MH07 - 032

Genes pesquisadosGenes pesquisados

Avaliação da Concentração Inibitória Mínima aos Antimicrobianos

(CIM) e Sorotipagem de Streptococcus pneumoniae na cidade de

São Paulo – Brasil (2002 a 2006).

MOURO, A 1, DOI, A.M. 1, KIFFER, C. 1, KOGA, P 1, DO CARMO, M.S. 1, SOUZA, A.G. 1, PIGNATARI, A.C.C 1

1 Laboratório Especial de Microbiologia (LEMC) - Universidade Federal de São Paulo, São Paulo/SP.

Introdução

Isolados de Streptococcus pneumoniae multi-R são descritos atualmente em todo mundo e, com frequência, apresentam

resistência à penicilina. Estudos evidenciam aumentos significativos nos índices de multirresistência a cada ano em diversos

países e essa característica pode ser encontrada em clones internacionais de S. pneumoniae (Widdowson, Klugman, 1999;

Kanavaki et. al., 2005).

A multirresistência em S. pneumoniae pode ser definida como resistência a um número maior que três classes de

antimicrobianos. O primeiro isolado multirresistente (multi-R) foi descrito em 1978, na África do Sul, e apresentava resistência

à penicilina, tetraciclina, cloranfenicol, clindamicina e TMP/SMX (Klugman, 2001). Infecções pneumocócicas adquiridas na

comunidade causadas por isolados multi-R foram primeiramente descritas nos EUA, em 1981, e consecutivamente no Canadá,

África do Sul e Espanha (Klugman, 1990; Castanheira et al., 2006).

Em um estudo brasileiro, com 644 amostras, 121(21,1%) apresentaram diminuição de susceptibilidade à penicilina, com apenas

0,93% de isolados com elevada resistência (CIM >2 g/ml). (Brandileone et al., 1998).

Devido ao perfil de susceptibilidade aos agentes -lactâmicos observado em alguns países, atualmente, as

cefalosporinas de terceira geração (cefotaxima e ceftriaxona) representam as principais opções terapêuticas para o tratamento

de meningites e bacteremias causadas por isolados com diminuição de susceptibilidade à penicilina ou mesmo para terapêutica

empírica, especialmente nos casos de meningites. No entanto, um aumento de resistência a estes agentes também têm sido

reportada. (Ko te al., 2000; Lovgren, 2007).

O objetivo do presente estudo foi acompanhar as variações das CIM’s em isolados de Streptococcus pneumoniae frente

a diversos antimicrobianos ao longo de 2002 a 2006 e caracterizar estes agentes através de sorotipagem e análise molecular.

Material e Métodos

Resultados

Conclusão

Referências Bibliográficas: Brandileone MC, Di Fabio JL, Vieira VS, Zanella RC, Casagrande ST, Pignatari AC, Tomasz A. Geographic distribution of penicillin resistance of Streptococcus pneumoniae in Brazil: genetic relatedness. Microb Drug Resist. 1998 Fall;4(3):209-17. Castanheira M, Gales AC, Pignatari AC, Jones RN, Sader HS. Changing antimicrobial susceptibility patterns among Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae from Brazil: Report from the SENTRY

Antimicrobial Surveillance Program (1998-2004). Microb Drug Resist. 2006 Summer;12(2):91-8. Enright MC, Spratt BG. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious invasive disease. Microbiology. 1998 Nov;144 ( Pt 11):3049-60. Kanavaki S, Mantadakis E, Karabela S, Anatoliotaki M, Makarona M, Moraitou H, Pefanis A, Samonis G. Antimicrobial resistance of Streptococcus pneumoniae isolates in Athens, Greece. Eur J

Clin Microbiol Infect Dis. 2005 Oct;24(10):693-6. Klugman KP. Antibiotic selection of multiply resistant pneumococci. Clin Infect Dis. 2001 Aug 15;33(4):489-91. Klugman KP. Pneumococcal resistance to antibiotics. Clin Microbiol Rev. 1990 Apr;3(2):171-96.

Lovgren M, Talbot JA, Brandileone MC, Casagrande ST, Agudelo CI, Castañeda E, Regueira M, Corso A, Heitmann I, Maldonado A, Echániz-Avilés G, Soto-Noguerón A, Hortal M, Camou T, Gabastou JM, Fabio JL and the SIREVA Study Group "Evolution of an International External Quality Assuran". J Clin Microbiol. 2007.

McDougal LK, Rasheed JK, Biddle JW, Tenover FC. Identification of multiple clones of extended-spectrum cephalosporin-resistant Streptococcus pneumoniae isolates in the United States. Mantese OC, Paula P, Almeida VVP, Aguiar PADF, Wolkers PCB, Alvares JR, Almeida SCG, Guerra MLLS, Brandileone MC. Prevalência de sorotipos e resistência antimicrobiana de cepas invasivas do pneumococo em crianças: análise de 9 anos. J Pediatr. 2009 Nov-Dez;85(6):495-502 . Sørensen UB. Typing

of pneumococci by using 12 pooled antisera. J Clin Microbiol. 1993 Aug;31(8):2097-100. Widdowson CA, Klugman KP. Molecular mechanisms of resistance to commonly used non-betalactam drugs in Streptococcus pneumoniae. Semin Respir Infect. 1999 Sep;14(3):255-68.

Foram avaliados entre o período de 2002 a 2006, como parte do Projeto EUREQA, 65 isolados de S. pneumoniae

causadores de infecções comunitárias isolados de diferentes sítios (trato respiratório, líquidos orgânicos ou sangue). O Projeto

EUREQA avaliou as infecções/colonizações bacterianas e suas características de resistência aos antimicrobianos em pacientes

moradores na cidade de São Paulo.

O teste de sensibilidade com determinação da CIM foi realizado pelo método elipsométrico com difusão em ágar,

utilizando o teste comercial Etest® de acordo com as recomendações do fabricante. Foram utilizados para interpretação dos

resultados os critérios do “Clinical Laboratory Standards Institute” - CLSI 2011; M100-S21. Os antimicrobianos testados

foram: penicilina, levofloxacina, cefaclor, ceftriaxona, amoxicilina, amoxicilina/clavulanato e azitromicina.

Neste estudo também foram aplicados métodos de tipagem epidemiológica (Sorotipagem, PFGE e MLST), os quais

auxiliam na classificação dos isolados de S. pneumoniae e na discriminação de isolados relacionados pertencentes à mesma

espécie.

Para sorotipagem as amostras foram enviadas ao laboratório do Statens Serum Institut, Dinamarca, às quais foram

submetidas à reação de eufeld-Quellung com antissoros policlonais produzidos pelo próprio Staten Serum Institute, Dinamarca

(Sorensen, 1993). A caracterização dos isolados foi realizada pela técnica de Pulsed Field Electroforesis (PFGE ) sendo que

identificação dos perfis eletroforéticos de PFGE foram inicialmente analisados visualmente, segundo os critérios de Tenover et

al., (1995). Posteriormente a análise destes perfis foram realizadas através do programa de computador BioNumerics (v 4.5;

Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium) utilizando-se o coeficiente de Dice e o método de pareamento das bandas

(UPGMA) para gerar os dendrogramas de relações genéticas entre as isolados.

A tipagem molecular por Multi Locus Sequence Typing (MLST) foi baseada no sequenciamento de sete genes

housekeeping de acordo com procedimentos descritos por Enright et al., 2000.

Em relação ao sítio de isolamento dos agentes estudados, 28 cepas (43,1%) foram isoladas do trato respiratório 27

(41,5%) do sangue e 10 (15,3%) de fluidos orgânicos (figura 1).

Em relação ao teste de susceptibilidade aos antimicrobianos testados, observamos uma elevada resistência a cefaclor

81% (n=55), seguida de azitromicina 78% (n=53). As penicilinas semi-sintéticas como a amoxacilina apresentou resistência de

12% (n = 8), já as cefalosporinas de 3ª geração como a ceftriaxona apresentou resistência de 13% (n = 9), o mesmo ocorreu

com amoxacilina/clavulanato (13%). Observamos alta susceptibilidade, de aproximadamente 100% à levofloxacina. (figura 1)

Podemos observar , vide figura 3, a mediana das CIMs dos 65 isolados de S. pneumoniae em relação aos anos do

estudo. Em 2004 há aumento na CIM do cefaclor (28,0 µg/mL) e ceftriaxona (1,0 µg/mL). Em 2006 a CIM da levofloxacina

(0,875 µg/mL) aumenta em relação aos anos anteriores.

Foi evidenciada tendência de aumento das CIMs entre as medianas ao longo dos anos para: penicilina (R2 = 0,581 -

58% de correlação entre os anos), levofloxacina (R2 = 0,50), cefaclor (R2 = 0,548), amoxacilina (R2 = 0,50) e

amoxicina/clavulanato (R2 = 0,50). Gráficos 4,5,6,7 e 8.

Gráfico 4 Gráfico 5 Gráfico 6

Gráfico 7 Gráfico 8

Gráficos 4 a 8: Mediana da concentração inibitória mínima de penicilina, levofloxacina, cefaclor, amoxicilina

e amoxicilina/clavulanato dos isolados de S. pneumoniae em relação aos anos 2002 a 2006

Não observamos tendência de aumento das CIMs entre as medianas ao longo dos anos para ceftriaxona (R2 = 0,439) e

azitromicina (R2 = 0,321) – Gráficos 9 e 10

Gráfico 9 Gráfico 10

Gráficos 9 a 10: Mediana da concentração inibitória mínima de azitromicina e ceftriaxona dos isolados de S. pneumoniae

em relação aos anos 2002 a 2006.

A similaridade genética entre os isolados foi obtida pela técnica de PFGE e a análise realizada utilizando o

coeficiente de similaridade de Dice de 80% e tolerância de 2.0. Foram identificados 4 diferentes clones dentre os isolados

estudados (A, B, C e D) com prevalência do clone A que apresentou elevadas taxas de resistência às cefalosporinas (93% de

resistência ao cefaclor e 12,3% de resistência a ceftriaxona)

Baseado no número de bandas e de seus pesos moleculares, a análise do perfil do DNA cromossômico identificou

onze clusters com mais de 80% de similaridade pelo coeficiente de Dice. A porcentagem de similaridade de acordo com o

coeficiente de Dice variou de 40,4 a 79,3% . Entre as amostras, 21 apresentaram menos de 80% de similaridade, sendo,

portanto consideradas como amostras individuais. Dois clusters apresentaram cerca de 79% de similaridade com o restante

das amostras, mas 80% de similaridade entre si, sendo portanto classificadas como um cluster à parte (linhas rachuradas)

(Figura 1).

Figura 1: Dendograma de similaridade genética entre 65 isolados de S. pneumoniae (PFGE),

método de agrupamento UPGMA (coeficiente de Dice).

A análise da sorotipagem realizada em 22 isolados demonstrou que 50% pertenciam ao sorotipo 14 (4 destes

pertencendo ao mesmo clone pela análise do PFGE), 6 isolados pertenciam ao sorotipo 23F, um isolado classificado com

sorotipo 6B, um isolado como sorotipo 19F e 3 isolados foram não tipáveis. Os isolados sorotipo 14 apresentaram mediana

da CIM para penicilina de 1,5 µg/mL sendo que , 72% apresentaram resistência a cefaclor e mais de 80% destes agentes

foram isolados em crianças menores de 6 anos de idade. Tanto o sorotipo 14 quanto o 23F apresentaram 18% e 33% de

resistência a penicilina e 9% e 17% de resistência a ceftriaxona respectivamente. Todos os antimicrobianos foram ativos

frente ao isolado sorotipo 6B (totalmente suscetível), que no dendograma de PFGE não foi classificado em nenhum clone. O

isolado com sorotipo 19F apresentou resistência para penicilina, azitromicina e cefaclor e foi associado ao clone B e MLST

(878).

Foram analisados 10 isolados de S. pneumoniae pela técnica de MLST, sendo que seis possuíam o mesmo Sequence

Type (ST) 557, os quais foram classificados como sorotipo 14. Os isolados 2, 4 e 8 de S. pneumoniae foram identificados

com ST 81, 878 e 180 respectivamente. Três isolados de S. pneumoniae não foram classificados em nenhum sorogrupo pela

técnica de tipagem capsular, e destes, dois isolados foram resistentes ao cefaclor e suscetíveis para os demais

antimicrobianos.

Observamos aumento significativo das CIMs para penicilina, levofloxacina, cefaclor, amoxacilina e

amoxicilina/clavulanato no período de 2002 a 2006. Evidenciamos também percentuais elevados de resistência para

azitromicina e cefaclor ao contrário de percentuais baixos para levofloxacina.

Os dados encontrados ressaltam a importância de Estudos Epidemiológicos como este, que acompanhem a

distribuição das CIMs ao longo dos anos, tendo em vista a emergência de patógenos multirresistentes devido à utilização

não racionalizada de antibióticos em nosso meio. Estes dados são fundamentais para orientar a terapia empírica a ser

adotada frente a infecções comunitárias e até mesmo nosocomiais causadas por Streptococcus pneumoniae.

Apontamos também a presença de quatro clones principais de isolados de S. pneumoniae circulantes no município

de São Paulo nesse período, com predomínio dos sorotipos 14 (MLST 557) e 23F (MLST 878). Três isolados de S.

pneumoniae não foram classificados em nenhum sorogrupo pela técnica de tipagem capsular, e destes, dois isolados foram

resistentes ao cefaclor e suscetíveis para os demais antimicrobianos.

A caracterização do perfil epidemiológico dos sorotipos e da similaridade genética em nosso ambiente contribui

para adoção de medidas preventivas como vacinação uma vez que todos os sorotipos descritos neste estudo estão presentes

na vacina 7-valente (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) (Mantese et al., 2009), além de nos permitir avaliar o padrão de

disseminação das infecções por estes agentes espacialmente.

Gráfico 1: Distribuição Percentual do sítio de infecção dos isolados

de S. pneumoniae comunitário na cidade de São Paulo entre 2002 a

2006.

Gráfico2: Perfil de suscetibilidade dos antimicrobianos (Etest®) dos

isolados de S. pneumoniae (CLSI 2010; M100-S21).

Gráfico 3: Concentração inibitória mínima (Etest®) dos antimicrobianos dos isolados de S. pneumoniae entre 2002 a

2006.