BIORREDUÇÃO DE CETONAS AROMÁTICAS UTILIZANDO … · meu melhor acontecer, obrigada por tudo. Ao meu pai, por quem eu sempre busquei ser melhor nessa vida. A minha vó (in memoriam),

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

JULIANA MARIA OLIVEIRA DE SOUZA

BIORREDUÇÃO DE CETONAS AROMÁTICAS

UTILIZANDO CÉLULAS ÍNTEGRAS DE HELIANTHUS

ANNUUS L. (GIRASSOL)

FORTALEZA-CEARÁ

2012

1

JULIANA MARIA OLIVEIRA DE SOUZA

BIORREDUÇÃO DE CETONAS AROMÁTICAS UTILIZANDO CÉLULAS

ÍNTEGRAS DE HELIANTHUS ANNUUS L. (GIRASSOL)

FORTALEZA-CEARÁ

2012

Dissertação de Mestrado submetida à

Coordenação do Curso de Pós-Graduação

em Química, da Universidade Federal do

Ceará, como requisito parcial para

obtenção do Título de Mestre em Química.

Área de Concentração: Química Orgânica

Orientadora: Telma Leda Gomes de Lemos

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências e Tecnologia

______________________________________________________________________ S715b Souza, Juliana Maria Oliveira de.

Biorredução de cetonas aromáticos utilizando células íntegras de Helianthus annuus L. (Girassol) /

Juliana Maria Oliveira de Souza. – 2012.

137 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de

Química. Programa de Pós-Graduação em Química, Fortaleza, 2012.

Área de concentração: Química Orgânica.

Orientação: Profa. Dra. Telma Leda Gomes de Lemos.

1. Biorredução-cetona. 2. Biocatálise. 3. Girassol. I. Título.

CDD 547

2

3

A Deus por toda graça.

A minha mãe e irmão por todo amor e dedicação.

Ao meu pai, meu herói.

A minha vó, Izaura (in memoriam), por todo exemplo.

Aos amigos por todos os momentos.

4

"Provai e vede como o Senhor é bom, feliz o homem que encontra nele o seu refúgio.”

Salmo 33

5

AGRADECIMENTOS

A Deus por todo amor e infinita misericórdia, por sustentar-me inúmeras vezes nessa

batalha tão difícil que a vida, por mostrar-me os caminhos certos a seguir e por nunca

desistir de mim, por ter me dado a oportunidade de ser apenas eu e poder estar ao lado

dessas pessoas aqui embaixo, agradecendo a elas também.

A minha mãe, razão de toda essa conquista, por sempre estar ao meu lado,

demonstrando infinito amor e compreensão, por fazer o seu melhor, para sempre ver o

meu melhor acontecer, obrigada por tudo.

Ao meu pai, por quem eu sempre busquei ser melhor nessa vida.

A minha vó (in memoriam), por ter me incentivado a ser uma pessoa guerreira e

batalhadora por aquilo que acredito, por ser meu maior exemplo e minha maior coragem

de viver. Saudades!

A minha orientadora, Profa. Telma Leda, por ter aceito mais esta filha de peito aberto na

família LBPN, por todos os conhecimentos repassados, por toda atenção,

disponibilidade e contribuição para a minha vida acadêmica e profissional.

Ao meu irmão, Rafael, por ser meu apoio, minha segurança, minha infância sempre

vivida e revivida a cada dia.

A Leila Parente, por ter me encaminhado nos primeiros experimentos do laboratório,

por ter me ensinado o “andar da carruagem” e assim contribuído com o

desenvolvimento deste trabalho e seu consequente sucesso.

A minha querida amiga Ayla, por sempre ter me ajudado nos momentos de sufoco,

pelas análises de RMN e ensinamentos experimentais, mas o que tenho de mais

importante a agradecer foi a oportunidade de tê-la feito presença marcante em minha

vida com sua amizade. Pessoa querida, que amo muito, sua amizade é dádiva de Deus.

Aos amigos Leo Alcântara, Bertini e Felipe, fiéis guerreiros de batalha. Obrigada pelo

apoio e pelos domingos, feriados e madrugadas em que podemos trabalhar juntos. Leo,

não esqueço, muito obrigada pela força durante a seleção do doutorado, mostrou-se um

verdadeiro amigo. Bertini muito obrigada pelo apoio.

6

Aos amigos irmãos do laboratório mais feliz da UFC: Ayla, Leo Alcântara, Bertini,

Luciana, Felipe, Cleane, Patrícia, André, Leila, Karina, Anderson, Allyson, Gisele e Leo

Carvalho. Os melhores dias são todos aqueles em podemos trabalhar juntos. Obrigada

por tudo, por me acolherem, por todo apoio, amizade, companheirismo e lealdade,

guardo-os em meu coração. Não esquecendo da amiga Daniele, pelos momentos de

descontração e fiel amizade.

A minha família tão querida e que sempre me apoiou, obrigada pelos sempre belos

gestos de amizade e pelas orações.

Aos meus amigos mais polares, Thays e Leo, por sempre estarem ao meu lado, por me

amarem tanto, amo-os muito, que a vida possa sempre dar oportunidade para eu declarar

minha felicidade por tê-los comigo sempre

A minha amiga mais irmã, Lilian, flor da minha vida, presente sempre nos momentos de

alegria e nos momentos de não tanta alegria, apoio certo e amizade eterna.

As minhas amigas, Pamella e Gliamici, lembrança sempre viva em meu coração, base

de tudo sou, pessoas mais que importantes são essenciais em minha vida.

Aos amigos de hoje e sempre, que levaram um pouco de mim e deixaram um pouco de

si, obrigada por me cativarem, e terem se tornado únicos no mundo.

Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Química pelos conhecimentos e apoio

durante o curso, obrigada por contribuirem de forma direta para minha formação.

A Caroline Lustosa do LABS por conceder, sempre com muita atenção, alguns dos

substratos investigados neste trabalho.

A Edilane pela compreensão nas análises de CG/EM.

A FUNCAP pela bolsa concedida.

7

RESUMO

O estudo da biocatálise tem se intensificado nos últimos anos devido à busca de rotas

sintéticas alternativas para a obtenção de compostos enantiomericamente puros. A

utilização de sementes de Helianthus annuus L. ainda não foi relatada na literatura em

reações de biorredução e diante dessa perspectiva, foram investigadas na biorredução de

cetonas aromáticas, para a obtenção de álcoois enantiomericamente puros. O teor de

proteínas das sementes foi determinado pelos métodos de Lowry e Bradford e

apresentaram valores correspondentes a 10,1 g/L e 8,8 g/L, respectivamente. As reações

de biorredução foram otimizadas utilizando acetofenona (1), e nestas foram avaliados os

fatores: quantidade de biocatalisador, meio tamponante (pH), co-solvente, germinação

de sementes e extrato bruto com polivilpirrolidona (PVP). Foram obtidos boas

conversões (56,9%) em meio aquoso e, excelentes excessos enantiómericos (ee),

(>99,0%) com o extrato bruto enzimático em PVP do enantiômero (S). Derivados da

acetofenona, uma cetona α-halogenada e duas outras cetonas aromáticas, α-tetralona e

α-indanona, foram submetidas às metodologias otimizadas de conversão e ee, obtendo-

se bons resultados, com produção do enantiômero S, exceto para a 3-metóxi-

acetofenona em meio aquoso, que apresentou o isômero R. A quantificação dos teores

de conversão foi realizada por intermédio da construção de curvas de calibração em

Cromatográfo Líquido de Alta Eficiência (CLAE), bem como a resolução dos álcoois

quirais utilizando coluna quiral OB-H.

Palavras-chave: biorredução, cetonas aromáticas, Helianthus annuus L, células

íntegras.

8

ABSTRACT

The study of biocatalysis has intensified in recent years due to the search for alternative

synthetic routes to obtain enantiomerically pure compounds. The use of seeds of

Helianthus annuus L. has not been reported in the literature and bioreduction reactions

at this point of view, were investigated in the bioreduction of aromatic ketones, to

obtain enantiomerically pure alcohols. The protein content of the seeds was determined

by Lowry and Bradford methods and gave values corresponding to 10,1g/L and 8,8g/L,

respectively. The bioreduction reactions were optimized using acetophenone (1), and

these factors were evaluated: the amount of biocatalyst, using buffer (pH), co-solvent,

seed germination and the crude extract with polyvinylpyrrolidone (PVP). Good

conversions were obtained (56,9%) in aqueous solution and excellent enantiomeric

excess (ee) (>99,0%) crude extract with the enzyme in PVP enantiomer (S). Derivatives

of acetophenone, an α-halogenated ketone and two other aromatic ketones, α-tetralone

and α-indanone were subjected to the methods of conversion and ee optimized to yield

good results, with production of the S enantiomer, except for the 3-methoxy-

acetophenone in aqueous media, which made the R isomer. Quantitation of the

conversion levels were determined by the construction of calibration curves in a High

Efficiency Liquid Chromatograph (HPLC) and the resolution of chiral alcohols using a

chiral column OB-H.

Keywords: bioreduction, aromatic ketones, Helianthus annuus L., whole cell.

9

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estruturas da Efedrina, Ampicilina e Cefadroxil obtidas por

biotransformações...........................................................................................

32

Figura 2 Álcoois quirais e produtos obtidos a partir de álcoois quirais........................ 34

Figura 3 Estruturas de terpenos quirais e produtos obtidos a partir deles..................... 35

Figura 4 Álcoois quirais de interesse industrial............................................................ 36

Figura 5 Redução assimétrica biocatálitica de compostos carbonílicos com NADPH

na presença de ADH.......................................................................................

37

Figura 6 Biorredução da acetofenona utilizando várias espécies de plantas................. 38

Figura 7 Cetonas utilizadas na biorredução com Arabidopsis thaliana........................ 39

Figura 8 Fotografia da flor de Helianthus annuus L. tendo como detalhe as sementes

utilizadas nas biotransformações....................................................................

41

Figura 9 Estruturas dos ácidos fenólicos presentes nas sementes de Helianthus

annuus L..........................................................................................................

43

Figura 10 Aminoácidos utilizados para biotransformação por Helianthus annuus

L......................................................................................................................

44

Figura 11 Esquema da reação de redução das cetonas pró-quirais por via química....... 46

Figura 12 Detalhe da reação do extrato enzimático das sementes de Helianthus

annuus L. com o íon cobre (II)....................................................................... 55

Figura 13 Detalhe da reação do extrato enzimático das sementes de Helianthus

annuus L. com o reagente de Folin-Ciocalteau.............................................. 55

Figura 14 Detalhe do método de Bradford para determinação de proteínas após a

adição do reagente Coomassie Brilliant Blue G-250...................................... 56

Figura 15 Esquema da reação de redução da acetofenona por via enzimática................ 58

Figura 16 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 5 g de

Helianthus annuus L....................................................................................... 59

Figura 17 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 10 g

de Helianthus annuus L.................................................................................. 59

Figura 18 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 20 g

de Helianthus annuus L.................................................................................. 59

Figura 19 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 1% de

isopropanol...................................................................................................... 61


isopropanol......................................................................................................

61

10


isopropanol...................................................................................................... 62

Figura 22 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 10%

de isopropanol................................................................................................. 62

Figura 23 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando

solução tampão pH 6,0.................................................................................... 64






extrato bruto enzimático com PVP................................................................. 66

Figura 27 Estrutura monomérica do polímero PVP........................................................ 67


sementes germinadas de Helianthus annuus L............................................... 68

Figura 29 Cetonas selecionadas para a reação com as sementes de Helianthus annuus

L...................................................................................................................... 69

Figura 30 Produtos esperados da reação das cetonas -para substituídas utilizando a

metodologia G10 e Gpvp................................................................................ 70

Figura 31 Cromatograma de biorredução da 4-bromo-acetofenona utilizando a

metodologia G10............................................................................................. 71


metodologia Gpvp........................................................................................... 71

Figura 33 Cromatograma de biorredução da 4-fluoro-acetofenona utilizando a

metodologia G10............................................................................................. 73

Figura 34 Cromatograma de biorredução da 4-fluoro-acetofenona utilizando a


Figura 35 Cromatograma de biorredução da 4-cloro-acetofenona utilizando a

metodologia G10............................................................................................. 74



Figura 37 Cromatograma de biorredução da 4-metóxi-acetofenona utilizando a

metodologia G10............................................................................................. 76

11


metodologia Gpvp...........................................................................................

76

Figura 39 Cromatograma de biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando a

metodologia G10............................................................................................. 78

Figura 40 Cromatograma de biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando a


78

Figura 41 Cromatograma CG/EM da biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando a


79

Figura 42 Espectro de massa do 4-metil-feniletanol....................................................... 79

Figura 43 Espectro de massa da 4-metil-acetofenona..................................................... 79

Figura 44 Produtos esperados da reação das cetonas -meta substituídas utilizando a

metodologia G10 e Gpvp................................................................................

81


metodologia G10.............................................................................................

82



82


metodologia G10.............................................................................................

84



84

Figura 49 Produtos esperados da reação das cetonas -orto substituídas utilizando a


85


metodologia G10.............................................................................................

86



86


metodologia G10.............................................................................................

88



88


metodologia G10.............................................................................................

89

12



90

Figura 56 Cromatograma de biorredução da 2-hidróxi-acetofenona utilizando a

metodologia G10.............................................................................................

91

Figura 57 Cromatograma de biorredução da 2-hidróxi-acetofenona utilizando a


91

Figura 58 Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) da 2-hidróxi-acetofenona.............. 92

Figura 59 Produto esperado da reação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando a


93

Figura 60 Cromatograma de biorredução da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando a

metodologia G10.............................................................................................

94

Figura 61 Cromatograma de biorredução da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando a


94

Figura 62 Produtos esperados da reação da α-tetralona e da α-indanona utilizando a


95

Figura 63 Cromatograma de biorredução da α-tetralona utilizando a metodologia

G10..................................................................................................................

96

Figura 64 Cromatograma de biorredução da α-tetralona utilizando a metodologia

Gpvp................................................................................................................

96

Figura 65 Cromatograma de biorredução da α-indanona utilizando a metodologia

G10..................................................................................................................

98

Figura 66 Cromatograma de biorredução da α-indanona utilizando a metodologia

Gpvp................................................................................................................

98

Figura 67 Detalhe da CCD da biorredução da acetofenona............................................ 101

Figura 68 Cromátografo Líquido de Alta Eficiência utilizado nas análises de

biorredução e em detalhe a coluna quiral OB-H.............................................

102

Figura 69 Detalhe do espectrofotômetro modelo Cary 50 Conc da Varian.................... 104

Figura 70 Reações de biorredução utilizando as sementes de girassol........................... 107

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Disposição cinética e efeitos estereosseletivos de alguns fármacos

quirais..........................................................................................................

31

Tabela 2 Rendimentos da obtenção dos álcoois padrões 1a-15a............................... 46

Tabela 3 Substratos utilizados para a obtenção das curvas de calibração para

análise do teor de conversão nas reações de biorredução...........................

47

Tabela 4 Resultados de biorredução da acetofenona utilizando 5 g, 10 g e 20 g de

Helianthus annuus L...................................................................................

58

Tabela 5 Resultados de biorredução da acetofenona com sementes de Helianthus

annuus L. utilizando isopropanol como co-solvente.................................. 61


annuus L. utilizando diferentes soluções tampão....................................... 64


annuus L. utilizando extrato bruto enzimático com PVP........................... 66


annuus L. germinadas................................................................................. 67

Tabela 9 Resultados da biotransformação da 4-bromo-acetofenona com sementes

de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 71

Tabela 10 Resultados da biotransformação da 4-fluoro-acetofenona com sementes


Tabela 11 Resultados da biotransformação da 4-cloro-acetofenona com sementes




Tabela 13 Resultados da biotransformação da 4-metil-acetofenona com sementes




Tabela 15 Resultados da biotransformação da 3-metóxi-acetofenona com sementes




14


de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.........................

87

Tabela 18 Resultados da biotransformação da 2-metóxi-acetofenona com sementes


Tabela 19 Resultados da biotransformação da 2-hidróxi-acetofenona com sementes


Tabela 20 Resultados da biotransformação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona com

sementes de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......... 93

Tabela 21 Resultados da biotransformação da α-tetralona com sementes de

Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.............................. 96

Tabela 22 Resultados da biotransformação da α-indanona com sementes de

Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.............................. 97

Tabela 23 Parâmetros de análise por CLAE dos substratos utilizados nas reações de

biotransformação......................................................................................... 103

15

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Curva de calibração da acetofenona........................................................... 49

Gráfico 2 Curva de calibração do (±)-feniletanol....................................................... 49

Gráfico 3 Curva de calibração da 4-bromo-acetofenona............................................ 50

Gráfico 4 Curva de calibração do: (±) 1-(4-bromofenil)-etanol................................. 50

Gráfico 5 Curva de calibração da 4-fluoro-acetofenona............................................. 50

Gráfico 6 Curva de calibração do (±) 1-(4-fluorofenil)-etanol................................... 50

Gráfico 7 Curva de calibração da 4-cloro-acetofenona............................................... 50

Gráfico 8 Curva de calibração do (±) 1-(4-clorofenil)-etanol..................................... 50

Gráfico 9 Curva de calibração da 4-metóxi-acetofenona............................................ 51

Gráfico 10 Curva de calibração do (±) 1-(4-metóxifenil)-etanol.................................. 51

Gráfico 11 Curva de calibração da 4-metil-acetofenona............................................... 51

Gráfico 12 Curva de calibração do (±) 1-(4-metilfenil)-etanol..................................... 51


Gráfico 14 Curva de calibração do (±)3-bromo-feniletanol......................................... 51




Gráfico 18 Curva de calibração do (±) 1-(2-bromofenil)-etanol................................... 52

Gráfico 19 Curva de calibração da 2-cloro-acetofenona............................................... 52

Gráfico 20 Curva de calibração do (±) 1-(2-clorofenil)-etanol..................................... 52



Gráfico 23 Curva de calibração da 2,2,2-trifluoro-acetofenona................................... 53

Gráfico 24 Curva de calibração do 2,2,2-trifluoro-feniletanol..................................... 53

16

Gráfico 25 Curva de calibração da α-tetralona............................................................. 53

Gráfico 26 Curva de calibração do (±)-α-tetralol.......................................................... 53

Gráfico 27 Curva de calibração da α-indanona............................................................. 54

Gráfico 28 Curva de calibração do α-indanol............................................................... 54

Gráfico 29 Estudo comparativo das metodologias de Lowry e Bradford para a

determinação de proteínas solúveis totais...................................................

57

Gráfico 30 Perfil de conversão da biorredução da acetofenona utilizando diferentes

proporções de biocatalisador.......................................................................

60

Gráfico 31 Perfil do excesso enantiomérico da biorredução da acetofenona

utilizando diferentes proporções de biocatalisador.....................................

60

Gráfico 32 Perfil de conversão da biorredução da acetofenona utilizando diferentes

proporções de co-solvente: isopropanol......................................................

63


utilizando diferentes proporções de co-solvente: isopropanol....................

63

Gráfico 34 Perfil de conversão da biorredução da acetofenona utilizando soluções

tampão com diferentes valores de pH.........................................................

65


utilizando soluções tampão com diferentes valores de pH.........................

65

Gráfico 36 Perfil de biotransformação da 4-bromo-acetofenona utilizando as

metodologias G10 e Gpvp..........................................................................

72

Gráfico 37 Perfil de biotransformação da 4-fluoro-acetofenona utilizando as


73

Gráfico 38 Perfil de biotransformação da 4-cloro-acetofenona utilizando as


75

Gráfico 39 Perfil de biotransformação da 4-metóxi-acetofenona utilizando as


77

Gráfico 40 Perfil de biotransformação da 4-metil-acetofenona utilizando as


80



82



84

17



87

Gráfico 44 Perfil de biotransformação da 2-cloro-acetofenona utilizando as


88



90

Gráfico 46 Perfil de biotransformação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando as


94

Gráfico 47 Perfil de biotransformação da α-tetralona utilizando as metodologias

G10 e Gpvp.................................................................................................

97

Gráfico 48 Perfil de biotransformação da α-indanona utilizando as metodologias

G10 e Gpvp.................................................................................................

98

18

LISTA DE ABREVIATURAS

AcOEt Acetato de Etila

BSA Albumina Bovina

CC Coluna Cromatográfica

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CENAUREMN Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética

Nuclear

CG/EM Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

ee Excesso Enantiomérico

IV Infravermelho

iPrOH Isopropanol

NADH/NAD+ Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo

NADP/NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótideo Fosfato

pH Potencial Hidrogeniônico

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

r.p.m Rotação por minuto

Tr Tempo de retenção

UV-Vis Ultravioleta Visível

Ф Diâmetro

19

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS........................................................................................... 9

LISTA DE TABELAS..........................................................................................

LISTA DE GRÁFICOS........................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS..........................................................

13

15

18

1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 23

2. BIOCATÁLISE................................................................................................. 28

2.1 Quiralidade e Biocatálise.................................................................................. 30

2.2 Álcoois Quirais................................................................................................. 33

2.2.1 Obtenção de álcoois a partir de cetonas via enzimática................................. 37

3. CONSIDERAÇÕES SOBRE Helianthus annuus L....................................... 41

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES.................................................................... 46

4.1 Obtenção dos álcoois padrões por via química................................................. 46

4.2 Curvas de calibração dos substratos.................................................................. 47

4.2.1 Acetofenona e (±)-1-feniletanol..................................................................... 49

4.2.2 4-bromo-acetofenona e (±) 1-(4-bromofenil)-etanol..................................... 50

4.2.3 4-fluoro-acetofenona e (±) 1-(4-fluorofenil)-etanol....................................... 50

4.2.4 4-cloro-acetofenona e (±) 1-(4-clorofenil)-etanol.......................................... 50

4.2.5 4-metóxi-acetofenona e (±) 1-(4-metóxifenil)-etanol.................................... 51

4.2.6 4-metil-acetofenona e (±) 1-(4-metilfenil)-etanol.......................................... 51


4.2.8 3-metóxi-acetofena e (±) 1-(3-metóxifenil)-etanol........................................ 52


4.2.10 2-cloro-acetofenona e (±) 1-(2-clorofenil)-etanol........................................ 52

4.2.11 2-metóxi-acetofenona e (±) 1-(2-metóxifenil)-etanol.................................. 53

4.2.12 2,2,2-trifluoro-acetofenona e (±)-2,2,2-trifluoro-feniletanol....................... 53

4.2.13 α-tetralona e (±)-α-tetralol............................................................................ 53

4.2.14 α-indanona e (±)-α-indanol.......................................................................... 54

4.3 Determinação do teor de proteínas das sementes de Helianthus annuus L...... 54

4.3.1 Método de Lowry (modificado por Hartree).................................................. 54

4.3.2 Método de Bradford....................................................................................... 56

4.4 Processos biocatalíticos..................................................................................... 57

4.4.1 Quantidade de biocatalisador......................................................................... 58

20

4.4.2 Co-solvente: Isopropanol............................................................................... 60

4.4.3 Meio tamponante: tampão fosfato.................................................................. 63

4.4.4 Extrato enzimático bruto segundo Lupetti (2000)......................................... 65

4.4.5 Germinação das sementes de Helianthus annuus L....................................... 67

4.4.6 Reações de biotransformação utilizando derivados da acetofenona.............. 68

4.4.6.1 Cetonas -para substituídas.......................................................................... 70

4.4.6.2 Cetonas -meta substituídas.......................................................................... 80

4.4.6.3 Cetonas -orto substituídas........................................................................... 85

4.4.6.4 Cetona α-halogenada................................................................................... 92

4.4.6.5 Cetonas aromáticas..................................................................................... 95

5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................... 100

5.1 Material utilizado.............................................................................................. 100

5.2 Métodos de Análise........................................................................................... 100

5.2.1 Cromatografia em Camada Delgada (CCD).................................................. 100

5.2.2 Cromatografia de Adsorção........................................................................... 101

5.2.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)...................................... 101

5.2.4 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)....................................................... 103

5.2.5 Espectroscopia na Região do UV/VIS........................................................... 103

5.2.6 Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG/EM)....... 104

5.3 Determinação de Proteínas................................................................................ 104

5.3.1 Método de Lowry (modificado por Hartree).................................................. 105

5.3.2 Método de Bradford....................................................................................... 105

5.4 Processos Biocatalíticos.................................................................................... 106

5.4.1 Procedimento geral das biotransformações utilizando células íntegras de

vegetais.................................................................................................................... 106

5.4.1.1 Quantidade de biocatalisador...................................................................... 107

5.4.1.2 Uso de co-solvente: Isopropanol................................................................. 107

5.4.1.3 Meio tamponante: pH 6,0, 7,0 e 8,0............................................................ 108

5.4.1.4 Extrato bruto enzimático (LUPPETI, 2000)............................................... 108

5.4.1.5 Sementes de Helianthus annuus L. germinadas.......................................... 108

5.4.2 Obtenção dos álcoois padrões por via química........................................... 109

5.4.3 Substratos selecionados nas reações de biotransformação utilizando as

sementes de Helianthus annuus L...........................................................................

109

5.4.4 Cetonas........................................................................................................... 110

21

5.4.5 Obtenção dos excessos enantioméricos (ee).................................................. 110

5.4.6 Obtenção das curvas de calibração dos substratos e produtos esperados...... 110

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................... 112

7. REFERÊNCIAS................................................................................................ 115

ANEXO.................................................................................................................. 124

22

INTRODUÇÃO

23

1. INTRODUÇÃO

O termo biotransformação pode ser aplicado para descrever modificações

específicas ou interconversões de substâncias químicas catalisadas por células vegetais,

animais ou microbianas, ou ainda enzimas isoladas. É conhecido por apresentar um

grande potencial em gerar novos produtos ou, ainda, produzir mais eficientemente

produtos conhecidos.

Grande parte do interesse pelas biotransformações deve-se à habilidade de se

catalisar reações com regio-, quimio- e estereosseletividade, aliada a outros fatores

como a utilização de meios aquosos, biodegradabilidade e a não necessidade de

proteção de alguns grupos funcionais. A união destes fatores representa uma alternativa

sintética bastante viável e dentro dos princípios da química verde.

A área multidisciplinar da biocatálise encontra-se atualmente em amplo

desenvolvimento. Pesquisas realizadas em vários ramos da química e da biologia tem

como principal objetivo o desenvolvimento de novos catalisadores para uso industrial.

A biocatálise é hoje um dos campos mais promissores dentro das novas

tecnologias para síntese de compostos de alto valor agregado (CARVALHO et al.,

2005). O seu desenvolvimento pode ser relacionado com produção de novas drogas e

agrotóxicos, bem como o seu uso em outros processos industriais (ZAKS; DODDS,

1997). Várias reações foram introduzidas e aperfeiçoadas, especialmente em síntese de

moléculas quirais de interesse farmacológico (LUNA, 2004; SHARMA et al., 2005),

cosméticos e substâncias químicas indústrias (VEIT, 2004; LIU; WEIS; GLEIDER.,

2004).

Novas técnicas de biologia molecular, metodologias de seleção de

biocatalisadores e novas abordagens de pesquisa, foram desenvolvidas a fim de se obter

catalisadores com suas especificidades melhoradas bem como a exploração da

biodiversidade. Os catalisadores biológicos nativos atualmente disponíveis, em sua

maioria apresentam limitações quanto à utilização em processos industriais, sendo este

o maior desafio do campo. As limitações encontradas na aplicação sintética de enzimas

em sua forma nativa estão sendo contornadas atualmente através da alteração da

estereoespecificidade, termoestabilidade e atividade através de técnicas de biologia

molecular de mutações sítio dirigidas ou aleatórias (CONTI; RODRIGUES; MORAN,

2001).

24

Indústrias que adquiriram conhecimentos em síntese assimétrica, atualmente

apresentam grandes vantagens tecnológicas e industriais, comparadas com as que não se

encontram capacitadas para a produção de compostos enantiomericamente puros.

Também, a área de biocatálise emergiu como uma ferramenta poderosa para a chamada

química ecologicamente correta (green chemistry), a qual levará cada vez mais a

processos industriais comprometidos com a preservação ambiental (VIEIRA et al.,

2010).

Dentre as numerosas aplicações de reações enzimáticas em meio orgânico

destacam-se a síntese de produtos de interesse nas áreas clínica, nutricional, ambiental,

industrial e biotecnológica (REETZ, 2002).

Os processos mais estudados em reações enzimáticas utilizam bactérias e

fungos, mas também são relatados ensaios com enzimas isoladas e, mais recentemente,

com células íntegras e imobilizadas de vegetais. O uso de células íntegras significa a

utilização da biomassa da fonte enzimática nas reações em questão (VILELA;

SGARBIERI; ALVIM, 2000).

A incessante busca por compostos com atividade farmacológica os quais, em sua

grande maioria, são compostos quirais com pelo menos um centro estereogênico, o que

pode dificultar sua obtenção através de reações por via química, torna os estudos de

biocatálise e a procura de novas fontes biocatalíticas cada vez mais comuns. Em função

disto, as maiores aplicações da biocatálise são referentes a sua utilização em síntese

assimétrica, onde enzimas vêm sendo utilizadas em substituição dos processos químicos

clássicos (PANKE; HELD; WOBBOLTS, 2004). Outra realidade a ser apontada é o

fato de que o emprego de catalisadores naturais apresenta uma alternativa

ambientalmente mais correta em relação às rotas sintéticas convencionais.

Vários estudos relatam a relação da atividade biológica com a quiralidade

molecular. Um dos casos mais conhecidos é a talidomida, onde na década de 1960,

provocou a má formação fetal em várias gestantes. Descobriu-se que apenas o

enantiômero R era o responsável pelas funções biológicas do medicamento (SILVEIRA

et al., 2001).

A síntese de compostos orgânicos de origem sintética e natural na forma

opticamente ativa é um desafio em química orgânica, devido à sua importância em áreas

que vão deste a medicina à ciência dos materiais. No entanto, a natureza fornece apenas

um número limitado de fontes quirais, bem como de apenas um enantiômero. Em

muitos casos, isso tem forçado químicos orgânicos a desenvolverem catalisadores

25

eficientes e altamente seletivos para a síntese de enantiômeros puros através de reações

assimétricas (BALAKRISHNAN et al., 2011).

A produção de compostos quirais requer o uso de catalisadores específicos,

caros e tóxicos. Nessa perspectiva a biocatálise pode ser utilizada para minimizar esses

impactos. Dentre os compostos quirais que possuem grande importância nos processos

de síntese orgânica, destacam-se os álcoois.

A produção de álcoois enantiomericamente puros é de grande importância para a

química orgânica, pois estes são utilizados como intermediários na síntese de produtos

químicos para as indústrias agroquímicas e farmacêuticas, mais especificamente. Muitos

destes compostos são obtidos através de reduções assimétricas de cetonas pró-quirais

utilizando microorganismos, vegetais ou enzimas isoladas como biocatalisadores

(KURBANOGLU et al., 2010).

A redução assimétrica de cetonas é uma das reações mais importantes,

fundamentais e práticas para a produção de álcoois quirais, que podem ser

transformados em várias funcionalidades na sua forma enantiomérica pura (YANG et

al., 2006).

O emprego de células íntegras de vegetais na biorredução de cetonas para a

produção de álcoois vem aumentado atualmente em relação ao uso de enzimas isoladas,

pois não necessitam de co-fatores e sua regeneração não é necessária para a manutenção

de sua atividade catalítica. Destaca-se também, o fato que são de mais fácil obtenção,

baixo custo e mais estáveis (KURBANOGLU et al., 2010).

Em reações químicas e bioquímicas, o uso de enzimas puras pode ser

dispendioso e seu descarte após o uso é economicamente inviável. Além disso, a

recuperação do meio reacional pode ser difícil (FABER, 2000).

O uso de vegetais em reações de biocatálise, mesmo com todos os avanços e

investigações já realizados até o momento, ainda é um campo muito novo visto a

enorme diversidade de espécies vegetais existentes e ao pequeno número de espécies

investigadas. Só no Brasil, o número de espécies de plantas ultrapassa os 56.000

(cinquenta e seis mil), o que compreende quase 19% da flora mundial, sendo que o

conhecimento da biodiversidade no país ainda é muito incompleto (GIULIETTI et al.,

2005).

Nessa perspectiva o presente trabalho teve como objetivo ampliar os estudos

relacionados à biocatálise de compostos orgânicos, dando continuidade às pesquisas

nessa área desenvolvidas pelo nosso grupo, buscando a investigação de novas fontes

26

vegetais com potencial promissor para biotransformação de substratos, destacando-se as

sementes de Helianthus annuus L. na biorredução de cetonas aromáticas. O estudo se

inicia com a determinação protéica do material, seguida do estudo de parâmetros

reacionais para a otimização da biorredução para a acetofenona, dando continuidade

com a biorredução de seus derivados e outras cetonas aromáticas.

27

BIOCATÁLISE

28

2. BIOCATÁLISE

O estudo da biocatálise consiste na utilização de enzimas para promover a

catálise de reações químicas, onde esses biocatalisadores podem ser oriundos de fontes

vegetais, fúngicas, microbianas, bem como de animais. O emprego dos biocatalisadores

nas reações químicas pode ser feito na sua forma purificada, isolado de algum material,

e na sua forma imobilizada, onde se utiliza um suporte polimérico como matriz

imobilizadora das enzimas, bem como na sua forma íntegra, natural, onde são usadas as

fontes enzimáticas em si, como por exemplo, vegetais e células em crescimento de

microorganismos.

Segundo Faber (2004) a utilização dos materiais, fontes de enzimas, para as

reações de biocatálise, ocorre da seguinte forma:

Células em crescimento: os substratos são adicionados ao meio de cultura

simultaneamente à inoculação ou durante a fase de crescimento do micro-

organismo;

Células em repouso: o micro-organismo é cultivado até seu crescimento

ótimo, a biomassa é filtrada ou centrifugada e ressuspensa em soluções ou

solventes adequados, com posterior adição de susbtratos;

Enzimas imobilizadas: as enzimas estão ligadas a suportes inertes insolúveis

por meios físicos ou químicos;

Enzimas isoladas: as enzimas são adicionadas diretamente no meio

reacional, dependendo da enzima há necessidade da adição de co-fator.

A utilização de células vegetais na sua forma íntegra tem sido relatada na

literatura com frequência. A manipulação da fonte biocatalítica neste procedimento é

simples e consiste na desinfecção do material vegetal e adição deste, juntamente com o

substrato, em soluções ou solventes adequados.

A utilização de enzimas na transformação de compostos orgânicos é conhecida

há mais de cem anos (COSTA; AMORIM, 1999). A aplicação de biocatalisadores na

indústria é objeto de muitas investigações e a importância do uso de enzimas em

biocatálise tem se mostrado cada vez mais evidente por apresentar inúmeras vantagens.

Dentre as vantagens do uso de biocatalisadores em reações orgânicas destacam-se:

A eficiência catalítica, onde promovem reações com velocidades na ordem

de 106

– 1014

mais rápidas do que a correspondente reação não catalisada,

29

valor considerado muito acima dos promovidos por catalisadores comuns

(FERREIRA, 2002);

Não geram resíduos de alta toxicidade e são facilmente degradados pelo

meio ambiente;

Atuam sob condições brandas de reação como pH e temperatura.

Catalisam uma ampla faixa de reações químicas como reduções, oxidações,

glicosilações, hidroxilações, esterificações, hidrolises, entre outras.

São bastante específicos e catalisam reações com:

Quimiosseletividade: a enzima atua preferencialmente em grupos funcionais

específicos, mantendo as demais funcionalidades presentes nos substratos

intactas;

Regiosseletividade: a enzima atua diferenciando grupos funcionais idênticos

de acordo com o ambiente químico em que se encontram nos substratos;

Estereosseletividade: a enzima é capaz de diferenciar um enantiômero do

outro, produzindo com isso, compostos enantiomericamente puros, pois são

considerados catalisadores quirais e reconhecem em seu sítio ativo, moléculas

quirais ou pró-quirais (ARAÚJO, 2010).

A possibilidade da produção de compostos enatiomericamente puros pelas

enzimas em reações químicas motivaram uma ampla busca por novas fontes

biocatalíticas e a grande biodiversidade mundial, mais especificamente brasileira, tem

sido fator primordial.

A exploração da biodiversidade na busca de novos catalisadores por técnicas de

seleção de microrganismos, de plantas ou células animais representam os métodos

tradicionais de descoberta de novas enzimas para o desenvolvimento da biocatálise em

escala industrial e acadêmica (DEMIRJIAN; SHAH; MORIS-VAS, 1999).

A grande variabilidade de plantas taxionomicamente diferentes disponíveis e

com fácil acesso, associado aos fatores experimentais como fácil separação do produto

da mistura reacional, através de simples filtração ou centrifugação, somam pontos

positivos para a crescente busca de materiais vegetais como fontes biocatalíticas, além

de sua realização em meio aquoso e o restante do material descartado ser facilmente

degradado pelo meio ambiente, mostrando em contrapartida uma alternativa viável em

relação às reações químicas clássicas que requerem o uso de reagentes tóxicos e metais

pesados, onde sua eliminação ao meio ambiente geram grandes impactos (SALVANO

et al., 2011).

30

Segundo Takeda et al. (2011) a utilização de materiais vegetais como fontes de

enzimas são mais eficientes porque fornecem um ambiente mais favorável para a

biotransformação de substratos onde destacam-se a presença de numerosas enzimas e

em grande variedade e a presença de co-fatores, bem como as vias metabólicas

necessárias para a regeneração dos co-fatores. Ressalta-se ainda a facilidade de

obtenção desses materiais vegetais, o baixo custo apresentado e estabilidade por eles

garantida (KURBANOGLU et al., 2010).

Muitas transformações de diferentes substratos, tais como hidroxilação e reações

de oxidação (Gynostemma pentaphyllum), hidrólise de ésteres (Solanum tuberosum,

Helianthus tuberosus), bioredução de cetonas e aldeídos (Daucus carota, Foeniculum

vulgare, Cucurbita pepo, Phaseolus aureus, Cocos nucifera, Saccharum officinarum,

Manihot dulcis, Manihot esculenta), lactonização (Malus sylvestris, Helianthus

tuberosus) glicosilação, (Ipomoea batatas, Eucalyptus perriniana), etc, tem sido

realizadas, e produziram bons resultados usando plantas e suas células em cultura.

(SALVANO et al., 2011).

2.1 Quiralidade e Biocatálise

Compostos opticamente ativos são intermediários úteis para a síntese de

produtos farmacêuticos, agroquímicos e cristais líquidos. A necessidade de síntese

estereosseletiva de compostos opticamente ativos com atividades biológicas é

importante porque somente um isômero entre os muitos compostos opticamente ativos

disponível tem uma atividade biológica específica (GOTOR; ALFONSA; GARCIA-

URDIALES, 2008).

Em compostos bioativos, tais como, produtos farmacêuticos e agroquímicos, a

atividade biológica depende, em muitos casos de sua configuração absoluta.

Normalmente um dos estereoisômeros apresenta atividade biológica, enquanto o outro é

menos ativo, ou até mesmo tóxico ou inativo (BONATTO; JABOR; GAITANI, 2005).

Exemplos dessa relação atividade biológica e quiralidade para alguns fármacos,

encontram-se na Tabela 1 (p. 31), a seguir:

31

Tabela 1: Disposição cinética e efeitos estereosseletivos de alguns fármacos quirais

FÁRMACO QUIRAL Disposição cinética e efeito farmacológico dos

enantiômeros

Morfina (analgésico) O enantiômero (-)-(R)- é o único com atividade analgésica.

Propanolol (antiarrítimico) A forma enantiomérica (+)-(S)- é 100 vezes mais potente

que a (-)-(R)- e apresenta tempo de meia vida mais longo.

Ácido 1-metil-5-fenil-5-

propilbarbitúrico (sedativo)

Atividades opostas no sistema nervoso central. Um

enantiômero apresenta o efeito sedativo desejado

(hipnótico ou narcótico dependendo da dose) e o outro é

um convulsivante.

Ácido

2-bromofenoxipropiônico

(agente de crescimento)

Uma ação antagonista é evidenciada pela forma (-)-(R)-

enquanto o enantiômero (+)-(S)- é um estimulante de

crescimento.

Ibuprofeno (antinflamatório)

Este fármaco é administrado como racemato pois o

enantiômero inativo (-)-(R)- sofre inversão quiral para o

enantiômero ativo (+)-(S)- no organismo.

A utilização de biocatalisadores para o desenvolvimento de novos fármacos e

agrotóxicos é bem conhecida e, uma grande variedade de enzimas já está sendo usada

em processos industriais. A síntese do fármaco Efedrina, com atividade β-adrenérgica é

realizada com a utilização da levedura Saccharomyces cerevisae, enquanto os

antibióticos Ampicilina e Cefadroxil são sintetizados com o intermédio da enzima

penicilina acilase de acordo com Conti, Rodrigues e Mouran (2001). As estruturas dos

fármacos relatados encontram-se na Figura 1 (p. 32).

32

Figura 1: Estruturas da Efedrina, Ampicilina e Cefadroxil obtidas por

biotransformações.

NHCH3

OH

CH3

NH2

O

HO

N

O

S

COOH

H

NH2

O N

O

H

S

COOH

Ampicilina

Cefadroxil

Efedrina

Além de atuarem na preparação de fármacos como precursores, compostos

opticamente ativos são importantes na síntese de feromônios, aromas, fragrâncias,

cosméticos e pesticidas (UTSUKIHARA et al., 2007).

Plantas como fonte biocatalítica são encontradas na literatura sua aplicação na

fitorremediação de poluentes orgânicos (SINGH; JAIN, 2003), biorredução de cetonas

(NAOSHIMA; AKAKABE, 1991; YADAV et al., 2001; BASKAR et al., 2004)

lactonização enzimática (OLEJNICZAK; MIRONOWICZ; WAWRZENCZYK, 2003),

hidrólise de ésteres (MIRONOWICZ, 1998; MACZKA; MIRONOWICZ, 2002), adição

de hidrogênio cianídrico (HERNANDEZ et al., 2004), reações de hidroxilação e

oxidação (SAKAMAKI et al., 2005), e ainda o interesse na preparação de álcoois

quirais na redução de cetonas pelo uso de culturas de plantas (YADAV et al., 2002;

COMASSETO et al., 2004).

33

2.2 Álcoois Quirais

A produção de álcoois quirais enantiomericamente puros é relevante na química

orgânica, pois eles são importantes intermediários para a síntese de produtos químicos,

mais precisamente de fármacos, e também podem ser utilizados como blocos de

construção quiral (“chiral building blocks”) na produção de diversos compostos quirais

de importância biológica (ARAÚJO, 2010). Entre vários exemplos, o (S)-(-)-3-hidróxi-

butanoato de etila, oticamente ativo, é um dos álcoois quirais mais utilizados como

precursor quiral em síntese orgânica: o (S)-(+)-sulcatol, importante insumo para a

síntese de outros produtos naturais; (R)-lavandulol, importante aditivo na indústria de

perfumes; (R)-(+)-recifeiolídeo, macrolídeo natural isolado do Cephalosporum recifei;

(R,R)-(-)-grahamimicina, macrodiolídeo de atividade antibiótica reconhecida; (R,R)-

pirenoforina, um diolídeo representativo de ocorrência natural com atividade fungicida

obtido a partir de sulcatol e a carbomicina B, um outro antibiótico macrolídeo (Figura 2,

p. 34) (TEMBA; OLIVEIRA; DONNICI, 2003).

34

Figura 2: Álcoois quirais e produtos obtidos a partir de álcoois quirais.

OH O

O

OH

OH

O

CH3

O

(S)-(-)-3-hidróxi-butanoato de etila

(S)-(+)-sulcatol

(R)-lavandulol

(R)-(+)-recifeiolídeo

O

O

O

O O

OH3C

H3C

(R,R)-(-)-grahamimicina

O O

O

O

O

OH3C

CH3

(R,R)-pirenoforina

carbomicina B

OH3C

H3CO

OCOCH3

OR'

CH3

CHO

O

O

R' = desoxiaçúcar

Os terpenos incluem álcoois e derivados de grande importância em síntese

orgânica, quer como precursores, quer como auxiliares quirais, sendo vários de origem

natural. Existem exemplos destacáveis de síntese total partindo-se de terpenóides, por

exemplo, a síntese da milbemicina b3 a partir do (S)-(-)-citronelol e a síntese de

proxifomina a partir do (R)-(+)-citronelol (Figura 3, p. 35) (TEMBA; OLIVEIRA;

DONNICI, 2003).

35

Figura 3: Estruturas de terpenos quirais e produtos obtidos a partir deles.

O

O

O

OH3C CH3

OH

CH3

CH3

H3C

Milbemicina b3

CH3

O

HN

Bn

O

H3C

H3C

Proxifomina

HO

CH3

HO

CH3

(S)-(-)-citronelol

(R)-(+)-citronelol

O mentol, outro terpeno quiral, também é muito usado como insumo, natural ou

sintético, tendo a sua grande aplicação como aromatizante pelo efeito refrescante, tão

apreciado, apenas do enantiômero levógiro, o (1R,2S,5R)-(-)-5-metil-2-(1-metiletil)-

ciclo-hexanol, ou (1R,2S,5R)-(-)-mentol (a). Além disso, o mentol tem amplo uso como

auxiliar de quiralidade e várias outras aplicações sintéticas. Cabe lembrar que vários

feromônios de interesse são também álcoois quirais como o sulcatol, que tem sido muito

estudado como feromônio do besouro Gnathotrichus sulcatus e Gnathotrichus retusus e

outros vários, como os exemplos de b a f (Figura 4, p. 36) que também foram

36

sintetizados por vários métodos clássicos, de complexidade variável, envolvendo a-

aminoácidos, carboidratos e terpenos como material de partida. Um exemplo de álcool

quiral ainda mais notável é o 1-octen-3-ol (g) que é feromônio importante na atração de

mosquitos, tendo chamado muito a atenção de pesquisadores em todo o mundo e no

Brasil (TEMBA; OLIVEIRA; DONNICI, 2003).

Figura 4: Álcoois quirais de interesse industrial.

OH

OH

OH OH

OHOH

OH

(a) (b) (c) (d)

(e)

(f)

(g)

Nessa perspectiva a produção de álcoois quirais se torna um campo promissor de

estudo para vários setores estratégicos, como nas indústrias de medicamentos,

cosméticos, agrotóxicos, alimentícias, biotecnologias, entre outras, que buscam acima

de tudo metodologias capazes para sua obtenção de forma eficiente, através de rotas

alternativas, ambientamente favoráveis e economicamente mais atraentes.

Aliada a essa visão surge como ferramenta a biotransformação de compostos

orgânicos para a obtenção de álcoois quirais enantiomericamente puros.

37

2.2.1 Obtenção de álcoois a partir de cetonas via enzimática

A redução enzimática de grupos carbonila representa uma das reações

importantes mais empregadas na síntese de álcoois quirais. As enzimas responsáveis por

essa transformação são as oxidorredutases, mais precisamente as álcool desidrogenases

(ADH), que necessitam da presença de um co-fator (coenzima), como NADH ou

NADPH, que transfere o hidreto para o ânion do composto carbonílico, sendo formado

NAD+ ou NADP

+. O papel da álcool desidrogenase é proporcionar uma interação do

substrato com o co-fator de forma termodinamicamente favorável para que a reação

ocorra (Figura 5) (ARAÚJO et al., 2010).

Figura 5: Redução assimétrica biocatálitica de compostos carbonílicos com NADPH na

presença de ADH.

R

O

+ NADPH

ADH

R

OH

H

*

+ NADP+

Nos últimos anos, as culturas de células vegetais na sua forma íntegra, têm sido

investigados como potenciais agentes para reações de biotransformação.

Um dos primeiros trabalhos utilizando vegetais na forma de células íntegras foi

com as raízes de Daucus carota (cenoura). Este estudo alertou investigações no uso de

planta fresca, intacta como um reagente ao invés do uso de sistemas de células,

suspendida ou imobilizada, ou algumas enzimas derivadas. Estes investigadores

descreveram aspectos dos seus estudos em uma patente italiana (CORDELL et al.,

2007).

Yadav et al. (2002), utilizando como fonte de biocatalisador as raízes de Daucus

carota obteve álcoois secundários opticamente ativos através da redução de várias

cetonas proquirais tais como acetofenonas, cetonas α-azido aril, β-ceto-ésteres, cetonas

alifáticas cíclicas e acíclicas com rendimentos químicos de moderados a excelentes sob

condições extremamente suaves e aceitas ambientalmente em meio aquoso.

Recentemente, Comasseto et al. (2004), utilizando raízes de D. carota como

catalisador conseguiram reduzir organoseleno- e organotio-acetofenonas. Os

38

correspondentes álcoois quirais foram preparados conseguindo 99% de excesso

enantiomérico. Andrade et al. (2004), relatou as mesmas biorreduções utilizando células

íntegras de fungos. Andrade et al. (2006), realizou um estudo com acetofenona (Figura

6) utilizando espécies de plantas como biocatalisadores.

Figura 6: Biorredução da acetofenona utilizando várias espécies de plantas.

Machado et al. (2006) utilizando espécies de Manihot esculenta e Manihot

dulcis na redução de cetonas (alifáticas, cíclicas e α,β-insaturadas) obteve entre baixos

(12,5-14,9%) e altos (91,7-97,8%) de valores de conversão para o respectivo álcool,

apresentando também ótimos valores de excesso enantiómero 93-98%. Entretanto,

cetonas esteroidais não foram reduzidas.

Fonseca et al. (2008) avaliaram o potencial biocatalítico da água de côco do

Ceará (Cocos nucifera) na redução de cetonas alifáticas, cíclicas e aromáticas obtendo

ótimos valores de excesso enantiomérico (56-99%) dos álcoois correspondentes.

Destaca-se a redução da acetofenona e da 3-metóxi-acetofenona com valores de excesso

enantiomérico de 95% e 99%, respectivamente.

Assunção et al. (2008) investigaram o potencial do caldo de cana obtido da

moagem da cana-de-açúcar, Saccharum officinarum, como fonte enzimática para a

redução de uma série de cetonas com excelentes rendimentos e moderada

enantiosseletividade.

Bizerra et al. (2010) realizou o estudo de biorredução de cetonas aromáticas e

alifáticas utilizando feijão (Vigna unguiculata) onde obteve excelentes valores de

excessos enantioméricos dos produtos formados, variando entre 87% e acima de 99%,

entretanto os valores de conversão apresentaram-se entre baixos (5%) para os substratos

(2-metóxi-acetofenona e 4-metóxi-acetofenona) e ótimos (86%) para a 3-metóxi-

acetofenona.

O OH

39

Mais recentemente, Takeda et al. (2011) utilizando a espécie Arabidopsis

thaliana promoveu a biorredução de cetonas assimétricas (aromáticas e alifáticas)

obtendo valores moderados de conversão e excelentes excessos enantioméricos (Figura

7).

Figura 7: Cetonas utilizadas na biorredução com Arabidopsis thaliana.

O

R1 R2

Arabidopsis thaliana

OH

R1 R2

OH

R1 R2

+

1a-d

(1a) R1=CF3; R2=C6H5

(1b) R1=CH3; R2=CH2CO2Bu(1c) R1=CO2CH3; R2=C6H5

(1d) R1= 2-tienil; R2= CF3

(2a);(2c);(2d) 2b

40

CONSIDERAÇÕES

SOBRE Helianthus annuus L.

41

3. CONSIDERAÇÕES SOBRE Helianthus annuus L.

Helianthus annuus L., conhecido popularmente por girassol, é uma dicotiledônia

anual caracterizada por apresentar sistema radicular com raiz principal pivotante e

inflorescência conhecida como capítulo (Figura 8) (GONÇALVES; TOMICH, 1999),

pertencente à família Asteraceae (ROSSI, 1991). A própria planta do girassol, bem

como os grãos, os restos da cultura e os subprodutos gerados na extração do óleo podem

ser usados na alimentação animal. Na dieta de ruminantes o girassol pode ser utilizado

como alimento volumoso. Tem sua origem conhecida nas planícies da Mesoamérica

desde o século 26 a.C (POPE et al., 2001).

Figura 8: Fotografia da flor de Helianthus annuus L. tendo como detalhe as sementes

utilizadas nas biotransformações.

O cultivo de Helianthus annuus L. é promissor em todo mundo, por se tratar de

uma oleoginosa (PUTT, 1978; JONIC et al., 2000). O óleo de Helianthus annuus L.

possui altos valores nutricionais é praticamente livre de compostos tóxicos e tem alta

concentração de ácido linoléico. Este ácido graxo poliinsaturado essencial não é

sintetizado pelos seres humanos e é um precursor de outros ácidos graxos como o gama-

linolênico e o araquidônico (DORELL, 1978).

42

Nos últimos anos a produção mundial de sementes de girassol (Heliantus annuus

L.) tem aumentado significativamente em comparação com outras culturas de

produtoras de óleo (NIMET et al., 2011). Dentre as mais importantes culturas o girassol

encontrou-se em 6º lugar no ranking mundial das fontes de oleoginosas com a produção

de 30,4 milhões de toneladas em 2010, segundo dados da organização das nações unidas

para a alimentação em cultura (FAOSTAT, 2011). Devido à sua composição química e

valor nutritivo, as sementes de girassol são consideradas como grande fonte de lipídios

e proteínas e além de ser utilizada na produção de óleos comestíveis, também vem

sendo comercializada para alimentação animal (BRATFALEAN et al., 2008). O teor de

proteínas das sementes é de aproximadamente 50-60%. Além disso, o óleo de girassol

tem uma elevada quantidade de vitamina E natural oxidante em comparação com outros

óleos comestíveis (NIMET et al., 2011).

O girassol apresenta características agronômicas importantes, como maior

resistência à seca, ao frio e ao calor, que a maioria das espécies normalmente cultivadas

no Brasil. Apresenta ampla adaptabilidade a diferentes condições edafoclimáticas e seu

rendimento é pouco influenciado pela latitude, pela altitude e pelo fotoperíodo

(GOMES et al., 2006).

As sementes de girassol são ricas em compostos fenólicos, sendo estes

encontrados tanto na semente em si, quanto na casca. Dentre os compostos fenólicos

presentes nas sementes de girassol destacam-se os ácidos protocatequínico, clorogênico,

caféico, siríngico e felúrico (Figura 9, p. 43) (WEISZ; KAMMERER; CARLE, 2009).

Os ácidos fenólicos são algumas das substâncias que constituem o grupo dos compostos

fenólicos. Caracterizam-se por terem um anel benzênico, um grupamento carboxílico e

um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metóxila na molécula, conferindo

propriedades antioxidantes tanto para os alimentos como para o organismo, sendo, por

isso, indicados para o tratamento e prevenção do câncer, doenças cardiovasculares e

outras doenças (SOARES, 2002).

43

Figura 9: Estruturas dos ácidos fenólicos presentes nas sementes de Helianthus annuus

L.

OH

O

HO

HO

Ácido protocatequínico

OH

O

HO

H3CO

Ácido siríngico

OCH3

O

OH

O

HO

OH

OH

O

OH

OH

Ácido clorogênico

HO

OH

O

Ácido ferúlico

HO

OH

O

HO

Ácido caféico

Hartwell (1982) relata o uso das sementes de Helianthus annuus L. na medicina

popular onde são utilizadas no tratamento de doenças pulmonares, tosse, garganta,

constipações e expectorantes, bem como afirma o uso associado com as flores em

remédios populares na Venezuela para o tratamento de câncer.

Tishinov et al. (2009) utilizaram as sementes de girassol para um estudo cinético

de aminopeptidases através da hidrólise de aminoácidos e derivados, relatando pela

primeira vez a aplicação do material em processos de biotransformação.

Aminopeptidases isoladas das sementes foram utilizadas na hidrólise dos aminoácidos

apresentados na Figura 10 a seguir (p. 44).

44

Figura 10: Aminoácidos utilizados para biotransformação por Helianthus annuus L.

O2N

HN

O

R

NH2

(1) R=CH3

(2) R=CH2CH3

(3) R=(CH2)2CH3

(4) R=(CH2)3CH3

(5) R=(CH2)4CH3

O

R2R1

H2N

(6) R1=CH2C6H5; R2=NH2(7) R1=C6H5; R2=NH2(8) R1=CH2C6H5; R2=OCH3

O

O

NH2

(9)

O

HN

R1 R2

R3

H2N

(10) R1=R2=R3=H(11) R1=COOCH3; R2=R3=H(12) R1=H; R2= COOCH3; R3=H(13) R1=R2=H; R3=COOCH3

O

HN

H2N

(14)

O

HN

H2N O

(15) R1=CH3

(16) R1=CF3

O

R

Aminopeptidades das sementes de girassol foram empregadas com sucesso na

resolução de misturas racêmicas de amidas e aminoácidos, mostrando-se eficiência

catalítica e alta enantiosseletividade para o isômero S (TISHINOV et al., 2009).

O uso das sementes de Helianthus annuus L. em biorredução ainda não foi

relatado na literatura, possibilitando com que este trabalho seja um promissor processo

investigativo da atuação dessa classe de enzimas presentes neste material em processos

biocatalíticos.

45

RESULTADOS E

DISCUSSÕES

46

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Obtenção dos alcoóis padrões por via química

Os alcoóis padrões das respectivas cetonas pró-quirais utilizadas nos processo de

biorredução, foram obtidos por via química utilizando NaBH4/MeOH conforme Figura

11 e metodologia descrita no item 5.4.2 (p. 109). Os alcoóis 1a-15a (Tabela 2) foram

obtidos em bons rendimentos após purificação por cromatografia em coluna, sendo em

seguida analisados por RMN ¹H para a confirmação de suas estruturas (anexo). A

finalidade desta etapa foi a obtenção de padrões para a construção de curvas de

calibração e comparação com os produtos das biorreduções.

Figura 11: Esquema da reação de redução das cetonas pró-quirais por via química.

Tabela 2: Rendimentos da obtenção dos alcoóis padrões 1a-15a

Álcool padrão Rendimento (%)

(±)-1-feniletanol (1a) 89,8

(±) 1-(4-bromofenil)-etanol (2a) 89,7

(±) 1-(4-fluorfenil)-etanol (3a) 86,0

(±) 1-(4-clorofenil)-etanol (4a) 88,5

(±) 1-(4-metóxifenil)-etanol (5a) 79,9

(±) 1-(4-metilfenil)-etanol (6a) 81,4




(±) 1-(2-clorofenil)-etanol (10a) 83,4


(±) 1-(2-hidróxifenil)-etanol (12a) 72,5

(±)-2,2,2-trifluor-feniletanol (13a) 92,0

(±)-α-tetralol (14a) 61,3

(±)-α-indanol (15a) 70,0

R

O

R'

NaBH4

R

OH

R'MeOH

47

4.2 Curvas de calibração dos substratos

As análises do teor de conversão dos substratos 1-15 (cetonas) utilizados nas

reações de biorredução foram realizadas por intermédio de curvas de calibração. Os

respectivos padrões foram injetados em equipamento de Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE) e as curvas elaboradas em programa Origin 7.0. A obtenção das

curvas tanto do substrato, cetona, quanto do produto, álcool, fez-se necessária para

minimizar os erros de quantificação da conversão. As estruturas dos substratos

utilizados estão listadas na Tabela 3, bem como dos respectivos produtos.

Tabela 3: Substratos e produtos utilizados na obtenção das curvas de calibração para

análise do teor de conversão nas reações de biorredução.

SUBSTRATO PRODUTO

acetofenona (1)

(±)-1-feniletanol (1a)

4-bromo-acetofenona (2)

(±) 1-(4-bromofenil)-etanol (2a)

4-fluoro-acetofenona (3)

(±) 1-(4-fluorofenil)-etanol (3a)

4-cloro-acetofenona (4)

(±) 1-(4-clorofenil)-etanol (4a)

4-metóxi-acetofenona (5)

(±) 1-(4-metóxifenil)-etanol (5a)

OHO

O

Br

OH

Br

O

F

OH

F

O

Cl

OH

Cl

OH

H3CO

O

H3CO

48

4-metil-acetofenona (6)

(±) 1-(4-metilfenil)-etanol (6a)







2-cloro-acetofenona (10)

(±) 1-(2-clorofenil)-etanol (10a)



2-hidróxi-acetofenona (12)

(±) 1-(2-hidróxifenil)-etanol (12a)

O

H3C

OH

H3C

O

Br

OH

Br

O

OCH3

OH

OCH3

OH

Br

O

Br

O

Cl

OH

Cl

OH

OCH3

O

OCH3

O

OH

OH

OH

49

2,2,2-trifluor-acetofenona (13)

(±)-2,2,2-trifluor-feniletanol (13a)

α-tetralona (14)

(±)-α-tetralol (14a)

α-indanona (15)

(±)-α-indanol (15a)

A seguir são apresentadas as respectivas curvas de calibração para as cetonas

utilizadas no procedimento experimental e para os alcoóis obtidos (Gráficos 1-28, p. 49-

54). Os gráficos foram plotados em função das concentrações versus área, obtendo-se os

respectivos valores de “R” e equação da reta para cada composto.

4.2.1 Acetofenona e (±)-1-feniletanol

20 40 60 80 100

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

Absorbância

Concentraçمo em ppm

0 10 20 30 40 50

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

Absorbância


R = 0,99949

OH

CF3

OH

CF3

O

O OH

O OH

R = 0,99826

O

Áre

a Áre

a

Gráfico 2: Curva de calibração do (±)

1-feniletanol. Gráfico 1: Curva de calibração da

acetofenona.

50

4.2.2 4-bromo-acetofenona e (±) 1-(4-bromofenil)-etanol

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

Absorbância


0 20 40 60 80 100

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

Absorbância


4.2.3 4-fluoro-acetofenona e (±) 1-(4-fluorofenil)-etanol

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Absorbância


20 40 60 80 100

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

Absorbância


4.2.4 4-cloro-acetofenona e (±) 1-(4-clorofenil)-etanol

0 20 40 60 80 100

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Absorbância


0 20 40 60 80 100

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Absorbância


R = 0,99962

O

Br

R = 0,99987

OH

Br

F

O

R = 0,99915

OH

F

R = 0,99947

O

Cl

OH

Cl

R = 0,99997 R = 0,99993

Áre

a

Áre

a

Áre

a

Áre

a Á

rea

Áre

a

Gráfico 3: Curva de calibração da 4-

bromo-acetofenona.


1-(4-bromofenil)-etanol.


fluoro-acetofenona.


1-(4-fluorofenil)-etanol.


cloro-acetofenona.

Gráfico 8: Curva de calibração do (±) 1-

(4-clorofenil)-etanol.

51

4.2.5 4-metóxi-acetofenona e (±) 1-(4-metóxifenil)-etanol

0 20 40 60 80 100

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

Absorbância


0 20 40 60 80 100

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

Absorbância


4.2.6 4-metil-acetofenona e (±) 1-(4-metilfenil)-etanol

0 20 40 60 80 100

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

Absorbância


0 20 40 60 80 100

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Absorbância



0 20 40 60 80 100

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

Absorbância


0 20 40 60 80 100

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

Absorbância


O

H3CO

OH

H3CO

R = 0,99983 R = 0,99984

O

Br

R = 0,99954 R = 0,99975

OH

Br

O

H3C

OH

H3C

R = 0,99982 R = 0,99977

Áre

a

Áre

a

Áre

a

Áre

a

Áre

a

Áre

a


metóxi-acetofenona. Gráfico 10: Curva de calibração do (±)

1-(4-metóxifenil)-etanol.


metil-acetofenona.


1-(4-metilfenil)-etanol.


bromo-acetofenona.

Gráfico 14: Curva de calibração do

(±)3-bromo-feniletanol.

52

4.2.8 3-metóxi-acetofena e (±) 1-(3-metóxifenil)-etanol

0 20 40 60 80 100

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

Absorbância


0 20 40 60 80 100

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

Absorbância



0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

Ab

sorb

ân

cia

Concentração em ppm

0 20 40 60 80 100

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Ab

sorb

ân

cia


4.2.10 2-cloro-acetofenona e (±) 1-(2-clorofenil)-etanol

0 20 40 60 80 100

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Abso

rbânci

a


0 20 40 60 80 100

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

Abso

rbânci

a


O

Br

OH

Br

R = 0,9985 R = 0,99985

O

Cl

OH

Cl

R = 0,99966 R = 0,99916

O

OCH3

OH

OCH3

R = 0,99982 R = 0,99996

Áre

a

Áre

a

Áre

a

Áre

a

Áre

a

Áre

a


metóxi-acetofenona.




bromo-acetofenona.


1-(2-bromofenil)-etanol.


1-(2-clorofenil)-etanol.


cloro-acetofenona.

53

4.2.11 2-metóxi-acetofenona e (±) 1-(2-metóxifenil)-etanol

0 20 40 60 80 100

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

Absorbância


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

Absorbância


4.2.12 2,2,2-trifluoro-acetofenona e (±)-2,2,2-trifluoro-feniletanol

20ppm 40ppm 60ppm 80ppm 100ppm

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Absorbância


0 20 40 60 80 100

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Absorbância


4.2.13 α-tetralona e (±)-α-tetralol

0 20 40 60 80 100

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

Absorbância


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

18000000

Absorbância


R = 0,99953

O

R = 0,99978

OH

CF3

O

CF3

OH

R = 0,99993 R = 0,9968

O

OCH3

OH

OCH3

R = 0,99946 R = 0,99858

Áre

a

Áre

a

Áre

a Áre

a

Áre

a

Áre

a


metóxi-acetofenona.



Gráfico 23: Curva de calibração da

2,2,2-trifluoro-acetofenona.


2,2,2-trifluoro-feniletanol.

Gráfico 25: Curva de calibração da α-

tetralona.


(±)-α-tetralol.

54

4.2.14 α-indanona e (±)-α-indanol

0 20 40 60 80 100

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

Ab

sorb

ân

cia


0 20 40 60 80 100

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

18000000

Ab

sorb

ân

cia


4.3 Determinação do teor de proteínas das sementes de Helianthus annuus L.

A determinação do teor de proteínas das sementes de Helianthus annuus L. foi

realizada como estudo inicial para avaliar o seu possível potencial como fonte

biocatalítica em reações de biorredução. A medida do teor de proteínas serve de

estimativa da concentração de enzimas do material vegetal.

Vários métodos são encontrados na literatura relacionados com determinação da

concentração de proteínas, tais como: métodos do Biureto, de Lowry, de Bradford, entre

outros. Todos esses métodos baseiam-se na obtenção de compostos coloridos através da

reação de grupos presentes na molécula da proteína e substâncias específicas (MIWA,

2003).

No presente trabalho foram utilizados os métodos de determinação de proteínas

proposto por Lowry (modificado por Hartree, 1972), que determina a concentração de

proteínas solúveis e o proposto por Bradford. Estes métodos apresentam como principal

vantagem a alta sensibilidade (LUCARINI; KILIKIAN, 1999).

4.3.1 Método de Lowry (modificado por Hartree)

A determinação de proteínas proposta por Lowry (modificada por Hartree, 1972)

foi realizada no extrato aquoso da semente de Helianthus annuus L. O método consiste

na reação da proteína com íon cobre (II) em solução alcalina (reação do biureto) o que

resulta em uma coloração azul (Figura 12, p. 55).

O OH

R = 0,99975 R = 0,99972

Áre

a

Áre

a

Gráfico 27: Curva de calibração da α-

indanona.

Gráfico 28: Curva de calibração do α-

indanol.

55

Figura 12: Detalhe da reação do extrato enzimático das sementes de Helianthus annuus

L. com o íon cobre (II).

A utilização de reagente Folin-Ciocalteau, constituído de uma mistura de ácidos

fosfomolibdato-fosfotungstico (3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O e

3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O) é necessária para ampliar o sinal do Biureto, onde a

redução do reagente em questão com proteínas na presença de cobre em solução

alcalina, produz um complexo de coloração azul, como mostrado na Figura 13 (MIWA,

2003; OKUTUCU et al., 2007).

Figura 13: Detalhe da reação do extrato enzimático das sementes de Helianthus annuus

L. com o reagente de Folin-Ciocalteau.

O extrato aquoso das sementes de Helianthus annuus L. apresentou um teor de

proteínas bastante considerável, 10,1g/L, mostrando-se como uma fonte promissora de

enzimas, possibilitando sua utilização em processos biocatalíticos.

56

4.3.2 Método de Bradford

O método para determinação de proteínas totais de Bradford (1976) em

comparação com Lowry (modificada por Hartree, 1972) é mais sensível, mais rápido e

está sujeito a um número menor de interferentes, destaca Zaia et al. (1998).

O processo consiste na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de

proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas, como por

exemplo, arginina e histidina (Figura 14). No pH de reação, a interação entre a proteína

de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do

corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm (LUCARINI;

KILIKIAN, 1999; ZAIA et al., 1998).

A utilização do reagente de Bradford contendo o corante BG-250 modifica

instantaneamente o extrato enzimático a ser analisado, no caso o extrato aquoso das

sementes de Helianthus annuus L. como detalhado na Figura 14 .

Figura 14: Detalhe do método de Bradford para determinação de proteínas após a

adição do reagente Coomassie Brilliant Blue G-250.

Através deste método obteve-se um teor de proteínas de 8,8g/L. O resultado

apresentado, inferior em comparação com o obtido por Lowry, pode ser justificado pela

possível presença de enzimas com tamanhos pequenos, já que a interação com o

reagente de Coomassie Brilliant Blue G-250 não foi tão sensível, bem como a presença

resíduos de aminoácidos não aromáticos e não básicos nas enzimas presentes no extrato

57

aquoso das sementes de Helianthus annuus L. O Gráfico 29 apresenta o estudo

comparativo das metodologias de determinação de proteínas solúveis totais do material

vegetal em estudo.

Gráfico 29: Estudo comparativo das metodologias de Lowry e Bradford para a

determinação de proteínas solúveis totais

Os resultados apresentados pelo extrato aquoso das sementes de Helianthus

annuus L. foram bastante consideráveis, revelando uma promissora potencialidade deste

material como fonte biocatalítica.

4.4 Processos biocatalíticos

As sementes de Helianthus annuus L., mostradas em detalhe na Figura 8 (p. 41),

foram submetidas a reações de biorredução para avaliar seu potencial catalítico tendo

como substrato modelo, a acetofenona (1) (Figura 15, p. 58). Foram realizados

processos em diferentes condições reacionais buscando melhores conversões e excessos

enantioméricos (ee) através da variação de condições como: quantidade de

biocatalisador, co-solvente, meio tamponante (pH), obtenção do extrato bruto e

germinação de sementes. Os resultados obtidos foram apresentados e discutidos nos

itens a seguir.

8 8,5 9 9,5 10 10,5

Determinação de proteínas totais

g/L

Bradford

Lowry

58

Figura 15: Esquema da reação de redução da acetofenona por via enzimática.

O

Sementes

Helianthus annuus L.

OH

11a

4.4.1 Quantidade de biocatalisador

Inicialmente a quantidade de material vegetal (biocatalisador) foi investigada

para verificação do potencial biocatalítico frente à reação de biorredução da acetofenona

(1). O material vegetal foi previamente submetido à assepsia, utilizando-se solução de

hipoclorito de sódio (5%), em seguida lavado com água destilada e seco. Em cada

experimento utilizou-se 50 mg de substrato (1), 50 mL de água de destilada e a

quantidade de catalisador variou entre 5 e 20 g de sementes de Helianthus annuus L. As

reações foram realizadas sob agitação de 175 r.p.m., a temperatura ambiente e com 72

horas de tempo reacional. Os resultados de bioconversão, apresentados na Tabela 4,

mostraram-se moderados, sendo quase nulo quando utilizado 5 g de biocatalisador,

como mostra o Gráfico 30 (p. 60). Entretanto, os valores de excesso enantiomérico

obtidos apresentaram-se entre 88,0->99,0%, do enantiômero (S), conforme apresentado

no Gráfico 31 (p. 60). As Figuras 16-18 (p. 59) apresentam os cromatogramas obtidos

para cada análise realizada.

Tabela 4: Resultados de biorredução da acetofenona utilizando 5 g, 10 g e 20 g de

sementes Helianthus annuus L.

Sementes de

Helianthus annuus L. Conversão (%) ee (%)

5 g 0,9 > 99,0 (S)

10 g 56,9 92,3 (S)

20 g 40,7 88,0 (S)

ee – Excesso enantiomérico

59

Figura 16: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 5 g de

sementes de Helianthus annuus L.





OH

O

OH

OH

O

OH

O

OH

60

A partir destas análises de biorredução da acetofenona (1) os demais parâmetros

verificados (co-solvente, meio tamponante (pH), extrato bruto enzimático e germinação

das sementes) foram estudados com 10 g de biocatalisador, visto que com essa

quantidade foram obtidos os melhores resultados de bioconversão e excesso

enantiomérico.

4.4.2 Co-solvente: Isopropanol

A classe de enzimas denominadas oxirredutases responsáveis pela

biotransformação da acetofenona (1) no respectivo álcool (1a) são dependentes de um

cofator (NAD+/NADH ou NADP

+/NADPH) para que possam desenvolver seus

processos adequadamente. Cofatores são pequenas substâncias que na sua ausência

provocam a inativação da enzima. O isopropanol atua no meio reacional reciclando o

cofator e concomitantemente, aumentando a solubilidade do substrato da reação

principal em água, facilitando a interação substrato enzima (BON et al., 2008). Nesse

contexto foram testados meios reacionais com diferentes proporções de isopropanol

(1%, 2%, 5% e 10%), para observação do comportamento da enzima visando obtenção

de melhores resultados de conversão e excessos enantioméricos. Os resultados

encontram-se na Tabela 5 (p. 61), bem como os cromatogramas das análises realizadas

para as biorreduções com o uso de co-solvente nas proporções estudadas apresentados

nas Figuras 19, 20 (p. 61), 21 e 22 (p. 62).

0

10

20

30

40

50

60

5g 10g 20g

Conversão: Quantidade de biocatalisador

Gráfico 30: Perfil de conversão da biorredução

da acetofenona utilizando diferentes

proporções de biocatalisador.

80

85

90

95

100

5g 10g 20g

Excesso enantiomérico: Quantidade de …

Gráfico 31: Perfil do excesso enantiomérico

da biorredução da acetofenona utilizando

diferentes proporções de biocatalisador.

61

Tabela 5: Resultados de biorredução da acetofenona com sementes de Helianthus

annuus L. utilizando isopropanol como co-solvente.

Co-solvente Conversão (%) ee (%)

iPrOH 1% 16,2 89,0 (S)

iPrOH 2% 19,8 90,7 (S)

iPrOH 5% 20,2 92,7 (S)

iPrOH 10% 12,0 88,2 (S)

iPrOH - Isopropanol


Figura 19: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 1% de

isopropanol.


isopropanol.

OH

O

OH

OH

O

OH

62


isopropanol.


isopropanol.

Os Gráficos 32 e 33 (p. 63) mostram o perfil de atuação do complexo enzimático

das sementes de Helianthus annuus L. utilizando o isopropanol como co-solvente.

OH

O

OH

OH

O

OH

63

A utilização de isopropanol como co-solvente não possibilitou a melhoria da

conversão, pelo contrário, provocou drástico decréscimo. Entretanto, os valores de

excesso enantiomérico obtidos em todos os ensaios mostraram semelhantes aos obtidos

sem co-solvente, resultando como majoritário o enantiômero (S). Os melhores

resultados para a otimização com este parâmetro foram obtidos quando utilizou-se uma

proporção (v/v) de 5% de isopropanol.

4.4.3 Meio tamponante: tampão fosfato

As reações de biorredução da acetofenona (1), utilizando as sementes de

Helianthus annuus L., também foram avaliadas em meios tamponantes para verificação

da influência do pH na atuação da enzima, buscando melhores valores de conversão e

ee. Foram testadas soluções tampões fostato com os respectivos valores de pH 6,0, 7,0,

e 8,0. A Tabela 6 (p. 64) a seguir mostra os resultados obtidos nos ensaios. Os

cromatogramas das análises das reações apresentam-se nas Figuras 23, 24 (p. 64) e 25

(p. 65). Os Gráficos 34 e 35 (p. 65) mostram o perfil de conversão e do excesso

enantiomérico obtidos por esta metodologia.


da acetofenona utilizando diferentes

proporções de co-solvente: isopropanol.



diferentes proporções de co-solvente:

isopropanol.

0

5

10

15

20

25

1% 2% 5% 10%

Conversão: Co-solvente (Isopropanol)

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

1% 2% 5% 10%

Excesso enantiomérico: Co-solvente (Isopropanol)

64


annuus L. utilizando diferentes soluções tampão.

pH Conversão (%) ee (%)

6,0 8,4 84,8 (S)

7,0 4,1 48,6 (S)

8,0 17,3 43,4 (S)


Figura 23: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando solução

tampão pH 6,0.


tampão pH 7,0.

OH

O

OH

OH

O

OH

65


tampão pH 8,0.

4.4.4 Extrato enzimático bruto segundo Lupetti (2000)

A metodologia de Lupetti (2000) foi adotada para esse procedimento, porém,

com modificações. Triturou-se 10 g de sementes de Helianthus annuus L. e

acrescentou-se 1 g de polivinilpirrolidona (PVP), juntamente com 50 mL de solução

tampão fosfato pH 6,5. À mistura resultante foi adicionado 50 mg de substrato (1). A

reação foi processada em duplicata com velocidade de agitação de 175 r.p.m. e tempo

de 72 horas. Excelente valor de excesso enatiomérico, para o enantiômero (S), foi obtido

como mostra o cromatograma da Figura 26 (p. 66) e, em detalhe na Tabela 7 (p. 66). O

OH

O

OH

0

5

10

15

20

6,0 7,0 8,0

Conversão: Tampão fosfato


da acetofenona utilizando soluções tampão

com diferentes valores de pH.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

6,0 7,0 8,0

Excesso enantiomérico: Tampão fosfato



soluções tampão com diferentes valores de pH.

66

valor de conversão obtido, entretanto, foi inferior a outros obtidos com outras

metodologias realizadas anteriormente.


annuus L. utilizando extrato bruto enzimático com PVP.

Extrato enzimático bruto

com PVP Conversão (%) ee (%)

Gpvp 21,0 >99,0 (S)


Figura 26: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando extrato

bruto enzimático com PVP.

]

Segundo Zeraik et al. (2008), o papel do polímero é agir como um protetor,

removendo compostos fenólicos naturais dos extratos enzimáticos, evitando oxidações

pelas enzimas peroxidases, entretanto o objetivo da reação não foi a utilização desta

classe de enzimas, mas o excelente resultado para o excesso enantiomérico obtido fez-se

com que esta metodologia, fosse testada também com os derivados da acetofenona 4-

bromo-acetofenona (2), 4-fluoro-acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-

acetofenona (5), 4-metil-acetofenona (6), 3-bromo-acetofenona (7), 3-metóxi-

acetofenona (8), 2-bromo-acetofenona (9), 2-cloro-acetofenona (10), 2-metóxi-

acetofenona (11) e 2-hidróxi-acetofenona (12) foram submetidos as reações com as

sementes de Helianthus annuus L. Uma cetona α-halogenada, 2,2,2-trifluoro-

acetofenona (13), bem como duas outras cetonas aromáticas, α-tetralona (14) e α-

OH

O

67

indanona (15), também foram testadas para corroboração deste resultado. Zeraik et al.

(2008) salientam, ainda, que o bom desempenho deste agente protetor é atribuído à sua

baixa solubilidade em meio aquoso e à formação de ligação de hidrogênio entre os

substratos naturais e o polímero PVP. A Figura 27, a seguir, mostra a estrutura da

polivinilpirrolidona.

Figura 27: Estrutura monomérica do polímero PVP.

N O

*

* n

4.4.5 Germinação das sementes de Helianthus annuus L.

Segundo Beckert et al., (2000) a germinação pode ser definida como uma série

de processos metabólicos e morfogenéticos, que se inicia com a absorção de água pela

semente seca e quiescente, seguida da síntese e ativação de várias enzimas. Com essa

perspectiva buscou-se a otimização no processo de biorredução da acetofenona (1) com

sementes de Helianthus annuus L. germinadas. A germinação ocorreu em um período

máximo de 120 horas, onde as sementes foram deixadas em meio úmido até a abertura

dos cotilédones e surgimento das primeiras porções de raiz. As sementes foram

trituradas e, sob as mesmas condições reacionais descritas na metodologia 5.4.1.5 (p.

108), apresentaram baixos valores de conversão e bons resultados de excesso

enantiomérico, conforme a Tabela 8 mostrada a seguir, bem como o cromatograma na

Figura 28 (p. 68).

Tabela 8: Resultados de biorredução da acetofenona com sementes germinadas de


Sementes germinadas de


Conversão (%) ee (%)

28,7 83,8 (S)


68

Figura 28: Cromatograma do produto de biorredução da acetofenona utilizando

sementes germinadas de Helianthus annuus L.

O processo de germinação não possibilitou uma melhoria no teor de conversão,

obtendo-se valor inferior (28,7%) ao resultado em meio aquoso. O excesso

enantiomérico apresentou valor considerável de 83,8% para o isômero S, entretanto,

melhor resultado foi obtido anteriormente, no caso, utilizando o extrato bruto

enzimático com PVP de >99,0%.

4.4.6 Reações de biotransformação utilizando derivados da acetofenona

Após a obtenção dos resultados de otimização para a acetofenona (1) utilizando

sementes de Helianthus annuus L., procedeu-se as biotransformações com alguns de

seus derivados: 4-bromo-acetofenona (2), 4-fluoro-acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona

(4), 4-metóxi-acetofenona (5), 4-metil-acetofenona (6), 3-bromo-acetofenona (7), 3-

metóxi-acetofenona (8), 2-bromo-acetofenona (9), 2-cloro-acetofenona (10), 2-metóxi-

acetofenona (11) e 2-hidróxi-acetofenona (12). Testou-se, ainda, uma cetona α-

halogenada, 2,2,2-trifluoro-acetofenona (13), e duas outras cetonas aromáticas, α-

tetralona (14) e α-indanona (15). As estruturas dos substratos encontram-se na Figura 29

(p. 69).

OH

O

OH

69

Figura 29: Cetonas aromáticas selecionadas para a reação com as sementes de


O

Br

O

F

O

Cl

O

H3CO

O

H3C

O

Br

O

OCH3

O

Br

O

OCH3

O

Cl

O

OH

O

CF3

O O

(2) (3) (4) (5)

(9)

(8)(7)

(6)

(10)

(13)

(11)

(14)

(12)

(15)

O melhor resultado de bioconversão da acetofenona foi verificado com a

utilização de 10g de sementes de Helianthus annuus L. em meio aquoso (G10), 56,9%,

enquanto o melhor excesso enantiomérico foi encontrado quando utilizou-se o extrato

bruto enzimático com PVP (Gpvp), >99,0%. Baseando-se nesses resultados procedeu-

se as biotransformações das cetonas acima listadas utilizando ambas as metodologias.

Os resultados obtidos foram discutidos para os derivados em função do grupamento

substituinte nas diferentes posições do anel aromático (-para, -meta e -orto), e das

demais em função de suas particularidades, como descrito nos tópicos a seguir.

70

4.4.6.1 Cetonas -para substituídas

Observou-se, inicialmente, o efeito de grupos substituintes na posição -para da

acetofenona (1) através da biotransformação dos derivados 4-bromo-acetofenona (2), 4-

fluoro-acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-acetofenona (5) e 4-metil-

acetofenona (6), analisando-se a conversão e o excesso enantiomérico, por intermédio

de curvas de calibração já apresentadas neste capítulo (p. 49-54). Os produtos

esperados para a biorredução das acetofenonas –para substituídas encontram-se na

Figura 30 para as metodologia G10 e Gpvp.

Figura 30: Produtos esperados da reação das cetonas -para substituídas utilizando as

metodologias G10 e Gpvp.

O

R1

(2) R = Br

(3) R = F

(4) R = Cl

(5) R = OCH3

(6) R = CH3

OH

R1

(2a) R = Br

(3a) R = F

(4a) R = Cl

(5a) R = OCH3

(6a) R = CH3

G10 e Gpvp

As reações com o derivado 4-bromo-acetofenona (2) apresentaram ótimos

valores de excesso enantiomérico para as duas metodologias utilizadas, entretanto, os

valores de conversão foram baixos, inclusive quando se utilizou a metodologia de

melhor conversão para a acetofenona (1), como mostra a Tabela 9 (p. 71). As Figuras 31

e 32 (p. 71) apresentam os cromatogramas dos produtos da bioconversão deste derivado

em meio aquoso (G10) e em extrato bruto enzimático (Gpvp), respectivamente. O

Gráfico 36 (p. 72) apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas

metodologias para o derivado em questão.

71

Tabela 9: Resultados da biotransformação da 4-bromo-acetofenona com sementes de

Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.

Sementes de Helianthus annuus L.

4-bromo-acetofenona Conversão (%) ee (%)

G10 17,5 98,1 (S)

Gpvp 17,5 85,0 (S)


Figura 31: Cromatograma do produto da biorredução da 4-bromo-acetofenona

utilizando a metodologia G10.


utilizando a metodologia Gpvp

.

O

Br

OH

Br

O

Br

OH

Br

72

Gráfico 36: Perfil de biotransformação da 4-bromo-acetofenona utilizando as


Utilizando-se o derivado 4-fluoro-acetofenona (3), obtiveram-se baixos valores

de conversão em comparação com a cetona não substituída (1) (Tabela 10), entretanto,

ótimos valores de ee foram observados de acordo com os cromatogramas das Figuras 33

e 34 (p. 73), em ambas as metodologias. O perfil do ensaio biocatalítico utilizando as

duas metodologias para o derivado em questão está representado pelo Gráfico 37 (p.

73).

Tabela 10: Resultados da biotransformação da 4-fluoro-acetofenona com sementes de



4-fluoro-acetofenona Conversão (%) ee (%)

G10 8,4 92,0 (S)

Gpvp 9,8 90,2 (S)


17,5

98,1

17,5

85,0

0

20

40

60

80

100

120

Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)

4-b

rom

o-a

ceto

fen

on

a

G10

Gpvp

73

Figura 33: Cromatograma do produto da biorredução da 4-fluoro-acetofenona


Figura 34: Cromatograma do produto da biorredução da 4-fluoro-acetofenona

utilizando a metodologia Gpvp.

Gráfico 37: Perfil de biotransformação da 4-fluoro-acetofenona utilizando as


8,4

92,0

9,8

90,2

0

20

40

60

80

100


4-f

luo

r-ac

eto

fen

on

a G10

Gpvp

O

F

OH

F

O

F

OH

F

74

O derivado 4-cloro-acetofenona apresentou resultados não esperados em relação

ao contexto já relatado, pois a metodologia que apresentou melhor conversão foi aquela

com o polímero PVP (Gpvp). Os valores de conversão para este substrato em

comparação com a acetofenona (1) foram consideráveis em ambas as metodologias,

destacando-se 58,5% para Gpvp (Figura 36, p. 75) e 29,6% para G10 (Figura 35),

apresentando excessos enantioméricos de 91,0% e 65,0%, respectivamente, para o

isômero S (Tabela 11). O Gráfico 38 (p. 75) apresenta o perfil do ensaio biocatalítico

utilizando as duas metodologias para o derivado 4-cloro-acetofenona.

Tabela 11: Resultados da biotransformação da 4-cloro-acetofenona com sementes de



4-cloro-acetofenona Conversão (%) ee (%)

G10 29,6 65,0 (S)

Gpvp 58,5 91,0 (S)


Figura 35: Cromatograma do produto da biorredução da 4-cloro-acetofenona utilizando

a metodologia G10.

OH

Cl

O

Cl

75


a metodologia Gpvp.

Gráfico 38: Perfil de biotransformação da 4-cloro-acetofenona utilizando as


Avaliando o derivado 4-metóxi-acetofenona (5) na biorredução utilizando as

sementes de Helianthus annuus L. obteve-se bons resultados de excesso enantiomérico,

ressaltando-se >99,0% para o isômero (S) (Tabela 12, p. 76), utilizando metodologia

Gpvp, corroborando com os resultados obtidos com a acetofenona (1). Em relação os

valores de conversão, pouco satisfatórios, a metodologia que apresentou melhor

resultado foi Gpvp com 21,5%. Em contrapartida a metodologia G10 apresentou um

pobre valor de conversão 7,2% (Figuras 37 e 38, p. 76). Avalia-se nessas condições que

para biotransformação do derivado 4-metóxi-acetofenona (5), a utilização do meio

reacional Gpvp para obtenção do produto enantiomericamente puro é mais favorável. O


metodologias para o derivado em questão.

29,6

65,0 58,5

91,0

0

20

40

60

80

100


4-c

loro

-ace

tofe

no

na

G10

Gpvp

OH

Cl

O

Cl

76

Tabela 12: Resultados da biotransformação da 4-metóxi-acetofenona com sementes de



4-metóxi-acetofenona Conversão (%) ee (%)

G10 7,2 82,0 (S)

Gpvp 21,5 >99,0 (S)


Figura 37: Cromatograma do produto da biorredução da 4-metóxi-acetofenona




O

H3CO

O

H3COOH

H3CO

OH

H3CO

77

Gráfico 39: Perfil de biotransformação da 4-metóxi-acetofenona utilizando as


Avaliou-se o desempenho do complexo enzimático das sementes de Helianthus

annuus L. utilizando um derivado com substituinte alquila, doador de elétrons por

indução, 4-metil-acetofenona, para comparação de resultados com a cetona não

substituída (1) (Tabela 13). Os valores de conversão apresentaram-se pouco

satisfatórios, obtendo-se 12,7% e 30,3%, utilizando-se G10 (Figura 39, p. 78) e Gpvp

(Figura 40, p. 78), respectivamente. Por outro lado, ótimos valores de excesso

enantiomérico foram encontrados sendo 82,0% para G10 e >99% para Gpvp.

Tabela 13: Resultados da biotransformação da 4-metil-acetofenona com sementes de



4-metil-acetofenona Conversão (%) ee (%)

G10 12,7 82,4 (S)

Gpvp 30,3 >99,0 (S)


7,2

82,0

21,5

> 99,0

0

20

40

60

80

100

120


4-m

etó

xi-a

ceto

fen

on

a G10

Gpvp

78

Figura 39: Cromatograma do produto da biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando

a metodologia G10.

Figura 40: Cromatograma do produto da biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando

a metodologia Gpvp.

O cromatograma da análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE) da 4-metil-acetofenona apresentou um pico com tempo de retenção diferente

dos padrões anteriormente injetados para a metodologia Gpvp, evidenciando a formação

de um produto não esperado, entretanto foi realizada a análise em Cromatográfo Gasoso

acoplado a Espectrômetro de Massa (CG/EM) para confirmação da estrutura do produto

formado. O cromatograma CG/EM do produto reacional se encontra na Figura 41 (p.

79), bem como nas Figuras 42 e 43 (p. 79) os espectros de massa.

OH

H3C

OH

H3C

O

H3C

O

H3C

79

Figura 41: Cromatograma CG/EM do produto da biorredução da 4-metil-acetofenona


Figura 42: Espectro de massa do 4-metil-feniletanol.

Figura 43: Espectro de massa da 4-metil-acetofenona.

O grupamento metila na posição -para do anel aromático da acetofenona

interfere diretamente nos valores de conversão, em contrapartida os valores de excesso

enantiomérico se mantiveram em bons patamares, demonstrando que o complexo

enzimático do material em questão atua com alta estereosseletividade. O Gráfico 40

OH

H3C

O

H3C

OH

H3C

O

H3C

80

apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o

derivado em questão.

Gráfico 40: Perfil de biotransformação da 4-metil-acetofenona utilizando as


Os excessos enantioméricos dos substratos estudados apresentaram-se como

valores aproximados daqueles obtidos com acetofenona (1), mostrando que a adição

desses grupamentos na posição -para não interferem no acoplamento enzima-substrato,

sendo produzido apenas o enantiômero de configuração S.

4.4.6.2 Cetonas -meta substituídas

A redução de derivados da acetofenona -meta substituídos também foi avaliada,

no caso, a 3-bromo-acetofenona (7) e a 3-metóxi-acetofenona (8). A Figura 44 (p. 81)

apresenta os produtos esperados dos derivados em questão para as metodologias G10 e

Gpvp, respectivamente.

12,7

82,4

30,3

> 99,0

0

20

40

60

80

100

120


4-m

eti

l-ac

eto

fen

on

a G10

Gpvp

81

Figura 44: Produtos esperados da reação das cetonas -meta substituídas utilizando as


O

(7) R = Br

(8) R = OCH3

OH

(7a) R = Br

(8a) R = OCH3

G10 e Gpvp

R R

O derivado 3-bromo-acetofenona (7) apresentou baixos valores de conversão

tanto para metodologia G10, quanto para a metodologia Gpvp, 11,8% e 11,7%,

respectivamente. Por outro lado os valores de excessos enantioméricos encontrados

foram ótimos, sendo 85,5% (G10) e >99,0% (Gpvp) (Tabela 14) como apresentado nos

cromatogramas das Figuras 45 (G10) e 46 (Gpvp) (p. 82), respectivamente. O Gráfico

41 (p. 82) apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para

o derivado em questão.





G10 11,8 85,5 (S)

Gpvp 11,7 >99,0 (S)


82







11,8

85,5

11,7

> 99,0

0

20

40

60

80

100

120


3-b

rom

o-a

ceto

fen

on

a

G10

Gpvp

O

BrOH

Br

O

Br

OH

Br

83

A 3-metóxi-acetofenona (8) foi reduzida ao correspondente álcool com

excelentes excessos enantioméricos >99,0% (Tabela 15) em ambas as metodologias

utilizadas. Ressalta-se a obtenção do isômero R utilizando a metodologia G10, fato

ainda não encontrado nesses estudos de biorredução. Diante deste resultado conclui-se

que a presença do grupo metoxila na posição -meta interfere na estereosseletividade das

oxirredutases presentes no complexo enzimático de Helianthus annuus L. Nesse

contexto, sugere-se que novos experimentos sejam feitos, utilizando-se outros tipos de

cetonas aromáticas, com este substituinte. Destaca-se também o fato das conversões

terem apresentado razoáveis valores, 31,4% (G10) e 25,3% (Gpvp), como mostrado nos

cromatogramas das Figuras 47 e 48 (p. 84). O Gráfico 42 (p. 84 ) apresenta o perfil do

ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o derivado em questão.





G10 31,0 >99,0 (R)

Gpvp 25,3 >99,0 (S)




OH

OCH3

O

OCH3

84





Os valores de conversão para os derivados em questão mostraram-se baixos, em

relação à cetona não substituída (1). Uma justificativa para tal fato deve ser o

impedimento estérico do grupo substituinte dificultando o acoplamento enzima-

substrato. Entretanto a classe de enzimas, oxirredutases, das sementes de Helianthus

annuus L. demonstraram alta estereosseletividade frente aos derivados –meta para a

metodologia Gpvp, formando o isômero S, com exceção para o derivado 3-metóxi-

acetofenona (8) utilizando a metodologia G10, com a formação do isômero R.

31,0

> 99,0

25,3

> 99,0

0

20

40

60

80

100

120


3-m

etó

xi-a

ceto

fen

on

a

G10

Gpvp

OH

OCH3

O

OCH3

85

4.4.6.3 Cetonas -orto substituídas

Acetofenonas, –orto substituídas, (9), (10), (11) e (12), também foram

investigadas nos processos de biorredução. A presença do grupamento nesta posição do

anel aromático da correspondente cetona pode atuar impedindo o acoplamento eficaz

com a enzima, diminuindo os valores de conversão. A Figura 49 apresenta os produtos

esperados pelas metodologias G10 e Gpvp, respectivamente, para as cetonas –orto

substituídas.

Figura 49: Produtos esperados da reação das cetonas -orto substituídas utilizando as


O

(9) R = Br

(10) R = Cl

(11) R = OCH3

(12) R = OH

OH

G10 e Gpvp

R R(9a) R = Br

(10a) R = Cl

(11a) R = OCH3

(12a) R = OH

A 2-bromo-acetofenona (9) foi reduzida ao correspondente álcool, isômero de

configuração S, com excelentes valores de excesso enantiomérico >99,0%, em ambas as

metodologias (Figura 50 e 51, p. 86). Entretando apresentaram baixos valores de

conversão 23,5% (G10) e 21,4% (Gpvp) conforme apresentado na Tabela 16 (p. 86). O


metodologias para o derivado 2-bromo-acetofenona.

86





G10 23,5 >99,0 (S)

Gpvp 21,4 >99,0 (S)






OH

Br

OH

Br

O

Br

O

Br

87



A redução da 2-cloro-acetofenona (10) ocorreu com excelente conversão

utilizando-se a metodologia Gpvp, onde obteve-se 94,6% do produto, bem acima do

ocorrido com a cetona não substituída (1) e com a metodologia G10, obteve-se valor de

conversão igual a 61,4% (Tabela 17). Os valores de excessos enantioméricos

encontrados correspondentes a 5,4% e 5,3% para as metodologias Gpvp e G10,

respectivamente, são insatisfatórios, uma vez que o presente trabalho tem como objetivo

a produção de substâncias enantiomericamente puras. Os cromatogramas obtidos do

produto reacional do derivado em questão estão apresentados nas Figuras 52 e 53 (p.

88) para as metodologias Gpvp e G10, respectivamente. O Gráfico 44 (p. 88) apresenta

o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o derivado em

questão.

Tabela 17: Resultados da biotransformação da 2-cloro-acetofenona com sementes de



2-cloro-acetofenona Conversão (%) ee (%)

G10 61,4 5,3 (S)

Gpvp 94,6 5,4 (S)


23,5

> 99,0

21,4

> 99,0

0

20

40

60

80

100

120


2-b

rom

o-a

ceto

fen

on

a G10

Gpvp

88


a metodologia G10.


a metodologia Gpvp.

Gráfico 44: Perfil de biotransformação da 2-cloro-acetofenona utilizando as


61,4

5,3

94,6

5,4

0

20

40

60

80

100


2-c

loro

-ace

tofe

no

na

G10

Gpvp

OH

Cl

OH

Cl

O

Cl

O

Cl

89

A diferença do tamanho relativo do átomo de halogênio entre os derivados -orto

halogenados estudados proporcionou uma mudança acentuada na atuação das enzimas

responsáveis pelo processo de biorredução. A conversão ao correspondente álcool para

o derivado 2-cloro foi bastante superior a aquele apresentado pelo derivado 2-bromo,

onde provavelmente o fator estérico foi preponderante para este resultado. Entretanto os

melhores resultados de excesso enantiomérico foram encontrados para o derivado 2-

bromo em relação ao quase nulo encontrado para o 2-cloro. Uma possível justificativa

para tal fato seria a melhor interação, da enzima com o substrato 2-bromo, formando

apenas o estereoisômero, demonstrando nesse caso sua estereosseletividade.

O derivado 2-metóxi-acetofenona (11) apresentou baixos valores de conversão,

como mostrado na Tabela 18 a seguir, sendo para a metodologia Gpvp o melhor

resultado de 22,8%. Os álcoois formados pelas duas metodologias apresentaram

configuração S, e foi obtido com valores de 92,5% (Figura 54) para G10 e >99,0% para

Gpvp (Figura 55, p. 90), sendo considerados ótimos resultados. O Gráfico 45 (p. 90)







G10 14,0 92,5 (S)

Gpvp 22,8 >99,0 (S)




OH

OCH3

O

OCH3

90





A redução do derivado 2-hidróxi-acetofenona (12) não foi obtida. Os

cromatogramas das reações com metodologia G10 (Figura 56, p. 91) e Gpvp (Figura 57,

p. 91) apresentam somente o pico correspondente à cetona, substrato inicial (Tabela 19).

Tabela 19: Resultados da biotransformação da 2-hidróxi-acetofenona com sementes de



2-hidróxi-acetofenona Conversão (%) ee (%)

G10 NR -

Gpvp NR -

NR – Não reagiu; ee – Excesso enantiomérico

14,0

92,5

22,8

> 99,0

0

20

40

60

80

100

120


2-m

etó

xi-a

ceto

fen

on

a G10

Gpvp

OH

OCH3

O

OCH3

91

Figura 56: Cromatograma do produto da biorredução da 2-hidróxi-acetofenona


Figura 57: Cromatograma do produto da biorredução da 2-hidróxi-acetofenona


A posição do grupamento hidroxila na posição -orto favorece a formação de

ligação de hidrogênio intramolecular tornando a carbonila pouco reativa. O espectro de

RMN ¹H sugere o fato acima discutido com o aparecimento de um sinal em δH 12,26

ppm (s, 1H) correspondente à hidroxila quelada (Figura 58, p. 92).

O

OH

O

OH

92

Figura 58: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) da 2-hidróxi-acetofenona.

4.4.6.4 Cetona α-halogenada

2,2,2-trifluoro-acetofenona, um derivado α-halogenado da acetofenona, também

teve sua biorreatividade comparada com a acetofenona (1) frente às sementes de

Helianthus annuus L. O produto esperado pela biorredução deste substrato com as

metodologias G10 e Gpvp encontra-se na Figura 59, p. 93.

OO

H

93

Figura 59: Produto esperado da reação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando as


CF3

O

CF3

OH

G10 e Gpvp

(13) (13a)

A substituição dos hidrogênios alfa pelos átomos de flúor, retiradores de elétrons

por efeito indutivo, acarretaram uma diminuição na densidade eletrônica da carbonila,

tornando-a mais eletrofílica e com isso mais reativa.

As conversões obtidas foram excelentes para ambas as metodologias >99,0%

(Tabela 20), em contrapartida baixos valores de excesso enantiomérico foram

encontrados, sendo o maior deles apresentado pela metodologia G10 18,1% (Figura 60,

p. 94) em comparação com Gpvp onde se obteve um valor quase nulo 3,9% (Figura 61,

p. 94). A configuração do álcool obtido não foi determinada. O Gráfico 46 (p. 94)



Tabela 20: Resultados da biotransformação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona com

sementes de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.


2,2,2-trifluoro-acetofenona Conversão (%) ee (%)

G10 >99,0 18,1

Gpvp >99,0 3,9


94

Figura 60: Cromatograma do produto da biorredução da 2,2,2-trifluoro-acetofenona


Figura 61: Cromatograma do produto da biorredução da 2,2,2-trifluoro-acetofenona


Gráfico 46: Perfil de biotransformação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando as


> 99,0

18,1

> 99,0

3,9

0

20

40

60

80

100

120


2,2

,2-t

rifl

uo

race

tofe

no

na

G10

Gpvp

CF3

OH

CF3

OH

95

4.4.6.5 Cetonas aromáticas

A biotransformação da α-tetralona (14) tendo como objetivo a obtenção do α-

tetralol (14a), foi investigada devido este álcool ser considerado um intermediário muito

utilizado em sínteses (FERRAZ et al., 2008). A redução da α-indanona (15) também foi

investigada. Segundo Polo et al. (2008) o anel indânico está presente em uma série de

produtos naturais e fármacos com atividade farmacológica, tais como o Indinavir® –

um inibidor da HIV-protease; o Aricept® – utilizado no tratamento do mal de

Alzheimer; o mutisiantol; o taiwaniaquinol B e a (+)-indacrinona – fármaco contra

hipertensão, sendo também encontrado em várias formulações de fragrâncias. Os

produtos esperados das reações da α-tetralona e da α-indanona, utilizando as

metodologias G10 e Gpvp, encontram-se na Figura 62.

Figura 62: Produtos esperados da reação da α-tetralona e da α-indanona utilizando a

metodologia G10 e Gpvp.

G10 e Gpvp

(14) n = 2(15) n = 1

O

(14a) n = 2(15a) n = 1

n

OH

n

Os resultados de excesso enantiomérico encontrados para a α-tetralona

utilizando as metodologias G10 e Gpvp foram excelentes, >99,0%, mostrando uma alta

estereosseletividade da enzima das sementes de Helianthus annuus L. frente a esse

substrato (Tabela 21, p. 96).

A conversão detectada para a metodologia G10 foi 23,4% (Figura 63, p. 96), e

para Gpvp foi 21,6% (Figura 64, p. 96), através da análise dos cromatogramas por

intermédio de curva de calibração apresentada neste capítulo (4.2 p. 49-54).

96

Um comparativo dos meios reacionais utilizados para a investigação da

biotransformação da α-tetralona está representado no Gráfico 47 (p. 97).

Tabela 21: Resultados da biotransformação da α-tetralona com sementes de Helianthus

annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.


α-tetralona Conversão (%) ee (%)

G10 23,4 >99,0 (S)

Gpvp 21,6 >99,0 (S)

NQ – Não quantificado; ee – Excesso enantiomérico

Figura 63: Cromatograma do produto da biorredução da α-tetralona utilizando a

metodologia G10.

Figura 64: Cromatograma do produto da biorredução da α-tetralona utilizando a

metodologia Gpvp.

O

OH

O

OH

97

Gráfico 47: Perfil de biotransformação da α-tetralona utilizando as metodologias G10 e

Gpvp.

A redução da α-indanona (15) foi considerada satisfatória quando utilizou-se a

metodologia G10, sendo obtido 23,5% de conversão (Tabela 22) ao correspondente

álcool, α-indanol (15a) com excelente excesso enantiomérico para o isômero S,

conforme cromatograma apresentado na Figura 65 (p. 98). A metodologia Gpvp

apresentou valor de conversão muito baixo 4,3%, entretanto apenas um enantiômero

formado de configuração S (Figura 66, p. 98). O gráfico 48 (p. 98) apresenta o perfil do

ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o derivado em questão.

Tabela 22: Resultados da biotransformação da α-indanona com sementes de Helianthus

annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.

,


α-indanona Conversão (%) ee (%)

G10 2,0 >99,0 (S)

Gpvp 4,3 >99,0 (S)


23,4

> 99,0

21,6

> 99,0

0

20

40

60

80

100

120


α-t

etr

alo

na

G10

Gpvp

98

Figura 65: Cromatograma do produto de biorredução da α-indanona utilizando a

metodologia G10.

Figura 66: Cromatograma do produto da biorredução da α-indanona utilizando a

metodologia Gpvp.

Gráfico 48: Perfil de biotransformação da α-indanona utilizando as metodologias G10 e

Gpvp.

Os resultados semelhantes de conversão e excesso enantiomérico entre as duas

cetonas acima destacadas, α-tetralona e α-indanona, mostram a compatibilidade de

interação entre enzima-substrato independente da cadeia cíclica conjugada ao anel

aromático que faz parte do esqueleto dessas cetonas.

2,0

> 99,0

4,3

> 99,0

0

20

40

60

80

100

120


α-i

nd

ano

na

G10

Gpvp

OH

OH

O

O

99

PROCEDIMENTO

EXPERIMENTAL

100

5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

5.1 Material utilizado

As determinações de massas foram realizadas utilizando balança analítica Ohaus

Analytical Plus.

As reações enzimáticas foram realizadas em uma mesa agitadora modelo CT-

165 da fabricante CIENTEC.

Os solventes utilizados nas reações, tratamento de reações e colunas

cromatográficas são de qualidade P.A. e de procedência comercial da Synth. O reagente

Folin-Ciocalteau utilizado na determinação de proteínas dos vegetais estudados tem

procedência comercial da marca QEEL – Química Especializada Erich LTDA e o

reagente de Bradford da Sigma Aldrich. Tartarato duplo de sódio e potássio

(KNaC4H4O6.4H2O), carbonato de sódio (Na2CO3), hidróxido de sódio (NaOH), sulfato

cúprico (CuSO4.5H2O) são de procedência VETEC.

Borohidreto de sódio (NaBH4) tem procedência comercial da PROSYNTH.

5.2 Métodos de Análise

As análises necessárias para obtenção dos espectros e cromatogramas, incluindo

técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e ressonância magnética

nuclear (RMN) foram realizadas na Central Analítica do Departamento de Química

Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará.

5.2.1 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Para cromatografia em camada delgada (CCD) foram utilizadas cromatoplacas

de gel de sílica 60 (Ф = 2-25μm) sobre poliéster T-6145 provenientes da marca SIGMA

CHEMICAL CO com camada de 250 μm de espessura e dimensões de 10x5 cm.

Também foram utilizadas placas de vidro revestidas com uma camada de

aproximadamente 0,5 mm de espessura de sílica gel 60 (Ф = 0,004-0,005 mm) código

1094 da marca VETEC.

Após eluição das substâncias nas cromatoplacas, as mesmas foram reveladas

através de pulverização com solução de vanilina (C8H8O3, 5,0 g) e ácido perclórico

(HClO4, 0,75 mol/L, 100 mL) em etanol (C2H5O, 100 ml) seguida de aquecimento a

101

100ºC com pistola aquecedora da marca Steinel, modelo HL500, por aproximadamente

1 min (Figura 67).

Figura 67: Fotografia da CCD da biorredução da acetofenona.

5.2.2 Cromatografia de Adsorção

Os produtos reacionais, após extração, foram purificados em coluna

cromatográfica utilizando como adsorvente gel de sílica 60 (Ф = 0,025-0,020mm),

código 45 337, de procedência VETEC. O comprimento e diâmetro das colunas

variaram de acordo com a quantidade de amostra a ser cromatografada e de sílica

utilizadas. Como eluente foi usado diclorometano de qualidade PA da marca Synth

puro.

5.2.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

A conversão e o excesso enantiomérico dos produtos de biorredução da

acetofenona (1), de seus derivados, 4-bromo-acetofenona (2), 4-fluoro-acetofenona (3),

4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-acetofenona (5), 4-metil-acetofenona (6), 3-bromo-

acetofenona (7), 3-metóxi-acetofenona (8), 2-bromo-acetofenona (9), 2-cloro-

acetofenona (10), 2-metóxi-acetofenona (11) e 2-hidróxi-acetofenona (12). Uma cetona

α-halogenada, 2,2,2-trifluoro-acetofenona (13), bem como duas outras cetonas

aromáticas, α-tetralona (14) e α-indanona (15), foram determinados por Cromatógrafo

102

Líquido de Alta Eficiência Shimadzu LC-20AT, com coluna quiral OB-H de dimensões

150 x 4,6 mm e detector UV-Vis Shimadzu SPD-M20A (Figura 68). Os resultados

foram obtidos mediante curvas de calibração, apresentadas no capítulo 4, tópico 4.2 (p.

49-54). As análises foram realizadas a 30 °C e conforme parâmetros destacados na

Tabela 23 (p. 103), a seguir.

Figura 68: Fotografia do Cromátografo Líquido de Alta Eficiência utilizado nas

análises de biorredução e em detalhe a coluna quiral OB-H.

103

Tabela 23: Parâmetros de análise por CLAE dos substratos utilizados nas reações de

biotransformação.

Entrada Substrato/Produto Fase móvel

Hex:iPrOH

Fluxo

(mL/min)

Tr (min)

(Cetona/Alcoóis)

1 (1)/(1a) 95:5 0,5 13,5/9,9 (S) - 14,5 (R)

2 (2)/(2a) 95:5 0,3 17,3/16,0 (S) - 18,3 (R)

3 (3)/(3a) 95:5 0,3 20,1/15,3 (S) - 16,6 (R)

4 (4)/(4a) 92:8 0,8 5,8/4,4 (S) - 4,9 (R)

5 (5)/(5a) 92:8 0,8 20,1/10,2 (S) - 13,3 (R)

6 (6)/(6a) 98:2 0,5 13,9/16,6 (S) - 19,3 (R)

7 (7)/(7a) 95:5 0,5 12,1/10,3 (S) - 13,7 (R)

8 (8)/(8a) 92:8 0,8 9,8/8,9 (S) - 11,3 (R)

9 (9)/(9a) 95:5 0,5 12,9/7,2 (S) - 9,8 (R)

10 (10)/(10a) 92:8 0,8 11,9/6,8 (R) - 8,4 (S)

11 (11)/(11a) 95:5 0,5 23,0/10,5 (S) - 18,8 (R)

12 (12)/(12a) 95:5 0,5 9,4/ND

13 (13)/(13a) 95:5 0,5 5,3/8,3 (X) - 9,1 (X)

14 (14)/(14a) 98:2 0,5 17,2/13,1 (R) - 23,4 (S)

15 (15)/(15a) 95:5 0,5 22,2/9,8 (R) – 16,1 (S)

Tr – Tempo de retenção

ND – Não detectado

5.2.4 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Os espectros de RMN 1H foram obtidos no Centro Nordestino de Aplicação e

Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal de Ceará

(CENAUREMN/UFC), utilizando-se Espectrômetros de Bruker, modelo Avance DPX –

300 e modelo Avance DRX-500, que operam na frequência de 300 e 500 MHz para

hidrogênio, respectivamente.

A dissolução das amostras analisadas foi realizada utilizando clorofórmio

deuterado (CDCl3) como solvente.

5.2.5 Espectroscopia na Região do UV/VIS

As medidas de absorbância na região do ultravioleta-visível foram obtidas

utilizando-se um espectrofotômetro modelo Cary 50 Conc da Varian (Figura 69). As

104

leituras foram realizadas no comprimento de onda determinado para cada análise, todas

no mínimo em triplicata.

Figura 69: Fotografia do espectrofotômetro modelo Cary 50 Conc da Varian.

5.2.6 Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG/EM)

Os produtos reacionais obtidos foram analisados e quantificados por CG-EM

(Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa) QP2010 da SHIMADZU,

usando coluna capilar RTX-5MS (30,0m x 0,25mm x 0,30mm), com dois gradientes de

temperatura, um de 10°C/min (40-180°C) e de 40°C/min (180°-300°C), e outro com

temperatura de 10ºC/min (100-180ºC), com a temperatura de injetor de 250°.

O espectrômetro de massa foi usado para registrar espectros de massa (EM), dos

substratos e produtos, sendo realizado em um cromatógrafo da Hewlett Packard 1100

(APCI+) e detector (EI

+) Hewlett Packard 5973.

5.3 Determinação de Proteínas

A determinação de proteínas do extrato aquoso das sementes de Helianthus

annuus L. foi realizada como estudo preliminar da sua utilização como biocatalisador.

As sementes foram primeiramente lavadas com solução de hipoclorito de sódio 5%

durante 20 minutos e posteriormente com água destilada. Para obtenção dos extratos

aquosos das sementes de Helianthus annuus L. 10,0 g de sementes foram trituradas e 50

mL de água destilada foram adicionados em erlenmeyers de 125 mL, sendo a mistura

mantida sob agitação constante em mesa agitadora por 72 h a 175 r.p.m. O extrato foi

105

filtrado e submetido as metodologias de determinação de proteínas solúveis descrita na

literatura por Lowry (modificada por HARTREE, 1972) e por Bradford (1976).

5.3.1 Método de Lowry (modificado por Hartree)

Para a realização da determinação de proteínas das sementes de Helianthus

annuus L. pelo método de Lowry foi necessário o preparo das seguintes soluções:

Solução A: Foram pesados 50,0 g de Na2CO3 que foi dissolvido em 250 mL de

solução de NaOH 1M, seguida da adição de 1,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio

(KNaC4H4O6.4H2O). O volume foi aferido para 500 mL de água destilada.

Solução B: 1,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio (KNaC4H4O6.4H2O) e 0,5

g de CuSO4.5H2O dissolvidos em 45 mL de água, seguido da adição de 5 mL de NaOH

1M.

Solução C: 1 mL do reagente de Folin-Ciocalteau 2M diluído em 15 mL de

água.

A quantificação da concentração de proteínas solúveis nos extratos vegetais foi

feita através de curva de calibração usando solução aquosa de BSA (Albumina Bovina).

Procedimento geral: 0,9 mL de solução A foi adicionado em um tubo de ensaio

contendo 1,0 mL de amostra de extrato vegetal diluído (1,0 mL de amostra para 10,0

mL de solução). A mistura reacional foi aquecida em banho-maria a 50 ºC durante 10

minutos. Após esse período, o material foi resfriado a temperatura ambiente e

adicionados 0,1 mL de solução B que foi deixado em repouso durante 10 minutos. Em

cada tubo de ensaio acrescentou-se 3,0 mL de solução C seguida de aquecimento

durante 10 minutos a 50 ºC em banho-maria. Após resfriamento o material foi analisado

em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 650 nm. O branco foi realizado

com 1,0 mL de água destilada. A análise foi realizada no mínimo em triplicata para cada

amostra de extrato vegetal.

5.3.2 Método de Bradford

A determinação de proteínas nesta metodologia foi realizada segundo Bradford

(1976) e fez se necessário o preparo da seguinte solução:

106

- Solução de Bradford: 50 mg de Comassie G 250 foram dissolvidos em 25 mL

de Álcool Etílico. Essa solução foi agitada durante 1 hora em um erlenmeyer envolto

com papel alumínio. Em seguida, foram adicionados 50 mL de ácido fosfórico 85%. O

volume foi aferido para 500 mL com água destilada. A solução resultante foi filtrada

três vezes com papel de filtro e acondicionada em frasco âmbar a temperatura ambiente.

Procedimento geral: 0,1 mL de amostra de extrato vegetal foi diluído

adicionando-se 2,9 mL de água destilada, retirou-se alíquotas de 0,1 mL e adicionou-se

2,5 mL do reagente de Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250) e após 10 minutos

foi realizada a leituras das amostras em espectrofotômetro no comprimento de onda de

595 nm. Os ensaios foram realizados em triplicata e o branco feito com a mesma

quantidade de água destilada. A quantificação foi realizada utilizando solução aquosa de

BSA como padrão da curva de calibração.

5.4 Processos Biocatalíticos

5.4.1 Procedimento geral das biotransformações utilizando células íntegras de

vegetais

Nas reações de biotransformação realizadas, usou-se metodologia proposta por

MACHADO et al., (2006), com modificações. As sementes de Helianthus annuus L.

utilizadas como fonte biocatalítica foram adquiridas em comércio local. Buscou-se a

otimização dos teores de conversão e de excesso enantiomérico para a acetofenona (1)

através dos parâmetros: quantidade de biocatalisador, uso de co-solvente, solução

tamponante, extrato bruto enzimático com pvp e germinação das sementes (Figura 70,

p. 107).

107

Figura 70: Fotografia das reações de biorredução utilizando as sementes de Helianthus

annuus L.

5.4.2.1 Quantidade de biocatalisador

As sementes de Helianthus annuus L. foram trituradas e lavadas com solução de

hipoclorito de sódio 5 % por 20 minutos e em seguida com água destilada. Foram

pesados 5,0 g, 10,0 g e 20,0 g das sementes de Helianthus annuus L. em erlenmeyers de

125 mL, 50 mg de substrato e adicionado 50 mL de água destilada. Os frascos foram

lacrados e submetidos à agitação em mesa agitadora a uma velocidade de 175 r.p.m.

durante um período de 72 h. Todas as reações foram realizadas no mínimo em duplicata.

5.4.2.2 Uso de co-solvente: Isopropanol



pesados 10,0 g das sementes de Helianthus annuus L. em erlenmeyers de 125 mL,

juntamente com 50 mg de substrato e adicionado a cada erlenmeyer, juntamente com

50 mL de água destilada, proporções de isopropanol nas seguintes relações (v/v) em

água destilada: 1%, 2%, 5% e 10%. Os frascos foram lacrados e submetidos à agitação

em mesa agitadora a uma velocidade de 175 r.p.m. durante um período de 72 h. Todas

as reações foram realizadas no mínimo em duplicata.

108

5.4.2.3 Meio tamponante: pH 6,0, 7,0 e 8,0



pesados 10,0 g das sementes de Helianthus annuus L. em erlenmeyers de 125 mL,

juntamente com 50 mg de substrato e adicionado a cada erlenmeyer 50 mL de soluções

tampões previamente preparadas a partir de sais ácidos (Na2HPO4/KH2PO4) com os

valores de pH 6,0, 7,0 e 8,0. Os frascos foram lacrados e submetidos à agitação em

mesa agitadora a uma velocidade de 175 r.p.m. durante um período de 72 h. Todas as

reações foram realizadas no mínimo em duplicata.

5.4.2.4 Extrato bruto enzimático (LUPPETI, 2000)

A metodologia de Lupetti (2000) adotada para esse procedimento foi

modificada. Triturou-se 10 g de sementes de Helianthus annuus L., após lavagem com

solução de hipoclorito de sódio 5 %, e acrescentou-se 1 g de polivinilpirrolidona (PVP)

juntamente com 50 mL de solução tampão fosfato pH 6,5, à mistura resultante foi

adicionado 50 mg de substrato (1). Os frascos foram lacrados e submetidos à agitação

em mesa agitadora a uma velocidade de 175 r.p.m. durante um período de 72 h. Todas

as reações foram realizadas no mínimo em duplicata.

5.4.2.5 Sementes de Helianthus annuus L. germinadas

As sementes de Helianthus annuus L. lavadas com solução de hipoclorito de

sódio 5 % por 20 minutos e em seguida com água destilada, foram deixadas em meio

aquoso por aproximadamente 120 h. Durante este período a água era substituída

diariamente para não acarretar no aparecimento de fungos. Foram pesados e triturados

10,0 g das sementes de Helianthus annuus L. germinadas em erlenmeyers de 125 mL,

juntamente com 50 mg de substrato (1) e adicionado a cada erlenmeyer 50 mL água

destilada. Os frascos foram lacrados e submetidos à agitação em mesa agitadora a uma

velocidade de 175 r.p.m. durante um período de 72 h. Todas as reações foram realizadas

no mínimo em duplicata.

109

5.4.3 Obtenção dos alcoóis padrões por via química

Os alcoóis padrões racêmicos 1a-15a foram obtidos a partir da redução dos

respectivos aldeídos e cetonas através da reação com NaBH4 utilizando metodologia

descrita por Vogel (1974) com algumas modificações. Em um balão de fundo redondo

de 125 mL foram adicionados 3 mmol de cada substrato carbonílico dissolvidos em

10,0 mL de metanol. Para cada reação foram adicionados 6 mmol de borohidreto de

sódio sob banho de gelo. A mistura foi deixada sob agitação durante 1 hora. Em

seguida, o metanol foi evaporado sob pressão reduzida, o material foi dissolvido em

água e o respectivo álcool foi extraído com AcOEt. A fase orgânica foi seca com sulfato

de sódio anidro e o solvente evaporado sob pressão reduzida.

Os alcoóis racêmicos 1a-15a foram purificados em coluna cromatográfica de gel

de sílica utilizando como fase móvel mistura binária de hexano/AcOEt (8:2) e

identificados através de RMN 1H.

5.4.3 Substratos selecionados nas reações de biotransformação utilizando as


Após a otimização dos valores de conversão e de excesso enantiomérico

utilizando como substrato a acetofenona, alguns de seus derivados disponíveis 4-bromo-

acetofenona (2), 4-fluoro-acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-

acetofenona (5), 4-metil-acetofenona (6), 3-bromo-acetofenona (7), 3-metóxi-

acetofenona (8), 2-bromo-acetofenona (9), 2-cloro-acetofenona (10), 2-metóxi-

acetofenona (11) e 2-hidróxi-acetofenona (12) foram submetidos às reações com as

sementes de Helianthus annuus L.. Uma cetona α-halogenada, 2,2,2-trifluoro-

acetofenona (13), bem como duas outras cetonas aromáticas, α-tetralona (14) e α-

indanona (15), também foram selecionadas e submetidas à biotransformação. As

metodologias selecionadas para a biotransformação dos substratos acima citados estão

destacadas a seguir.

Metodologia G10: As sementes de Helianthus annuus L. foram trituradas e

lavadas com solução de hipoclorito de sódio 5 % por 20 minutos e em seguida com

água destilada. Foram pesados 10,0 g das sementes de Helianthus annuus L. em

erlenmeyers de 125 mL, 50 mg de substrato e adicionado 50 mL de água destilada. Os

frascos foram lacrados e submetidos à agitação em mesa agitadora a uma velocidade de

110

175 r.p.m durante um período de 72 h. Todas as reações foram realizadas no mínimo em

duplicata.

Metodologia Gpvp: A seguinte metodologia está descrita conforme item

5.4.1.4 deste capítulo.

5.4.4 Cetonas

Uma série de derivados da acetofenona (1) foram selecionados como substratos

nas biorreduções com as sementes de Helianthus annuus L., pelas metodologias acima

destacadas. Os derivados selecionados foram: 4-bromo-acetofenona (2), 4-fluoro-

acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-acetofenona (5), 4-metil-

acetofenona (6), 3-bromo-acetofenona (7), 3-metóxi-acetofenona (8), 2-bromo-

acetofenona (9), 2-cloro-acetofenona (10), 2-metóxi-acetofenona (11) e 2-hidróxi-

acetofenona (12). Uma cetona α-halogenada, 2,2,2-trifluoro-acetofenona (13), bem

como duas outras cetonas aromáticas, α-tetralona (14) e α-indanona (15).

5.4.5 Obtenção dos excessos enantioméricos (ee)

A análise do excesso enantiomérico dos produtos da biorredução a partir de

cetonas pró-quirais, foi realizada através do cromatograma obtido por CLAE, mais

precisamente das áreas dos picos observados para cada álcool, conforme equação

abaixo:

ee (%) = Área do enantiômero majoritário – área do enantiômero minoritário x 100%

Área do enantiômero majoritário + área do enantiômero minoritário

A razão dos picos fornece uma medida da composição enantiomérica da amostra

precisa e quantitativa com alto grau de precisão (± 0,05%) (PILISÃO, 2006).

5.4.6 Obtenção das curvas de calibração dos substratos e produtos esperados

Padrões dos substratos (cetona) e dos produtos (alcoóis) com concentração entre

5-100 ppm foram injetados em equipamento de CLAE, cuja descriminação está no item

5.2.3 (p. 100) deste capítulo, para obtenção dos valores de área correspondente a cada

concentração. Os dados analisados foram organizados em software Origin 7.0 para a

construção das respectivas curvas de calibração (item 4.2, p. 49-54) e obtenção dos

dados de coeficientes da reta.

111

CONSIDERAÇÕES FINAIS

112

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

As sementes de Helianthus annuus L. nos ensaios biocatalíticos realizados neste

trabalho mostraram-se bastante eficientes nos processos de biorredução de cetonas

aromáticas.

A determinação do teor de proteínas pelo método de Lowry, modificado por

Hartree (10,1g/L), bem como de Bradford (8,8g/L), descritos na literatura, revelou

valores consideráveis para o extrato aquoso das sementes de Helianthus annuus L., fator

este confirmado pelas boas conversões do substrato acetofenona (1).

Os parâmetros de otimização analisados para a biorredução da acetofenona tais

como, quantidade de biocatalisador, co-solvente, uso de tampões (pH), obtenção do

extrato bruto e germinação de sementes, permitiram um detalhado estudo do

comportamento das enzimas, oxidorredutases, das sementes de Helianthus annuus L.,

onde independente do meio reacional, demonstraram alta estereosseletividade para

obtenção do estereoisômero majoritário (S). Em contrapartida, os valores de conversão

obtidos apresentados para as mesmas condições descritas mostraram-se dependentes

diretamente da condição reacional.

As reações de biotransformação dos derivados da acetofenona (2-12), da cetona

α-halogenada (13) e das outras cetonas aromáticas, α-tetralona (14) e α-indanona (15)

apresentaram resultados distintos para os excessos enantioméricos obtidos, com valores

variando de 4% à >99,0%. Ressalta-se a alta estereosseletividade do complexo

enzimático das sementes de Helianthus annuus L. utilizando a metodologia com o

polímero PVP (Gpvp) evidenciada nos estudos destes substratos, obtendo-se sempre

como produto majoritário o enantiômero (S) e com excelentes excessos enantioméricos

(>99,0%), com exceção para os substratos 2,2,2-trifluoro-acetofenona (13) com 4,0% e

2-cloro-acetofenona com 5,4%.

As metodologias selecionadas G10 e Gpvp não apresentaram grandes

divergências entre os resultados esperados pelos substratos citados quando em

comparação com a acetofenona, mostrando que independente da utilização de

metodologias distintas, as enzimas atuantes do material vegetal confirmaram sua alta

estereosseletividade, obtendo-se sempre o enantiômero de configuração S, exceto para o

derivado 3-metóxi-acetofenona com metodologia G10, onde foi obtido o respectivo

álcool com configuração R com >99,0% de excesso enatiomérico.

113

As sementes de Helianthus annuus L. mostraram-se, frente ao trabalho

realizado, um material promissor para os processos de biotransformação de cetonas

aromáticas, devido aos excelentes resultados de excessos enantioméricos encontrados,

fator primordial para o emprego nos estudos de biocatálise, onde busca-se a produção de

compostos enantiomericamente puros. Vale ressaltar que o material vegetal possui um

fácil acesso e um baixo custo, proporcionando também neste âmbito meios satisfatórios

para continuidade da pesquisa.

O estudo do complexo enzimático das sementes de Helianthus annuus L. pode

ser dado continuidade com a biorredução de outras cetonas aromáticas, bem como de

cetonas alifáticas, buscando-se sempre a obtenção de alcoóis enantiomericamente puros,

ressalta-se ainda a possibilidade da avaliação do potencial de outras classes de enzimas

possivelmente presentes no material vegetal, como por exemplo, as lipases, em reações

de hidrólise e acetilação de substratos.

114

REFERÊNCIAS

115

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123

ANEXO

124

Anexo: Álcoois padrões

Figura 1: Cromatograma obtido por CLAE do feniletanol (1a)

Figura 2: Espectro de RMN ¹H (500 MHz, CDCl3) do feniletanol (1a)

125

Figura 3: Cromatograma obtido por CLAE do 4-bromo-feniletanol (2a)

Figura 4: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-bromo-feniletanol (2a)

126

Figura 5: Cromatograma obtido por CLAE do 4-fluoro-feniletanol (3a)

Figura 6: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-fluoro-feniletanol (3a)

127

Figura 7: Cromatograma obtido por CLAE do 4-cloro-feniletanol (4a)

Figura 8: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-cloro-feniletanol (4a)

128

Figura 9: Cromatograma obtido por CLAE do 4-metóxi-feniletanol (5a)

Figura 10: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-metóxi-feniletanol (5a)

129

Figura 11: Cromatograma obtido por CLAE do 4-metil-feniletanol (6a)

Figura 12: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-metil-feniletanol (6a)

130


Figura

14: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 3-bromo-feniletanol (7a)

131



132


Figura 18: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 2-bromo-feniletanol (9a)

133

Figura 19: Cromatograma obtido por CLAE do 2-cloro-feniletanol (10a)

Figura 20: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 2-cloro-feniletanol (10a)

134



135

Figura 23: Cromatograma obtido por CLAE do 2,2,2-trifluor-feniletanol (13a)

Figura 24: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 2,2,2-trifluoro-feniletanol (13a)

136

Figura 25: Cromatograma obtido por CLAE do α-tetralol (14a)

Figura 26: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do α-tetralol (14a)

137

Figura 27: Cromatograma obtido por CLAE do α-indanol (15a)

Figura 28: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do α-indanol (15a)

Documents

BIORREDUÇÃO DE CETONAS AROMÁTICAS UTILIZANDO … · meu melhor acontecer, obrigada por tudo. Ao meu pai, por quem eu sempre busquei ser melhor nessa vida. A minha vó (in memoriam),