Biossegurança em Organismos

Geneticamente Modificados

Pelotas, 2009

Priscila M. M. de Leon Médica Veterinária, Dra. em Biotecnologia

PNPD Biotecnologia/UFPel

Maio 2012

Pelotas, 2009

Parte I. Introdução a Biossegurança e Organismos

Geneticamente Modificados

Parte II. Forma de Manejo e Abordagem Legal

Animais Geneticamente Modificados

Plantas Geneticamente Modificadas

Microrganismos Geneticamente Modificados

Métodos de Controle de Agentes de Risco

LIVRO DE BIOSSEGURANÇA EM ORGANISMOS

GENETICAMENTE MODIFICADOS

na fronteira da manipulação genética

OGMs x Biossegurança

• Conceito de OGMs:

Organismos geneticamente modificados são os que

sofreram modificações do seu material genético

(DNA/RNA), em forma de adição ou subtração de

informação genética, com o objetivo de fazê-lo capaz de

produzir novas substâncias ou realizar novas funções;

Transgênicos: Plantas, Animais e Microrganismos

Químicos, Radiotivos e Ergonômicos

RISCO Agentes Biológicos Homem

Engenharia Genética Sociedade

Meio Ambiente

Biossegurança: Conjunto de ações voltadas para a prevenção,

minimização ou eliminação de riscos inerentes ás atividades de

pesquisa, ensino, desenvolvimento tecnológico, visando a saúde do

homem, dos animais e preservação do meio ambiente.

Biossegurança x OGMs

O conceito de Biossegurança envolve as seguintes relações:

Biossegurança x OGMs

• Histórico:

– Em 1999, Protocolo de Cartagena:

• Conferência sobre Diversidade Biológica em

Cartagena/Colômbia,

O Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança é um

tratado ambiental que faz parte da Convenção sobre

Diversidade Biológica (CDB);

Documento foi aprovado em janeiro de 2000, em vigor em

setembro de 2001;

Brasil aderiu em novembro de 2003, vigorar em fevereiro de

2004;

Atualmente 188 países fazem parte;

Biossegurança x OGMs

Protocolo de Cartagena

Objetivo: assegurar o nível adequado de proteção

envolvendo a transferência, manipulação e uso de OGMs;

Preocupação: com os efeitos adversos na conservação e no

uso sustentável da diversidade biológica, levando em

consideração os riscos para a saúde humana e na

movimentação transfronteiriça;

• http://bch.cbd.int/protocol/

Biossegurança x OGMs

• Malásia, em 2004: ONGs de 160 países; aspectos operacionais

e institucionais da implantação do Protocolo e à identificação

de OVM;

• Canadá em 2005: identificação de OVMs destinados à

alimentação humana, animal e ao processamento; criação de

regime de responsabilidade e compensação pelo danos

causados.

• Curitiba/Brasil em 2006: discussão de formas de identificação

de OVMs e a responsabilização sobre prejuízos ao ser humano

ou ao meio ambiente em razão da manipulação de OVMs;

FORMA DE MANEJO PARA CADA TÓPICO

Pelotas, 2009

Principais práticas de manejo de OGMs

Animais Geneticamente Modificados

Plantas Geneticamente Modificadas

Microrganismos Geneticamente Modificados

Animais Geneticamente Modificados

ANGM

• Conceito:

Animais Geneticamente Modificados são considerados

todos aqueles animais cujas sequências em seu DNA

sofreram modificações induzidas;

camundongos até animais domésticos de grande porte

podem ser classificados como AnGM;

Histórico AnGM

• Geração de animais transgênicos:

realizada no final dos anos 70, através da transferência de um

retrovírus em embrião de camundongo, levando a geração de

camundongos transgênicos com genes exógenos inseridos de

forma estável em seus genomas;

Transgênese tornou-se uma das técnicas essenciais para a

biologia e biotecnologia.

Modelos animais para o estudo: na regulação gênica, de

oncogenes, doenças genéticas, na produção de proteínas

recombinantes, xenotransplantes e entendimento de interações

celulares.

Eficiência da Microinjeção de DNA:

• 2% camundongo

• 0,1 a 0,5% suíno;

• 0,01 a 0,1% cabras;

• Menor em bovino e ovino;

• Nível de Biossegurança (NB):

– Nível de segurança biológica recomendável para

um dado setor que desenvolve atividade de risco

para o profissional e comunidade;

– permite o trabalho em laboratórios/biotérios de forma

segura, com risco mínimo para o operador e meio

ambiente.

Classificação dos AnGMS quanto ao

Nível de Biossegurança:

Classificação dos AnGMS

quanto ao NB:

Nível de Biossegurança 1:

• Neste nível são classificados os AnGM:

– que após as manipulações genéticas sofridas, não tiverem

alteradas suas características de transmissibilidade de

doenças para outras espécies vegetais ou animais, incluindo

seres humanos;

– que não apresentarem vantagens seletivas quando liberados

no meio ambiente;

– AnGM que a contenham o genoma de vírus e não levam à

doenças infecciosas transmissíveis.

* Exemplo: modelo animais para estudo de obesidade e diabetes,

hipertensão e doenças cardíacas.

Classificação dos AnGMS

quanto ao NB:

Nível de Biossegurança 2:

• Neste nível são classificados os AnGM:

– que passam a expressar substâncias sabidamente tóxicas

para animais, incluindo o homem, ou vegetais e que, para tais

toxinas, existam formas efetivas de prevenção ou tratamento;

– que contenham mais de 75% do genoma de vírus NB-1

(doenças infecciosa transmissível);

– que possam ser susceptíveis à infecções que normalmente

não ocorram na espécie equivalente.

* Exemplo: modelo animais suscetíveis ao Trypanosoma cruzi e

Leishmaniose.

Classificação dos AnGMS

quanto ao NB:

Nível de Biossegurança 3:

• Neste nível são classificados os AnGM:

– que contenham mais de 75% do genoma de vírus manipulados

em NB-2 ou 3;

– que são considerados mais aptos à sobrevivência no meio

ambiente que os equivalentes não geneticamente modificados.

* Exemplo: camundongos resistente a influenza e resistente a

salmonelose;

Classificação dos AnGMS

quanto NB:

Nível de Biossegurança 4:

• Neste nível são classificados os AnGM:

– que contenham mais de 75% do genoma de vírus manipulados

em NB-4;

– que após a manipulação genética passem a expressar

substâncias sabidamente tóxicas, incluindo seres humanos e

vegetais, e que para tais toxinas não existam formas efetivas de

prevenção ou tratamento;

* Exemplo: modelo animais para estudo de AIDS (contenham o

genoma do vírus)

Classificação dos AnGMS quanto

ao Grupo de Risco:

AnGM do Grupo I:

• Nível de Biossegurança 1;

• CIBio autoriza, e envia a planta do biotério e normas de

funcionamento a CTNBio;

AnGM do Grupo II:

• Níveis de Biossegurança 2, 3 ou 4;

• CTNBio faz visita técnica para a aprovação;

Nível de Biossegurança dos

Biotérios para AnGM (NB-A):

Características mínimas de Biossegurança para Biotérios:

– porta principal deverá estar sempre trancada;

– acesso restrito às pessoas credenciadas;

– animais de diferentes espécies e não envolvidos em um mesmo

experimento deverão estar alojados em áreas fisicamente separadas;

– todas as áreas que permitam ventilação deverão conter barreiras

físicas para impedir a passagem de insetos e outros animais.

Nível de Biossegurança dos

Biotérios para AnGM (NB-An):

NB-An1:

* Comitê de Ética em Experimentação Animal Institucional

• As instalações separadas da área de livre circulação do prédio;

• Pesquisador Principal: estabelece normas, procedimentos e

protocolos para situações de emergência.

• Toda manipulação deverá ser realizada de forma a evitar a

liberação acidental do AnGM no meio ambiente.

• Todo material deverá ser descartado (CIBio/CTNBio)

Nível de Biossegurança dos

Biotérios para AnGM (NB-An):

NB-An2:

• apenas as pessoas autorizadas e qualificadas podem ter acesso

ao biotério (vacinadas contra os agentes infecciosos);

• Ante Sala;

• O material deve ser acondicionado e a desinfecção poderá ocorrer

fora do biotério;

• É obrigatório o uso de EPIs apropriados como: máscara, gorro,

luva, protetores para os pés, óculos e protetores faciais.

(descontaminação após o uso);

NB-An3:

• 4 áreas: Ante Sala, Sala de Materiais, Sala de Animais e Sala de Experimentação;

• sistema de pressão de ar negativo (controle automático) e purificação do ar;

• Sistema de Microisoladores;

• todo o líquido efluente deverá ser descontaminado antes de liberado;

• autoclave de duas portas;

• incinerador na Sala de Animais ou na Sala de Experimentação;

• A CIBio estipula procedimentos de emergência em caso de acidentes ( em cada

Sala deverá haver sistema de alarme);

• amostras de soro dos usuários (CIBio propõe sistema de monitoramento);

Nível de Biossegurança dos

Biotérios para AnGM (NB-An):

NB-An4:

• Construção deve ser isolada e vigiada 24h;

• 6 áreas: Ante Sala; Sala de Troca de Vestimenta - três divisões; Sala de

Materiais; Sala de Animais; Sala de Experimentação; Sala de

Necropsia;

• Sistema de acesso por cartão magnético ou códigos digitais;

• Sistema de filtração utilizado para exaustão de ar deverá possuir dupla

barreira de filtragem;

• A entrada de qualquer material para as Salas de Animais deverá ser

realizada, via autoclave de duas portas;

Nível de Biossegurança dos

Biotérios para AnGM (NB-An):

Liberação Acidental de AnGM no

meio ambiente:

AnGM deverá possuir marcador genético;

Marca permanente para identificação

macroscópica;

Imediata comunicação a CIBio e CTNBio;

Plantas Geneticamente Modificados

PGM

• Conceito:

Plantas Geneticamente Modificados apresentam gene

ou genes que foram artificialmente inseridos,

apresentando características desejáveis oriundas de outra

variedade da planta, ou mesmo de outra espécie;

PGM

• Aplicações:

incremento de compostos de interesse nutricional e funcional;

melhoras no aproveitamento de micronutrientes do solo;

aumento de produtividade;

resistência a pragas e a herbicidas;

tolerância a estresses abióticos;

diminuição de impactos ambientais;

produção de compostos químicos, farmacêuticos, vacinas;

aumento de biomassa servindo como fonte de combustíveis;

• década de 1980 – foram obtidas e liberadas as primeiras

PGM;

• 1990 – comercialização de PGM:

tabaco resistente a vírus, produzido na China;

tomate de maturação lenta, produzido pela empresa

Calgene;

soja Roundup Ready produzida pela Monsanto

(tolerante ao glifosato);

• 1996 – grande aumento na produção e na comercialização

Histórico PGM

Nível de risco para PGM:

• Determinação do Nível de Risco:

Fonte e natureza do DNA/RNA introduzido (agente infeccioso

exótico/patogênico; fragmento do DNA/genoma completo);

Organismo destinatário: modalidade/facilidade de disseminação;

capacidade de invasão;

Natureza da proteína expressada: toxina/alérgeno;

Ambiente local: espécie selvagem compatível (permite cruzamento);

Procedimentos experimentais: impedir a disseminação do material

genético inserido;

Classificação de PGM:

Nível de Biossegurança 1:

• Neste nível são classificadas PGM:

– cujos organismos parentais não causam doenças ao homem,

animais ou plantas, não se comportem como ervas daninhas;

– não exóticos sem potencial para disseminação rápida;

– não possui riscos de causar impacto negativo no ecossistema

natural ou manejado;

* Exemplo: tomate de amadurecimento tardio;

Nível de Biossegurança 2:

• Neste nível são classificadas PGM:

– se disseminados fora da casa de vegetação seriam viáveis no meio

ambiente, mas possui controle;

– Microrganismos associados a plantas que são nativos na área e

potencialmente perigosos ao ambiente, mas manejáveis;

– estudos com insetos associados a plantas que não prejudiquem

ecossistemas naturais ou manejados;

– consideradas ervas daninhas ou se reproduzam com elas;

– com genoma completo de agente infeccioso não exótico;

* Exemplo: banana e batata com agentes de doença infeciosa

gastrointestinal (vacinas)

Classificação de PGM:

Nível de Biossegurança 3:

• Neste nível são classificadas PGM:

– associada a organismo que apresenta potencial impacto ao meio

ambiente;

– contendo genes que codifiquem para toxinas de vertebrados;

– contendo o genoma completo de agente infeccioso exótico

transmissível, ou onde haja a possibilidade de reconstituição

completa e funcional;

– contendo microrganismos patogênicos a insetos ou outros

pequenos animais associados com plantas;

– potencial para produzir efeitos negativos em ecossistemas

naturais ou manejados;

* Exemplo: plantas resistentes a insetos.

Classificação de PGM:

Nível de Biossegurança 4:

• Neste nível são classificadas PGM:

– pequena escala de agente infeccioso exótico

transmissível na presença de seu vetor, poderá ser

potencial patógeno para outras plantas cultivadas

– É vedado este tipo de experimento em grande escala.

Classificação de PGM:

Princípios de Contenção

para PGM

• evitar transmissão de genomas de plantas ou organismos

associados às plantas, contendo DNA recombinante;

• minimizar a possibilidade de efeitos deletérios nos

organismos e ecossistema;

• evitar a disseminação de patógenos da casa de

vegetação para a agricultura;

• evitar a introdução e estabelecimento não-intencional de um

organismo no ecossistema;

Casa de Vegetação

• Estrutura com paredes, teto e piso, projetada e usada, principalmente,

para o crescimento de plantas em ambiente controlado e protegido;

• As paredes e o teto são geralmente construídos de material transparente

ou translúcido para permitir a passagem de luz solar;

Medidas Preventivas para PGM

na casa de vegetação

• A partir do NB-2 a casa de vegetação deve ser de concreto;

• cobrir ou remover flores e sementes;

• colher o material de estudo antes da maturidade sexual ou usar plantas

macho-estéreis;

• controlar o tempo de floração evitando reprodução com outras plantas

compatíveis;

• utilizar técnicas de modificação genética que localize transgene em partes não

propagativas da planta.

• evitar a geração de aerossóis ao inocular as plantas com microrganismos;

• manter distâncias adequadas entre a planta infectada e hospedeiros

suscetíveis;

• realizar experimentos em época do ano onde as plantas suscetíveis não

cresçam;

• eliminar vetores insetos;

Medidas Preventivas para PGM

na casa de vegetação

• modificar geneticamente o microrganismos minimizando sua sobrevivência e

reprodução fora da planta hospedeira;

• tratar a água que escoa das plantas após irrigação;

• Insetos geneticamente modificados associados a plantas:

– Utilizar cepas estéreis ou que não sejam capazes de voar;

– conduzir experimentos em época do ano quando a sobrevivência dos

insetos que vierem a escapar é impossível;

– escolher organismos que tem uma associação obrigatória com a planta;

– evitar o uso de insetos pequenos devido a difícil eliminação;

– destruir insetos polinizadores após transferência do pólen para eliminar

qualquer potencial de disseminação de pólen transgênico no ambiente.

Microrganismos Geneticamente Modificados

MGM Microrganismos Geneticamente Modificados

• Aplicações:

• produção de vacinas;

• teste imunodiagnósticos;

• Biorreatores para produção de compostos de interesse;

• redução do uso de agrotóxicos e aumento da produção agrícola;

MGM

Microrganismos Geneticamente Modificados

• Critérios de segurança ambiental:

• Sobrevivência, dispersão e possibilidade de interações com outras

espécies;

• transferência de genes para outras populações microbianas do

ambiente;

• rearranjos genéticos;

• potencial patogênico do microrganismo ao homem, a outros

animais e/ou às plantas;

• vantagem ocasionando uma pressão seletiva ou a um prejuízo

metabólico na competição com outros microrganismos;

Grupos de risco de MGM:

Grupo de Risco I: (apenas NB-1)

Riscos: individual e comunitário baixos (não patogênico);

Microorganismos que têm probabilidade nula ou baixa de provocar

doenças para o homem e que não constituem risco para o meio

ambiente. Ex. Lactobacillus

Grupo de Risco II: (NB-2, NB-3 e NB-4)

Riscos: individual e comunitário

Organismos patogênicos, porém geralmente não apresentam um

perigo sério para os indivíduos. Pode provocar infecções graves, porém

já se conhecem medidas profiláticas adequadas com risco de propagação

limitado ou reduzido. Ex. Leptospira, M.tuberculosis, vírus Ebola

Classificação de MGM:

Grupo de Risco I:

A. Organismos receptor ou parental:

• Não patogênico;

• Isento de agentes adventício (associados);

• Multiplicação limitada;

• Sem efeitos negativos no meio ambiente;

B. Vetor/Inserto:

• adequadamente caracterizado quanto a todos os aspectos, e

desprovido de sequências nocivas conhecidas;

• tamanho limitado quanto à sequência genética;

• não deve incrementar a estabilidade do organismo modificado no

meio ambiente;

• não deve transmitir nenhum marcador de resistência a organismos;

Classificação de MGM:

Grupo de Risco I:

C. Microrganismo Geneticamente Modificado:

• não-patogênicos;

• que ofereçam a mesma segurança que o organismo receptor

ou parental;

• sobrevivência e/ou multiplicação limitadas;

• sem efeitos negativos para o meio ambiente;

Grupo de Risco II: todos não incluídos em I

A.Organismos receptor ou parental:

• patogênico;

• agentes adventícios (associados);

• multiplicação facilitada;

• efeitos negativos no meio ambiente;

B.Vetor/Inserto:

• poderá possuir sequencias nocivas conhecidas;

• maior tamanho da sequência genética;

• poderá incrementar a estabilidade do organismo modificado no

meio ambiente;

• poderá transmitir marcador de resistência a organismos;

Classificação de MGM:

Grupo de Risco II: todos não incluídos em I

C.Microrganismo Geneticamente Modificado:

• patogênicos;

• sobrevivência e/ou multiplicação avançada;

• efeitos negativos no meio ambiente;

Classificação de MGM:

VACINAS E TESTES

IMUNODIAGNÓSTICOS

O nível de risco e o nível de biossegurança adotado

para laboratórios que realizam experimentos envolvendo

desenvolvimento de vacinas e testes imunodiagnósticos

está diretamente relacionado ao risco biológico

apresentado pelo microrganismo manipulado.

VACINAS E TESTES

IMUNODIAGNÓSTICOS

Classe de Risco I: NB-1

• Baixo risco individual e para a coletividade: incluem os agentes que não

possuem capacidade comprovada de causar doença em pessoas ou animais

sadios;

Classe de Risco II:NB-2

• Moderado risco individual e limitado risco para a comunidade;

• incluem os agentes que podem causar doença no homem ou animais, porém

não apresentam riscos sérios para os profissionais do laboratório, para a

comunidade, para animais e para o meio ambiente.

• importação restrita

VACINAS E TESTES

IMUNODIAGNÓSTICOS

Classe de Risco III: NB-3

• Alto risco individual e risco moderado para a comunidade;

• causam doenças graves em humanos ou animais, as quais podem ser tratadas

por medicamentos ou medidas terapêuticas gerais;

• importação restrita;

Classe de Risco IV: NB-4

• Alto risco individual e alto risco para a comunidade;

• alto risco biológico que causam doenças humanas e animais de alta gravidade,

capazes de se disseminar na comunidade e no meio ambiente;

• inclui principalmente agentes virais;

• importação proibida;

VACINAS E TESTES

IMUNODIAGNÓSTICOS

EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL:

• Riscos físicos, biológicos e ao meio ambiente: espécies envolvidas;

• Biotérios adequados: instalações, equipe e práticas;

* Os próprios animais podem apresentar riscos: aerossóis, morder e arranhar,

zoonoses

* Comitê de Ética em Experimentação Animal Institucional

• Práticas padrões

• Equipamentos de Segurança (Barreiras Primárias)

• Instalações (Barreiras Secundárias)

• Práticas Especiais para o nível 4

* imunizações e a avaliação sorológica dos profissionais

Métodos de Controle de Agentes de Risco

Boas Práticas de Laboratório: conjunto de normas e procedimentos de

segurança que visam minimizar os acidentes em laboratório;

prevenção e/ou redução do risco de desenvolver doença profissional por

exposição a diversos agentes, presentes no ambiente de laboratório, podem

ser alcançadas pelo uso de práticas seguras nas atividades laboratoriais;

1. Práticas e técnicas microbiológicas padronizadas

2. Conhecimento prévio dos riscos

3. Treinamento de segurança apropriado

4. Manual de biossegurança (identificação dos riscos, especificação das

práticas, procedimentos para eliminação de riscos)

Equipamento de proteção individual – EPI

Os EPIs são empregados nas medidas de proteção individual, protegendo a saúde

e integridade física do manipulador. A roupa e o equipamento utilizado servem

também para evitar a contaminação do material em experimento ou em

produção.

Métodos de Controle de Agentes de Risco

Equipamento de proteção coletiva- EPC

Os EPCs são equipamentos de uso no laboratório que permitem executar

operações em ótimas condições de salubridade para o operador e demais pessoas

no laboratório, bem como do meio ambiente, minimizando a exposição a riscos de

contaminação e reduzindo as conseqüências em caso de acidentes

• Cabine de Segurança Biológica

• Capela de exaustão

• Chuveiro de Emergência / Lava Olhos

• Extintores de Incêndio

• Balde de areia

• Kits de tratamento para acidentes com químicos ácidos, cáusticos,

solvente

Métodos de Controle de Agentes de Risco

• Procedimentos de Descarte

– Descarte de animais de Laboratório

– Descarte de Materiais contaminados

• Manipulação de Reagentes Químico

• Manipulação de Material Biológico

• Manipulação de equipamento de uso comum

• Boas Práticas em Biotério

Risco Biológico

Métodos de Controle de Agentes de Risco

Saúde das Espécies Convencionais de Laboratório

Fatores Condições

Alojamento densidade populacional por gaiola, tipo de gaiola, freqüência de

trocas, qualidade da limpeza

Higiene Pessoal uniformes, banhos, limpeza das mãos

Higiene Ambiental remoção de poeiras e detritos, controle de trânsitos das

pessoas, isolamento de áreas de manutenção dos animais

Equipamentos desinfecção, esterilização, conservação

Rações Qualidade, quantidade, prazo de validade, estocagem em

ambiente apropriado

Animais Quarentena, controle sanitário, seleção das matrizes,

isolamentos das espécies diferentes

Equipe técnica

Postura profissional, movimentação, manipulação, contensão,

conhecimento das principais características das espécies

animais

Tabela 1 - Fatores que podem interferir no comportamento normal dos

animais de laboratório

Condição Normal Distúrbios/Sintomas Causas

Pele e Anexos Pêlos

Pele elástica, úmida, lisa Pêlos homogêneos, brilhantes e sedosos com inserção firme

Perda de pêlos Fungos, ácaros, sarna, bactérias e deficiência alimentar

Ferimentos Brigas, cama com resíduos grosseiros

Formação de cicatrizes ou calos Bactérias

Irritação da pele Alergias, intoxicação

Pêlos sem brilho e perda de pêlos Anemia, hepatite, distúrbios metabólicos

Mucosas Aparentes

Úmidas, brilhantes e róseas

Secas, sem brilho, branca, amarelada Corrimento purulento nasal e ocular

Desidratação, anemia, deficiência nutricional, hepatite, infecções, verminoses

Olhos

Brilhantes, úmidos e vivazes

Secos, sem brilho, com corrimento purulento

Desidratação, infecções, conjuntivites, alergias

Aparelho genital

Fêmeas com ciclo estral regular

Aborto, infertilidade, canibalismo Anestro (fase de repouso sexual)

Disfunções hormonais, deficiência nutricional, alta densidade de animais por gaiola Fêmeas roedoras mantidas em gaiola com outras fêmeas por períodos prolongados

Aparelho digestivo

Dentes íntegros, Crescimento normal

Emagrecimento acentuado, crescimento anormal e quebras de dentes, dificuldade de apreensão dos alimentos

Brigas, farpas de alimentos ou outros resíduos

Apatia, diarréia Ingestão de alimentos ou água contaminados por bactérias ou vírus, alimentos deteriorados

Constipações intestinais Desidratação

Tabela 2 - Correlação entre as condições normais de saúde, os distúrbios do organismo e suas principais causas.

Obrigada pela atenção!