Bromatologia 2018.19 - Espectrofotometria (PB) · 2018-12-03 · 30/11/2018 3 Bromatologia–FCNAUP joséfernandes Natureza corpuscular das REM A uma radiação electromagnética

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Bromatologia – FCNAUP

josé fernandes

BROMATOLOGIA

MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS


josé fernandes


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� Os Métodos Espectrofotométricos envolvem a avaliação quantitativa dos fenómenosresultantes da interacção de radiações electromagnéticas (luz visível, raios de UV, raios X,etc) com a matéria (átomos, moléculas, iões)

� Essa interacção pode assumir várias formas, que dependem

� da natureza da radiação

� Fonte� Densidade óptica do meio atravessado� Intensidade

� da natureza da(s) substância(s) com que as radiações entram em contacto

� Estrutura molecular� Opacidade� Sensibilidade fotoquímica


Princípio Geral


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As REM consistem num fenómeno de natureza vibracional ou ondulatória que se pode definir como:

Propagação de uma perturbação electromagnética no espaço

Natureza ondulatória das REM

Período (T) – intervalo de tempo (s) ao fim do qual um ponto do espaçovolta a possuir um vector campo eléctrico (ou magnético) máximo.

Frequência (ν) – número de períodos por unidade de tempo (Hz ou s-1)E

H

e

λ

Comprimento de onda (λ) – menor distância (m) entre dois pontos doespaço com vector campo eléctrico (ou magnético) máximo.

Número de onda (ν) – número de comprimentos de onda por unidade decomprimento (cm-1)


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Natureza corpuscular das REM

A uma radiação electromagnética de uma determinada frequência está associada uma quantidadediscreta de energia – quantum (plural: quanta) ou fotão.

h = 6,624 x 10-34 J.s (constante de Planck)

A dualidade corpúsculo-onda das REM é fundamental para explicar os fenómenos de absorção e deemissão radiantes pela matéria

É possível calcular a energia de um fotão pela relação de Einstein:

E = hν



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λ, m

10-13

10-11

10-9

10-7

10-5

10-3

10-1

101

ν, Hz

1021

1019

1017

1015

1013

1017

109

107

Rá

dio

in

fra

ve

rme

lho

u

ltra

vio

leta

r

aio

s γ

mic

roo

nd

as

vis

íve

l

ra

ios

X

Região espectralλ

(x 10-9 m)ν

(x 1012 Hz)

Ultravioleta de vácuo

10-18030 000-1 670

Ultravioletapróximo

180-350 1 670-857

Visível 350-780 857-380

Infravermelhopróximo

780-2 500 380-120

Infravermelho médio

- 120-6

Infravermelho longínquo

- 6-0,3

Regiões do Espectro Electromagnético com interesse analítico


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Quando a luz incide numa interface entre dois meios com densidade ópticas diferentes são vários os fenómenos que podem ocorrer

� Refracção� Reflexão � Absorção

Interacção da luz com a matéria



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I0 Ir

n1

n2

θi θr

Reflexão e refracção da luz

Quando uma REM incide numa interface entre dois meios comdensidade ópticas diferentes pode observar-se:

� a reflexão de parte da radiação incidente

� uma variação brusca da direcção de propagação que decorreda diferença da velocidade de propagação nos dois meios(refracção)

A refracção é um fenómeno útil nadecomposição de feixes policromáticos:


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A Absorção dá-se quando a densidade óptica do meio é suficientemente baixa (elevada transparência) e

a intensidade da radiação suficientemente alta para permitir a sua penetração e passagem através da

substância. Nesse caso, parte da energia é absorvida e parte é transmitida

A absorção de energia por parte das moléculas de uma dada substância está relacionada com o tipo de

transições sofridas por estas quando passam do estado fundamental para um estado excitado

Absorção da luz



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� Electrónicas – passagem de electrões para estados excitados

� Raios X (electrões de camadas internas)

� UV e Visível (electrões de camadas externas)

� Vibracionais – deformação nas ligações entre os átomos

� IV

� Rotacionais

� IV longínquo e micro-ondas

� Transição de spin

� Rádio-frequência

Tipos de Transição


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josé fernandeshttps://www.youtube.com/watch?v=ZWwLCnuYRys

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Considere-se uma radiação

� Comprimento de onda - λ1

� Intensidade – I0

A atravessar a solução de uma substância S

� Espessura da solução - l

Uma parte da radiação vai ser absorvida, pelo que a intensidade da radiação transmitida vai ser menor

S

l

dx

I0

It

Absorção de REM



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Transparência ou Transmitância (T) = It/I0 varia entre 0 e 1

Percentagem de Transmitância (%T) = 100 x T varia entre 0 e 100

Conceito de Absorvência

A absorvência pode ser convertida em transmitância sabendo que:

%T = 100 x T -log %T = - log 100 – log T A = 2-log%T

Absorvência (A) = log I0/It ou log 1/T

varia entre 0 e + ∞


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Obtenção de espectros de UV-VIS

FEIXE DE RADIAÇÕES MONOCROMÁTICO:

Conjunto de radiações electromagnéticas de um único comprimento de onda(frequência) que percorrem direcções paralelas no espaço.

FEIXE DE RADIAÇÕES POLICROMÁTICO:

Conjunto de radiações electromagnéticas de diferentes comprimentos de onda(frequências) que percorrem direcções paralelas no espaço.



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Obtenção de espectros de UV-VIS


Componentes básicos de um equipamentoconvencional

• fonte de radiação policromática

• sistema de monocromação

• compartimento de amostragem

• dispositivo de detecção

• dispositivo de leitura

Absorção molecular selectiva de REM no UV/VIS, resultante de transições electrónicas, vibracionais

e rotacionais de modo quantificado e proporcional à concentração.

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Espectros de UV-VIS



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Espectros de UV-VIS


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Os equipamentos utilizados na espectrofotometria de UV/VIS podem ter diferentes designaçõesde acordo com a região espectral onde actuam e o modo de selecção de comprimentos de onda:

Colorímetros no VIS, independentemente do tipo de selecção de λ

Fotómetros selecção descontínua (apenas alguns λ)

Espectrofotómetros selecção contínua de λ

Analisadores multicanal usam policromador

Equipamento



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É igualmente possível efectuar medidas de absorvência utilizando a visão como elemento de detecção:

Comparadores visuais

avalia-se a cor complementar reflectida

Colorímetros

avalia-se a intensidade da cor

complementar transmitida

Equipamento


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Nas lâmpadas de deutério, a descarga eléctrica ocasiona a dissociação molecularcom libertação de fotões de comprimento de onda entre 160 e 375 nm

As lâmpadas de tungsténio/ halogéneo emitem REM entre os 350 e os 2500 nm.O halogeneto de tungsténio formado após sublimação decompõe-se no filamentoincandescente aumentando o tempo de vida útil da lâmpada

Fontes de Radiação



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Nos monocromadores a selecção dos comprimentos de onda é contínua: depende da inclinação doelemento dispersante relativamente a radiação incidente.

Os monocromadores apresentam transparência próxima de 100% e largura de banda fixa ou ajustável entre 0,2 e 20 nm.

fenda de entrada

fenda de saída

rede de difracção

espelhos colimadores

λ1 λ2

fenda de entrada fenda de

saída

lente colimadora lente de

focagem

prisma

200 400 600 800 nm

350 400 500 800 nm

200 250 300 400 800 nm

rede

prisma de vidro

prisma de quartzo

Monocromadores


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O compartimento de células é o elemento constituinte do equipamento com o qual o operadormais interactua devendo ser estanque à luz exterior e pintado internamente de negro por forma aabsorver REM estranha à medida.

As células devem ser colocadas namesma posição ou com a mesma facepara a REM incidente.

Células de leitura



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Quando se opera na zona do visível podem-se utilizar células de vidro ou plástico (estas descartáveis). Nazona do ultra-violeta as células devem ser de quartzo ou sílica fundida.

Não existem duas células iguais, pelo que quando seexecutam uma série de medidas sobre soluções comabsorvência reduzida, deve usar-se a mesma célula.

Existem diferentes tipos de células com diferentes percursosópticos, capacidade, agitação magnética, de fluxo,termostatáveis.

Células de leitura


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Nos espectrofotómetros de feixe duplo a REM proveniente da fonte ésubdivida ou direccionada de modo alternado entre uma célula contendoo branco ou uma célula contendo a amostra.

Espectrofotómetros de feixe duplo



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Embora mais dispendiosos os espectrofotómetros de feixe duplo apresentam duas vantagensimportantes:

1 - o sinal do branco e da amostra são comparados em simultâneo, não sendonecessária a estabilização térmicas do equipamento.

2 - possibilitam o traçado dos espectros de modo automático:

as duas células são preenchidas com o “branco”, e traça-se o espectro. O equipamento corrige todos os

valores de absorvência para 0.

substitui-se a solução do branco pela amostra e procede-se ao traçado do espectro

Espectrofotómetros de feixe duplo


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Lei de Lambert-Beer - Premissas de validade

1 . A radiação incidente é monocromática

2. A composição da solução é homogénea

3. A temperatura é constante

4. As partículas absorventes têm carácter independente

5. O índice de refracção não varia com a concentração



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k – constante de proporcionalidadel – comprimento da zona atravessada pela radiaçãoc – concentração

A = k x c x l

Lei de Lambert-Beer

k é a constante de proporcionalidade na lei de Beer. Na prática corresponde ao valor de absorvênciaquando l é unitário e c é unitário para um dado comprimento de onda e um dado sistemasoluto/solvente.

l costuma medir-se em cm.

se c= 1 mol/L, k representa-se por є (absortividade molar)

se c= 1 g/L, k representa-se por a (absortividade específica)

se c = 1 g/dL, k representa-se por A1%1 cm (coef. absorção específica)


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A absorvência (A) depende

� Estrutura molecular da substância

� grupos cromóforos

� grupos auxócromos

� Comprimento de onda da radiação

� Natureza do solvente

Coeficientes de Absorção

Atendendo aos valores normais de A1%1cm (raramente são superiores a 1000), as soluções têm de

ser analisadas em concentrações da ordem dos 10-2 – 10-6 gramas/L



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Um grupo cromóforo corresponde à parte de uma molécula responsável pela sua cor. A cor surge quando a

molécula absorve radiações de determinado comprimento de onda e transmite ou reflecte em outro

comprimento de onda. O grupo cromóforo corresponde à região da molécula onde a diferença de energia

entre duas orbitais moleculares é igual à energia da radiação incidente. Nesse caso a radiação pode ser

absorvida pela excitação de um electrão do seu estado fundamental para o estado excitado


Grupos Cromóforos e Auxócromos

Um grupo auxócromo corresponde a um grupo funcional ligado ao grupo cromóforo capaz de modificar a

capacidade deste de absorver luz, alterando o comprimento de onda ou a intensidade da absorção

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Grupos Cromóforos e Auxócromos


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Compostos corados

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Um elevado número de espécies de natureza orgânica e inorgânica podem ser quantificadospor espectrofotometria de UV/VIS.

� Método da Curva de Calibração

� Método das adições (de padrão)

� Outros métodos


Análise Quantitativa


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conc.

A

MÉTODO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO:

Fundamenta-se no traçado de uma curvade calibração de A em função da concen-tração da espécie que se pretende quantificar.Pode ser obtida por ensaio de soluções decalibração com concentração crescente naespécie a medir ou por calibração “in situ”.

É o método analítico mais utilizado em espectrofotometria de UV/VIS

É utilizado quando a matriz da amostra é simples e fácil de simular

É utilizado quando o número de amostras a analisar é elevado

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Geralmente admite-se uma variação proporcional de A em função da concentração, sendo a rectacalculada por regressão de A em c pelo método dos mínimos quadrados.

A escolha das soluções de calibração é bastante importante pois condiciona a exactidão dosresultados.

Pode-se optar por:

Soluções puras da espécie a medir

Padrões de matriz sintética – simula-se a composição da amostra quanto aos constituintesmaioritários


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conc.

A

Precisão

Valor médio

A precisão das medidas (diminuição do

impacto dos erros fortuitos) aumenta

com:

1º número de soluções de calibração utilizadas

2º declive da recta de calibração

3º número de medidas sobre cada amostra

4º proximidade entre o valor de absorvência

medido e o valor médio das absorvências

obtidas para as soluções de calibração



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Procedimentos abreviados (menos precisos quando não automatizados):

� uma única solução de calibração – pressupõe que a lei de Beer é válida até à concentração dopadrão quando se acerta o 0 de absorvência com o solvente

� duas soluções de calibração – pressupõe a existência de um erro sistemático à lei de Beer devendoa concentração da amostra situar-se entre as das soluções de calibração. O 0 de absorvência éacertado com o reagente ou com a matriz da amostra (branco).

A validação da exactidão dos resultados pode ser efectuada por:

1º ensaio de amostras certificadas (padrões NBS, BCR e IAEA)2º correlação de resultados com outra técnica analítica3º ensaios de recuperação (pouco fiável para amostras complexas)




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MÉTODO DAS ADIÇÕES DE PADRÃO:

Fundamenta-se no traçado de uma curva deregressão de A em função da concentração,volume ou massa de padrão adicionado aalíquotas da amostra contendo a espécie que sepretende quantificar.

Deve existir proporcionalidade entre absorvên-cia e concentração

É utilizado quando a matriz da amostra condiciona a magnitude daabsorção.É utilizado quando a matriz da amostra é complexa e difícil de simularÉ utilizado quando o número de amostras a analisar é reduzido

conc.massa ouvolume

A



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Quantidades crescentes de uma solução padrãosão adicionadas a volumes constantes deamostra, sendo o volume final de todas assoluções submetidas a ensaio similar.

O resultado é calculado com base no valor daabcissa correspondente à interpolação do dobroda ordenada na origem ou pelo móduloda abcissa obtido após extrapolação da recta deregressão.

A

m

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