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RAQUEL GIRARDELLO

AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA À POLIMIXIN A B EM

ISOLADOS CLÍNICOS DE Acinetobacter baumannii

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo - Escola Paulista

de Medicina, para obtenção do Título de

Doutor em Ciências.

São Paulo

2012

RAQUEL GIRARDELLO

CARACTERIZAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA À POLI MIXINA B

EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Acinetobacter baumannii

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo - Escola Paulista

de Medicina, para obtenção do Título de

Doutor em Ciências.

Orientadora: Professora Dra. Ana

Cristina Gales

São Paulo

2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA

Chefe do Departamento:

Professor Dr. Álvaro Nagib Atala

Coordenador do curso de Pós-graduação:

Professor Dr. Ricardo Sobhie Diaz

São Paulo

2012

RAQUEL GIRARDELLO

CARACTERIZAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA À POLI MIXINA B

EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Acinetobacter baumannii

Presidente da Banca:

Profª Drª Ana Cristina Gales

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Alexandre Prehn Zavascki

Profª Drª Silvia Figueiredo Costa

Prof. Dr. Guilherme Henrique Campos Furtado

Prof. Dr. Nilton Lincopan

Suplentes:

Prof. Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari

Profª Drª Anna Sara Shafferman Levin

São Paulo

2012

Girardello, Raquel

Avaliação dos mecanismos de resistência à polimixin a B entre isolados clínicos de Acinetobacter baumannii. Raquel Girardello - São Paulo, 2012. vi. 137 f.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Ciências Básicas em Infectologia.

Título em inglês: Evaluation of mechanisms of resistance to polymyxin B in Acinetobacter baumannii clinical isolates.

1. Polimixinas; 2. Acinetobacter baumannii; 3. Lipopolissacarídeo; 4. Two component systems; 5. Parede celular.

DEDICATÓRIADEDICATÓRIADEDICATÓRIADEDICATÓRIA

Dedico este estudo aos meus pais Valcir Girardello e Maria Rossi

Girardello pela imensa dedicação e auxílio para minha formação pessoal e

profissional e, em agradecimento por acreditarem sempre, independente de

qualquer dificuldade, no meu crescimento e sucesso.

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha orientadora Drª Ana Cristina Gales, pela oportunidade oferecida

e pelo exemplo de dedicação, inteligência e esforço que levarei comigo para o resto de

minha vida.

Agradeço a toda a minha família, em especial meus pais Valcir Girardello e Maria

Rossi Girardello e meu irmão e cunhada Ricardo Girardello e Susana Vassoller por

estarem sempre de braços abertos a espera toda vez que eu precisar. Vocês são a força

que me faz seguir em frente cada vez mais.

Agradeço à Professora Drª Maria Cristina Brognharo Tognin pela confiança e pelo

auxílio e indicação ao laboratório ALERTA, essenciais para que este trabalho tenha sido

realizado.

Agradeço ao Professor Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari pelo grande exemplo

de vida que nos oferece sempre nos lembrando da importância de nossos estudos na

vida de pacientes com os quais ele e outros médicos convivem diariamente pelos

hospitais do Brasil e do mundo.

Agradeço a Tiago Massao Yamanaka pelo grande auxílio durante a realização

desta tese, na parte experimental e na formatação deste documento, além da pronta

disponibilidade para suporte em todos os momentos durante o decorrer da minha

formação.

Um agradecimento especial ao colega de laboratório e amigo Rodrigo Cayô, pela

dedicação e auxílio técnico e científico nos experimentos desta tese, em especial os

experimentos de PBPs e porinas.

Agradeço aos colegas de laboratório Talita Trevizani Rocchetti, Paulo José

Martins Bispo e Liana Carballo de Menezes pelo grande auxílio nos experimentos de

PCR em Tempo Real.

Agradeço à Cecilia Godoy Carvalhaes e André Mario Doi pelas correções deste

trabalho e pela amizade e sempre pronta disponibilidade.

Agradeço ao Centro de Microscopia Eletrônica da UNIFESP, em especial aos

funcionários André Aguillera e Márcia Tanakai e à Professora Drª Edna Haapalainen

pelos experimentos de microscopia eletrônica de transmissão deste estudo.

Agradeço a toda a família LEMC-ALERTA pela convivência nesses quatro anos

de estudos, de confraternizações, alegrias e tristezas, muitas risadas e muito trabalho e,

principalmente, muitas amizades criadas. Levarei todos vocês sempre no meu coração.

Agradeço à secretária do laboratório Rosana Capecce pela amizade e auxílio em

diversos momentos.

Agradeço à Professora Dra Halha Ostrensky Saridakis por todo cuidado e

ensinamentos durante a realização do mestrado, na Universidade Estadual de Londrina.

E, por fim, mas não menos importante, um agradecimento muito especial aos

meus orientadores de iniciação científica, durante a graduação na Universidade de Passo

Fundo, Professor Dr. Luiz Carlos Kreutz e Professora Dra. Laura Beatriz Rodrigues por

me ensinarem o caminho da microbiologia, ensinamentos esses que carrego comigo até

hoje e nunca serão esquecidos.

SUMÁRIO

Índice de Tabelas...................................................................................................... i

Índice de Figuras....................................................................................................... ii

RESUMO.................................................................................................................. iv

ABSTRA CT.............................................................................................................. vi

1. INTRODUÇÃO...................................................................................................... 01

2. REVISÃO BIBLIOGR ÁFICA.............................................. .................................. 04

2.1 Acinetobacter baumannii.............................................................................. 05

2.2 Opções terapêuticas e mecanismos de resistência..................................... 06

2.2.1 β-lactâmicos......................................................................................... 06

2.2.1.1 Produção de enzimas β-lactamases.......................................... 07

2.2.1.2 Alteração de porinas................................................................... 09

2.2.1.3 Hiperexpressão de sistemas de efluxo....................................... 10

2.2.1.4 Alterações de PBP..................................................................... 12

2.2.2 Polimixinas........................................................................................... 14

2.2.2.1 Mecanismos de resistência às polimixinas..................................... 17

3. OBJETIVOS.......................................... ................................................................ 26

4. MATERIAL E MÉTODOS.............................. ....................................................... 28

4.1 Fluxograma.................................................................................................. 29

4.2 Seleção dos isolados bacterianos................................................................ 30

4.3 Indução de resistência à polimixina B.......................................................... 31

4.4 Estabilidade da resistência induzida à polimxina B..................................... 32

4.5 Análise da similaridade genética por PFGE................................................. 32

4.6 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos................................................ 33

4.7 Microscopia eletrônica de transmissão........................................................ 36

4.8 Cultivo em meio hipotônico.......................................................................... 36

4.9 Sequenciamento do sistema de dois componentes PmrAB........................ 37

4.10 PCR em Tempo Real para quantificação da transcrição do sistema de

dois componentes PmrAB..................................................................................

38

4.10.1 Extração de RNA Total e síntese de cDNA...................................... 38

4.10.2 Quantificação relativa da transcrição gênica................................... 39

4.10.3 Análise da quantificação relativa da transcrição gênica.................. 39

4.11 Associação de resistência às polimixinas com mecanismos de

resistência relacionados à parede celular bacteriana........................................

40

4.11.1 Avaliação de proteínas de membrana externa............................. 40

4.11.1.1 Extração de proteínas de membrana externa........................ 40

4.11.1.2 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por

SDS-PAGE...........................................................................................

41

4.11.1.3 Quantificação relativa da transcrição dos genes que

codificam porinas.................................................................................

42

4.11.2 Quantificação relativa da transcrição do gene adeB, que codifica

a proteína estrutural do sistema de efluxo AdeABC.................................

42

4.11.3 Sequenciamento dos genes que codificam as PBPs.................... 42

5. RESULTADOS...................................... ............................................................... 45

5.1 Caracterização dos isolados de A. baumannii............................................. 45

5.2 Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos................................................ 46

5.3 Estabilidade da indução de resistência à polimixina B................................ 48

5.4 Análise da similaridade genética.................................................................. 48

5.5 Microsopia Eletrônica de Transmissão (MET)............................................. 49

5.6 Cultivo em meio hipotônico.......................................................................... 50

5.7 Sequenciamento dos genes que compõem o sistema regulatório de dois

componentes PmrAB.........................................................................................

51

5.8 Quantificação relativa da transcrição do sistema regulatório de dois

componentes PmrAB.........................................................................................

51

5.9 Avaliação da influência de resistência à polimixina B em mecanismos

relacionados à parede celular bacteriana..........................................................

52

5.9.1 Expressão de Proteínas de Membrana Externa................................... 52

5.9.2 Quantificação relativa da transcrição da bomba de efluxo AdeABC.... 55

5.9.3 Alterações nas PBPs............................................................................ 56

6. DISCUSSÃO......................................................................................................... 59

7. CONCLUSÕES..................................................................................................... 72

8. REFERÊNCIAS.................................................................................................... 74

9. ANEXOS............................................................................................................... 98

i

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Sequências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para as reações

de PCR e sequenciamento.......................................................................................

43

Tabela 2. Seqüências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para reações

PCR em tempo real...................................................................................................

44

Tabela 3. Padronização da curva de melting para cada gene submetido à PCR

em tempo real...........................................................................................................

44

Tabela 4. Isolados sensíveis e resistentes à polimixina B, selecionados para o

estudo, antes e após o cultivo na presença de polimixina B....................................

46

Tabela 5. Perfil de sensibilidade de isolados A. baumannii sensíveis e resistentes

às polimixinas, antes e após a indução de resistência com sulfato de polimixina

B................................................................................................................................

47

Tabela 6. Perfil de sensibilidade à polimixina B durante o cultivo na ausência da

droga, após a indução de resistência.......................................................................

48

Tabela 7. Mutações dos genes que codificam as PBP de alto peso molecular nos

isolados de A. baumannii antes e após o cultivo na presença de sulfato de

polimixina B...............................................................................................................

58

ii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 . Estrutura química das moléculas de polimixinas...................................... 15

Figura 2 . Estrutura química do sulfato de colistina e colistimetato de sódio........... 16

Figura 3. Desenho esquemático da parede celular bacteriana de bactérias Gram

negativas...................................................................................................................

18

Figura 4. Esquema da regulação do desenvolvimento de resistência às

polimxinas por isolados de Enterobactérias controlado por sistemas de dois

componentes.............................................................................................................

21

Figura 5. Desenho esquemático do sistema de dois componentes que regula o

desenvolvimento de resistência à polimixinas em isolados de A. baumannii...........

23

Figura 6. Desenho esquemático das passagens de subcultivos na presença de

concentrações crescentes de sulfato de polimixina B para a indução de

resistência à mesma, nos isolados de A. baumannii................................................

32

Figura 7. Desenho esquemático da distribuição das concentrações de polimixina

B na placa de microdiluição em caldo.......................................................................

36

Firgura 8. Desenho esquemático da placa de microdiluição em caldo (TREK

Diagnostics) utilizada para avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos............

36

Figura 9. Perfil de similaridade genética pela metodologia de PFGE...................... 50

Figura 10. Microscopia eletrônica de transmissão de isolados clínicos de A.

baumannii, cultivados na presença e ausência de polimixina B...............................

51

Figura 11. Quantificação relativa da transcrição dos genes do sistema regulatório

de dois componentes PmrAB nos isolados de A. baumannii....................................

53

Figura 12. Quantificação relativa da transcrição dos genes que codificam as

porinas dos isolados de A. baumannii antes e após o cultivo na presença de

polimixina B...............................................................................................................

55

iii

Figura 13. Gel de SDS-PAGE das proteínas de membrana externa (OMPs) dos

isolados clínicos e os mutantes induzidos de A. baumannii.....................................

56

Figura 14. Quantificação da transcrição relativa do gene adeB para os isolados

de A. baumannii, antes e após o cultivo na presença de polimixina B.....................

57

iv

RESUMO

A. baumannii é um agente etiológico frequente de infecções relacionadas à

assistência à saúde no Brasil, pois possui grande capacidade em sobreviver em

condições adversas e desenvolver ou adquirir mecanismos de resistência aos

antimicrobianos. As altas taxas de resistência juntamente com a falta de novas opções

terapêuticas disponibilizadas pelas indústrias farmacêuticas atualmente, tem levado à

necessidade de incluir novamente na prática clínica, drogas antigas como as polimixinas

que, atualmente, constituem uma das últimas opções terapêuticas em casos de infecções

por bacilos Gram negativos multirresistentes. Neste estudo foram analisados os fenótipos

de resistência “natural” e induzida à polimixina B em isolados clínicos de A. baumannii.

Um isolado sensível e outro resistente às polimixinas foram submetidos ao cultivo em

concentrações crescentes de polimixina B para a indução de resistência às mesmas. Os

isolados clínicos de A. baumannii foram analisados por microscopia eletrônica de

transmissão, antes e após o cultivo na presença de polimixina B. Foram realizados o

sequenciamento e qRT-PCR do sistema de dois componentes PmrAB, relacionado com o

surgimento de resistência às polimixinas em A. baumannii. Análises dos mecanismos de

resistência relacionados à parede celular bacteriana foram realizadas para estudar a

associação destes ou não com os fenótipos de resistência às polimixinas. O isolado

sensível à polimixina reverteu o perfil de sensibilidade aos β-lactâmicos e

aminoglicosídeos após a indução de resistência à polimixina B. Esse perfil de

sensibilidade foi estável, mesmo após o cultivo na ausência do antimicrobiano. Esse

mesmo isolado não conseguiu sobreviver em meio hipotônico, sugerindo uma diminuição

da integridade da parede celular bacteriana. Essas alterações no perfil de sensibilidade

não foram observadas no isolado com resistência “natural” quando cultivado na presença

de polimixina B. Nesse isolado, diferente do isolado sensível, foi observado um

espessamento na parede celular, mesmo antes da exposição ao antimicrobiano. O

sequenciamento do sistema de dois componentes PmrAB mostrou duas mutações no

v

gene pmrB, somente no isolado com resistência induzida à polimixina B. Para esses

genes, também foram observados diferentes níveis de transcrição entre o isolado com

resistência induzida e com resistência “natural”, sugerindo que esse segundo fenótipo

não seja regulado pelo sistema PmrAB. A diminuição da expressão da porina OmpW foi

relacionada ao surgimento de resistência induzida às polimixinas nos isolados de A.

baumannii. As mutações nas PBPs de alto peso molecular observadas nos isolados com

resistência “natural” à polimixina podem ser responsáveis pelo fenômeno de

espessamento da parede celular e, consequentemente, pelo fenótipo de resistência. A

concentração dos íons presentes no meio de cultura deve ser avaliado antes da

realização dos testes de sensibilidade às polimixinas, para garantir a confiabilidade e

reprodutibilidade dos testes.

vi

ABSTRACT

A. baumannii is a common pathogen associated to health care infections in Brazil,

due to its capacity to survive in adverse conditions and develop resistance to broad

spectrum antimicrobial agents. The high resistance rate combined to together with the

absence of new antimicrobial options turned polymyxins the last line antimicrobial drugs to

treat Gram negative MDR infections. In this study both, an in vitro induced and a non-

induced polymyxin-resistant phenotype in A. baumannii clinical isolates were analyzed.

The in vitro induced and the non-induced A. baumannii isolates were subcultured in

progressive polymyxin B concentration. The transmission electron microscopy was

performed previous or not the polymyxin B exposure. The PmrAB two component

regulatory system were analyzed by sequencing and qRT-PCR. The polymyxin resistance

determinants associated with the bacterial cell wall were studied. A modification on the

susceptibility testing profile of the induced isolate was observed after polymyxin B

exposure, mainly due to a reduction on the β-lactam and aminoglycosides MICs values.

This susceptibility profile was stable after subculturing the strain in the absence of

antimicrobial pressure. Moreover, this isolate could not survive in a hypotonic environment

suggesting a rupture on the cell wall integrity. This phenomenon was not observed in the

“natural” polymyxin resistant isolate when exposed to polymyxin B pressure. In the non-

induced polymyxin resistant isolate, unlike the induced one, a cell wall thickness was

observed, comparing to the same strain previously drug exposure. The PmrAB

sequencing showed two mutations in the pmrB gene, only in the induced resistant isolate.

Different transcription rates between the induced and the non-induced polymyxin B

resistant isolates was also observed when evaluating the two component system genes

suggesting that the non-induced phenotype was not regulated by this system. In addition,

a decrease in the OmpW expression was observed in the induced polymyxin B resistant

strain but not in the non-induced one. The mutations observed in high molecular weight

vii

PBPs of non-induced polymyxin B resistant isolate may be responsible to the thickness in

the cell wall presented by this isolate.

Introdução

1

1.1.1.1. INTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

Introdução

2

1. INTRODUÇÃO

Microrganismos resistentes aos antimicrobianos constituem um dos principais

problemas enfrentados por hospitais do mundo inteiro, incluindo os brasileiros. Infecções

causadas por bacilos Gram negativos, como Acinetobacter baumannii, Pseudomonas

aeruginosa e Klebsiella pneumoniae eram, até a algumas décadas, tratadas com diversos

antimicrobianos, principalmente os beta-lactâmicos. No entanto, ao longo dos anos,

esses microrganismos tem desenvolvido, cada vez mais, diferentes mecanismos de

resistência a esta classe de antimicrobianos, sendo eles, a produção de β-lactamases, a

hiperexpressão de sistemas de efluxo, a perda ou a redução da expressão de porinas e

alterações nas proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs), tornando esses antimicrobianos

ineficazes contra infecções causadas por esses microrganismos.

A espécie A. baumannii está normalmente envolvida como agente etiológico de

infecções relacionadas à assistência à saúde, como infecções do sistema respiratório ou

de corrente sanguínea e são, frequentemente, responsáveis por surtos hospitalares de

difícil controle. A capacidade de sobreviver em condições adversas, em desenvolver ou

adquirir mecanismos de resistência aos antimicrobianos, aliado a sua resistência

intrínseca, torna as infecções causadas por esses microrganismos de difícil tratamento.

As altas taxas de resistência juntamente com a ausência de novas opções terapêuticas

disponibilizadas pelas indústrias farmacêuticas atualmente, tem levado à necessidade de

incluir novamente na prática clínica, drogas antigas como as polimixinas, que estavam

em desuso desde a década de 70, devido à nefrotoxicidade e à neurotoxicidade

relacionadas ao seu uso.

Segundo um estudo do Sentry Antimicrobial Surveillance Program, as polimixinas

permanecem ativas contra a maioria dos microrganismos não fermentadores

pertencentes às espécies A. baumannii e P. aeruginosa. Apesar disso, embora raro,

relatos de resistência a essas drogas já vem sendo observados em amostras clínicas,

Introdução

3

porém mais frequentemente em mutantes laboratoriais que apresentam resistência

induzida às polimixinas. Os diversos estudos que tentaram elucidar os mecanismos de

resistência às polimixinas não conseguiram esclarecer ainda o aparecimento dos dois

distintos fenótipos de resistência às polimixinas, observados na clínica, um mecanismo,

denominado “natural”, intrínseco ao isolado e, outro fenótipo, que é observado quando há

a exposição da bactéria à polimixina. Cada um dos fenótipos de resistência é,

provavelmente, regulado por diferentes sistemas, o que ainda necessita ser

extensivamente estudado.

Este estudo teve por objetivo avaliar as diferenças nos mecanismos de resistência

“natural” e induzida à polimixina B em isolados clínicos de A. baumannii e sua associação

com outros mecanismos de resistência aos betalactâmicos. Desta maneira, por meio da

compreensão dos distintos mecanismos bacterianos envolvidos na resistência às

polimixinas, esperamos entender como podemos menos favorecer a seleção de

resistência às polimixinas.

Revisão Bibliográfica

4

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA


5

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Acinetobacter baumannii

Microrganismos pertencentes ao gênero Acinetobacter spp. são coco-bacilos

Gram negativos que apresentam metabolismo oxidativo, sendo portanto, classificados

como parte do grupo dos não-fementadores. Dentre as espécies já descritas

pertencentes ao gênero Acinetobacter, A. baumannii é a espécie de maior importância

clínica, pois apresenta maior taxa de resistência aos antimicrobianos disponíveis, como

aminoglicosídeos, fluoroquinolonas e beta-lactâmicos (Vila et al., 2007’; Yau et al., 2009;

Gales et al., 2011). A. baumannii é um patógeno oportunista responsável por uma

variedade de infecções, como as do trato respiratório e de corrente sanguínea no

ambiente hospitalar, e, especialmente, em unidades de terapia intensiva (UTI)

(Monterrubio-Villar et al., 2009). Sua capacidade de sobreviver em superfícies inertes

(Jawad et al., 1998), bem como sua habilidade para trocar material genético e adquirir

determinantes de resistência aos antimicrobianos pode ter contribuído para o sucesso e a

longevidade deste microrganismo no ambiente nosocomial, e consequente disseminação

causando surtos de difícil controle (Higgins et al., 2010), já que geralmente os clones

responsáveis por esses surtos tornam-se endêmicas nas unidades acometidas.

Vila et al. (2007) descreve alguns fatores que favorecem a persistência de

Acinetobacter spp. no ambiente hospitalar, entre eles, a habilidade desses isolados em

sobreviver em ambientes com diferentes temperaturas e valores de pH, além de suas

necessidades nutricionais mínimas. Devido a sua maior persistência, a aquisição de

elementos genéticos móveis como plasmídios, transposons e integrons, que são

responsáveis pela transmissão de genes de resistência é favorecida entre diferentes

indivíduos pertencentes à mesma espécie ou não. Esses fatores limitam ainda mais as

opções terapêuticas disponíveis.


6

2.2 Opções terapêuticas e mecanismos de resistência

Devido ao fenótipo de multirresistência apresentado por isolados de A. baumannii,

as opções terapêuticas, como quinolonas e aminoglicosídeos, já não são mais eficazes

frente estes patógenos em muitos centros médicos mundiais. Os carbapenens são,

normalmente, os antimicrobianos de primeira escolha para o tratamento dessas

infecções. No entanto, desde o início da década de 90, surtos causados por isolados de

A. baumannii resistentes aos carbapenems tem sido descritos com maior frequência

(Wang et al., 2007; Giannouli et al., 2010).

Para isolados com resistência aos carbapenens, geralmente a tigeciclina e/ou as

polimixinas podem constituir opções terapêuticas disponíveis ou os únicos

antimicrobianos disponíveis para tanto. Embora a tigeciclina tenha sido somente

aprovada pela “Food and Drug Administration” (FDA) para o tratamento de infecções de

pele e partes moles, infecções intra-abdominais complicadas e pneumonia comunitária

(Tygacil, bula do medicamento, 2007), esse antimicrobiano tem sido frequentemente

utilizado no tratamento de infecções causadas por A. baumannii (Curcio et al., 2008).

Porém, devido à sua farmacocinética e ao mecanismo bacteriano responsável pela sua

resistência, hiperexpressão de sistemas de efluxo, estar presente no cromossomo

bacteriano, relatos de resistência à tigeciclina em A. baumannii tem surgido com uma

frequência cada vez maior (Peleg et al., 2007, Navon-Venezia et al., 2007; Horsey et al.,

2010; Al-Sweih et al., 2011). Desta maneira, as polimixinas e a associação de

ampicilina/sulbactam representam as principais opções terapêuticas empregadas no

tratamento das infecções causdas por A. baumannii resistentes aos carbapenens

(Oliveira et al., 2008).

2.2.1 ββββ-Lactâmicos

No Brasil, os isolados de A. baumannii, em geral, apresentam taxas de resistência

aos carbapenems entre 25% a 45% (Levin et al., 1999). Entretanto, um estudo conduzido

por Prates et al. (2011) mostrou que a taxa de resistência aos carbapenenens isolados de


7

A. baumannii em uma UTI de um hospital terciário no sul do país aumentou de 29,4% em

2006 para 78% em 2008, muito acima da média nacional. O mesmo estudo mostrou que

a incidência de A. baumannii resistente aos carbapenens foi de 3,78/1000 pacientes-dia

durante o período de estudo (1,49 pacientes-dia em 2006 para 5,45 em 2008) e a

mortalidade observada nesses pacientes foi de 69,7%.

Os mecanismos de resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos de A.

baumannii incluem: (i) produção de β-lactamases (Poirel et al., 2010); (ii)

impermeabilidade de membrana externa associado à perda ou à diminuição da

expressão de porinas (Mussi et al., 2005) e, (iii) hiperexpressão de sistemas de efluxo

(Huang et al., 2008). No entanto, há informações limitadas sobre o papel das

modificações nas proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) na resistência aos β-

lactâmicos em A. baumannii (Gehrlein et al., 1991; Obara & Nakae, 1991; Fernández-

Cuenca et al., 2003; Cayô et al.; 2010).

2.2.1.2 Produção de β-lactamases

A produção de β-lactamases é o principal mecanismo de resistência aos β-

lactâmicos em A. baumannii e em outros bacilos Gram negativos. Estas enzimas se

encontram armazenadas no espaço periplásmico, por onde os β-lactâmicos precisam

atravessar para chegar até o seu sítio alvo que são as PBPs, localizadas na membrana

interna da célula bacteriana. Isolados clínicos de A. baumannii já foram descritos

carreando uma grande variedade de β-lactamases. As β-lactamases da classe C de

Ambler codificada pelo gene blaAmpC é cromossomal e, portanto, intrínseca em A.

baumannii. Distintamente do que ocorre em outros bacilos Gram negativos, que também

possuem as enzimas AmpC cromossomais, o gene blaAmpC não é induzível em A.

baumannii. Entretanto, a presença da sequência de inserção ISAba1 a montante deste

gene leva à sua hiperexpressãoe, consequentemente, resistência às cefalosporinas de

amplo espectro (Bush & Jacoby, 2010; Lee et al., 2011).


8

Outro grupo de β-lactamases também descrito em A. baumannii, são as

pertencentes a classe A de Ambler e ao grupo funcional 2be, conhecidas como β-

lactamases de espectro ampliado (ESβL) e por conferirem a resistência às cefalosporinas

de amplo espetro. Em A. baumannii já foram descritas ESβL do tipo TEM (Peleg et al.,

2008), SHV (Peleg et al., 2008), CTX-M (Peleg et al., 2008), PER (Opazo et al., 2012) e

GES (Bogaerts et al., 2010). Embora relatos já tenham sido descritos, acredita-se que a

prevalência de ESβL em isolados de A. baumannii seja relativamente baixa, quando

comparada àquelas apresentadas por isolados de enterobactérias e de P. aeruginosa.

As metalo-β-lactamases (MβLs), pertencentes à classe B de Ambler, são capazes

de degradar todos os antimicrobianos β-lactâmicos com exceção do aztreonam, e são

muito frequentes em isolados clínicos de P. aeruginosa. As MβLs também foram

descritas em isolados clínicos de A. baumannii, sendo o segundo grupo de

carbapanemases mais frequente nestes microrganismos. Os grupos de MβLs descritos

até o momento em A. baumannii foram do tipo IMP (Yamamoto et al., 2011), VIM (Huang

et al., 2008), SIM (Lee et al., 2005), e NDM-1 (Bogaerts et al., 2012). A carbapenemase

de classe A do tipo KPC, inicialmente descrita em isolados de K. pneumoniae nos

Estados Unidos, em 2001, se disseminou mundialmente, não somente para outras

espécies de enterobactérias, como também para isolados de P. aeruginosa e A

baumannii (Robledo et al., 2010). Outra carbapenemase pertecente a classe A de Ambler

também já foi descrita em A. baumannii, sendo esta do tipo GES (Bonnin et al., 2011).

Felizmente, essas enzimas ainda são restritas a determinadas regiões geográficas.

Dentre todas as β-lactamases produzidas por isolados de A. baumannii, as mais

importantes e prevalentes são aquelas pertencentes ao grupo das oxacilinases com

atividade frente aos carbapenems, conhecidas como CHDLs. As oxacillinases constituem

um grupo de β-lactamases com propriedades estruturais e bioquímicas heterogêneas

(Poirel et al., 2010), pertecentes a classe D de Ambler. Estas enzimas variam desde β-

lactamases de espectro limitado, capazes de hidrolisar somente a oxacilina, até β-

lactamases do tipo ESβL, com capacidade de hidrolisar também as cefalosporinas de


9

amplo espectro, e as CHDLs que hidrolisam os carbapenens menos eficientemente que

as MβLs. Em Acinetobacter spp., as oxacilinases do tipo ESβL são menos

frequentemente detectadas que as CHDLs, sendo que estas estão divididas em cinco

clusters principais. O cluster OXA-51, que está presente no cromossomo de A.

baumannii, podendo também ser encontrada concomitantemente em plasmídeos em

algumas regiões na Ásia (Lee et al., 2012). Nessa região, inclusive o plasmídeo

carreando o gene blaOXA-51 foi transferido para a espécie A. nosocomialis (Lee et al.,

2012). Os outros quatro clusters principais de CHDL são: o cluster OXA-23 (Paton et al.,

1993), o cluster OXA-24 (Bou et al., 2000), o cluster OXA-58 e o cluster OXA-143, que

podem estar localizados tanto no plasmídeo como no cromossomo bacteriano (Bush e

Jacoby, 2010; Poirel et al., 2010). No Brasil, a resistência aos carbapenens em isolados

clínicos de A. baumannii está principalmente associada à produção de OXA-23 (Dalla-

Costa et al., 2003), seguida pela produção de OXA-143 (Antonio et al., 2011; Werneck et

al., 2011a; Mostachio et al., 2012) e da MβL IMP-1 (Gales et al., 2003). Esporadicamente,

isolados produtores de OXA-58 e de OXA-72 (variante do cluster OXA-24) foram

relatados no Brasil (Antonio et al., 2011; Werneck et al., 2011b). Assim como ocorre para

o gene blaAmpC, a expressão dos genes blaOXA-51-like, blaOXA-23-like e blaOXA-58-like também está

associada à presença de sequências de inserção. Diferente do que ocorre com as MβL,

os carbapenems não são seu substrato preferencial e não apresentam atividade frente às

cefalosporinas de amplo espectro (Poirel et al., 2010).

2.2.1.3 Alteração de porinas

Porinas são proteínas de membrana externa que formam canais para o transporte

de moléculas através das membranas, pois essas apresentam baixa permeabilidade aos

solutos hidrofílicos (Vila et al., 2007). Assim como ejeção do antimicrobiano por meio de

sistemas de efluxo, a redução da permeabilidade celular, por perdas ou modificações de

porinas pode desempenhar papel significativo no desenvolvimento de resistência aos

diversos antimicrobianos. A superfície celular de A. baumannii é menos permeável em


10

relação à superfície de outros bacilos Gram negativos, devido ao menor número e

tamanho das suas porinas (Obara et al., 2001; Sato e Nakae, 1991; Lee et al., 2011). A

proteína de membrana externa mais expressa em A. baumannii é a OmpHMP, de 35,6

kDa que é homóloga à porina OmpA e OprF de enterobactérias e P. aeruginosa,

respectivamente. Porinas pertencentes à família da OmpA permitem a penetração de

antimicrobianos β-lactâmicos e sacarídeos de até 800 Da (Gribum et al., 2003; Nitzan et

al., 1999).

Isolados de A. baumannii resistentes a imipenem apresentam perda ou diminuição

da expressão das porinas 33-36 kDa; CarO (29 kDa) e uma proteína de 43 kDa homóloga

à OprD de P. aeruginosa (Vila et al., 2007). Vila et al. (2007) sugere que as porinas CarO

e OprD-like possam funcionar como canais inespecíficos e específicos, respectivamente,

para entrada de carbapenens na célula de A. baumannii. Dois estudos brasileiros

avaliaram a associação entre a produção de β-lactamases e a alteração de porinas no

fenótipo de resistência aos carbapenens em isolados clínicos de A. baumannii (Costa et

al., 2000; Mostachio et al., 2012). O estudo de Costa et al. (2000) avaliou a indução da

resistência in vivo a imipenem em três pacientes após a terapia com este antimicrobiano.

Foram isolados de cada paciente duas cepas sendo uma antes e a outra após a terapia

com imipenem. Eles obervaram que em um dos pacientes houve a perda de uma porina

de 31-36 kDa (correspondente à porina 33-36 kDa) no isolado resistente, quando este era

comparado ao isolado sensível. Um estudo recente, Mostachio et al. (2012) verificaram

que na maioria dos isolados com altos níveis de resistência ao meropenem havia tido a

perda de uma porina de 43 kDa. O mesmo estudo verificou também a perda da porina

33-36 kDa. Nesses isolados os autores verificaram uma alta prevalência da OXA-143,

seguido de OXA-23 e IMP-1.

2.2.1.4 Hiperexpressão de sistemas de efluxo

Associada à produção de enzimas, a hiperexpressão de sistemas de efluxo tem

sido relacionada a altos níveis de resistência aos β-lactâmicos em isolados de A.


11

baumannii. A hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC pertencente à família RND

(“Resistance-Nodulation-Division”) promove a resistência aos aminoglicosídeos, aos β-

lactâmicos, ao cloranfenicol, à eritromicina,à tetraciclina, à tigeciclina e às

fluoroquinolonas (Magnet et al., 2001; Resenfeld et al., 2012), O sistema AdeABC é

composto por três proteínas: AdeA, uma proteína de fusão de membrana; AdeB, a

proteína que faz o transporte e; AdeC, a proteína de membrana externa. Esse sistema de

efluxo é o mais descrito em espécies de Acinetobacter spp. e tem sido relacionado com

níveis mais elevados de resistência aos carbapenens em isolados produtores de OXA-23

(Lee et al., 2010; Lee et al., 2011). A hiperexpressão deste sistema é regulada pelos

genes adeR e adeS (Coyne et al., 2010; Marchand et al., 2004).

O sistema de efluxo AdeFGH possui como substrato os antimicrobianos

cloranfenicol, clindamicina, fluoroquinolonas, trimetoprim, tetraciclina, tigeciclina e

sulfonamidas (Coyne et al., 2010). O aumento da expressão desse sistema de efluxo é

devido à mutação do gene adeL, localizado à montante do gene adeFGH que codifica a

proteína reguladora transcricional LysR (Coyne et al., 2010).

Outro sistema de efluxo AdeIJK está presente em todos os isolados de A.

baumannii e promove resistência à ticarcilina, às cefalosporinas, ao aztreonam, às

fluoroquinolonas, à tetraciclina, à tigeciclina, às lincosamidas, à rifampicina, ao

cloranfenicol, ao cotrimazole, à novobiocina e ao ácido fusídico. O sistema regulatório da

hiperexpressão desse sistema de efluxo foi descrito recentemente por Rosenfeld et al.

(2012) e envolve o gene adeN que atua reprimindo a expressão de AdeIJK.

A família de sistemas de efluxo MFS (“Major Facilitator Superfamily”) também é

encontrada em A. baumannii. O sistema de efluxo Tet é responsável pela resistência à

tetraciclina em bactérias Gram negativas e seus genes podem estar presentes em

transposons que estão inseridos em plasmídios normalmente conjugativos. Esse sistema

de efluxo é regulado pela presença da tetraciclina. Na ausência dessa droga, a proteína

repressora bloqueia a transcrição dos genes estruturais do sistema de efluxo (Chopra e

Robertz, 2001). Em isolados de A. baumannii os principais sistemas dessa família são


12

TetA que confere resistência à tetraciclina e TetB que confere resistência à tetraciclina e

à minociclina. A tigeciclina não é afetada por esses sistemas de efluxo; porém, é ejetada

pelo sistema AdeABC (Martí et al., 2006).

A família MATE (“Multidrug and toxic compound extrusion”) inclui o sistema de

efluxo AbeM que confere resistência à norfloxacina, à ciprofloxacina, à gentamicina, à

canamicina, à eritromicina, ao cloranfenicol, ao trimetoprim, além de alguns antissépticos.

Esse sistema utiliza a força próton-motriz para ejetar os antimicrobianos da célula

bacteriana (Su et al., 2005).

2.2.1.5 Alterações de PBPs

Na membrana interna da parede celular bacteriana estão localizadas as PBPs,

que são responsáveis pela síntese do peptideoglicano e constituem o alvo de ação dos

antimicrobianos β-lactâmicos. O peptidioglicano é composto por cadeias de glicano

formadas alternadamente pelo ácido acetilglicosamina e pelo ácido acetilmurâmico. Cinco

aminoácidos são ligados ao ácido acetilmurâmico. (Ghuysen et al., 1968; Schleifer e

Kandler, 1972; Vollmer et al., 2004; Vollmer et al., 2008). Na transglicosilação, as PBPs

catalizam a polimerização de cadeias de glicano e, na transpeptidação, essas proteínas

promovem a ligação cruzada entre as cadeias laterais de peptideoglicano. Dessa forma,

essas proteínas são responsáveis por determinar a forma da célula bacteriana e

assegurar que essa seja mantida por gerações seguintes. O peptideoglicano celular

intacto permite à célula bacteriana resistir a danos devido às pressões intracelular e

extracelular (Sauvage et al., 2008).

As PBPs são divididas em duas categorias, as PBPs de alto peso molecular e as

PBPs de baixo peso molecular. As PBPs de alto peso molecular são PBPs

multifuncionais responsáveis pela polimerização do peptídioglicano e inserção do mesmo

na parede celular pré-existente (Goffin e Ghuysen, 1998; Born et al., 2006). Dependendo

de sua estrutura e atividade catalítica do seu domínio N-terminal elas são pertencentes

às classes A ou B. Nas PBPs de classe A de Escherichia coli, chamadas PBP1a, PBP1b


13

e PBP1c, o domínio N-terminal é responsável pela atividade de glicosiltransferase,

catalizando a elongação de cadeias de glicano não ligadas. Nas PBPs de classe B,

chamadas PBP2 e PBP3, o domínio N-terminal desempenha papel na morfogênese

celular e não possuem atividade de glicosiltransferase (Höltje et al., 1998; Zapun et al.,

2008). Em ambas as classes A e B, o domínio C-terminal cataliza a ligação cruzada entre

as duas cadeias de glicano através da atividade de transpeptidase (Sauvage et al., 2008).

As PBPs 1a e 1b, são as principais transpeptidases e transglicosilases da célula

bacteriana. Entretanto, a deleção de apenas uma dessas duas proteínas não é letal para

a célula bacteriana. A função da PBP1c ainda não foi completamente elucidada até o

momento, e não está presente em todos os bacilos Gram negativos. Ela não sofre

alteração pela maioria dos antimicrobianos β-lactâmicos e sua hiperexpressão não supre

a ausência da PBP1a e da PBP1b. As PBPs de classe B são transpeptidases

monofuncionais, onde a PBP2 tem função de elongase, enquanto a PBP3 está envolvida

no complexo de divisão celular.

As PBPs de baixo peso molecular ou de classe C podem ser subdivididas nas

subclasses C1, C2 e C3 (Sauvage et al., 2008). Essas proteínas estão envolvidas na

separação celular, maturação e reciclagem do peptideoglicano. A PBP4 e PBP7 são

endopeptidases que clivam as ligações cruzadas entre as duas cadeias de glicano,

entretanto, parecem que a PBP4 não é encontrada no genoma de A. baumannii (Cayô et

al., 2011). A PBP5 é a principal carboxipeptidase e é responsável pela clivagem do

domínio terminal D-Ala-D-Ala tornando a cadeia de peptídio disponível para a

transpeptidação (Spratt e Strominger, 1976). Em E. coli, as PBP6 e PBP6b possuem

sequencias homólogas à sequencia da PBP5 e, assim como ela, também possuem ação

de carboxipeptidase. Em isolados de Acinetobacter spp. somente a PBP6 é idêntica à

PBP5 (Cayô et al., 2011). As outras PBPs de baixo peso moleculas já descritas PBP4b e

AmpH possuem função desconhecida (Sauvage et al., 2008).

As PBPs possuem variado grau de afinidade pelos β-lactâmicos e, dessa forma,

alterações nessas proteínas são responsáveis pelo desenvolvimento de resistência à


14

esses antimicrobianos (Sauvage et al., 2008). Ainda existem poucos estudos em relação

à participação de PBPs na resistência aos β-lactâmicos em isolados de A. baumannii

(Gehrlein et al., 1991; Obara & Nakae, 1991; Fernández-Cuenca et al., 2003; Cayô et al.;

2011). Gehrhein et al. (1991) associou alterações nas PBPs de isolados clínicos de A.

baumannii com resistência à imipenem nesses isolados.

2.2.2 Polimixinas

As polimixinas são antimicrobianos polipeptídicos descobertos em 1947 como

produto do microrganismo de solo Paenibacillus (Bacillus) polymyxa. Esses

antimicrobianos são utilizados na prática clínica nas formas de polimixina B e E, essa

última também chamada de colistina. A estrutura química das duas polimixinas se

diferencia pela presença de um único aminoácido na mesma posição, D-Leucina na

molécula de colistina e D-Fenilalanina na molécula de polimixina B (Bergen et al., 2006),

conforme mostrado na Figura 1. O sulfato de colistina é utilizada somente na formulação

tópica, enquanto que o colistimetato de sódio é uma preparação para uso parenteral e

seus principais componentes são colistina A e colistina B (Figura 2), que diferem em sua

composição pelo resíduo de ácidos graxos (Landman et al., 2008). Desde sua descoberta

até a década de 1960, essas drogas eram opções terapêuticas frequentemente usadas

para o tratamento de infecções graves por bacilos P. aeruginosa. A partir da década de

1970, as polimixinas foram gradativamente substituídas pelas cefalosporinas de amplo

espectro e pelos aminoglicosídeos, que apresentavam o espectro de atividade,

semelhante, mas com menor toxicidade. Até a década de 1990, as polimixinas eram

utilizadas somente em formulações tópicas ou inalatórias no tratamento de infecções não

graves ou na prevenção da colonização por P. aeruginosa em pacientes com fibrose

cística, respectivamente (Li et al., 2006a).


A molécula de polimixina consiste de uma cadeia lateral de ácidos graxos ligada a

um anel peptídeo policatiônico composta de dez aminoácidos.

catiônicos, as polimixinas possuem alta afinidade por superfícies carregadas

negativamente, como o lipopolissacarídeo (

antimicrobianos dessa classe agem

bacteriana, deslocando as

promovendo o aumento da permeabilidade

da mesma forma com a membrana interna da célula, promovendo a

componentes celulares, lev

Figura 1: Estrutura química das moléculas de polimixina

B: Molécula de colistina. Adaptado de Bergen



um anel peptídeo policatiônico composta de dez aminoácidos. Por serem compostos

as polimixinas possuem alta afinidade por superfícies carregadas

lipopolissacarídeo (LPS) da membrana externa bacteriana.

icrobianos dessa classe agem na membrana celular externa

deslocando as moléculas de cálcio e magnésio que estabilizam

promovendo o aumento da permeabilidade celular. Logo após, essas drogas interagem

da mesma forma com a membrana interna da célula, promovendo a

componentes celulares, levando à morte celular bacteriana (Hancock, 1997

Estrutura química das moléculas de polimixinas. A: Molécula de polimixina B;

Adaptado de Bergen et al., 2006.

15


Por serem compostos

as polimixinas possuem alta afinidade por superfícies carregadas

da membrana externa bacteriana. Os

externa da parede celular

léculas de cálcio e magnésio que estabilizam o LPS,

celular. Logo após, essas drogas interagem

da mesma forma com a membrana interna da célula, promovendo a liberação dos

Hancock, 1997).

Molécula de polimixina B;


16

Figura 2: Estrutura química da colistina - A e do colistimetato de sódio - B (Li et al.,

2006b).

Atualmente, as taxas de infecção causada por bactérias Gram negativas

resistentes à maioria dos antimicrobianos utilizados comumente na clínica tem

aumentado com grande rapidez, restringindo cada vez mais as opções terapêuticas.

Associado a esse fato, a indústria farmacêutica não tem produzido novos

antimicrobianos, para os quais as bactérias ainda não tenham desenvolvido mecanismo

de resistência. Dessa forma, as polimixinas foram novamente introduzidas na prática

clínica, em alguns casos, como a última opção terapêutica ainda efetiva.

As polimixinas possuem um amplo espectro de ação contra bactérias Gram

negativas, com algumas exceções, como, Proteus spp. Burkholderia spp., Serratia spp.,

Morganella morgannii e Providencia spp., que apresentam resistência intrínseca a esse

agente antimicrobiano. A resistência às polimixinas ainda é rara entre microrganismos

não fermentadores, como Acinetobacter spp. e P. aeruginosa (Gales et al., 2001; Gales

et al., 2006). Um estudo recente do Sentry Antimicrobial Surveillance Program apontou


17

que polimixina B ainda apresenta excelente atividade contra bactérias Gram negativas,

incluindo aquelas que apresentam resistência aos carbapenens. No entanto, esses

autores observaram uma tendência a um aumento da resistência às polimixinas entre os

isolados de K. pneumoniae de hospitais localizados na América Latina. Esses isolados

apresentam concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de polimixina B e colistina mais

elevadas do que as observadas entre isolados não fermentadores que apresentam esse

fenótipo (Gales et al., 2011; Sader et al., 2011).

2.2.2.1 Mecanismos de resistência às polimixinas

O mecanismo de resistência às polimixinas não está completamente elucidado até

o momento. Em geral, são observados dois fenótipos de resistência, o primeiro,

denominado resistência natural, provavelmente resultante de mutação no genoma

bacteriano e que promove baixo grau de resistência com CIMs próximas aos pontos de

corte para mudança de categoria de sensibilidade. O segundo fenótipo de resistência às

polimixinas é denominado mecanismo adaptativo, no qual a bactéria, inicialmente

sensível, desenvolve resistência às polimixinas após à exposição cem concentrações

crescentes de polimixinas. Esse último mecanismo pode levar a CIMs bem mais

elevadas, acima de 128 µg/mL e pode ser um fenótipo reversível, dependendo da

espécie bacteriana, na ausência da pressão seletiva estabelecida pela droga (Skiada et

al., 2011). Dessa forma, a utilização do antimicrobiano em doses não suficientes para

erradicação do patógeno pode contribuir para o surgimento do fenótipo adaptativo de


A parede celular de bactérias Gram negativas é formada por uma membrana

interna que separa o conteúdo intracelular do espaço periplasmático onde estão

presentes as betalactamases, seguida por uma camada fina de peptideoglicano. Esses

microrganismos possuem a membrana externa fosfolipídica envolvendo a célula. A


parede celular bacteriana é ancorada por moléculas de LPS

total da superfície celular bacteriana, com exceção dos espaços ocupados pelas porinas

(Nikaido, 2003). O LPS é composto

por um lipídio A, na porção central

extremidade mais externa, por um antígeno O

Figura 3. Desenho esquemático da parede celular bacteriana de bactérias Gram

negativas (Adaptado de Brock, 2003).

Lipídio A é a porção que ancora o LPS

composto por fosfolipídios

endotoxina bacteriana, responsável por

Like 4, desencadeando a resposta inflamatória

Whitfield, 2002; Koch et al., 2012


parede celular bacteriana é ancorada por moléculas de LPS que cobre

bacteriana, com exceção dos espaços ocupados pelas porinas

O LPS é composto por três regiões, em sua extremidade mais

na porção central por um core de oligossacarídeo e, em sua

, por um antígeno O (Figura 3).

Desenho esquemático da parede celular bacteriana de bactérias Gram

Brock, 2003).

Lipídio A é a porção que ancora o LPS na superfície da membrana

s baseados em moléculas de glicosamina.

endotoxina bacteriana, responsável por ativar os receptores do sistema imunológico Toll

a resposta inflamatória, que pode levar ao choque tóxico

., 2012; Triantafilou et al., 2012). Devido à grande afinidade da

18

cobrem a área externa

bacteriana, com exceção dos espaços ocupados pelas porinas

, em sua extremidade mais interna,

arídeo e, em sua

Desenho esquemático da parede celular bacteriana de bactérias Gram

na superfície da membrana interna e é

glicosamina. O lipídio A é a

ativar os receptores do sistema imunológico Toll-

choque tóxico (Raetz e

. Devido à grande afinidade da


19

molécula de polimixina pelo lipídio A, cuja carga é negativa, essa droga também

apresenta atividade anti-endotoxina (Chen et al., 2010).

O core de oligossacarídeo é uma pequena porção central do LPS dividida em core

externo e core interno (lipídio A proximal), esse último é composto por heptose e resíduos

de ácido 3-deoxi-D-manno-oct-2-ulosonico (KDO). Assim como o lipídio A, o core de

oligossacarídeo é uma região altamente conservada e desempenha papel crucial na

estabilização das funções de barreira da membrana externa bacteriana (Heinrichs et al.,

1998; Nikaido, 2003). Durante sua formação, o core de oligossacarídeo é agregado a um

lipídio A pré-formado, por transferência sequencial do radical glicosil a partir de

precursores de açúcares. Esse processo envolve um complexo de glicosiltransferases

associadas à membrana, agindo na face interna da membrana celular interna. Após a

síntese do LPS, o MsbA, um transportador do tipo ABC, é responsável por lançar o lipídio

A através da membrana (Heinrichs et al., 1998; Nikaido, 2003).

A porção do antígeno-O é a mais externa da molécula de LPS e, dessa forma,

define as propriedades da superfície celular em espécies que não produzem cápsula.

Essa porção do LPS é importante para fugir do ataque do sistema imunológico do

hospedeiro. Para isso, essa porção é menos conservada do que o lipídio A e o core de

oligossacarídeo. Microrganismos produtores de cápsula podem não possuir o core de

oligossacarídeo em seu LPS, ou esse não estar aparente na superfície celular (Nikaido,

2003).

Estudos em Salmonella enterica foram os primeiros a demonstrar a associação

entre alterações no LPS bacteriano e diminuição da sensibilidade às polimixinas. A

principal alteração encontrada foi uma adição de 4-amino-arabinose na porção do lipídio

A do LPS (Castelli et al., 2000; Navarre et al., 2005). Logo após os estudos com S.

enterica, essas alterações de LPS também foram descritas em outras espécies, inclusive

entre microrganismos não fermentadores (Gunn et al., 1998; Moskowitz et al., 2004;

Winfield et al., 2005). Em geral, alterações no LPS bacteriano são descritas como


20

responsáveis por alterações na carga de superfície da célula bacteriana e redução na

afinidade do antimicrobiano pela parede celular.

A regulação gênica do desenvolvimento de resistência às polimixinas, por meio de

alterações no LPS conhecida até o momento, é realizada pelos sistemas de dois

componentes (“Two Component Systems”). Esses sistemas são ativados por fatores

ambientais, como, presença de ferro, concentrações elevadas de cálcio ou baixas de

magnésio, ou ainda, alterações do pH no meio. A presença de polimixinas no meio

também desencadeia a ativação desses sistemas (Groisman et al., 1997, Moskowitz et

al., 2012).

Esses sistemas de dois componentes são sistemas globais de regulação gênica,

utilizados por diversas espécies bacterianas para regulação da expressão de diferentes

fatores de resistência e também de virulência. Eles são constituídos por uma proteína

sensor de histidina quinase que percebe estímulos ambientais, sofrendo uma reação de

autofosforilação, ativando uma segunda proteína citoplasmática, por uma reação de

transfosforilação. A segunda proteína, então, promove a ativação ou a repressão dos

genes alvo, desencadeando a resistência às polimixinas (Gooderhan e Hancock, 2009).

Estudos com isolados de K. pneumoniae mostraram a participação dos sistema

PhoPQ e PmrAB em diferentes condições ambientais para o desenvolvimento de

resistência às polimixinas (Mitrophanov et al., 2008, Mitrophanov e Groisman, 2008).

Mitrophanov et al. (2008) observaram que em baixas concentrações de magnésio, o

sistema PhoPQ é ativado promovendo a expressão do gene pmrD. Tanto a expressão de

pmrD, quando a presença de ferro estimulam a ativação do sensor quinase pmrB, que

promove a ativação de PmrA, que por sua vez, leva a modificações no LPS bacteriano

em K. pneumoniae e à resistência às polimixinas. O mesmo grupo de pesquisa, em

estudos anteriores avaliando outras enterobactérias como S. enterica e E. coli,

mostraram a participação desses dois sistemas. No entanto, nessas duas espécies, tanto


o sistema PhoPQ quanto o sistema PmrAB ativa

Kato et al., 2003; Kato et al.,

Figura 4. Esquema da regulação do desenvolvimento de resistência às polim

isolados de Enterobactérias controlado por sistemas de dois componentes.

regulatório em S. enterica.

2008).

A resistência às polimixinas em isolados de

rede de sistemas de dois componentes.

sistemas com resistência às polimixinas

mais recentemente, o sistema ParR/S (Barrow e Kwon, 2009; Fernández

Miller et al., 2011; Moskowitz

mutações no gene pmrB, associado à expressão dependente de

importantes mecanismos de regulação de resistência às polimixinas (Barrow e Kwon,

2009; Moskowitz et al., 2012). O sistema PhoP

A do LPS de bactérias Gram

do gene phoQ e contribuem para o desenvolvimento de altos níveis de resistência às

polimixinas (Barrow e Kwon, 2009; Miller

PhoPQ, promovem modificações na expressão do operon

adição de 4-amino-arabinose no lipídio A, que leva à alteração no fenótipo de resistência


o sistema PhoPQ quanto o sistema PmrAB ativaram diretamente o gene

et al., 2007).

Esquema da regulação do desenvolvimento de resistência às polim

isolados de Enterobactérias controlado por sistemas de dois componentes.

S. enterica. B. Sistema regulatório em K. pneumoniae (Mitrophanov

A resistência às polimixinas em isolados de P. aeruginosa envolve

rede de sistemas de dois componentes. Até este momento, o envolvimento de

sistemas com resistência às polimixinas foram descritos, o sistema

mais recentemente, o sistema ParR/S (Barrow e Kwon, 2009; Fernández

., 2011; Moskowitz et al., 2012). Alterações no sistema PmrA

, associado à expressão dependente de pmrA


., 2012). O sistema PhoPQ está envolvido na modificação do lip

A do LPS de bactérias Gram negativas, devido à mutações que levam a perda de função

e contribuem para o desenvolvimento de altos níveis de resistência às

limixinas (Barrow e Kwon, 2009; Miller et al., 2011). Ambos os sistemas, PmrAB e

Q, promovem modificações na expressão do operon arnBCADTEF responsável pela

arabinose no lipídio A, que leva à alteração no fenótipo de resistência

21

m diretamente o gene pmrD (Figura 4,

Esquema da regulação do desenvolvimento de resistência às polimixinas por

isolados de Enterobactérias controlado por sistemas de dois componentes. A. Sistema

(Mitrophanov et al.,

envolve uma complexa

Até este momento, o envolvimento de três destes

, o sistema PmrAB, PhoPQ e,

mais recentemente, o sistema ParR/S (Barrow e Kwon, 2009; Fernández et al., 2010;

ções no sistema PmrAB, por meio de

pmrA, representam


Q está envolvido na modificação do lipídio

negativas, devido à mutações que levam a perda de função

e contribuem para o desenvolvimento de altos níveis de resistência às

os sistemas, PmrAB e

BCADTEF responsável pela

arabinose no lipídio A, que leva à alteração no fenótipo de resistência


22

às polimixinas. O sistema de dois componentes ParRS foi o último descrito até o

momento em isolados de P. aeruginosa com resistência adaptativa às polimixinas. Esse

sistema foi relacionado a mutações no operon arnBCADTEF na presença de

concentrações subinibitórias de polimixina, que levaram à modificações no LPS e

conseqüente resistência à mesma (Fernández et al., 2010).

Em A. baumannii, somente o operon pmrCAB foi descrito, até o momento, como

relacionado à resistência às polimixinas. Seus genes compõem um sistema de dois

componentes, onde o pmrB é o sensor de histidina quinase e o pmrA é a proteína

reguladora da resposta. Esse sistema controla a expressão do gene pmrC o qual é

responsável pela adição de fosfoetanolamina ao lipídio A do LPS da parede celular

bacteriana levando à resistência bacteriana (Figura 5). Mutações nos genes pmrA ou

pmrB também promovem diminuição da sensibilidade às polimixinas (Adams et al., 2009;

Arroyo et al., 2011).


Figura 5: Desenho esquemático do sistema de dois componentes que regula o

desenvolvimento de resistência à polimixinas em isolados de

PmrCAB (B). Adaptado de Mitrophanov

Em 2010, Moffat et al

A. baumannii com resistência

gene que codifica o LPS,

bacteriana. Moffat et al. (2010)

uma parede celular na ausência de LPS para sobreviver às pressões externas e internas.

Esses autores afirmaram que a perda do LPS promoveu

parede celular bacteriana e, consequentemente levou a mudanç

sensibilidade dos isolados de

perfil de sensibilidade com reversão da resistência aos antimicrobianos, incluindo aqueles


Desenho esquemático do sistema de dois componentes que regula o

desenvolvimento de resistência à polimixinas em isolados de A. baumannii

Adaptado de Mitrophanov et al., 2008.

et al. relataram a perda total do LPS bacteriano em isolados de

com resistência in vitro à colistina. Esses autores observaram

gene que codifica o LPS, lpxA, que levou a perda total do LPS da parede celular

(2010) ainda sugerem que esses isolados conseguiram elaborar


m que a perda do LPS promoveu a diminuição da integridade da

parede celular bacteriana e, consequentemente levou a mudanç

sensibilidade dos isolados de A. baumannii. Alguns estudos descrevem a mudança do


23

Desenho esquemático do sistema de dois componentes que regula o

A. baumannii (A). Operon

bacteriano em isolados de

à colistina. Esses autores observaram a mutação no

, que levou a perda total do LPS da parede celular

ados conseguiram elaborar


a diminuição da integridade da

parede celular bacteriana e, consequentemente levou a mudanças no perfil de

. Alguns estudos descrevem a mudança do



24

para os quais os isolados de Acinetobacter spp. são intrinsecamente resistentes (Gordon

et al., 2010; Cai et al., 2012). Alguns autores sugerem, tanto em estudos in vivo quanto in

vitro, o uso da associação sinérgica de polimixinas a outros antimicrobianos como

carbapenens, tigeciclina, vancomicina, rifampicina, ampicilina/sulbactam ou amicacina,

para tratamento de infecções graves causadas por A. baumannii (Fulnecky et al., 2005;

Biancofiore et al., 2007; Pantopoulou et al., 2007; Bassetti et al., 2008; Song et al., 2008;

Principe et al., 2009; Candel et al., 2010; Pankuch et al., 2010; Rodriguez et al., 2010;

Hornsey et al., 2011; Santimaleeworagun et al., 2011; Sheng et al., 2011; Shields et al.,

2011; Peck et al., 2012).

Além de alterações no LPS bacteriano, a produção de cápsula polissacarídica já

foi relacionada com a diminuição da sensibilidade às polimixinas em isolados de K.

pneumoniae (Llobet et al., 2008; Cheng et al., 2010). Cheng et al. (2010) observaram que

amostras mutantes para o gene ugd, responsável pela biossíntese de cápsula

apresentavam maior sensibilidade às polimixinas em relação à cepa selvagem, o que

demonstra que, nessa espécie, a produção de cápsula também está envolvida com


A membrana externa da parede celular de bactérias Gram negativas permite a

passagem de moléculas de nutrientes pequenas e lipofílicas. No entanto, sua natureza

hidrofóbica dificulta a entrada de solutos hidrofílicos por ela, como a maioria dos

nutrientes celulares. Sendo assim, a parede celular bacteriana possui canais formados

por proteínas que permitem a entrada dessas moléculas e a saída de moléculas tóxicas

para a célula. Essas proteínas são denominadas porinas e servem de porta de entrada

para os antimicrobianos hidrofílicos na célula bacteriana. Dessa forma, a perda ou a

diminuição na expressão de porinas contribuem para a resistência. A regulação da

expressão de porinas em resposta à presença de antimicrobianos é uma estratégia de

sobrevivência desenvolvida por bactérias de diferentes espécies (Nikaido, 2003). Um

estudo conduzido por Vila e colaboradores (2007) observou que a redução na expressão


25

da porina OmpW (21 kDa) foi observada em isolados mutantes resistentes à colistina de

A. baumannii selecionados in vitro, demonstrando um possível papel dessa porina na

resistência a essa classe de antibióticos (Vila et al., 2007; Lee et al., 2011).

Em 2006, Li et al. (2006b) descreveram o aparecimento de heterorresistência à

colistina em isolados de A. baumannii. Heterorresistência é denominada quando é

detectado o surgimento de uma subpopulação resistente em uma população de isolados

sensíveis à colistina. Após esse estudo, outros relatos de heterorresistência à colistina

começaram a ser publicados em todo o mundo (Ko et al., 2007; Yau et al., 2009;

Rodriguez et al., 2009; Chang et al., 2012). Entretanto, o conceito de heterorresistência

ainda não é concenso entre pesquisadores. Ainda não se sabe se a base para essa

resistência é a presença de uma população de indivíduos geneticamente distintos ou se a

variação no sistema regulatório entre indivíduos idênticos pode ser suficiente para a

expressão de resistência às polimixinas (Adams et al., 2009). Segundo Cai et al. (2012),

a prévia exposição à colistina contribui para o desenvolvimento de heterorresistência,

selecionando isolados com CIMs mais elevadas, o que pode levar a falha terapêutica. O

uso inapropriado do antimicrobiano é um fator de risco tanto para o surgimento de

heterorresistência quanto para o aparecimento dos fenótipos de indução de resistência

nos isolados clínicos. Hawley et al. (2008) observaram em seu estudo que, dos pacientes

com infecções por A. baumannii que estavam recebendo polimixina em seu tratamento,

eram isoladas cepas com CIMs para polimixinas extremamente elevadas, acima dos

pontos de corte para mudança de categoria de sensibilidade. Esses autores ressaltam a

importância em monitorar a emergência de resistência durante o uso prolongado de

polimixinas para evitar falha terapêutica em tratamento por infecções causadas por A.

baumannii multirresistentes. Lopez-Rojaz et al. (2011) sugerem que as taxas de

resistência às polimixinas ainda são baixas devido à um custo energético sofrido pelo

isolado bacteriano para o desenvolvimento do fenótipo de resistência, reduzindo seu

fitness. Entretanto, Rolain et al. (2011) afirmam que essas taxas de resistência


26

aumentarão assim que o uso da droga se tornar mais comum, levando ao

desenvolvimento de resistência por adaptação à pressão seletiva exercida pela droga. Al-

Sweih et al. (2011) prevê grandes problemas clínicos assim que a atividade das

polimixinas for reduzida e não existirem outras opções terapêuticas disponíveis para o

tratamento de infecções por bacilos Gram negativos multirresistentes.

Objetivos

27

3. OBJETIVOS3. OBJETIVOS3. OBJETIVOS3. OBJETIVOS

Objetivos

28

3. OBJETIVOS

3.1 Geral.

Estudar os mecanismos de resistência, “natural” e induzida, à polimixina B em

isolados clínicos de Acinetobacter baumannii e sua associação com os mecanismos de

resistência a antimicrobianos.

3.2 Específicos.

• Promover a indução de resistência à polimixina em isolados de A. baumannii

sensível e naturalmente resistente à polimixina B;

• Confirmar a similaridade genética entre os isolados de A. baumannii antes e após

a indução de resistência à polimixina B;

• Avaliar a estabilidade do fenótipo de resistência induzida à polimixina B;

• Avaliar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de cada isolado de A.

baumannii, antes e após a indução de resistência à polimixina B;

• Avaliar a estrutura da célula bacteriana dos isolados de A. baumannii antes e

após a indução de resistência à polimixina B por meio de microscopia eletrônica

de transmissão.

• Realizar o sequenciamento e análise de transcrição do sistema de dois

componentes PmrAB dos isolados de A. baumannii antes a após a indução de

resistência à polimixina B;

• Avaliar a interferência da indução de resistência à polimixina B com outros

mecanismos de resistência que atuam na síntese da parede celular por meio da

análise das proteínas de membrana externa, das proteínas ligadoras de

penicilinas e do sistema de efluxo AdeABC.

Material e Métodos

29

4. MATERIAL E MÉTODOS4. MATERIAL E MÉTODOS4. MATERIAL E MÉTODOS4. MATERIAL E MÉTODOS

Material e Métodos

30

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Fluxograma.

No fluxograma abaixo encontram-se resumidamente descritos os testes realizados

neste estudo:

A027 (S)

A009 (R)

Indução de

resistência à

polimixina B

A027 e A027Ind

A009 e A009Ind

Estabilidade do

fenótipo de

resistência

Microscopia

eletrônica de

transmissão

Teste de sensibilidade

aos antimicrobianos

Cultura em meio

hipotônico

Sequenciamento

PmrAB

qRT-PCR

PmrAB

ANÁLISE DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA

RELACIONADOS À PAREDE CELULAR

Porina

qRT-PCR

SDS-PAGE

Efluxo

qRT-PCR

PBPs

Sequenciamento

Análise da

similaridade

genética por PFGE

Material e Métodos

31

4.2 Seleção dos isolados bacterianos

Foi selecionado para este estudo um isolado clínico de A. baumannii resistente à

polimixina B, A009 (CIM, 16 µg/mL), isolado em 30/06/2007 de um paciente

diagnosticado com infecção do trato respiratório inferior, que não recebeu polimixina B

durante seu tratamento. A partir do isolado resistente, para fins comparativos, foi

selecionado um isolado de A. baumannii sensível à polimixina B, A027 (CIM, 0,25 µg/mL),

recuperado também de um paciente com infecção de trato respiratório inferior, na mesma

época (30/06/2007). Ambos isolados estavam armazenados no banco de microrganismos

do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC). Neste estudo, foi denominada

resistência “natural”, aquela resistência observada no isolado A009, sem exposição às

polimixinas. A resistência apresentada após o subcultivo na presença de polimixina B foi

denominada resistência induzida.

O perfil de sensibilidade à polimixina B havia sido previamente determinado pelo

laboratório clínico e, após a seleção dos isolados, foi confirmado pela técnica de

microdiluição em caldo, de acordo com o item 4.3.

Os isolados foram inicialmente identificados pelo método automatizado Phoenix

System (BD Diagnostics). A identificação foi confirmada pelo sequenciamento da porção

16S do rRNA de aproximadamente 1500bp, utilizando as sequência de oligonucleotídeos

16S-8F e 16S-1493R contidas na Tabela 1, nas seguintes condições de termociclagem:

desnaturação inicial à 94ºC por 5 min, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por

20 segundos, anelamento dos primers a 53ºC por 45 segundos e extensão das fitas a

72ºC por 30 segundos, e uma extensão final à 72ºC por 10 minutos (Mendes et al., 2007).

Após a identificação, foi realizada a caracterização dos isolados quanto à

presença de genes codificadores de CHDLs, de acordo com as metodologias descritas

por Woodford et al., 2006.

Material e Métodos

4.3 Indução de resistência à polimixina B

Os dois isolados de

submetidos ao cultivo em concentrações crescentes de

Aldrich, St Louis, MO, USA

resistentes à polimixina B

diluição de polimixina B de 0,125

dos isolados, até atingir a concentração de

Bertani (LB) (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra)

induzida à polimixina B foram submetidos

meio LB Agar até a obtenção da cepa resistente.

Figura 6. Desenho esquemático das passagens de subcultivos na presença de

concentrações crescentes de sulfato de polimixina B para a indução de resistência

mesma, nos isolados de A.

Indução de resistência à polimixina B

de A. baumannii, sensível e resistente à polimixina B

em concentrações crescentes de sulfato de polimixina B

, St Louis, MO, USA), em dias consecutivos, até a obtenção de isolados

resistentes à polimixina B. Os subcultivos começaram a ser realizados

de 0,125 µg/mL, abaixo da concentração inibitóri

atingir a concentração de 64 µg/mL em meio de cultura

(Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) (Figura 6). Os isolados com resistência

induzida à polimixina B foram submetidos no total a nove passagens de

meio LB Agar até a obtenção da cepa resistente.

Desenho esquemático das passagens de subcultivos na presença de

concentrações crescentes de sulfato de polimixina B para a indução de resistência

A. baumannii.

32

à polimixina B, foram

polimixina B (Sigma-

até a obtenção de isolados

a ser realizados utilizando uma

abaixo da concentração inibitória mínima (CIM)

g/mL em meio de cultura sólido Luria

Os isolados com resistência

nove passagens de subcultivos em

Desenho esquemático das passagens de subcultivos na presença de

concentrações crescentes de sulfato de polimixina B para a indução de resistência à

Material e Métodos

33

4.4 Estabilidade da resistência induzida à polimixi na B

Após a obtenção dos mutantes resistentes pela indução, esses isolados foram

submetidos ao subcultivo em dias consecutivos em ágar LB na ausência de polimixina B,

para verificar a estabilidade do fenótipo de resistência induzida na presença da droga e

verificar se a CIM retornaria ao valor inicial, observado antes da indução.

4.5 Análise da similaridade genética por “Pulsed Fi eld Gel Eletrophoresis”

(PFGE)

A relação genética entre os isolados de A. baumannii, antes e após o cultivo na

presença de polimixina B, foi avaliada pela técnica de PFGE com o objetivo de comprovar

que os isolados estudados permaneciam os mesmos, após os diversos repiques

realizados na presença de polimixina B descartando, assim, a possibilidade de

contaminação.

As amostras foram incubadas por 18 horas em 10 mL de caldo LB (Oxoid,

Basingstoke, Inglaterra) e, então, centrifugadas por 20 minutos a 3000 rpm. O

sobrenadante foi desprezado e o precipitado, contendo as células bacterianas, diluído em

1 mL de solução salina, homogeneizado e transferido para tubo de microcentrífuga

previamente pesado.

Os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 12000 rpm e o sobrenadante

removido. O sedimento bacteriano foi diluído em solução salina, na proporção 1:1 entre o

volume de diluente e o peso do material obtido pela centrifugação. Esse último valor foi

calculado pela subtração do peso do tubo vazio pelo peso do tubo contendo o precipitado

de células. Após minuciosa homogeneização, 40 µL da mistura foi transferido para outro

tubo contendo 300 µL de tampão TEN (Tris 100 mM pH 7,5; EDTA 100 mM, NaCl 150

mM). Foi adicionado, então, 340 µL de agarose de baixo ponto de fusão e colocado em

moldes para a formação de blocos de gel.

Material e Métodos

34

Depois de solidificados, os blocos foram incubados a 37ºC, por no mínimo 4 horas

em solução EC (Tris 6 mM pH 6,5, NaCl 1 M; EDTA 0,01 M, Brij 58 0,5%, Sarcosil 0,5% e

Deoxiglicolato 0,2%). A solução de EC foi removida e substituída por 2 mL de solução ES

(EDTA 0,4 M pH 9,3 e Sarcosil 10%) contendo 1 mg/mL de proteinase K 20 mg/mL. As

amostras foram incubadas por 12 horas a 50ºC. Após o tratamento com proteinase K,

foram realizadas quatro lavagens com CHEF-TE (Tris 0,1 M pH 7,5, EDTA 0,1 M), de 30

a 60 minutos cada. Os blocos foram armazenados em CHEF-TE. O DNA bacteriano

contido nos blocos de agarose foi submetido à clivagem com ApaI, a 37ºC por 12 a 18

horas, de acordo com instruções do fabricante (New England Biolabs, Ipswich, EUA).

A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1%, em TBE 0,5x (Tris 0,089 M,

ácido bórico 0,089 M e EDTA 0,002 M), no sistema CHEF-DR III (BioRad Laboratories,

Califórnia, EUA) à temperatura de 13oC e utilizando corrente elétrica de 200 Volts

(6V/cm). O gel foi corado com GelRed (Uniscience) e fotografado sob iluminação

ultravioleta em Transiluminador (BioRad Laboratories, Califórnia, EUA).

O gel foi analisado por inspeção visual, utilizando os critérios de Tenover et al.

(1995) para avaliar a similaridade genética entre os isolados. Para serem considerados

idênticos, os isolados deveriam apresentar o mesmo perfil eletroforético.

4.6 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos

O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado utilizando a

metodologia de microdiluição em caldo, seguindo as recomendações do CLSI (2009)

para polimixina B. O sal de sulfato de polimixina B foi obtido da Sigma-Aldrich (St Louis,

MO, USA). Uma solução mãe contendo 2.560 µg/mL de sulfato de polimixina B foi

preparada em água ultrapura e diluída 1:10 em caldo Mueller-Hinton - MH (Oxoid,

Basingstoke, Inglaterra) para obtenção da maior concentração de 256 µg/mL a ser

testada. A partir dessa diluição, foram realizadas diluições seriadas até a obtenção da

concentração de 0,125 µg/mL. Cem microlitros de cada diluição foi dispensado em

microplaca, conforme mostrado na Figura 7.

Material e Métodos

35

O inóculo bacteriano foi preparado em caldo MH a uma turbidez correspondente à

escala 0,5 de McFarland (1.5 x 108) e diluído novamente em caldo MH, para a

concentração de 2,5 x 105 para obtenção de um volume final de 5 mL. Cem microlitros do

inóculo bacteriano foi dispensado na placa de microdiluição e, dessa maneira, tanto o

inóculo bacteriano quanto a concentração do antimicrobiano se reduziram à metade ao

final do experimento.

Para determinar o perfil de sensibilidade à amicacina, à ciprofloxacina, à

levofloxacina, ao aztreonam, à cefoxitina, à tigeciclina, à ceftriaxona, à ceftazidima, à

cefepima, ao imipenem, ao meropenem e à piperacilina/tazobactam, foram utilizadas

placas de microdiluição em caldo liofilizadas obtidas da TREK Diagnostics (Cleveland,

Ohio, USA) e os testes foram realizados conforme recomendações do fabricante (Figura

8).

Foram utilizadas como controle de qualidade as cepas ATCC 25922 de

Escherichia coli e ATCC 27853 de P. aeruginosa. A leitura das placas de microdiluição foi

realizada visualmente. A CIM foi considerada como a primeira concentração a inibir

completamente o crescimento bacteriano. Os resultados foram interpretados de acordo

com os pontos de corte estabelecidos pelo CLSI (2012), com excessão da tigeciclina para

a qual foram utilizados os pontos de corte do EUCAST (2012).

Material e Métodos

Figura 7. Desenho esquemático da distribuição das

concentrações de polimixina B na placa de microdiluição

caldo.

Firgura 8. Desenho esquemático da placa de microdilui

utilizada para avaliação da

polimixina B; CIPRO: ciprofloxacina; LEVO: levofloxacina; AZT; aztreonam; FOX:

cefoxitina; TGC: tigeciclina; AXO: ceftriaxona; TAZ: ceftazidima; FEP: cefepima; IMI:

imipenem; MERO: meropene

controle negativo.

AMI CIPRO AZT TGC32 2 16 4

AMI CIRPO AZT TGC16 1 8 2

AMI CIPRO AZT TGC8 0.5 4 1

AMI CIPRO AZT TGC4 0.25 2 0.5

POLI LEVO AZT TGC4 4 1 0.25

POLI LEVO FOX TGC2 2 16 0.12

POLI LEVO FOX TGC1 1 8 0.06

POLI LEVO FOX TGC0.5 0.5 4 0.03

Desenho esquemático da distribuição das

concentrações de polimixina B na placa de microdiluição

Desenho esquemático da placa de microdiluição em caldo (TREK Diagnostics)

utilizada para avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos. AMI: amicacina; POLI:



imipenem; MERO: meropenem; P/T: piperacilina/tazobactam; POS: controle positivo; NEG:

TGC AXO TAZ FEP IMI MERO P/T4 32 16 16 8 8 64/4



TGC AXO TAZ FEP IMI MERO P/T0.5 4 2 2 1 1 8/4

TGC AXO TAZ FEP IMI MERO P/T0.25 2 1 1 0.5 0.5 4/4TGC AXO TAZ FEP IMI MERO P/T0.12 1 0.5 0.5 0.25 0.25 2/4TGC AXO TAZ FEP IMI MERO0.06 0.5 0.25 0.25 0.12 0.12TGC AXO TAZ FEP IMI MERO0.03 0.25 0.12 0.12 0.06 0.06

POS

POS

36

Desenho esquemático da distribuição das

em

ção em caldo (TREK Diagnostics)

AMI: amicacina; POLI:



obactam; POS: controle positivo; NEG:

P/T NEG64/4P/T NEG32/4P/T NEG16/4P/T NEG8/4P/T NEG4/4P/T NEG2/4

NEG

NEG

POS

POS

Material e Métodos

37

4.7 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

Os isolados bacterianos foram cultivados em 20 mL de Caldo LB na presença e

na ausência de polimixina B até atingirem uma absorbância de 0,6 a um comprimento de

onda de 660 nm em espectrofotômetro BioMate 5, ThermoSpectronic (Thermo Fisher

Scientific, Wilmington, DE, USA), correspondente à fase exponencial de crescimento

bacteriano. A cultura foi centrifugada a 12.000 rpm por 10 minutos em temperatura

ambiente. O pellet foi ressuspenso em 1 mL de Glutaraldeído 2,5% adicionado a FA 2%

em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2. O material foi então incubado por 1 hora

em temperatura ambiente para a primeira fixação. Decorrido esse período, foi realizada a

primeira lavagem com 3 ciclos de 15 minutos com tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH

7,2. A segunda fixação foi realizada com tetróxido de ósmio 2%, diluído em tampão

cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2, por 2 horas. Depois da fixação, foi realizada a outra

lavagem com tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2 por duas vezes de 10 minutos

cada. O material foi então desidratado gradativamente com etanol 70%, 90% e 100% por

2 ciclos de 15 minutos cada, seguido por 2 ciclos de 30 minutos com óxido de propileno.

Após a desidratação o material foi submetido à infiltração em resina EPON de acordo

com as seguintes etapas: incubação do material com a mistura resina:óxido de propileno

(1:2) por 12 horas; seguido por resina:óxido de propileno (1:1) por 8 horas; resina:óxido

de propileno (2:1) por 12 horas e, por último, resina pura por 4 horas. Foi então realizada

a aplicação de vácuo por 2 horas. A inclusão e polimerização foram realizadas a 60ºC por

48 horas. As amostras foram visualizadas em microscópio eletrônico de transmissão Jeol

1200 EXII.

4.8 Cultivo em meio hipotônico

Os isolados de A. baumannii foram submetidos ao cultivo em água destilada

estéril por 8 horas para verificar se as alterações observadas por MET correspondiam as

alterações na estrutura da parede celular bacteriana. Após a incubação, os isolados

Material e Métodos

38

foram cultivados em meio LB ágar por 18 horas, a 37ºC. O crescimento no meio LB após

o cultivo em água descarta uma deficiência estrutural na parede celular.

4.9 Sequenciamento do sistema de dois componentes P mrAB

Os isolados de A. baumannii, cultivados na presença e ausência de polimixina B,

foram submetidos à PCR utilizando sequências de oligonucleotídeos iniciadores

(Invitrogen) específicos para os genes que compõem o sistema de dois componentes

PmrAB envolvidos na regulação da resistência às polimixina.

Para o gene pmrA, que codifica a proteína reguladora da resposta transcricional,

foram utilizadas as sequências de oligonucleotídeos, com anelamento interno e externo

aos gene, pmrA1_F, pmrA1_R, pmrA2_F e pmrA2_R, respectivamente. Para o gene

pmrB, que codifica a proteína sensor quinase, foram utilizadas as sequências pmrB1_F,

pmrB1_R, pmrB2_F e pmrB2_R, que anelam externamente e internamente ao gene,

respectivamente. Todas as sequências de oligonucleotídeos possuem temperatura de

anelamento de 55ºC e estão descrita na Tabela 1. A PCR foi realizada em termociclador

EP Gradient (Eppendorf) e as condições de ciclagem foram as seguintes: desnaturação

inicial a 95ºC por 10 minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 30

segundos, anelamento dos oligonucleotídeos (20 µm) a 55ºC por 30 segundos e

extensão das fitas a 72ºC por 3 minutos. Após os 35 ciclos, foi realizada uma extensão

final a 72ºC por 10 minutos. A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1,5%,

utilizando um marcador de peso molecular conhecido de 1 Kb (Fermentas, USA).

Os fragmentos gerados na PCR foram purificados com Kit PCR CleanUp (Qiagen,

Hilden, Alemanha) e submetidos ao sequenciamento utilizando 2 µL de BigDye

Terminator v 3.1 (Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom), diluídos em 6 µL de

Tampão Big Dye Terminator 5x (Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom),

adicionado a 1 µL do oligonucleotídio diluído a 3,2 µm e 5 µL de DNA purificado. A

reação foi completada com água para a obtenção de um volume final de 20 µL. As

condições de ciclagem foram as seguintes: desnaturação do DNA a 95ºC por 1 minuto;

Material e Métodos

39

anelamento dos oligonucleotídeos a 50ºC por 30 segundos e extensão das fitas a 60ºC

por 3 minutos. O sequenciamento foi realizado em ABI Prism 3500 Series (Applied

Biosystems).

As sequências obtidas foram comparadas com sequências depositadas no banco

de dados do GeneBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e analisadas utilizando as

ferramentas de alinhamento do software DNA Star.

4.10 PCR em Tempo Real (qRT-PCR) para quantificação da transcrição do

sistema de dois componentes PmrAB

4.10.1 Extração de RNA Total e síntese de cDNA

Os isolados foram cultivados em 20 mL de Caldo LB na presença e ausência de

sulfato de polimixina B (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) a 37ºC, sob agitação, até

atingirem a fase logarítmica de crescimento, correspondente à absorbância de 0,5 a 0,6 a

um comprimento de onda de 600 nm em espectrofotômetro BioMate 5, ThermoSpectronic

(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA), correspondente à fase exponencial de

crescimento. Um mililitro da cultura foi adicionado a 1 mL de RNA Protect Bacteria

Reagent (Qiagen, Hilden, Alemanha), homogeneizado por completo em vórtex e

incubado por 5 minutos em temperatura ambiente. Transcorrido esse período, foi

realizada uma centrifugação por 10 minutos a 12.000 rpm em temperatura ambiente. O

RNA foi então extraído a partir do sedimento bacteriano resultante, utilizando o RNeasy

Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as recomendações do fabricante.

Para retirada de resíduos de DNA bacteriano foi realizado um tratamento com RNAse

Free-DNAse Set (Qiagen, Hilden, Alemanha) durante a extração do RNA. O RNA total foi

quantificado em NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). A

reação de transcriptase reversa foi realizada utilizando 30 ng de RNA de cada amostra,

com High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Warrington,

United Kingdom), de acordo com as recomendações do fabricante. A reação foi incubada

Material e Métodos

40

por 10 minutos a 25ºC, seguido por 120 minutos a 37ºC, em termociclador Eppendorf. O

cDNA foi armazenado em freezer -80ºC até sua utilização.

4.10.2 Quantificação relativa da transcrição gênica

A técnica de PCR em tempo real foi utilizada para quantificar a transcrição relativa

dos genes que compõe o sistema de dois componentes PmrAB, que estão envolvidos no

desenvolvimento de resistência às polimixinas em A. baumannii.

O cDNA preparado a partir da extração de RNA das amostras de A. baumannii,

sensíveis e resistentes às polimixinas, foi submetido à reação de PCR em tempo real

utilizando sequências de oligonucleotídeos iniciadores (Invitrogen, Eragny, France)

específicos para cada gene que compõe o sistema de dois componentes PmrAB,

RT_pmrA_F e RT_pmrA_R para o gene pmrA e, RT_pmrB_F e RT_pmrB_R para o gene

pmrB (Tabela 2). As reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata

utilizando 12,5 µL de Platinum SyBR Green qPCR com ROX (Invitrogen, Eragny, France),

adicionado de 0,25 µL de cada oligonucleotídeo iniciador. À mistura, foi adicionado 2 µL

de cDNA para obtenção de um volume final de 25 µL. A reação de PCR foi realizada no

equipamento Real Time 7500 (Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom).

4.10.3 Análise da quantificação relativa da transcr ição gênica

Para determinação da eficiência de cada oligonucleotídeo foi realizada uma curva

de desnaturação (“melting curve”) utilizando um extrato de DNA a partir de um inóculo

bacteriano do isolado sensível A027, na escala 0,5 de McFarland. Desse inóculo inicial foi

realizada uma diluição seriada de 1:10 até a diluição de 10-8. Todas as reações de qRT-

PCR foram realizadas em triplicata e o gene ribossomal 16S foi utilizado como gene de

referência para a normalização da transcrição dos genes alvo.

A eficiência das reações de amplificação dos genes estudados foi determinada de

acordo com a fórmula E = (10-1/slope -1) x 100, onde “slope” representa a inclinação da reta

no gráfico de regressão linear das médias dos valores de Ct observadas nas 3 replicatas

Material e Métodos

41

das reações de qRT-PCR para as diluições seriadas do extrato do isolado sensível A027.

Ct (“Ciclo Threshold”) é considerado o ciclo em que foi detectada fluorescência durante a

amplificação da reação de qRT-PCR, acima do limite basal de fluorescência observado

no início da reação.

A análise da expressão foi realizada utilizando o software SDS v 2.0 (Applied

Biosystems, Warrington, Reino Unido) pelo método Ct comparativo (∆∆Ct), onde a

expressão normalizada (EN) é calculada de acordo com a fórmula ∆Ct = Ctgene alvo – Ctgene

endógeno. Para a correção do cálculo da RQ, a eficiência da reação de cada gene foi

calculada utilizando o modelo matemático descrito por Pfaffl et al. (2001), utilizando o

software SDS v 2,0.

A transcrição relativa de cada gene alvo para os isolados clínicos de A. baumannii

foi calculada em relação à transcrição de cada gene no isolado A027, sensível à

polimixina B a partir da diferença entre o ∆Ct de cada gene alvo na amostra referência e

o ∆Ct de cada gene na amostra a ser testada. Dessa forma, o valor de RQ indica quantas

vezes um gene é transcrito em uma amostra em relação à expressão quantificada na

amostra usada como referência, utilizando a fórmula RQ = 2-∆∆Ct.

As temperaturas de melting e a eficiência de cada oligonucleotídeo para as

reações estão descritas na Tabela 3.

4.11 Associação de resistência às polimixinas com m ecanismos de

resistência relacionados à parede celular bacterian a

4.11.1 Avaliação de proteínas de membrana externa

4.11.1.1 Extração de proteínas de membrana externa

Para verificar possíveis alterações no perfil de porinas e PBPs das membranas

dos isolados de A. baumannii após o cultivo na presença de sulfato de polimixina B,

Material e Métodos

42

esses foram submetidos ao SDS-PAGE do extrato de proteínas de membrana externa e

interna.

Os isolados foram cultivados em 15 mL de caldo LB na presença e ausência de

sulfato de polimixina B, a 37ºC, sob agitação, por 24 horas. Os inóculos foram

centrifugados a 4.000 rpm, por 15 minutos, a 4ºC. O sedimento bacteriano foi então

ressuspenso em 1 mL de tampão TrisMg (Tris 10mM; MgCl2 5mM), pH7,3 e sonicado por

5 ciclos de 30 segundos, parando por 1 segundo a cada 5 segundos corridos. Após essa

etapa, foi realizada outra centrifugação a 5.000 rpm, por 5 minutos, a 4ºC. O

sobrenadante foi transferido para outro tubo e centrifugado novamente por 30 minutos, a

17.000 rpm, a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e 800 µL de Sarcosil 30% foi

adicionado ao sedimento e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente.

Transcorrido esse período, foi realizada uma nova centrifugação de 30 minutos, a 17.000

rpm, a 4ºC. O sedimento foi então lavado com tampão TrisMg (Tris 10mM; MgCl2 5mM),

pH 7,3 e centrifugado por 30 minutos, a 17.000 rpm, a 4ºC. O sobrenadante foi

descartado e o sedimento, correspondente à porção da membrana externa, foi

ressuspenso em 40 µL do tampão TrisMg (Tris 10 mM; MgCl2 5 mM), pH 7,3. O extrato

protéico foi armazenado a uma temperatura de -20ºC até sua utilização. Os extratos

protéicos foram quantificados com reagente de Bradford.

4.11.1.2 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE

As concentrações dos extratos protéicos foram igualadas em tampão de amostra

Laemmi Sample Buffer (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) adicionado de 2-

Mercaptoetanol (Merck, Darmstadt, Germany) e aquecidas a 100ºC por 5 minutos. Vinte

microlitros da mistura foi adicionada ao gel de poliacrilamida a 15%. A eletroforese foi

realizada a uma voltagem de 15 V por 30 minutos para a entrada do material no gel de

poliacrilamida, seguido por uma voltagem foi aumentada para 100 V por 2 horas. Foi

utilizado um marcador de peso molecular Pre-stained SDS-Page Standards, Broad

Range (Roche Diagnostics).

Material e Métodos

43

4.11.1.3 Quantificação relativa da transcrição dos genes que codificam porinas

O cDNA foi preparado a partir da extração de RNA dos isolados de A. baumannii

cultivados, na presença e ausência de sulfato de polimixina B, conforme item 4.10.1 e foi

submetidos à reação de qRT-PCR para verificar alterações na expressão dos genes

responsáveis por codificar as proteínas de membrana externa CarO, OmpA e OmpW.

Foram utilizados oligonucleotídeos iniciadores (Invitrogen, Eragny, France) específicos

para cada porina, descritos na Tabela 2. A reação de PCR em tempo real foi realizada de

acordo com o protocolo descrito no item 4.10.2.

4.11.2 Quantificação relativa da transcrição do gene adeB, que codifica a

proteína estrutural do sistema de efluxo AdeABC

Os isolados de A. baumannii cultivados na presença e ausência de polimixina B

foram submetidos à reação de qRT-PCR para verificar alterações na transcrição do

sistema de efluxo AdeABC. A extração de RNA e a síntese do cDNA foram realizados de

acordo com o protocolo descrito no item 4.10. Foram utilizados oligonucleotídeos

iniciadores (Invitrogen, Eragny, France) específicos para o gene adeB, responsável pela

síntese da proteína estrutural que está acoplada à membrana e compõe os sistema de

efluxo AdeABC, AdeB_F e AdeB_R (Tabela 2). A reação de qRT-PCR foi realizada de

acordo com o protocolo descrito no item 4.10.

4.11.3 Sequenciamento dos genes que codificam as PB Ps

Para verificar possíveis alterações nas PBPs nos isolados de A. baumannii antes

e após o cultivo na presença de polimixina B, foram realizados sequenciamento dos

genes que codificam as PBPs de alto peso molecular de classe A (PBP1a e PBP1b) e

classe B (PBP2 e PBP3), responsáveis pela síntese da parede celular bacteriana de

acordo com o protocolo descrito no item 4.9. Foram utilizadas sequencias de

oligonucleotídeos iniciadores descritos anteriormente por Cayô et al. (2011), encontradas

na Tabela 1.

Material e Métodos

44

Tabela 1. Sequências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para as reações de

PCR e sequenciamento.

Primer Sequência (5’-3’) Fragmento

(pb) Referência

pmrA1_F TGTGGTTCTCTGAAAGTTGGAA 1.060

Este estudo

pmrA1_R GGGTGCTCAGCTGTTCTTTC Este estudo

pmrA2_F GATGGTTTGGCTCAATTGGCG 227

Este estudo

pmrA2_R CGGGCAAGCAACTCATCAAAC Este estudo

pmrB1_F AAATCGTGAATGGGCAATCT 1.914

Este estudo

pmrB1_R CTGCCCTTGGAATATGGTTC Este estudo

pmrB2_F GCAGCCATTATTCGTCGTGG 229

Este estudo

pmrB2_R GTGCAGTCACAGGTGTTCGT Este estudo

PBP1a_ponA_F ATGTATCTCTATATTGCCCCA 2.450

Cayô et al., 2011

PBP1a_ponA_R ATCAAGTTTTCTAATTCATCTTTTTCA Cayô et al., 2011

PBP1a_ponA2_F GAACGTCGCAACTGGATTTT 2.450

Cayô et al., 2011

PBP1a_ponA4_R TGACTGTTATTTTTGTCCGTCTG Cayô et al., 2011

PBP1b_mrcB_F GTTATAACTACCACTTGAAATGATTCG 2390

Cayô et al., 2011

PBP1b_mrcB_R TGAAGTTTGAACGTGGTATCG Cayô et al., 2011

PBP1b_mrcB3_F GATGGACCTTGAACCAAACC 2.390

Cayô et al., 2011

PBP1b_mrcB3_R GGTTTGGTTCAAGGTCCATC Cayô et al., 2011

PBP2_pbpA_F AGCACTTTCCTTTAAAAGATATCCAG 2.010

Cayô et al., 2011

PBP2_pbpA_R ATTCATCGACCTCGTTTGTAGC Cayô et al., 2011

PBP2_pbpA3_F TCCAAATGGATGAAAGGTGA 2.010

Cayô et al., 2011

PBP2_pbpA3_R TTGCACGTAAAACATGTGGAA Cayô et al., 2011

PBP3_ftsI_F TTACCTGCGAATAGGATTTTCTG 1.758

Cayô et al., 2011

PBP3_ftsI_R ATGTGGCGGTTTTATCTGCT Cayô et al., 2011

PBP3_ftsI3_F TCAAACCAATAATTTGGGCATT 1.758

Cayô et al., 2011

PBP3_ftsI3_R TTATTACCCRCAACCTCAGC Cayô et al., 2011

16S_8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1.485

Mendes et al., 2007

16S_1493R ACGGCTACCTTGTTACGACTT Mendes et al., 2007

Material e Métodos

45

Tabela 2. Seqüências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para reações PCR em

tempo real.

Primer Sequência (5’-3’) Fragmento

(pb) Referência

RT_pmrA_F GATGGTTTGGCTCAATTGGCG 227

Este estudo

RT_pmrA_R CGGGCAAGCAACTCATCAAAC Este estudo

RT_pmrB_F GCAGCCATTATTCGTCGTGG 229

Este estudo

RT_pmrB_R GTGCAGTCACAGGTGTTCGT Este estudo

OmpA_F CTCTTGCTGGCTTAAACG 254

Pereira, 2009

OmpA_R TGTGTGACCTTCGATACG Pereira, 2009

OmpW_F TTAGCATCAGCAGGTTGG 120

Pereira, 2009

OmpW_R TATTGGTATCGGGGCAAC Pereira, 2009

CarO_F GCAATGGCAGATGAAGC 111

Pereira, 2009

CarO_R TAAAGCACCACCGTAACC Pereira, 2009

AdeB_F GGATTATGGCGACAGAAGGA 106

Pereira, 2009

AdeB_R AATACTGCCGCCAATACCAG Pereira, 2009

16S_F CAGCTCGTGTCGTGAGATGT 150

Pereira, 2009

16S_R CGTAAGGGCCATGATGACTT Pereira, 2009

Tabela 3. Padronização da curva de melting para cada gene submetido à PCR em tempo

real.

Temperatura de

Melting Eficiência (%) Slope

Concentração do

inóculo

pmrA 80,8 142,97 -2,594 10-1-10-4

pmrB 80,4 113,8 -3,03 10-1-10-5

OmpW 78,3 124,2 -2,851 10-1-10-4

OmpA 81,1 117,45 -2,964 10-1-10-4

CarO 79,3 119,4 -2,93 10-1-10-4

AdeB 77,9 125,7 -2,828 10-1-10-4

Resultados

46

5. 5. 5. 5. RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS

Resultados

47

5. RESULTADOS

5.1 Caracterização dos isolados de A. baumannii

Os isolados clínicos de A. baumannii sensível (A027) e resistente (A009) à

polimixina B e seus mutantes com resistência induzida, A027Ind e A009Ind foram

caracterizados quanto à presença de genes que codificam enzimas β-lactamases. O

isolado A027 e seu mutante com resistência induzida A027Ind foram positivos para os

genes blaOXA-51, blaOXA-23 e blaTEM-1 (Tabela 4).

A indução de resistência à polimixina B foi realizada com dez subcultivos

consecutivos até a diluição de 64 µg/mL de sulfato de polimixina B. A partir dessa diluição

não foram recuperados os isolados de A. baumannii (Tabela 4).

Tabela 4. Isolados sensíveis e resistentes à polimixina B, selecionados para o estudo,

antes e após o cultivo na presença de polimixina B.

Isolado Espécie

CIM Polimixina

B(µg/mL) /

(Categoria de

Sensibilidade) a

Sítio de

isolamento

Data do

isolamento

Detecção de genes que

codificam β-lactamases

A027 A. baumannii 0,25 (S) Trato Resp Inferior 26/07/2007 blaOxa-23, blaOxa-51, blaTEM-1

A009 A. baumannii 16 (R) Trato Resp Inferior 30/06/2007 blaOxa-51

A027Ind A. baumannii >64 (R) Trato Resp Inferior Mutante blaOxa-23, blaOxa-51, blaTEM-1

A009Ind A. baumannii >64 (R) Trato Resp Inferior Mutante blaOxa-51

a. Categoria de sensibilidade de acordo com os ponto de corte do CLSI (2012).

5.2 Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos

O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados de A. baumannii está

descrito na Tabela 5. O isolado clínico de A. baumannii A027 apresentou sensibilidade

somente à polimixina B (CIM, 0,25 µg/mL) e à tigeciclina (CIM, 1 µg/mL). Quando esse

isolado foi submetido ao cultivo na presença de 8 µg/mL de sulfato de polimixina B

(A027Ind) tornou-se resistente à mesma (CIM, >64 µg/mL), mas, passou a ser sensível a

outros antimicrobianos como aos carbapenems: meropenem (CIM, de >8 para 1µg/mL) e

Resultados

48

imipenem (CIM, de >8 para 2 µg/mL); às cefalosporinas: ceftazidima (CIM, de >16 para 8

µg/mL), cefepima (CIM, de >16 para 4 µg/mL) e ceftriaxona (CIM, de >32 para 4 µg/mL);

ao aztreonam (CIM, de >16 para 4 µg/mL) e à piperacilina/tazobactam (CIM, de >16

µg/mL para 8 µg/mL). Não foi observada alteração no perfil de sensibilidade às

quinolonas nesse isolado. O isolado clínico resistente à polimixina A009 (CIM, 16 µg/mL),

apresentou sensibilidade aos outros antimicrobianos testados com exceção de cefoxitina

(CIM, >16 µg/mL). A cultura desse isolado na presença de polimixina B (A009Ind),

aumentou sua CIM de polimixina B de 16 µg/mL para 64 µg/mL. Porém, não houve

alteração no perfil de sensibilidade aos outros antimicrobianos testados para o isolado

A009Ind (Tabela 5).

Tabela 5. Perfil de sensibilidade de isolados A. baumannii sensíveis e resistentes às

polimixinas, antes e após a indução de resistência com sulfato de polimixina B.

Antimicrobiano Concentração Inibitória Mínima (µg/mL)/Categoria de sensibilidadea.

A027 A027Ind A009 A009Ind

Polimixina B 0,25 (S) >128 (R) 16 (R) 64 (R)

Amicacina >32 (R) ≤4 (S) ≤4 (S) 8 (S)

Aztreonam >16 (R) 4 (S) 8 (S) 16 (S)

Tigeciclina 1 (S) 0,5 (S) 0,25 (S) 0,12 (S)

Ciprofloxacina >2 (R) >2 (R) ≤0,25 (S) ≤0,25 (S)

Levofloxacina >4 (R) >4 (R) ≤0,5 (S) ≤0,5 (S)

Cefoxitina >16 (R) 16 (S) >16 (R) >16 (R)

Ceftriaxona >32 (R) 4 (S) 8 (S) 8 (S)

Ceftazidima >16 (R) 8 (S) 2 (S) 8 (S)

Cefepima >16 (R) 4 (S) 0,5 (S) 1 (S)

Doripenem >16 (R) 1 (S) 0,25 (S) 0,25 (S)

Imipenem >8 (R) 2 (S) 0,12 (S) 0,25 (S)

Meropenem >8 (R) 1 (S) 0,12 (S) 0,25 (S)

Pipe/Tazo >64 (R) 8 (S) ≤2 (S) 4 (S)

a. Categoria de sensibilidade de acordo com CLSI (2012).

Resultados

49

5.3 Estabilidade da indução de resistência à polimi xina B

Os isolados de A. baumannii com resistência induzida à polimixina B foram

submetidos ao cultivo na ausência do antimicrobiano para verificar a estabilidade da

resistência desenvolvida. O isolado sensível A027Ind não reverteu seu perfil de

sensibilidade após o cultivo na ausência da droga, mostrando a estabilidade do novo

fenótipo de resistência. Já o isolado resistente A009Ind reverteu o perfil de sensibilidade

para a CIM inicial de 16 µg/mL, após a ausência de pressão seletiva exercida pela

polimixina B (Tabela 6).

Para verificar a estabilidade do perfil de sensibilidade aos carbapenens

apresentado pelo isolado A027Ind, ele foi submetido ao cultivo na presença de

concentrações crescentes de imipenem. Entretanto, o isolado não foi recuperado, ainda

nas diluições correspondentes à categoria de sensibilidade.

Tabela 6. Perfil de sensibilidade à polimixina B durante o cultivo na ausência da droga,

após a indução de resistência.

1º rep 2º rep 3º rep 4º rep 5º rep 6º rep 7º rep 8º rep 9º rep

A027Ind >128 >128 >128 >128 >128 >128 128 >128 128

A009Ind 64 64 16 32 32 16 32 16 16

5.4 Análise da similaridade genética

Os isolados clínicos de A. baumannii e seus mutantes com resistência induzida à

polimixina B apresentaram perfis de similaridade genética idênticos por meio da

metodologia de PFGE, descartando a possibilidade de uma possível contaminação ao

longo dos subcultivos para indução de resistência à polimixina B (Figura 9).

Resultados

Figura 9. Perfil de similaridade genética pela metodologia de PFGE.

Marcador de peso molecular 48

mutante A027Ind; Coluna 4:

5.5 Avaliação da parede celular bacteriana dos isol ados de

MET

Para verificar alterações na parede celular dos isolados clínicos de

seus derivados mutantes,

induzidos A027Ind e A009Ind foi observada uma deposição de “grânulos” na porção

interna da membrana citoplasmática. Não foi observada

integridade da parede celular do isolado

A009, resistente à polimixina B apresentou um aumento na espessura da parede celular

em relação ao isolado sensível à polimixina B A027. Quando esse isolado foi exposto à

polimixina B o espessamento de parede f

Perfil de similaridade genética pela metodologia de PFGE.

Marcador de peso molecular 48 kb; Coluna 2: Isolado clínico A027;

Coluna 4: Isolado clínico A009; Coluna 5: Isolado mutante A009Ind.

5.5 Avaliação da parede celular bacteriana dos isol ados de

Para verificar alterações na parede celular dos isolados clínicos de

seus derivados mutantes, foi realizada a metodologia de MET. Em ambos isolados


interna da membrana citoplasmática. Não foi observada, por análise visual,

integridade da parede celular do isolado A027Ind em relação ao isolado A027. O isolado



polimixina B o espessamento de parede foi mantido (Figura 10).

50

Perfil de similaridade genética pela metodologia de PFGE. Coluna 1 e 6:

Isolado clínico A027; Coluna 3: Isolado

Isolado mutante A009Ind.

5.5 Avaliação da parede celular bacteriana dos isol ados de A. baumannii por

Para verificar alterações na parede celular dos isolados clínicos de A. baumannii e

MET. Em ambos isolados


, por análise visual, alteração na

A027Ind em relação ao isolado A027. O isolado



Resultados

51

Figura 10. Microscopia eletrônica de transmissão de isolados clínicos de A. baumannii,

cultivados na presença e ausência de polimixina B. A: Isolado A027, sensível à polimixina

B; B: Isolado sensível submetido ao cultivo na presença de polimixina B (A027Ind); C:

Isolado A009, resistente à polimixina B; D: Isolado naturalmente resistente submetido ao

cultivo na presença de polimixina B (A009Ind).

5.6 Cultivo em meio hipotônico

Para verificar alterações estruturais na parede celular bacteriana após o cultivo

consecutivo em concentrações crescentes de sulfato de polimixina B, os isolados foram

cultivados em água destilada estéril para verificar a estabilidade da parede celular. Todos

os isolado foram capazes de sobreviver em meio hipotônico, com exceção do isolado

A027Ind, inicialmente sensível à polimixina B, que se tornou resistente após o cultivo na

presença da droga.

5.7 Sequenciamento dos genes que compõem o sistema regulatório de dois

componentes PmrAB

Resultados

52

Os isolados clínicos de A. baumannii foram submetidos ao sequenciamento dos

genes que compõem o sistema de dois componentes PmrAB, antes e após o cultivo na

presença de sulfato de polimixina B. Não foi observada nenhuma mutação no gene pmrA,

em nenhum dos isolados testados. No sequenciamento do gene pmrB foram observadas

duas alterações. O isolado A027Ind teve a deleção de um aminoácido Treonina na

posição 28 e uma inserção de Glutamina na posição 45 quando comparado à cepa

parental A027. Não foi observada mutação no isolado A009 e seu mutante induzido

A009Ind.

5.8 Quantificação relativa da transcrição do sistem a regulatório de dois

componentes PmrAB

A quantificação relativa da transcrição dos genes do sistema de dois componentes

PmrAB foi realizada em comparação com à transcrição do isolado sensível à polimixina B

A027. O isolado A027Ind apresentou um aumento na transcrição do gene pmrA. Porém,

nesse isolado, houve redução na transcrição do gene pmrB (Figura 11). O isolado

resistente à polimixina B, A009, e seu mutante induzido A009Ind apresentaram um nível

de transcrição maior para o gene sensor quinase pmrB em relação ao isolado sensível

A027. No entanto, esse aumento não resultou em aumento da transcrição do gene pmrA,

o qual teve uma transcrição menor em relação ao isolado sensível, nesses dois isolados

(Figura 11).

Resultados

Figura 11. Quantificação relativa da transcrição dos genes do sistema regulatório de dois

componentes PmrAB nos isolados de

5.9 Avaliação da influência de resistência às polim

relacionad os à parede celular bacteriana

5.9.1 Expressão d e Proteínas de Membrana Externa

O isolado A027, sensível à polimixina B, foi utilizado como parâmetro para a

determinação da transcrição relativa de todas as porinas. Dessa fo

um valor de transcrição de 1 para esse isolado. O isolado A027Ind apresentou uma

redução na transcrição do gene que codifica a porina OmpW em relação à sua cepa

selvagem sensível A027 (Figura 12). Essa redução pode ser comprovada, como

observado na Figura 13, onde há ausência da banda correspondente à essa porina. O

Quantificação relativa da transcrição dos genes do sistema regulatório de dois

PmrAB nos isolados de A. baumannii estudados.

5.9 Avaliação da influência de resistência às polim ixina B em mecanismos

os à parede celular bacteriana

e Proteínas de Membrana Externa


determinação da transcrição relativa de todas as porinas. Dessa forma, foi determinado



selvagem sensível A027 (Figura 12). Essa redução pode ser comprovada, como


53

Quantificação relativa da transcrição dos genes do sistema regulatório de dois

ixina B em mecanismos


rma, foi determinado



selvagem sensível A027 (Figura 12). Essa redução pode ser comprovada, como pode ser


Resultados

54

isolado A009, já apresentou uma redução na transcrição do gene ompW em relação ao

isolado sensível A027, mesmo antes da exposição à droga. Seu isolado mutante A009Ind

manteve essa menor transcrição, não havendo mudança significativa entre eles (Figura

12). No entanto, para esses isolados, não foi possível estabelecer uma relação entre as

metodologias de qRT-PCR e SDS-PAGE utilizadas, já que a redução no nível de

transcrição do gene ompW foi acompanhada pelo aumento da intensidade da banda no

gel de SDS-PAGE (Figuras 12 e 13).

Foi observado um aumento na transcrição do gene ompA no isolado A027Ind.

Pela metodologia de qRT-PCR foi observado um nível de transcrição reduzido do gene

que codifica essa porina nos isolados A009 e seu mutante induzido A009Ind em relação

ao isolado sensível A027. Porém, os resultados do qRT-PCR não foram corroborados

pelo SDS-PAGE, onde a porina OmpA parece ter a sua expressão reduzida no isolado

A027Ind e aumentada no isolado A009 e seu mutante induzido A009Ind (Figuras 12 e

13).

Tanto o isolado com resistência induzida, A027Ind, quanto o isolado com

resistência “natural” A009 apresentaram uma transcrição mais elevada do gene que

codifica a porina CarO em relação ao isolado sensível à polimixina B, A027. Porém, no

SDS-PAGE, a expressão da porina CarO pareceu estar reduzida no isolado A027Ind e

muito aumentada nas isolados A009 e A009Ind (Figuras 12 e 13).

Resultados

Figura 12. Quantificação relativa da transcrição dos genes que codificam as porinas dos

isolados de A. baumannii antes e após o cultivo na presença de polimixina B.

Quantificação relativa da transcrição dos genes que codificam as porinas dos


55

Quantificação relativa da transcrição dos genes que codificam as porinas dos


Resultados

56

Figura 13. Gel de SDS-PAGE das proteínas de membrana externa (OMPs) dos isolados clínicos e

os mutantes induzidos de A. baumannii. Coluna 1 e 7: Marcador de peso molecular Dual Color

(BioRad); Coluna 2: Isolado clínico A027, sensível à polimixina B; Coluna 3: Isolado A027Ind,

sensível com resistência induzida à polimixina B; Coluna 4: Isolado clínico A009, resistente à

polimixina B; Coluna 5: Isolado A009Ind, com resistência induzida à polimixina B. Coluna 6:

ATCC 19606; A: Omp D (43 kDa); B: OprB (40 kDa); C: Omp HMP (OmpA, 35,6 kDa); D: 33-36

kDa (31 kDa); E: CarO (29 kDa); F: Omp25 (25 kDa) e G: OmpW (21 kDa).

5.9.2 Quantificação relativa da transcrição da bomb a de efluxo AdeABC

A quantificação relativa da transcrição do gene adeB foi realizada utilizando o

valor de transcrição da amostra sensível à polimixina, B A027, para fins comparativos. O

isolado sensível à polimixina B quando submetido ao cultivo na presença de polimixina B

(A027Ind), teve uma redução no nível de transcrição do gene. O isolado A009 apresentou

250 kDa

150 kDa

100 kDa

75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa

20 kDa

15 kDa

C

F

G

E D

B A

1 2 3 4 5 6 7

Resultados

um nível de transcrição menor

B, assim como seu mutante com resistência induzida A009Ind (Figura 14).

Figura 14. Quantificação da transcrição relativa do gene

baumannii, antes e após o cultivo na presença de polimixina B.

5.9.3 Sequenciamento das

Devido a observação de alterações na parede dos isolados de

como a mudança no perfil de sensibilidade aos antimicrobianos

isolados foram submetidos ao sequenciamento dos genes que codificam as PBPs de alto

peso molecular das classes A (PBP1a, PBP1b) e B (PBP2 e PBP3), para verificar

possíveis mutações nesses genes

descritos na Tabela 7.

No isolado A009, com resistência “natural” à polimixina B, foram observados

diversas mutações pontuais no

de aminoácidos na proteína resultante

um nível de transcrição menor do gene adeB em relação ao isolado sensível à polimixina

, assim como seu mutante com resistência induzida A009Ind (Figura 14).

Quantificação da transcrição relativa do gene adeB para os isolados de

, antes e após o cultivo na presença de polimixina B.

Sequenciamento das PBPs

Devido a observação de alterações na parede dos isolados de

como a mudança no perfil de sensibilidade aos antimicrobianos β



mutações nesses genes. Os resultados do sequenciamento das PBPs estão


ões pontuais nos quatro genes de PBPs avaliados que geraram alterações

de aminoácidos na proteína resultante, principalmente nos genes

57

em relação ao isolado sensível à polimixina

, assim como seu mutante com resistência induzida A009Ind (Figura 14).

para os isolados de A.

Devido a observação de alterações na parede dos isolados de A. baumannii, bem

β-lactâmicos, esses



. Os resultados do sequenciamento das PBPs estão


que geraram alterações

, principalmente nos genes ponA e mrcB

Resultados

58

codificadores das PBPs de classe A PBP1a e PBP1b, respectivamente. Essas mutações

se mantiveram quando esse isolado foi cultivado na presença de polimixina B (A009Ind).

Algumas dessas mutações estão próximas aos motivos conservados dos sítios de

transglicosilação e/ou transpeptidação (mutações sublinhadas na Tabela 7), dessa forma,

são possíveis mutações candidatas a causar alterações na estrutura das quatro PBPs

avaliadas, podendo levar ao espessamento da parede celular, observadas pela

metodologia de MET nesses isolados (Figura 10). No isolado A009 e seu respectivo

mutante induzido, foi observada uma inserção de uma Treonina na posição 804 do gene

ponA condificador da PBP1a, marcado em vermelho, que alterou o “frame” de leitura da

sequência de aminoácidos desse ponto em diante (Tabela 7). No quinto motivo

conservado do sítio de transpetidação do gene mrcB codificador da PBP1b para os

isolados A009 e A009ind observou-se um mudança de uma Leucina por uma Metionina

na posição 320. Ambos os aminoácidos são apolares.

Diferente do observado no isolado com resistência natural à polimixina B, o

isolado sensível A027 e seu mutante com resistência induzida A027Ind apresentaram

somente uma mutação na PBP1a e na PBP3. Essas mutações não foram relacionadas

com o surgimento de resistência induzida à polimixina B pelo fato de já estarem

presentes no isolado antes da exposição ao antimicrobiano (Tabela 7).

Resultados

59

Tabela 7. Mutações encontradas na sequencia de aminoácidos dos genes codificadores de PBPs de alto peso molecular nos isolados de A.

baumannii antes e após o cultivo na presença de sulfato de polimixina B.

PBP1a PBP1b PBP2 PBP3

ponA mrcB pbpA ftsI

Transglicosilase/Transpeptidase Transglicosilase/Tra nspeptidase Elongase Divisão Celular

A009 16 8 >16 8 2 0,5 8 0,1 0,12 0,25

N83T; A206S; K300Q; A308S; E334Q; Q345E; S351N; S352N; A385G; V495S; A606S; D611E; V615A; T636A; T637A; T715A; V716I; G746D; A748S; Q750K; E773A; T775V; V778I; T804A; T805N;

N806T; D808N; F809D; D810F; L812D; P813L; G814P; E815G; I817E; V818I; I819V;

P820I; S821P; K822S; T823K; T824A; P825A; A827P; M828A; K829M; P830K; S831P; Q832S; G833Q; A834G; P836A; K837P; R838R; E839R; K840E; D841K; E842D; L843E; E844L; N845E; L846N;

I847L; N848I; Q849N; I850Q; E851I;

Y90F; V126A; S164N; L320M; N343G; N396D; A406T; N407Q; Q476K; V484I; I504V; T543P; S632P; A634T; S704T;

R712H; S714T; A732T; T754A; D766P; T769S

N97D; V98P;T100A; D170E; I231V; V321A; A345S; N427S; S437T; T483S; P530S; V600I;

K609N; N638G; S640T; T647A; S648A; A649T; P650T; S652A; A655T; T657A; T661A; T663A

V52I; I72V; I98M; T114S; N122K; A149T; I216V; S384T; S409T; R423K; P483A; K513T; N542S

A009Ind 64 16 >16 8 8 1 16 0,3 0,25 0,25

N83T; A206S; K300Q; A308S; E334Q; Q345E; S351N; S352N; A385G; V495S; A606S; D611E; V615A; T636A; T637A; T715A; V716I; G746D; A748S; Q750K; E773A; T775V; V778I; T804A; T805N;

N806T; D808N; F809D; D810F; L812D; P813L; G814P; E815G; I817E; V818I; I819V;

P820I; S821P; K822S; T823K; T824A; P825A; A827P; M828A; K829M; P830K; S831P; Q832S; G833Q; A834G; P836A; K837P; R838R; E839R; K840E; D841K; E842D; L843E; E844L; N845E; L846N;

I847L; N848I; Q849N; I850Q; E851I;

Y90F; V126A; S164N; L320M; N343G; N396D; A406T; N407Q; Q476K; U484T; I504U; T543P; S632P; A634T; S704T; R712H; S714T; D723A; A732T; T754A; I761A; E763A; P764S; D766P; T769S;

N778S

N97D; V98P;T100A; D170E; I231V; V321A; A345S; N427S; S437T; T483S; P530S; V600I;

K609N; N638G; S640T; T647A; S648A; A649T; P650T; S652A; A655T; T657A; T661A; T663A

V52I; I72V; I98M; T114S; N122K; A149T; I216V; S384T; S409T; R423K; P483A; K513T; N542S

A027 0,25 >64 >16 >32 >16 >16 >16 >8 >8 >16 V495S 0 0 A583V

A027Ind >128 8 16 4 8 4 4 2 1 1 V495S 0 0 A583V

Proteínas Ligadoras de PenicilinasConcentração Inibitória Mínima (µg/mL)

Isolados

PO PTZ IPM MEM DORFOX CRO CAZ FEP AZT

Discussão

60

6. DISCUSSÃO6. DISCUSSÃO6. DISCUSSÃO6. DISCUSSÃO

Discussão

61

6. DISCUSSÃO

As polimixinas constituem, frequentemente, a única opção terapêutica para o

tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa e A. baumannii resistentes aos

carbapenens. Embora a resistência às polimixinas ainda seja baixa nessas espécies, ela

tem se tornado mais frequente em amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC e a

compreensão dos seus mecanismos de resistência é de fundamental importância visto

que não há, a um curto prazo, nenhuma droga sendo desenvovolvida pela industria

farmacêutica que seja efetiva contra esses patógenos (Gales et al., 2011).

Nos últimos anos, diferentes estudos vem tentando determinar o mecanismo de

resistência às polimixinas (Cai et al., 2012). Como amostras clínicas de P. aeruginosa e

A. baumannii resistentes à polimixina são raramente isoladas pelos laboratórios de

microbiologia em pacientes que não foram expostos à polimixina, a maioria dos estudos

que avalia os mecanismos de resistência às polimixinas se utilizaram de isolados clínicos

de A. baumannii sensíveis às polimixinas que tiveram a resistência a este agente

induzida in vitro ou em cepas de P. aeruginosa, isoladas de pacientes com fibrose

cística, que receberam polimixina por tempo prolongado no tratamento e/ou profilaxia de

infecção crônica (Moffat et al., 2010; Arroyo et al., 2011; Beceiro et al., 2011; Moffat et al.,

2011; Moskowitz et al., 2012).

Dois fenótipos distintosde resistência às polimixinas tem sido observado, sendo o

primeiro decorrente da indução pela presença da droga e um segundo fenótipo de

resistência “natural”, não correlacionado com a exposição prévia às polimixinas.

Geralmente, isolados com resistência induzida às polimixinas atingem CIMs elevadas,

acima de 128 µg/mL. Diferente disso, o fenótipo de resistência apresentado por isolados

que não foram expostos à polimixina, possui CIMs próximas ao ponto de corte de

resistência estabelecido pelo CLSI, ≥ 8 µg/mL (CLSI, 2012). Os isolados selecionados

para este estudo possuíam essas características. O isolado com resistência induzida

(A027) apresentou CIM > 64 µg/mL à polimixina B, enquanto o isolado com resistência

“natural” (A009) apresentou uma CIM de 16 µg/mL para esse antimicrobiano. O isolado

Discussão

62

clínico de A. baumannii que apresentou resistência à polimixina B, foi selecionado por

apresentar sensibilidade aos outros antimicrobianos e, também por ter sido isolado de um

paciente que não havia recebido previamente polimixinas em seu tratamento e, desta

maneira, minimizar a chance de que tivesse havido indução de resistência às mesmas.

Em nosso estudo, o isolado clínico de A. baumannii sensível à polimixina B (A027)

apresentou, inicialmente, resistência aos β-lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas.

Além da polimixina B, esse isolado apresentou sensibilidade somente à tigeciclina. De

acordo com estudos do programa de vigilância “SENTRY antimicrobial surveillance

programme”, esse isolado representa o perfil de sensibilidade encontrado em muitas

regiões do mundo entre isolados de A. baumannii (Yau et al., 2009; Gales et al., 2011).

Em nosso estudo, a resistência à polimixina B induzida no isolado A027ind se

mostrou estável, já que, mesmo após vários subcultivos em meio de cultura sem a adição

de sulfato de polimixina B a resistência foi mantida. Resultados semelhantes foram

observados em isolados clínicos de A. baumannii in vivo, durante terapia com colistina e

mesmo após diversos cultivos na ausência do antimicrobiano, seu fenótipo de

sensibilidade também não foi recuperado. (Rodrigues et al., 2009). Diferente do

fenômeno que ocorre com isolados de A. baumannii, Moskowitz et al. (2012) mostrou que

isolados de P. aeruginosa que foram submetidos ao cultivo na presença de colistina,

reverteram seu fenótipo de sensibilidade quando cultivados na ausência da droga.

Em nosso estudo foi observado que, ao mesmo tempo em que a resistência à

polimixina B foi desenvolvida pela indução devido à pressão seletiva exercida pelo

antimicrobiano, o isolado mutante resultante dessa indução, A027Ind, passou a

apresentar sensibilidade a outros antimicrobianos aos quais era, anteriormente,

resistente, entre eles os β-lactâmicos e os aminoglicosídeos. Assim como o

desenvolvimento de resistência à polimixina B, o perfil de sensibilidade aos β-lactâmicos

também foi estável no isolado A027Ind, sugerindo uma desestruturação irreversível da

parede celular, que poderia ter facilitado a ação dos outros antimicrobianos. Essa

mudança no perfil de sensibilidade pode fazer com que essas amostras não sejam

Discussão

63

detectadas nos laboratórios de microbiologia, pois esses pacientes geralmente utilizam

outros antimicrobianos em associação com polimixinas.

Estudos clínicos têm sugerido a associação de polimixina B com outros

antimicrobianos para o tratamento de infecção por A baumannii multirresistentes (MDR).

Relatos de sucesso terapêutico em casos, onde houve a utilização de colistina em

associação com rifampicina ou amicacina para infecções respiratórias e de corrente

sanguínea por A. baumannii MDR levaram foram publicados e incentivaram ainda mais

estudos de sinergismo entre esses antimicrobianos (Fulnecky et al., 2005; Petrosillo et

al., 2005; Biancofiore et al., 2007; Bassetti et al., 2008; Song et al., 2008). Estudos mais

recentes têm descrito a associação dos carbapenens, imipenem, meropenem e, mais

recentemente, doripenem, além de tigeciclinacom colistina com boa resposta clínica para

o tratamento de infecções por A. baumannii multirresistentes (Principe et al., 2009;

Candel et al., 2010; Pankuch et al., 2010; Rodriguez et al., 2010; Hornsey et al., 2011;

Santimaleeworagun et al., 2011; Sheng et al., 2011; Shields et al., 2011; Peck et al.,

2012). A desestruturação observada no isolado A027ind poderia justificar em parte o

sucesso do sinergismo entre as polimixinas e outras classes de antimicrobianos. Essa

desestruturação da parede poderia favorecer a entrada dos outros antimicrobianos.

Entretanto, em nosso estudo não foi observada redução nas CIM para quinolonas no

isolado A027Ind, possivelmente pelo fato de que o mecanismo de ação e resistência a

esses agentes são relacionados à síntese de DNA bacteriano e não com a parede celular

(Sheng et al., 2009).

Além da restituição da sensibilidade aos carbapenens, estudos têm demonstrado

que bactérias Gram negativas com resistência induzida às polimixinas podem tornar-se

sensíveis até mesmo a antimicrobianos aos quais apresenta resistência intrínseca, entre

eles a vancomicina (Gordon et al., 2010), devido ao aumento da permeabilidade do

envoltório celular, facilitando o acesso da vancomicina ao seu sítio de ligação na

membrana celular interna bacteriana.

Discussão

64

O isolado A027 apresentou resistência aos β-lactâmicos devido à produção de

carbapenemase OXA-23, provavelmente associada a ISAbaI. Mesmo após a indução de

resistência à polimixina B e a alteração do fenótipo de sensibilidade aos β-lactâmicos,

esses genes ainda estavam presentes no isolado A027Ind, o que indica que essa

reversão de sensibilidade aos diversos antimicrobianos não foi devido à perda de

plasmídios ao longo dos vários subcultivos para indução de resistência à polimixina B,

mas, possivelmente pela perda da integridade da parede celular bacteriana. Outra

observação realizada em nosso estudo e que reforça essa hipótese, é o fato de que

somente o isolado A027Ind não conseguiu sobreviver em meio hipotônico, sugerindo uma

fragilidade maior em sua parede celular após o cultivo na presença de polimixina B.

Moffat et al. (2010) sugerem a diminuição da integridade da parede celular de

isolados de A. baumannii submetidos à indução de resistência à colistina em laboratório

devido à perda total de LPS, por meio de espectrometria de massa. Mutações nos genes

que catalisam a síntese do LPS foram observadas, o que justificaria a perda total do LPS

bacteriano nesses isolados. Em outro estudo, esses mesmos autores descreveram uma

seqüência de inserção ISAba11 nos genes que codificam a síntese de LPS, lpxA e lpxC,

que justificaria os resultados obtidos no primeiro estudo (Moffat et al., 2011). Esses

autores também relacionam a inativação desses genes com a alteração do perfil de

sensibilidade aos outros antimicrobianos. Mais experimentos são necessários para

determinar se nossos isolados resistentes à polimixina B sofreram mutações nos genes

que codificam o LPS.

Pela metodologia de MET, foi observada uma deposição de “grânulos” na porção

intracelular da membrana interna em ambos isolados submetidos à indução de

resistência à polimixina B. Por essa metodologia não foi possível observar diferenças na

integridade da parede celular no isolado A027Ind, que possam ter provocado as

alterações observadas no perfil de sensibilidade. Entretanto, foi observado um

espessamento de parede celular no isolado com resistência “natural” à polimixina B. Essa

Discussão

65

observação sugere que o mecanismo observado no fenótipo de resistência “natural” às

polimixinas é diferente do mecanismo observado no fenótipo de resistência induzida a

esses antimicrobianos.

Em estudos anteriores, experimentos com microscopia eletrônica de varredura e

microscopia de força atômica mostraram diferenças na topografia e rugosidade da

superfície celular de A. baumannii em isolados com resistência in vitro à colistina (Gordon

et al., 2010; Soon et al., 2011a). Soon et al. (2009) observaram que a natureza e o grau

de dano na parede celular de isolados de A. baumannii submetidos ao tratamento com

colistina foi similar na fase estacionária e logarítmica da curva de crescimento bacteriano.

Esses autores analisaram a superfície celular desses isolados em baixas (4 µg/mL) e

elevadas (32 µg/mL) concentrações de colistina. O tratamento com 4 µg/mL de colistina

promoveu o aparecimento de pequenas cavidades ao longo da superfície celular

bacteriana e aumento da rugosidade, mas a forma celular foi mantida. Eles também

observaram diferenças na topografia celular e presença de debris ao longo de algumas

células após o tratamento com colistina. Na presença de 32 µg/mL, os isolados de A.

baumannii apresentaram uma superfície mais lisa à inspeção visual. Além disso, o

número de células foi reduzido e apresentaram uma tendência em formar “clusters”.

Moffat et al. (2011) também observaram diferenças na integridade das membranas de

isolados sensíveis e resistentes in vitro à colistina, utilizando provas de fluorescência para

superfícies hidrofóbicas, sugerindo a modificação estrutural da parede celular bacteriana

após o contato com o antimicrobiano.

A molécula de polimixina B é carregada positivamente e, por isso, possui alta

afinidade pela superfície celular bacteriana negativa. A redução nessa carga diminui a

afinidade desses agentes antimicrobianos pela célula bacteriana, desenvolvendo

resistência aos mesmos. O mecanismo de espessamento de parede é conhecido em

isolados de Staphylococcus aureus quando apresenta resistência à vancomicina, um

antimicrobiano da classe dos glicopeptídeos que age na parede celular, se ligando à

porção D-Ala-D-Ala dos resíduos de mureína, inibindo a síntese do peptideoglicano pelas

Discussão

66

PBPs presentes na membrana interna da célula bacteriana. A parede mais espessa age

como uma barreira para a vancomicina atingir seu sítio alvo (Sanyal e Greenwood, 1993;

Norazah et al., 2009). No entanto, não foi encontrada na literatura a relação entre

espessamento de parede e resistência às polimixinas. Devido ao mecanismo de ação das

polimixinas ser por alteração eletrostática na parede celular bacteriana, sugerimos que o

espessamento de parede observado no isolado resistente à polimixina B poderia ter

levado a uma redução da carga negativa da membrana celular de A. baumannii ou uma

maior dificuldade para o antimicrobiano em atingir o LPS bacteriano. Segundo Nikaido et

al. (2003), microrganismos com hiperprodução de cápsula polissacarídica podem não

apresentar a porção antígeno O do LPS na parede celular bacteriana, dessa forma, a

parede celular poderia apresentar uma superfície com carga menos negativa.

Diversos estudos tem demonstrado a participação de sistemas de dois

componentes na regulação do desenvolvimento de resistência às polimixinas (Adams et

al., 2010; Arroyo et al., 2005; Moskowitz et al., 2004). Em isolados de A. baumannii é

encontrado o sistema PmrAB que envolve a participação da proteína PmrC para adição

de fosfoetanolamina no lipídio A, promovendo modificações no LPS bacteriano e

consequente alteração no sítio de ligação das polimixinas (Miller et al., 2011; Beceiro et

al., 2011; Moskovitz et al., 2012).

Estudos mais recentes demontraram que mutações no gene pmrB tem levado ao

desenvolvimento de resistência às polimixinas em isolados de A. baumannii e P.

aeruginosa (Adams et al., 2011; Moskowitz et al., 2012). Nossos isolados de A.

baumannii foram submetidos ao sequenciamento dos genes que compõe o sistema de

dois componentes PmrAB e foram encontradas alterações no gene pmrB no isolado

A027Ind, com resistência induzida. Essas alterações não foram observadas no isolado

com resistência “natural”.

Para verificar alterações que possam ser promovidas por essa mutação,

realizamos análise da transcrição desses genes por qRT-PCR. Foram detectados

diferentes níveis de transcrição entre o isolado que apresentou resistência induzida e

Discussão

67

àquele que já apresentava resistência “natural”. Quando o isolado sensível foi submetido

ao cultivo na presença de polimixina B (A027Ind), foi observado um aumento da

transcrição do gene pmrA, que foi ativado pelo sensor quinase pmrB, que, por sua vez,

apresentou uma redução da transcrição após a indução. A proteína PmrB é a mais

externa do sistema e tem função de sensor quinase, que reconhece fatores ambientais e

desencadeia a expressão do sistema, neste caso, a presença da polimixina B no meio

(Miller et al., 2011). Essa redução da transcrição de pmrB pode ter sido devido à

desestruturação da parede celular bacteriana em decorrência da localização dessa

proteína ou mesmo devido à auto-regulação do sistema de dois componentes. Os

resultados de transcrição de PmrAB nos isolados sensível e seu mutante com resistência

induzida à polimixina B estão de acordo com resultados já observados por Baceiro et al.

(2011).

Diferente do isolado A027Ind, a transcrição de pmrB no isolado com resistência

“natural” à polimixina B, A009, estava elevada em relação ao isolado sensível A027. No

entanto, a transcrição desse gene não resultou na ativação de pmrA nesse isolado, nem

em seu respectivo mutante induzido, reforçando nossa hipótese de que a resistência

“natural” às polimixinas envolve outro mecanismo de regulação gênica. Não foi observada

mutação no gene pmrA, que pudesse justificar a dimiuição da transcrição nesse isolado.

Em um estudo de Adams et al. (2011), a deleção do gene pmrB, promoveu a

perda do perfil de resistência induzida à colistina. No entanto, Moskowitz et al. (2012)

afirmam que a resistência à colistina mediada por PmrB é dependente de PmrA, pois a

indução de resistência não foi capaz de ser atingida no isolado com deleção do gene

pmrA, mesmo após ativação de pmrB. Dessa forma, podemos afirmar que a resistência

observada no isolado A009 não estava sendo regulada pelo sistema PmrAB, diferente do

observado com o isolado A027Ind. Entretanto, mais estudos são necessários para

determinar o mecanismo que está envolvido no fenótipo de resistência “natural” à

polimixina B (Andrews et al., 2002; Arroyo et al., 2011; Miyazaki et al., 2009; Moskowitz et

al., 2004).

Discussão

68

Alterações no LPS da parede celular bacteriana, com adição de 4-aminoarabinose

e fosfoetanolamina no lipídio A tem sido descritas (Miller et al., 2011; Moskowitz et al.,

2011; Arroyo et al., 2011). Segundo Adams et al. (2011), essas alterações modificam a

natureza do LPS, tornando-o mais hidrofílico. As polimixinas são antimicrobianos

detergentes, dessa forma, possuem natureza lipofílica. Essas alterações promovidas pela

indução de resistência promovem diminuição da interação da droga com as membranas

celulares bacterianas. O mecanismo de ação das polimixinas envolve interação com as

cargas negativas da parece celular bacteriana. De acordo com Soon et al. (2011b), os

isolados clínicos de A. baumannii, assim como ATCC 19606, apresentaram diminuição na

carga negativa da membrana quando foram submetidos ao cultivo na presença de

polimixina B e colistina, reduzindo a interação do antimicrobiano pela superfície celular.

Dessa forma, experimentos de mensuração de cargas de superfície ainda são

necessários para esclarecimento das alterações sofridas pelos isolados de A. baumannii

avaliados neste estudo. Esses mecanismos de resistência descritos até o momento

correspondem ao fenótipo adaptativo de resistência às polimixinas.

Como a desestruturação da parede celular poderia interferir com o mecanismo de

ação e resistência de outros antimicrobianos que agem na síntese de parede celluar,

avaliamos os mecanismos de resistência a beta-lactâmicos nos isolados expostos à

polimixina B, estudamos mecanismos de resistência conhecidos, envolvidos com a

parede celular bacteriana. Por experimentos de qRT-PCR, foi observada uma redução na

expressão do sistema de efluxo AdeABC no isolado induzido A027Ind em relação à sua

cepa parental sensível. O sistema de efluxo atua na resistência aos β-lactâmicos por

ejetar da célula bacteriana os antimicrobianos e, também, as enzimas β-lactamases

produzidas no espaço periplasmático da mesma, as quais vão atuar sobre o

antimicrobiano e reduzir sua atividade na célula (Rosenfeld et al., 2012). Estudos

sugerem que a enzima OXA-23 atue em associação com a hiperexpressão do sistema de

efluxo AdeABC, para que sua ação seja significativa no perfil de resistência aos

carbapenens em isolados de A. baumannii (Lee et al. 2010). Dessa forma, a diminuição

Discussão

69

da expressão desse sistema de efluxo pode estar associada com perfil de sensibilidade

aos carbapenens observado no isolado A027Ind, após a indução de resistência à

polimixina B.

Análises de porinas mostraram alterações em suas transcrições nos isolados de

A. baumannii, antes e após a indução de resistência à polimixina B. Vila et al. (2007) citou

em seu estudo que os resultados observados sugeriam a modificação na expressão da

porina OmpW em isolados mutantes de A. baumannii com resistência à polimixina B

induzida em laboratório. Essa observação foi confirmada em nosso estudo pelos

experimentos de qRT-PCR e SDS-PAGE de proteínas de membrana externa. A porina

OmpW teve uma redução na sua expressão após o cultivo na presença de polimixina B.

A porina OmpW possui natureza hidrofóbica e é relacionada à osmorregulação

bacteriana (Xu et al., 2005; Berg et al., 2004). Hong et al. (2006) observaram uma alta

afinidade de uma molécula detergente, utilizada na extração de proteínas de membrana

externa, pela porina OmpW. A molécula de polimixina possui natureza detergente, dessa

forma, a diminuição da expressão de OmpW, pode contribuir para a redução da afinidade

de antimicrobianos dessa classe pela superfície celular bacteriana, contribuindo para o

aumento da resistência. Já a diminuição da expressão da porina CarO tem sido

relacionada com o aumento da resistência aos carbapenens (Vila et al., 2007). O isolado

com resistência induzida à polimixina, A027Ind, que se tornou sensível aos β-lactâmicos

após a indução de resistência à polimixina B, apresentou aumento da expressão das

porinas OmpA e CarO após à exposição ao antimicrobiano. Esse aumento de expressão,

assim como a diminuição da expressão do sistema de efluxo AdeABC, pode ter

contribuído para o perfil de sensibilidade exibido por esse isolado após a indução de

resistência à polimixina B. Os outros resultados de transcrição de porinas por qRT-PCR e

expressão dessas proteínas no gel de SDS-PAGE não puderam ser relacionados,

provavelmente, por alguma particularidade das técnicas que não foram controladas em

nosso estudo. Esses resultados necessitam de maiores análises posteriores.

Discussão

70

Para verificar o mecanismo utilizado para promover o espessamento de parede

observado no isolado com resistência “natural” à polimixina B, estudamos possíveis

alterações nas PBPs dos isolados de A. baumannii. As PBPs são proteínas presentes na

membrana interna da parede celular bacteriana e são responsáveis pela síntese e

organização do peptideoglicano na parede celular, promovendo a manutenção da forma

celular por gerações seguintes (Sauvage et al., 2008). Em nosso estudo, foram

sequenciados os genes que codificam as PBPs de alto peso molecular, de classe A,

PBP1a e PBP1b, que exercem função de transpeptidases e transglicosilases. Também

foram sequenciadas as PBPs de classe B, PBP2 que desempenha o papel de elongase e

PBP3 que está envolvida no processo de divisão celular (Sauvage et al., 2008).

As PBPs de classe A, 1a e 1b, possuem função de transglicosilação, catalisando a

polimerização de cadeias de glicano e, função de transpeptidação promovendo a ligação

cruzada entre as cadeias de glicano através das cadeias laterais de pentapeptídeo

(Sauvage et al., 2008). Sauvage et al. (2008) afirmam que na inativação de uma das duas

proteínas, a outra substitui sua função na síntese de peptideoglicano para manutenção

da atividade da célular bacteriana. As PBPs de classe B, PBP3 e PBP4 possuem função

de elongase e divisão celular, respectivamente. É sabido que alterações nessas PBPs

promovem redução da afinidade da superfície celular por β-lactâmicos, levando à

resistência aos mesmos (Sauvage et al., 2008).

Yun et al. (2011) relata a participação da PBP1a, PBP3 e PBP5 de A. baumannii,

associada com outros mecanismos de resistência como hiperexpressão de sistemas de

efluxo AdeABC e AdeIJK, além de produção de β-lactamases, na diminuição da

sensibilidade dessa especíe aos β-lactâmicos. No entanto, não existe na literatura relatos

da relação entre modificações de PBPs e perfil de resistência às polimixinas. Cayô et al.

(2011) observaram que a maioria das mutações encontradas nos genes que codificavam

as PBPs de alto peso molecular foram silenciosas não gerando alterações de

aminoácido. Estes autores observaram que estas mutações sempre ocorriam nas

mesmas posições (prováveis “Hot Spot Mutations”) e estavam mais relacionadas ao perfil

Discussão

71

clonal do que a resistência aos β-lactâmicos, uma vez que essas mesmas mutações

também estavam presentes nas cepas sensíveis. O mesmo foi observado para a cepa

sensível e seu mutante induzido em nosso estudo. Entretanto, um grande número de

mutações foi observado para a cepa resistente e seu mutante induzido, incluindo

alterações no “frame” de leitura no final da PBP1a, além de uma mutação ocorrida no

quinto motivo conservado do sítio de transpeptidação da PBP1b dessas cepas. Tais

mutações, até o momento, não foram descritas em nenhuma cepa de A. baumannii, cujas

sequencias de PBPs foram avaliadas, o que leva a crer que, provavelmente, essas

mutações representem um fator evolutivo na resistência “natural” às polimixinas. Além

disso, as mutações observadas nas sequencias de PBPs de alto peso molecular de

classe A (PBP1a e PBP1b) podem justificar o aumento da parede celular no isolado A009

observada na MET. Entretanto, estudos posteriores com inclusão de PBPs sem mutação

nesse isolado serão realizados para verificar a reversão ou não do fenótipo de

sensibilidade e determinar sua associação com o fenótipo de resistência “natural” à

polimixina B.

A resistência às polimixinas, seja ela por um mecanismo adaptativo ou por um

mecanismo “natural”, merece grande atenção por profissionais da saúde, para evitar que

haja a perda dessa opção terapêutica para o tratamento de infecções por A. baumannii e

outros bacilos Gram negativos que apresentem resistência a todos os outros

antimicrobianos disponíveis comercialmente. Felizmente, a resistência “natural” ainda é

raramente observada na clínica. No entanto, sabendo da capacidade dos isolados de A.

baumannii em se adaptar ao ambiente, sob pressão seletiva e em adquirir diferentes

mecanismos de resistência, o uso de outros antimicrobianos deve ser realizado com

extrema cautela para que o mecanismo “natural” de resistência às polimixinas não

comece a ser relatado em isolados multirresistentes, acabando com as possibilidades de

tratamento para essas infecções.

Discussão

72

A resistência aos diversos antimicrobianos apresentada por isolados clínicos de A.

buamannii vem aumentando as taxas de mortalidade por infecções que anteriormente

eram mais facilmente tratadas com β-lactâmicos ou outros antimicrobianos. Novos alvos

terapêuticos precisam ser descobertos já que esses microrganismos possuem um amplo

arsenal para defesa contra os antimicrobianos já existentes. Dessa forma, as polimixinas

tornaram-se a última opção para tratamento de infecções por bacilos Gram-negativos

multirresistentes. No entanto, atualmente o conhecimento dos mecanismos de resistência

às polimixinas tornou-se essencial para manter a viabilidade dessa droga até que novas

opções terapêuticas estejam disponíveis para serem utilizadas.

Conclusões

73

7. CONCLUSÕES7. CONCLUSÕES7. CONCLUSÕES7. CONCLUSÕES

Conclusões

74

7. CONCLUSÕES

• A resistência induzida às polimixinas verificada para o isolado incialmente

sensível é estável, ao contrário do observado para o isolado incialmente

resistente à polimixina B quando submetido ao cultivo na presença de

polimixina B;

• A indução da resistência às polimixinas no isolado MDR A027 levou a

reversão da sensibilidade aos β-lactâmicos e aos aminoglicosídeos;

• A resistência induzida está relacionada à desestruturação da parede celular

bacteriana com provável contribuição da diminuição da expressão da porina

OmpW.

• A resistência “natural” pode estar relacionada ao espessamento da parede

celular e, pode estar associada a mutações nos genes codificadores das

PBPs;

• O sistema regulatório de dois componentes PmrAB está associado à

resistência induzida às polimixinas, mas essa associação não foi observada

no fenótipo de resistência “natural” neste estudo;

• Os resultados deste estudo nos permitem sugerir que os dois fenótipos de

resistência, “natural” e induzido, às polimixinas observados em isolados de

A. baumannii resultam de distintos mecanismos de resistência.

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AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA À ...lemc.com.br/public/uploads/teses/Raquel_Girardello...4.10.1 Extração de RNA Total e síntese de cDNA..... 38 4.10.2 Quantificação