CaCa2+2+-ATPase e Produção de -ATPase e Produção de CalorCalor

Daniel M B Lima

IntroduçãoIntrodução Retículo Sarcoplasmático (RS): Principal reservatório

intracelular de Ca2+ em músculo esquelético; SERCA: bombeia Ca2+ para o interior do RS, as custas

de ATP.

IntroduçãoIntrodução Duas regiões distintas, morfologicamente e

funcionalmente:◦ Túbulos longitudinais

Fração leve (LSR); Enriquecida em Ca2+-ATPase;

◦ Cisternas terminais Fração Pesada (HSR); Contato Direto com os Túbulos T.

IntroduçãoIntrodução

IntroduçãoIntrodução SERCAs: Conversão de energia química liberada na

quebra do ATP em energia osmótica (transporte de Ca2+) e produção de calor (termogênese);

SERCA 1◦ Produz mais calor durante a hidrólise do ATP do que

qualquer outra SERCA;◦ Encontrada, predominantemente, em musculatura

esquelética branca e tecido adiposo marrom.

IntroduçãoIntrodução SERCA 1: Ciclo catalítico, 2 vias:

◦ Acoplada: Transporte de Ca2+ + Liberação de Calor◦ Desacoplada: Liberação de Calor

◦ A via desacoplada é muito importante na produção de calor, tanto em grandes mamíferos quanto humanos adultos;

◦ Em hipotireoidismo e exposição ao frio, duas condições que afetam a termogênese, a expressão de SERCA 1 está aumentada.

IntroduçãoIntrodução Evidências têm mostrado que o K+ afeta passos

intermediários do ciclo catalítico da SERCA 1; O presente artigo explora os efeitos do K+ na

atividade termogênica da SERCA 1.

MetodologiaMetodologia◦ Foram utilizadas vesículas leves e pesadas de retículo

sarcoplasmático isoladas de músculo branco de membro posterior de coelhos.

◦ Antes do uso as vesículas foram diluídas em tampão adequado, para dar 4µM de Ca2+ livre

Captação de Ca2+

◦ Traços de 45Ca foram incluídos no meio◦ O meio foi filtrado e a radiação remanescente nos filtros

foi avaliada por cintilação liquida.◦ Para os experimentos de efluxo, as vesículas foram pré-

carregadas com cálcio, e com o equilíbrio alcançado, KCl foi adicionado ao meio.

MetodologiaMetodologia Atividade ATPásica

◦ Medição da liberação de 32Pi de [γ-32P]ATP.◦ A reação foi interrompida com TCA e o [γ-32P]ATP não

hidrolisado foi retirado com carvão ativado◦ Duas diferentes ATPases

Dependente de Mg2+, medida na presença de EGTA Dependente de Ca2+, descontando a atividade da anterior

Calor da Reação◦ Calorímetro◦ A Entalpia calorimétrica (ΔHcal ) foi calculada dividindo-se a

quantidade de calor liberado pela quantidade de ATP hidrolisado Valores negativos: reação exotérmica Valores positivos: reação endotérmica

MetodologiaMetodologia Procedimento Experimental

◦ Todos os experimentos foram realizados a 35ºC◦ Durante um experimento típico, o meio utilizado nos

ensaios é dividido em 3 amostras que são utilizadas simultaneamente para avaliação da captação de Ca2+, hidrólise de ATP e liberação de calor

◦ Inibidor de ATP sintase foi utilizado a fim de se evitar possível interferência devido a contaminação.

ResultadosResultados Efeito do KCl na captação de Ca2+ pela SERCA 1

ResultadosResultados

ResultadosResultados O efeito observado está relacionado ao cátion (K+) ou

ao ânion (Cl-)?

ResultadosResultados Efeito do KCl no efluxo de Ca2+

Resultados KCl provoca diminuição da concentração de equilíbrio

de Ca2+

◦ Inibição da atividade de Ca2+-ATPase? Não

ResultadosResultados Correlação entre as taxas de hidrólise de ATP e

produção de calor◦ Estudos anteriores demonstraram que:◦ (i) Em leaky LSRs, que não conseguem acumular Ca2+

durante a hidrólise de ATP, a quantidade de calor liberado por mol de ATP clivado é 50% menor que em vesículas intactas que acumulam Ca2+.

◦ (ii) Ao contrário, a ΔHcal da hidrólise de ATP não é modificada pelo acúmulo de Ca2+ em HSRs

◦ Esses ensaios, realizados em meio contendo KCl, foram confirmados.

ResultadosResultados Utilizando meio sem KCl

O calor liberado por molécula de ATP clivada é maior.

ResultadosResultados Efeitos da Valinomicina na captação de Ca2+ e na

produção de calor

ResultadosResultados

DiscussãoDiscussão Receptores de rianodina interagem com receptores de

diidropiridina e essa interação física parece ser necessária para o acoplamento excitação-contração que ocorre em células musculares de mamíferos;

Enquanto o potencial de ação se propaga pelo Túbulo T também ocorre uma mudança nas concentrações de Na+ e K+ nas junções comunicantes entre esses túbulos e o RS;

Variações nas concentrações destes íons nessa região podem ser importantes para aumentar o efluxo de Ca2+ na cisterna terminal;

Alguns estudos já demonstraram que Na+ e K+ interagem com o receptor de rianodina, aumentando sua permeabilidade ao Ca2+.

DiscussãoDiscussão Devido a localização desse receptor predominantemente em

HSR, o efeito do K+ na liberação de Ca2+ poderia ser atribuido à ligação do K+ no receptor de rianodina;

Entretanto, isso não explica a diferença na atividade termogênica encontrada entre vesículas LSR e HSR;

Alguns estudos já sugeriram que o K+ se liga a Ca2+ ATPase e altera passos do seu ciclo. De fato, o presente trabalho mostrou alterações na atividade ATPásica, tanto em HSR quanto LSR

Outras proteínas associadas, no HSR. O aumento de K poderia interferir nestas proteínas, que por sua vez atuariam concomitantemente na Receptor de Rianodina e na SERCA