glândulas salivares, especialmente

secreções da glândula parótida a qual secreta também a lactoferrina, e em paralelo

redução na secreção de imunoglobulinas A (IgA) contribuindo com infecções bucais

freqüentes.

Marder, Barr, Mandel (1985) não encontraram diferenças nas taxas de

proteínas salivares de indivíduos HIV-positivos e saudáveis; já Atkinson et al.(1990)

notaram aumento significativo nas concentrações de lactoferrina secretada em

pacientes HIV positivos.

A Lf inibe Candida albicans, que normalmente está presente em pacientes

portadores de próteses odontológicas (BERKHOUT et al. 2002; LUPETTI et al.

2003). Segundo Samaranayake et al. (2001) afirmam que recentemente alguns

estudos têm demonstrado o efeito antifúngico da lactoferrina sobre Candida, através

do efeito de ligações livres de apolactoferrina, obtidas do colostro humano.

Cole et al. (1976), Lassiter et al. (1987) e Weinberg (1978) afirmaram que a

lactoferrina é um antimicrobiano com efeito bactericida e bacteriostático in vitro,

especialmente sobre Streptococcus mutans.

A (Lf) pode interferir no desenvolvimento do biofilme dental, inibindo a adesão

de S. mutans (OHO, MITOMA, KOGA, 2002) ou modulando a agregação das

bactérias planctônicas na forma de biofilme (FRANCESCA et al. 2004). Achados

como estes podem fornecer subsídios para a importância dessa molécula na

etiopatogênese da cárie dentária (ORSI, 2004; FINE, FURGAN, BEYDOWIN, 2002).


15

A Lf pode regular diretamente a resposta inflamatória (SINGH, 2002) ligando-

se a endotoxinas, como o lipopolissacarídeo (LPS) (TENG, 2002), mediador central

da resposta inflamatória em infecções bacterianas (VAN VEEN et al. 2002; BROCK,

2002). Estimula a produção de citocinas (VAN VEEN et al. 2002) que é responsável

por coordenar a resposta celular humana, atuando na maturação e ativação de

macrófagos e neutrófilos, podendo sua deficiência causar supressão no sistema

imunológico, e seu excesso, uma exacerbada resposta imune (WARD,

CONNEELY,2004; SON et al.,2002). Os leucócitos polimorfonucleares são ricos em

Lf (PANELLA et al. 1991), que agem como fator de proteção contra diversas

infecções (ORSI, 2004; WARD, CONNEELY, 2004).

2.4 RELAÇÃO DAS PROTEÍNAS SALIVARES (LACTOFERRINA E

LISOZIMA) COM O FLUXO SALIVAR E ÍNDICE DE CÁRIE (CPO-D)

Existem fatores correlacionados à alteração das proteínas salivares no que

diz respeito à secreção salivar (fluxo), e o índice CPO-D (JOHANSSON, LUMIKARI-

LENANDER, SAELLTROM, 1994; ATKINSON, BAUM, 2001; BANDERAS-TARABAY

et al. 2002; SIKORSKA, MIELNIK-BLASZCZAK, KAPEC, 2002; MASS et al. 2002;

DE FARIAS, BEZERRA, 2003; FRANCESCA et al. 2004; JENTSCH et al. 2004;

AZEVEDO et al. 2005; BARDOW et al. 2005; VITORINO et al. 2006; JONASSON et

al. 2007), o que pode interferir na proteção contra cárie, e nas bactérias formadoras

do biofilme dental (PUY, 2006; BANDERAS-TARABAY et al. 2002).

Johansson, Lumikari-Lenander, Saelltrom (1994) estudaram a composição da

saliva de 34 crianças de 8-12 anos de idade, com má nutrição, verificando-se a

correlação encontrada entre quantidade total de proteínas, fluxo salivar e

capacidade tampão. Atkinson, Baum (2001) relataram que pacientes com reduzido

fluxo salivar, estão sujeitos a maiores índices CPO-D e infecções gengivais.

Mass et al. (2002) investigaram condições salivares e cárie em crianças com

disautonomia familiar (DF), onde, um dos sinais clínicos é o fluxo salivar aumentado.

Observaram que as crianças com DF apresentaram maior fluxo salivar, menor

concentração de proteínas totais na saliva, menores números de lactobacilos e

estreptococos do grupo mutans e menos cárie. Já as crianças controle com


16

experiência de cárie, mostraram as mais altas concentrações de lactobacilos e

estreptococos do grupo mutans, assim como altas concentrações de lisozima.

Sikorska, Mielnik-Blaszczak, Kapec (2002), relataram que os índices de

lactoferrina apresentaram-se aumentados nos 83 adolescentes avaliados quando

estes possuiam índice CPO-D elevado.

De Farias, Bezerra (2003) analisaram a composição orgânica da saliva de 20

crianças sem cárie e cárie precoce aos 12 anos de idade, sexo feminino e

masculino, submetidos ao teste imunológico e bioquímico. Verificaram que as

crianças com cárie precoce obtiveram aumento nos níveis de proteínas salivares

IgA/IgG, enquanto a atividade amilase, concentração total de proteínas e IgM foram

similares em ambos os grupos.

Jentsch et al. (2004) observaram baixos níveis de dentes cariados

relacionados a um alto fluxo salivar, assim como valores baixos de dentes cariados

estiveram associados à baixa concentração de Lf.

Francesca et al. (2004) dizem haver uma associação significante entre o

índice de superfície cariada e a concentração de lactoferrina salivar sendo que

maiores concentrações de ferro levam à inibição da agregação de S. mutans.

Azevedo et al em 2005 mostraram haver maior atividade de cárie, diante de

um fluxo salivar diminuído. Este resultado pode estar refletindo a importância –

diante do fluxo normal - da maior remoção mecânica de resíduos alimentares e

bactérias potencialmente cariogênicas, assim como a presença aumentada de

componentes salivares protetores, como a lactoferrina e imunoglobulinas.

Bardow et al. (2005) observaram que altas concentrações de fosfato,

proteínas e amilase na saliva dos indivíduos pesquisados mostraram um papel

protetor contra a cárie.

Vitorino et al. (2006) avaliaram a composição salivar em especial as proteínas

salivares e a sua influência na formação do biofilme dentário e possível correlação

com a doença cárie, utilizando uma amostra de 32 indivíduos do sexo masculino, de

acordo com o Índice CPO-D, presença e ausência da doença. O grupo suscetível à

cárie demonstrou quantidade maior das proteínas amilase, lactoferrina e

imunoglobulina A nas suas amostras de saliva.


17

2.5 MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Existem vários métodos para a quantificação de proteínas, nomeadamente o

método do Biureto, método Bradfort ou BG-250, método “BCA” ou reagente de

Smith, método Lowry, métodos de eletroforese dentre a qual a eletroforese em gel

de poliacrilamida (SDS-PAGE), eletroforese bidimensional (2D-PAGE), entre outros.

O método do biureto se baseia na reação do reativo do biureto, que é

constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que

estabiliza o cobre em solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado por

(GORNALL, BARDAWILL, DAVID, 1949). O cobre, em meio alcalino, reage com

proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O

produto de reação apresenta duas bandas de absorção espectofotométrica, uma em

270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentarem em

seis vezes a sensibilidade do método de biureto (ITZHAKI, GILL, 1964), a banda na

região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque diversas

substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na

região de 270 nm causando muita interferência no método.

Segundo Zaia, Zaia, Lichtig, 1998 em um artigo de revisão relatam que o

método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteínas

totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguíneo, líquido cérebro

espinhal (líquor), urina, alimentos, saliva, fibrinogênio e tecido animal, além de ser

utilizado em análise por injeção em fluxo, assim como em alguns métodos cinéticos.

O método de Bradfort é uma técnica para a determinação de proteínas totais

que utiliza o corante de “Coomassie brilliant blue” BG-250. Este método é baseado

na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém

aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a

interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o

deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve a luz

fortemente em 595 nm (COMPTON, JONES, 1985). Tem sido utilizado para

determinação de proteínas totais em diversos meios: plasma ou soro sanguíneo,

líquor, saliva humana, produtos alimentícios e leite humano, de acordo com (ZAIA,

ZAIA, LICHTIG, 1998).


18

O método BCA ou reagente de Smith baseia-se na reação de cobre (II) com

proteínas, em meio alcalino, produzindo cobre (I) e formando um complexo com o

BCA, que absorve fortemente a luz na região de 560 nm. (SMITH et al. 1985). Tem

sido aplicado na determinação da concentração de proteínas totais em saliva

proteínas celulares, interferons, leite humano e determinação de grupos funcionais,

além de ser recomendado em estudos de comparação de metodologias para a

determinação de proteínas totais em leite humano e células (ZAIA, ZAIA, LICHTIG,

1998).

O método de Lowry ou atualmente conhecido como LOWRY e cols. (1951)

para determinação de proteínas totais, foi originalmente proposto por (WU, 1922),

sendo esta a metodologia mais utilizada para a determinação de proteínas. O

princípio do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido

fosfórico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com

proteínas, na presença do catalisador cobre (II), e produz um composto com

absorção máxima de luz em 570 nm. Tem sido utilizado para determinação da

concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: líquor, plasma

sanguíneo, saliva humana, tecido animal, plantas, suco biliar, membranas, leite

humano e produtos alimentícios. Devido ao seu extenso uso, o método de LOWRY e

cols. (1951) vem sendo utilizado em diversos tipos de equipamentos automatizados

e estudos comparativos de métodos (ZAIA, ZAIA, LICHTIG, 1998).

De acordo com Jorgenson (1986) a eletroforese constitui a primeira escolha

entre os métodos utilizados para a separação e análise de substâncias protéicas A

eletroforese de proteínas foi realizada pela primeira vez em 1937 por Arne Tiselius,

que idealizou um método denominado de eletroforese livre, a qual consistia na

decomposição do soro sanguíneo em cinco frações protéicas principais. É uma

técnica de separação baseada na migração das moléculas carregadas numa

solução, em função da aplicação de um campo elétrico (ROCHA et al. 2005;

TISELIUS, 1937).

Kinersly (1953) utilizou eletroforese em papel para estudar os componentes

da saliva. Geller, Hames, Rovelstad (1959) utilizando eletroforese em papel, e

comparando a mobilidade das frações separadas com materiais de referência,

relatou para a saliva de parótida humana cinco frações: albumina, alfa-albumina,


19

beta-globulina, gama-globulina e lisozima. O mesmo trabalho registra para a saliva

humana total as frações albumina, alfa-albumina, beta-globulina e lisozima.

Masson, Carbonara e Heremans (1965) trabalhando com saliva total,

eletroforese em papel, eletroforese em gel de agarose, imunoeletroforese e

cromatografia em dietilamincetil-celulose, comprovaram que as frações separadas

por GELLER, HAMES, ROVELSTAD (1959) eram compostas de diversas frações,

além de confirmar a presença de mucinas salivares, amilases salivares (situadas na

área de globulinas-beta 2) e de lisozima, mostraram a separação de globulinas-alfa

1, globulinas-alfa 2, globulinas-beta 1, globulinas-alfa 2 mucosal e um componente

catódico.

Oberg, Izutisu, Truelove (1982) usando gel de dodecil sulfato sódico de

poliacrilamida, identificou em salivas de parótidas humanas, um total de 23

diferentes frações de natureza protéica. SHIBA, SHIBA, SUZUKI (1985), também em

gel de dodecil sulfato de poliacrilamida, registraram 22 frações protéicas em saliva

total humana.

Schwartz, Zhu, Sreebnyl (1995) propuseram o uso da eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) como uma metodologia adequada para avaliar o

conteúdo proteico da saliva.

Nas últimas décadas, a técnica de eletroforese tem sofrido aperfeiçoamentos

constantes, possibilitando análises mais precisas. O método mais utilizado

denomina-se eletroforese zonal, que utiliza uma matriz sólida em um gel de

poliacrilamida (ROCHA et al. 2005).

A velocidade da migração das proteínas neste suporte depende da força do

campo aplicado, da carga, do tamanho e forma das moléculas, da força iônica, da

viscosidade e temperatura do meio. (ROCHA et al. 2005).

A eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida na presença de

dodecilsulfato de sódio (SDS) é um método unidimensional de separação muito

utilizado para análise de massas moleculares de proteínas oligoméricas, ou seja,

formada por mais de uma cadeia polipeptídea (ROCHA et al. 2005). O método

fornece uma maneira fácil de calcular o número de polipeptídeos em uma amostra, e

assim avaliar a complexidade desta (WESTERMEIER, 1997).

A eletroforese em gel de poliacrilamina tem a capacidade de fornecer

informações sobre os pesos moleculares das proteínas e o padrão de massa


20

molecular, ou seja, estrutura e organização das subunidades das proteínas. É um

método relativamente simples de usar e altamente reprodutível. O seu uso mais

comum é para análise qualitativa de misturas complexas de proteínas

(WESTERMEIER, 1997).

O elemento chave em um sistema de eletroforese em gel é obviamente, o gel

em si. Ele determina as taxas de migração das proteínas (WESTERMEIER, 1997).

Esse gel é uma matriz constituída de um polímero de acrilamida com ligações

cruzadas de N, N-metil-bis-acrilamida, cuja porosidade da malha pode ser escolhida

(ROCHA et al. 2005), ou seja, os mesmos podem ser moldados em uma variedade

de tamanhos de poros adequados para peneiramento das proteínas. O tamanho dos

poros é determinado pelas condições de polimerização e pode ser alterada, pela

concentração de monômero (WESTERMEIER, 1997). Quanto maior a concentração

de acrilamida, menores serão os poros da malha formada (ROCHA et al. 2005).

Antes de iniciar a eletroforese, as variáveis forma e carga nativa das proteínas

devem ser eliminadas para que a separação dependa apenas de sua massa

molecular. Para isso, as proteínas são misturadas com SDS, um detergente

anfipático, ou seja, possui uma porção polar (cabeça aniônica) e uma parte apolar

(cauda lipofílica) (MENDES, 2006), cuja função é desnaturá-las, convertê-las numa

estrutura linear; a forma nativa é geralmente globular; e conferir-lhes densidade de

carga uniforme.

O SDS tem alta carga negativa e uma cauda hidrofóbica que interage com as

cadeias polipeptídicas numa proporção aproximada de 1,4 g de SDS para cada

grama de proteína, tornando-as negativamente carregadas. Na ausência do SDS, as

proteínas com massas iguais podem migrar diferentemente na malha do gel, devido

ao diferencial de cargas de suas estruturas tridimensionais. Além da adição do SDS,

as proteínas podem ser opcionalmente fervidas na presença de um agente redutor,

como o DDT (ditiotreitol) ou 2-mercaptoetanol que desfazem as pontes de

dissulfetos ajudando a eliminar a estrutura tridimensional dos polipeptídeos (ROCHA

et al. 2005).

Após esse tratamento, as proteínas são aplicadas no topo de um gel de

poliacrilamida e submetidas a uma corrente elétrica, fazendo com que elas migrem

através da malha de acrilamida em direção ao pólo positivo. Dependendo do seu

tamanho, cada proteína se moverá diferentemente. As proteínas menores migrarão


21

mais rapidamente, enquanto que as maiores terão mais dificuldade em atravessar a

malha do gel, e assim, se moverão mais lentamente (ROCHA et al. 2005).

A mobilidade eletroforética de uma proteína depende da sua carga, tamanho

e forma. O seu ponto isoelétrico depende apenas do seu valor líquido global. Assim,

diversos sistemas de eletroforese foram desenvolvidos para explorar a diferença

entre essas duas propriedades fundamentais das proteínas (WESTERMEIER, 1997),

como no caso da eletroforese bidimensional (2D-PAGE), a qual surgiu em 1975 com

trabalhos de O’FARREL; MACGILLIVRAY et al., KLOSE, onde utilizava-se como

meio de separação das proteínas o seu ponto isoelétrico e a mobilidade

eletroforética.

As proteínas podem levar carga positiva, negativa ou zero, dependendo do

pH do meio ambiente local. Para cada proteína existe um pH específico no qual a

carga líquida é zero. Este pH é chamado de “ponto isoelétrico”, ou (pI) da proteína.

Uma proteína é positivamente carregada em soluções com valores de pH abaixo de

seu (pI), e de carga negativa, quando o pH está acima do seu (pI)

(WESTERMEIER,1997).

Esta dependência do pH na carga afeta as mobilidades de proteínas tanto em

termos de magnitude e direção da migração, o que é explorado na eletroforese em

gel, especialmente na técnica da eletroforese 2D-PAGE (WESTERMEIER,1997).

Apesar da eletroforese em gel de poliacrilamida ser já bastante utilizada, são

poucos os trabalhos na literatura com esta técnica que possuem o intuito de

identificar as proteínas salivares, especialmente correlacionando com os parâmetros

clínicos odontológicos. Para melhor esclarecimento do perfil eletroforético das

proteínas salivares antimicrobianas, julgamos oportuno avaliar pela técnica SDS-

PAGE sua presença e ainda, quantificá-las, buscando elucidar fatores do hospedeiro

envolvidos com a etiologia e desenvolvimento da cárie dentária.


PROPOSIÇÃO

ste trabalho pretendeu avaliar a experiência e a atividade de cárie em

crianças aos 12 anos de idade, associando-as com o padrão de expressão

das proteínas salivares lactoferrina e lisozima, através da eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE).

Além de investigar a associação do índice CPO-D com os demais fatores:

níveis salivares de estreptococos do grupo mutans (EGM),

fluxo salivar e

presença de biofilme dentário.

EE


METODOLOGIA

4.1 PROCEDIMENTOS ÉTICOS

projeto desse estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)

da Universidade Norte do Paraná (UNOPAR/Londrina) recebendo parecer

favorável à sua execução (Protocolo PT-0319/08 – Apêndice 1), e à

apreciação da diretoria da Escola Estadual de Ensino de Londrina/PR (Maria José B.

Aguilera), sito à Rua Tarcisa Kikuti, 55; bem como o Núcleo Regional de Ensino do

Município de Londrina/PR; requerida a autorização oficial para a realização da

pesquisa.

Além disso, os responsáveis legais pelos escolares participantes deste estudo

foram informados pelos próprios filhos sobre a natureza do trabalho e a necessidade

da obtenção de uma autorização (Apêndice 2) antes da realização de qualquer

procedimento, conforme orientações contidas na Resolução 196 de 10 de outubro

de 1996, do Conselho Nacional de Saúde para pesquisas envolvendo seres

humanos. Foram informados também sobre o preenchimento de um questionário

para investigação de problemas sistêmicos; uso de medicamentos e hábitos de

higiene oral (Apêndice 3).

Após a explicação detalhada da pesquisa a respeito dos riscos e benefícios

dos procedimentos, preenchimento do questionário, bem como os passos das

coletas de amostras, todos os envolvidos levaram para casa as autorizações e o

questionário, sendo os mesmos assinados e preenchidos pelos responsáveis legais,

autorizando, portanto a participação do (a) menor na referida pesquisa.

OO

Metodologia

24

4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E POPULAÇÃO DO ESTUDO

Este estudo se caracterizou por ser de delineamento transversal exploratório,

do tipo quantitativo, sobre avaliação dos níveis salivares de estreptococos do grupo

mutans (EGM), sialometria (fluxo salivar), quantificação das proteínas salivares pela

técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), experiência de cárie

dentária (CPO-D) e índice de placa (biofilme) bacteriano (IHOS - Índice de Higiene

Oral Simplificado) de Greene Vermillion (1964) em escolares da cidade de

Londrina/PR.

Para a presente investigação foram selecionados escolares na faixa etária de

12 (doze) anos de idade, de ambos os sexos.

Os participantes foram selecionados com base nos seguintes critérios de

inclusão:

1) pacientes cujos responsáveis não relatassem doenças sistêmicas;

2) não ter usado medicação (usuários crônicos de antiinflamatórios e de

antibióticos) que alterem parâmetros salivares até 30 (trinta) dias antes do estudo;

3) não usar aparelho ortodôntico e ortopédico;

4) presença de doença cárie em relação ao número de dentes cariados,

perdidos e obturados e ausência de doença cárie, com o objetivo de constituir dois

grupos de estudo quanto à variável (crianças com presença e ausência de doença

cárie);

5) não ter ingerido alimentos em geral (goma de mascar, balas, frutas ácidas)

duas horas antes da coleta; e

6) não apresentar comportamento que dificultasse as coletas.

Após aprovação do CEP foi realizado um estudo piloto com 8 (oito) escolares

de cada grupo (presença e ausência de doença cárie) para validação da

metodologia proposta, verificando assim questões práticas relacionadas à logística

do estudo, a serem utilizados no protocolo definitivo. Dentre elas analisou-se a

adequação da linguagem dos instrumentos de coleta de dados, a previsão de tempo

a ser utilizada durante a aplicação dos instrumentos e o comportamento das

crianças durante o exame clínico.

Metodologia

25

4.3 TREINAMENTO E CALIBRAÇÃO DOS EXAMINADORES

Os escolares foram examinados no laboratório da própria escola (Maria José

B. Aguilera – Londrina/PR).

Para a coleta dos dados clínicos, participou um examinador (cirurgião-

dentista) e um anotador (acadêmico de iniciação científica) para o exame das

condições bucais baseado na experiência de cárie dentária, segundo critérios

definidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS-WHO,1997), através do índice

CPO-D.

Para a avaliação da presença de biofilme bacteriano (Índice de placa

bacteriana) onde se utilizou o IHOS - Índice de Higiene Oral Simplificado, idealizado

por Greene Vermillion (1964) tiveram como colaboração os mesmos examinadores e

anotadores. Contou-se também com a colaboração de mais um acadêmico para a

avaliação dos níveis salivares de estreptococos do grupo mutans (EGM) e dois

alunos de iniciação científica, para a coleta de saliva e verificação do fluxo salivar

para quantificação das proteínas salivares. Ao final da coleta outro acadêmico

ofereceu instrução de higiene oral e escovação.

O treinamento do examinador envolveu o nivelamento teórico e prático. O

nivelamento teórico foi realizado através do estudo da literatura científica e o prático

através de oficina de calibração. A oficina de calibração foi realizada examinando

crianças na faixa etária do estudo, na clínica odontológica da Unopar durante a

clínica de odontopediatria (graduação) e escolares da escola (Maria José B. Aguilera

– Londrina/PR).

A concordância inter e intra-examinador foi verificada com um grupo de 20

(vinte) crianças, escolhidas aleatoriamente, através da realização de exames em

duplicata, com intervalo de 30 (trinta) minutos entre eles. O teste estatístico Kappa

(Kramer & Feinsteim, 1981) foi utilizado para aferição de concordância. Os

resultados do índice Kappa foram: intra-examinador de 0,857 e inter-examinador de

1,0.

Metodologia

26

4.4 COLETA DE DADOS

Foi aplicado um questionário entregue aos pais/responsáveis legais com o

objetivo de levantar dados retrospectivos relacionados a problemas sistêmicos e uso

de medicamentos (antiinflamatórios e antibióticos) que pudessem vir a alterar

parâmetros salivares (Apêndice 2), sendo o mesmo utilizado como critério de

inclusão. Tal questionário foi entregue aos alunos da 6a série (12 anos) para serem

preenchidos pelos responsáveis. No dia seguinte esses questionários eram

recolhidos, verificado as respostas de acordo com os critérios de inclusão, e a partir

disso os escolares eram selecionados para a pesquisa, sendo então divididos em

dois grupos, cariados e não cariados.

4.5 COLETA DAS AMOSTRAS

Como as amostras foram coletadas no laboratório da escola, dividiu-se o

mesmo em bancadas, totalizando 6 (seis) bancadas.

Cada criança ao chegar teria que segui-las em ordem cronológica de (1 a 6),

sendo:

a) bancada 1,

- coleta para avaliação dos níveis salivares de estreptococos do grupo

mutans (EGM);

b) bancada 2 ,

- sialometria (fluxo salivar);

c) bancada 3,

- coleta para quantificação das proteínas salivares;

d) bancada 4,

- avaliação da experiência de cárie (CPO-D);

e) bancada 5,

- avaliação do índice de placa (IHOS), e

Metodologia

27

f) bancada 6,

- instrução de higiene oral e escovação.

4.6 AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS SALIVARES DE ESTREPTOCOCOS DO

GRUPO MUTANS (EGM)

A coleta da saliva, bem como os demais procedimentos clínicos, foi realizada

em dias agendados no período da tarde, uma vez que o ensino médio funcionava

apenas nesse período.

Foi alertado para que os mesmos ficassem em jejum até o momento da coleta

das amostras de saliva, a qual foi iniciada por volta das 14h00min.

A saliva foi estimulada pela mastigação de uma película de Parafilm “M”

(Laboratory Film; American National Can. Chicago, IL) (Figura 3) de

aproximadamente 3x3 cm, durante 1 minuto. Durante a mastigação foi recomendado

às crianças que não engolissem a saliva nem o parafilme.

Figura 3 – Película de Parafilm “M” (Laboratory Film; American National Can. Chicago, IL)

Para que fosse realizada uma coleta da saliva total padronizada foram

utilizados os seguintes requisitos (LIMA, 1999; FRANCO, 2004):

Não ter ingerido nenhum tipo de alimento ou bebida (exceto água)

durante o período de duas horas que antecedia a coleta.

Não ter fumado.

Não ter sido submetido à grande estresse físico antes da coleta.

Metodologia

28

No momento da coleta o paciente deveria sentar-se em posição

relaxada em uma cadeira comum (não odontológica) e de olhos

abertos.

Mastigar o pedaço de parafilme alternando-o entre os lados direito e

esquerdo da boca durante o tempo determinado pelo pesquisador que

fazia o controle do tempo da coleta.

A coleta de amostras de saliva foi realizada antes do intervalo de aulas das

crianças, através de uma espátula de madeira de acordo com o que foi descrito por

KÖHLER & BRATTHAL (1979). O procedimento consiste em cerca de 30 mm da

ponta de uma espátula de madeira de 150x130 mm é introduzida na boca das

crianças e pressionada 10 (dez) vezes (cinco vezes de cada lado) sobre o dorso da

língua (Figura 4). Ao retirar a espátula pediu-se aos participantes da pesquisa que

fechasse os lábios, não encostando os dentes, com a finalidade de reter os

excessos de saliva na espátula.

Figura 4 – Coleta de amostras de saliva com espátula de madeira

Logo após a coleta da saliva, cada lado da espátula foi pressionado em uma

área diferente da superfície de ágar mitis-salivarius acrescido de sacarose (15%) e

bacitracina (0,2 U/mL), segundo GOLD, JORDAN, VAN HOUTE (1973), que é um

meio seletivo para streptococos do grupo mutans (Figura 5). Foi adicionado também

telurito de potássio a 1% (solução de Chapman) que também é um agente inibidor

do crescimento de outros microrganismos que não estreptococos do grupo mutans.

Metodologia

29

Figura 5 – Impressão da espátula no ágar mitis-salivarius em ambos os lados

Foi feita uma solução estoque da bacitracina e do telurito de potássio a 1%,

sendo estes esterilizados por filtração. O ágar autoclavado juntamente com a

sacarose foi resfriado até a temperatura de 45C, quando se adiciona então a

bacitracina e o telurito de potássio. O meio foi distribuído em placas do tipo Rodac

de 67x15 mm (Inlab-Interlab Distribuidora de Produtos Científicos Ltda, São

Paulo/SP), cuja base é quadriculada permitindo a contagem de colônias nas áreas

delimitadas por um quadrado (Figura 6).

Figura 6 – Placas do tipo Rodac de 67x15 mm (Inlab-Interlab Distribuidora de Produtos Científicos Ltda, São Paulo/SP)

Estas placas foram, em seguida, acondicionadas em jarras de anaerobiose

(Permition, Curitiba/PR) com chama de vela para a remoção do oxigênio e produção

de CO2, propício para o crescimento de EGM (Figura 7). O material foi incubado em

estufa a 37C, durante 48 horas.

Metodologia

30

Figura 7 – Jarra de anaerobiose (Permution, Curitiba/PR)

A contagem de colônias cuja morfologia era indicativa de pertencer aos

estreptococos do grupo mutans foi realizada por um único examinador, com o auxílio

de um contador de colônias (Phoenix-CP602) (Figura 8).

Figura 8 – Contador de colônias (Phoenix- CP602)

Foi selecionada para contagem, uma área de aproximadamente 1,5 cm2,

correspondente ao quadriculado das placas Rodac. A área escolhida era a que

apresentava maior quantidade de colônias de EGM. A média das unidades

formadoras de colônias (UFC) das contagens dos quadrados, referente à semeadura

dos dois lados da espátula, foi interpretada com base no critério descrito no Quadro

1, por KÖHLER & BRATTHAL (1979) e visualizada na (Figura 9).

Metodologia

31

Quadro 1 - Média de EGM em unidades formadoras de colônias (UFC) e a correlação com o risco de cárie dentária

Fonte: Köhler & Bratthal (1979)

Figura 9 – Exemplos de cultura de EGM após incubação representando pelo número de colônias baixo (A), médio (B) e alto (C) risco à cárie, segundo Köhler & Bratthal (1979)

4.7 SIALOMETRIA (FLUXO SALIVAR)

A fim de obter a melhor padronização possível das análises salivares, todas

as coletas foram realizadas no período da tarde entre as 14h00min e 16h00min,

seguindo os requisitos para a coleta padronizada da saliva total, citada

anteriormente.

Inicialmente, foi solicitado que a criança mastigasse uma película de Parafilm

“M” (Laboratory Film; American National Can. Chicago, IL) de aproximadamente

3x3cm, por 1 (um) minuto. Durante a mastigação, foi recomendado às crianças que

não engolissem a saliva e nem o Parafilm. Essa primeira porção de saliva foi

descartada. A seguir, foi acionado o cronômetro e solicitado que continuassem

mastigando a película de Parafilm durante três minutos. Os pacientes foram

instruídos a cuspir a saliva em intervalos regulares em uma proveta (Figura 10 A e

Figura 10 B).

C

0-20 UFC, equivalente a 0-104 UFC de EGM por mililitro de saliva, representando

baixo risco de cárie;

21-100 UFC, correspondente a 105-10

6 de EGM por mililitro de saliva, representando

médio risco de cárie;

100 UFC, equivalente a 106

UFC de EGM por mililitro de saliva, representando alto

risco de cárie.

Metodologia

32

Figura 10 – Película de parafilme utilizada para estímulo da salivação (A) e proveta (B) utilizada para a coleta da amostra salivar

Ao término do tempo estabelecido foi mensurado o volume de saliva total

coletado (não incluindo a espuma formada durante a coleta) e calculado o fluxo

salivar estimulado em ml/min. O valor obtido foi categorizado de acordo com Quadro

2:

Quadro 2 - Categorização do fluxo salivar estimulado em ml/min

Fonte: Krasse (1988)

4.8 COLETA PARA QUANTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS SALIVARES

Foi coletado 1 mL adicional de amostras de saliva total com seringas

descartáveis (BD, Brasil, volume de-3 mL).

Velocidade normal do fluxo salivar: 1-3 mL/min. Velocidade baixa do fluxo salivar: 0,7-0,9 Ml/min.

Velocidade muito baixa do fluxo salivar (Hipossalivação): menor que 0,7 ml/min.

Metodologia

33

As amostras obtidas foram identificadas, acondicionadas em sacos plásticos

individuais e armazenadas em caixa térmica submersas em gelo seco por no

máximo 3 horas; cujo principal objetivo foi a preservação do conteúdo salivar

evitando possível degradação das proteínas por bactérias até o transporte das

amostras ao laboratório da UNOPAR/PR.

No laboratório as amostras salivares foram suspendidas em microtubos tipo

eppendorf de 1,5 mL, onde os mesmos foram pesados em uma balança digital semi-

analítica (Eletronic Balance/ MARK BEL Engineering) para equilíbrio durante a

centrifugação.

Figura 11 – Coleta da saliva por meio de seringa plástica descartável (BD, Brasil, volume de-3 mL), sendo as amostras acondicionadas em microtubos

As amostras pesavam entre 1.7-2.0 gramas. Amostras com menos de 1.7

gramas eram ressuspendidas em água destilada, através de pipetas calibradas

(Transferpette/Brand), atingindo assim a média de peso estabelecido.

Em seguida, essas amostras foram centrifugadas em uma centrífuga

refrigerada (Mikro 22 R/ Hettich Zentrifugen) durante 10 minutos a 4°C, em uma

velocidade de 10.000 rpm, a fim de eliminar debris celulares, evitando que micro-

resíduos sólidos dificultassem a aplicação no gel.

Foi retirado 100 µL de cada amostra, e aliquotadas em eppendorf de 1,5 mL.

Após a centrifugação as amostras foram mantidas em freezer a uma temperatura de

-20°C até o momento da liofilização.

No dia seguinte as amostras foram acondicionadas em grades de isopor, sem

retirá-las do freezer, para em seguida serem liofilizadas. A liofilização ocorreu

Metodologia

34

durante 48h (Liofilizador L 101/LIOBRAS, Brasil) com o intuito de concentrar as

proteínas salivares (Figura 12 (a) e Figura 12 (b)).

Figura 12 – (a) Aparelho Liofilizador (L 101/LIOBRAS) com amostras de saliva; (b) Amostra de saliva após centrifugação sendo liofilizada durante 48h

O ciclo de liofilização varia de acordo com o tipo da amostra e volume, mas

geralmente o processo caminha na velocidade de 1 mm por hora. Durante o

processo, o indicador de vácuo deve permanecer abaixo de 500 µHg, podendo

chegar até 50 µHg ao final do processo.

Após a liofilização, as amostras de saliva liofilizadas foram ressuspendidas

em 30 µL de solução tampão tris-HCl 50mM (pH 7.5), e acrescentado 50 µL da

solução desnaturante de SDS/DDT/azul de bromofenol (50mM). As mesmas foram

fervidas em banho-maria durante 1minuto (Figura 13).

Figura 13 – Amostras de saliva com tampão desnaturante após fervura

A B

Metodologia

35

Amostras de Lf (Lf bovina, Life Extension TM, Ft. Lauderdale, Florida.) e LZ (LZ

extraída de gema de ovo de galinha, USB, EUA) comerciais foram utilizadas como

controle ou padrão no gel de poliacrilamida para posterior quantificação das bandas

produzidas. Foi obtida uma amostra de 15 µL de Lf (solução na concentração de

1,5mg/mL) para 60 µL de tampão de amostra (62,5 mM tris-HCl, 20% glicerol, 2%

SDS, 5% β-mercaptoetanol – pH 6.8 e bromofenol).Para a amostra de LZ, 100 µL da

solução na concentração de 80mg/mL foi adicionada a 100 µL de tampão de

amostra.

Em seguida foi realizada análise pela eletroforese em gel de poliacrilamina –

(SDS/PAGE) na concentração de 15%, utilizando-se como base o método de

Laemmli,1970.

4.9 MÉTODO DE ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

(SDS-PAGE) PARA QUANTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS SALIVARES

(LF E LZ)

O equipamento de escolha para a eletroforese foi o de sistema vertical (Bio-

Rad/Miniprotean 3 cell/ 600 VDC/13W/USA), peça única para a execução dos géis.

Esse equipamento na maioria das vezes aceita géis pré-fabricados. Tem a vantagem

de que no mesmo equipamento pode-se usar dois géis em uma mesma corrida

eletroforética, estando estes na mesma unidade, pois o equipamento possui 2 (dois)

módulos de suporte (Anexo 1).

Para o preparo das soluções foi utilizada água destilada e base tris (glicina).

O tris Cl foi utilizado para indicar o pH das soluções. O preparo das mesmas está

descrito no (Anexo 2 ).

Em primeiro lugar pegou-se uma placa de vidro (Bio-Rad) retangular longa de

1.0 cm de espessura (placa espaçadora) e acoplou-a em outra placa de vidro (Bio-

Rad) mais curta, fazendo um conjunto. As duas placas (conjunto) foram deslizadas

na moldura de vazamento, mantendo a placa de vidro mais curta virada para frente.

Fecharam-se os bloqueios de pressão (alças laterais) para garantir a união das

placas de vidro (Anexo 3).

Metodologia

36

Com o conjunto de placas de vidro estabilizado no suporte de presilhas, o

passo seguinte foi o preparo do gel de separação e de empilhamento para a corrida

eletroforética.

Tabela 1 – Formulações utilizadas no preparo do gel de separação (15%) e gel de empilhamento (4%)

Soluções Gel de separação

(15%) Gel de Empilhamento

(4%)

A. tris 1.5 M (pH 8.8) 1250 µL

B. tris 0.5 M (pH 6.8)

C. Acrilamida de Amônio Bis (29,2% + 0,8%)

2500 µL

1250 µL 650 µL

D. H20 1180 µL 3050 µL

E. SDS 10% 50 µL 50 µL

F. PSA 10%

G. TEMED 100%

25 µL 5.0 µL

25 µL 10 µL

Fonte: Antunes, 2003

No preparo do gel de separação, o preparo da solução de monômero ocorre

através da combinação de vários reagentes como descritos na tabela 1; exceto PSA

(Persulfato de amônio) e TEMED. Esses dois últimos reagentes devem ser

adicionados nos últimos minutos, pois não podem entrar em contato com o ar,

devido à polimerização que se inicia logo que ambos são adicionados. Portanto, logo

que a mistura foi feita, deve-se injetar a solução na placa de vidro preparada.

As soluções A, C, D, E, F e G, descritos na tabela 1, foram misturadas nas

proporções indicadas. A solução foi cuidadosamente invertida para os moldes de

vidro previamente preparados, até faltar 1,5 cm para completar a placa. Este espaço

foi completado com água destilada para que durante a polimerização não formasse

menisco côncavo no gel. Assim, a polimerização foi realizada formando uma linha

horizontal no mesmo.

Em seguida preparou-se o gel de empilhamento (4%). As soluções B, C, D, E,

F e G, descritas na tabela 1, foram misturadas nas proporções indicadas. As

concentrações das soluções foram obtidas utilizando-se pipetas automáticas. Para a

adição da solução de gel de empilhamento foi retirada a solução de água destilada,

Metodologia

37

precedido de secagem com tiras de papel filtro (Melitta, Brasil), sendo preenchido

todo o espaço com a referente solução; tomando-se o cuidado para evitar a

formação de bolhas. Após a adição da solução, formando uma camada de 1,5cm de

altura, foi colocado um molde de acrílico (pente com 10 dentes de 1.0 cm), de

coloração verde, com o intuito de se modelar os slots (poços) onde foram aplicadas

as amostras (Figura 14).

Figura 14 – Moldagem dos slots após adição da solução de empilhamento

Aguardou-se a polimerização do gel durante 45 minutos à 1h. Neste

momento, retirou-se o pente cuidadosamente, preencheram-se os slots recém

formados com água destilada e retirou-se todo o conjunto do suporte incolor e das

presilhas verdes. A placa de vidro foi acondicionada em um saco plástico umedecido

internamente com água destilada para não desidratar o gel. O mesmo foi refrigerado

por uma noite, continuando a análise no dia seguinte.

As placas de vidro (conjunto) foram acondicionadas no reservatório da cuba

com o vidro especial virado para fora e o vidro comum virado para dentro. Travaram-

se as presilhas de segurança (Anexo 3).

Foi adicionada no reservatório uma quantidade suficiente de tampão de

corrida (Electrode Buffer) já diluído com SDS 10%, como descrito na tabela de

preparação das soluções (Anexo 2). Com o auxílio de uma bagueta, foi adicionado o

tampão no interior das duas placas de vidro até atingir o nível de ambas, até

completar a cuba, para promover o contato dos géis com os eletrodos.

As amostras foram aplicadas dentro de uma capela. Inicialmente aplicou-se 8

µL do padrão de peso molecular com as amostras das proteínas miosina (peso

molecular: 207,3), β-galactosina (peso molecular: 114,3), Albumina (peso molecular:

80), Ovalbumina (peso molecular: 53,0), Anidrase Carbônica (peso molecular: 35,7),

Metodologia

38

Saiber Tríplice (peso molecular: 29), Lisozima (peso molecular: 20) e Apotinina (peso

molecular: 7,1) - (Prestained SDS-PAGE/BioRad, catalog # 161-0318, EUA),sendo

depositadas no primeiro slot (primeira coluna da esquerda para a direita).

As amostras de saliva de crianças com cárie (segundo, terceiro e quarto slot –

20 µL) (da esquerda para a direita), e amostras de saliva de crianças sem cárie

(quinto, sexto e sétimo slot – 20 µL) (da esquerda para a direita) foram inseridas,

ficando os dois últimos slots (oitavo e nono slot) (da esquerda para a direita) para o

padrão de peso molecular da proteína LZ (peso molecular: 20) e Lf (peso molecular:

em torno de 76-80), sendo aplicados (20 µL em cada um dos slots) (Figura 15).

Figura 15 – Amostras de saliva aplicadas em gel de poliacrilamida a 15%, sendo o primeiro slot (primeira coluna da esquerda para a direita) marcadores de peso molecular, slots do meio (segunda coluna à sétima coluna da esquerda para direita) amostras de saliva cariada e não cariada, e os dois últimos slots (oitava e nona coluna da esquerda para a direita) amostras do padrão de peso molecular da LZ e Lf, respectivamente

Levou-se à capela um béquer com água destilada e outro béquer para

descarte dessa água, pois é necessário efetuar a lavagem da micro-seringa

(Hamilton Company/ Reno, Nevada – 100 µL) entre uma amostra e outra, lavando

cinco vezes com água destilada e uma vez com a própria amostra de acordo com a

orientação do fabricante. Evitando desse modo contaminação entre as amostras.

Utilizou-se um guia com o objetivo de padronizar cada amostra de saliva

diretamente no seu slot pré-determinado, facilitando o posicionamento correto da

micro-seringa, evitando assim possíveis furos nos slots (Figura 16).

Metodologia

39

Figura 16 – Guia conector com o objetivo de facilitar o posicionamento correto da micro-seringa, evitando furos nos slots

É importante identificar a placa onde foram aplicadas as amostras,

especificando corretamente cada slot para facilitar o processo de leitura do gel. Em

seguida retirou-se o guia (conector) e colocou-se a tampa conectada nos eletrodos,

encaixando corretamente os plugs nas cores vermelha e preta. Conectou-se a cuba

a uma fonte estabilizadora mantendo-se a 200 V. A amperagem foi fixada em 23mA

(Figura 17). A corrida eletroforética levou em torno de 4h.

Figura 17 – Fixação da constante de velocidade (V) em (200 v), e

amperagem (A) em 23mA

Em um recipiente plástico colocou-se a solução corante (Brillant Blue

Colloidal) e mergulhou a placa. Com a mesma mergulhada, tentou-se “deslocar” os

dois vidros, utilizando uma espátula apropriada, para remoção do gel. Foi verificado

se o corante cobriu totalmente o gel, e o mesmo permaneceu overnight nessa

solução.

Metodologia

40

Recolheu-se o corante em um frasco próprio para descarte, pois o mesmo

pode ser reutilizado inúmeras vezes. Lavou-se o gel em água destilada e deixou o

mesmo em solução descorante até completa descoloração, ocorrendo o

acentuamento da cor das bandas. Esse gel foi identificado e armazenado em água

destilada sob refrigeração, para em seguida serem fotografados e analisados. O

mesmo procedimento ocorreu com todas as amostras de saliva.

A leitura e interpretação dos resultados dos géis de poliacrilamida foram

realizadas utilizando-se o programa LabImage L-PIX (H.E) 1D-L340 (Loccus

Biotecnologia, Brasil).

O programa L-PIX/H.E é um sistema de fotodocumentação e análise digital de

géis de eletroforese em tempo real. Captura a imagem digital gravados

eletronicamente, cuja imagem é impressa na forma de arquivo. Através dessa

imagem impressa, as bandas referentes às amostras de saliva (cariados e não

cariados) são localizadas de acordo com o peso molecular e com a intensidade

(maior grau de conversão dos pixels), verificando desse modo a presença ou

ausência das proteínas Lf e LZ nas amostras de saliva. A quantificação das bandas,

em relação ao volume das mesmas (expressividade) é dada através da calibração

por volume em mg/L, de acordo com o volume inserido nas amostras padrão de Lf e

LZ (Figura 18).

Metodologia

41

Figura 18 – Imagem do gel de poliacrilamida em A, após escaneamento. Na esquerda

estão os pesos moleculares do marcador e na direita os pesos moleculares dos

padrões de lisozima e lactoferrina. Em B e C observa-se a imagem após a aplicação

no software (L-PIX (H.E) 1D-L340 (Loccus Biotecnologia), referente à localização das

bandas das amostras de saliva de crianças com dentes cariados (B) e não cariados

(C), em relação à quantificação da proteína Lf e LZ, de acordo com a intensidade e

posicionamento dos pixels.

CARIADO NÃO CARIADO

Lf (76-80 kDa)

LZ (20 kDa)

202

115 98

51

37

20

A

B C

Metodologia

42

4.10 AVALIAÇÃO DO ÍNDICE DE PLACA (IHOS)

A avaliação da higiene bucal das crianças foi realizada sob luz natural por

um único examinador, através do Índice de Higiene Oral Simplificado (IHOS)1,

sendo utilizados o espelho bucal e a sonda (IPC)2 (Figura 19). Durante o

exame o paciente permanecia sentado em uma cadeira e a examinadora ficou

em pé, posicionada ao lado do examinado.

Figura 19 – Sonda IPC

Fonte: Bassani e Lunardelli, 2006

O índice tem a capacidade de mensurar a presença de placa na superfície

vestibular do dente 54 ou (14), vestibular do dente 61 ou (21), lingual do dente 75 ou

(35) e vestibular do dente 82 ou (42), mediante evidenciação com o corante fucsina

a 2% (Figura 20).

Figura 20 – Aplicação do corante fucsina 2% para evidenciação de biofilme dental nos dentes 21 e 42

1 Somente os dentes totalmente erupcionados (aqueles que tenham atingido a linha oclusal) foram

considerados para análise, bem como a dentição permanente. 2 Sonda leve, preconizada pela OMS. Apresenta uma ponta esférica de 0,5 mm uma faixa preta entre

3,5 e 5,5 mm. e anéis de 8,5 e 11,5 mm.de distância da ponta esférica.

Metodologia

43

Os escores para o índice de placa bacteriana (índice de Higiene Oral

Simplificado – IHOS) variaram de zero a três (GREENE & VERMILLION,1964)

(Quadro 3 – Figura 21); onde cada superfície do dente recebeu um código (Apêndice

4), sendo que o resultado final do IHOS foi dado a partir da soma dos códigos de

cada dente dividida pelo total de dentes examinados.

Para a categorização dos dados, as médias obtidas entre 0 e 1

corresponderam à higiene bucal satisfatória; de 1,1 a 2 regular; e de 2,1 a 3

deficiente (PINTO, 2003). Após este procedimento foi realizada a instrução de

higiene oral e escovação (Figura 22). Foi distribuído um kit de higiene contendo uma

escova dental e um creme dental para cada participante da pesquisa.

Quadro 3 - Códigos (escores) para o índice de placa bacteriana (Índice de Higiene Oral Simplificado – IHOS)

Fonte: Greene & Vermillion, 1964

Fonte:< http://www.whocollab.od.mah.se/index.html >

Figura 21 – Ilustração dos códigos do Índice de Higiene Oral Simplificado

Figura 22 – Instrução de Higiene Oral e escovação

0 - Não há induto; 1 - induto cobrindo até 1/3 da superfície ou mancha extrínseca; 2 - induto cobrindo mais de 1/3 até 2/3 da superfície do dente; 3 - induto cobrindo mais de 2/3 da superfície do dente.

Metodologia

44

4.11 AVALIAÇÃO DA EXPERIÊNCIA DE CÁRIE (ÍNDICE CPO-D)

As crianças foram examinadas no laboratório da escola, sob iluminação

natural. Utilizou-se apenas uma cadeira para ser feito a avaliação, onde cada criança

ficava com a cabeça apoiada para trás. Os dentes foram secos com uma gaze e o

exame visual conduzido com o auxílio de um espelho plano. Em caso de dúvida, a

superfície foi investigada com sonda exploradora de ponta romba (Figura 23).

Figura 23 – Superfície dental sendo investigada com sonda exploradora de ponta romba

Os critérios de diagnóstico de cárie foram considerados com base na

Organização Mundial da Saúde (OMS-WHO,1997) (Quadro 4) para determinar o

índice CPO-D (número de dentes permanentes cariados, perdidos ou obturados).

Os dados foram anotados em uma ficha clínica individual (Apêndice 5)

composta por um odontograma com códigos propostos pela (OMS-

WHO,1997),sendo este uma adaptação dos métodos básicos recomendados pela

(OMS-WHO,1999) de acordo com a tabela abaixo (Tabela 2).

Metodologia

45

Tabela 2 – Critérios utilizados para a determinação de cárie

CODIFICAÇÃO

PARA COROA DE DENTES CONDIÇÃO / ESTADO

0 Hígido 1 Cariado

1A Cárie evidente 1B Cárie incipiente 1C Cárie duvidosa 2 Restaurada, com cárie 3 Restaurada, sem cárie 4 Ausente, devido à cárie 5 Ausente, por outros motivos 6 Suporte para prótese, coroa protética 7 Traumatismo (fratura) 8 Selante de fissura 9 Permanente não erupcionado

Fonte: OMS,1999

Para a análise da atividade de cárie, os resultados foram categorizados em

dois grupos: Grupo 1 - indivíduos que apresentavam dentes cariados (CPO-D ≥1) e

Grupo 2 - indivíduos que não apresentavam dentes cariados (CPO-D=0). Em relação

à experiência de cárie, os voluntários do Grupo 1 foram subdivididos em indivíduos

que apresentavam dentes cariados (com lesão ativa), indivíduos que apresentavam

dentes restaurados sem cárie, e indivíduos que apresentavam dentes restaurados

com cárie.

Foram considerados cariados somente os dentes que apresentavam

cavitação (cárie ativa); os dentes selados e as lesões de manchas brancas foram

considerados hígidos, de acordo com a OMS/WHO.

Metodologia

46

Quadro 4 – Critérios utilizados para o diagnóstico de cárie

Fonte: OMS-WHO, 1997 sendo este modificado em relação à lesão de mancha branca e selante de fissura, sendo considerados como coroa hígida, de acordo com a OMS/WHO, 1999.

0 – Coroa hígida: esmalte de cor normal, sem evidência de lesões de cárie tratadas ou não; sulcos e fissuras pigmentados pela aplicação de saforide, na ausência de cavidade. Coroa cariada 1 A- Cárie evidente: coroa com lesão evidente, evidência clínica de cavitação 1 B- Cárie incipiente: quando existe mancha branca, opaca, rugosa e crivo 1 C- Cárie duvidosa: quando a lesão é de interpretação duvidosa entre um defeito de estrutura e uma lesão cariosa 2 - Coroa restaurada, com cárie: coroa com restauração permanente, apresentando lesão cariosa em um ou mais pontos da coroa; dente com restauração provisória (à base de ZOE, Ionômero), mas também cariado 3 - Coroa restaurada, sem cárie: dente com material restaurador permanente (Ionômero, resina, amálgama) sem a presença de lesão cariosa em ponto algum da coroa

4 - Ausente, devido à cárie

5 - Ausente, por outros motivos (traumatismo, esfoliação fisiológica, agenesia, etc.)

6 - Suporte para prótese

7 - Traumatismo: fratura

8 - Selante de fissura: dentes nos quais foi colocado um selante de fissuras na superfície oclusal; ou para os dentes nos quais a fissura oclusal foi amplamente aumentada por uma broca esférica ou “em chama de vela”, com aplicação de resina composta. Caso um dente com selante esteja cariado, ele deveria ser codificado como 1.

Cárie ativa: pigmentação clara Cárie inativa: pigmentação escurecida


Resultados

5.1 Análise Descritiva da Amostra

as 80 crianças examinadas, foram adotados como fatores clínicos de análise

o índice de placa (biofilme bacteriano) (IHOS) e o índice de cárie CPO-D. Os

fatores salivares avaliados foram o fluxo salivar, os níveis salivares de

estreptococos do grupo mutans (EGM) através do número de unidades formadoras de

colônias (UFCs) e os níveis das proteínas lactoferrina e lisozima, obtidos através da

coleta de saliva. Todas as crianças tinham 12 anos de idade.

As faixas de valores agrupados em cada variável foram estabelecidas pela

literatura, nos índices pré-determinados, com exceção da proteína lisozima,

estabelecido neste trabalho.

O gênero está expresso na tabela 3, onde observa-se 28 (35%) pacientes do

sexo masculino e 52 (65%) do sexo feminino. Observou-se uma maior percentagem

para o gênero feminino.

Tabela 3 – Características da amostra em relação ao gênero

Variável Freqüência (%)

Gênero da criança Masc 28 (35)

52 (65) Fem

Total 80 (100)

A avaliação das condições bucais baseada na experiência de cárie dentária,

segundo critérios da (OMS/WHO,1997), foi realizada através do Índice CPO-D. No

presente estudo foi observada a média para o CPO-D= 2,09, sendo, de um modo geral,

o índice composto por um dente cariado e um dente restaurado.

NN

Análise Estatística e Descritiva dos Resultados 48

Foi realizada a divisão da população de estudo em dois grupos: Grupo 1-

indivíduos que apresentavam experiência de cárie (CPO-D ≥1) e Grupo 2- indivíduos

que não apresentavam experiência de cárie (CPO-D=0). Os voluntários do Grupo 1

abrangeram os indivíduos que apresentavam dentes cariados (com lesão ativa),

indivíduos que apresentavam dentes restaurados com cárie (lesão ativa), e indivíduos

que apresentavam dentes restaurados sem cárie (tabela 4).

Outra análise separou os grupos em A e B, através da atividade de cárie, onde o

grupo A incluiu os indivíduos cárie-ativos (dentes cariados e restaurados com cárie) e

grupo B incluindo os cárie-inativos (dentes hígidos e restaurados) (tabela 4).

Tabela 4 – Distribuição da amostra de acordo com a experiência de cárie

Cárie Freqüência (%)

Experiência de cárie Sim (grupo 1) Não (grupo 2)

53 (63,3) 27 (33,8)

Atividade de cárie Ativo (grupo A) Inativo (grupo B)

33 (41,3) 47 (58,8)

Tabela 5 – Distribuição da amostra de acordo com a avaliação dos níveis salivares de EGM

UFCs Número de UFCs Freqüência (%)

Amostra

Total

0 – 20

21 – 100

> 100

16 (20,0)

43 (53,8)

21 (26,3)

80 (100,0)

A avaliação dos níveis salivares de EGM classificou os escolares em alto (> 100

UFC/mL), médio (21-100 UFC/mL) e baixo (0-20 UFC/mL) risco à cárie através da

contagem de estreptococos do grupo mutans. Na população estudada, encontrou-se

em 53,8% dos voluntários média contagem de EGM e os demais apresentaram, 20% e

26,3%, respectivamente, baixa e alta contagem de EGM (tabela 5).


O fluxo salivar (sialometria) foi classificado em muito baixo (< 0,7 mL/min), baixo

(0,7-0,9 mL/min) e normal (1-2,9 mL/min). Foi encontrado fluxo salivar baixo e muito

baixo em apenas 12,5% e 2,5% da amostra, respectivamente. A grande maioria dos

voluntários apresentou fluxo salivar normal (48,8%) e 29 crianças (36,3%)

apresentaram hiper-salivação (> 3 mL/min) (tabela 6).

Tabela 6 – Distribuição da amostra de acordo com a avaliação do fluxo salivar (sialometria)

Quantidade de

Fluxo

Resultado do

índice (mL/min)

Freqüência (%)

Fluxo < 0,7

0,7-0,9

1-2,9

>3

2 (2,5)

10 (12,5)

39 (48,8)

29 (36,3)

Total 80 (100,0)

Quanto ao índice de higiene oral simplificado (IHOS), a higiene dos voluntários

foi classificada em satisfatória (0 - 1), regular (1,1 - 2), deficiente (2,1 - 3). De acordo

com a pesquisa foi verificado que 48,8% dos escolares tinham uma higiene regular,

26,3% possuiam boa e 25% apresentaram uma higiene ruim. Nenhum dos

participantes mostrou higiene muito ruim, ou maior que 3 (tabela 7).

Com relação às proteínas salivares, a Lf esteve ausente na saliva de 44

voluntários e presente em 36 participantes do estudo (tabela 8). A LZ esteve presente

em todos os participantes em diferentes concentrações, estando presente em

concentrações menores que 81,55 mg/mL em 24 voluntários, 28 voluntários

apresentaram concentrações entre 81,56 mg/mL a 91,55 mg/mL, e 28 voluntários

apresentaram concentrações maiores que 91,56 mg/mL (tabela 9).


Tabela 7 – Distribuição de indivíduos em relação à quantidade de placa bacteriana (IHOS)

Quantidade de

placa bacteriana

Resultado do

índice

Freqüência (%)

IHOS

Total

0 – 1,0

1,1 – 2,0

2,1 – 3,0

21 (26,3)

39 (48,8)

20 ( 25,0)

80 (100,0)

Tabela 8 – Distribuição de indivíduos em relação à presença ou ausência de lactoferrina

Lf Freqüência (%)

Presente

Ausente

Total

44 (55)

36 (45)

80 (100)

Tabela 9 – Distribuição de indivíduos em relação à concentração de lisozima

LZ Concentração Freqüência (%)

LZ

Total

<81,55 mg/mL

81,56-91,55 mg/mL

>91,56 mg/mL

24 (30,0)

28 (35,0)

28 (35,0)

80 (100,0)


5.2 Análise estatística

Uma vez realizada a coleta dos dados, os mesmos foram codificados para todas

as variáveis e categorias estudadas, possibilitando a elaboração de um banco de

dados, no programa Statistical Package for Social Sciences 15.0 (SPSS, Londres,

Reino Unido), assumindo nível de significância de 5% (p0,05) para os testes

aplicados. Foi considerada como variável dependente a experiência e atividade de

cárie, medidas pelo índice CPO-D e seus componentes. Utilizou-se inicialmente a

comparação dos grupos de crianças com cárie e sem cárie e suas diferenças em

relação às demais variáveis, através do teste de variância, Kruskall-Wallis (para

avaliação entre dois grupos) e Mann-Whithney (em avaliação para mais de dois

grupos). Foram utilizados escores para contagem de estreptococos do grupo mutans

(EGM), fluxo salivar, índice de placa (IHOS) e quantificação das proteínas (LZ e Lf).

Para se avaliar a experiência de cárie quanto ao gênero, os indivíduos de CPO-

D=0 foram comparados com todos os demais indivíduos de CPO-D≥1 ( indivíduos com

dentes cariados, dentes restaurados sem cárie e dentes restaurados com cárie). O

teste de Mann-Whithney não mostrou diferença entre os grupos para o gênero dos

pacientes (p=0,399). O CPO-D médio foi de 2,43 para o gênero masculino, e 1,9 para o

gênero feminino, sendo o componente restaurado o mais expressivo (tabela 10).

Tabela 10 – Valores médios do índice CPO-D e seus componentes distribuídos por gênero

Sexo

(Gênero)

CPO-D

Componente

cariado

Componente

restaurado

cariado

Componente

restaurado

Masculino

Feminino

2,43

1,90

0,57

0,77

0,04

0,00

1,39

1,08

*p= 0,399


O teste de KrusKall-Wallis não identificou diferença estatisticamente significante

entre o índice CPO-D médio (p=0,496), ou seus componentes de dentes restaurados e

cariados (p=0,245), ou dentes apenas restaurados (p=0,900) e a contagem de EGM.

Entretanto, constataram-se maiores contagens de EGM no componente do índice

CPO-D dentes cariados (lesão ativa) estatisticamente significantes (p=0,031) (tabela

11).

Tabela 11 – Valores médios do índice CPO-D e seus componentes distribuídos por

contagem de EGM

EGM

(Número de

UFCs)

CPO-D

Componente

cariado

Componente

restaurado

cariado

Componente

restaurado

0 – 20

21 – 100

> 100

2,25

1,93

2,29

0,44

0,56

1,19*

0,00

0,00

0,05

1,63

1,12

1,00

*p=0,031

Não se observou diferença estatística quanto ao índice de placa (IHOS) para o

índice CPO-D (p=0,178) a partir do teste de Kruskall-Wallis, nem para os seus

componentes de dentes cariados (p=0,412), restaurados e cariados (p=0,591), ou

apenas restaurados (p=0,101) (tabela 12).

Tabela 12 – Valores médios do índice CPO-D e seus componentes distribuídos pela classificação do IHOS

IHOS

Resultado do

índice

CPO-D

Componente

cariado

Componente

restaurado

cariado

Componente

restaurado

0 – 1

1,1 – 2

2,1-3

1,71

1,72

3,20

0,67

0,54

1,05

0,00

0,03

0,00

0,86

1,03

1,85


O teste de Kruskall-Wallis tampouco identificou diferença significante entre o

fluxo salivar para o índice CPO-D (p=0,946), e seus componentes de dentes cariados

(p=0,852), restaurados e cariados (p=0,789), ou apenas restaurados (p=0,894) (tabela

13).

Tabela 13 – Valores médios do índice CPO-D e seus componentes distribuídos pela

classificação do fluxo salivar (sialometria)

Fluxo Salivar

Resultado do

índice

CPO-D

Componente

cariado

Componente

restaurado

cariado

Componente

restaurado

< 0,7

0,7-0,9

1-2,9

>3

2,00

2,50

2,18

1,83

1,00

0,90

0,62

0,72

0,00

0,00

0,03

0,00

1,00

1,50

1,36

0,86

Com relação à presença das proteínas salivares, o teste de Mann-Whithney não

identificou diferença significante entre a concentração de Lf na saliva e o índice CPO-D

(p=0,057). Não houve diferença também para os seus componentes dentes cariados

(p=0,169), e restaurados e cariados (p=0,269). Entretanto, foi constatado uma maior

expressividade desta enzima nas crianças com maisdentes restaurados (p=0,016)

(tabela 14).


presença ou ausência da proteína Lf

Lf

(Presença

ou ausência)

CPO-D

Componente

cariado

Componente

restaurado

cariado

Componente

restaurado

Presença

Ausência

2,75

1,55

0,83

0,59

0,03

0,00

1,75*

0,73

*p=0,016


Com relação à concentração de LZ na saliva da amostra, o teste de Kruskall-

Wallis não identificou diferença para o índice CPO-D (p=0,382), nem para seus

componentes de dentes cariados (p=0,324), restaurados e cariados (p=0,395) e

apenas restaurados (p=0,594) (tabela 15).


classificação atribuída à concentração da proteína LZ

LZ

concentração

CPO-D

Componente

cariado

Componente

restaurado

cariado

Componente

restaurado

<81,55 mg/mL

81,56-91,55

mg/mL

>91,56 mg/mL

2,79

1,96

1,61

0,96

0,64

0,54

0,00

0,00

0,04

1,58

1,18

0,86

O teste de Pearson foi empregado para confirmar possíveis correlações entre os

dados (tabela 16).

Tabela 16 – Resultados obtidos para a correlação de Pearson (r) entre o índice CPO-D e

seus componentes e demais variáveis

Variáveis CPO-D

Componente

cariado

Componente

restaurado

cariado

Componente

restaurado

EGM - Número de UFCs

IHOS

Fluxo salivar

Lf

LZ

-

0,359(**)

-

0,245(*)

-

0,288(**)

0,244(*)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

0,349(**)

-

0,297(**)

-

(**) Correlação de significância de 0,01

(*) Correlação de significância de 0,05


Por meio do teste de Pearson foi possível observar correlação positiva entre o

índice CPO-D e, índice de placa (IHOS) e CPO-D e a presença da proteína Lf.

Para o componente cariado, obteve-se correlação positiva para contagem de

EGM e placa (IHOS). Já para o elemento restaurado, houve correlação positiva com a

proteína Lf e placa (IHOS).

Avaliando-se as demais variáveis entre si, observou-se a correlação positiva

entre o índice IHOS e a concentração da proteína lactoferrina pelo teste de Pearson

(coeficiente =0,287, p=0,01), resultados expressos na (tabela 17).

Tabela 17 – Correlação entre todas as variáveis e a proteína lactoferrina

Variáveis Lf

CPO-D

CPO-D cariado

CPO-D restaurado cariado

CPO-D restaurado

EGM - Número de UFCs

IHOS

Fluxo salivar

LZ

0,245(*)

-

-

0,297(**)

-

0,287(**)

-

-

(**) Correlação de significância de 0,01

(*) Correlação de significância de 0,05


Discussão

6.1 DISCUSSÃO

cárie dentária é uma doença infecciosa, de etiologia multifatorial, resultante

de um desequilíbrio entre os processos de desmineralização e

remineralização do esmalte (FEJERSKOV,1998), processos estes que

dependem do fluxo e capacidade tampão da saliva, “quantidade e qualidade do biofilme

bacteriano” e quantidade e freqüência do consumo de açúcar (MALTZ,2000;

THYLSTRUP & FEJERSKOV,1995).

Além de tais fatores, é de suma importância verificar a relação da composição e

secreção da saliva, bem como sua disponibilidade, uma vez que de acordo com

Thylstrup, Fejerskov (1995), parecem ser fatores relevantes na etiopatogênese e

progressão da cárie influenciando desse modo o ambiente intrabucal (VAN NIEUW

AMERONGEN, BOLSCHER, VEEMAN,2004).

Todas as estruturas presentes na cavidade bucal são banhadas pela saliva,

que é o produto de secreção das glândulas salivares maiores – parótidas,

submandibulares e sublinguais -; menores e do fluido crevicular. Sua composição é

feita, basicamente de água (99%), matéria orgânica e inorgânica. Contêm ainda,

bactérias, células epiteliais descamadas e resíduos alimentares presentes na cavidade

bucal. A saliva desempenha importantes funções na manutenção da saúde bucal,

destacando-se a digestão, lubrificação dos tecidos duros e moles da cavidade bucal,

diluição das substâncias introduzidas na boca e subseqüente remoção, neutralização e

tamponamento dos ácidos dos alimentos ou produzidos pela placa bacteriana,

saturação em relação aos constituintes dos dentes, o que possibilita interferir no

processo de desmineralização, remineralização e efeito antimicrobiano (EDGAR,1992).

Entre os fatores protetores da saliva, o efeito limpante (“clearance”) do fluxo

salivar é um dos mais importantes. Sua atuação remove microrganismos endógenos,

AA

Discussão 57

exógenos e seus produtos para o intestino. Além disso, uma quantidade constante do

fluído garante a presença de fatores antimicrobianos imunológicos e não imunológicos

na boca (TENOVUO,1998).

Sabe-se de acordo com (Thylstrup & Fejerskov,1995) que as superfícies da

cavidade bucal são constantemente colonizadas por microrganismos. Esses

microrganismos constituem uma microbiota muito complexa que, por si só, não resulta

em doença, visto que eles existem em equilíbrio com o hospedeiro. Como essa

microbiota está sob influência de componentes específicos e não específicos do

sistema imunológico secretor, ou seja, proteínas antimicrobianas, (LEONE,

OPPENHEIM,2001; FEJERSKOV,1998; KIDD & FEJERSKOV,2004; FEJERSKOV &

KIDD,2006, TENOVUO,1998) a principal função de tais proteínas é a de limitar a

colonização microbiana das superfícies bucais e prevenir a penetração de substâncias

nocivas nestas superfícies, evitando-se assim danos aos tecidos subjacentes.

Van Nieuw Amerongen, Bolscher, Veeman (2004) relacionam como proteínas

salivares antimicrobianas a lisozima, lactoferrina, lactoperoxidase, aglutininas, mucina,

histatina, cistatina e imunoglobulinas (anticorpos específicos), dando ênfase especial

às quatro primeiras.

Vários autores observaram efeito antibacteriano destas enzimas (Cole et al.,

1976, Weinberg, 1978, Lassiter et al.,1987, Arnold, Cole, Mcghee,1980, Jenssen,

Hancick,2008). Podem interferir no desenvolvimento do biofilme dental, inibindo a

adesão de S. mutans (OHO, MITOMA, KOGA,2002) ou modulando a agregação das

bactérias planctônicas na forma de biofilme (SINGH et al., 2002, FRANCESCA et

al.,2004). Outros estudos mostram efeitos antivirais (MULLER et al.,1992; HARMSEN

et al.,1995; VAN DER STRATE et al.,2001) e antifúngicos (SAMARANAYAKE et al.

2001; BERKHOUT et al.,2002; LUPETTI et al.,2003). Achados como estes podem

fornecer subsídios para a importância destas na etiopatogênese da cárie dentária

(ORSI,2004; FINE, FURGAN, BEYDOWIN,2002).

Foi devido a tais informações que se pretendeu avaliar uma possível associação

entre experiência e atividade de cárie, quantidade de biofilme dentário, contagem de

esteptococos do grupo mutans, fluxo salivar e padrão de expressão das proteínas

salivares especificamente (Lf e LZ) em amostras de saliva de pacientes com cárie e

sem cárie; uma vez que todos esses fatores interagem-se entre si.

Discussão 58

Nos últimos 10 anos houve um avanço exponencial a respeito de testes

salivares, como método de diagnóstico descrevendo o uso da saliva total a fim de

monitorar doenças sistêmicas e bucais (STREKFUS, BIGLER,2002), reforçando relatos

de (KAUFMAN, LAMSTER,2002).

Também corroboram Dawes (1993); Lima (1999) e Moura (2004), que

consideram que as propriedades biológicas da saliva estão relacionadas à mistura de

fluídos orais e seus conteúdos, motivo pelo qual se tem incrementado o uso da saliva

total nas pesquisas representando assim um meio confiável para se avaliar a

composição da microbiota bucal.

Dentre as diversas possibilidades de uso da saliva como meio de diagnóstico,

pode-se citar a sua utilização nas medidas de risco de cárie utilizando a mensuração

do fluxo salivar, capacidade tampão, potencial hidrogeniônico (pH) e para contagem de

microrganismos, particularmente o Streptococus mutans ( DAWES,1993, DEZAN et al.,

2002, SEGURA et al., 2006, BOTELHO et al., 2007).

A facilidade de coleta da saliva, bem como o fato de oferecer menor risco de

contaminação para o operador quando do manuseio da mesma, representam aspectos

importantes para subsidiar a escolha da mesma como meio de diagnóstico. Aliado a

isso, os estudos realizados comparando resultados dos testes salivares com outros

métodos de credibilidade científica comprovada, como dosagens sanguíneas de

substâncias, têm tornado o método confiável e, portanto com sua aplicabilidade

validada (MOURA,2004).

Levando em consideração os relatos mencionados; utilizamos para a referente

pesquisa, o uso da saliva total como meio de diagnóstico. Para que fosse realizada

uma coleta da saliva total padronizada foram utilizados os requisitos de LIMA (1999) e

FRANCO (2004), como não ter ingerido nenhum tipo de alimento ou bebida (exceto

água) durante o período de duas horas que antecedia a coleta; não ter fumado; não ter

sido submetido à grande estresse físico antes da coleta; no momento da coleta o

paciente deveria sentar-se em posição relaxada em uma cadeira comum (não

odontológica) e de olhos abertos e mastigar o pedaço de parafilme alternando-o entre

os lados direito e esquerdo da boca durante o tempo determinado pelo pesquisador

que fazia o controle do tempo da coleta, sendo esta realizada no período da tarde.

Discussão 59

Uma vez que a lisozima provêm das glândulas salivares maiores e menores, do

fluído do sulco gengival e dos leucócitos salivares (ARNOLD, COLE, MCGHEE,1980) e

a lactoferrina pelas células serosas das glândulas salivares maiores e menores

(WARD, URIBE-LUNA, CONNEELEY,2002), favoreceu ainda mais a confirmação da

escolha do uso de saliva total na referente pesquisa.

A coleta da saliva pode ser feita de forma estimulada e não estimulada. A forma

estimulada pode ser realizada de maneira mecânica (goma de mascar, parafina, látex)

ou através de produtos químicos (ácido cítrico). A forma não estimulada é aquela que

não possui estímulos exógenos, onde o fluxo salivar pode ser alterado apenas por

estímulos olfatórios, exposição à luminosidade, posicionamento do corpo e ciclo

circadiano (KAUFMAN, LAMSTER,2002).

Existem diferenças na composição salivar entre as diversas glândulas quando

relacionadas ao tipo de estímulo utilizado, conforme mencionado por JENKINS (1978).

O mesmo relata que a glândula parótida contribui com aproximadamente 10%

do volume salivar quando em saliva total não estimulada. No entanto produz parte

significante da saliva estimulada. Dessa forma, a saliva estimulada é quase que

totalmente representativa do tipo de secreção produzida pelas parótidas. Medidas de

variação de fluxo das diferentes glândulas mostram que a submandibular produz maior

fluxo em condição de repouso, porém quando o fluxo é estimulado a parótida é a mais

responsiva que a submandibular (JENKINS,1978).

De acordo com Whelton (1996) a composição média da saliva não estimulada é

formada por 99,4% de água e 0,6% de componentes sólidos, enquanto a saliva

estimulada é composta por 99,5% de água e 0,5% de elementos sólidos. Seus

constituintes variam de acordo com o fluxo, natureza da estimulação, duração,

composição do plasma, à hora do dia na qual as amostras são coletadas

(NEWBRUM,1988). De qualquer forma, a diferença percentual entre ambas é muito

discreta e provavelmente exerceu pouca influência nos resultados do presente estudo.

A composição salivar sofre variações em função da velocidade do fluxo salivar, e

este está intimamente relacionado ao tipo, intensidade de duração do estímulo utilizado

na obtenção da amostra. Há também alterações significativas na composição salivar

em diferentes indivíduos e no mesmo indivíduo sob diferentes circunstâncias

Discussão 60

(JENKINS,1978). No entanto, a velocidade do fluxo salivar é considerada o principal

fator que afeta a composição salivar (TENOVUO, LAGERLÖF,1995).

Entre os fatores que afetam a velocidade do fluxo, intensidade e composição

pode-se citar o ciclo circadiano. O fluxo salivar atinge seu pico no final da tarde e é

praticamente nulo durante o sono. (EDGAR, O’MULLANE,1996). A secreção salivar é

menor à noite em relação à secreção diurna. Todavia, a concentração de proteínas é

maior à tarde (DOUGLAS,1998), o que pode ter favorecido a detecção das proteínas

avaliadas neste estudo. Buscando a padronização, as coletas foram feitas neste

período da tarde em um intervalo de duas a três horas, de maneira semelhante para os

grupos com cárie e sem cárie.

Além do ciclo circadiano, o tempo de duração do estímulo também afeta o teor

das substâncias da saliva. Caso a estimulação persista por muito tempo, a

concentração das substâncias na saliva tendem a diminuir (DOUGLAS,1998). O tempo

de estimulação utilizado neste estudo foi de um minuto.

O esforço físico contribui destacadamente para modificar a composição

eletrolítica e osmolar, bem como o volume salivar (DOUGLAS,1998), para tal, as

coletas foram realizadas antes do intervalo de aulas das crianças. Oliveira et al., 2005

relatam que além da atividade aumentada da alfa-amilase na saliva total de suas

amostras, a concentração da mesma na saliva aumenta progressivamente com a

intensidade do exercício.

Idade e sexo são fatores que também alteram o volume da saliva. O ápice da

produção salivar ocorre entre os 6 e 14 anos de idade, declinando a partir dos 20 até

os 60 anos, quando a produção total é cerca de 0,025 a 0,034 mL/min. (TOMASSI,

LIMA,2002). Banderas-Tarabay et al. (2002) encontraram um fluxo médio de 0,397

mL/min em 120 pacientes saudáveis de 17 a 24 anos. Entretanto, na literatura

científica, há controvérsias com relação à interferência da idade em relação ao fluxo

salivar, pois vários fatores secundários, tais como: a utilização de próteses,

edentulismo total ou parcial, tonicidade muscular, uso de medicamentos, doenças

inerentes aos pacientes geriátricos, colaboração do paciente em realizar a coleta da

saliva, interferem na velocidade do fluxo salivar e é imprescindível que sejam

considerados quando se avalia epidemiologicamente a velocidade do fluxo salivar

(VISSINK et al.,1988; PANKHURST et al.,1996; ATKINSON e WU,1994). Neste estudo,

Discussão 61

o fluxo médio foi de 2,58 mL em 3 minutos, ou 0,861 mL/min, para crianças com 12

anos de idade, concordando com as observações anteriores.

Utilizando-se ainda como base o estudo de Banderas-Tarabay et al. (2002) que

avaliaram o fluxo salivar e a concentração de proteínas na saliva total humana não

estimulada, verificaram que as mulheres apresentaram uma menor velocidade do fluxo

salivar e uma maior concentração de proteínas totais. Dezan et al. (2002) encontraram

uma tendência para fluxo aumentado nos bebês do sexo femino. Neste estudo, 65% da

população eram de meninas e não houve associação do sexo com fluxo salivar ou com

a concentração de proteínas salivares.

Determinadas doenças sistêmicas também podem comprometer o

funcionamento das glândulas salivares e conseqüentemente a produção de saliva,

influenciando tanto na quantidade de saliva produzida quanto na qualidade desses

fluídos. Uma vez que pode afetar os constituintes químicos e as propriedades físicas do

mesmo (RUDNEY,2000; PALMER et al.,2001).

O uso de determinados medicamentos como antidepressivos tricíclicos, os

antiparkisonianos, as fenotiazinas, as benzodiazepinas, os anticolinérgicos, os

antihipertensivos, os antihistamínicos, os antipsicóticos e os diuréticos reduzem a

velocidade do fluxo salivar (GARCÍA-POLA et al.,1999).

No caso do uso de medicamentos, foi aplicado um questionário entregue aos

pais/responsáveis legais com o objetivo de levantar dados retrospectivos à cerca de

problemas sistêmicos e uso de medicamentos (antiinflamatórios e antibióticos) que

pudessem vir a alterar o fluxo salivar, sendo estes casos não incluidos neste estudo.

Existem vários métodos para a quantificação de proteínas, nomeadamente o

método de Biureto, método Lowry, método Bradfort ou BG-250, método “BCA” ou

reagente de Smith, métodos de eletroforese dentre as quais a eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) e eletroforese bidimensional (2D-PAGE). Muitos métodos,

ao longo dos anos têm sido propostos, mas não existe uma metodologia considerada

de uso universal para todos os meios (ZAIA, ZAIA, LICHTIG,1998).

O método de Biureto, apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e

não apresentar grande variação da absorvidade específica para diferentes proteínas,

não é muito sensível, colocando-o em desvantagem. O método de Lowry apresenta

uma grande sensibilidade para proteínas, porém possui algumas desvantagens tais

Discussão 62

como: estar sujeito a muitos interferentes, apresentar longo tempo de análise, possuir

absortividade específica altamente variável para diferentes proteínas (ZAIA, ZAIA,

LICHTIG,1998).

Apesar do método de Bradfort ou BG-250 ser mais rápido, sensível e estar

sujeito a um número bem menor de interferências que o método de Lowry, o mesmo

apresenta algumas desvantagens tais como: variação da absortividade específica para

diferentes proteínas, devido à sua baixa solubilidade, ou baixo peso molecular das

mesmas, e fornecimento de resultados nem sempre reprodutíveis devido ao grau de

pureza do corante BG-250. O método “BCA” ou reagente de Smith tem a vantagem de

ser mais simples no preparo dos reagentes, sensível e relativamente rápido, porém

possui algumas desvantagens como a dependência da temperatura de incubação das

amostras, a variação da absortividade específica para diferentes proteínas e a variação

da absorbância com o tempo (ZAIA, ZAIA, LICHTIG,1998).

A eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida na presença de

dodecilsulfato de sódio (SDS) é um método unidimensional de separação muito

utilizado para análise de massas moleculares de proteínas oligoméricas, ou seja,

formada por mais de uma cadeia polipeptídea (ROCHA et al.,2005). O método fornece

uma maneira fácil de calcular o número de polipeptídeos em uma amostra, e assim

avaliar a complexidade desta (WESTERMEIER,1997).

Tem a capacidade de fornecer informações sobre os pesos moleculares das

proteínas e o padrão de massa molecular, ou seja, estrutura e organização das

subunidades das proteínas. É um método relativamente simples de usar e altamente

reprodutível. O seu uso mais comum é para análise qualitativa de misturas complexas

de proteínas (WESTERMEIER, 1997).

A eletroforese bidimensional (2D-PAGE), surgiu em 1975 com trabalhos de

O’FARREL; MACGILLIVRAY et al., KLOSE, onde utiliza-se como meio de separação

das proteínas o seu ponto isoelétrico e a mobilidade eletroforética (ROCHA et

al.,2005). Apesar de engenhosa a metodologia 2D-PAGE é muito trabalhosa,

demorada, difícil de ser reproduzida em diferentes laboratórios e depende da

habilidade do pesquisador para obtenção de resultados consistentes (PANDEY &

MANN,2000). Proteínas com pesos moleculares muito altos ou muito baixos não são

bem separadas nas eletroforeses 2D. Proteínas altamente hidrofóbicas e alcalinas

Discussão 63

também necessitam de métodos específicos de preparação das amostras (extração,

precipitação e solubilização). (GÖRG et al.,2000; HERBERT et al.,2001).

Como as bandas protéicas tendem a se sobrepor, os métodos unidimensionais

de separação como a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), podem

separar um número relativamente pequeno de proteínas (geralmente menos de 50). A

eletroforese bidimensional, ao combinar dois processos distintos de separação, pode

ser usada para separar mais de 1000 proteínas em um único gel, e o resultado final

consiste em um gel com diversos discos (spots) dispersos, cada um correspondendo a

uma proteína particular. O poder de separação é tão grande que duas proteínas que

diferem em apenas um aminoácido carregado podem ser prontamente distinguida

(ROCHA, et al.,2005).

Escolheu-se para este trabalho a metodologia de eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) uma vez que a intenção do estudo foi verificar a presença

de proteínas salivares específicas (Lf e LZ), assim como a lactoperoxidase, nas

amostras de saliva coletada, e não a presença de todas as proteínas salivares,

possuindo então um número relativamente pequeno de proteínas para separação das

bandas.

As amostras de saliva foram liofilizadas com a intenção de desnaturar o meio e

concentrar as proteínas presentes na saliva. Como padronização foi realizada um teste

piloto com a saliva de um único voluntário, onde a mesma era liofilizada e não

liofilizada. Além disso, as amostras de saliva foram preparadas com solução

desnaturante e tampão tris-HCl, em concentrações variadas. A partir disso foi verificada

a expressividade das bandas no gel, de acordo com o melhor processamento das

amostras.

A lisozima é uma proteína catiônica de peso molecular (20 kDa), a sua ação

antimicrobiana baseia-se em sua atividade de muramidase, além de ativar as

“autolisinas” bacterianas, que por sua vez também podem destruir os componentes da

parede celular (ARNOLD, BREWEN, GAUTHIER,1980).

A lactoferrina é uma glicoproteína de (76 kDa) ligadora de ferro, pertencente à

família da transferrina (WARD, URIBE-LUNA; CONNEELEY,2002). Muitas funções

biológicas são atribuídas a lactoferrina (Lf), como a de modular a resposta imune contra

infecções e possuir atividade antimicrobiana. A atividade antimicrobiana da Lf ocorre

Discussão 64

basicamente por ligar ferro com grande afinidade, o que acaba tornando esse íon

indisponível para um grande número de espécies bacterianas. Ela exerce sua atividade

antimicrobiana através de outros mecanismos de ação, como por exemplo, através da

interação direta entre a Lf e componentes celulares de bactérias (JENSSEN;

HANCOCK,2008). Recentemente muitas outras funções foram atribuídas a Lf, tais

como imunomodulação, regulação do crescimento celular, função antitumoral, atividade

antioxidante e antiinflamatório (WARD, URIBE-LUNA, CONNEELEY,2002).

Baker, Baker (2004); Lampreave et al. (1990); Gasymov et al. (1999); Zakharova

et al. (2000); Ward, Conneely (2004); Conte et al. (1999) relatam que a lactoferrina é

uma glicoproteína composta por uma única cadeia polipeptídica de peso molecular de

80 kDa. Moore et al.,1997 verificaram através de cristalografia por difração de raio-x a

estrutura tridimensional da Lf, como tendo um peso molecular de 76 kDa, o mesmo

peso molecular citado por (JENSSEN, HANCOCK,2008).

Nesta pesquisa, foram encontradas variações nos géis em relação ao peso

molecular tanto para a proteína Lf em torno de 78 a 107 kDa e para a proteína LZ em

torno de 18 a 24 kDa, respectivamente. Para a proteína LZ utilizou-se como referência

o padrão de peso molecular universal da BioRad (Prestained SDS-PAGE/BioRad,

catalog #161-0318, EUA) na qual referenciava como peso molecular da LZ de 20 kDa.

Para a Lf foi confeccionado um padrão de referência, utilizando-se a concentração de

1.5 mg/mL. Acredita-se que essa variação possa ter sido causada devido a oscilações

decorrentes da rede elétrica, uma vez que a fonte estabilizadora foi estabilizada

mantendo-se uma voltagem em 200 V e a amperagem fixada em 23mA.

Quanto ao número amostral das crianças a serem avaliadas, recorreu-se a

literatura científica. Schwartz, Zhu, Sreebnyl (1995) realizaram pesquisa para

observação do perfil eletroforético das proteínas salivares de 20 indivíduos. Sikorska,

Mielnik-Blaszczak, Kapec (2002) utilizaram amostras de 83 escolares para avaliação de

proteínas salivares correlacionando-as com cárie. Já Dezan et al. (2002) avaliaram

parâmetros salivares de 94 bebês. Jentsch et al. (2004) avaliaram 28 amostras de

saliva de adultos jovens quanto ao fluxo salivar, pH e capacidade tampão, lisozima,

lactoferrina, peroxidase, tiocianato, imunoglobulina A e proteínas totais correlacionando

com o índice CPO-D, e Jonasson et al. (2007) avaliaram proteínas de saliva de 38

Discussão 65

crianças de 12 anos de idade. Diante destes estudos, optou-se pela realização da

pesquisa em 80 escolares no presente estudo.

Sabe-se que entre os dentistas existe uma grande variação sobre o diagnóstico

final de um dente com cárie. A fim de minimizar esse problema na pesquisa

odontológica, é essencial que o pesquisador determine primeiramente os critérios de

diagnóstico de cárie. A lesão de cárie deve ser óbvia o suficiente para não deixar

dúvidas quanto a sua presença. A OMS e outros órgãos oficiais de diferentes países

determinaram que para ser caracterizada a presença de cárie tem que haver, sem

dúvida, cavidade (OMS-WHO,1999). Desta forma, lesões brancas foram consideradas

como dentes hígidos na avaliação do índice CPO-D, assim como selantes de fissuras,

e o examinador submeteu-se a um treinamento e posterior calibração para obtenção do

índice Kappa, como descrito na metodologia.

Foi estipulado que em cada gel da eletroforese constassem três amostras de

saliva de crianças com cárie ativa (grupo A) e três amostras de crianças sem cárie

(podendo haver dentes restaurados sem cárie) (grupo B). Assim, em um mesmo gel,

com a mesma variação elétrica de corrida poderiam ser comparadas as duas diferentes

situações, imaginando que as concentrações das proteínas variassem (Figura 24).

Figura 24 – Esquema representativo das amostras de saliva e marcadores inseridos no gel de eletroforese

Os dentes restaurados sem cárie foram incluidos no grupo dos cárie-inativos,

supondo que onde houvesse cárie em evolução – ativa – poderíamos encontrar maior

número de EGM, em franco metabolismo de carboidratos, assim como maior

MAR

CAD

OR

S

EM

C

ÁRI

E

S

EM

C

ÁRI

E

S

EM

C

ÁRI

E

COM

CÁRIE

CO

M

CÁ

RIE

CO

M

CÁ

RIE

PA

DRÃ

O

LZ

PA

DRÃ

O

Lf

Discussão 66

concentração das proteínas salivares protetoras ou antimicrobianas. Desse modo,

cárie-ativos compôs o grupo A e cárie-inativos, o grupo B. Das 80 crianças, 58,8%

estavam no grupo B, cárie-inativas.

Por outro lado, separou-se as crianças em grupos 1 e 2, sendo o grupo 1 com

experiência de cárie, e aqui eram incluidos os dentes restaurados também, pois estas

crianças poderiam não ter cavidade de cárie ativas, mas já tinham passado por uma

experiência prévia da doença, remediada por uma restauração. O grupo 2 incluiam os

dentes sem experiência de cárie, ou seja, somente os dentes hígidos. Das 80 crianças,

63,3% estavam no grupo 1, ou seja, com experiência de cárie, atual ou prévia.

Os resultados estatísticos nos mostraram em ambas as classificações,

associação do componente do índice CPO-D dente cariado com maiores contagens de

EGM pelo teste de KrusKall-Wallis (tabela 11) e correlação de Pearson (tabela 16),

corroborando a literatura, que classifica a presença aumentada da referida bactéria

como fator indicador de risco à cárie (HAMADA, SLADE,1980; ALALUUSUA,

RENKONEN,1983; DE LORENZO,2004; DITTERICH et al.,2004; GALAVITZ et al.,

2005; SEGURA et al.,2006; BOTELHO et al.,2007). Mass et al. (2002) encontraram

associação entre menor número de EGM e lactobacilos e alto fluxo salivar, assim como

maior número de bactérias cariogênicas com maiores níveis de lisozima em crianças

com cárie.

Não houve associação do fluxo salivar com o índice CPO-D ou com a

concentração das proteínas salivares. A maioria das crianças desta população (85,1%)

possuia fluxo salivar normal ou aumentado, portanto, seria difícil haver uma correlação

com a quantidade de cárie, uma vez que a literatura relata maior índice CPO-D com

fluxo salivar reduzido (JOHANSSON et al.,1994; ATKINSON, BAUM,2001; MASS et al.,

2002;BANDERAS-TARABAY et al.,2002;SIKORSKA, MIELNIK-BLASZCZAK,

KAPEC,2002; DE FARIAS, BEZERRA,2003; JENTSCH et al.,2004; FEJERSKOV,2004;

AZEVEDO et al.,2005;BARDOW et al.,2005;VITORINO et al.,2006;JONASSON et

al.,2007). Se a maioria da população possuia um bom fluxo, também ficou inviável

detectar associação de muito ou pouco fluxo com a concentração de proteínas

salivares.

Graças a sua praticidade e rapidez de execução, o IHOS – índice de higiene oral

simplificado - é um instrumento de mensuração utilizado em todo o mundo. Foi criado

Discussão 67

com base na estreita relação entre o cuidado individual com a saúde bucal e a

incidência de doença periodontal (BASSANI, LUNARDELLLI,2006; BOTs et al.,2006;

GREENE & VERMILLION,1964;PANDEY & PANDEY,2005). Tem sido também

correlacionado com a experiência de cárie em alguns estudos (SEGURA et al.,2006;

BOTELHO et al.,2007).

Neste estudo não houve associação do índice de higiene oral com o CPO-D ou

seus componentes pelo teste de Kruskall-Wallis (tabela 12), no entanto, foi observada

fraca correlação pelo teste de Pearson entre IHOS e CPO-D, componente cariado e

restaurado (tabela 16). Houve também fraca correlação entre IHOS e a expressão da

proteína lactoferrina.

Esta última observação de correlação entre IHOS e lactoferrina denota que

provavelmente a produção da enzima deva ser estimulada frente ao aumento do

contingente bacteriano, estando esta desempenhando seu papel protetor. Não

encontramos relatos na literatura a respeito desta associação.

A enzima amilase foi encontrada como tendo associação com alto CPO-D

(Vitorino et al.,2006) e com pouca perda mineral dentária por Bardow et al.(2005).

Farias; Bezerra (2003) não encontraram associação da enzima amilase e concentração

total de proteínas salivares com cáries precoces da infância em 20 crianças de 12 a 47

meses de idade. Banderas-Tarabay et al.(2002) também não encontraram relação

desta proteína com o índice CPO-D. Foi observado no presente estudo em todos os

géis, alta expressão da amilase, tanto para crianças cárie-ativas como inativas, no

entanto, não nos detivemos na sua quantificação por não se tratar de uma enzima

antimicrobiana, segundo VAN NIEUW AMERONGEN, BOLSCHER, VEERMAN,(2004).

Apesar da enzima lactoperoxidase não ser escopo inicial deste trabalho, foi

incluida na análise dos resultados, uma vez que é uma enzima antimicrobiana (VAN

NIEUW AMERONGEN, BOLSCHER, VEERMAN,2004) e apareciam picos de sua

presença nos gráficos gerados pelo programa Lpix. Não foi usado um padrão especial

da proteína pura lactoperoxidase nos géis de poliacrilamida e a intensidade de suas

bandas foi comparada com o padrão de peso molecular e com os padrões das

proteínas puras lactoferrina e lisozima. Entretanto, não houve associação da presença

ou quantidade da lactoperoxidase com nenhum dos outros fatores avaliados, fluxo

salivar, níveis salivares de EGM, experiência e atividade de cárie.

Discussão 68

A proteína lisozima não foi associada nem correlacionada com o índice CPO-D,

IHOS, fluxo salivar ou contagem de EGM. Sabe-se que ela exerce um efeito

antimicrobiano considerável, maior que da lactoferrina e está em quantidade bem mais

abundante na saliva (concentração em torno de 41,74 a 93,86 mg/L) enquanto que a

lactoferrina demonstrou concentração de 2,95 a 10,49 mg/L. Apenas 3 crianças (3,8%)

da amostra possuiam níveis não detectáveis de lisozima em suas salivas nesta

metodologia, porém não houve diferença estatística de concentração entre as crianças

com cárie e sem cárie. Ao observar a tabela 15, os valores de CPO-D e de seus

componentes diminuiam a medida que aumentava a concentração de lisozima, ou

seja, eram inversamente proporcionais inferindo que a lisozima também possa estar

desempenhando seu efeito protetor antimicrobiano. Não houve diferença estatística,

mas há de se considerar que por ser mais abundante na cavidade bucal, essa enzima

tenha o seu papel de importância.

Mass et al.(2002) observaram na sua pesquisa associação entre maiores

concentrações de lisozima e a presença de cárie dentária, em concordância com a

tendência de resultados apresentados neste estudo.

Outro ponto com relação à lisozima é que por sua maior expressão nos géis em

relação à lactoferrina e lactoperoxidase, e quase a totalidade da população

apresentando-a, foi feita a opção de categorizar a quantidade de lisozima presente nas

salivas das crianças durante o teste estatístico (tabela 9 e 15). A estratificação foi

baseada no número de crianças nos três grupos separados pela concentração da

proteína. Como relatado por Banderas-Tarabay et al.(2002) as análises das moléculas

salivares são normalmente feitas como apenas presentes ou ausentes. No teste

estatístico foram testadas a lisozima estratificada e também a presença ou ausência

apenas, sem contudo, detectar significância estatística da presença da lisozima com

quaquer outra variável.

A lactoferrina mostrou associação positiva significante com os dentes

restaurados pelo teste de Kruskall-Wallis. Pela correlação de Pearson houve

significância estatística tanto para dentes restaurados como para o CPO-D geral

(tabela 16), apesar dos valores do coeficiente do teste não serem muito elevados.

Também encontraram associação da quantidade de lactoferrina com o índice CPO-D.

Vitorino et al.(2006) e, Azevedo (2005), observar a relação do risco/atividade de cárie

Discussão 69

com a presença de polimorfismo no gene da lactoferrina. Sikorska, Mielnik-Blaszczak,

Kapec (2002) observaram relação significante entre os níveis de lactoferrina pelo teste

ELISA e o índice CPO-D em 83 crianças de 15 anos de idade, resultados próximos ao

do presente estudo, apesar da diferença metodológica.

Johansson et al.(1994) investigaram proteínas totais, imunoglobulinas,

lactoferrina, lisozima e outras proteínas salivares em crianças (8 a 12 anos) com e sem

má-nutrição, observando valores diminuídos de lactoferrina e IgA no grupo estudo,

salientando que a deficiência nutricional pode afetar a capacidade de resposta

imunológica do indivíduo.

Interessante observar no presente estudo, que a lactoferrina foi a única proteína

salivar associada com o CPO-D e também com o índice de placa aumentados,

demonstrando sua importância no combate à etiologia - placa bacteriana – da cárie

dentária. Diante do fato de que estreptococos do grupo mutans são os principais

microrganismos associados com essa doença, porém não exclusivos, ou seja, existem

outras espécies fortemente ligadas à etiologia dessa doença, enfatiza-se o caráter não

específico desta proteína salivar, aumentando seus níveis não apenas na presença de

EGM, mas também do biofilme dentário como um todo. Concordando com os achados

de Johansson et al.(1994); Sikorska, Mielnik-Blaszczak, Kapec (2002); Azevedo (2005)

e Vitorino et al.(2006), a presença da lactoferrina parece estar associada com a

presença da cárie dentária, o que pode contribuir para um maior conhecimento dos

aspectos etiológicos da doença.


Conclusões

7.1 CONCLUSÕES

partir dos resultados obtidos, podemos concluir que:

apesar de 63,3% das crianças do presente estudo possuirem experiência

de cárie; 58,8% eram cárie-inativas;

a maioria das crianças apresentou fluxo salivar normal, não havendo

relação deste fator com o CPO-D;

o índice CPO-D foi correlacionado com a quantidade de biofilme dentário,

assim como seus componentes, dentes cariados e restaurados;

os dentes cariados foram correlacionados positivamente com os níveis

salivares de estreptococos do grupo mutans;

as proteínas salivares não foram relacionadas com a quantidade de

estreptococos do grupo mutans, no entanto, houve correlação positiva

entre biofilme dentário e a proteína lactoferrina;

apesar de 45% das crianças não possuírema proteína lactoferrina

detectada nos géis de poliacrilamida, quando presentes, foram

correlacionadas com maior CPO-D e seu componente dentes

restaurados.

AA

REFERÊNCIAS

1

ALALUUSUA, S.; RENKONEN, O.V. Streptococcus mutans establishment and dental caries

experience in children from 2 to 4 years old. Scand. J. Dent. Res., v. 91, n. 6, p. 453-57, Dec.,

1983.

2 ANDERSON, B.F.; BAKER, H.M.; NORRIS, G.E. et al. Apo-lactoferrin structure demonstrates

ligand-induced conformational change in transferrins. Nature, v. 344, p. 784-787, 1990.

3 ANTUNES, A.J. Funcionalidade de Proteínas do Soro de Leite Bovino. São Paulo: Editora

Manole,. v. 01. 150 p. 2003.

4 APPELMELK, B.J.; AN, Y.K.; GEERTS, M. et al. Lactoferrin is a lipid Abinding protein. Infect.

Immun., v. 62, p. 2628-2632, 1994.

5 ARNOLD, R.R.; BREWEN, M.; GAUTHIER J.J. Bactericidal activity of human lactoferrin:

sensitivity of a variety of microorganisms. Infect. Immun., v. 28, p. 893-898, 1980.

6 ARNOLD, R.R.; COLE, M.F.; MCGHEE, J.R. A bactericidal effect for human lactoferrin. Science,

v. 197, p. 263-265, 1977.

7 ATKINSON, J.C.; WU, A.J. Salivary gland dysfunction: causes, symptoms and treatment. J. Am.

Dent. Assoc., Chicago, v.125, p. 409-416, Apr., 1994.

8 ATKINSON, J.C.; YEH C-K.; BERMUDEZ, D. et al. Longitudinal evaluation of major salivary gland

function in HIV-1 infected patients. J. Oral Pathol. Med., v. 18, p. 469-470, 1989.

9 ATKINSON, J.C.; YEH C-K.; OPPENHEIM, F.G. et al. Elevation of salivary antimicrobial proteins

following HIV-1 infection. J. Acquir. Immune Defic. Syndrs, n. 3, p. 41-48, 1990.

10 ATKISON, J.C.; BAUM, B. Salivary enhancement: current status and future therapies. J. Dent.

Educ., v. 65, n. 10, p. 1096-1101, 2001.

11

AZEVEDO, L.F.; ARRUDA, E.S.; SANTOS, T.B. et al. Evaluation of socioeconomic aspects,

salivary factors and oral habits on the caries risk determination in 12-year-old students of a private

school in Curitiba/PR, Brazil. Journal of dental clinics and researchs. In press: [article in

Portuguese], 2005.

12 BAKER, E.N. Structure and reactivity of transferrins. Adv. Inorg. Chem., v. 41, p. 389-463, 1994b.

13 BAKER, E.N.; ANDERSON, B.F.; BAKER, H.M. et al. Three-dimensional structure of lactoferrin in

various functional states. Adv. Exp. Med. Biol., v. 357, p. 1-12, 1994a.

14 BAKER, E.N.; BAKER, H.M. A structural framework for understanding the multifunctional

character of lactoferrin, doi:10.1016/j.biochi.2008.05.006, 2008.

15 BAKER, H.M.; BAKER, E.N. Lactoferrin and iron: structural and dynamic aspects if binding and

release. Biometals, v. 17, p. 209-16, 2004.

16 BALI, P.K.; AISEN, P. Receptor-modulated iron release from transferrin: differential effects on the

N-and C-terminal sites. Biochemstry, v. 30, p. 9947-9952, 1991.

17 BANDERAS-TARABAY, J.A. et al. Electrophoretic analysis of whole saliva and prevalence of

dental caries. A study in mexican dental students. Arch. Oral Biol., v. 33, p. 499-505, 2002.

18 BARDOW A. et al. Effect of saliva composition on experimental root caries. Caries Res., n. 39, p.

71-77, 2005.

19

BASSANI D, LUNARDELLI A.N. Condições Periodontais. In: ANTUNES, J.L.F.; PERES, M.A.

Epidemiologia da Saúde Bucal: fundamentos de Odontologia. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, Cap.5, p.68-82, 2006.

20

BERKHOUT, B.; VAN WAMEL, J.L.; BELJAARS, L. et al. Characterization of the anti-HIV effects

of native lactoferrin and other milk proteins and protein-derived peptides. Antiviral Res., v. 55, n.

2, p. 341-55, 2002.

Referências 72

21

BOACKLE, R.J.; SUDDICK, R.P. Proteínas salivares e saúde bucal. In: MENAKER, L.;

MORHART, R.E.; NAVIA, J.M. Cáries Dentárias: bases biológicas. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, p. 118-131, 1984.

22

BOTELHO, M.P.J.; GARBELINI, C.C.D.; CHIMENTÃO, L.K.; PINTO, L.M.C.P.; FERNANDES,

K.B.P.; FERREIRA, F.B.A. Presença de microrganismos cariogênicos e condições bucais de

crianças portadoras de asma brônquica em Londrina-PR. Braz. Oral Res., (21) Suppl. 1: 162-222

(Proceedings of the 24th SBPqO Annual Meeting) p.181, 2007.

23

BOTS, C.; POORTERMAN, J.; BRAND, H.; KALSBEEK, H.; AMERONGEN, B.; VEERMAN, E.;

NIEUW AMERONGEN, A. The oral health status of dentate patients with chronic renal failure

undergoing dialysis therapy. Oral Diseases, (12): 176-80, 2006.

24 BROCK, J.H. The physiology of lactoferrin. Biochem. Cell. Biol., v. 80, p. 1-6, 2002.

25 BULLEN, J.J.; ROGERS, H.J.; LEIGH, L. Iron-binding proteins in milk and resistance to

Escherichia coli infection in infants. Br. Med. J., p. 69-75, 1972.

26 BURT, B.A.; PAI, S. Sugar consumption and caries risk: a systematic review. J. Dental Educ., v.

65, n. 10, p. 1017-27, 2001.

27

COLE, M.F.; ARNOLD, R.; MESTECKY, J.; KULHAVY, R. and MCGHEE, J.R. Studies with

human lactoferrin and Streptococcus mutans. In H. Stiles. LOESCHE, W. and BRIEN, T.O.

Microbial aspects of dental caries II – Information retrieval, Washington, D.C., 1976.

28 COMPTON, S.J.; JONES, C.G.; Anal Biochem, (151): 369, 1985.

29 CONRADS, G. DNA probes and primers in dental practice. Clin. Infect. Dis., v. 35 (supplement),

p. 72-7, 2002.

30

CURY, J.A.; REBELO, M.A.; DELL BEL CURY, A.A. et al. Biochemical composition and

cariogenicity of dental plaque formed in presence of sucrose or glucose and fructose. Caries

Res., v. 34, n. 6, p. 491-7, 2000.

31 DAWES, C. Considerations in the development of diagnostic tests on saliva. Ann. NY Acad. Sci.,

New York, v. 20, n. 694, p. 255-269, Sep., 1993.

32

DE BORTOLI, N.; LEONARDI, G.; CIANCIA, E. et al. Helicobacter pylori eradication: a

randomized prospective study oftriple therapy versus triple therapy plus lactoferrin and probiotics.

Am. J. Gastroenterol., v. 102, p. 951-956, 2007.

33 DE FARIAS, G.D.; BEZERRA, B.C.A. Salivary antibodies, amylase and protein from children with

early childhood caries. Clin. Oral Invest., n. 7, p. 154-157, 2003.

34 DE LORENZO, J.L. Microbiologia para o estudo de odontologia. São Paulo: Ateneu, 2004.

35

DEZAN, C.C.; NICOLAU, J.; SOUZA, D.N.; WALTER, L.R.F. Flow rate, amylase activity, and

protein and sialic acid concentrations of saliva from children aged 18,30 and 42 months attending

a baby clinic. Arch. Of Oral Biology, n. 47, p. 423-27, 2002.

36 DITTERICH, R.G. et al. Cárie de aparecimento precoce: uma revisão. UEPG Ci. Biol. Saúde,

v.10, n. 314, p. 33-41, Set./dez., 2004.

37 DOUGLAS, C.R. Patofisiologia oral: fisiologia normal e patológica aplicada à odontologia e

fonoaudiologia. São Paulo: Pancast, v. 2, p.17-38, 1998.

38 EDGAR, W.M. Saliva: its secretion, composition and functions. Brith. Dent. J., London, v. 172, n.

8, p. 305-312, Apr., 1992.

39 EDGAR, W.M.; O’MULLANE, D.M. Saliva and oral health. 2.ed. London: British Dental

Association, 140 p., 1996.

40

ELLISON, R.T.; GIEHL, T.J.; LAFORCE, F.M. Damage of the outer membrane of enteric Gram-

negative bacteria by lactoferrin and transferring. Infect. Immun., v. 56, p. 2774-2781, 1988.

Referências 73

41 EPSTEIN, J.B.; SCULLY, C. The role of saliva in oral health and the causes and effects of

xerostomia. J. Can. Dent. Assoc., Ottawa, v. 58, n. 3, p. 217-221, Mar., 1992.

42

ERICSON, T.; MAKINEN, K.K. Saliva – Formação, Composição e Possível Função. In:

THYLSTRUP, A.; FEJERSKOV, O. Tratado de Cariologia. Rio de Janeiro: Cultura Média Ltda, p.

16-19, 1988.

43 FEATHERSTONE, J.D.B. The continuing of dental caries – Evidence for a dynamic disease

process. J. Dent. Res., v. 83, p. 39-42, 2004.

44 FEJERSKOV, O. Changing paradigms in concepts on dental caries: consequences for oral health

care. Caries Res., v. 38, n. 3, p. 182-9, 2004.

45 FEJERSKOV, O. Concepts of dental caries and their consequences for understanding the

disease. Community Dent. Oral. Epidemiol., v. 25, p. 5-12, 1998.

46 FEJERSKOV, O.; KIDD, E.A.M. Cárie Dentária, a doença e seu tratamento clínico. São Paulo,

Editora Santos, p. 189-219, 2006.

47 FINE, D.H.; FURGAN, D.; BEYDOWIN, F. Lactoferin iron levels are reduced in saliva of patients

with local aggressive periodontites. J. Periodontol., v. 73, n. 6, p. 624-30, 2002.

48 FRANCESCA, B.; AJELLO, M.; BOSSO, P. et al. Both lactoferrin and iron influence aggregation

and biofilm formation in Streptococcus mutans. Biometals, v. 17, n. 3, p. 271-8, 2004.

49

FRANCO, F. A relação entre transplantados renais comparados a insuficientes renais

crônicos e indivíduos saudáveis verificando condições de saliva, dentes e mucosas

bucais. Porto Alegre, Rio Grande do Sul, 2004. 216f. Tese de Doutorado em Odontologia:

Estomatologia clínica. Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.

50 GALAVITZ, L.A.A.A et al. Caries risk in children:determine by levels of mutans streptococci and

Lactobaccilus. The journal of clinical Pediatric Dentistry, v. 29, n. 4, p. 329-333, 2005.

51 GARCÍA-POLA, M.J. et al. Xerostomía. Formación Médica Continuada, Quito, v. 6, n. 4, p. 229-

39, Abr., 1999.

52 GELLER, J.H.; HAMES, L.; ROVELSTAD, G. Electrophoresis of saliva. J. Dent. Res., (5): 854-

859, 1959.

53

GERSTEIN, M.; ANDERSON, B.F.; NORRIS, G.E. et al. Domain closure in lactoferrin: two hinges

produce a see-sawmotion betweem alternative close-packed interface. J. Mol. Biol., v. 234, p.

357-372, 1993.

54 GOLD, O.; JORDAN, H.V.; VAN HOUTE, J.A. Selective medium for Streptococcus mutans. Arch.

Oral Biol., v. 18, p. 1357-64, 1973.

55

GÖRG A.; POSTEL, W.; GÜNTHER, S. et al. Improved horizontal two-dimensional

electrophoresis with hybrid isoeletric focusing in immobilized pH gradients in the first dimension

and laying-on transfer to the second dimension. Electrophoresis, Weinheim, Germany, v. 6, p.

599-604, 1985.

56 GORNALL, A.G.; BARDAWILL, C.J.; DAVID, M.M. Determination of serum proteins with the folin

phenol reagent. J.Biol. Chem., v.193, p.265-271, 1951.

57 GREENE, J.C.; VERMILLION, J.R. The simplified oral hygiene index. J. Am. Dent. Assoc.,

Chicago, v. 68, p. 7-13, Jan., 1964.

58 HAMADA, S.; SLADE, H.D. Biology, immunology and cariogenicity of Streptococcus mutans.

Microbiol. Rev., v. 44, n. 2, p. 331-384, Jun., 1980.

59

HARMSEN, M.C.; SWART, P.J.; DE BETHUNE, M.P. et al. Antiviral effects of plasma and

milkproteins: lactoferrin shows potent activity against both human immunodeficiency virus and

human cytomegalovirus replication in vitro. J. Infect Dis., n. 172, p. 380-388, 1995.

60 HERBERT, B.R.; HARRY, J.L.; PACKER, N.H. et al. What place for polyacrylamide in

proteomics? Trends in Biotechonology, Oxford, v. 19 (Supplement), p. 3-9, 2001.

Referências 74

61 ITZHAKI, R.F.; GILL, D.M.; Anal Biochem, (9): 401, 1964.

62 JENKINS, G.N. Saliva. In _____ The physiologic and biochemistry of the mouth. 4 ed., Oxford,

Blacwell Scientific Publications, p. 284-395, 1978.

63 JENSSEN, H.; HANCOCK, R.R.W. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie, 2008. doi:

10.1016/j. biochi.2008.05.015.

64 JENTSCH et al. Salivary analyses and caries increment over 4 years an approach by cluster

analyses. Clin. Oral Invest., n. 8, p. 156-160, 2004.

65 JOHANSSON, I.; LUMIKARI-LENANDER, M.; SAELLSTROM-K.A. Saliva composition in Indian

children with chronic protein-energy malnutrition. J. Dent. Res., v. 73, n. 1, p. 11-19, Jan., 1994.

66 JONASSON ANETTE et al. Innate immunity glycoprotein gp-340 variants may modulate human

susceptibility to dental caries. BMC Infections Diseases, v. 57, n. 7, 2007.

67 JORGE, A.O.C. Microbiologia Bucal. São Paulo: Santos, 121 p., 1995.

68 JORGENSON, J.W. Electrophoresis. Anal. Chem., (7): 743-760, 1986.

69 KAMAYA, T. Lytic action of lysozyme on Candida albicans. Mycol. Appl., v. 42, p. 197-207, 1970.

70 KAUFMAN, E.; LAMSTER, I.B. Analysis of saliva for periodontal diagnosis- a review. J. Clin.

Periodontol, Copenhagen, v. 27, n. 7, p. 453-65, Jul., 2000.

71

KIDD, E.A.M.; FEJERSKOV, O. What Constitutes Dental Caries? Histopathology of Carious

Enamel and Dentin related to the Action of Cariogenic Biofilms. J. Dent. Res., v. 83 (Spec Iss C),

p. C35-C38, 2004.

72 KINERSLY, T. Preliminary paper electrophoretic study of saliva. J. Biol. Med., (26): 211, 1953.

73 KIRSTILA, V.; TENOVUO, J.; RUUSKANEN, O. et al. Salivary defense factors and oral health in

patients with common variable immune deficiency. J. Clin. Immunol., v. 14, p. 229-236, 1994.

74 KÖHLER, B.; BRATTHAL, D. Practical method to facilitate of Streptococcus mutans levels in

saliva. Journal of Clinical Microbiology, p. 584-588, May., 1979.

75 KRAMER, M.S. & FEINSTEIM, A.R. Clinical biostatistics: The biostatistics of concordance.

Clinical Pharmacology & Therapeutic, v. 29, p. 454-459, 1981.

76 KRASSE, B. Risco de cárie – Um guia prático para avaliação e controle, 2.ed., São Paulo:

Quintessence Books, p. 41-43, 1988.

77 LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacterial phage

T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.

78 LASSITER, M.O.; NEWSOME, A.L.; SAMS, L.D. and ARNOLD, R.R. Characterization of

lactoferrin interaction with Streptococcus mutans. J. Dent. Res., v. 66, p. 480-485, 1987.

79 LAWRENCE, H.P. Salivary markers of systemic disease: noninvasive diagnostic of disease and

monitoring of general health. J. Can. Dent. Assoc., Toronto, v. 68, n. 3, p. 170-174, Mar., 2002.

80 LEONE, C.; OPPENHEIM, F. Physical and chemical aspects of saliva as indicators of risk for

dental caries in humans. J. Den. Educ., v. 65, n. 10, p. 1054-62, 2001.

81

LEWIS, L. A.; ROHDE, K.; GIPSON, M. et al. Identification and molecular analysis of lbpBA,

whichencodes the two-component meningococcal lactoferrin receptor. Infect. Immun., v. 66, p.

3017-3023, 1998.

82

LIMA, A.A.S. Avaliação sialométrica e sialoquímica de indivíduos submetidos à radioterapia

da região de cabeça e pescoço. Porto Alegre, Rio Grande do Sul, 1999, 194f. Tese de

Doutorado em Odontologia: Estomatologia clínica. Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande

do Sul.

83 LIU, D.; WANG, X.; ZHANG, Z.; TENG, C.T. An intronic alternative promoter of the human

lactoferrin gene is activated by Ets. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 301, p. 472-79, 2003.

84 LÓPEZ, M.E.; COLLOCA, M.E.; PAEZ, R.G. et al. Salivary characteristics of diabetic children.

Braz. Dent. J., Ribeirão Preto, v. 14, n. 1, p. 26-31, Jul., 2003.

Referências 75

85 LOWRY, O.H.; N.J. ROSEBROUGH, A. LEWIS FARR & R.J. RANDALL. Protein measurement

with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., (193): 265-275, 1951.

86

LUPETTI, A.; ANNEMMA, P.A.; WELLING, M.M. et al. Synergist activity of the N-terminal peptide

of human lactoferrin and fluconazole against Candida species. Antimocrob. Agents Chemother,

v. 47, n. 1, p. 262-7, 2003.

87 MALTZ M. Cárie Dental: Fatores relacionados. In: PINTO, V.G., Saúde Bucal Coletiva. São

Paulo: Santos, p. 319-339, 2000.

88 MANDEL, I.D. The function of saliva. J. Dent. Res., Washington, v. 66, Spec.n., p. 623-627, Feb.,

1987.

89 MANDEL, I.D.; BARR, C.E. and TURGEON, L. Longitudinal study of parotid saliva in HIV-1

infection. J. Oral Pathol. Med., v. 21, p. 209-213, 1992.

90

MARDER, M.Z.; BARR, C.E. and MANDEL, I.D. Cytomegalovirus presence and salivary

composition in acquired immunodeficiency syndrome. Oral. Surgery Oral Med. Oral Pathol., v.

60, p. 373-376, 1985.

91 MARQUIS, G.; MONTPLAISIR, S.; GARZON, S. et al. Fungitoxicity of muramidase, ultrastructural

damage to Candida albicans. Lab Investg., v. 46, p. 627-636, 1982.

92 MASS E. et al. Can salivary composition and high flow rate explain the low caries rate in children

with familial dysautonomia? Pediatr. Dent., v. 24, n. 5, p. 81-6, 2002.

93 MASSON, P.L.; CARBONARA, A.O.; HEREMANS, J.F. Studies on the proteins of human saliva.

Biochem. Biophys. Acta. (107): 485-500, 1965.

94 MASSON, P.L.; HEREMANS, J.F. Lactoferrin in milk from different species. Comp. Biochem.

Physiol. B., v. 39, p. 119-129, 1971.

95 MENDES, N. Estudo do teor proteico da saliva de pequenos ruminantes. Universidade de

Évora (Portugal), 41p., 2006.

96 MOORE, S.A.; ANDERSON, B.F.; GROOM, C.R. et al. N.Three-dimensional structure of diferric

bovine lactoferrin at 2.8 Å resolutions. J. Mol. Biol., v. 274, p. 202-236, 1997.

97

MOURA, S.A.B. Análises clínicas, sialométrica e sialoquímica em indivíduos portadores da

Síndrome do ardor bucal. Tese (Doutorado em Estomatologia), 2004. 136p. Universidade

Federal da Paraíba, João Pessoa.

98

MOURA, S.A.B.; MEDEIROS, A.M.C.; COSTA, F.R.H. et al. Valor diagnóstico da saliva em

doenças orais e sistêmicas: Uma revisão de literatura. Pesq. Bras. Odontoped. Clin. Integr.,

João Pessoa, v. 7, n. 2, p. 187-194, maio/ago., 2007.

99

MULLER, F.; PETERSEN-HOLBERG, M.; DEGRE, H.; BRANDTZAEG, P. and FROLAND, S.S.

Nonspecific oral immunity in individuals with HIV infection. J. Acquir. Immunedefic. Syndr., n. 5,

p. 46-51, 1992.

100

NARIYAMA, M.; SHIMIZU, K.; UEMATSU, T. et al. Identification of chromosomes associated with

dental caries susceptibility using quantitative trait locus analysis in mice. Caries Res., v. 38, p. 79-

84, 2004.

101 NEWBRUN, E. Cariologia, 2.ed. São Paulo: Santos, 326 p., 1988.

102

NOBRE DOS SANTOS, M.; MELO DOS SANTOS, L.; FRANCISCO, S.B.; CURY, J.A.

Relationship among dental plaque composition, daily sugar exposure and caries in the primary

dentition. Caries Res., v. 36; n. 5, p. 347-52, 2002.

103 O’FARREL, P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. Journal of

Biological Chemistry. Bethesda, USA, v. 250, p. 4007-4021, 1975.

104 OBERG, S.G.; IZUTSU, K.T.; TRUELOVE, E.L. Human parotid saliva protein composition:

dependence on physiological factores. Res. Oral Biol., p. 291-236, 1982.

Referências 76

105

OHO, T.; MITOMA, M.; KOGA, T. Functional domain of bovine milk lactoferrin which inhibits the

adherence of streptococcus mutans cells to a salivary film. Infect Immun., v. 70, n. 9, p. 5279-82,

2002.

106 OLIVEIRA, V.N.; BORTOLINI, M.J.S.; LAMOUNIER, R.P.M.S.; ESPÍNDOLA, F.S. Biomarcadores

Salivares. Fitness & Performance Journal, Rio de Janeiro, v. 4, n. 2, p. 86, Mar./Abr., 2005.

107 OMS. Levantamentos Básicos em Saúde Bucal. 4 ed. São Paulo: Santos; 1999. 66 p

108 OMS-WHO. Levantamento Epidemiológico Básico de Saúde Bucal. Manual de Instruções. 4

ed. Genebra, p. 35-42, 1997.

109 ORSI, N. The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives. Biometals, v.

17, n. 3, p. 189-196, 2004.

110

PALMER JR, R.J.; KAZMERZAK, K.; HANSEN, M.C. et al. Mutualism versus independence:

strategies of mixed-species oral biofilms in vitro using saliva as the sole nutrient source. Infec.

Immun., Washington, v. 69, n. 9, p. 5794-5804, Sept., 2001.

111 PANDEY, A.; MANN, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature, v. 405, p. 837-846,

2000.

112

PANELLA, T.I.; LIU, Y.; HUANG, A.T.; TENG, C.T. Polymorphism and altered methylation of the

lactoferrin gene in normal leukocytes, leudemic cells, and breast cancer. Cancer Res., v. 51, p.

3037-43, 1991.

113 PANKHURST, C.L. et al. Diagnosis and management of the dry mouth: part I. Dental Update,

Guildford, n. 2, p. 56-62, Mar., 1996.

114

PINTO, L.M.C. Fatores associados com a experiência de cárie em crianças de 4 e 6 anos de

idade atendidas em um programa educativo-preventivo. 2003. 139f. Tese (Doutorado em

Odontopediatria)- Universidade Estadual Paulista, Faculdade de odontologia, Araçatuba, 2003.

115 PUY, C.L. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal, v. 11 E, p. 449-55, 2006.

116 RANTONEN, P.J.F.; MEURMAN, J.H. Viscosity of whole saliva. Acta Odontol. Scand., Oslo, v.

56, n. 4, p. 210-214, Aug., 1998.

117

ROCHA, T.L.; COSTA, P.H.A; MAGALHÃES, J.C.C et al. Eletroforese bidimensional e análise de

proteomas (EMBRAPA): Comunicado Técnico 136, Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento, 1 ed, p. 1-12, out.,2005. Disponível em: http://www.cenargem.embrapa.br. Acesso

em 5 out. 2008.

118 RUDNEY, J.D. Saliva and dental plaque. Adv. Dent. Res., Washington, v. 14, n. 1, p. 29-39, Dec.,

2000.

119

SAMARANAYAKE, Y.H.; SAMARANAYAKE, L.P.; POW, E.H.N. et al. Antifungical effects of

lysozyme and lactoferrin against genetically similar sequential Candida albicans isolates from a

human immunodeficiency virus-infected southern Chinese cohort. J. Clin. Microbiol., v. 39, p.

3296-3302, 2001.

120

SCHWARTZ, S.S.; ZHU, W.X.; SREEBNYL, L.M. Sodium dodecil sulphate-polyacrylamide gel

electrophoresis of human whole saliva. Arch. Oral. Biol., Oxford, v. 40, n. 10, p. 949-958, Oct.,

1995.

121

SEGURA, V.G.; FERREIRA, F.B.A.; FREDERICO, R.C.P.; MACIEL, S.M.; PIERALISI, F.J.S.;

LANZA, P. Relação de fatores microbiológicos e sociodemográficos na experiência de cárie em

mães e filhos de CEMEIs em Londrina. Braz. Oral Res., v. 20, Supplement (Proceedings of the

23rd Annual SBPqO Meeting), p. 302, 2006.

122

SHIBA, A.; SHIBA, K.S.; SUZUKI, K. Analysis of salivary proteins by thin layer sodium dodecyl

sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. J. Prosth. Dent., p.263-271, 1985.

http://www.cenargem.embrapa.br/




Referências 77

123

SIKORSKA, M.H.; MIELNIK-BLASZCZAK, M.; KAPEC, E. The relationship between the levels of

SigA, lactoferrin and alpha (1) proteinase inhibitor in saliva and permanent dentition caries in 15-

year-olds. Oral Microbiol. Immunol., v. 17, p. 272-6, 2002.

124 SINGH, P.K. Iron sequestration by human lactoferrin stimulates P.aeruginosa surface motility and

blocks biofilm formation. Biometals, v. 17, p. 267-70, 2002.

125 SON, K.N.; PARK, J.; CHUNG, D.K. et al. Human lactoferrin activates transcription of IL-1beta

gene in mammalian cells. Biochem. Biophys Res. Commun., v. 290, n. 1, p. 236-41, 2002.

126 STRECKFUS, C.F.; BIGLER, L.R. Salivary glands an saliva: saliva as a diagnostic fluid. Oral

Diseases, Houndmills, v. 8, n. 3, p. 69-76, 2002.

127 STUCHELL, R.N.; MANDEL, I.D.; BAURMASH, H. Clinical utilization of sialochemistry in Sjögren’s

Syndrome. J. Oral Pathology., Copenhagen, v. 13, p. 303-309, 1984.

128 TENG, C.T. Lactoferrin gene expression and regulation: an overview. Biochem. Cell. Biol., v. 80,

n. 1, p. 7-16, 2002.

129 TENOVUO, J. Antimicrobial function of human saliva- how important is it for oral health? Acta

Odontol. Scand., Oslo, v. 56, n. 5, p. 250-256, Oct., 1998.

130 TENOVUO, J. Clinical applications of antimicrobial host proteins lactoperoxidase, lysozyme and

lactoferrin in xerostomia: efficacy and safety. Oral disease, v. 8, n. 1, p. 23-9, 2002.

131 TENOVUO, J.; LAGERLÖF, F. Saliva: In: THYLSTRUP, A., FEJERSKOV, O. Cariologia clínica.

2 ed., São Paulo: Santos, p. 17-43, 1995.

132 THYLSTRUP, A.; FEJERSKOV, O. Cariologia clínica. São Paulo: Santos, 1995.

133 TISELIUS, H.A. Electrophoresis of serum globulin. II. Biochem. J., (31): 1464, 1937.

134 TOBGI, R.S.; SAMARANAYAKE, L.P. and MACFARLANE, T.W. The in vitro susceptibility of

Candida species to lysozyme. Oral. Microbiol. Immunol., n. 2, p. 1-4, 1988.

135 TOMMASI, F.A.; LIMA, A.A.S.de. In: TOMMASI. Diagnóstico em patologia bucal. 3.ed. São

Paulo: Pancast, p. 347-357, 2002.

136 TSANG, G.S.P. and SAMARANAYAKE, L.P. Salivary lysozyme and related parameters of a

predominantly Chinese, HIV infected cohort in Hong Kong. Oral Disease, n. 5, p. 241-246, 1999.

137 VAN DER STRATE, B. W.; BELJAARS, L.; MOLEMA, G. et al. Antiviral activities of lactoferrin.

Antiviral Res., v. 52, p. 225-239, 2001.

138 VAN NIEUW AMERONGEN, A.; BOLSCHER, J.G.; VEERMAN, E.C. Salivary proteins: protective

and diagnostic value in cariology? Caries Res., v. 38, p. 247-53, 2004.

139

VAN VEEN, H.A.; GEERTS, M.E.J; VAN BERKEL, P.H.C.; NUIJENS, J.H. Analytical cation-

exchange chromatography to assess the identity, purity, and N-terminal integrity of human

lactoferrin. Anal Biochem., v. 309, n. 1, p. 60-66, 2002.

140 VISSINK, A. et al. Treatment of hyposalivation. Ear. Nose Throat. J., Cleveland, v. 67, p. 179-

185, Mar., 1988.

141 VITORINO, R.; GUEDES, S.M.; FERREIRA, R. et al. Two-dimensional electrophoresis study of in

vitro pellicle formation and dental caries susceptibility. Eur. J. Oral Sci., v. 114, p. 147-53, 2006.

142 WARD, P. P.; URIBE-LUNA, S.; CONNEELEY; O. M. Lactoferrin in host defense. Biochem. Cell.

Biol., v. 80, p. 95-102, 2002.

143 WARD, P.P.; CONNEELY, O.M. Lactoferrin: role in iron homeostasis and host defense against

microbial infection. Biometals, v. 17, n. 3, p. 203-8, 2004.

144 WATERMAN, H.A.; BLOM, C.; HOLTERMAN, H.J. et al. Rheological properties of human saliva.

Arch. Oral Biol., Oxford, v. 33, n. 8, p. 589-596, 1988.

145 WEINBERG, E.D. Iron and infection. Microbiol. Rev., v. 42, p. 45-66, 1978.

Referências 78

146 WESTERMEIER, R. Electrophoresis in practice: a guide to methods and applications of DNA and

protein separations (2nd edn). VCH. Press, Weinheim, 1997.

147 WHELTON, H. Introduction the anatomy and physiology of salivary glands. In: EDGAR, W.M.;

O’MULLANE, D.M. Saliva and oral health. 2.ed. London: British Dental Association, p. 1-8, 1996.

148 WU, H.; J. Biol. Chem., (51): 33, 1922.

149 YAMAUCHI, K.; TOMITA, M.; GIEHL, T.J.; ELLISON, R. T. Antibacterial activityof lactoferrin and a

pepsin derived lactoferrin peptide fragment. Infect. Immun.,v. 61, p. 719-728, 1993.

150 YARAT, A et al.Salivary sialic acid, protein, salivary flow rate, pH, buffering capacity and caries

indices in subjects with Down’s Syndrome. J.Dent., v. 27, n.2, p.115-118, Feb., 1999.

151 YEH, J-Y.; BEILSTEIM, M.A.; ANDREWS, J.S.; WHANGER, P.D. Tissue distribuition and

influence of selenium status on levels of selenoprotein. W.FASEB J., v. 9, p. 392-396, 1995.

152 ZAIA, D.A.M.; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via espectrofometria:

vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, v.21, n.6, p.787-793, 1998.

APÊNDICE

Apêndices 80

Apêndice 1 - Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da

Universidade Norte do Paraná (UNOPAR/Londrina) Protocolo PT-0319/08.

Apêndices 81

Apêndice 2 - Modelo da carta informativa entregue aos pais/responsáveis

legais juntamente com o Termo de consentimento livre e esclarecido

PROJETO: AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS SALIVARES LACTOFERRINA E LISOZIMA E PRESENÇA DE ESTREPTOCOCOS DO GRUPO MUTANS EM CRIANÇAS COM E SEM CÁRIE DENTÁRIA

CARTA DE INFORMAÇÃO AO PACIENTE

A presente pesquisa visa avaliar as proteínas salivares mais abundantes em crianças com e sem cárie aos 12 anos de idade. Serão realizados:

o exame clínico da boca para verificar as condições de seus dentes,

o avaliação da salivação (fluxo salivar),

o utilização de corantes nos dentes para medição do grau de higiene bucal (índice de placa bacteriana),

o coleta de saliva para verificação das proteínas salivares presentes.

Todos os procedimentos descritos já foram amplamente utilizados em pesquisas científicas. Não haverá gastos adicionais, e os pesquisadores garantem não haver riscos ou desconforto de qualquer natureza para os participantes, além de responderem pelo caráter confidencial das informações. Os dados serão divulgados e os pesquisadores comprometem-se a fornecer aos entrevistados todas as informações obtidas durante a pesquisa.

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

O paciente incluído no estudo tem a liberdade de recusar-se a participar ou de retirar seu consentimento em qualquer fase da pesquisa, sem penalização alguma e sem prejuízo ao seu cuidado (Res. CNS 196/96 – item IV.1f) e receberá uma cópia do termo de Consentimento Livre e Esclarecido na íntegra por ela assinado (Item IV., 2d).

Pelo presente instrumento que atende às exigências legais, o(a) Sr.(a)

_____________________________________________________________, portador da célula de identidade n

o_________________________, responsável pelo escolar

_____________________________________________________________, após a leitura minuciosa da CARTA DE INFORMAÇÃO AO PACIENTE, devidamente explicada pelo(s) profissional (is), ficando ciente do procedimento a ser realizado, não restando quaisquer dúvidas a respeito do explicado, firma seu CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO, concordando em participar da pesquisa proposta. Fica claro que todo trabalho realizado se torna informação confidencial e será guardado por força do sigilo profissional.

Por estarem em acordo, assinam o presente termo. Londrina, ____de _______________de 2008. ______________________________________ Assinatura do paciente (Responsável)

__________________________________ ________________________________________ Klissia Romero Felizardo – pesquisadora Flaviana Bombarda A. Ferreira – pesquisadora

Apêndices 82

Apêndice 3 - Modelo do questionário entregue aos pais/responsáveis legais com o objetivo de levantar dados retrospectivos relacionados a problemas

sistêmicos e uso de medicamentos (antiinflamatórios e antibióticos, além de avaliar hábitos de higiene oral e dieta.

PROJETO: AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS SALIVARES LACTOFERRINA E LISOZIMA E PRESENÇA DE ESTREPTOCOCOS

DO GRUPO MUTANS EM CRIANÇAS COM E SEM CÁRIE DENTÁRIA

I – DADOS PESSOAIS

Nome completo da criança:________________________________________ .Sexo - 1.( ) M. 2.( ) F. Data de Nascimento _____________ Idade _________anos. Endereço __________________________________________________________Telefone________________. Nome da mãe:___________________________________________________Idade: ____anos. Escolaridade da mãe: ( )1º. Grau incompleto ( )1º. Grau Completo ( ) 2º. Grau incompleto ( )2º. Grau completo ( )3º. Grau Nome do pai:___________________________________________________Idade: ____anos. Escolaridade do pai: ( )1º. Grau incompleto ( )1º. Grau Completo ( )2º. Grau incompleto ( )2º. Grau completo ( ) 3º. Grau Profissão do pai: ________________________ Profissão da mãe: __________________________. II – HISTÓRIA MÉDICA DA CRIANÇA

1. Como classifica a saúde de seu filho ( ) ótima ( ) boa ( ) regular ( ) ruim ( ) muito ruim 2. Qual o problema de saúde que seu filho apresentou mais freqüentemente? ( ) 1. Infecção viral (virose) ( ) 2. Otite ( ) 3. Infecção urinária ( ) 4. Alteração dermatológica ( ) 5. Problemas respiratórios ( ) 6. Anemias ( ) 7. Convulsões ( ) 8. Outros: ____________________ 3. Com que freqüência tomou antibióticos (Amoxicilina) ( )nenhuma vez ( ) 1 vez ( ) 2 vezes ( )a cada 3 meses ( )a cada dois meses ( )todos os meses ( )mais de uma vez ao mês 4. Já ficou hospitalizado? ( )nenhuma vez ( )1 vez ( )2 vezes ( )3 vezes ( )mais de 3 vezes 5. Faz uso regular de algum medicamento? ( ) 1. Não ( ) 2. Sim Especificar_________________________________ 6. Tomou antibiótico nos últimos 2 meses? ( ) 1. Não ( ) 2. Sim Especificar_________________________________ 7. Tomou antiinflamatório nos últimos 2 meses? ( ) 1. Não ( ) 2. Sim Especificar_________________________________

Apêndices 83

III – SAÚDE BUCAL

8. Seu filho já foi ao dentista? ( ) 1. Não. ( ) 2. Sim. 9. Qual é a freqüência que vai ao dentista? ( ) 1. Regularmente a cada 6 meses ( ) 2. Uma vez por ano ( ) 3. Somente quando apresenta algum problema odontológico

10. Quantas vezes seu filho ingere açucar (chocolate, bolacha recheada, bala) por dia, fora das refeições?

( ) 1. Nenhuma vez

( ) 2. Até 3 vezes.

( ) 3. Mais de três vezes

11. Quantas vezes seu filho ingere salgadinhos, pão, lanchinhos, por dia, fora das refeições?

( ) 1. Nenhuma vez

( ) 2. Até 3 vezes.

( ) 3. Mais de três vezes

12. Atualmente, quantas vezes por dia seu filho(a) limpa os dentes? ( ) 1. Não limpa. ( ) 2. Uma vez. ( ) 3. Duas vezes. ( ) 4. Três vezes. ( ) 5. Outros. Especificar: ______________________________________________ 13. Seu filho utiliza o fio dental? ( ) 1. Não ( ) 2. Sim. 14. Seu filho utiliza dentifrício (creme dental) nas escovações? ( ) 1. Não ( ) 2. Sim

Apêndices 84

Apêndice 4 - Ficha clínica individual com os escores para o índice de placa bacteriana (sub-índice do índice de Higiene Oral Simplificado – IHOS) (GREENE & VERMILLION, 1964).

AVALIAÇÃO DE ÍNDICE DE HIGIENE ORAL

Apêndices 85

31 32 33 34 3 5 3 6 3 7 3 8 71 72 73 74 7 5

55 54 53 52 51

18 17 16 15 14 13 12 11

61 62 63 64 65 21 22 23 24 25 26 27 28

48 47 46 45 44 43 42 41

85 84 83 82 81

Apêndice 5 - Ficha clínica individual composta por um odontograma para

avaliação do Índice de cárie (CPO-D)

Examinadora: ..........................................……………………… Data: ........................ Paciente: ……………..................................................................

AVALIAÇÃO DE CÁRIE

ANEXOS

Anexos 87

Anexo 1 - Equipamento de escolha para a eletroforese em gel de

poliacrilamida. Sistema vertical (Bio-Rad/Miniprotean 3 cell/ 600 VDC/13W/USA),peça única para a execução dos géis.

Anexos 88

Anexo 2 - Tabelas de soluções utilizadas no preparo do gel de poliacrilamida.

Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: Solução tampão gel

SOLUÇÃO TAMPÃO GEL - (1,5 M TRIS HCl, pH 8.8 -200mL)

Foi dissolvido 36,3 g de TRIS (base) em 150 mL de água destilada. Em seguida adicionado HCl até obter um pH em torno de 8.8. Avolumou-se para 200 mL em proveta com água destilada. A solução foi armazenada a 4°C.


Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: Solução de estoque

Foi dissolvido 60 g de acrilamida (C3H5NO), e 1.6 g de bis acrilamida (C7H10N202) em 150 mL de água destilada, sendo o volume final de 200 mL, o mesmo avolumado em uma proveta. A solução foi filtrada em filtro de papel e armazenada a 4°C em frasco protegido da luz. A acrilamida é um produto neurotóxico e explosivo, assim devem ser manuseados com máscara e luva, evitando seu

aquecimento (máximo 70C). Nunca deve ser descartada na pia ou lixo comum. Tempo máximo de

uso: 3 meses.

Fonte: Antunes, 2003 Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: Gel de empilhamento

Foi dissolvido 3.0 g de TRIS (base) em 40 mL de água destilada. Adicionado HCl até atingir pH 6.8 e completado o volume para 50 mL. A solução foi mantida em temperatura de 4°C.

Fonte: Antunes, 2003 Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: Solução de SDS (10%)

SOLUÇÃO DE SDS (Sodium dodecyl sulfate) – (10%)

Foi dissolvido 10 g de SDS em 70 mL de água destilada. Depois completado o volume para 100 mL e armazenado em temperatura ambiente.


Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: Tampão de corrida (sem SDS)

SOLUÇÃO DE ESTOQUE DE ACRILAMIDA 30% e BIS-ACRILAMIDA 0,8% (200 mL)

STACKING GEL (Gel de empilhamento) – (0.5 M TRIS/Cl, pH 6.8 – 50 mL)

Anexos 89

TAMPÃO DE CORRIDA – (0.025 M TRIS, 0,192 M glicina, pH 8.3) – sem SDS

Solução estoque (10 x) – Foi dissolvido 30,28 g de TRIS (base) e 144,13 g de glicina em 500 mL de água destilada. Foi completado o volume para 1000 mL. Não se ajusta o pH, a diluição é feita na hora de usar, sendo: 1 parte de tampão (10 mL de SDS-10%) + 9 partes (100 mL de tampão de corrida sem SDS) e avoluma-se com água destilada até completar 1000 mL.

Fonte: Antunes, 2003 Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: Tampão de amostra

Foi acrescentado 3,4 mL de água destilada, 1,0 mL de 0,5 M TRIS-HCl pH 6.8 (Stacking gel buffer), 1,6 mL de solução de SDS (10%), 0,4 mL de β-mercaptoetanol, 1 pitada de azul de bromofenol (1 g). Volume total 8,0 mL. Esse tampão pode ser armazenado à temperatura ambiente. Diluiu-se a amostra no tampão de amostra na proporção de 1:4. Aquece a 95°C por 4 minutos. A amostra, depois de preparada foi armazenada em congelador.


Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: TEMED

TEMED (N, N, N’, N’ TETRA METHYLETHYLENEDIAMINE) – 50 Ml

(BioRad Laboratories)- Catalog 161-0801

Foi aliquotada a solução em eppendorf de 1,5 mL.


Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: Solução Descorante

SOLUÇÃO DESCORANTE (10% ácido acético, 30% metanol)

Misturou-se 100 mL de ácido acético em 300 mL de metanol, avolumando com água destilada (600 mL). Usa-se para descoloração rápida do gel.


TAMPÃO DE AMOSTRA – TAMPÃO REDUTOR COM SDS

(62,5mM TRIS HCl, 20% SDS, 5% β-mercaptoetanol – pH 6.8 e bromofenol)

Anexos 90

Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: Solução Corante

Foi dissolvido o Coomassie Blue e o sulfato de amônia em ácido acético. Depois completado com água destilada para o volume desejado. Os géis devem ser corados no mínimo por 24h e descorados em água destilada (várias lavagens) ou solução descorante.


Preparo das soluções para o gel de poliacrilamida: Solução de Persulfato de Amônio (PSA-10%)

SOLUÇÃO DE PERSULFATO DE AMôNIO (PSA) – 10%

Foi dissolvido 1 g de PSA em 10 mL de água destilada, e usada imediatamente. O restante foi congelado em eppendorfs. Descongelar e logo em seguida usar a solução.


SOLUÇÃO CORANTE (0,025% Coomassie Blue R-250, 40% Metanol, 7% ácido acético)

Anexos 91

Anexo 3 - Descrição da montagem das partes para o preparo do gel de

poliacrilamida.

Documents

AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS … · centro de ciÊncias biolÓgicas e da saÚde mestrado em odontologia klÍssia romero felizardo avaliaÇÃo do padrÃo de