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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE
DERIVADOS SEMICARBAZÔNICOS COMO POTENCIAIS
CANDIDATOS A FÁRMACOS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Andréa Vasconcelos Santos
Recife/ 2011
ANDRÉA VASCONCELOS SANTOS
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE
DERIVADOS SEMICARBAZÔNICOS COMO POTENCIAIS
CANDIDATOS A FÁRMACOS
Orientador: Prof. Dr. Dalci José Brondani
Recife/2011
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas do Centro de Ciências
da Saúde da UFPE, como requisito
parcial para obtenção do grau em
MESTRE EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS.
Santos, Andréa Vasconcelos
Avaliação das atividades biológicas de derivados Semicarbazônicos como
potenciais candidatos a fármacos / Andréa Vasconcelos Santos. – Recife: O
Autor, 2011.
145 folhas: il., fig. ; 30 cm.
Orientador: Dalci José Brondani.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS.
Ciências Farmacêuticas, 2011.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Nitrofurazona. 2. Doença de chagas. 3. Nitrocompostos. 4.N-Alquilação. I.
Brodani, Dalci José. II.Título.
UFPE
615.31 CDD (20.ed.) CCS2012-08
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LABSINFA – LABORATÓRIO DE PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DE
FÁRMACOS
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE DERIVADOS
SEMICARBAZÔNICOS COMO POTENCIAIS CANDIDATOS A FÁRMACOS
BANCA EXAMINADORA
Presidente:
Prof. Dr. Dalci José Brondani- DCFar/ UFPE
Membro Interno Titular:
Prof. Dr. Sebastião José de Melo- DA/UFPE
Membro Externo Titular:
Profa. Dra. Teresinha Gonçalves da Silva - DA/UFPE
Membros Suplentes:
Profa. Dra. Ivani Malvestiti- DQF/ UFPE
Profa. Dra. Janete Magali de Araújo DA/UFPE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Dr. José Tadeu Pinheiro
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Dalci José Brondani
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Profa. Dra. Ana Cristina Lima Leite
Dedicatória
A Deus, por sempre ter abençoado todos os meus momentos;
Aos meus pais, por terem me fornecido muito mais do que o
necessário para que minhas vitórias fossem conquistadas;
À minha madrinha Zuleide Diniz (in memorian) por ter feito
parte da minha educação e por sempre ter apostado em mim;
Aos meus irmãos e irmãs, pois sem sua ajuda e apoio eu
simplesmente não teria chegado até aqui.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me proporcionar vida, saúde, boas oportunidades, bons amigos e uma
família abençoada,
Aos meus pais, Socorro e Francisco, por tudo que aprendi durante a vida, pelo apoio e
compreensão, além de carinho, luta, amor e dedicação, me auxiliando a superar todas
as dificuldades e conquistar meus sonhos e me fazendo aprender com meus erros;
Aos meus irmãos Marcos, Eduardo, Daniel e Júnior pelos ensinamentos, apoio,
carinho, atenção e união;
Às minhas irmãs, Patrícia e Luciana, por sempre terem sido pra mim os exemplos de
tudo o quero ser quando crescer, ao lado de minha mãe, são as maiores lutadoras que
já conheci;
Aos meus familiares, em especial os mais próximos que sempre estiveram presentes
em todas as etapas da minha vida;
Aos amigos de Laboratório e agregados: Wan, Victor, Lucas, Lecílio, Daurinha,
Jannieres, Elany, Gevânio, Janessa e Laís por terem passado pela minha vida e
deixado muitos momentos bons que se transformaram em amizade;
À minha amiga Marcia, por ter estado realmente presente incondicionalmente em
todos os momentos, a Leilane, Hellen e Juliana, por terem estado junto comigo na
tortuosa e alegre caminhada dos últimos cinco anos;
Ao meu orientador Prof. Dr. Dalci José Brondani pela oportunidade de convívio e
aprendizado com todos os obstáculos e alegrias que a vida acadêmica pôde me
oferecer;
A todos os professores que fazem parte do PPGCF por compartilharem conosco seus
vastos conhecimentos e experiências;
Aos funcionários do DCFar, em especial Iguaci, Fátima e Margareth.
À CAPES, pela concessão do auxílio financeiro durante esses dois anos, possibilitando
a realização do projeto.
“Filho meu, guarda as minhas palavras, e
conserva dentro de ti os meus mandamentos”
Provérbios 7:1
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Barbeiro (Triatoma infestans), inseto transmissor da Doença de Chagas
Figura 2. Casas de pau-a-pique, um dos fatores predisponentes para o aparecimento da
doença de Chagas
Figura 3. Estimativa da população global afetada pelo Trypanosoma cruzi, 2009
Figura 4. Formas evolutivas do T. cruzi – A: formas amastigotas intracelulares, B: formas
tripomastigotas sangüíneas e C: formas epimastigotas
Figura 5. Ciclo biológico da doença de Chagas
Figura 6. Sinal de Romaña e Chagoma de inoculação
Figura 7. Coração de pacientes que desenvolveram doença de Chagas e morreram por: (A)
morte súbita, (B) megacólon ou mega-esôfago e (C) insuficiência cardíaca congestiva
Figura 8. Subestruturas químicas fundamentais de nitrocompostos empregados em
terapêutica: Derivados Nitrofurãnicos(1), Nitrotiofênicos(2), Nitroimidazólicos(3) e
Nitrobenzênicos(4).
Figura 9. Estrutura molecular da Nitrofurazona (5-nitro-2-furaldeído-semicarbazona).
Figura 10. Estrutura molecular do Beznidazol (Bzd) (6) e Nifurtimox (Nfx)(7)
Figura 11. Cascata de eventos, dependentes da TR, responsáveis pela neutralização das
espécies reativas de oxigênio (TR = Tripanotiona Redutase, TXN = Triparedoxina, TXNPx =
Triparedoxina peroxidase)
Figura 12. Estrutura quimica de novos compostos antichagásicos: (8) ravuconazol, TAK-187,
(10) K-777 e (11) D-0870
Figura 13. Estrutura química dos compostos antichagásicos (12) e (13)
Figura 14. Projetos em desenvolvimento de novos compostos antichagásicos
Figura 15. Estrutura geral de semicarbazonas e numeração dos átomos
Figura 16. Estrutura de complexos metálicos de semicarbazona com vanádio (V)
Figura 17. Estrutura química da Nitrofurazona
Figura 18. Estruturas de semicarbazonas com atividade anticonvulsivante: (21) benzaldeído
semicarbazona ; (22) para-bromobenzaldeído semicarbazona; (23) 2-tetralona semicarbazona
e (24) ariloxi(aril)-benzaldeído semicarbazona
Figura 19. Estrutura molecular dos nitrocompostos com alta atividade antimicrobiana
Figura 20. Estrutura do Metronidazol.
Figura 21. Estrutura geral de derivados nitrofurazônicos avaliados por Brondani et al
Figura 22. Estrutura do1-(1,5-dicloropentano-3-il)-4-nitrobenzeno
Figura 23. Esquema reacional de biorredução de nitrocompostos
Figura 24. Mecanismo proposto de dano ao DNA e indução de Carcinogênese pelo Nitrofural
Figura 25. Derivados guanil-hidrazonas com atividade Antitripanossomal
Figura 26. Estrutura química da pró-droga formada pela Nitrofurazona e Primaquina e sua
conversão através da ação da cruzipaína
Figura 27. Derivados 5-nitro-2-furaldeído e 5-nitro-tiofeno-2-carboxialdeído semicarbazona,
substituídos na posição N-4 da semicarbazona por cadeias alifáticas, arílicas e aminas
heterocíclicas
Figura 28. Estrutura geral de derivados nitrofurânicos e nitrotiofênicos avaliados por M.
Paulino, 2002
Figura 29. Estrutura química do Hidroximetilnitrofural (NFOH-121)
Figura 30. Derivados nitrofurânicos com potencial atividade anti-T. cruzi
Figura 31. Derivados semicarbazônicos estudados por Vega-Teijido et al.(2006)
Figura 32. Estruturas químicas dos compostos derivados de nitrofurilsemicarbazona com
Rênio (I) e Rutênio (II) desenvolvidos por OTERO et al., 2006
Figura 33. Estrutura quimica dos compostos semicarbazona (38), heptilcarbazato (39) e
adamantil (40)
Figura 34. Derivados sintetizados e avaliados como agentes anti-T. cruzi por Gerpe et
al.(2009)
Figura 35. Estrutura química do derivado 47 sintetizado por Cabrera et al.(2009)
Figura 36. Escpectro de RMN 1H do composto S08.
Figura 37. Espectro de IV do composto S08.
Figura 38. Espectro de RMN 1H do composto S02.
Figura 39. Espectro de Infravermelho do composto S02.
Figura 40. Espectro de IV do composto S10.
Figura 41. Estrutura química dos derivados semicarbazônicos sintetizados.
Figura 42. Estrutura química do derivado S02, Nifurtimox e Nitrofurazona.
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Rota de síntese de semicarbazonas a partir de 1-vinilpirrol-2-carboxaldeído
Esquema 2. Rota de síntese de 4-bromo-3-metilfenil semicarbazona
Esquema 3. Mecanismo envolvido na reação de Lawesson
Esquema 4. Esquema da primeira síntese da Nitrofurazona
Esquema 5. Preparação piloto para preparação industrial da Nitrofurazona
Esquema 6. Rotas de síntese para N-Alquilação de semicarbazonas.
Esquema 7. Reação de condensação entre semicarbazida hidroclorada e 2-tiofeno-
carboxaldeído na presença de HCl.
Esquema 8. Rota geral de obtenção de derivados da Nitrofurazona.
Esquema 9. Rota geral de obtenção de derivados do composto S02.
Esquema 10. Mecanismo de obtenção do composto S02.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Óbitos por Doença de Chagas Aguda (DCA) no Brasil, 2005-2010
Tabela 2. Principais efeitos colaterais observados no tratamento específico da Doença de
Chagas
Tabela 3. Derivados da Nitrofurazona N2 e N
2,N
4-alquilados.
Tabela 4. Derivados da Semicarbazona S02, N2 e N
2,N
4-alquilados.
Tabela 5. Estruturas químicas dos derivados S01-S13.
Tabela 6. As principais bandas de absorção (cm-1
) dos grupos inerentes às moléculas
sintetizadas.
Tabela 7. Valores das ZMI dos compostos testados, em mm.
Tabela 8. Valores da Concentração Mínima Inibitória e Concentração Mínima Bactericida
para os compostos S03-S09 frente às cepas avaliadas em µg/mL.
Tabela 9. Atividade anti-T. cruzi dos derivados semicarbazônicos.
Tabela 10. Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três
linhagens tumorais testadas na dose única de 25 µg/mL.
Tabela 11. Percentual de inibição do crescimento celular (IC50%) das amostras em três
linhagens tumorais
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Bdz- Benznidazol
Nfx - Nifurtimox
TCC- Cruzaína do T. Cruzi
TR- Tripanotiona Redutase
DCA- Doença de Chagas Aguda
GABA- Ácido γ-amino-butírico
NO2- Grupo nitro
JEFCA- (Joint FAO/WHO Expert Committee on Animal Nutrition).
RMN – Ressonância Magnética nuclear
CCD- Cromatografia em camada delgada
EtOH- Álcool etílico
MeOH- Metanol
p-TsOH- Ácido para-tolueno sulfônico
GR- Glutationa redutase
MRSAs- Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
DMSO- Dimetil sulfóxido
K2CO3- Carbonato de Potássio
CMI- Concentração mínima Inibitória
CMB- Concentração mínima Bacteriostática
DHFR-
GAPDH-
Diidrofolato redutase
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
NFOH- Hidroximetilnitrofurazona
IV- Infravermelho
RESUMO
A Doença de Chagas, ou Tripanossomíase Americana, é a infecção causada pelo protozoário
Trypanosoma cruzi. Apresenta uma fase aguda, que pode ser identificada ou não, com
tendência à evolução para a forma crônica, caso não seja tratada precocemente com
medicamento específico. Esta enfermidade ocorre principalmente na América Latina, a
contaminação nessa região afeta 18 a 20 milhões de indivíduos. No Brasil e na maioria dos
países, apenas o Benznidazol (Bdz) está disponível para o tratamento da doença de Chagas, e
apesar de seu uso clínico, este fármaco apresenta efeitos colaterais severos, sendo ativo
apenas na fase aguda da doença. Neste contexto, faz-se necessário a busca de novas
substâncias com potencial atividade anti-T. cruzi. Derivados semicarbazônicos têm sido
estudados quanto às suas propriedades antichagásica, antitumoral e antimicrobiana, dentre
eles, os derivados da Nitrofurazona (5-nitro-2-furfurilidenosemicarbazona), um
antimicrobiano de largo espectro de ação contra microorganismos Gram-positivos e Gram-
negativos, como também potente ação para a forma aguda da doença de Chagas. Utilizando as
boas propriedades destes compostos e buscando aperfeiçoá-las, aplicamos a técnica de
modificação molecular, para obtenção de derivados mais potentes e menos tóxicos. Novos
derivados semicarbazônicos foram sintetizados mediante a alquilação em meio aprótico, na
posição N2 e N
2,N
4 da porção semicarbazona para aumentar sua lipofilia. Ao realizar esta
reação com quantidades equimolares de semicarbazona e haletos de alquila são produzidos
derivados N2-monoalquilados que foram os mais ativos da série quanto à atividade
antimicrobiana em ensaio in vitro frente a microorganismos patogênicos quando comparados
aos dialquilados nas posições N2,N
4. Quanto à atividade antitumoral, semicarbazonas
possuem histórico de potencial mutagênico, porém novos estudos têm demonstrado que esse
potencial depende da dose empregada e do alvo específico. Diante disto, submetemos nossas
moléculas a testes de inibição de crescimento frente às linhagens de células de carcinomas de
cólon, mama e pulmão, e destes, o composto S04 mostrou-se mais promissor, com IC50=4,9
µg/ml. Para a avaliação antichagásica os derivados apresentaram atividade promissora para a
cepa epimastigota, com destaque para a substância S02, que apresentou IC50=0.5µg/ml e
citotoxicidade cerca de quatro vezes menor do que o Beznidazol. Desta forma, através deste
estudo é evidenciado que estes derivados podem ser considerados promissores protótipos não
apenas para a Doença de Chagas, como também para avanços na terapia antibacteriana e
antineoplásica.
Palavras chave: Nitrofurazona, Doença de Chagas, Nitrocompostos, N-Alquilação.
ABSTRACT
The Chagas disease, or American Trypanosomiasis, is the infection caused by the protozoan
Trypanosoma cruzi. Presents an acute phase, that can be or not identified, there is a tendency
to evolve to a chronic case, if untreated early with specific medicine. This illness occurs
mainly in Latin American, the contamination in this region affects 18 to 20 millions of
people. In Brazil and majority of countries, only the Benznidazole (Bdz) is available to the
treatment of Chagas disease, and despite of its clinical use, this drug presents severs collateral
effects, being active only in illness acute phase. In this context, it’s necessary the search of
new substances with potential activity anti-T. cruzi. Derivatives semicarbazones have been
studied about their Antichagasic properties, antitumor and antimicrobial, among them, the
Nitrofurazone’s derivatives (5- nitro- 2- furfurilideno semicarbazones), a broad-spectrum
antimicrobial that act against Gram – positive and Gram – negative microorganisms, like its
powerful action to the acutely chagas disease. Using the good properties of these compounds
and searching improve them, we applied the technique of molecular modification, to
achievement of derivatives more potent and less toxic. New derived semicarbazones were
synthesized by alkilation in aprotic media, in the position N² e N², N4
of semicarbazones
portion to increase their lipophilicity. To perform this react with equimolar quantities of
semicarbozone and alkyl halides, derivatives are produced N² monoalkyl who were the most
active of the serie as the antimicrobial activity in test in vitro front to pathogenic
microorganisms when compared to dialkyl in positions N², N4. As the antitumor activity,
semicarbozones have a mutagenic potential history, however new studies have shown that this
potential depends on the dose used and the specific target. Front it, submit our molecules to
growth inhibition tests against the carcinoma cell lines of colon, breast and lung, and in these,
the compound S04 proved be more promising, with IC50 = 4,9 µg/ml. To the antichagasic
evaluation, the derivative presented promising activity to the strain epimastigote, with
featured to the S02 substance, that presented, IC50=0.5µg/ml and citotoxicity about four times
lower than the Benznidazole. So, through this study is evidenced that these derivatives can be
considered promising prototypes not only to the Chagas disease, also to advances in
antibacterial and antineoplastic therapy.
Keywords: Nitrofurazone, Chagas Disease, Nitrocompounds, N-alkylation
SUMÁRIO
CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA E OBJETIVOS, 20
I- 1 INTRODUÇÃO, 21
I- 2 REVISÃO DA LITERATURA, 24
I- 2.1 Doença de Chagas, 24
I- 2.1.1 Generalidades da Doença de Chagas, 24
I- 2.1.2 Ciclo Biológico, 27
I- 2.1.3 Manifestações Clínicas, 30
I- 2.1.4 Tratamento e Alvos Terapêuticos, 31
I- 2.2 Química e Potencias atividades biológicas das semicarbazonas, 39
I- 2.2.1 Síntese das Semicarbazonas, 39
I- 2.2.2 Potenciais farmacológicos das semicarbazonas, 44
I- 2.2.3 Potencial antichagásico das Semicarbazonas, 51
I- 3 OBJETIVOS, 60
I- 3.1 Objetivo Geral, 60
I- 3.2 Objetivos Específicos, 60
REFERÊNCIAS, 61
CAPÍTULO II - OBTENÇÃO DOS DERIVADOS SEMICARBAZÔNICOS,74
II- 1 INTRODUÇÃO, 75
II- 2 METODOLOGIA,75
II- 2.1 Procedimento Geral de Obtenção das Semicarbazonas N2 e N
2,N
4-Alquiladas,75
III- 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO, 77
REFERÊNCIAS, 89
CAPÍTULO III - AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS, 90
III 1 INTRODUÇÃO,91
III- 2 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA,91
III- 2.1 Metodologia,91
III- 2.1.1 Método da difusão em discos de papel,91
III- 2.1.2 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) e Concentração
Mínima Bactericida (CMB), 93
III- 2.2 Resultados e discussão, 94
III 3 AVALIAÇÃO ANTICHAGÁSICA E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE, 97
III- 3.1 Metodologia,97
III- 3.1.1 Ensaio de citotoxicidade dos compostos em células esplênicas,97
III- 3.1.2 Avaliação da atividade tóxica dos compostos em células de camundongos
isogênicos,98
III- 3.1.3 Avaliação da atividade dos compostos contra Trypanosoma cruzi,98
III- 3.2 Resultados e Discussão,99
III- 4 AVALIAÇÃO ANTITUMORAL – AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE IN
VITRO,102
III- 4.1 Metodologia,102
III- 4.2 Resultados e Discussão,103
REFERÊNCIAS,107
CAPÍTULO IV CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS,109
VI- 1 CONCLUSÕES,110
VI- 2 PERSPECTIVAS,111
CAPÍTULO V- PARTE EXPERIMENTAL,112
V- 1 PARTE EXPERIMENTAL, 113
V- 1.1 Materiais e Métodos,113
V- 1.1.1 Cromatografias,113
V- 1.1.2 Pontos de Fusão,113
V- 1.1.3 Espectroscopias de IV, RMN 1H,113
V- 1.1.4 Equipamentos,113
V- 1.1.5 Reagentes e solventes,114
V- 1.2 Procedimentos Experimentais,115
V- 1.2.1 Síntese e Caracterização estrutural,115
V- 1.2.1.1 Composto S01 – 5-nitro-furaldeído semicarbazona,115
V- 1.2.1.1.1 Caracterização,115
V- 1.2.1.2 Composto S02 – 2-tiofenocarboxaldeído semicarbazona,116
V- 1.2.1.2.1 Caracterização,116
V- 1.2.1.3 Composto S03 – 2-secbutil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona,117
V- 1.2.1.3.1 Caracterização,117
V- 1.2.1.4 Composto S04 – 2-pentenil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona,118
V- 1.2.1.4.1 Caracterização,118
V- 1.2.1.5 Composto S05– 2,4-pentenil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona,119
V- 1.2.1.5.1 Caracterização,120
V- 1.2.1.6 Composto S06 –2-butil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona,120
V- 1.2.1.6.1 Caracterização,121
V- 1.2.1.7 Composto S07 – 2,4-dibutil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona,121
V- 1.2.1.7.1 Caracterização,122
V- 1.2.1.8 Composto S08 – 2-pentil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona,122
V- 1.2.1.8.1 Caracterização,123
V- 1.2.1.9 Composto S09 – 2,4 dipentil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona,123
V- 1.2.1.9.1 Caracterização,124
V- 1.2.1.10 Composto S10 – 2-secbutil- 1-tiofenocarboxaldeído semicarbazona,124
V- 1.2.1.10.1 Caracterização,125
V- 1.2.1.11 Composto S11 – 2,4-di-secbutil- 1-tiofenocarboxaldeído semicarbazona,125
V- 1.2.1.11.1 Caracterização,126
V- 1.2.1.12 Composto S12 – 2-pentenil- 1-tiofenocarboxaldeído semicarbazona,126
V- 1.2.1.12.1 Caracterização,127
V- 1.2.1.13 Composto S13 –2,4--pentenil- 1-tiofenocarboxaldeído semicarbazona,127
V- 1.2.1.13.1 Caracterização,128
V- 1.2.2 Avaliação da Atividade Antibacteriana,128
V- 1.2.2.1 Metodologia,128
V- 1.2.3 Avalização da atividade anti- T.cruzi.,129
V- 1.2.3.1 Metodologia,129
V- 1.2.3.1.1 Ensaio de citotoxicidade dos compostos em células esplênicas,130
V- 1.2.3.1.2 Avaliação da atividade tóxica dos compostos em células de camundongos
isogênicos,130
V- 1.2.3.1.3 Avaliação da atividade dos compostos contra Trypanosoma cruzi,131
REFERÊNCIAS,132
ANEXOS,133
20
Capítulo I
INTRODUÇÃO, REVISÃO
DA LITERATURA E
OBJETIVOS
21
I- 1 INTRODUÇÃO
A Química Medicinal estuda as razões moleculares da ação dos fármacos de
maneira a descrever a relação entre a estrutura química e a atividade farmacológica,
hierarquizando as diferentes contribuições funcionais. No contexto inverso, inclui-se o
planejamento e o desenho estrutural de novas substâncias que possuam propriedades
farmacoterapêuticas úteis, capazes de representar novas entidades químicas, candidatas
a protótipos de novos fármacos de uso seguro1.
O arsenal terapêutico atualmente disponível permite o tratamento da maioria das
doenças. No entanto, a eficácia da quimioterapia depende de fatores como a incidência
de resistência microbiana, efeitos colaterais e tóxicos, baixa eficácia e seletividade.
Adicionalmente, a ausência de compostos eficazes frente a doenças órfãs, como
algumas doenças infecto-contagiosas e alguns tipos de câncer evidenciam as
deficiências da terapêutica atual. Estes fatos demonstram a grande necessidade de
desenvolvimento de novos agentes bioativos, com eficácia comprovada, para o
tratamento dessas enfermidades e que possuam toxicidade e efeitos colaterais
compatíveis com a condição de fármaco. Neste sentido, alguns nitrocompostos,
candidatos potenciais a agentes terapêuticos, destacam-se como antibacterianos,
antiparasitários e até como antineoplásicos, o que ressalta a importância desta classe de
substâncias2.
O grupo nitro está presente em uma variedade de substâncias que apresentam
atividade antimicrobiana e antiparasitária, como por exemplo: furazolidona,
metronidazol, secnidazol, tinidazol, cloranfenicol, nitrofurantoína, nitrofural
(Nitrofurazona, atividade antimicrobiana), oxamniquina (atividade esquistossomicida);
benznidazol (BZN) e nifurtimox (atividade antichagásica), como também em outras
diversas classes terapêuticas como: ranitidina (anti-úlcera, anti-H2), nimesulida
(antiinflamatório) e clonazepam (ansiolítico)3.
Devido às importantes ações biológicas e à ocorrência da toxicidade elevada dos
nitrocompostos e seus derivados, o uso de técnicas racionais de modificação molecular
se mostra como promissora alternativa para a otimização da atividade biológicas destas
22
substâncias. Entre elas, se destaca a modificação baseada no Bioisosterismo, técnica que
utiliza compostos protótipos com mecanismos de ação bastante conhecidos, assim como
suas propriedades físico-químicas, sua biodisponibilidade, mecanismos de inativação e
efeitos colaterais4.
O sucesso desta estratégia no desenvolvimento de novas substâncias que são
terapeuticamente atraentes têm levado a um crescimento significativo de aplicação em
distintas classes terapêuticas, sendo amplamente utilizado pela indústria farmacêutica
para descobrir novos análogos de inovações terapêuticas comercialmente atraentes (me-
too), e também como uma ferramenta útil na modificação molecular4.
Todo ano morrem mais de um milhão de pessoas em todo mundo vítimas de
doenças intituladas negligenciadas. As opções de tratamento para estas patologias,
quando disponíveis, são ineficazes e ultrapassadas, causando uma série de efeitos
colaterais, além de não promoverem a cura definitiva. As doenças tropicais são os
principais representantes destas enfermidades, atingindo em sua grande maioria, pessoas
muito pobres, distribuídas pelos países com baixo nível de desenvolvimento sócio-
econômico.
Levando-se em consideração que as pessoas afetadas por essas doenças não
representam um mercado lucrativo para atrair investimentos necessários para a pesquisa
e o desenvolvimento de novos medicamentos, essas doenças vêm sendo
progressivamente marginalizadas por decisões dos responsáveis pelos programas de
pesquisa, tanto no setor privado, quanto no setor público. Entre 1975 e 2004, apenas 21
medicamentos foram registrados para doenças tropicais e tuberculose, ainda que estas
doenças constituam mais de 11% da carga global de doença. Durante o mesmo período,
1.535 medicamentos foram registrados para outras doenças5.
Desde a descoberta da Doença de Chagas, em 1909, pesquisadores têm se
empenhado na busca por fármacos que possam ser realmente eficazes contra esta
doença, promovendo a cura parasitológica tanto na fase aguda quanto na fase crônica.
Todavia, passados mais de cem anos, este é um problema que ainda permanece sem
uma solução adequada, visto que as duas principais drogas aplicadas na terapêutica, o
Nifurtimox e o Benznidazol se tratam de fármacos considerados de ação supressiva, não
curativa, apresentando atividade antiparasitária, porém sem capacidade de cura radical
da infecção, além disso, são compostos que apresentam alto índice de efeitos colaterais.
23
O Nifurtimox, um nitrofurano com estrutura geral 3-metil-4-(5´-
nitrofurfurilidenoamino)tetrahidro-4H-1, 4-tiazina-1,1-dióxido, foi comercializado
como nome de Lampit®, vem tendo sua produção descontinuada a partir da década de
1980, inicialmente no Brasil e depois na Argentina, Chile e Uruguai. O Benznidazol,
(N-benzyl-2-nitroimidazol acetamida) comercializado no Brasil com o nome de
Rochagan®, ainda é a melhor opção disponível para a terapia antichagásica.
Associando a grande incidência de parasitoses em nosso país ao fato de as cepas
brasileiras de Trypanosoma cruzi serem resistentes ao Nifurtimox e a ameaça de
suspensão da produção do Beznidazol pela Roche no Brasil, é de suma relevância e
urgência o desenvolvimento de agentes antichagásicos realmente eficazes,
principalmente para a fase crônica da doença6.
Semicarbazonas e semicarbazidas são importantes grupamentos farmacofóricos na
busca por novas drogas. Suas atividades biológicas e diversidade de aplicações médicas
são exemplificadas por uma gama de propriedades terapêuticas, atuando contra
Trypanosoma cruzi, tumor e bactérias7. Entre as semicarbazonas merece destaque o
Nitrofural (5-nitro-2-furfurilidenossemicarbazona), conhecido também como
Nitrofurazona. É quimioterápico de escolha para o tratamento de infecções
estafiloccócicas de pele resistentes a outros fármacos, sendo utilizado no tratamento, por
aplicação local, de infecções de feridas, queimaduras e ulcerações da pele, como
também, no preparo de superfícies de enxerto de pele8.
Tendo em vista as promissoras atividades dos derivados semicarbazônicos, neste
trabalho são aplicados métodos de modificação molecular com o objetivo de se obter
derivados mais lipofílicos através de metodologia simples de N-alquilação destes
compostos, para oferecer ao amplo arsenal terapêutico novas escolhas para a terapia
antibacteriana, novas drogas para o restrito tratamento anti-T. cruzi e um novo caminho
entre as pouco exploradas alternativas para a terapia antineoplásica desta classe de
substâncias.
24
I-2 REVISÃO DA LITERATURA
I-2.1 DOENÇA DE CHAGAS
1-2.1.1 Generalidades da Doença de Chagas
A Doença de Chagas, ou Tripanossomíase Americana, é a infecção causada pelo
protozoário Trypanosoma cruzi. Apresenta uma fase aguda que pode ser identificada ou
não (doença de Chagas aguda – DCA) e tendência à evolução para as formas crônicas,
caso não seja tratada precocemente com medicamento específico. Superada a fase
aguda, aproximadamente 60 a 70% dos infectados evoluirão para uma forma
indeterminada, sem nenhuma manifestação clínica da doença de Chagas. O restante,
entre 30 % a 40 %, desenvolverá formas clínicas crônicas, divididas em três tipos de
acordo com as complicações apresentadas: cardíaca, digestiva ou mista, esta última com
complicações cardíacas e digestivas9.
Globalmente a Doença de Chagas é descrita como a terceira mais importante
doença parasitária, sendo responsável por significativos encargos econômicos e de
saúde pública na América Latina11
. Nesta região, a enfermidade afeta 18 a 20 milhões
de indivíduos, porém nas últimas décadas tem sido detectado um aumento substancial
de casos nos Estados Unidos da América, Canadá, em muitos países europeus e do oeste
do Pacífico, fato atribuído à migração da população latino-americana para estas
regiões10
.
Estimativas informam que essa doença mata aproximadamente 14 mil pessoas por
ano nessa região, matando mais do que qualquer outra doença negligenciada, inclusive a
malária. Relata-se também que outros 100 milhões de indivíduos vivam em áreas de
risco de contaminação12, 13
.
Descoberta e descrita pelo grande cientista Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas
em Abril de 1909, a Doença de Chagas tem como seu agente etiológico o protozoário
Trypanosoma cruzi, por ele assim nomeado em homenagem a Oswaldo Cruz, e o inseto
vetor, um triatomíneo conhecido popularmente como barbeiro, Triatoma infestans,
(Figura 1) pelo hábito de picar o rosto de suas vítimas, descobertos previamente no
final de 190814, 15,16,17
.
25
Figura 1. Barbeiro (Triatoma infestans), inseto
transmissor da Doença de Chagas18
.
A doença é um exemplo típico de uma injúria resultante das alterações produzidas
pelo ser humano ao meio ambiente. O protozoário responsável pela parasitose vivia
restrito à situação silvestre, circulando entre mamíferos do ambiente natural através do
inseto vetor ou, também, por via oral através da ingestão de vetores e mamíferos
infectados. O homem se fez incluir no ciclo epidemiológico da doença, oferecendo ao
vetor hemíptero vivendas rurais de péssima qualidade (Figura 2), as chamadas casas de
pau-a-pique19
.
Relatos da literatura têm informado que a transmissão vetorial foi
significativamente reduzida devido aos esforços de controle, como a Iniciativa do Cone
Sul, um dos maiores programas de cooperação internacional contra a doença de Chagas,
criada em Brasília em julho de 199120,21
.
As formas mais importantes de transmissão da doença de Chagas ainda são as
vetoriais, seja via lesão resultante da picada, seja por mucosa ocular ou oral. Contudo,
apresenta também grande importância epidemiológica a transmissão transfusional e a
congênita. Mais recentemente, houve surtos de transmissão por meio da via oral, devido
à ingestão de alimentos contaminados, como cana-de-açúcar e açaí22
. A transmissão
transfusional ganhou relativa importância epidemiológica nas duas últimas décadas, em
função da migração de indivíduos infectados para os centros urbanos e da ineficiência
26
no controle das transfusões nos bancos de sangue23
. A falta de conhecimento e
informação em postos de saúde leva à deficiência na notificação dos casos (Tabela 1),
acarretando carência no levantamento de dados extremamente necessários para a
epidemiologia da Doença de Chagas 27
.
Recentes estudos mostraram um crescimento rápido e notável em países fora da
América Latina, intitulados países não-endêmicos (Austrália, Canadá, Espanha e
E.U.A). Isto se deve ao advento da migração de aproximadamente 15 milhões de
pessoas vindas de área conhecidamente endêmicas, como pode ser observado na Figura
3 15,24
.
Figura 2. Casas de pau-a-pique, um dos fatores predisponentes para o aparecimento da doença de Chagas
25.
Enquadrando-se no setor das doenças negligenciáveis a Doença de Chagas não
representa um mercado lucrativo para atrair investimentos necessários para a pesquisa e
o desenvolvimento de novos medicamentos, sendo por este motivo, progressivamente
marginalizadas por decisões dos responsáveis pelos programas de pesquisa, tanto no
setor privado, quanto no setor público26
27
REGIÃO NÚMERO DE ÓBITOS
(2005-2010)
Nordeste 3
Norte 13
Centro-Oeste 0
Sul 3
Sudeste 1
Brasil 20
Tabela 1. Óbitos por Doença de Chagas Aguda
(DCA) no Brasil, 2005-201027
.
Figura 3. Estimativa da população global afetada pelo Trypanosoma cruzi, 2009
28.
I- 2.1.2 Ciclo Biológico
O ciclo biológico do T. cruzi é do tipo heteroxênico, passando o parasito por uma
fase de multiplicação intracelular no hospedeiro vertebrado (homem e mamíferos
pertencentes a sete ordens diferentes) e extracelular no inseto vetor (triatomíneos). Este
ciclo compreende três estágios ou formas principais, dotadas de características
morfológicas e biológicas distintas. As formas evolutivas envolvidas nesse ciclo são a
amastigota, tripomastigota e epimastigota(Figura 4)29
.
28
Os amastigotas possuem formas arredondadas ou ovóides, imóveis, desprovidas
de flagelo livre. Agrupam-se em "ninhos" na intimidade de tecidos diversos do
hospedeiro vertebrado. Trata-se da forma de multiplicação do parasita no hospedeiro
vertebrado e medem de 1,5 a 4 µm de diâmetro30
.
Os tripomastigotas apresentam corpo alongado, com cerca de 20 µm de
comprimento. São formas encontradas no sangue dos hospedeiros vertebrados e nas
porções terminais do intestino dos vetores30
.
A forma epimastigota, apresenta cerca de 20 µm de comprimento e trata-se da
forma multiplicativa do parasita no intestino do triatomíneo, e é também a forma
predominante em cultivo axênico, sendo por isso, mais comumente utilizada em estudos
bioquímicos31
.
Figura 4. Formas evolutivas do T. cruzi – A: formas amastigotas intracelulares, B: formas
tripomastigotas sangüíneas e C: formas epimastigotas32
.
Considerando o mecanismo natural de infecção pelo T. Cruzi, os tripomastigotas
metacíclicos eliminados nas fezes e urina do vetor, durante ou logo após o repasto
sanguíneo, penetram pelo local da picada e interagem com células do sistema
mononuclear fagocitário da pele ou mucosas. O parasita tem acesso facilitado ao
interior do organismo pelo toque das mãos, já que a picada causa irritação local. Se a
picada for próxima dos olhos ou da boca, o parasita pode penetrar diretamente pelas
mucosas. Uma vez dentro do organismo, os tripomastigotas entram em uma variedade
de células, dentro das quais se transformam em amastigotas. Nesse estágio, os parasitas
reproduzem-se por fissão binária 33, 34,35
.
A seguir, ocorre a diferenciação dos amastigotas em tripomastigotas, que são
liberados da célula hospedeira caindo no interstício. Estes tripomastigotas caem na
corrente circulatória, atingem células de qualquer tecido ou órgão para cumprir novo
29
ciclo celular. Por vezes, estes podem ser destruídos por mecanismos imunológicos do
hospedeiro ou ainda serem ingeridos por triatomíneos, onde cumprirão seu ciclo
extracelular29
.
No estômago do inseto triatomíneo, a forma tripomastigota transforma-se
gradualmente em formas arredondadas, algumas com um longo flagelo colado ao corpo
e outras com um curto flagelo, chamadas de esferomastigotas e epimastigotas,
respectivamente. Em seguida, os parasitas migram para o intestino, onde se
multiplicam como formas epimastigotas, o que pode ser observado cerca de 25 horas
após o repasto sanguíneo. Posteriormente migram para a parte mais posterior, atingindo
o reto, e transformam-se em tripomastigotas metacíclicos, que são eliminados junto com
as fezes e urina do triatomíneo fechando assim o ciclo evolutivo do T. cruzi29
,
demonstrado na Figura 5.
Figura 5. Ciclo biológico da doença de Chagas36
.
30
I-2.1.3 Manifestações Clínicas
A infecção chagásica humana pode se manifestar na forma aguda (sintomática ou
assintomática), na forma crônica e indeterminada. Na maioria dos casos, a fase aguda da
doença é oligossintomática, principalmente em adultos, não sendo valorizada pelo
paciente ou pelo agente de saúde. Esta tem seu início evidenciado através das
manifestações locais geradas quando o T. cruzi penetra na conjuntiva ou na pele,
denominadas de sinal de Romaña e Chagoma de inoculação, respectivamente (Figura
6). Estas lesões aparecem em 50% dos casos agudos dentro de 7-10 dias após a picada
do barbeiro, regredindo em um ou dois meses37
.
Figura 6. Sinal de Romaña e Chagoma de inoculação38
.
As manifestações gerais são representadas por febre, mal-estar geral, dor de
cabeça, perda do apetite, fraqueza, edema localizado ou generalizado, inchaço de
gânglios linfáticos (adenopatia), hepatomegalia e esplenomegalia39
. A fase aguda da
doença pode durar de um mês a um ano, podendo o paciente evoluir para a fase crônica
ou indeterminada. Após a fase aguda, os sobreviventes passam por um longo período
assintomático, cerca de 10 a 30 anos, sendo esta fase chamada de indeterminada40
.
Aproximadamente 50% dos pacientes chagásicos que tiveram a fase aguda
evoluem para a fase indeterminada, que, apesar de assintomática e de apresentarem
lesões muito discretas, pode causar morte súbita de alguns pacientes mais debilitados29
.
Cerca de um terço dos casos agudos da doença de Chagas avança para a fase crônica.
Esta, em alguns casos, segue imediatamente o período agudo. Pacientes nessa fase da
doença apresentam manifestações clínicas diversas, afetando de forma irreversível um
ou mais órgãos. A cardiopatia chagásica crônica e o aparecimento dos megas
31
(megaesôfago e megacólon, principalmente) representam as formas clínicas de maior
gravidade 41,42
.
As manifestações digestivas são representadas principalmente no Brasil e na
Argentina pelos megas, onde aparecem alterações morfológicas e funcionais
importantes, como, por exemplo, a incoordenação motora (aperistalse, discinesia)
caracterizando o megaesôfago e o megacólon. Na forma cardíaca, o coração mostra-se
macroscopicamente aumentado de volume e mais pesado do que o normal, com peso de
550 g em média e hipertrofia das paredes (Figura 7). Dentre os seus principais sintomas
enquadram-se arritmias (75.000 casos/ano), insuficiência cardíaca, trombo-embolismo,
insônia, congestão visceral e edema dos membros inferiores29
.
Figura 7. Figura 9: Coração de pacientes que desenvolveram doença de
Chagas e morreram por: (A) morte súbita, (B) megacólon ou mega-esôfago
e (C) insuficiência cardíaca congestiva43
.
I-2.1.4 Tratamento e Alvos Terapêuticos
A doença de Chagas, por sua grande difusão, intensidade das manifestações que
pode apresentar e pela complexidade de sua profilaxia, representa grave e alarmante
problema sanitário44
. Mesmo após mais de 100 anos da sua descoberta, o tratamento
específico anti- T. Cruzi permanece inapropriado e irresoluto, levando a efeitos
supressivos, podendo apenas diminuir a parasitemia no curso do tratamento, não
garantindo, portanto, a cura definitiva37
.
Os primeiros compostos desenvolvidos experimentalmente para o tratamento
específico da tripanossomíase americana, após a sua descoberta em 1909, foram o
atoxyl (arsênico), a tintura de fucsina, o tártaro emético (antimonial pentavalente) e o
32
cloreto de mercúrio. Todos estes compostos se mostraram ineficazes no tratamento
proposto, além de exibirem uma alta toxicidade 45,46
.
Entre os anos de 1936 e 1960 diversos medicamentos foram testados na tentativa
de obter-se êxito, porém estes apenas obtiveram resultados negativos ou duvidosos47
.
Maior atenção foi dada aos nitrocompostos a partir da década de 40, com sua introdução
e emprego em terapêutica, período em que milhares de compostos desta classe foram
sintetizados e testados frente a diversas doenças, dentre estas a doença de Chagas48
.
Estes pareciam ter atividade biológica dependente da presença do grupo nitro ligado à
molécula, e entre estes nitrocompostos, destacam-se os derivados nitrotiofênicos,
nitrofurânicos, nitrobenzênicos e nitroimidazólicos (Figura 8).
Figura 8. Subestruturas químicas fundamentais de nitrocompostos empregados em terapêutica:
Derivados Nitrofurãnicos(1), Nitrotiofênicos(2), Nitroimidazólicos(3) e Nitrobenzênicos(4).
A década de 60 trouxe diversos avanços na terapia da Doença de Chagas, com
mudanças benéficas em nível de direcionamento para o desenvolvimento de novos
fármacos eficazes neste tratamento. O primeiro passo foi dado a partir da utilização de
um derivado dos nitrofuranos, a Nitrofurazona (5-nitro-2-furaldeído-semicarbazona)
(Figura 9), em esquema de duração prolongada (53 dias em média) na dose de
100mg/kg/dia, que curava mais de 95% dos camundongos cronicamente infectados.
Entretanto, a conclusão final foi de que a Nitrofurazona poderia ser curativa, mas os
pacientes não toleravam os efeitos colaterais nas doses e tempo necessário para a cura,
devido a sua alta toxicidade49
.
No final da década de 1960 e início de 1970 dois novos nitrocompostos, os quais
são utilizados até hoje, surgiram trazendo melhores perspectivas para o tratamento da
doença de Chagas, tanto pelo potencial curativo, particularmente para a fase aguda,
ON
+
O-
O
R
SN
+
O-
O
R
N
N
R R
N+
O-
O N
+
O-
O
R
1 2 3 4
33
como também por exibirem uma melhor tolerância quando comparados aos
medicamentos anteriores. Essas duas drogas são o Nifurtimox (Nfx), um derivado
nitrofurânico: 3-metil-4-(5´-nitrofurfurilidenoamino) tetrahidro-4H-1, 4-tiazina-1,1-
dióxido (Bayer 2502) comercializado com o nome de Lampit; e o Benznidazol (Bdz),
um derivado 2-nitroimidazólico: N-benzyl-2-nitroimidazol acetamida (RO 7-1051),
comercializado com o nome de Rochagan® no Brasil e Radanil® na Argentina(Figura
10). No Brasil, o Benznidazol é o único a ser comercializado. O grupamento nitro
(NO2), considerado como parasitóforo, presente em ambas as moléculas está
diretamente relacionado nos seus mecanismos de ação, também contribuindo para a
elevada toxicidade apresentada por estas12
.
Figura 9. Estrutura molecular da Nitrofurazona
(5-nitro-2-furaldeído-semicarbazona).
O Nifurtimox é tripanossomicida contra as formas amastigotas do T. cruzi. Seu
mecanismo de ação envolve a redução parcial ao ânion radical seguida por auto-
oxidação para regenerar o nitrofurano original e formar o radical ânion superóxido e
outras espécies reativas de oxigênio, como o peróxido de hidrogênio e radical hidroxila.
O T. cruzi mostra-se deficiente em mecanismos de detoxificação para metabólitos do
oxigênio, particularmente o peróxido de hidrogênio, apresentando-se assim, mais
sensível ao estresse oxidativo do que às células vertebradas 49
.
5
34
Figura 10. Estrutura molecular do Beznidazol (Bzd) e Nifurtimox (Nfx).
A ação do Benznidazol não envolve danos oxidativos, e seu mecanismo de ação
parece envolver uma diminuição da síntese de proteínas, redução de incorporação dos
precursores de RNA e diminuição da incorporação da timidina em DNA50, 51
.
O radical nitro estaria envolvido com seu efeito tripanocida através da formação
de ligações covalentes com macromoléculas do T. cruzi. A duração média do tratamento
é de cerca de sessenta dias, mas quando a doença crônica é reativada como em pacientes
imunocomprometidos, este pode durar cinco meses ou mais. Apenas em tratamentos de
pacientes contaminados acidentalmente, como por exemplo, em um laboratório, a
duração da profilaxia é aproximadamente dez dias52
.
Embora tenham sido considerados um avanço para o tratamento da Doença de
Chagas, o Nifurtimox e Benznidazol não são exemplos de drogas ideais, visto que não
são ativos durante a fase crônica da doença e apresentam sérios efeitos colaterais e
requerem administração por longos períodos de tempo sob supervisão médica52
.
Apesar de termos o Benznidazol disponível há bastante tempo no mercado,
formulações pediátricas foram recentemente desenvolvidas pelo LAFEPE (Laboratório
Farmacêutico do Estado de Pernambuco) - único laboratório público a produzir o
medicamento no país – desde 2008, apesar do fato de que crianças até 12 anos
possuírem maiores chances de se beneficiarem com o tratamento por não apresentarem
ainda a sintomatologia crônica da doença53
. As pesquisas terminaram e o mesmo espera
agora a liberação do registro por parte da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) para começar a produção e comercialização do medicamento54
.
Estes compostos apresentam ainda bastantes inconvenientes (Tabela 2), tais
como: (a) graves e frequentes efeitos colaterais como vômito, anorexia, neuropatia
NNH
O
NN
N+
O-
O
ON
+
O-
O NN SO2
CH3
Bdz(6) Nfx(7)
35
periférica, dermopatia alérgica, alterações psíquicas, mutagenicidade, entre outras; (b)
sensibilidade seletiva para diferentes cepas de T.cruzi; (c) tratamentos muito longos 8,55
.
Associando a grande incidência de parasitoses em nosso país ao fato de as cepas
brasileiras de Trypanosoma cruzi serem resistentes ao Nifurtimox e a ameaça de
suspensão da produção do Beznidazol pela Roche no Brasil, é de suma relevância e
urgência o desenvolvimento de agentes antichagásicos realmente eficazes,
principalmente para a fase crônica desta doença55
.
Tendo em vista todo esse panorama que define a terapêutica da doença de Chagas
como algo ineficaz, ultrapassado e inapropriado, têm-se cada vez mais intensificada a
necessidade de recorrer a novas alternativas terapêuticas para a obtenção de fármacos
mais seguros, ativos e com alvos biológicos mais específicos, principalmente para a fase
crônica da doença. O desenvolvimento deste tipo de fármaco requer melhor
conhecimento do ciclo de vida e do metabolismo do T. cruzi.
Tabela 2. Principais efeitos colaterais observados no tratamento específico da Doença de Chagas 44,56
.
Neste sentido, enzimas específicas, presentes apenas nos tripanossomos estão
sendo estudadas como alvos. Entre os alvos quimioterápicos potenciais em T.cruzi
encontram-se a tripanotiona redutase, a glutationa redutase (GR), a cruzipaína
Sintoma/Sinal Beznidazol Nifurtimox
Anorexia ++ +++
Cefaléia + ++
Dermatopatia +++ +
Excitação psíquica - +++
Gastralgia + +++
Insônia + ++
Náusea ++ +++
Perda de Peso + +++
Polineuropatia + ++
Vômito ++ +++
36
(cruzaína) ou GP, serina, treonina e metaloproteinases, a GAPDH (gliceraldeído-3-
fosfato desidrogenase), e outras enzimas glicolíticas, a transialidase, a biossíntese de
purinas, o metabolismo de folato e pteridina, a biossíntese do RNAm e do ergosterol,
dUTP nucleotideohidrolase, o cinetoplasto, DNA topoisomerase de tripanosomatídeos,
α-hidroxiacidodesidrogenase isosoenzima II, oleato desaturase e DHOD (diidrooronato
desidrogenase)57
.
A Tripanotiona redutase (TR), trata-se de uma flavoenzima responsável pela
proteção do parasita contra radicais livres. Ocorre exclusivamente em
tripanosomatídeos, sendo indicada por vários autores como um dos mais promissores
alvos na busca por drogas tripanomicidas. Esta enzima é dependente de NADPH e
catalisa a redução da tripanotiona disulfeto [T(S)2] em tripanotiona ditiol [T(SH)2],
desencadeando, assim, uma cascata de eventos responsáveis pela neutralização de
espécies reativas de oxigênio (Figura 11). Desta forma, a TR mantém um ambiente
redutor no interior do parasita, protegendo-o contra o estresse oxidativo58
.
Derivados nitrofurânicos têm demonstrado que produzem inativação irreversível
desta enzima em condições anaeróbicas. Em uma etapa inicial estes compostos são
reduzidos pela enzima, os produtos finais desta reação são oxidados pelo oxigênio
molecular e atuam como inibidores enzimáticos, bloqueando a redução do substrato
fisiológico, “tripanotiona dissulfide” 59
.
Figura 11. Cascata de eventos, dependentes da TR, responsáveis pela neutralização das
espécies reativas de oxigênio(TR = Tripanotiona Redutase, TXN = Triparedoxina,
TXNPx = Triparedoxina peroxidase)58
A Cruzaína (TCC) é a principal cisteína protease do T. cruzi, liberada em todos os
estágios do ciclo de vida do parasita, porém entregue em diferentes compartimentos
celulares em cada um deles. Esta enzima é essencial para a replicação intracelular do
parasita e recentemente demonstrou-se que a infecção pelo T. cruzi pode ser curada em
37
células de ratos pelo tratamento com inibição irreversível da cruzaína60
. Diversos
trabalhos têm descrito a atividade inibitória provocada por diversos grupos de
compostos, como por exemplo, N-acilhidrazidas, uréias, tiouréias e
tiosemicarbazonas61
.
Grande esforço vem sendo exercido pelos pesquisadores para avançar na
terapêutica de uma doença que ainda permanece sem resolução definitiva. Diante destas
pesquisas, novos compostos (Figura 12) têm demonstrado potencial atividade
antichagásica e se encontram em diferentes fases de estudo, e alguns deles já estão em
fase pré-clinica, como: triazóis [ravuconazol (8) e TAK-187 (9)]; o inibidor irreversível
[K-777(10)] da cruzipaína, uma enzima (protease) essencial presente em todos os
estágios do T. cruzi e que possui atividade in vitro e in vivo; novos derivados triazóis,
como o D-0870 (11), que são inibidores da esterol C14α desmetilase do T. cruzi,
possuindo atividade potente e seletiva, erradicando o parasita em modelos animais em
ambas as fases da doença de Chagas (aguda e crônica), estando atualmente em
desenvolvimento como agentes antifúngicos sistêmicos 62
.
Figura 12. Estrutura quimica de novos compostos antichagásicos: (8) ravuconazol, (9) TAK-187, (10) K-
777 e (11) D-0870 62
.
Ainda em 2005, Aguirre et al desenvolveram 26 compostos derivados de
benzofuroxanas, entre eles, o composto (12), que originou diversos análogos com
excelente atividade in vitro, contra a forma epimastigota do T.cruzi, sendo o composto
8 9
10
11
38
(13) o mais eficiente. Também foi verificado que quando se retira o grupo fenil destes
análogos, ocorre perda de atividade (Figura 13) 63
.
Figura 13. Estrutura química dos compostos antichagásicos (12) e (13) 63
.
Embora haja um empenho pela busca por medicamentos para a doença de Chagas,
a Figura 14 mostra os cinco projetos em desenvolvimento, que fazem parte do portfólio
da Drugs for Neglected Diseases Initiative (DNDi), de novos agentes antichagásicos,
tais como: benzofuroxanas, inibidores de tripanotiona redutase (TR), inibidores de
diidrofolato redutase (DHFR), nitroimidazóis e o Ravuconazol, sendo que este último
merece destaque por encontrar-se em fase pré-clinica 64
.
Figura 14. Projetos em desenvolvimento de novos compostos antichagásicos 64
.
O
N
N OH2
R
O
N
N OH2
(12) (13)
39
I-2.2 Química e Potencias atividades biológicas das semicarbazonas
I-2.2.1 Síntese das Semicarbazonas
Semicarbazonas constituem uma importante classe de compostos que
continuamente vem sido bastante estudada na Química Orgânica Medicinal, devido a
sua ampla gama de atividades biológicas. Apresentam-se com a estrutura geral da
Figura 15 e são obtidas diretamente por meio da condensação entre aldeídos ou cetonas
com a semicarbazida, podendo ser empregados diferentes meios reacionais.
Figura 15. Estrutura geral de semicarbazonas
e numeração dos átomos.
Semicarbazonas podem ser utilizadas como importantes intermediários na síntese
orgânica, principalmente para obtenção de anéis heterocíclicos, como tiazolidonas,
oxadiazóis, pirazolidonas e tiadiazóis7. Várias publicações relatam, nos últimos anos,
diferentes métodos para a obtenção de diferentes aril-semicarbazonas que apresentam
alto potencial para uso em Química Medicinal.
Em 2008, Mikhaleva et al sintetizou uma série de semicarbazonas através da
condensação entre uma série de 1-vinilpirrol-2-carboxaldeído e a semicarbazida sob
agitação em etanol e com adição de 0,1% de ácido trifluoracético(Esquema 1), como
catalisador. Porém antes disso, a semicarbazida foi primeiro convertida em base pela
agitação por 1 hora em temperatura ambiente com quantidade equimolar de NaHCO3 65
.
N1
NH2
3
N4
R3
R2
R
R1
O
14
40
Esquema 1. Rota de síntese de semicarbazonas a partir de 1-vinilpirrol-2-carboxaldeído 65
.
Utilizando irradiação em microondas, Shalini e equipe, em 2007, obteve uma série
de 4-bromo-3-metilfenil semicarbazonas (Esquema 2) fazendo-se reagir 4-bromo-3-
metilfenil semicarbazida e diferentes aldeídos ou cetonas substituídos em etanol e ácido
acético glacial, como catalisador, por um período de 2-3 minutos 66
.
Esquema 2. Rota de Síntese de 4-bromo-3-metilfenil semicarbazona 66
.
O grupamento carbonila presente na estrutura das semicarbazonas pode ser
convertido a um grupamento tiocarbonilado, obtendo-se desta forma, uma
tiossemicarbazona, composto que, assim como as semicarbazonas, possui uma vasta
utilização na Química Medicinal. A reação utilizando o reagente de Lawesson é mais
eficaz, limpa, de fácil purificação, realizada em condições brandas e com excelentes
rendimentos. O mecanismo proposto para esta reação encontra-se no Esquema 3 67
.
Esquema 3. Mecanismo envolvido na reação de Lawesson 67
.
NR
CH2
O
NH2NH
NH2
O
+ NR
CH2
NNH
NH2
O1) NaHCO3
2) 0.1% CF3COOH
EtOH, 20-25 °C, 4h
NH NH
O
NH2
CH3
Br
NH NH
O
NCH3
Br
R1
R
Aldeídos ou cetonas subst.
CH3COOH glacial, MW (I=80%), 2-3 min
P+
S
S-
O
CH3
NNHR1R2N
O
^^^^^^
P
S
R
S
O
N
R1R2N^^^^^^
NNHR1R2N
S
^^^^^^
41
Semicarbazonas e seus complexos metálicos exibem uma vasta gama de
atividades biológicas, sendo extensamente estudadas suas diversas propriedades com
diferentes complexos metálicos. A atividade biológica dos complexos metálicos difere
tanto em relação ao ligante como em relação ao íon metálico em si 68
.
Em 2004, P. Noblía e colaboradores estudaram a atividade antitumoral in vitro de
cinco ligantes semicarbazônicos com vanádio(V), onde foi observado que estes
complexos apresentaram seletiva citotoxicidade para linhagens de células tumorais TK-
10 (Figura 16) 69
.
Figura 16..Estrutura de complexos metálicos de semicarbazona com vanádio (V) 69
.
O Nitrofural (5-nitro-2-furfurilidenossemicarbazona), conhecido também como
Nitrofurazona (Figura 17), foi sintetizado pela primeira vez em 1944, por Dood e
Stillman, com base no conhecimento de que o ácido furóico, bem como seus derivados
alquilados e mercuriais, apresentavam atividade bacteriostática contra bactérias Gram-
positivas e negativas, sendo menos ativo contra Pseudomonas pyocyne 70
. A
Nitrofurazona é conhecida comercialmente pelo nome de Furacim® (Schering-ploug)71
,
sendo mais tarde também comercializada pelos laboratórios Brasmedica e Lafepe.
Figura 17. Estrutura química da Nitrofurazona 70
.
A Nitrofurazona, quimicamente corresponde à semicarbazona do 5-nitrofurfural e
foi preparada originalmente de acordo com o Esquema 4. Nesta síntese, o furfural (17),
RN
+
O
NH
NH
O+
R
VO2
N+
O
NH
NH2
O+
VO2
15
16
42
protegido sob a forma de diacetato (18), é nitrado (na posição 5 do anel), obtendo-se o
5-nitro derivado (19) e posterior condensação com semicarbazida em ácido sulfúrico
diluído, resultando na Nitrofurazona (20) 70
.
Esquema 4. Esquema da primeira síntese da Nitrofurazona 70
.
A Nitrofurazona foi primeiramente empregada no tratamento de queimaduras e
outras infecções durante a II Guerra Mundial. Nessa época, foi observada atividade
antimicrobiana de amplo espectro e baixa incidência de sensibilização. Entretanto, o
espectro antibacteriano foi se modificando ao longo dos 20 anos a partir da primeira
utilização. Atualmente algumas cepas de bactérias Gram-negativas são resistentes a este
fármaco 8.
Em 1969, Andrade e Brener estudando os efeitos deste fármaco contra T. cruzi,
observaram que o nitrofurano em questão provocava extensa destruição parasitária 72
.
Por outro lado, em 1988, Henderson e colaboradores, estudando a tripanotiona redutase
(TR), observaram que derivados de naftoquinonas e nitrofuranos, incluindo a
Nitrofurazona, apresentavam capacidade de inibir esta enzima 73
.
Após sua origem e comercialização, a síntese da Nitrofurazona passou a ser
pesquisada a fim de se obter um método de otimização de produção para a indústria
farmacêutica e vários métodos têm sido usados. O material de partida usado na síntese
pode ser: 5-nitro-furfuraldiacetato, 5-nitro-furaldeído, 2-furaldeído ou
nitrofurfuraloxime, desde que 2-furaldeído seja uma substância econômica e possa ser
usado para produção de Nitrofurazona em escala industrial. O 2-furaldeído foi utilizado
como substância de partida, aplicado a condições variadas de tempo, temperatura, pH e
catalisadores de provas para obtenção de produtos com qualidade adequada, rendimento
e produção suficientemente boa para ser alcançada industrialmente. De acordo com
Tehrani e Fathali, em 2003, dos oito métodos testados, chegou-se apenas à obtenção de
O
O
O
CH(OAC)2O
CH(OAC)2N+
O-
OO
NNH NH2
O
N+
O-
O
(17) (18) (19) Nitrofurazona(20)
43
um método plausível como procedimento otimizado para preparação piloto para a
indústria, segundo o Esquema 5 74
.
Esquema 5. Preparação piloto para produção industrial da Nitrofurazona 74
.
A Nitrofurazona é tóxica quando administrada por via oral, causando hemólise e
neuropatia periférica grave. Por isso, foi retirado do mercado de alguns países e, em
outros como no Brasil, seu uso é permitido apenas por via tópica (em baixas doses, de 2
a 5%). É quimioterápico de escolha para o tratamento de infecções estafiloccócicas de
pele resistentes a outros fármacos, sendo utilizado no tratamento, por aplicação local, de
infecções de feridas, queimaduras e ulcerações da pele, como também, no preparo de
superfícies de enxerto de pele. Topicamente, pode provocar dermatite de contato 8.
A N-alquilação de derivados semicarbazônicos tem se mostrado bastante atrativa
para a Química Medicinal, em especial para os campos de atividade antimicrobiana,
antichagásica e antitumoral, pois se apresenta como uma das soluções em se melhorar a
lipofilia destes derivados, tendo em vista que, a alta polaridade de fármacos pode
dificultar suas atividades em organismos biológicos. Diversos métodos de N-alquilação
de aminas foram publicados durante os últimos anos na literatura, inclusive a síntese de
aminas terciárias a partir de aminas secundárias, mas não havia referência de métodos
com regiosseletividade para as porções hidrazina e hidrazona especificamente, devido à
ocorrência de múltiplas alquilações, resultando em misturas de aminas secundárias,
terciárias e até sais de amônia quaternários.
Em 1999, Srivastava e colaboradores demonstraram a seletividade proporcionada
por este método utilizando K2CO3 como base e haletos de alquila primários em meio
aprótico para obtenção de dialquil e trialquilaminas, de acordo com a natureza do
eletrófilo utilizado75
.
Baseado nestas propriedades, Brondani et al. descreveu em 2007, um método
seletivo para N2-alquilação em derivados semicarbazônicos, utilizando meio aprótico e
controle cinético(Esquema 6). Até então, os métodos de N-alquilação em derivados
O
O
OCH(OAC)2N
+O
-
O
O
NNH NH2
O
N+
O-
O
1) HNO3, H2SO4
2) (CH3CO)2O
NH2NHCONH2CL-
44
semicarbazônicos só eram regiosseletivos para a porção NH2 (N4-alquilação) do
grupamento amida, sendo bastante comum a ocorrência das já citadas overalquilações
(N2, N
4-alquilação)
7.
Esquema 6. Rotas de síntese para N-alquilação de semicarbazonas a
Temperatura ambiente(A) e na presença de aquecimento(B)7.
I-2.2.2 Potenciais farmacológicos das semicarbazonas
Nas últimas décadas as semicarbazonas têm sido alvo constante de pesquisas e
modificações estruturais baseadas em diferentes estratégias da química medicinal
devido à promissora atividade biológica que suas estruturas têm apresentado. Entre
estas, destaque têm sido dado aos potenciais anticonvulsivante, antitumoral,
antimicrobiano e antichagásico de seus derivados.
A epilepsia é uma das afecções mais comuns do sistema nervoso central e atinge
cerca de 1% da população mundial. Trata-se de um distúrbio crônico, com crises
recorrentes provocadas por uma excessiva descarga dos neurônios. Aproximadamente
25% dos pacientes epilépticos apresentam crises não controladas pela medicação
disponível na clínica, e muitas das drogas anticonvulsivantes provocam efeitos
colaterais adversos que limitam sua utilização. Desse modo, o desenho de novos
anticonvulsivantes constitui área de grande interesse na pesquisa de fármacos 76
.
Recentemente semicarbazonas adquiriram um importante papel como drogas
anticonvulsivantes, podendo ser consideradas como uma nova classe de
anticonvulsivantes orais 77
, e que são desprovidas do grupo dicarboximida – encontrado
em drogas convencionais como barbitúricos, hidantoinas, oxazolidinadionas, dentre
outros, que parece estar associado á toxicidade e efeitos colaterais78
.
NNH NH2
O
R
NN NH2
O
R
R1
NN NH
O
R
R1 R
1
A
B
45
O mecanismo de ação desses compostos é ainda assunto de investigação. Alguns
deles interferem com a ligação de bicuculina aos receptores do ácido γ-amino-butírico,
o GABA, e outros com a ligação de picrotoxina aos canais de cloreto, sugerindo que
esses seriam possíveis mecanismos76
.
Através de estudos de relações estrutura-atividade, Dimmock e colaboradores
partiram do membro mais simples da série de aril semicarbazonas, a benzaldeído
semicarbazona (Figura 18), e foram feitas várias modificações estruturais, tais como a
obtenção de um derivado contendo um bromo em posição para, ou a síntese de
derivados nos quais a cadeia lateral não está livre para girar e ainda derivados contendo
espaçadores em diferentes posições 79
.
A 4-bromobenzaldeído semicarbazona foi escolhida como protótipo pelo
“National Institute of Health (NIH)” americano sendo protegida por patente por não
apresentar propriedades pró-convulsivantes e não foi observado o aparecimento de
tolerância após sua administração em ratos por um longo período de tempo70
.
Figura 18. Estruturas de semicarbazonas com atividade anticonvulsivante: (21) benzaldeído
semicarbazona ; (22) para-bromobenzaldeído semicarbazona; (23) 2-tetralona semicarbazona e (24)
ariloxi(aril)-benzaldeído semicarbazona 79
.
Derivados do furano - anel heterocíclico oxigenado de cinco membros - possuem
ação bacteriostática e bactericida. Em 1944, Dodd e Stillman demonstraram que a
adição do grupo nitro ao C5 deste anel lhe conferiu uma potente ação antimicrobiana,
enquanto que a ausência deste grupo ou a presença do grupo nitro reduzido não
favorecia esta atividade79
.
São compostos ativos contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e são
muito mais ativos contra bactérias anaeróbias, pois estas contêm um sistema enzimático
NNH
NH2O
NNH
NH2O
Br
NNH
NH2O
NNH
NH2O
O
21 22 23 24
46
que reduz de maneira bem eficiente o grupo nitro. São menos ativos contra bactérias
aeróbias e totalmente inativos contra bactérias deficientes de sistema enzimático de
nitrorredução. Variações na cadeia lateral deste anel furano no C2 deram origem a bons
agentes antimicrobianos, os denominados nitrofuranos, e entre estes, a Nitrofurantoína,
Nitrofurazona e Furazolidona (Figura 19), os quais vêm sendo usados por mais de 40
anos para o tratamento de vários tipos de infecções bacterianas, os dois últimos,
respectivamente, são usados no tratamento de infecções tópicas e no trato
genitourinário80
.
Figura 19. Estrutura molecular dos nitrocompostos com alta atividade antimicrobiana80
.
O mecanismo de ação antibacteriano dos nitrofuranos ainda não está totalmente
esclarecido. Eles inibem muitos sistemas enzimáticos bacterianos, a maioria
provavelmente por dano ao DNA. Uma enzima bacteriana, a nitrorredutase, converte os
compostos em intermediários de vida curta, incluindo radicais oxigenados livres, que
interagem com o
DNA causando quebras e posterior dano às bactérias. A resistência bacteriana destes
compostos não é medida por plasmídios, mas parece ser causada por uma mutação
associada à perda de atividade da nitrorredutase bacteriana81
.
Ainda sobre o mecanismo de ação dos nitrofuranos, em 1954, Paul et al afirmam
que a atividade antimicrobiana dos nitrofuranos no geral é devida a interferência nas
fases precoces do ciclo de Krebs, precisamente pela inibição que se processa na
formação anaeróbica da acetil-coenzima A, com conseqüente bloqueio do metabolismo
glicídico das células bacterianas82
.
ONO2
N N
NH
O
O
Nitrofurazona(25) Nitrofurantoína(26)
ONO2
N NO
O
Furazolidona(27)
47
Dentre as várias atividades atribuídas aos derivados nitrofuranos, alguns trabalhos
apontam a atividade destes compostos frente ao crescimento e estágio de latência do
bacilo Mycobacterium bovis, sendo o Metronidazol (Figura 20) o primeiro composto
que possui atividade frente ao estágio latente deste bacilo, embora o crescimento
bacteriano não seja afetado por este fármaco, atuando como uma pró-droga que requer a
redução do seu grupo nitro para um intermediário reativo que então causa danos para o
DNA e subseqüentemente morte celular. Assim, vários nitrofuranos se mostram ativos
frente ao Micobaterium bovis, uma vez que esta bactéria em condições de hipóxia,
encontra-se sensível à ação do oxigênio radicalar proveniente da redução destes
nitrofuranos83
.
Figura 20. Estrutura do Metronidazol.
Em 2008, Brondani et al sintetizou e avaliou a atividade antimicrobiana de novos
derivados da Nitrofurazona, e dentre estes, o composto 29 (Figura 21) apresentou
melhor atividade, sendo efetivo contra B. subtilis, S. Aureus, S. faecalis, Candida sp e
Aspergillus niger. Em relação à ação frente a microorganismos multirresistentes
(MRSAs - Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), o mesmo derivado 29 também
apresentou melhor potência84
.
Figura 21. Estrutura geral de derivados nitrofurazônicos
avaliados por Brondani et al. 84
Recentemente foi publicado o uso destas drogas no tratamento de infecções
causadas por bactérias não convencionais, por exemplo, o uso da Furazolidona e
ON
N N
O
O2N R2
HR12a: R1 = n-C4H9
R2 = H
28
29
48
Nitrofurantoína na pneumonia causada por Pneumocystis carinii ou PCP, o uso da
Furazolidona no tratamento de úlcera duodenal causada por Helicobacter pylori em
combinação com Claritromicina e Omeprazol80
.
Os nitrocompostos já foram empregados em várias classes terapêuticas e
atualmente possuem muitas aplicações clínicas, entre as quais se citam, entre outros,
usos como antianginosos, sedativos hipnóticos, antiparasitários e até antineoplásicos,
caso da nitracrina e do 1-(1,5-dicloropentano-3-il)-4-nitrobenzeno(Figura 22). A
maioria dos nitrocompostos com ação antineoplásica, antiparasitária e antibacteriana
apresenta o processo de biorredução enzimática do grupo nitro como provável
mecanismo de ação, o que coloca este requisito como sendo imprescindível para o
desempenho da atividade biológica destes compostos2.
Figura 22. Estrutura do 1-(1,5-dicloropentano-3-il)-
4-nitrobenzeno
Apesar de ser possível atribuir a função antineoplásica aos nitrocompostos, a
maioria dos estudos publicada nos últimos anos relata a potencial função mutagênica e
carcinogênica dos mesmos. Estas propriedades dos nitrofuranos devem-se,
provavelmente, à presença de dois grupos potencialmente reativos: o nitro na posição 5
e os substituintes (R) na posição 2 do anel furânico. Para desencadear sua atividade
biológica, o grupo nitro é completamente reduzido envolvendo a adição de seis elétrons
para formar a amina via o intermediário nitroso (2e-) e hidroxilamínico (4e
-), entretanto
alguns fármacos não procedem além da formação da hidroxilamina (Figura 23)3.
(30) 1-(1,5-dicloropentano-3-il)-
4-nitrobenzeno
49
Figura 23. Esquema reacional de biorredução de nitrocompostos3.
O fato de que os nitrocompostos ultimamente foram bastante utilizados em
animais para o consumo humano, levou alguns institutos especializados a realizar
avaliações a cerca dos riscos oferecidos por essas moléculas, entre eles, o JEFCA (Joint
FAO/WHO Expert Committee on Animal Nutrition)3.
A JEFCA considerou que o NF é um cancerígeno secundário e que a furazolidona
possui efeitos carcinogênicos e genotóxicos. O IARC considerou que a furaltadona é um
agente possivelmente carcinogênico para humanos e que a nitrofurantoína não é
classificável relativamente à sua carcinogenicidade para humanos3.
Neste sentido, pressupõe-se que o Nitrofural possui atividade carcinogênica
devido à alteração no DNA (Figura 24). Adicionalmente, a atividade estrogênica do NF
pode contribuir também para a carcinogênese, sabendo que o estrogênio pode causar
câncer em órgãos reprodutivos de fêmeas, tais como mamas e útero3.
Figura 24. Mecanismo proposto de dano ao DNA e indução de
Carcinogênese pelo Nitrofural3.
1e- 1e
- 2e
- 2e
-
Ar-NO2 Ar-NO2- Ar-NO Ar-NHOH Ar-NH2
50
Entretanto, apesar dos relatos de toxicidade destes compostos, esforços têm sido
realizados no sentido de diminuir esse efeito deletério e alguns deles têm obtido
resultados positivos, principalmente no que se refere ao uso de nitrocompostos na
terapia antitumoral, principalmente no tratamento de tumores sólidos contendo áreas
com hipóxia, resultantes de vascularização insuficiente destes tecidos2.
O ambiente de baixa concentração de oxigênio intracelular permite a biorredução
dos nitrocompostos e subseqüente formação de radicais livres em potenciais de redução
menores que o observado para células normais; este fator provém base para a atividade
citotóxica seletiva de células em hipóxia, contribuindo assim para a ação de fármacos
antineoplásicos e dando margem para o planejamento de novos compostos mais
específicos em relação a esta função2.
Alguns compostos desta classe possuem capacidade para sensibilizar células com
hipóxia para a radiação ionizante. Neste mecanismo, o evento químico que determina o
efeito da radiossensibilização é o potencial de redução do grupo nitro. Outro fator
importante a ser observado é a afinidade eletrônica do grupo nitro, que quanto maior for
maior será a sua capacidade radiossensibilizante. Este campo de aplicação carece ainda
de estudos mais aprofundados e apresenta grande perspectiva de crescimento no que diz
respeito ao desenvolvimento de futuros compostos radiossensibilizantes. A
possibilidade de a atividade biológica ser dependente da ligação dos intermediários de
nitrorredução ao DNA promove questionamentos sobre o caráter mutagênico e
neoplásico dos nitrocompostos. Neste sentido, alguns pesquisadores têm demonstrado
que alguns nitrocompostos causam anomalias cromossômicas em mamíferos, o que
sugere a ocorrência de efeito genotóxico e mutagênico2.
Blumenstiel et al em 1999, utilizando diversos derivados nitrofurânicos com
atividade frente ao Trypanosoma cruzi comprovaram que alguns compostos como a
nifuroxazida e o nifuprazine não apresentam efeitos tóxicos às células de mamíferos
quando em concentrações menores que 10 μM. Adicionalmente, em estudo realizado
com dois derivados nitrofurânicos distintos, a nifuroxazida e a nitrofurantoína, foi
demonstrado que a ação mutagênica é dependente da estrutura química e da
concentração do nitrocomposto em determinado órgão ou tecido2.
Considerando o mesmo raciocínio, em estudo de citotoxidade realizado por Rossa
e colaboradores, em 2003, foi sugerido que o nitrofurânico analisado, o quinifuril, em
comparação a outro nitrocomposto, a nitracrina, já disponível na terapêutica, apresentou
51
alta toxicidade in vitro em células leucêmicas de rato e baixa toxicidade em células de
animais normais. A partir do exposto, torna-se plausível supor que a provável ação
mutagênica, assim como a toxicidade dos nitrocompostos é dependente de fatores como
a estrutura química, tempo de exposição e dose utilizada, o que demonstra a
possibilidade, sob condições controladas, do emprego antitumoral de alguns
nitrocompostos2.
I-2.2.3 Potencial antichagásico das Semicarbazonas
Em 1995, Messeder e colaboradores sintetizaram uma série de compostos guanil-
hidrazonas aromáticas e avaliaram-nas frente à forma tripomastigota do T. cruzi. Dentre
os compostos sintetizados, o derivado guanil hidrazona contendo o grupo nitro (Figura
25), apresentou melhor atividade frente ao ensaio, com IC50 = 17,1 μM e cerca de 12
vezes mais potente que o derivado contendo o grupo amino como substituinte, com IC50
= 220,6 µM, e 16 vezes mais potente que o derivado não-substituído, com IC50=273,9
µM85
.
Figura 25. Derivados guanil-hidrazonas
com atividade Antitripanossomal85
.
Em 1996, Chung et al sintetizaram uma série de pró-fármacos seletivos de
nitrofural e primaquina, tendo como grupos espaçantes aminoácidos e
dipeptídeos(Figura 26). A ação mista de inibição de tripanotiona redutase pelo
nitrofural e de formação de radicais livres pela primaquina, além da cisão específica
pela enzima só existente no tripanossoma foi a base para o planejamento desses
fármacos e todos eles mostraram-se ativos em culturas de células infectadas com T.
cruzi86
.
O
O
R
NNH NH2
+
NH2
Cl-
R = H, NO2, NH2
52
Figura 26. Estrutura química da pró-droga formada pela Nitrofurazona e Primaquina e sua
conversão através da ação da cruzipaína 86
.
Em 1998, Cerecetto et al sintetizaram uma série de 5-nitro-furaldeído e 5-
nitrotiofeno-2-carboxaldeído semicarbazonas, nas quais a porção N4-semicarbazona foi
substituída por aminas alifáticas, arílicas e heterocíclicas. Estes derivados foram
testados in vitro frente à forma epimastigota do Tripanosoma cruzi devido à
possibilidade de mimetizar a porção espermidine da tripanotiona redutase (Figura 27),
com potencial ação tripanocida. Os compostos mais ativos da série, com atividade
semelhante ao composto padrão, o Nifurtimox, possuíam os substituintes butil, 2-
metoxietil e hexil na posição N4 da semicarbazona, sendo este último o mais ativo de
todos, sugerindo que a atividade dos mesmos é mais dependente do comprimento da
cadeia carbônica do que dos efeitos eletrônicos trazidos pela presença de heteroátomos
em seus substituintes87
.
CRUZIPAÍNA
ON+O
-
O
N NHNH
OLys Arg
NHNH
O
ON+O
-
O
N NHNH2
O
NH2NH
O
NITROFURAZONA (Tripanotiona Redutase) PRIMAQUINA (Estresse Oxidativo)
53
Figura 27. Derivados 5-nitro-2-furaldeído e 5-nitro-tiofeno-2-carboxialdeído semicarbazona,
substituídos na posição N-4 da semicarbazona por cadeias alifáticas, arílicas e aminas
heterocíclicas87
.
M. Paulino et al estudaram, em 2002, derivados 5-nitrofuranos e análogos 5-
nitrotiofenos quanto à taxa de inibição enzimática promovida por esses compostos em
relação a tripanotiona redutase (TR) e a glutationa redutase (GR), enzimas responsáveis
pela defesa contra radicais livres, no parasita e em mamíferos, respectivamente. Foi
observado que, estes compostos são melhores inibidores da GR do que da TR, fato este,
que pode estar ligado a efeitos tóxicos no hospedeiro mamífero88
.
Em relação à inibição in vitro do crescimento do T. cruzi foi observado que os
derivados 5-nitrofuranos foram mais potentes que seus análogos 5-nitrotiofeno. Os
compostos 31 e 32 (Figura 28) foram os que apresentaram maior potência inibitória
frente ao parasita88
.
Figura 28. Estrutura geral de derivados nitrofurânicos avaliados por M. Paulino, 200288
.
Como intermediário da base de Mannich entre o nitrofural e o dipeptídeo de
primaquina, em 2003, Chung et al sintetizaram o derivado hidroximetilado do
nitrofural. O hidroximetilnitrofural (NFOH-121) (Figura 29), mostrou-se mais ativo
que o Beznidazol e também que o Nitrofural, ressaltando o papel da modificação
molecular, mais especificamente da latenciação, no aprimoramento da ação de
fármacos59
.
xN+O
-
O
N NHNH
OR
X
NNH NH
O
N+
O-
O
R
31 , R = -C3H7
32 - R = -C5H11
X=O,S
Fragmentos miméticos da
Porção Espermidina(TR)
54
A atividade do NFOH-121 foi evidente tanto nas formas evolutivas
tripomastigotas quanto nas amastigotas quando comparadas ao Benznidazol, usado
como droga padrão. Com as formas amastigotas, o Benznidazol apresentou um
percentual de 81,1% de inibição do seu crescimento, enquanto que com o derivado
NFOH-121 foi de 99,6 e 100%, nas doses de 5 e 10 μM, respectivamente. Neste mesmo
ensaio, na dose de 5 μM, a Nitrofurazona inibe 97,2%. Estes mesmos autores revelaram
que o composto NFOH-121 atua como um pró-fármaco da Nitrofurazona, apresentando
menor potencial mutagênico em relação ao próprio nitrofural59
.
Figura 29. Estrutura química do Hidroximetilnitrofural (NFOH-121)59
.
Também em 2004, Trossini sintetizou bases de Mannich do derivado
hidroximetilado do nitrofural(NFOH) com aminoácidos lisina(Lys) e arginina(Arg) e o
dipeptídeo lisina-arginina resultante(Lys-Arg).Os compostos foram sintetizados
utilizando-se métodos clássicos e alternativos e grupos protetores normalmente
utilizados na síntese de peptídeos. Ésteres metílicos de arginina e etílico de lisina foram
obtidos como forma de proteção do grupo carboxílico dos respectivos aminoácidos para
posterior reação com o nitrofural (NFOH). Foram obtidas, enfim, as bases de Mannich
NF-Arg-OMe, Lys-OMe e NF-Lys(Cl-Z)-Arg(Tos)-Me. A melhor rota sintética para a
preparação das bases de Mannich foi a que emprega quantidades equimolares de
nitrofurazona e do aminoácido protegido na forma de éster e excesso de formaldeído,
em meio ácido89
.
Neste mesmo ano, Aguirre et al sintetizou derivados 5-nitrofurano substituídos e
os avaliou in vitro frente à forma epimastigota do T. cruzi. A maioria de seus compostos
inibiu o crescimento do parasita na dosagem de 10 e 25 µM, enquanto que os compostos
34[Hexil 4-(5-nitrofurfurilideno) carbazato], com IC50= 3.2 µM, e 35(N-Hexil 3-(5-
nitrofuril)propenamida) (Figura 30), com IC50 = 2.0 µM, mostraram-se mais ativos do
ON+O
-
O
N NHNH
O
OH
33
55
que o Nifurtimox(IC50 = 7.7 μM) na dosagem de 5 µM, sendo portanto, apontados como
potentes substratos para a tripanotiona redutase90
.
Figura 30. Derivados nitrofurânicos com potencial atividade anti-T. cruzi90
.
Uma série de oito compostos derivados nitrofurânicos e tiofênicos (Figura 31)
foram utilizados em estudos de docking e cristalografia por Vega-Teijido et al(2006) a
fim de explorar três possíveis sítios de ligação na glutationa e tripanotiona redutase,
divididos em sítio ativo (AS), sítio de ligação ao NADPH (NS) e sítio localizado na
interface (IS) das enzimas-alvo. Os resultados dos estudos de docking sugeriram uma
tendência geral destes compostos em formar complexos com o sítio da interface tanto na
tripanotiona redutase, quanto na glutationa redutase, indicando também um papel
importante e prevalente das porções nitrofurano e tiofeno sobre o restante de cada
molécula. O contato mais relevante é demonstrado entre estas porções e os resíduos de
histidina presentes no sítio de ambas as enzimas, His75 na GR, e His72 na TR, o que
anteriormente só havia sido publicado a respeito da porção nitrofurano e não em relação
ao tiofeno91
.
Ambrósio et al (2004) estudaram a Hidroximetilnitrofurazona(NFOH-121) quanto
à sua interferência no processo de trans-splicing do RNA mensageiro do T. cruzi. Foi
constatado que o nitrofural hidroximetilado inibe este processo, mas não
completamente, dando suporte para estudos posteriores92
.
ON
+O-
O
N NHOR
1
O
ON
+O-
OO
x
Composto 34 (R1 = Hexil) Composto 35(X = Hexilamino)
56
Figura 31. Derivados semicarbazônicos estudados por Vega-Teijido
et al.(2006)91
O experimento de Otero et al(2006) mostra que complexos derivados de
nitrofurilsemicarbazona com Rênio (36) ou Rutênio (37) (Figura 32), podem ser um
bom ponto de partida no planejamento de novos compostos com atividade contra T.
cruzi, pois aumentam o estresse oxidativo e os níveis de ligação com o DNA93
.
Figura 32. Estruturas químicas dos compostos derivados de nitrofurilsemicarbazona
com Rênio (I) e Rutênio (II) desenvolvidos por Otero et al., 2006 93
xN+O
-
O
N NHNH
O R
X = O : 4-(R)-1-(5-nitrofurfurilideno) semicarbazida
X = S : 4-(R)-1-(5-nitrotiofilideno) semicarbazida
Nitrofuranos (X=O): A (R=2-metóxietil), B(R=2-feniletil),
C(R=2-butil), D(R=2-hexil).
Nitrotiofenos (X=S): E(R=2-metóxietil), F(R=2-feniletil),
G(R=2-butil), H(R=2-hexil)
Cl
Cl
Ph3P
Re3-
O
N+
O-O
N+
NH
NH2
O+
O-
S+
Cl
Cl
Ru4-
O
N+
O-O
N+
NH
NH2
O+
S+
O
O
35
36
57
Novos derivados 5-nitrofurânicos, semicarbazonas (38), carbazatos (39), e amidas
(40) (Figura 33) mostraram excelente atividade tripanocida: a presença de cadeias
apolares em cada família dos derivados resultou em compostos mais ativos do que
aqueles com substituintes mais polares. Os derivados de carbazatos apresentaram maior
atividade que os de semicarbazonas, sendo o heptil carbazato (39) o composto mais
potente, enquanto a presença do grupo apolar adamantil (40), confere a este composto
uma melhor atividade tripanocida94
.
Figura 33.Estrutura quimica dos compostos semicarbazona (38), heptilcarbazato (39) e adamantil (40)94
.
Gerpe et al (2009), avaliou a capacidade de 5-nitrofuranos e 5-nitrotiofenos em
promover acúmulo de escaleno no T. cruzi, baseados na capacidade destes compostos
possuírem dupla ação antiparasitária: produção de estresse oxidativo, potencialmente
devido à presença do grupo nitro e capacidade de impedir a síntese de esteróis através
da inibição da enzima escaleno epoxidase, essencial para o seu metabolismo.
Oito derivados foram sintetizados e destes, os compostos 41,43,45 e 46 mostraram
atividade anti-T. cruzi na forma epimastigota equivalente ou maior do que o Nifurtimox.
Nos estudos de acúmulo de escaleno, também em comparação ao Nifurtimox, os
compostos 41, 42 e 44(Figura 34) promoveram aglomeração até seis vezes maior,
indicando alta inibição da enzima escaleno epoxidase, enfatizando a presença do grupo
nitro em todos eles e demonstrando que esta classe de derivados é extremamente
importante na busca por novos agentes antichagásicos95
.
ON
+O-
O
N NHNH
O buti l
ON
+O-
O
N NHNH
O heptil
ON
+O-
O
NH
O
38 39
40
58
Figura 34. Derivados sintetizados e avaliados como agentes anti-T. cruzi por Gerpe et al.(2009)
95
Dez derivados 5-nitrofuranos foram testados por Cabrera et al.(2009) em animais
saudáveis através das vias oral e intraperitoneal em comparação à droga padrão, o
Nifurtimox. Todos os compostos apresentaram infiltrados inflamatórios menores do que
a droga padrão, e destes, o derivado 47, 4-Hexil-1-[3-(5-nitro-2-furil)-2-propenilideno]
semicarbazida (Figura 35), mostrou a melhor atividade como agente anti-T. cruzi na
musculatura lisa, demonstrando melhor perfil de toxicidade aguda, sendo mais efetivo
do que o Nifurtimox96
.
Figura 35. Estrutura química do derivado 47 sintetizado por Cabrera et al.(2009)
96.
Trossini et al investigaram, em 2010, a ação da Nitrofurazona(NF) e de seu
derivado Hidroximetilnitrofurazona(NFOH) sobre a cisteína-protease cruzipaína. Testes
in vitro foram realizados para ambos os compostos e apresentaram valores para IC50 de
22.83 ± 1.2 μM e 10.55 ± 0.81 μM para a NF e NFOH, respectivamente. Estudos de
modelagem molecular foram feitos, confirmando a alta atividade inibitória da
Hidroximetilnitrofurazona frente à cruzipaína97
.
ON+O
-
O
N NHNH
O R
zy
NNH NH
S
CH2
n
41, -Y = -NO2, -Z = -O-, n = 0
42 -Y = -NO2, -Z = -O-, n = 1
43 -Y = -H, -Z = -O-, n = 0
44 -Y = -H, -Z = -O-, n = 1
45, -Y = -NO2, -Z = -S-, n = 0
46, -Y = -H, -Z = -S-, n = 0
n = 1; R = -(CH2)5CH3
47
59
Dando continuidade aos estudos com o hidroximetilnitrofural, Davies et al.(2010)
realizaram estudos histopatológicos em camundongos contaminados pelo T. cruzi. Estes
animais foram divididos em grupos que foram tratados pela Hidroximetilnitrofurazona
(NFOH), Nitrofurazona, Beznidazol e solvente (grupo placebo). O tratamento com a
Nitrofurazona foi interrompido devido à alta taxa de mortalidade (75%), ao contrário do
NFOH, que apresentou baixo índice (16%), seguido do Beznidazol (33%) e do grupo
placebo (66%).
A Hidroximetilnitrofurazona manteve, assim como o Beznidazol, níveis
indetectáveis de parasitemia. Os estudos histopatológicos mostraram infiltrados de
parasitas mais severos no músculo esquelético e cardíaco dos animais no grupo placebo,
contrastando com o grupo tratado pelo NFOH, que apresentou os menores índices,
corroborando estudos anteriores que apresentam a Hidroximetilnitrofurazona como
promissor agente antichagásico 98
.
60
I-3 OBJETIVOS
I-3.1 Objetivo Geral
Síntese e avaliação biológica de derivados semicarbazônicos, visando
obtenção de compostos ativos contra o T. cruzi e de menor toxicidade que os
fármacos utilizados atualmente na farmacoterapia da doença de Chagas, assim
como submetê-los também a testes de atividade antimicrobiana e antitumoral,
evidenciando o largo espectro de atividades destes compostos.
I-3.2 Objetivos Específicos
Sintetizar novos derivados semicarbazônicos N2 e N
2-N
4-alquilados por meio de
alquilação regiosseletiva em meio aprótico;
Caracterizar a estrutura química dos compostos sintetizados através de
Espectroscopia de Infravermelho (IVTF) e Ressonância Magnética Nuclear de
Prótons (1H-RMN), Análise Elementar, Ponto de Fusão e Rf;
Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro dos novos produtos frente a bactérias
Gram-positivas, Gram-negativas, fungos filamentosos e leveduras;
Avaliar a atividade antitumoral in vitro diante de três linhagens de células
tumorais;
Avaliar a atividade antichagásica, em ensaio in vitro frente à forma epimastigota,
com determinação da IC50.
61
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73
74
Capítulo II
OBTENÇÃO DOS DERIVADOS
SEMICARBAZÔNICOS
75
II- 1 INTRODUÇÃO
Semicarbazonas compõem uma importante classe de compostos bastante utilizada
na busca por novas drogas devido à sua diversidade de aplicação na química medicinal,
por exemplo, como agentes antichagásicos, alta atividade antibacteriana e promissora
atividade antitumoral. Do ponto de vista da síntese orgânica, são também intermediários
para obtenção de anéis heterocíclicos, como tiazolidonas, oxadiazóis, pirazolidonas e
tiadiazóis. Estes compostos possuem um perfil de polaridade que confere dificuldade
durante o planejamento de novos agentes bioativos, portanto, a busca pela diminuição
desta polaridade conferindo maior lipofilia a seus derivados constitui base sólida para
grandes pesquisas futuras1.
II-2 METODOLOGIA
II-2.1 Procedimento Geral de Obtenção das Semicarbazonas N2 e N
2,N
4-Alquiladas
Para obtenção Semicarbazonas N2 e N
2,N
4-Alquiladas partiu-se de duas
semicarbazonas diferentes: a Nitrofurazona(5-nitrofuraldeído semicarbazona)(S01) e o
composto 2-tiofenocarboxaldeído semicarbazona(S02). A Nitrofurazona foi obtida
comercialmente e em sequência purificada por recristalização e o composto S02 foi
sintetizado a partir de semicarbazida hidroclorada e 2-tiofeno-carboxialdeído em etanol
e meio ácido catalítico sob aquecimento (Esquema 7).
Esquema 7. Reação de condensação entre semicarbazida hidroclorada e 2-tiofeno-carboxialdeído na
presença de HCl.
S
O
+ NH2 NH
NH2
O
HCl, EtOH S
N NHNH2
O
RT
S02
76
Uma vez obtido, o compostos S02 e S03 foram submetidos à alquilação
regiosseletiva em meio aprótico, utilizando DMF (Dimetilformamida) como solvente.
Para obtenção de produtos monoalquilados (N2) as semicarbazonas foram misturadas a
diferentes haletos de alquila e K2CO3(carbonato de potássio) como base a temperatura
ambiente por 48 horas utilizando DMF(Dimetilformamida) como solvente. Para
obtenção dos produtos dialquilados (N2, N
4) as mesmas semicarbazonas S01 e S02 são
submetidas às mesmas condições da reação de monoalquilação, com exceção do uso de
NaOH (hidróxido de sódio) como base e aquecimento em um período de 3-4 horas. A
obtenção dos derivados das semicarbazonas S01 e S02 são mostrados no Esquema 8 e
9.
Esquema 8 Rota geral de obtenção de derivados da Nitrofurazona.
Composto R1 R2
S01 H H
S03 H3CCHCH2CH3 H3CCHCH2CH3
S04 CH2(CH2)2CHCH2 H
S05 CH2(CH2)2CHCH2 CH2(CH2)2CHCH2
S06 CH2(CH2)2CH3 H
S07 CH2(CH2)2CH3 CH2(CH2)2CH3
S08 CH2(CH2)3CH3 H
S09 CH2(CH2)3CH3 CH2(CH2)3CH3
Tabela 3. Derivados da Nitrofurazona N2 e N
2,N
4-alquilados.
ROTA B - DMF ON
+O-
O
N NN
O
R1 H
R2
Rota A: K2CO3/RT/48h
Rota B: NaOH/100⁰C/3-4h
ROTA A - DMF
77
Esquema 9. Rota geral de obtenção de derivados do composto S02.
Composto R1 R2
S02 H H
S10 H3CCHCH2CH3 H
S11 H3CCHCH2CH3 H3CCHCH2CH3
S12 CH2(CH2)2CHCH2 H
S13 CH2(CH2)2CHCH2 CH2(CH2)2CHCH2
Tabela 4. Derivados da Semicarbazona S02, N2 e N
2,N
4-alquilados.
II- 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Duas semicarbazonas serviram de ponto de partida para a obtenção de produtos
alquilados: Nitrofurazona (5-nitrofuraldeído semicarbazona) e composto S02 (2-
tiofenocarboxaldeído semicarbazona). A Nitrofurazona foi obtida comercialmente, e
para aumentar o rendimento de suas reações, a mesma foi submetida à recristalização
em mistura de 20% de etanol em água destilada sob agitação e aquecimento, originando
cristais amarelos puros. O composto S02 foi obtido através da reação de condensação
entre a semicarbazida hidroclorada e o 2-tiofeno-carboxialdeído com bom rendimento e
gerando cristais amorfos puros.
S
N NHNH2
O
Rota B – DMF
S
NN
R1
N
O
H
R2
Rota A: K2CO3/RT/48h
Rota B: NaOH/100⁰C/3-4h
Rota A – DMF
78
Uma vez obtidas, as semicarbazonas S01 e S02 foram submetidas às reações de
alquilação na presença de haletos de alquila em meio aprótico na presença de base,
dando origem a produtos mono e dialquilados quando submetidos à agitação em
temperatura ambiente e aquecimento a 100⁰C, respectivamente. A partir da
Nitrofurazona (S01) foram obtidos sete produtos (S03-S09) e o composto S02 deu
origem a quatro produtos (S10-S13) expostos na Tabela 5.
.
S
N NHNH2
O
S02
O
N NNH
O
N+O
-
O
S03
O
N NNH2
O
N+O
-
O
S04
O
N NNH
O
N+O
-
O
S05
S01
79
O
N NNH2
O
N+O
-
O
S06
O
N NNH
O
N+O
-
O
S07
Tabela 5 Estruturas químicas dos derivados S01-S13.
O
N NNH2
O
N+O
-
O
CH3
S08
O
N NNH
O
N+O
-
O
CH3
CH3
S09
S
N NNH2
O
S10
S
N NNH
O
S11
S
N NNH2
O
S12
S
N NNH
O
S13
80
Durante a reação de obtenção do composto S02, a adição de ácido clorídrico ao
meio reacional (agente catalisador), provocou a protonação do solvente, EtOH, o qual,
então, cedeu próton (H+) para o oxigênio carbonílico do aril-aldeído presente em reação.
Após a protonação do aldeído, ocorre ativação da carbonila aldeídica, evento que
favorece o ataque nucleofílico pelo par de elétrons livres presente no N1 da molécula de
semicarbazida. Ao formar quatro ligações, o nitrogênio (N1) da semicarbazida torna-se
instável, voltando a ser um átomo neutro após transferência do próton de H+
ao oxigênio
que antes integrava o grupamento carbonila no aldeído.
Ocorrida esta transferência do H+ para o oxigênio, a instabilidade gerada neste
átomo favorece a formação de uma ligação imínica entre o N1 da semicarbazida e o “C
carbonílico” do aldeído inicial, com liberação de água. O N1 é então estabilizado pela
perda de mais um átomo de hidrogênio para a formação do composto final
arilsemicarbazônico. Estas etapas encontram-se esquematizadas a seguir:
81
OH
H
Et
H
ArO
H
ArOH H2NN NH2
O
H
N
Ar
HOH N
H
O
NH2
H H HO Et
N
Ar
HOH N
H
O
NH2
HO
H
H
EtN
Ar
OH N
H
O
NH2
H
H
H
N
N
H
O
NH2
HAr
H
+ H2O
HO Et N
N
H
O
NH2
Ar
H
Esquema 10. Mecanismo de obtenção do composto S02.
Vários métodos de alquilação de hidrazonas têm sido reportados durante os
últimos anos e em sua maioria, visando métodos que aumentem a regiosseletividade
para obter derivados mais específicos, mono, di ou trialquilados, com o intuito de
aumentar a lipofilia de suas moléculas e diminuir a probabilidade de que ocorram várias
alquilações ao mesmo tempo em uma única reação. A reação de alquilação dos
compostos S01 e S02 foram realizadas segundo método descrito por Brondani et al
(2007), simples e realizado em etapa única, levando à formação dos produtos em
diferentes proporções. Todos os derivados foram obtidos utilizando quantidades
semelhantes de reagentes e o mesmo solvente (DMF). O que as diferencia são as bases
utilizadas, o tempo de reação e presença ou ausência de aquecimento. A escolha da base
mais forte (NaOH) na presença de aquecimento e de K2CO3, base mais fraca, a
temperatura ambiente evidencia a regiosseletividade do método, pois o aquecimento
diminui a probabilidade de obtenção de forma mais específica o produto
monoalquilado, processo facilitado pela presença da base mais fraca. A elucidação
82
estrutural das moléculas sintetizadas foi obtida através de análises de dados fornecidos
por técnicas espectroscópicas de RMN de 1H e de infravermelho (IV). As principais
bandas de absorção dos grupamentos inerentes às moléculas sintetizadas encontram-se
listadas na tabela abaixo.
COMPOSTO
Banda
Amida I
(C=O)
Def. axial
C-H
tiofeno
Def.
angular
C-H
Alceno
Def.
axial
N-H
(hidrazínico)
Def.
angular
C-H
(cadeia aberta
alcano)
Def. simétrica
NO2
Def. assimétrica
NO2
S01 1714,18 - 1019,71 3461,25 - 1349,45 1508,59
S02 1645,00 3064,10 708,02 3449,53 - - -
S03
1728,02 - 1017,82 - 2958,46 1351,51 1542,66
S04 1702,28 - 1022,69 3485,48 - 1353,52 1577,02
S05 1711,06
- 1017,46 3422,98 2927,76 1346,38 1502,69
S06 1700,18 - 1016,68 3485,46 2947,78 1391,12 1579,71
S08 1705,05 - 1019,82 3461,25 2943,03 1352,79 1577,12
S10 1656,50 3073,83 701,11 3482,50 2928,95 - -
S11 1685,68 - 707,40 3413,84 2964,30 - -
S12 1691,73 3076,25 718,79 3473,14 2933,43 - -
S13 1681,24 3077,84 721,61 3425,95 2925,81 - -
Tabela 6. As principais bandas de absorção (cm-1
) dos grupos inerentes às moléculas sintetizadas.
De posse do conhecimento da existência dos grupamentos funcionais desejados,
evidenciado pela análise de infravermelho, a confirmação estrutural mais detalhada foi
realizada por RMN 1H. Através da interpretação dos espectros de IV pôde-se confirmar
que as semicarbazonas foram de fato alquiladas, pois as bandas de absorção
representantes da absorção característica de cadeias abertas de alcanos, representantes
de radicais alquila, estavam presentes nos compostos S03-S09 e S10-S13, e ausentes em
suas semicarbazonas de origem, S01 e composto S02.
83
Nos espectros de RMN 1H das moléculas S04, S05, S06 e S08 estão presentes
sinais característicos de hidrogênios ligados ao anel de cinco membros (furano),
representados por dois singletos com absorção entre 7,73 e 7,79 ppm, região própria
de absorção de hidrogênios ligados em heterociclos. Tomando como exemplo o
espectro de RMN 1H do composto S08(Figura 36), é possível identificar dois dubletos
em 7,41 e 7,79 ppm, de mesma constante de acoplamento(3 Hz), sendo o mais
desblindado o hidrogênio ligado à posição 4’ do anel furano, provavelmente devido ao
efeito anisotrópico causado pela sua proximidade espacial com o grupamento nitro,
sofrendo uma acentuada desblindagem e o mais blindado localizado na posição 3’ do
mesmo anel.
Nesse mesmo espectro é possível ainda visualizar um singleto com deslocamento
em ppm correspondente a dois hidrogênios NH2, os quais absorvem em uma
mesma freqüência e bastante desblindados devido ao efeito de deslocalização eletrônica
exercido pela ligação do carbono com oxigênio e nitrogênio da porção amida.
A ligação dupla fixa que não permite a rotação da porção NH2 favoreceria uma
interação entre oxigênio da ligação C=O e o hidrogênio mais próximo a ele quando seus
orbitais se encontram nesse mesmo plano, porém, para as semicarbazonas esse
fenômeno não é observado devido ao pequeno raio atômico do oxigênio, vendo-se
apenas um singleto integrando para dois hidrogênios.
Nesse mesmo composto é possível localizar o singleto com deslocamento de 7,73
ppm correspondente ao CH azometínico em posição altamente desblindada devido ao
efeito anisotrópico causado pelo movimento dos elétrons π da ligação imínica, e pela
proximidade com um átomo mais eletronegativo. A confirmação de que as reações de
alquilação realmente aconteceram é evidenciada pela presença de um tripleto
característico do CH2N ligado ao N2 e multipletos correspondentes aos diversos
acoplamentos entres os hidrogênios das ramificações alquila das moléculas substituídas.
Estes multipletos são característicos dos espectros S04, S05, S06 e S08 devido às
absorções múltiplas em região altamente blindada dos espectros entre 1,23 e 5,89 ppm,
por possuírem pouca influência dos grupos eletronegativos destas moléculas, com
exceção dos dois hidrogênios mais próximos ao carbono ligado ao N2, que tomando o
exemplo da molécula S08 nota-se um tripleto característico do CH2N, com
deslocamento de 3,87 ppm e J=5,4 Hz.
84
Figura 36. Escpectro de RMN 1H do composto S08.
Nos espectros de IV das moléculas S04, S05, S06 e S08 estão presentes sinais
característicos das absorções correspondentes aos estiramentos simétrico e assimétrico
do grupo nitro (NO2) entre 1346,38 e 1579,21 cm-1
, além das confirmações de que as
reações de alquilação nos nitrocompostos foram eficientes, apresentando bandas de
absorção entre 2943,03 e 2958,43 cm-1
características de absorção de deformação
angular de CH de alcanos em cadeia aberta correspondente aos grupamentos alquila na
ramificação da mesma, ligados à N2 e N
4. Para o composto S08, temos estiramentos de
1352,79, 1577,12 e 2943,03 cm-1
para os estiramentos de deformação simétrica e
assimétrica de NO2 e deformação angular de CH de alcanos, respectivamente (Figura
37).
7,79 (d, 1H,
Het-H,
J= 3 Hz) 3,87(t, 2H, CH2N,
J=5,4 Hz)
7.73 (s, 1H, CH=N)
6,95 (s, 2H, NH2)
1,23-1,31
(m, 4H, 2CH2)
1,31-1,46
(m, 2H, CH2)
0,85(t, 3H, CH3, J=8,4 Hz)
7.41
(1H, Het-H,J=3 Hz)
85
Figura 37.. Espectro de IV do composto S08.
Nos espectros de RMN 1H da molécula S02(Figura 38) pôde ser confirmada a
formação da condensação entre aldeído e semicarbazida através da presença no mesmo
espectro dos singletos correspondentes aos hidrogênios ligados ao anel tiofeno
(ppm, 7,31 ppm, 7,07 ppm) que apesar de terem distância entre si de três ligações
não produziram acoplamento efetivo. Os singletos correspondentes aos hidrogênios
ligados aos nitrogênios N3 e N
4 possuem deslocamentos químicos em 6, 25 ppm e 10,22
ppm. O pico correspondente ao singleto localizado em 6,29 ppm aparece mais
alargado em relação aos outros singletos, pois trata-se de hidrogênios ligados ao
nitrogênio da porção amida, e seu pico de absorção reflete a influência do momento de
quadrupolo elétrico do núcleo de nitrogênio, pois o mesmo não possui distribuição
esférica e uniforme da carga em torno de seu núcleo. O hidrogênio ligado a um átomo
de nitrogênio pode sofrer troca rápida, intermediária ou lenta.
Se esta troca acontece de forma moderada a lenta, o sinal de NH aparece mais
alargado devido à relaxação moderadamente eficiente induzida pelo momento elétrico
N-H 3461,25
C-H 2943,03
NO2
1352,79
C=O 1705,05
86
do quadropolo do núcleo do nitrogênio e ao conseqüente aumento da meia-vida dos
estados de spin do núcleo do nitrogênio. O hidrogênio sofre, assim, o efeito dos três
estados de spin do núcleo de nitrogênio, que estão mudando a uma velocidade
moderada, e responde produzindo um pico largo2.
Figura 38. Espectro de RMN 1H do composto S02.
As substituições presentes nos derivados do composto S02 aparecem na forma de
multipletos nos espectros de RMN 1H que apresentam absorção entre 3,8 e 5,6 ppm
confirmando o processo de alquilação desta semicarbazona. Os espectros de IV
corroboram o sucesso do procedimento, pois o pico de absorção referente à deformação
angular de CH de cadeia aberta aparece entre 2925,81 e 2964,30 cm-1
correspondente ao
radical alquila substituinte nas posições N3 e N
4 dos compostos S10, S11, S12, S13 pico
o qual, está ausente no espectro de IV da molécula de origem, composto S02(Figura
39).
10.22
(s, 1H, NH)
8.03 (s,
1H, CH=N)
7.55 (s, 1H, Ar)
6.25 (s, 2H, NH2)
7.07 (s, 1H, Ar)
7.31 (s, 1H, Ar)
87
Figura 39. Espectro de Infravermelho do composto S02.
Figura 40. Espectro de IV do composto S10.
C=O 1645
N-H 3449,53
C-H tiofeno 3064,10
C=O 1656,50
N-H 3482,50
C-H tiofeno 3073,03
C-H
2928,95
88
89
REFERÊNCIAS
1 BRONDANI, D. J. et al. A new and efficient N-alkylation procedure for
semicarbazides/semicarbazones derivatives. Tetrahedron Letters. v. 48, p. 3919–3923,
2007.
2 SILVERSTEIN, R.M., WEBSTER, F.X. Identificação Espectrométrica de
Compostos Orgânicos.460 p., Sexta edição, 1998.
90
Capítulo III
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES
BIOLÓGICAS
91
III 1 INTRODUÇÃO
Derivados semicarbazônicos são compostos ativos contra bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas e são muito mais ativos contra bactérias anaeróbias, pois
estas contêm um sistema enzimático que reduz de maneira bem eficiente o grupo nitro.
São menos ativos contra bactérias aeróbias e totalmente inativos contra bactérias
deficientes de sistema enzimático de nitrorredução1. A atividade antichagásica dos
derivados nitrofurânicos e nitrotiofênicos vêm sendo estudada desde 1936, e suas
propriedades curativas ainda são empregadas através do uso de Beznidazol como terapia
curativa na fase aguda da doença. A atividade antitumoral destes compostos ainda é um
campo que se encontra em expansão, porém, se destaca por ser uma grande promessa na
busca por novas drogas que possam atuar como novas alternativas à atual terapia
antineoplásica.
III 2 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
III 2.1 Metodologia
III 2.1.1 Método da difusão em discos de papel
A atividade antimicrobiana dos derivados semicarbazônicos S01-S13 (Figura 40)
foi verificada in vitro, pelo método de difusão em disco de papel, frente a bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas e Fungos Filamentosos (Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Mycobacterium smegmatis, Proteus vulgaris, Candida albicans) da coleção de
microorganismos do Departamento de Antibióticos da UFPE.
92
Neste método, os discos contendo concentrações conhecidas dos compostos
sintetizados foram colocados na superfície de uma placa de ágar, onde uma suspensão
padronizada dos microorganismos em teste foi inoculada. As suspensões dos
microorganismos testes foram padronizadas através da escala de McFarland com
turbidez correspondente a 0,5, equivalente a 1 a 2 x108 unidades formadoras de colônias
por mililitros (UFC/mL). Discos de papel contendo apenas o solvente
Dimetilsulfóxido(DMSO) foram utilizados como controles negativos. As placas foram
levadas a estufa durante 24h e 48h à temperatura de 30°C e 37°C e após o período de
incubação mediram-se os halos de inibição em milímetros (mm). O halo de inibição
será considerado a área sem crescimento detectável a olho nu. A zona média de inibição
para Nitrofurazona (antibiótico) foi utilizada como valor de referência, a qual foi
medida em outro trabalho realizado por nosso grupo de pesquisa. Os experimentos
foram realizados em duplicata, e repetidos se os resultados apresentassem alguma
divergência2.
O
N NNH
O
N+O
-
O
O
N NNH2
O
N+O
-
O
O
N NNH
O
N+O
-
O
S01 S04 S05
O
N NNH2
O
N+O
-
O
O
N NNH
O
N+O
-
O
O
N NNH2
O
N+O
-
O
CH3
S06 S07 S08
93
Figura 41. Estrutura química dos derivados semicarbazônicos sintetizados.
III 2.1.2 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) e Concentração
Mínima Bactericida (CMB)
Para os ensaios de CMI e CMB, foi utilizada a técnica de macrodiluição em meio
líquido, onde a partir de uma solução-mãe com concentração de 1mg/mL dos compostos
em análise, solubilizados em dimetilsulfóxido, foram realizadas diluições seriadas para
obtenção das concentrações desejadas. Foram adicionados 100μL da suspensão
bacteriana, previamente padronizadas através da escala de McFarland acima citada, aos
tubos de Muller-Hinton contendo as concentrações desejadas dos compostos em análise.
Os tubos foram incubados a 37ºC por 24-48 h, e, em seguida, examinados para
visualização da presença ou ausência de organismos de cultivo.
O
N NNH
O
N+O
-
O
CH3
CH3
S
N NHNH2
O
S
N NNH2
O
S09 S02 S10
S
N NNH
O
S
N NNH2
O
S
N NNH
O
S11 S12 S13
94
Tubos contendo apenas DMSO também foram avaliados. Os valores de CMI
foram obtidos a partir da menor concentração dos compostos onde não foi observado
qualquer crescimento de bactérias. Os valores da CMB foram medidos através da
inoculação dos caldos utilizados para determinação do CMI para meio sem drogas. Os
valores de CMB foram observados a partir do crescimento da diluição subseqüente. Os
valores da CMI e da CMB, foram expressos em µg/mL3.
III- 2.2 Resultados e discussão
Neste trabalho a avaliação da atividade antibacteriana deu-se em duas etapas:
inicialmente foi realizado o teste qualitativo por meio da avaliação in vitro da atividade,
através da difusão em discos dos derivados semicarbazônicos testados, medindo-se a
zona média de inibição (ZMI). Esta foi obtida a partir da média dos valores dos halos de
inibição. Em seguida, as substâncias que apresentaram halo de inibição superior a 15
mm, foram submetidas à determinação da CMI. Os valores da ZMI obtidos frente às
bactérias em análise encontram-se expostos na Tabela 7.
Padrão Compostos Microorganismo S01 S03 S04 S05 S06 S07 S08 S09 S10 S12
Staphylococcus
aureus
42,5 21 37,5 24,5 35,6 24,3 30,6 24,6 12 -
Bacillus subtilis 42,30 23 40 25,3 39 28,6 34,6 25,3 15 16
Enterococcus
faecalis
25 - 2523 - 28,3 - 23 12 - -
Escherichia coli 46,50 10,5 18,6 13,6 18 18 - 24,7 - -
Pseudomonas
aeruginosa
- - - - - - - 17,3 - -
Mycobacterium
smegmatis
29,6 - - - 22 25,3 19,6 25 - 24,3
Proteus vulgaris 28 21 32,3 32,3 - 13,6 - 15 - -
Candida
albicans
- - - - 19 - - 13,6 - -
Tabela 7. Valores das ZMI dos compostos testados, em mm.
95
A análise da Tabela 7 nos permitiu notar que a maioria dos compostos testados
não conseguiu superar o halo de inibição produzido pelo antibiótico padrão, a
Nitrofurazona, apesar de apresentar valores de ZMI em valores bem próximos à mesma,
o que levou à confirmação da importância do grupo nitro nos derivados S03-S09 para a
atividade antibacteriana dos derivados semicarbazônicos. É perceptível que derivados
que possuem o anel tiofeno (S10-S13) com ausência do grupo nitro não demonstraram
atividade pronunciada e nem comparável à Nitrofurazona. Em 1944, Dodd e Stillman já
haviam demonstrado que adição do grupo nitro ao C5 do anel furano conferia às
moléculas uma potente ação antimicrobiana, enquanto que a ausência deste grupo ou a
presença do grupo nitro reduzido não favorecia esta atividade4.
Quanto à atividade antibacteriana, os compostos S06, S07, S08 e S09 foram, em
2008, testados por Brondani et al, e dentre estes, o composto S06 apresentou melhor
atividade, sendo efetivo contra B. subtilis, S. Aureus, S. faecalis, Candida sp e
Aspergillus niger. Em relação a ação frente a microorganismos multirresistentes
(MRSAs - Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), o mesmo derivado S06
também apresentou melhor potência5.
Ainda não se conhece o mecanismo específico de inibição bacteriana dos
nitrocompostos, sabe-se que eles inibem muitos sistemas enzimáticos bacterianos, a
maioria provavelmente por dano ao DNA. Uma enzima bacteriana, a nitrorredutase,
converte os compostos em intermediários de vida curta, incluindo radicais oxigenados
livres, que interagem com o DNA causando quebras e posterior dano às bactérias. A
resistência bacteriana destes compostos não é medida por plasmídios, mas parece ser
causada por uma mutação associada à perda de atividade da nitrorredutase bacteriana6.
No presente estudo, a alta atividade antibacteriana do composto S06 foi ratificada
por apresentar halo de inibição maior do que a Nitrofurazona para o microorganismo
Enterococcus faecalis e valores bem próximos para Staphylococcus aureus e Bacillus
subtilis.Os compostos S04 e S05 apresentaram ZMI em valores superiores à
Nitrofurazona para o microorganismo Proteus vulgaris, bactéria Gram-negativa
responsável por infecções hospitalares e do trato urinário, o que leva esses derivados a
serem estudados como boa alternativa para estas contaminações. Os derivados S06 e
S09 apresentaram baixa atividade contra Candida albicans, porém esta atividade deve
96
ser considerada, pois existe uma grande dificuldade em pesquisas de se obter compostos
que apresentem qualquer atividade contra este fungo filamentoso.
Os compostos S03-S09, por apresentaram uma melhor ação em relação aos
demais, foram selecionados para realização dos testes de determinação da CMI e da
CMB em meio líquido, em comparação à Nitrofurazona, resultados mostrados na tabela
8.
Tabela 8. Valores da Concentração Mínima Inibitória e Concentração Mínima Bactericida para
os compostos S01-S09 frente às cepas avaliadas em µg/mL.
Após realização dos testes de Concentração Mínima Inibitória (CMI) e
Concentração Mínima Bactericida (CMB), pôde-se constatar que, apesar de termos o
fato de que a maioria dos compostos não demonstrou halo de inibição maior do que a
Nitrofurazona, alguns daqueles que apresentaram ZMI em valores semelhantes ao
antibiótico de referência, mostraram valores promissores de CMI e CMB quando
comparados ao protótipo.
Os derivados semicarbazônicos S03, S05, S07 e S09 apresentaram valores de
concentração inibitória para Staphylococcus aureus cerca de 8 a 64 vezes menor do que
a Nitrofurazona para a CMB e CMI, respectivamente, enquanto os compostos S04, S06
e S09 demonstraram os mesmos valores do protótipo. Em relação ao Bacillus subtilis os
Substância
Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Proteus vulgaris
CMI CMB CMI CMB CMI CMB
S01 500 250 >500 - 125 62,5
S03 31,2 15,6 15,6 7,8 15,5 7,8
S04 - 250 500 250 - -
S05 62,5 31,2 - <3,9 - -
S06 500 250 500 250 - -
S07 62,5 31,2 500 250 - -
S08 500 250 500 250 - -
S09 7,8 3,9 15,6 7,8 - -
97
compostos S03, S05 e S09 apresentaram valores de concentração inibitória cerca de 64
a 32 vezes menor do que a Nitrofurazona para a CMB e CMI, respectivamente,
enquanto os compostos S04, S06, S07 e S09 demonstraram os mesmos valores do
protótipo.
Em relação ao Proteus vulgaris, o único composto que apresentou concentrações
inibitórias menores do que a Nitrofurazona foi o composto S03, com CMB e CMI oito
vezes menor do que o antibiótico de referência. Todos estes resultados apontam para
uma nova perspectiva em relação à busca de alternativas para o uso da Nitrofurazona
para o tratamento de infecções do trato urinário e da pele, sendo compostos que são
obtidos de forma simples, através de metodologia prática, os quais apresentaram
atividade melhor ou igual a este antibiótico.
III 3 AVALIAÇÃO ANTICHAGÁSICA E CITOTÓXICA
III- 3.1 Metodologia
III 3.1.1 Ensaio de citotoxicidade dos compostos em células esplênicas
Células esplênicas foram obtidas de acordo com Pereira et al. (2004). Após
sacrifício do animal em cilindro de CO2, o baço de cada camundongo foi removido em
condições assépticas e colocado em tubo Falcon contendo meio RPMI 1640 sem SFB
(meio incompleto). No fluxo vertical, cada baço foi transferido para placa de Petri onde
foram macerados. As suspensões celulares obtidas foram transferidas para tubos Falcon
contendo aproximadamente 10 ml de meio incompleto por baço, centrifugadas a 4°C,
200 x g durante 5 minutos. Após descarte do sobrenadante, ao sedimento adiciona-se
água destilada para promover lise das hemácias. O sobrenadante, sem conter os debris
celulares, foi coletado e centrifugado a 4°C, 200 x g durante 5 minutos. O sedimento
(contendo as células) foi ressuspendido em meio RPMI 1640 completo. Uma alíquota
de cada suspensão celular foi separada. Em seguida, diluída em azul de trypan para ser
quantificada em câmara de Neubauer, assim como verificar a viabilidade celular7.
III 3.1.2 Avaliação da atividade tóxica dos compostos em células de camundongos
isogênicos
98
Células esplênicas (6 X 105células/poço), obtidas de acordo com item anterior,
foram cultivadas em placas de 96 poços de fundo plano, contendo meio de cultura
completo. Para o ensaio de citotoxicidade, as células foram incubadas com os
compostos em sete diferentes concentrações (100, 50, 25, 10, 5 e 1 mg/ml) e de timidina
tritiada (1 microCi/poço) durante 24 h em estufa de CO2 a 37°C. Para o controle foram
utilizadas células tratadas com saponina (0,05%), células tratadas com DMSO (1%), e
sem tratamento, todos com timidina tritiada (1 mCi/poço) associada em paralelo. Cada
droga foi testada em triplicata. Após 24 h de incubação, as células foram coletadas em
papel de fibra de vidro e, posteriormente, a captação de timidina tritiada foi determinada
através do contador beta de cintilação. O percentual de citotoxicidade foi determinado
comparando-se a percentagem de incorporação de timidina tritiada nos poços com as
drogas em relação aos poços não tratados7.
III 3.1.3 Avaliação da atividade dos compostos contra Trypanosoma cruzi
Para determinar o efeito anti-proliferativo para T. cruzi, formas epimastigotas
(106/ml) crescidos em culturas axênicas, na fase log de crescimento, foram colocadas
em placas de 96 poços no volume de 100 ml, sob condições de cultura adequadas
(26°C). Já as formas tripomastigotas foram obtidas a partir da infecção in vitro de
células Vero. Os testes foram conduzidos tendo como controle o Benznidazol
(50 mg/ml) e culturas de parasitos sem tratamento. As substâncias foram avaliadas
quanto à concentração inibidora de 50% do crescimento dos parasitas (IC50%) onde
formas epimastigotas e tripomastigotas da cepa Y de T. cruzi foram cultivadas durante
11 dias e 24 horas, respectivamente, na presença de diferentes concentrações dos
compostos, procedendo-se em seguida a contagem de parasitas viáveis. O cálculo
da IC50% foi determinada por meio de uma regressão linear simples utilizando o
software Prisma 4 Graphpad7.
99
III 3.2 Resultados e Discussão
Desde 1995, diversas pesquisas vêm sendo direcionadas ao potencial
antichagásico dos derivados de séries de 5-nitro-furaldeído e 5-nitrotiofeno-2-
carboxaldeído semicarbazonas. Compostos alquilados com substituições nos nitrogênios
N3 e N
4 foram testados in vitro frente à forma epimastigota do Tripanosoma cruzi
devido à possibilidade de mimetizar a porção espermidine da tripanotiona redutase com
potencial ação tripanocida.
Os compostos mais ativos da série, com atividade semelhante ao composto
padrão, o Nifurtimox, possuíam os substituintes butil, 2-metoxietil e hexil na posição N4
da semicarbazona, sendo este último o mais ativo de todos, sugerindo que a atividade
dos mesmos é mais dependente do comprimento da cadeia carbônica do que dos efeitos
eletrônicos trazidos pela presença de heteroátomos em seus substituintes8.
A atividade tripanocida dos derivados semicarbazônicos (S01-S13), foi avaliada,
em valores de IC50, frente à forma evolutiva epimastigota do T. cruzi, crescidas em
culturas axênicas. Os valores de IC50 e Citotoxicidade, em µg/ml, para cada composto
sintetizado encontram-se dispostos na tabela abaixo.
COMPOSTO Citotoxicidade
µg/ml a
IC50 epimastigotas
(µg/ml)
S02 >100 0,5
S03 50 24,07
S04 5 1,50
S05 5 2,68
BDZ 25 1,73
NFX 1 0,54
Tabela 9. Atividade anti-T. cruzi dos derivados semicarbazônicos. a = maior concentração atóxica em células esplênicas de
camundongos BALB/c; BZD = Benznidazol; NFX = Nifurtimox.
100
A terapia atual da doença de chagas encontra na incidência dos efeitos colaterais
um dos principais obstáculos para ser considerada ideal. Estes, como descrito na
literatura, têm sido atribuídos ao efeito citotóxico inerente ao grupo nitro presente nas
drogas disponíveis no tratamento anti- T.cruzi, sendo, portanto, os nitrocompostos como
o benznidazol e nifurtimox, alvos de inúmeras discussões visando o esclarecimento de
sua toxicidade 9. Neste contexto, no intuito de se obter uma nova droga na terapêutica
da Doença de chagas, a avaliação da citotoxicidade é de suma importância para
considerá-la um protótipo no tratamento anti-T.cruzi.
Os derivados semicarbazônicos S02, S03, S04, S05 foram testados frente à forma
evolutiva epimastigota e demonstraram resultados promissores para as substâncias S02
e S04. O composto S04 mostrou citotoxicidade cinco vezes maior do que a droga
empregada na terapia atual, o Beznidazol, porém apresentou IC50 no valor de 1,50
µg/ml, quase duas vezes menor do que a droga padrão. O composto S02 apresentou
uma excelente ação tripanomicida, com IC50 na faixa de 0.5µg/ml, mostrando-se mais
potente que os fármacos padrões, Nifurtimox e Benznidazol.
Analisando sua estrutura química, observamos sua semelhança estrutural com a
molécula da Nitrofurazona (NF), droga com considerável ação anti-T. cruzi, que age via
inibição da enzima TR do parasita, porém é altamente tóxica. Comparando as estruturas
dos compostos S02, Nitrofurazona e Nifurtimox, percebe-se a semelhança estrutural
(Figura 41) devido à aplicação da técnica de modificação molecular denominada
bioisosterismo, através da substituição do átomo de oxigênio pelo enxofre.
O emprego do bioisosterismo como estratégia de modificação molecular para a
descoberta de novos agentes bioativos e permite que se antecipe uma comparável
afinidade entre duas substâncias bioisostéricas por um dado sítio receptor e,
conseqüentemente, um potencial de atividade biológica similar10
. Vale salientar a baixa
citotoxicidade apresentada por S02, cem vezes menor que a citotoxicidade apresentada
pelo Nifurtimox, fármaco com semelhante IC50 e utilizado na terapêutica da doença.
Supõe-se que a baixa citotoxicidade apresentada pelos compostos da série S02 esteja
101
relacionado à ausência do grupamento Nitro (NO2) nessa molécula, o qual está presente
no BZD, NFX e NF.
Figura 42. Estrutura química do derivado S02, Nifurtimox e Nitrofurazona.
As substâncias S03 e S05 não apresentaram resultados satisfatórios, pois
mostraram-se ao mesmo tempo mais tóxicas e com IC50 maior do que o Beznidazol. Os
compostos S06, S07, S08, S10, S11, S12 e S13 ainda encontram-se em processo de
finalização dos testes, não sendo possível anexar e discutir seus resultados até o
encerramento deste trabalho.
ON
+
O-
O NN SO2
CH3
Nifurtimox Nitrofurazona
S
N NHNH2
O
S02
102
III 4 AVALIAÇÃO ANTITUMORAL – AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE
IN VITRO
III- 4.1 Metodologia
Para a avaliação de citotoxicidade in vitro através de screening inicial, foram
utilizadas três linhagens tumorais diferentes: HT29 (carcinoma de cólon - humano),
HEp-2 (carcinoma de mama - humano) e NCI H-292 (câncer de pulmão– humano), as
quais foram obtidas do Banco de células do Rio de Janeiro, tendo sido cultivadas em
meio RPMI 1640 ou DMEN, suplementados com 10% de soro fetal bovino e 1% de
antibióticos, mantidas em estufa a 37 C e atmosfera contendo 5% de CO2.
As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril e testadas na concentração de
25 µg/mL para substâncias puras e 50 µg/mL para extratos ou frações. As células foram
plaqueadas na concentração de 1 x 105 células/mL. As placas foram incubadas por 72
horas em estufa a 5% de CO2 a 37C. Em seguida, foram adicionados 25 L da solução
de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram incubadas por 3h. A absorbância foi lida
após dissolução do precipitado com 100 L de DMSO puro em espectrofotômetro de
placa a 595nm.
Os experimentos foram analisados segundo suas médias e respectivos desvio no
programa GraphPad Prism. Cada amostra foi testada em duplicata. Uma escala de
intensidade foi utilizada para avaliar o potencial citotóxico das amostras testadas.
Amostras sem atividade (1 a 20% de inibição), com pouca atividade (inibição de
crescimento celular variando de 20 a 50%), com atividade moderada (inibição de
crescimento celular variando de 50 a 70%) e com muita atividade (inibição de
crescimento variando de 70 a 100%)12
.
103
III 4.2 Resultados e Discussão
Análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa
de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), que testa mais de
10.000 amostras a cada ano. É um método rápido, sensível e barato. Foi descrita
primeiramente por Mosman (1983), tendo a capacidade de analisar a viabilidade e o
estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-
(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT) em azul de
formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células
metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir
facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação12
.
O principal objetivo deste método é verificar a citoxicidade in vitro de substâncias
puras, extratos, frações e subfrações em pelo menos 3 linhagens de células tumorais.
Essa análise faz parte de um screening inicial para determinação do potencial
antitumoral de amostras das substâncias S02-S10 e S12. As três linhagens escolhidas
foram HT29 (carcinoma de cólon - humano), HEp-2 (carcinoma de mama - humano) e
NCI H-292 (câncer de pulmão– humano). A tabela 10 mostra que os resultados mais
expressivos aconteceram com os compostos S03, S04,S05, S06 e S08.
Tabela 10. Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três linhagens
tumorais testadas na dose única de 25 µg/mL.
Amostra HT29 HEp-2 NCI-H-292
Média IC% SD Média IC% SD Média IC% SD
S03 47,3 0,5 78,6 0,6 29,2 3,5
S04 95,9 0,7 97,3 0,0 95,0 0,5
S05 80,3 0,9 90,3 1,9 72,2 3,9
S06 93,6 0,9 91,3 1,3 92,2 0,5
S08 94,9 0,3 92,8 0,6 94,1 1,6
104
O composto S03 apresentou atividade de inibição de crescimento celular em
intervalos de 25, 82 a 78%, enquanto que os compostos S04, S05, S06 e S08
apresentaram percentuais de inibição os quais excederam os 70%, o que nos levou à
conclusão de que estas moléculas foram todas muito ativas, levando à continuidade do
procedimento apenas para estes quatro compostos, devido ao padrão mínimo de
exigência para cálculo da IC50 de 70% de inibição de crescimento celular.
Assim como para o composto S03, as substâncias S02, S07, S09, S10 e S12
apresentaram pouquíssima atividade inibitória, interrompendo temporariamente a
continuidade dos testes. Os resultados para análise da IC50 dos compostos S04, S05, S06
e S08 estão listados na tabela abaixo.
Tabela 11. Percentual de inibição do crescimento celular (IC50%) das amostras em três
linhagens tumorais
A maioria dos nitrocompostos com ação antineoplásica, antiparasitária e
antibacteriana apresenta o processo de biorredução enzimática do grupo nitro como
provável mecanismo de ação, o que coloca este requisito como sendo imprescindível
para o desempenho da atividade biológica destes compostos11
. Isto pôde ser confirmado
através do método MTT utilizado em nossas moléculas, pois os compostos que
apresentaram atividades pronunciadas, todos eles, possuem o grupo nitro em suas
estruturas, enquanto que aqueles que possuíam o anel heterocíclico tiofeno sem o grupo
nitro não apresentaram atividade inibitória diante das três linhagens de células tumorais,
sendo assim, a estratégia de modificação através do bioisosterismo confirmou os dados
literários de que a substituição de oxigênio por enxofre não influenciou a atividade
antineoplásica dos derivados semicarbazônicos.
Amostra HT29 HEp-2 NCI-H-292
IC%50 Intervalo IC%50 Intervalo Média IC% Intervalo
S04 5,5 3.5 a 8.6 5,4 3,3 a 8,7 4,9 3,8 a 6,2
S05 > 25 - > 25 0,0 > 25 -
S06 8,9 5.9 a 13.7 10,3 3.9 to 7.2 10,43 8.3 a 13.1
S08 7,5 4.7 a 12.1 5,4 3.3 a 8.8 7,03 5.8 a 8.5
105
Apesar de ainda não se ter conhecimento detalhado a respeito da possível
atividade antitumoral dos nitrofuranos, resultados positivos vêm sendo obtidos no
tratamento de tumores sólidos contendo áreas com hipóxia, resultantes de
vascularização insuficiente destes tecidos. Alguns compostos desta classe possuem
capacidade para sensibilizar células com hipóxia para a radiação ionizante. Neste
mecanismo, o evento químico que determina o efeito da radiossensibilização é o
potencial de redução do grupo nitro. Outro fator importante a ser observado é a
afinidade eletrônica do grupo nitro, que quanto maior for, melhor será a sua capacidade
radiossensibilizante. Este campo de aplicação carece ainda de estudos mais
aprofundados e apresenta grande perspectiva de crescimento no que diz respeito ao
desenvolvimento de futuros compostos radiossensibilizantes11
.
Sendo assim, na determinação da IC50, as substâncias S04, S06 e S08
apresentaram concentrações inibitórias, considerando os desvios padrão, extremamente
promissoras para que seja dado prosseguimento aos estudos, pois se considera para a
IC50 valores menores que 4 µg/ml13
como propícios para a continuação dos estudos, o
que exclui o composto S05 dos próximos passos, pois apresentou valores bem acima do
permitido com IC50 > 25 µg/ml para todas as linhagens testadas. Entre os compostos
S04, S06 e S08, aquele que apresentou o valor mais expressivo, considerando o desvio
padrão, foi a substância S04, com IC50 de até 3,3 µg/ml.
Estes testes nos induzem á manutenção da pesquisa em um campo de atuação
ainda pouco explorado pelos estudiosos, considerando que semicarbazonas são
extremamente pesquisadas como antibacterianos e antichagásicos aliados ao fato de que
os nitrofuranos possuem potencial mutagênico, o que afasta um pouco os esforços para
transformar essas substâncias em potenciais agentes antineoplásicos.
Nosso estudo demonstra que as possibilidades existem, podem ser aprimoradas e
apresenta os nitrocompostos como uma classe de compostos com largo espectro de ação
que possuem para cada uma de suas atividades a dependência de fatores como a
estrutura química, tempo de exposição e dose utilizada, o que demonstra a promissora
possibilidade, sob condições controladas, principalmente como uma nova classe de
compostos antitumorais, considerado grande avanço na Química Medicinal, já que trata-
se de uma doença de terapia tão desgastante e ainda sem cura em grande parte de seus
casos.
106
107
REFERÊNCIAS
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INFANTE, W., CHARRIS, J. Relation between molecular electrostatic potential,
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E.D.; FERREIRA, A.G.P.; KRIEGER, M.A.; GOLDENBERG, S.; SOARES, M.B.P.;
COUTINHO, E.M.; CORREA-OLIVEIRA, R.; GOMES,Y.M. Humoral and cellular
immune responses in BALB/c and C57BL/6 mice immunized with cytoplasmic (CRA)
and flagellar (FRA) recombinant repetitive antigens, in acute experimental
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PELUFFO, G.; QUIJANO, C.; PAULINO. Synthesis and anti-trypanosomal activity of
novel 5-nitro-2-furaldehyde and 5-nitrothiophene-2-carboxaldehyde semicarbazone
derivatives. II Farmaco, v. 53, p. 89-94, 1998
9 PAULA, F.R.; SERRANO, S.H.P.; TAVARES, L.C. Aspectos mecanísticos
dabioatividade e toxicidade de nitrocompostos. Quim. Nova, v. 32, No. 4, p.1013-
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10 BARREIRO, E. J.; FRAGA, C.A.M. Química Medicinal: as bases moleculares da
ação dos fármacos. 2ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2008.
11 PAULA, F.R., SERRANO, S.H.P., TAVARES, L.C. Aspectos mecanísticos
dabioatividade e toxicidade de nitrocompostos. Revista Quimica Nova, vol. 32,
p.1013-1020, 2009.
12 BERRIDGE, M. V., TAN, A. S., McCOY, K. D., WANG, R. The Biochemical and
Cellular Basis of Cell Proliferation Assays that Use Tetrazolium Salts. Biochemica, 4:
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13 GERAN, R.I., N.H. GREENBER, M.M. MACDONAL
R.I., Schumach & B.J. Aboott. Cancer
Chemother. V. 2:p. 121-35, 1972
109
Capítulo IV
CONCLUSÕES E
PERSPECTIVAS
110
VI- 1 CONCLUSÕES
Os compostos em estudo foram obtidos partindo-se de metodologia simples, e
econômica, e apresentando rendimentos que variaram de 40-60%. A
confirmação estrutural deu-se através da análise de dados espectroscópicos de
IV, RMN 1H;
Quanto à atividade antibacteriana desses derivados, os compostos S03,S05, S06,
S07 e S09 obtiveram os melhores resultados, merecendo maior destaque o
composto S06, que se mostrou mais ativo que a droga controle utilizada.
Algumas semicarbazonas N-alquiladas também foram avaliadas frente a
atividade anti-T.cruzi contra a forma evolutiva epimastigota, sendo os
compostos S02 e S03 aqueles que apresentaram melhores atividades. Dentre
estes, o composto S02 apresentou relevância, mostrando-se cerca de três vezes
mais potente e quatro vezes menos citotóxica do que a droga padrão;
Quanto á atividade antitumoral das substâncias testadas, aquelas que
demonstraram boa porcentagem de inibição de crescimento de três linhagens
tumorais possuem em sua estrutura o grupo nitro, que demonstrou-se
indispensável para tal atividade, dentre eles o composto S03 mostrou-se mais
promissor por apresentar IC50 em valores aceitáveis e promissores para seja dado
continuidade a esta pesquisa.
111
VI-2 PERSPECTIVAS
Acompanhar os resultados restantes da atividade anti-T. cruzi, que são de
extrema importância para conclusão deste trabalho;
Refazer espectros de RMN dos compostos que sofreram degradação no processo
de elucidação estrutural, assim como complementá-los com espectros de C13
;
Realizar estudos de “docking” com os compostos que aquelas substâncias
obtiveram os melhores resultados Anti-T.cruzi;
Realizar testes de avaliação da atividade frente a forma evolutiva tripomastigota
do T. cruzi;
Sintetizar um número maior de moléculas para realizar estudos de QSAR
relativas às atividades biológicas expostas neste trabalho;
Prosseguimento nos estudos quanto à terapia antitumoral que apresentou-se
como promissora atividade para os compostos semicarbazônicos N-
alquilsubstituídos.
112
Capítulo V
PARTE
EXPERIMENTAL
113
V- 1 PARTE EXPERIMENTAL
V- 1.1 Materiais e Métodos
V- 1.1.1 Cromatografias
As cromatografias em camada delgada (CCD) foram conduzidas em placas de Sílica
Gel 60 F254 da MERCK de 0,25 mm de espessura. A leitura das mesmas foi realizada
através de radiação de ultravioleta (UV) no comprimento de onda (λ) de 254 nm.
V- 1.1.2 Pontos de Fusão
Os pontos de fusão foram medidos no equipamento QUILMES Q.340.23, em tubos
capilares imersos em banho de silicone.
V- 1.1.3 Espectroscopias de IV e RMN 1H
Os espectros de IV moram obtidos em espectrofotômetro BRUKER IFS-66, em discos
de KBr. Os espectros de RMN 1H foram obtidos em um equipamento UNITYplus-300
MHz-VARIAN, utilizando-se DMSO-d6 como solvente. Os deslocamentos químicos (d)
foram reportados em ppm, utilizando tetrametilsilano como referência interna. As
constantes de acoplamento foram indicadas em Hz, e as multiplicidades dos sinais
foram designadas da seguinte forma: s – singleto, d – dubleto, dd – duplo dubleto, t –
tripleto, m – multipleto.
V- 1.1.4 Equipamentos
Bomba de vácuo TECNAL TE 058;
Estufa;
Evaporador rotativo;
Balança analítica BEL 220;
114
Balança semi-analítica BEL Marc 500 C;
Placas de agitação e aquecimento FISOTON 752A;
Vidraria geral;
Espectrofotômetro (Biorad 3550);
Capela com exaustão;
Freezer;
Espátulas e pinças metálicas.
V- 1.1.5 Reagentes e solventes
Semicarbazida Hidroclorada;
2-tiofeno-carboxialdeído;
Ácido Clorídrico concentrado;
Álcool etílico e metílico absoluto;
Nitrofurazona;
Hexano;
Água destilada;
Acetato de etila;
2-Br-butano;
1-Br-butano;
1-Br-penteno;
1-Br-pentano;
Dimetil-sulfóxido (DMSO);
Dimetil-formamida (DMF);
Meio de cultura Muller-Hinton;
Soro Bovino Fetal;
Timidina Tritiada;
Duodecil sulfato de sódio.
115
V- 1.2 Procedimentos Experimentais
V- 1.2.1 Síntese e Caracterização estrutural
V- 1.2.1.1 Composto S01 – 5-nitro-furaldeído semicarbazona
A Nitrofurazona foi obtida comercialmente e recristalizada em mistura de 20% de
etanol em água destilada sob agitação e aquecimento para obtenção de cristais amarelos
puros para posterior reação de alquilação.
V- 1.2.1.1.1 Caracterização
F.M: C6H6N4O4
P.M: 198,14 g/mol
Sólido amarelo ocre; Rf: 0,45 (Acetato de Etila/Hexano 7:3); P.F: 242-244 ºC.
Análise Elementar: C=36,74%, N=28%, O= não realizado, H= 2,99%
RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6): 10,77 (s, 1H, NH); 7,79 (s, 1H, CH);
7,76 (d, 1H,Het-H, j=3Hz); 7,21 (d, 1H, Het-H, J=3Hz); 6,66 (s, 2H, NH2),
V- 1.2.1.2 Composto S02 – 2-tiofenocarboxaldeído semicarbazona
S
N NHNH2
O
116
O composto S02 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo com
álcool etílico absoluto, de 1,5 mmol de semicarbazida hidroclorada e 2-tiofeno-
carboxialdeído para promover condensação na presença de pequenas quantidades de
ácido clorídrico concentrado, que age como catalisador. A reação foi mantida em
temperatura ambiente e constante agitação magnética, por um período de 3-5 horas. O
acompanhamento das reações foi realizado por meio de análise cromatográfica em
camada delgada e após o término das mesmas, o derivado arilsemicarbazônico obtido,
precipitado no meio reacional, foi filtrado em funil sinterizado e lavado com água e
solvente orgânico (hexano). Para a purificação do composto sintetizado foram
realizadas recristalizações em água destilada, conteúdo esse que foi levado ao
dessecador para retirada completa de qualquer resquício de solvente e a pureza dos
cristais visualizada em lâmpada ultravioleta após cromatografia em camada delgada
utilizando sistema solvente adequado.
V- 1.2.1.2.1 Caracterização
F.M: C6H7N3OS
P.M: 169 g/mol
Sólido cinza claro; Rendimento: 78%; Rf: 0,18 (Acetato de Etila/Hexano 6/4);
P.F: 229,5-231,5⁰C
Análise Elementar: C=38,51%, O= não-realizado, S=16.91%; N=22,21%,
H=4,4%
RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6: 6.25 (s, 2H, NH2); 7.07 (s, 1H, Ar); 7.31
(s, 1H, Ar); 7.55 (s, 1H, Ar); 8.03 (s, 1H, CH=N); 10.22 (s, 1H, NH).
117
V- 1.2.1.3 Composto S03 – 2-secbutil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona
O composto S03 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de
mmol da semicarbazona S01 com 1,2 mmmol do haleto de alquila 2-Br-butano, a 1,5
mmol de NaOH como base. A reação foi mantida sob refluxo a temperatura ambiente
por 3-5 horas e devidamente acompanhada com cromatografia de camada delgada em
meio 7:3 Acetato de Etila/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído utilizando
uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente orgânico
(acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica para
obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.3.1 Caracterização
F.M: C14H22N4O4
P.M: 302 g/mol
Óleo vermelho claro; Rendimento: 45%; Rf: 0,73 (Acetato de Etila/Hexano 6/4)
Análise Elementar: C=69,6%, O= não-realizado, N=15,89%, H=2,99%
RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6: NÃO FOI POSSÍVEL A
DETERMINAÇÃO.
V- 1.2.1.4 Composto S04 – 2-pentenil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona
O
N NNH
O
N+O
-
O
118
O composto S04 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de 1
mmol da semicarbazona S01 com 1,2 mmmol do haleto de alquila 1-Br-penteno, a 1,5
mmol de K2CO3 como base. A reação foi mantida sob refluxo a temperatura ambiente
por 48 horas e devidamente acompanhada com cromatografia de camada delgada em
meio 7:3 Acetato de Etila/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído utilizando
uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente orgânico
(acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica para
obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.4.1 Caracterização
F.M: C11H14N4O4
P.M: 258 g/mol
Cristal amarelo-ocre; Rendimento: 52%; Rf: 0,34 (Hexano:Acetato de Etila 7/3);
P.F: 124-126⁰C
Análise Elementar: C=52,09%, O= não-realizado, N=20,36%, H=5,2%
RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6: 7,79 (d, 1H, Het-H,J= 3 Hz); 7.42 (1H,
Het-H,J=3 Hz); 7.75 (s, 1H, CH=N); 6,94 (s, 2H, NH2); 5,78-5,89 (m, 1H, CH);
4,95-5,07(m, 2CH); 3,89(t, 2H, CH2N, J=5,7 Hz); 2,02-2,07(m, 2H, CH2); 1,51-
1,55(m, 2H, CH2)
O
N NNH2
O
N+O
-
O
119
V- 1.2.1.5 Composto S05– 2,4-pentenil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona
O composto S05 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo 1 mmol
da semicarbazona S01 com 1,2 mmmol do haletos de alquila 1-Br-penteno, a 1,5 mmol
de NaOH como base. A reação foi mantida sob refluxo a temperatura ambiente por 3-5
horas e devidamente acompanhada com cromatografia de camada delgada em meio 7:3
Acetato de Etila/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído utilizando uma
porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente orgânico (acetato
de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica para obtenção de
compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de resquício de
solvente
V- 1.2.1.5.1 Caracterização
F.M: C16H22N4O4
P.M: 326 g/mol
Óleo alaranjado; Rf: 0,80 (Hexano/Acetato de Etila 7:3)
Análise Elementar: C=73,36%, O= não-realizado, N=10.95%, H=6,57%
RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6: 7,82 (d, 1H, Het-H,J=3 Hz); 7.40 (1H,
Het-H,J=3 Hz); 7.70 (s, 1H, CH=N); 4,03 (t, 2H, 2CH2N, J= 5,1 Hz); 4,32 (t,
O
N NNH
O
N+O
-
O
120
1H, NH, J= 4,8 Hz); 5,78-5,89(m, 2H, 2CH); 4,95-5,07(m, 4H, 4CH); 1,98-2,05
(m, 4H, 2CH2); 1,53-1,73(m, 4H, 2CH2)
V- 1.2.1.6 Composto S06 – 2-butil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona
O composto S06 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de 1
mmol da semicarbazona S01 com 1,2 mmol do haleto de alquila 1-Br-butano, a 1,5
mmol de K2CO3 como base. A reação foi mantida sob refluxo a temperatura ambiente
por 48 horas e devidamente acompanhada com cromatografia de camada delgada em
meio 6:4 Acetato de Etila/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído utilizando
uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente orgânico
(acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica para
obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.6.1 Caracterização
F.M: C10H14N4O4
P.M: 246 g/mol
Sólido amarelo ocre; Rendimento: 60%; Rf: 0,76 (Acetato de Etila/Hexano 6/4);
P.F: 128-130⁰C
Análise Elementar: C=49,04%, O= não-realizado, N=21,39%, H=5,96%
O
N NNH2
O
N+O
-
O
121
RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6: 7,79 (d, 1H, Het-H,J= 3 Hz); 7.41 (1H,
Het-H,J=3 Hz); 7.73 (s, 1H, CH=N); 6,92 (s, 2H, NH2); 3,88(t, 2H, CH2N, J=5,4
Hz); 1,33-1,46(m, 2H, CH2); 1,22-1,33(m, 2H, CH2); 0,89(t, 3H, CH3, J=5,4
Hz);
V- 1.2.1.7 Composto S07 – 2,4-dibutil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona
O composto S07 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de 1
mmol da semicarbazona S01 com 1,2 mmmol do haletos de alquila 1-Br-butano, a 1,5
mmol de NaOH como base. As reações foram mantidas sob refluxo a temperatura
ambiente por 3-5 horas e devidamente acompanhadas com cromatografia de camada
delgada em meio 6:4 Acetato de Etila/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído
utilizando uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente
orgânico (acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica
para obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.7.1 Caracterização
F.M: C14H22N4O4
P.M: 310 g/mol
Óleo amarelo-escuro; Rf: 0,84 (Acetato de Etila/Hexano 6/4)
O
N NNH
O
N+O
-
O
122
NÃO FOI POSSÍVEL OBTER DADOS DO RMN 1H, POIS A AMOSTRA FOI
PROVAVELMENTE DEGRADADA PELA DEMORA NA EXECUÇÃO DO
PROCESSO DE ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL.
V- 1.2.1.8 Composto S08 – 2-pentil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona
O composto S08 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de 1
mmol da semicarbazona S01 com 1,2 mmmol do haleto de alquila 1-Br-pentano, a 1,5
mmol de K2C03 como base. A reação foi mantida sob refluxo a temperatura ambiente
por 48 horas e devidamente acompanhada com cromatografia de camada delgada em
meio 6:4 Acetato de Etila/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído utilizando
uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente orgânico
(acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica para
obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.8.1 Caracterização
F.M: C11H16N4O4
P.M: 268 g/mol
Sólido amarelo escuro; Rendimento: 54%; Rf: 0,69 (Acetato de Etila/Hexano
6/4); P.F: 127,5-129,5
O
N NNH2
O
N+O
-
O
CH3
123
Análise Elementar: C=51,06%, O= não-realizado, N=20,04%, H=7,04%
RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6: 7,79 (d, 1H, Het-H,J= 3 Hz); 7.41 (1H,
Het-H,J=3 Hz); 7.73 (s, 1H, CH=N); 6,95 (s, 2H, NH2); 3,87(t, 2H, CH2N, J=5,4
Hz); 1,31-1,46(m, 2H, CH2); 1,23-1,31(m, 4H, 2CH2); 0,85(t, 3H, CH3, J=8,4
Hz)
V- 1.2.1.9 Composto S09 – 2,4 dipentil-1-(5-nitrofurfurilidene)semicarbazona
O composto S09 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de 1
mmol da semicarbazona S01 com 1,2 mmmol do haletos de alquila 1-Br-pentano, a 1,5
mmol de NaOH como base. As reações foram mantidas sob refluxo a temperatura
ambiente por 3-5 horas e devidamente acompanhadas com cromatografia de camada
delgada em meio 6:4 Acetato de Etlia/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído
utilizando uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente
orgânico (acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica
para obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.9.1 Caracterização
F.M: C16H22N4O4
P.M: 310 g/mol
Óleo amarelo escuro; Rf: 0,87 (Acetato de Etila/Hexano 6/4)
O
N NNH
O
N+O
-
O
CH3
CH3
124
NÃO FOI POSSÍVEL OBTER DADOS DO RMN 1H, POIS A AMOSTRA FOI
PROVAVELMENTE DEGRADADA PELA DEMORA NA EXECUÇÃO DO
PROCESSO DE ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL.
V- 1.2.1.10 Composto S10 – 2-secbutil- 1-tiofenocarboxaldeído semicarbazona
O composto S10 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de 1
mmol da semicarbazona S08 com 1,2 mmol do haleto de alquila 2-Br-butano, a 1,5
mmol de K2CO3 como base. A reação foi mantida sob refluxo a temperatura ambiente
por 48 horas e devidamente acompanhada com cromatografia de camada delgada em
meio 6:4 Acetato de Etila/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído utilizando
uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente orgânico
(acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica para
obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.10.1 Caracterização
F.M: C10H15N3OS
P.M: 225 g/mol
Óleo alaranjado; Rendimento: 44%; Rf: 0,51 (Acetato de Etila/Hexano 6/4)
Análise Elementar: C=51,21%, O= não-realizado, N=14,59%,S=13,31%
H=5,66%;
S
N NNH2
O
125
RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6 :6.38 (s, 2H, NH2); 7.08 (dd, 1H, J = 3.3
Hz, J = 5.08 Hz, Ar); 7.09 (d, 1H, J =3.3 Hz, Ar); 7.1 (d, 1H, J = 8,08 Hz, Ar);
7,98 (s, 1H, CH=N); 4,63 (t, 3H, CH3, J=5,1 Hz); 4,97(d, 3H, CH3, J= 7,5 Hz);
5,79-5,9 (m, 1H, CH); 3,82-3,94 (m, 1H, CH)
V- 1.2.1.11 Composto S11 – 2,4-di-secbutil- 1-tiofenocarboxaldeído semicarbazona
O composto S11 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de 1
mmol da semicarbazona S08 com 1,2 mmmol do haletos de alquila 2-Br-butano, a 1,5
mmol de NaOH como base. As reações foram mantidas sob refluxo a temperatura
ambiente por 3-5 horas e devidamente acompanhadas com cromatografia de camada
delgada em meio 7:3 Hexano/Acetato de Etila. Ao fim da reação, o produto foi extraído
utilizando uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente
orgânico (acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica
para obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.11.1 Caracterização
F.M: C14H23N3OS
P.M: 281 g/mol
Óleo amarelo escuro; Rendimento: 58%; Rf: 0,79 (Hexano/Acetato de Etila 7/3)
S
N NNH
O
126
Análise Elementar: C=45,10%, O= não-realizado,S=13,79%, N=9,43%,
H=5,38%
NÃO FOI POSSÍVEL OBTER DADOS DO RMN 1H, POIS A AMOSTRA FOI
PROVAVELMENTE DEGRADADA PELA DEMORA NA EXECUÇÃO DO
PROCESSO DE ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL.]
V- 1.2.1.12 Composto S12 – 2-pentenil- 1-tiofenocarboxaldeído semicarbazona
O composto S12 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de 1
mmol da semicarbazona S08 com 1,2 mmol do haleto de alquila 1-Br-butano, a 1,5
mmol de K2CO3 como base. A reação foi mantida sob refluxo a temperatura ambiente
por 48 horas e devidamente acompanhada com cromatografia de camada delgada em
meio 6:4 Acetato de Etila/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído utilizando
uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente orgânico
(acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica para
obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.12.1 Caracterização
F.M: C11H15N3OS
P.M: 237 g/mol
S
N NNH2
O
127
Óleo alaranjado; Rendimento: 62%; Rf: 0,50 (Hexano/Acetato de Etila 7:3)
Análise Elementar: C=53,94%, O= não-realizado, S=12,36%; N=16,07%,
H=6,03%
NÃO FOI POSSÍVEL OBTER DADOS DO RMN 1H, POIS A AMOSTRA FOI
PROVAVELMENTE DEGRADADA PELA DEMORA NA EXECUÇÃO DO
PROCESSO DE ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL.
V- 1.2.1.13 Composto S13 –2,4--pentenil- 1-tiofenocarboxaldeído semicarbazona
O composto S13 foi sintetizado através da adição em balão de fundo redondo de 1
mmol da semicarbazona S08 com 1,2 mmmol do haletos de alquila 1-Br-butano, a 1,5
mmol de NaOH como base. As reações foram mantidas sob refluxo a temperatura
ambiente por 3-5 horas e devidamente acompanhadas com cromatografia de camada
delgada em meio 6:4 Acetato de Etlia/Hexano. Ao fim da reação, o produto foi extraído
utilizando uma porção de 100 mL de água destilada e três porções de 20 ml solvente
orgânico (acetato de etila), com posterior purificação através de coluna cromatográfica
para obtenção de compostos puros que foram mantidos em dessecador para retirada de
resquício de solvente.
V- 1.2.1.13.1 Caracterização
F.M: C16H23N3OS
S
N NNH
O
128
P.M: 305 g/mol
Óleo alaranjado; Rendimento: 56%; Rf: 0,83 (Hexano/Acetato de Etila 8/2)
Análise Elementar: C=58,53%, O= não-realizado, S=19,51%, N=11,51%,
H=5,1%
NÃO FOI POSSÍVEL OBTER DADOS DO RMN 1H, POIS A AMOSTRA FOI
PROVAVELMENTE DEGRADADA PELA DEMORA NA EXECUÇÃO DO
PROCESSO DE ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL.
V- 1.2.2 Avaliação da Atividade Antibacteriana
V- 1.2.2.1 Metodologia
Os ensaios preliminares de atividade antibacteriana foram realizados em triplicata,
utilizando-se a metodologia de Difusão em Disco em meio sólido1. Soluções na
concentração de 10 mg/mL foram preparadas para cada molécula analisada. Discos de
papel foram impregnados com 30 μL das soluções recém-preparadas, resultando numa
concentração final de 300 μg/disco. Os mesmos foram depositados sobre placas de Petri
contendo os meios de cultura previamente semeados com os microrganismos testados, e
inoculados a 37 ºC por 24-48 h. Discos previamente umedecidos com DMSO foram
utilizados como controle negativo. Os resultados foram analisados através das médias
aritméticas dos halos de inibição, expressas em milímetros, sendo designadas como
Zonas Médias de Inibição (ZMI).
Os compostos S03-S09, por apresentaram uma melhor ação em relação aos demais,
foram selecionados para realização dos testes de determinação das concentrações
mínima inibitória (CMI) e mínima bactericida (CMB), em meio líquido. Para os ensaios
em meio líquido, a partir da solução estoque (10 mg/mL) para cada composto
selecionado, diluições seriadas foram preparadas, obtendo-se concentrações que
variaram entre 7,8125 e 500 μg/mL para os derivados S03-S09.
Estas concentrações foram adicionadas aos tubos teste contendo os meios de cultura, e
posteriormente as suspensões dos microrganismos foram inoculadas. Para o controle
positivo, foram preparados tubos contendo apenas o meio de cultura e a suspensão do
129
microrganismo. Tubos contendo o meio de cultura, a suspensão do microrganismo e o
solvente DMF foram utilizados como controle negativo.
Os tubos foram incubados a 37ºC por 24-48 h, e, em seguida, examinados e plaqueados
para visualização ou não de crescimento. Os valores de CMI foram obtidos a partir da
maior concentração dos compostos onde não se observou crescimento, e os valores de
CMB, observados a partir do crescimento da diluição subseqüente, sempre plaqueando-
os para uma melhor visualização e confirmação.
V- 1.2.3 Avalização da atividade anti- T.cruzi.
V- 1.2.3.1 Metodologia
V- 1.2.3.1.1 Ensaio de citotoxicidade dos compostos em células esplênicas
Células esplênicas serão obtidas de acordo com Pereira et al. (2004). Após sacrifício do
animal em cilindro de CO2, o baço de cada camundongo foi removido em condições
assépticas e colocado em tubo Falcon contendo meio RPMI 1640 sem SFB (meio
incompleto). No fluxo vertical, cada baço foi transferido para placa de Petri onde foram
macerados. As suspensões celulares obtidas foram transferidas para tubos Falcon
contendo aproximadamente 10 ml de meio incompleto por baço, centrifugadas a 4°C,
200 x g durante 5 minutos. Após descarte do sobrenadante, ao sedimento adiciona-se
água destilada para promover lise das hemácias. O sobrenadante, sem conter os debris
celulares, foi coletado e centrifugado a 4°C, 200 x g durante 5 minutos. O sedimento
(contendo as células) foi ressuspendido em meio RPMI 1640 completo. Uma alíquota
de cada suspensão celular foi separada. Em seguida, diluída em azul de trypan para ser
quantificada em câmara de Neubauer, assim como verificar a viabilidade celular2.
130
V- 1.2.3.1.2 Avaliação da atividade tóxica dos compostos em células de
camundongos isogênicos
Células esplênicas (6 X 105células/poço), obtidas de acordo com item anterior, foram
cultivadas em placas de 96 poços de fundo plano, contendo meio de cultura completo.
Para o ensaio de citotoxicidade, as células foram incubadas com os compostos em sete
diferentes concentrações (100, 50, 25, 10, 5 e 1 mg/ml) e de timidina tritiada
(1 microCi/poço) durante 24 h em estufa de CO2 a 37°C. Para o controle foram
utilizadas células tratadas com saponina (0,05%), células tratadas com DMSO (1%), e
sem tratamento, todos com timidina tritiada (1 mCi/poço) associada em paralelo. Cada
droga foi testada em triplicata. Após 24 h de incubação, as células foram coletadas em
papel de fibra de vidro e, posteriormente, a captação de timidina tritiada foi determinada
através do contador beta de cintilação. O percentual de citotoxicidade foi determinado
comparando-se a percentagem de incorporação de timidina tritiada nos poços com as
drogas em relação aos poços não tratados2.
V- 1.2.3.1.3 Avaliação da atividade dos compostos contra Trypanosoma cruzi
Para determinar o efeito anti-proliferativo para T. cruzi, formas epimastigotas (106/ml)
crescidos em culturas axênicas, na fase log de crescimento, foram colocadas em placas
de 96 poços no volume de 100 ml, sob condições de cultura adequadas (26°C). Já as
formas tripomastigotas foram obtidas a partir da infecção in vitro de células Vero. Os
testes foram conduzidos tendo como controle o Benznidazol (50 mg/ml) e culturas de
parasitos sem tratamento. As substâncias foram avaliadas quanto à concentração
inibidora de 50% do crescimento dos parasitas (IC50%) onde formas epimastigotas e
tripomastigotas da cepa Y de T. cruzi foram cultivadas durante 11 dias e 24 horas,
respectivamente, na presença de diferentes concentrações dos compostos, procedendo-
se em seguida a contagem de parasitas viáveis. O cálculo da IC50% foi determinada por
meio de uma regressão linear simples utilizando o software Prisma 4 Graphpad2.
131
132
REFERÊNCIAS
1 BAUER AW, KIRBY WMM, SHERRIS JC, TURCK M. Antibiotic susceptibility
testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol.p. 493-496, 1996
2 PEREIRA, V.R.A.; LORENA, V.M.B.; NAKAZAWA, M.; LUNA, C.F.; SILVA,
E.D.; FERREIRA, A.G.P.; KRIEGER, M.A.; GOLDENBERG, S.; SOARES, M.B.P.;
COUTINHO, E.M.; CORREA-OLIVEIRA, R.; GOMES,Y.M. Humoral and cellular
immune responses in BALB/c and C57BL/6 mice immunized with cytoplasmic (CRA)
and flagellar (FRA) recombinant repetitive antigens, in acute experimental
Trypanosoma cruzi infection. Parasitology Research. v. 96, p. 154–161, 2001.
133
ANEXOS
134
ESPECTRO 1
RMN SUBSTÂNCIA S01
135
ESPECTRO IV SUBSTÂNCIA S01
136
ESPECTRO IV SUBSTÂNCIA S03
137
ESPECTRO 1
RMN SUBSTÂNCIA S04
138
ESPECTRO IV SUBSTÂNCIA S04
139
ESPECTRO 1
RMN SUBSTÂNCIA S05
140
ESPECTRO IV SUBSTÂNCIA S05
141
ESPECTRO IV SUBSTÂNCIA S06
142
ESPECTRO 1H RMN SUBSTÂNCIA S08
143
ESPECTRO IV SUBSTÂNCIA S08
144
ESPECTRO IV SUBSTÂNCIA S10
145
ESPECTRO 1H RMN SUBSTÂNCIA S10
