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Cancro da Próstata e Obesidade:
Efeito da Leptina na Proliferação e Angiogénese do
Cancro da Próstata
Andreia Henriques Moutinho Ribeiro
Dissertação de Mestrado em Oncologia
2009
2
Andreia Henriques Moutinho Ribeiro
Cancro da Próstata e Obesidade: Efeito da Leptina na Proliferação e Angiogénese do Cancro da Próstata
Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Oncologia submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto.
Orientador – Professora Doutora Mariana Monteiro.
Categoria – Professora Auxiliar
Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto.
Co-orientador – Professor Doutor Rui Medeiros
Categoria – Professor Auxiliar com Agregação Convidado
Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto e Instituto Português de Oncologia do Porto
3
À minha avó.
4
Resumo
A obesidade está associada ao aumento da incidência e agressividade de
algumas neoplasias, nomeadamente da próstata. Estudos recentes sugerem que
hormonas do tecido adiposo, nomeadamente a leptina, possam influenciar o
crescimento e proliferação dos tumores, embora alguns resultados sejam
controversos.
O objectivo deste trabalho foi avaliar o crescimento de células de
adenocarcinoma da próstata murinas em ratinhos obesos com diversos
ambientes hormonais endógenos quanto à sensibilidade e aos níveis plasmáticos
de leptina.
Foram utilizados 4 grupos de ratinhos (n=6/grupo), C57BL6/J normoponderais
(controlo), obesos com mutação inactivante do receptor da leptina OBR (db/db),
obesos com deficiência leptina knock-out OB (ob/ob) e obesos induzidos pela
dieta (DIO), inoculados na região subcutânea dorsal com 3,0x105 células RM1
(células androgénio-independentes). Os tumores foram avaliados 14 dias depois,
tendo sido realizado um estudo morfométrico do grau de angiogénese e
proliferação celular (imunocito-química para a caveolina e Ki-67,
respectivamente). Os níveis de leptina e insulina plasmáticas foram doseados por
ELISA.
Quando comparados com o grupo controle, verificou-se que os tumores
induzidos nos grupos ob/ob e DIO eram significativamente maiores (p<0.001),
enquanto os do grupo db/db eram significativamente menores (p=0.047). A
análise morfométrica revelou que o índice mitótico e a densidade de núcleos
marcados com Ki-67, marcadores de proliferação celular era significativamente
mais baixa nos tumores do grupo db/db (p<0.001). Observou-se ainda uma
correlação inversa entre níveis plasmáticos de leptina e o peso do tumor (r=-
0.642, p<0.01), índice mitótico (r=-0.646, p<0.01) e o grau de proliferação
tumoral (r=-0.795, p<0.001). Não foi observada nenhuma relação entre os níveis
de insulina e a dimensão ou características histológicas do tumor.
Estes resultados sugerem que concentrações elevadas de leptina não são
favoráveis ao crescimento de células de carcinoma da próstata androgénio-
independente. Pelo contrário, níveis elevados de leptina, estão associados a
menor proliferação celular e angiogénese in vivo.
5
Abstract
Obesity has been associated with increased incidence and aggressiveness of
several cancers, such as prostate cancer. Several studies have suggested that
hormones from the adipose tissue, namely leptin, could influence tumoral growth
and proliferation, although there are some controversial data on this issue.
The main goal of this study was to access cellular growth and proliferation of
prostate adenocarcinoma cells in vivo, which was evaluated in obese mice with
different endogenous hormonal environments in what relates to leptin plasma
levels and sensitivity.
Four groups of mice (n=6/group) were used, namely obese mice with non-
functioning leptin receptor OBR due to a mutation that inactivates the db gene
(db/db), obese mice with leptin deficiency due to a mutation of the leptin gene ob
(ob/ob), DIO mice with diet induced and normoponderal C57BL6/J (control). All
groups of mice where injected subcutaneously at dorsal region with 3,0x105 RM1
cells (prostate carcinoma androgen independent cells). Tumour growth was
evaluated 14 days after inocculation, and immunocytochemical study was done to
evaluate the angiogenic and cellular proliferation index (using anti-caveolin and
Ki-67 immunestaining, respectively). Leptin and insulin plasma levels were also
evaluated by ELISA.
When compared with controls, the tumours induced in ob/ob and DIO mice
were significantly larger (p<0.001) while those induced in db/db mice were
significantly smaller (p=0,047). Morphometric analysis revealed that mitotic index
and Ki-67 positive nuclear density, both cell proliferation markers, were
statistically lower in db/db mice (p<0,001) when compared to controls. An inverse
correlation was observed between leptin plasma levels and tumour weight (r=-
0.642, p<0.001), mitotic index (r=-0.646, p<0.01) and Ki-67 positive nuclear
density (r=-0.795, p<0.001). No relationship was observed between the insulin
plasma levels and the tumour dimensions or histological parameters.
These results suggest that high leptin concentrations are not favourable to
RM1 androgen-independent prostate adenocarcinoma growth and proliferation.
On the contrary, high plasma leptin levels, were associated with less cellular
proliferation and angiogenesis in vivo.
6
Resumé
L'obesité est associé al'augmentation de l'incidence et agressivité de quelques
neoplasies, nottament de la prostate.
Des études récentes suggèrent: Les hormones du tissu adipeux, nommément
la leptine peuvent influencer la croissance et devellopement des tumeurs, même
si quelques resultats sont controversés.
Evaluer la croissance de célulles de adénocarcinome de la prostate des souris
obèses en plusieurs milieux hormonaux endogènes, rapport à la sensibilité et aux
niveaux plasmatiques de leptine.
Ont été utilisés quatre groupes de souris (n=6/groupe), C57BL6/J
normopondéraux (contrôle), obèses avec mutattion inactivante du recepteur de la
leptine OBR (db/db), obèses avec deficit de leptine knock-out OB (ob/ob) et
obèses induits par le regime (DIO), innocullles dans la region sous-cutannée
dorsal avec 3,0x105 celules RM1 (celules androgeno-independentes. Les tumeurs
ont été évalues 14 jours apès, ayant été realisé une étude morphométrique du
degrée del'angiogenèse et proliferation celulaire (imuno-cito-chimique pour la
cavéoline et Ki-67, respectivement). Les niveaux de léptine et insuline
plasmatiques ont été dosés par ELISA.
Quand on comparés avec le groupe de contrôle, les tumeurs induites dans les
groupesob/ob et DIO etaient remarquablement plus gros (p<0.001), alors que
ceux du groupe db/db etaient remarquablement plus petits (p=0.047). L'analyse
morphomètrique a revelè que l'indice mitotique et la densité des noyaux
marqués avec Ki-67, marqueurs de prolifération célulaire est nottablement plus
inferieure dans les tumeurs du groupe db/db (p<0.001).
Il aété observée une correlation inversée entre les niveaux plasmatiques de
lleptine et le poids de la tumeur (r=-0.642, p<0.01). Indice mitotique (r=-
0.646,p<0.01) et le degrée de proliferation tumoral (r=-0.795, p<0.001) Il n'a pas
été observée aucune relation entre les niveux de insuline et la taille où les
caracteristiques histologiques de la tumeur.
Ces resultats suggèrent que les concentrations èlevèes de leptine ne sont pas
favorables à la croissance de celules de Carcinome de la prostate andregenio-
independente.
Bien au contraire, des niveaux élevés de leptine, sont associés à une moindre
proliferation celulaire et angiogenèse in vivo.
7
Agradecimentos
Agradeço reconhecidamente ao Professor Carlos Lopes todo o apoio a nível de
histologia e por permitir o meu estágio no Serviço de Anatomia Patológica do
Hospital de Santo António. O conhecimento aí adquirido foi essencial para que
pudesse desenvolver o meu trabalho.
Ao Professor Sousa Pereira os meus agradecimentos por todo o apoio.
Ao Professor Artur Águas estou profundamente agradecida pela oportunidade
que me deu de estagiar no Departamento de Anatomia e de fazer parte da sua
equipa. Agradeço toda a receptividade e incentivo que foram imprescindíveis para
desenvolver e realizar o presente trabalho.
Obrigada especial ao Professor Rui Medeiros por ser meu co-orientador e pela
colaboração prestada ao desenvolvimento deste trabalho.
Estou profundamente agradecida à Professora Mariana Monteiro por todo o
apoio e disponibilidade concedidos desde o primeiro momento na minha
iniciação na área de investigação. Agradeço por ter aceite ser minha orientadora
como aluna de mestrado. Pela sua dedicação, pelo seu empenho, pela sua
paciência, pelo gosto que tem pela investigação o qual me conseguiu transmitir.
O meu muito, muito obrigada.
Obrigada especial ao Dr Ricardo Ribeiro pela disponibilidade e paciência
sempre demonstradas e pelo apoio na caracterização molecular da linha celular
que foi essencial para o desenvolvimento do meu trabalho.
Agradeço ao Professor Thimoty Thompson do MD Anderson Câncer Center,
Houston, Texas, USA, por gentilmente nos ter oferecido as células RM1 sem as
quais não seria possível concretizar o presente trabalho.
Agradeço à Dra Susana Carrilho, Dra Catarina Diogo do IBMC, à Dra Adelina
ICBAS e à Dra Carla Cerqueira pelo apoio prestado no desenvolvimento da técnica
de cultura celular da linha em estudo.
8
Agradeço à Dra Raquel Marques do Departemento de Anatomia do ICBAS por
toda a disponibilidade e paciência demonstrados no desenvolvimento da técnica
de Western-blot.
Um especial agradecimento ao técnico Duarte Monteiro do Departamento de
Anatomia do ICBAS pela disponibilidade sempre demonstrada, pelo apoio no
estudo in vivo e pela ajuda preciosa na encadernação da presente tese.
Agradeço a toda a equipa do Departamento de Anatomia do ICBAS: Professora
Maria João, Professora Paula Proença, Professor Joaquim Reis, Professor Teixeira
Gomes, Dra Sara Andrade, Dra Filipa Pinho e Dra Mónica Cunha e aos técnicos: à
Dra Madalena Costa, Alexandrina Ribeiro pelo apoio na realização da
imunocitoquímica, Ana Pinto, Costa e Silva, Manuela Silva.
Agradeço a todo o Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Geral de Santo
António, à directora dos técnicos Sra. D. Adelaide Brito, à equipa dos técnicos de
histologia: Virgínia Alexandra, Alexandra Oliveira, Carlos Azevedo e Antonieta
Maia. Um especial agradecimento ao técnico Carlos Gouveia pelo apoio na
imunohistoquímica, muito importante para a realização dos estudos
morfométricos, à Sra. D. Amélia Almeida e à Sra. D. Carla Ambrósio.
9
Índice de conteúdo
Resumo…………………………………………………………………………………………….4
Abstract……………………………………………………………………………………..........5
Resumé…………………………………………………………………………………………….6
Agradecimentos………………………………………………………………………………….7
Índice de conteúdo………………………………………………………………………………9
Índice de tabelas……………………………………………………………………………….12
Índice de Imagens……………………………………………………………………………..12
Abreviaturas…………………………………………………………………………………….14
Capítulo 1…………………………………………………………………………………….....16
Introdução……………………………………………………………………………………….17
1. Obesidade como factor de risco ………………………………………………...........17
2. Tecido adiposo………………………………………………………………………………18
2.1. Hormonas segregadas pelo adipócito……………………………………………..20
2.1.1. Leptina………………………………………………………………………………….20
2.1.2. Adiponectina…………………………………………………………………….……21
2.1.3. Resistina………………………………………………………………………….……21
2.1.4. Visfatina………………………………………………………………………………..22
2.1.5. Estrogénios……………………………………………………………………………23
2.2. Citoquinas e factores de crescimento produzidos pelo tecido
adiposo………………………………………………………………………………...24
2.2.1. TNF-α……………………………………………………………………………………24
2.2.2. VEGF…………………………………………………………………………………….24
2.2.3. IL-6………………………………………………………………………………………25
2.3.4. IGF-1…………………………………………………………………………………….26
3. Cancro e obesidade………………………………………………………………………..27
3.1. Resenha histórica………………………………….…………………………………...27
3.2. Actualidade………………………………………………………………………………27
3.3. Obesidade e cancro….………………………………………………………………...28
3.3.1. Factor do tecido adiposo…………………………………………………………..29
3.3.2. Leptina e carcinogénese……………………………………………………………29
3.3.2.1. Base molecular……………………………………………………………………..29
3.3.2.2. Leptina e desenvolvimento tumoral………………..…………………………30
3.3.3. Adiponectina e carcinogénese…………………………………….……….........31
3.3.3.1. Base molecular……………………………………………………………………..31
10
3.3.3.2. Adiponectina e desenvolvimento tumoral…………………………………….32
3.4. Factor indirecto hiperinsulinismo associado à insulina-resistência
presente ma obesidade: papel trófico da insulina……………………………….33
4. Cancro da próstata…………………………………………………………………………34
4.1. Cancro da próstata e obesidade…………………………………………………….34
Capítulo 2………………………………………………………………………………………..36
Objectivo…………………………………………………………………………………………37
Capítulo 3………………………………………………………………………………………..38
Material e métodos…………………………………………………………………………….39
5. Cultura celular………………………………………………………………………………39
6. Caracterização da linha celular RM1……………………………………………………41
6.1. Imunocitoquímica para o receptor da leptina……………………………………41
6.2. Estudo histológico da próstata de ratinho saudável……………………….…..41
6.2.1. Processamento da próstata………………………………………………………..41
6.2.2. Imunohistoquímica para receptor da leptina………………………………….42
7. Expressão do receptor da leptina nas células por RT-PCR
(reverse transcriptase polymerase chain reaction)……...………………………43
7.1. Extracção de RNA das células em cultura…………………………………………43
7.2. Transcriptase reversa (síntese de DNA)………………………..………………….43
7.3. Polymerase chain reaction (PCR)………….…………………………………………44
7.4. Electroforese dos produtos PCR…...……………………………………………….45
8. Western-blot para receptor da leptina…………………………………………………46
8.1. Preparação das amostras……………………………………………………………..46
8.2. Doseamento das proteínas...……………………………………………………......46
8.3. Electroforese SDS-Page……….……………………………………………………….47
8.4. Coloração de prata……………………………………………………………………..47
8.5. Western-blot…..........................................................................................48
9. Estudos in vivo...............................................................................................49
9.1. Animais………………………………………………………………………………......49
9.2. Curva dose-resposta em ratinhos C57BL6/J normoponderais………………..50
9.3. Crescimento das células RM1 em ratinhos obesos……………………………..51
10. Análise hsitológica dos tumores………………………………………………………52
10.1. Processamento dos tecidos…………………………………………………………52
10.2. Imunohistoquímica para Ki-67…………………………………………………….52
10.3. Imunohistoquímica para caveolina……………………………………………….53
11. Morfometria………………………………………………………………………………..54
11
12. Doseamentos hormonais………………………………………………………………..55
12.1. Doseamento da leptina………………………………………………...……………55
12..2. Doseamento da insulina……………………………………………………………56
13. Análise estatística dos resultados…………………………………………………….57
Capítulo 4……………………………………………………………………………………..…58
Resultados……………………………………………………………………………………….59
14. Caracterização da linha celular..………………………………………………………59
14.1. Imunocitoquímica para receptor da leptina..…………………………………..59
14..2. Imunohistoquímica da próstata de ratinho para receptor da lptina………60
14..3. Expressão do receptor de leptina nas células RM1 avaliado por RT-
PCR……………………………………………………………………………………..60
14.4. Western-blot para receptor da leptina…..……………………………………….62
15. Avaliação do crescimento das células tumorais RM1in vivo…………………….64
15.1. Curva dose-resposta em ratinhos C57BL6/J normoponderais………………64
15.2. Crescimento das células RM1 em ratinhos obesos……………………………65
16. Estudo morfométrico…………………………………………………………………….68
17. Doseamentos hormonais………………………………………………………………..73
18. Correlações…………………………………………………………………………………75
Capítulo 5………………………………………………………………………………………..77
Discussão geral e conclusão…………………………………………………………………78
Referências……………………………………………………………………….……………..90
12
Índice de Tabelas
Tabela 1. Representação dos primers e respectivas temperaturas de
anealing.……………………………………………………………………………43
Tabela 2. Descrição das estirpes utilizadas neste trabalho…………………………..49
Índice de Imagens
Figura 1. Imunocitoquímica obtida utilizando como anticorpo primário
anti-ObR……………………………………………………………………………..59
Figura 2. Cortes histológicos de próstata normal de ratinho
C57BL6/J marcados com anticorpo OBR 12A……………………………….60
Figura 3. Imagem da electroforese dos produtos de RT-PCR………………………...61
Figura 4. Resultados obtidos por electroforese e Western-blot para
receptor da leptina…………………………………..…………………………….63
Gráfico 1. Curva dose-resposta obtida por relação da inoculação de várias
doses de células tumorais………………………………………………………64
Gráfico 2. Peso dos ratinhos, nos diferentes grupos, no início do estudo………..65
Gráfico 3. Peso final dos ratinhos, 14º dia após inoculação, nos diferentes
grupos………………………………………………………………..…………....66
Gráfico 4. Comparação da percentagem de gordura epididimária entre os
diferentes grupos de ratinhos…………………………………………………67
Gráfico 5. Peso do tumor nos diferentes grupos de ratinhos………………………..67
Figura 5. Fotografias de imunohistoquímica realizada em cortes de tumor
para quantificação da proliferação celular utilizando como
marcador o Ki-67………………………………………………………………….68
Gráfico 6. Densidade nuclear determinada por observação de lâminas
marcadas com Ki-67……………………………………………………………..69
Figura 6. Fotografias de imunohistoquímica realizada em cortes de tumor
para determinação do índice mitótico utilizando como marcador
o Ki-67………………………………………………………………………………70
Gráfico 7. Densidade mitótica, nos diferentes grupos em estudo,
determinada por observação de lâminas marcadas com Ki-67…..…….71
Figura 7. Fotografias de imunohistoquímica realizada em cortes de tumor
para quantificação da angiogénese utilizando caveolina como
marcador do endotélio…………………………………………………………..72
13
Gráfico 8. Resultados obtidos na determinação da angiogénese tumoral
através de contagem de vasos marcados por caveolina…………………72
Gráfico 9. Representação gráfica da concentração da Leptina plasmática,
determinados por ELISA, dos diferentes grupos em estudo…………….73
Gráfico 10. Valores dos níveis de insulina plasmática obtidos nos diferentes
grupos………………………………………………………………………………74
Gráfico 11. Representação gráfica da relação entre os níveis de leptina
plasmáticos e o peso do tumor tendo-se verificado uma
correlação negativa entre estes dois parâmetros…….…………………75
Gráfico 12. Representação gráfica da relação entre concentração de leptina
plasmática e a marcação nuclear por Ki-67. Níveis de letpina e
angiogénese apresentam correlação negativa……………………………76
Gráfico 13. Representação gráfica da correlação entre níveis plasmáticos de
leptina e o índice mitótico. Estes dois parâmetros
apresentam correlação negativa…………………………………………….76
14
ABREVIATURAS
ADIPO-R1 Receptor 1 para adiponectina
ADIPO-R2 Receptor 2 para adiponectina
ANOVA Análise de Variância
DMEM Dulbecco’s Modified Eagles Medium
DMSO Dimethyl Sulfoxide
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
ERK Extracellular Signal-regulated Kinases
FCS Soro Bovino Fetal
FGF Fibroblast Growth Factor
HBEGF Heparin-binding EGF-like growth protein
HE Coloração hematoxilina eosina
HUVECs Células endoteliais humanas do cordão umbilical
ICQ Imunocitoquímica
IGF-1 Factor de crescimento 1 semelhante à insulina
IGFBP1 Proteína de ligação 1 do factor de crescimento semelhante à insulina
IGFBP2 Proteína de ligação 2 do factor de crescimento semelhante à insulina
IHQ Imunohistoquímica
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
IL-10 Interleucina 10
IL-12 Interleucina 12
IL-18 Interleucina 18
IMC Índice de massa corporal
JAK Janus Kinase
MAPK Mitogen-activated protein kinase
NSILA Nonsuppressible Insulin-like activity
PDGF-BB Patelet-derived growth factor BB
PI-3K Phosphoinositide 3-kinase
PCR Polymerase chain reaction
RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction
TAB Tecido adiposo castanho
TNF-α Factor de necrose tumoral alfa
TNF-R1 Receptor 1 factor de necrose tumoral
15
TNF-R2 Receptor 2 factor de necrose tumoral
VCAM Vascular Cell Adhesion Molecule
VEGF Factor de Crescimento Endotelial Vascular
16
Capítulo 1
INTRODUÇÃO
17
INTRODUÇÃO
1. OBESIDADE COMO FACTOR DE RISCO
No século passado, a obesidade tomou proporções epidémicas na maior parte
das populações ocidentais (Lehingue 1999; Hedley, Ogden et al. 2004; Ogden,
Carroll et al. 2006). O aumento da prevalência da obesidade e do excesso de
peso são atribuídos ao aumento do consumo de alimentos calóricos, em
particular dietas ricas em gordura, juntamente com o estilo de vida sedentário
(Crespo, Smit et al. 2001; Calle and Kaaks 2004; Stubbs and Lee 2004). A
obesidade é um importante problema de saúde pública uma vez que é
considerada um factor de risco para o desenvolvimento de várias comorbilidades
tais como hipertensão, diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares e alguns tipos
de cancro como, cólon, mama, próstata entre outros (Calle and Kaaks 2004;
Mistry, Digby et al. 2007). Desde 1970 que os estudos epidemiológicos defendem
a possibilidade de associação entre aumento de adiposidade e aumento de
incidência de cancro do cólon (Schoen, Tangen et al. 1999; Calle and Kaaks 2004;
Pischon, Lahmann et al. 2006; Giovannucci and Michaud 2007), da mama (Calle
and Kaaks 2004; Majed, Moreau et al. 2007), do rim (Asal, Risser et al. 1988;
Calle and Kaaks 2004; Luo, Margolis et al. 2007), do esófago (Brown, Swanson et
al. 1995; Vaughan, Davis et al. 1995; Calle and Kaaks 2004; Veugelers, Porter et
al. 2006) e do endométrio (Calle and Kaaks 2004; Chia, Newcomb et al. 2007)
assim como um prognóstico desfavorável e um aumento da taxa de mortalidade
por cancro (Calle and Kaaks 2004).
Como tal, é reconhecidamente importante o estudo das alterações que
ocorrem ao nível do tecido adiposo permitindo-nos perceber qual a relação entre
obesidade e doenças associadas (Wajchenberg 2000; Calle and Kaaks 2004).
18
2. TECIDO ADIPOSO
Na maioria dos mamíferos o tecido adiposo é classificado segundo
características histológicas e moleculares em tecido adiposo branco (TAB) e
tecido adiposo castanho (Garg 2006) sendo o primeiro mais abundante, e o
segundo, que desempenha um importante papel na termogénese, apenas
encontrado nos humanos durante a infância quando participa na manutenção do
calor corporal (Garg 2006; Tilg and Moschen 2006). O TAB funciona como
reservatório energético, que durante os estados de deprivação calórica pode ser
mobilizada libertando ácidos gordos livres que vão ser oxidados noutros tecido e
órgãos (Trayhurn and Beattie 2001; Garg 2006). Este tecido promove o
isolamento térmico e desempenha papel importante na regulação da homeostase
da glucose (Trayhurn and Beattie 2001).
O TAB está distribuído subcutaneamente formando tecido adiposo subcutâneo
e preenchendo cavidades como a abdominal e envolvendo os órgãos internos
formando o tecido adiposo visceral (Calle and Kaaks 2004). O tecido adiposo
intra abdominal é classificado como gordura omental e mesentérica e está
localizado perto das vísceras abdominais e no espaço retroperitoneal (Marin,
Andersson et al. 1992).
O tecido adiposo para além dos adipócitos, células mais abundantes, também
possui vários outros tipos de células tais como pré-adipócitos, células
estromáticas, fibroblastos, leucócitos e macrófagos (Trayhurn and Beattie 2001;
Frayn, Karpe et al. 2003; Kershaw and Flier 2004).
Os adipócitos possuem vesículas de gordura que ocupam mais de 90% do
volume total da célula e que para além de funcionarem como depósitos de
energia também mostram actividade lipolítica libertando quantidades elevadas de
ácidos gordos livres para o plasma consoante o necessário (Garg 2006; Ronti,
Lupattelli et al. 2006). Contrariamente ao que se pensou durante muitos anos, o
tecido adiposo não é apenas um depósito de triglicerídeos passivo mas também
um tecido metabolicamente muito activo apresentando funções biológicas e
endócrinas importantes, particularmente marcadas no tecido adiposo visceral
(Trayhurn and Beattie 2001; Kershaw and Flier 2004; Kelesidis, Kelesidis et al.
2006; Ronti, Lupattelli et al. 2006).
Em 1987, foram identificadas as primeiras vias endócrinas no adipócito com a
descoberta de várias enzimas que participam no metabolismo de hormonas
sexuais esteróides, tais como a aromatase, responsável pela conversão de
19
androgénios (testosterona, androgénio 4-androstenediona) em estrogénios
(oestradiol, oestrone), e a 17-hidroxi-esteroide-desidrogenase (17-HSD),
responsável pela conversão da androstenediona em testosterona e de estrona em
estradiol (Trayhurn and Beattie 2001; Calle and Kaaks 2004; Kershaw and Flier
2004). A obesidade promove um aumento da síntese de testosterona e de
estradiol no adipócito, aumentando a sua disponibilidade (Calle and Kaaks 2004).
Contudo, foi apenas em 1994 com a descoberta da leptina, a primeira hormona
produzida pelo adipócito a ser identificada que levou à aceitação do tecido
adiposo como órgão endócrino (Zhang, Proenca et al. 1994). Após a descoberta
da leptina várias outras hormonas produzidas peo adipócito foram descobertas
tais como, a adiponectina (Haque and Garg 2004; Ronti, Lupattelli et al. 2006;
Tilg and Moschen 2006; Badman and Flier 2007), a angiotensina (Ronti, Lupattelli
et al. 2006; Badman and Flier 2007), a resistina (Haque and Garg 2004; Ronti,
Lupattelli et al. 2006; Tilg and Moschen 2006; Badman and Flier 2007) e a
visfatina (Fukuhara, Matsuda et al. 2005; Ronti, Lupattelli et al. 2006; Badman
and Flier 2007) e além de várias citocinas tais como TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10,
IL-18 e, factores de crescimento, como VEGF, VCAM, os quais participam em
processos inflamatórios (Wajchenberg 2000; Trayhurn and Beattie 2001; Kershaw
and Flier 2004).
Algumas destas hormonas e factores de crescimento segregados pelo
adipócito parecem estar associados com a carcinogénese (Hoda, Grimm et al.
2005; Baillargeon, Platz et al. 2006; Bub, Miyazaki et al. 2006; Garofalo and
Surmacz 2006; Horiguchi, Sumitomo et al. 2006; Kelesidis, Kelesidis et al. 2006;
Sharma, Saxena et al. 2006; Soliman, Wu et al. 2006; Takemura, Osuga et al.
2006; Hou, Xu et al. 2007; Kang, Yu et al. 2007; Mistry, Digby et al. 2007; Weiss,
Huang et al. 2007). Vários estudos apoiam a relação entre níveis de leptina, TNF-α
(Mistry, Digby et al. 2007), IL-6 (Mistry, Digby et al. 2007) e VEGF (Mistry, Digby et
al. 2007), cujas concentrações se encontram elevadas nos indivíduos obesos, e o
risco de desenvolver alguns tipos de carcinoma tais como o cancro da próstata
(Mistry, Digby et al. 2007). Enquanto que outros factores, tais como a
adiponectina, parecem exercer um efeito protector na carcinogénese (Goktas,
Yilmaz et al. 2005; Bub, Miyazaki et al. 2006; Mistry, Digby et al. 2007).
20
2.1. Hormonas segregadas pelo adipócito
2.1.1. Leptina
A leptina é uma proteína composta por 167 aminoácidos com um peso
molecular de 16kDa, é segregada pelo adipócito, predominantemente pelo tecido
adiposo subcutâneo, e libertada para o plasma onde circula em níveis geralmente
proporcionais à quantidade de tecido adiposo assim como ao estado nutricional
do indivíduo (Frederich, Hamann et al. 1995; Boden, Chen et al. 1996; Haque and
Garg 2004), contudo a leptina também é segregada por outros tecidos e órgãos,
tais como células da mucosa gástrica (Bado, Levasseur et al. 1998), células
epiteliais mamárias (Smith-Kirwin, O'Connor et al. 1998), miócitos (Wang, Liu et
al. 1998) e placenta (Senaris, Garcia-Caballero et al. 1997). Os níveis plasmáticos
de leptina estão positivamente correlacionados com a massa gorda (Frederich,
Hamann et al. 1995; Boden, Chen et al. 1996; Thomas, Burguera et al. 2000),
assim indivíduos obesos têm níveis de leptina elevados, com rara excepção dos
pacientes com deficiência congénita de leptina (Farooqi, Matarese et al. 2002;
Bjorbaek and Kahn 2004; Farooqi, Bullmore et al. 2007).
A leptina é codificada pelo gene ob e actua ao nível do hipotálamo onde
regula o peso corporal e a homeostase energética, produzindo sinais de
saciedade (Zhang, Proenca et al. 1994; Farooqi, Bullmore et al. 2007). Nas formas
comuns de obesidade observa-se um aumento dos níveis de leptina associados a
resistência à leptina, nomeadamente aos efeitos anorexizantes centrais, por
razões ainda não clarificadas (Caro, Kolaczynski et al. 1996; Kolaczynski,
Ohannesian et al. 1996).
Esta hormona tem várias outras funções nomeadamente regulação
hematopoiética, angiogénica e também actua como mediador no sistema
imunológico e no processo inflamatório (Wajchenberg 2000; Trayhurn and Beattie
2001; Ambrosini, Nath et al. 2002). A leptina pertence à família das adipocinas
uma vez que a estrutura molecular é homóloga à da família das citocinas
(Fantuzzi and Faggioni 2000).
21
2.1.2. Adiponectina
Adiponectina é uma hormona polipéptidica, com peso molecular 30kDa
constituída por 244 aminoácidos, contendo um grupo amina (N) na sequência
sinal terminal, um domínio variável, um domínio de colagénio e um domínio
carboxilo (C) terminal globular (Maeda, Okubo et al. 1996; Trayhurn and Beattie
2001). A adiponectina encontra-se no plasma sob duas formas, a forma longa (f-
adiponectina) e a forma curta ou fragmento globular (g-adiponectina) (Yamauchi,
Kamon et al. 2003; Kadowaki and Yamauchi 2005; Mistry, Digby et al. 2007). Os
receptores da adiponectina são proteínas membranares integrais e são
designados por AdipoR1 e AdipoR2 (Yamauchi, Kamon et al. 2003; Kershaw and
Flier 2004; Kadowaki and Yamauchi 2005; Mistry, Digby et al. 2007). O primeiro
tem afinidade elevada para a forma globular sendo mais abundante no músculo
esquelético e o segundo tem afinidade intermédia para ambas as formas da
hormona e é expresso predominantemente no fígado (Goldstein and Scalia 2004;
Kelesidis, Kelesidis et al. 2006). Esta hormona desempenha um papel importante
na regulação do equilíbrio energético e homeostase da glucose, funcionando
como factor anti-diabético, anti-inflamatório e anti-aterogénico pelo aumento da
sensibilidade à insulina (Hotta, Funahashi et al. 2001; Diez and Iglesias 2003;
Lihn, Pedersen et al. 2005; Ronti, Lupattelli et al. 2006).
Os níveis de adiponectina plasmática estão diminuídos em algumas condições
patológicas tais como, obesidade, lipodistrofia e resistência à insulina
(Wajchenberg 2000; Kershaw and Flier 2004; Lihn, Pedersen et al. 2005).
2.1.3. Resistina
Resistina é uma proteína constituída por 114 aminoácidos, apresentando
12kDa sendo codificada pelo gene Retn (Steppan, Bailey et al. 2001; Kershaw and
Flier 2004; Kusminski, McTernan et al. 2005).
Os níveis plasmáticos estão altamente correlacionados com a massa de tecido
adiposo. Vários estudos mostraram que os níveis de resistina se encontram
aumentados na obesidade, em humanos (McTernan, McTernan et al. 2002;
McTernan, McTernan et al. 2002; Azuma, Katsukawa et al. 2003) e em roedores
(Savage, Sewter et al. 2001; McTernan, McTernan et al. 2002; McTernan,
McTernan et al. 2002; Rajala, Qi et al. 2004; Lee, Bullen et al. 2005).
22
A hormona é sintetizada pelo adipócito, no ratinho, e nos adipócitos,
miocitos, células pancreáticas e principalmente nas células mononucleares
(macrófagos) nos humanos (Savage, Sewter et al. 2001; Tilg and Moschen 2006).
Tal como outras adipocinas, a resistina, desempenha papel importante na
homeostase energética, pela termogénese (Qi, Nie et al. 2006) e na resistência à
insulina (Savage, Sewter et al. 2001; Janke, Engeli et al. 2002; Oliver, Ribot et al.
2006). Savage colocou a hipótese desta desta hormona poder estabelecer ligação
entre obesidade e resistência à insulina, ao constatar que a resistina contrariava a
acção da insulina in vivo e in vitro numa linha celular de adipócitos (Savage,
Sewter et al. 2001). Oliver et al verificou que os níveis de resistina são
determinados pelo estado nutricional, mais do que pela obesidade, a qual está
relacionada com alterações no conteúdo gástrico e nos níveis de insulina (Oliver,
Ribot et al. 2006).
Nos humanos existe alguma controvérsia quanto ao papel desempenhado
pela resistina. Alguns estudos detectaram aumento dos níveis de resistina na
obesidade (McTernan, McTernan et al. 2002; McTernan, McTernan et al. 2002;
Azuma, Katsukawa et al. 2003) enquanto outros autores não detectaram qualquer
associação (Nagaev and Smith 2001; Janke, Engeli et al. 2002).
Também contrariamente ao que foi observado nos roedores, nos humanos
não foi detectada qualquer associação entre níveis elevados de resistina e
resistência à insulina (Nagaev and Smith 2001; Savage, Sewter et al. 2001; Janke,
Engeli et al. 2002; Utzschneider, Carr et al. 2005). Nagaev não encontrou
qualquer diferença nos níveis de expressão da resistina, em adipocitos de
indivíduos com sensibilidade à insulina normal, resistência à insulina e diabetes
tipo 2 (Nagaev and Smith 2001). Por outro lado a resistina humana parece
desempenhar funções pró-inflamatórias uma vez que promove a síntese de
citocinas pró-inflamatórias tais como TNFα, IL-1, IL-6 e IL-12 (Silswal, Singh et al.
2005).
2.1.4. Visfatina
A visfatina é outra hormona que foi recentemente identificada, é uma proteína
com 52 kDa, segregada e libertada pelos adipócitos, principalmente pelos do
tecido adiposo visceral (Tilg and Moschen 2006) estando os seus níveis
plasmáticos aumentados na obesidade. Este factor parece estar relacionado com
a diminuição da resistência à insulina sendo capaz de se ligar aos receptores de
23
insulina, sem competir com a insulina mas tendo os mesmos efeitos (Fukuhara,
Matsuda et al. 2005). Apresenta semelhanças estruturais com o factor pré-célula
B sendo atribuído a esta hormona comportamento imunológico em doenças
inflamatórias tais como lesões pulmonares agudas (Ye, Simon et al. 2005) e na
inibição da apoptose dos neutrófilos activos (Jia, Li et al. 2004). A visfatina actua
como um importante regulador imunológico com propriedades pró-inflamatórias
(Moschen, Kaser et al. 2007).
2.1.5. Estrogénios
Os estrogénios são as principais hormonas sexuais femininas ocorrendo
principalmente sobre a forma de estradiol, estriol e estrona, resultantes da
transformação enzimática de androgénios (aromatização). Os estrogénios
desempenham várias funções biológicas tanto nos homens como nas mulheres,
tendo neste último caso como papel principal, o desenvolvimento das
características sexuais secundárias e a regulação dos ciclos reprodutores. Nos
homens, os estrogénios também são importantes no sistema reprodutor
principalmente na maturação do esperma. Os estrogénios desempenham papel
importante no desenvolvimento do esqueleto, sendo responsável pelo
dimorfismo sexual do esqueleto (Turner, Riggs et al. 1994). Na mulher adulta,
funciona como protector ósseo (Turner, Riggs et al. 1994; Sunyer, Lewis et al.
1999). Na menopausa os níveis de estrogénios decaem levando a perda de massa
óssea o que leva a um aumento de risco de fractura. A hormona actua sobre os
osteoclastos melhorando a densidade óssea diminuindo ou inibindo a actividade
reabsortiva nas superfícies trabeculares do osso medular e das zonas
endocorticais do osso cortical (Turner, Riggs et al. 1994).
A aromatase é uma enzima expressa no tecido adiposo que desempenha
papel importante na síntese de estrogénios, sendo responsável pela conversão da
testosterona em estradiol e da androstenediona em estrona. A expressão da
aromatase e a taxa de conversão dos androgénios em estrogénios está
aumentada na obesidade (Wajchenberg 2000; Calle and Kaaks 2004).
24
2.2. Citoquinas e factores de crescimento produzidos pelo tecido
adiposo
2.2.1. TNF-α
O factor de necrose tumoral alfa (TNF-α) é uma citoquina, pró-inflamatória,
que foi descrita inicialmente como sendo uma endotoxina, semelhante a
caquexina, com capacidade para promover a necrose tumoral (Ruan and Lodish
2003; Rose, Komninou et al. 2004). Este factor é produzido pelo tecido adiposo,
principalmente pelos macrófagos residentes (Rose, Komninou et al. 2004). O
TNF-α é uma proteína transmembranar com 26 kDa a qual é clivada numa
proteína mais pequena 17kDa, biologicamente activa actuando nos receptores
TNF-R1, expresso na maior parte dos tecidos incluindo o tecido adiposo, e TNF-
R2, encontrado nas células do sistema imunológico (Fain, Madan et al. 2004;
Ronti, Lupattelli et al. 2006). Este factor é segregado pelos monócitos e
macrofagos ligando-se aos receptores nos neutrófilos promovendo a resposta
quimiotática (La Cava and Matarese 2004).
TNF-α é também expresso nos adipócitos do tecido adiposo,
predominantemente no tecido adiposo subcutâneo (Wajchenberg 2000; Fain,
Madan et al. 2004; Kershaw and Flier 2004) e está relacionado com a massa
gorda total. Os níveis circulantes deste factor estão aumentados na obesidade e
diminuem significativamente após a perda de peso (Wajchenberg 2000; Fain,
Madan et al. 2004; Guerre-Millo 2004; Ronti, Lupattelli et al. 2006). Observa-se
uma correlação positiva entre expressão de TNF-α no tecido adiposo e o nível da
insulinemia e da resistência à insulina (Trayhurn and Beattie 2001; Ruan and
Lodish 2003; Ronti, Lupattelli et al. 2006).
2.2.2. VEGF
O factor de crescimento vascular endotelial (VEGF) é um mediador que
apresenta peso molecular igual a 46 kDa e cujas concentrações plasmáticas estão
correlacionadas positivamente com a quantidade de tecido adiposo visceral
(Baillargeon, Platz et al. 2006; Miyazaki, Bub et al. 2008). Desempenha funções
mitogénicas estimulando também a migração celular, angiogénese e
permeabilidade vascular (Claffey, Wilkison et al. 1992; Frankenberry, Somasundar
et al. 2004; Rose, Komninou et al. 2004). Foi demonstrado que VEGF tem papel
25
importante na vascularização de tumores sólidos malignos facilitando a invasão
celular e a formação de metástases à distância (Mistry, Digby et al. 2007).
O tecido adiposo é o principal local de produção de Interleucina 6 (IL-6),
citoquina com peso molecular entre 21 e 28kDa, sendo a sua produção duas a
três vezes superior no tecido adiposo visceral do que no subcutâneo (Fried,
Bunkin et al. 1998; Fain, Madan et al. 2004). A concentração plasmática da IL-6
está correlacionada positivamente com a quantidade de tecido adiposo,
obesidade e resistência à insulina (Fain, Madan et al. 2004; Guerre-Millo 2004;
Kershaw and Flier 2004; Khaodhiar, Ling et al. 2004; Mistry, Digby et al. 2007),
enquanto que está inversamente relacionada com a sensibilidade à insulina
(Guerre-Millo 2004; Ronti, Lupattelli et al. 2006). Juntamente com a TNF-α, a IL-6
regula a expressão da lipoproteína lipase, enzima que desempenha um papel
importante na regulação da deposição de ácidos gordos no tecido adiposo (Fried,
Bunkin et al. 1998). Participa na regulação imunológica, na regulação das funções
celulares como proliferação, apoptose, angiogénese e diferenciação celular (Culig,
Steiner et al. 2005), actua como regulador metabólico de lípidos e proteínas no
tecido adiposo e modula o eixo hipotálamo-hipófise-supra renal (Wajchenberg
2000). No hipotálamo os efeitos da IL-6 são semelhantes aos da leptina,
promovendo a diminuição da ingestão alimentar e o aumento do gasto
energético, promovendo produção hepática de triglicerídeos sendo responsável
pela resistência à insulina e pela tolerância à glicose (Wajchenberg 2000).
2.2.3. IL-6
O tecido adiposo é o principal local de produção de Interleucina 6 (IL-6),
citoquina com peso molecular entre 21 e 28kDa, sendo a sua produção duas a
três vezes superior no tecido adiposo visceral do que no subcutâneo (Fried,
Bunkin et al. 1998; Fain, Madan et al. 2004). A concentração plasmática da IL-6
está correlacionada positivamente com a quantidade de tecido adiposo,
obesidade e resistência à insulina (Fain, Madan et al. 2004; Guerre-Millo 2004;
Kershaw and Flier 2004; Khaodhiar, Ling et al. 2004; Mistry, Digby et al. 2007),
enquanto que está inversamente relacionada com a sensibilidade à insulina
(Guerre-Millo 2004; Ronti, Lupattelli et al. 2006). Juntamente com a TNF-α, a IL-6
regula a expressão da lipoproteína lipase, enzima que desempenha um papel
importante na regulação da deposição de ácidos gordos no tecido adiposo (Fried,
Bunkin et al. 1998). Participa na regulação imunológica, na regulação das funções
26
celulares como proliferação, apoptose, angiogénese e diferenciação celular (Culig,
Steiner et al. 2005), actua como regulador metabólico de lípidos e proteínas no
tecido adiposo e modula o eixo hipotálamo-hipófise-supra renal (Wajchenberg
2000). No hipotálamo os efeitos da IL-6 são semelhantes aos da leptina,
promovendo a diminuição da ingestão alimentar e o aumento do gasto
energético, promovendo produção hepática de triglicerídeos sendo responsável
pela resistência à insulina e pela tolerância à glicose (Wajchenberg 2000).
2.2.4. IGF-1
Inicialmente designado por NSILA (nonsupressible insuline-like and cell-growth
promoting activities), trata-se de um polipéptido encontrado no soro humano
com actividade semelhante à insulina mas não suprimido por anticorpos anti-
insulina (Froesch, Buergi et al. 1963). Rinderknecht e colegas após verificarem
que o NSILA actua como factor de crescimento na síntese de DNA, RNA, e
proteínas e na taxa de crescimento de fibroblastos propuseram uma nova
designação para esta molécula, insulin-like growth factor-1 (IGF-1) (Rinderknecht
and Humbel 1976). O factor de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) é uma
proteína constituída por 70 aminoácidos apresentando 7649 Da e que é
produzida redominantemente no fígado (Rinderknecht and Humbel 1978; Severi,
Morris et al. 2006; Sievers, Schneider et al. 2008) possuindo receptores em quase
todas as células do corpo humano, tais como os adipócitos.
O IGF-1 foi identificado como sendo um péptido com funções pleiotrópicas,
nomeadamente metabólicas, mitogénicas, anti-apoptóticas, promotor de síntese
proteica, neurogénico, glicogénico e neuroprotector, promotor de sinapses,
modulador da libertação de neurotransmissores, remodelação de vasos e
composição corporal (Firth and Baxter 2002; Sievers, Schneider et al. 2008).
Actua nos pré-adipócitos promovendo a proliferação celular e diferenciação
em adipócitos (Kamai, Mikawa et al. 1996; Wajchenberg 2000). Os níveis de IGF-1
foram relacionados com cancro, doenças cardiovasculares e metabólicas (Sievers,
Schneider et al. 2008).
27
3. CANCRO E OBESIDADE
3.1. Resenha histórica
No início do século XX já se suspeitava da relação entre cancro e obesidade
tendo-se efectuado numerosos estudos nesta área recorrendo ao modelo animal,
procurando estabelecer a associação entre ingestão de dietas hipercalóricas,
obesidade e desenvolvimento tumoral. Em 1953, Waxler e colegas, recorreram ao
modelo animal C3H, o qual apresenta incidência elevada de tumores mamários
espontâneos, tendo induzido a obesidade em ratinhos do sexo feminino por
injecção intraperitoneal de tioglucose e verificado que nos ratinhos com
obesidade induzida o aparecimento dos tumores ocorria mais precocemente e em
maior número de casos do que nos ratinhos controlo (Waxler, Tabar et al. 1953).
Em 1966, também Waxler e colaboradores apresentaram um trabalho em que
procurava estudar a acção da obesidade no desenvolvimento tumoral em ratinhos
do sexo feminino castrados tendo para isso recorrido ao modelo C3H. As fêmeas,
aos três meses de idade, foram divididas em dois grupos sendo um dos grupos
sujeito a uma ooforectomia bilateral. Duas semanas após a cirurgia dividiu-se
cada um dos grupos anteriores em dois grupos formando-se quatro grupos:
ratinhos castrados obesos, ratinhos castrados não obesos, ratinhos não castrados
obesos e ratinhos normais. Verificou-se que os ratinhos obesos apresentavam
uma percentagem 45%,superior de desenvolvimento tumoral relativamente a
todos os grupos, apresentando o grupo de ratinhos obesos castrados a menor
percentagem (18%). Apoiando este estudo o efeito da obesidade no aumento da
incidência e aparecimento precoce de tumores mamários espontâneos (Waxler
and Leef 1966).
1.2.2. Actualidade
A relação entre cancro e obesidade parece existir e é apoiada por vários
autores (Calle, Rodriguez et al. 2003; Calle and Kaaks 2004; Rapp, Schroeder et
al. 2005). Calle et al (2003) efectuou estudo prospectivo seguindo uma cohort de
900 053 adultos, 404 576 homens e 495 477 mulheres, livres de cancro no início
do estudo, com idade média de 57 anos, e acompanhada durante 16 anos tendo
observado que indivíduos com índice de massa corporal de pelo menos 40, têm
taxas de mortalidade 52%, no caso dos homens, e 62%, para as mulheres, mais
28
elevadas do que homens e mulheres apresentando peso normal. Concluindo
assim que existe relação entre excesso de peso e obesidade e todos os tipos de
cancro verificando-se um aumento da taxa de mortalidade com a obesidade
(Calle, Rodriguez et al. 2003). Rapp et al efectuou um estudo prospectivo numa
cohort 145 931 adultos, 78 484 mulheres e 67 447 homens, durante
aproximadamente 9,9 anos, sendo a idade média dos participantes 42 anos e o
valor mínimo de índice de massa corporal aceite 18,5 Kg/m-2 e o máximo 35
Kg/m-2, verificou, nos indivíduos do sexo masculino, que um aumento relativo do
peso corporal está associada ao aumento do cancro do cólon, do recto e do
pâncreas quando comparado com homens apresentando peso normal. Nos
indivíduos do sexo feminino, embora se observasse uma fraca associação
positiva entre o índice de massa corporal e o cancro em geral, verificou-se uma
forte associação da obesidade com o cancro do endométrio e o aumento da
incidência do linfoma non-Hodgkin, não se verificando associação entre
obesidade e cancro do cólon e do recto (Rapp, Schroeder et al. 2005). No entanto
alguns estudos apoiam o contrário, ou seja, a não relação entre obesidade e
cancro afirmando mesmo que o tecido adiposo possa funcionar como um
protector na carcinogenese. Nunez e colaboradores realizaram um estudo, não
epidemiológico, recorrendo ao modelo animal “Fatless mouse A-ZIP/F1” tendo
concluído que a promoção do desenvolvimento tumoral não está relacionado com
as adipocinas que se encontram aumentadas na obesidade. Os ratinhos A-ZIP/F1
são animais com pouco tecido adiposo branco produzindo quantidades
indetectáveis de adipocinas no entanto apresentam maior incidência tumoral do
que ratinhos controlo da estirpe selvagem. Estes estudos apoiam a relação entre
níveis elevados de factores de crescimento e citoquinas tais como insulina, IGF-1,
hormona de crescimento, factor de crescimento endotelial vascular e citoquinas
proinflamatórias como sendo os principais responsáveis pelo desenvolvimento
tumoral neste modelo animal (Nunez, Oh et al. 2006). Ablamunits e
colaboradores defendem a ideia de que o tecido adiposo actua como protector no
desenvolvimento tumoral uma vez que após indução de papilomas cutâneos em
ratinhos com lipodistrofia e ratinhos obesos ob/ob, ambos com níveis de leptina
muito baixos ou inexistente verificou que o crescimento tumoral era maior nos
ratinhos obesos (Ablamunits, Cohen et al. 2006).
29
3.3. Obesidade e cancro
Existem várias hipóteses explicativas para a associação encontrada entre
obesidade e cancro, sendo uma das principais a presença de factores do tecido
adiposo alterados, nomeadamente a produção excessiva de mediadores pró-
carcinogénicos e/ou a diminuição da produção de mediadores anti-
carcinogénicos pelo tecido adiposo. Outra hipótese defendida por alguns autores
é a presença de resistencia a insulina, frequentemente associada a obesidade,
mas também presente noutros estados patológicos, tais como síndromes
lipodistróficos.
3.3.1. Factor do tecido adiposo
O tecido adiposo, como órgão endócrino, produz várias hormonas e factores
de crescimento, das quais a leptina e a adiponectina são dois exemplos que na
obesidade se encontram aumentadas e diminuídas, respectivamente, tendo
ambas sido implicadas como potenciais mediadores na carcinogénese.
3.3.2. Leptina e carcinogénese
3.3.2.1. Base molecular
A leptina tem sido apontada como factor de crescimento e desenvolvimento
tumoral e níveis elevados de leptina são considerados um factor de risco para o
cancro do colon, da mama e da próstata (Dieudonne, Machinal-Quelin et al. 2002;
Hu, Juneja et al. 2002; Laud, Gourdou et al. 2002; Stattin, Lukanova et al. 2004).
Em 1995 (Tartaglia, Dembski et al. 1995) e início de 1996 (Lee, Proenca et al.
1996) foram identificados os receptores transmembranares da leptina, os quais
são responsáveis pela actividade desta hormona. O OBRb é, das seis isoformas
existentes (OBRa-e), a principal sendo uma das responsáveis pela activação das
vias de sinalização intracelulares. As três vias principais são: a via JAK2/STAT3
(Janus Kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3), a cascata de
sinalização Ras/ERK1/2 (Ras/extracellular signal-regulated kinases 1/2), e a via
de crescimento antiapoptótica PI-3K/Akt/GSK3 (phosphoinositide 3
kinase/protein kinase B/ glycogen synthesis kinase 3). A ligação de leptina ao
OBRb pode activar vários genes envolvidos na proliferação celular, incluindo c-fos,
30
c-jun, junB, egr-1 e socs3 e na regulação da expressão de factores angiogénicos,
tais como VEGF (Murakami, Yamashita et al. 1997; Fruhbeck 2006).
3.3.2.2. Leptina e desenvolvimento tumoral
A leptina é considerada um mediador mitogénico, anti-apoptótico (Hoda and
Popken 2008), angiogénico e promotor do desenvolvimento tumoral, uma vez
que tumores com grandes massas celulares poderão entrar em hipoxia se não
ocorrer angiogénese (Ambrosini, Nath et al. 2002). Ambrosini et al observaram
que o gene da leptina está transcripcionalmente activo em resposta à hipoxia
fazendo com que os níveis de leptina aumentem nestas situações (Ambrosini,
Nath et al. 2002).
Vários ensaios foram realizados para estudar a influência da leptina no
desenvolvimento de vários carcinomas nomeadamente do cólon, renal,
endométrio, mama e próstata.
No cancro do cólon, Hoda et al concluiram que a leptina actua como factor
mitogénico e anti-apoptótico activando as vias de sinalização MAPK e PI3-K, vias
de transdução de sinal que desempenham um importante papel na proliferação
celular e progressão tumoral (Hoda, Grimm et al. 2005). Também os estudos de
Hardwick e colaboradores são a favor associação da obesidade e cancro do cólon,
os autores verificaram por RT-PCR a presença de receptores de leptina, isoformas
curta e longa, em linhas celulares de carcinoma do colon e por
imunohistoquímica em tecido humano de cancro de cólon e confirmaram a acção
da leptina como factor de crescimento celular ao realizarem estudos in vitro que
demonstraram que a leptina actua como factor pró-proliferativo celular ao activar
a via de sinalização MAPK e estudos in vivo que demonstraram o aumento da
proliferação celular verificada pela incorporação nuclear de bromodeoxiuridina
nas células de epitélio cólico normal em ratinhos com ambientes endógenos ricos
em leptina (ratinhos db/db) e em ratinhos C57BL6/J com hiperleptinémia exógena
após administração intraperitoneal de leptina recombinante (Hardwick, Van Den
Brink et al. 2001).
Relativamente ao carcinoma celular renal, Horiguchi et al documentaram que
níveis plasmáticos de leptina elevados e expressão elevada de OBR estão positiva
e significativamente relacionados com a presença de invasão venosa em doentes
com este tipo de carcinoma devendo estes factores desempenhar um papel na
31
invasão das células renais podendo ser importantes indicadores da progressão do
carcinoma renal (Horiguchi, Sumitomo et al. 2006).
Sharma et al avaliaram o papel da leptina na proliferação celular, estudando
as vias de sinalização da leptina, nomeadamente a JAK/STAT e a ERK/AKT em
linhas celulares, Ishikawa e ECC1, de adenocarcinoma de endométrio humano,
tendo verificado que a hormona desempenhava um papel importante na activação
da STAT3, do ERK e AKT sendo estas vias essenciais para a proliferação célular
(Sharma, Saxena et al. 2006).
Os estudos de Hou et al apoiam a relação entre obesidade e cancro de mama,
ao terem verificado que níveis elevados de leptina associados a níveis baixos de
adiponectina cursam com o aumento de risco de desenvolver cancro da mama
(Hou, Xu et al. 2007).
No que diz respeito a cancro da próstata também há resultados que apoiam o
efeito positivo da leptina no desenvolvimento tumoral. Frankenberry e
colaboradores realizaram um estudo in vitro cultivando células tumorais
prostáticas androgénio independentes humanas, DU145 e PC-3, na presença de
leptina tendo verificado que este factor tinha um efeito mitogénico (Frankenberry,
Somasundar et al. 2004).
3.3.3. Adiponectina e carcinogénese
3.3.3.1. Base molecular
A adiponectina, para além de estar relacionada com o metabolismo lipídico e
da glucose, parece desempenhar um importante papel na prevenção de alguns
tipos de cancro. Dado que a obesidade cursa frequentemente com uma
diminuição dos níveis de adiponectina, este factor poderia facilitar a
carcinogénese e justificar a associação entre a obesidade e cancro (Kelesidis,
Kelesidis et al. 2006). Esta hormona actua como anti carcinogénico ligando-se a
vários factores de crescimento mitogénicos como platelet-derived growth factor
(PDGF-BB), fibroblast growth factor (FGF) básico e heparin-binding epidermal
growth factor (HBEGF), inibindo a mitogénese, apresentando efeito
antiproliferativo celular e inibindo o VEGF (Yokota, Oritani et al. 2000; Kelesidis,
Kelesidis et al. 2006) . Esta adipocina também desempenha um importante papel
na prevenção do cancro através do seu efeito anti-angiogénico (Ishikawa,
Kitayama et al. 2005; Takemura, Osuga et al. 2006; Hou, Xu et al. 2007) podendo
32
ainda, actuar como factor protector através da sua função como regulador
negativo da hematopoiese e do sistema imunológico ao suprimir o crescimento
de linhas celulares mielomonociticas (Yokota, Oritani et al. 2000; Kelesidis,
Kelesidis et al. 2006)
Níveis baixos de adiponectina plasmática, observados na obesidade,
promovem indirectamente o desenvolvimento tumoral, ao agravarem a
resistência à insulina e causarem hiperinsulinémia compensatória (Diez and
Iglesias 2003; Calle and Kaaks 2004; Kershaw and Flier 2004; Lihn, Pedersen et
al. 2005). Níveis baixos de adiponectina plasmática têm um efeito negativo na
produção das proteínas de ligação do IGF-1 insulin growth factor binding protein
1 (IGFBP1) e 2 (IGFBP2) pelo fígado o que, por sua vez, leva a um aumento de
disponibilidade do factor de crescimento semelhante à insulina 1 (insulin-like
growth factor 1 (IGF1). Os níveis lelvados de insulina e IGF-1 ligam-se
respectivamente aos seus receptores promovendo a proliferação celular e a
inibição da apoptose em vários tipos de tecidos e regulando a secreção de vários
factores de crescimento endotelial vascular que contribuem para a carcinogénese
(Calle and Kaaks 2004).
3.3.3.2. Adiponectina e desenvolvimento tumoral
Alguns estudos sugerem que na obesidade, os níveis baixos de adiponectina,
podem favorecer indirectamente a promoção do desenvolvimento tumoral.
Cancros da mama, do endométrio, do colon, da próstata, estomago e leucemia
são alguns exemplos em que se verifica uma associação entre os níveis baixos de
adiponectina e o risco de neoplasia (Kelesidis, Kelesidis et al. 2006).
Por outro lado, a adiponectina, quando elevada, actua como factor protector
para o desenvolvimento de vários tipos de cancro, incluindo o cancro da próstata
(Mistry, Digby et al. 2007) enquanto que níveis baixos de adiponectina são
frequentes nos indivíduos com carcinoma da prostata (Goktas, Yilmaz et al. 2005;
Bub, Miyazaki et al. 2006; Kelesidis, Kelesidis et al. 2006; Mistry, Digby et al.
2006). Mistry e colaboradores demostraram que a f-adiponectina em
concentrações subfisiológicas inibe o crescimento celular no cancro da próstata
(Bub, Miyazaki et al. 2006; Mistry, Digby et al. 2007) e suprime a proliferação
estimulada pela leptina, IGF-1 e di-hidrotestosterona (Mistry, Digby et al. 2006).
Goktas e colaboradores verificaram que os níveis plasmáticos de adiponectina
são mais baixos em doentes com cancro da próstata e apresentam uma
33
correlação negativa com o grau de desenvolvimento histológico e fase de
desenvolvimento (Goktas, Yilmaz et al. 2005).
3.4. Factor indirecto hiperinsulinismo associado à insulino-resistência
presente na obesidade: papel trófico da insulina
A insulina, descoberta em 1921, é uma hormona peptídica composta por
51aminoácidos, apresentando peso molecular de 5.8 kDa que é produzida pelas
células beta dos ilhéus de Langerhans do pâncreas. É responsável pela remoção
da glucose do sangue para o fígado e músculos onde vai ser armazenada sob a
forma de glicogénio, levando também à captação de lipidos por parte dos
adipócitos e posterior transformação em triglicerídeos. A resistência à insulina
resulta de vários factores como excesso de peso, obesidade, tipo de alimentação,
o sedentarismo e susceptibilidade genética (Calle and Kaaks 2004) verificando-se
que os níveis normais de insulina são inadequados para a produção de resposta
normal por parte da gordura, músculos e fígado. Esta síndrome leva a um
aumento da libertação de ácidos gordos livres pelos adipócitos para o sangue, à
redução do uptake da glucose pelos músculos e à diminuição do armazenamento
de glucose pelo fígado (Kahn and Flier 2000; Calle and Kaaks 2004).
Hiperinsulinémia resulta de um aumento da secreção pancreática de insulina para
prevenir um aumento excessivo da glucose sanguínea como resultado da
resistência à insulina (Kahn and Flier 2000; Calle and Kaaks 2004).
Há evidências que atribuem à insulina um papel como promotora da
carcinogénese, funcionando como agente mitogénico e inibidor da apoptose por
activação das vias RAS/RAF/MEK/ERK e Akt por fosforilação do PI-3,
respectivamente, após ligação ao receptor da insulina (IR) (Frasca, Pandini et al.
2008). O papel pró-carcinogénico da insulina é apoiado por vários estudos, tal
como o realizado por Nandi et al que inocularam ratinhos nude diabéticos com
células de tumor mamário MCF-7 tendo verificado que apenas os ratinhos
tratados com insulina desenvolviam tumores (Nandi, Guzman et al. 1995). A
confirmação da expressão de receptores de insulina em células de cancro da
tiróide (Frittitta, Sciacca et al. 1999) e de cancro da próstata (Cox, Gleave et al.
2009) sugerem que este factor possa contribuir para a promoção do cancro.
34
4. CANCRO DA PRÓSTATA
O cancro da próstata é considerado o terceiro tipo de cancro mais comum
(Buschemeyer and Freedland 2007) e a segunda causa de morte no sexo
masculino nos países ocidentais (Jemal, Siegel et al. 2007). Apesar de se estar a
verificar um aumento da sua incidência, a mortalidade devido a carcinoma da
prostata tem diminuído graças a um diagnóstico mais precoce (Buschemeyer and
Freedland 2007).
4.1. Cancro da próstata e obesidade
A associação entre cancro da próstata e obesidade é um tema muito
controverso, uma vez que os resultados obtidos em vários estudos que
procuraram verificar a relação entre incidência de cancro da próstata e obesidade
foram muitas vezes contraditórios.
A obesidade parece estar por um lado associada ao aumento do risco de
desenvolver formas agressivas de carcinoma da próstata observando-se uma
relação positiva entre obesidade e agressividade e mortalidade por esta
neoplasia, e por outro lado está associada ao decréscimo no risco de desenvolver
tumores de baixo grau (Freedland, Giovannucci et al. 2006; Ribeiro, Lopes et al.
2006; Mistry, Digby et al. 2007). Gong et al verificaram que a obesidade está
relacionada com o aumento de risco mestastização e mortalidade por este tipo de
neoplasia sendo os efeitos mais acentuados em homens com carcinoma de
classificação de Gleason elevada (8-10) (Gong, Agalliu et al. 2007). O aumento
dos níveis de insulina, IGF-1 e leptina com a obesidade podem participar nos
mecanismos biológicos que promovem a progressão do cancro da próstata
latente para uma forma mais agressiva (Amling 2004; Ribeiro, Lopes et al. 2006;
Mistry, Digby et al. 2007).
Pelo contrário, outros estudos não conseguiram encontrar uma associação
entre a obesidade e o risco de desenvolver carcinoma da próstata. Giovannucci e
colegas efectuaram um estudo prospectivo para verificar qual a relação entre o
índice de massa corporal (IMC) e o risco de desenvolver cancro da próstata,
esporádico e hereditário, e concluíram que para indivíduos com idade inferior a
60 anos ou com história familiar de cancro de próstata, o IMC não contribuía para
o aumento de risco, enquanto nos indivíduos com idade superior a 60 anos se
observou o contrário, no entanto, a relação não é estatisticamente significativa.
35
Segundo os autores, IMC elevados estão associados a níveis baixos de
testosterona o que não é favorável ao desenvolvimento deste carcinoma
(Giovannucci, Rimm et al. 2003).
Dada a controvérsia da associação entre obesidade e carcinoma da próstata e
leptina, cujos níveis plasmáticos se encontram aumentados na obesidade, do seu
papel na proliferação celular, angiogénese e no desenvolvimento tumoral,
resultante dos resultados obtidos em estudos epidemiológicos, clínicos e estudos
in vitro com linhas celulares, e visto não haver registo de estudos in vivo da acção
desta hormona no desenvolvimento do cancro da próstata, decidimos recorrer ao
modelo animal induzindo o carcinoma em ratinhos obesos ob/ob, com deficiência
em leptina, ratinhos db/db, com níveis elevados de leptina, e ratinhos DIO
(obesidade induzida pela dieta) com níveis aumentados de leptina, inoculados
com células tumorais de carcinoma da prostata murino RM1, na tentativa de
contribuir para elucidar um pouco melhor a acção desta hormona na
carcinogénese deste tipo de tumor.
36
Capítulo 2
OBJECTIVO
37
OBJECTIVO
Avaliar o papel da leptina na proliferação celular e angiogénese do carcinoma
da próstata inoculando células da linha celular RM1 em ratinhos apresentando
diferentes ambientes endógenos, nomeadamente, em ratinhos db/db que
apresentam excesso de leptina plasmática e resistência endogena à leptina por
mutação inactivante dos receptores da leptina, em ratinhos ob/ob com deficiência
congénita da leptina e em ratinhos ratinhos C57BL6/J com obesidade induzida
pela dieta DIO.
38
Capítulo 3
MATERIAL E MÉTODOS
39
MATERIAL E MÉTODOS
5. CULTURA CELULAR
As células de carcinoma da próstata androgénio independentes RM1, de
origem murina, foram obtidas a partir de tumores induzidos em ratinhos Zip
ras/myc-9 modelo MPR (cancro da próstata reconstituído em ratinho) produzidos
pela equipa do Prof T Thompson do MD Anderson Cancer Center, Houston,
Texas, USA, que gentilmente nos ofereceu uma amostra para realização do
presente estudo.
As células congeladas obtidas na passagem 7 (P7) foram cultivadas até à
passagem 8 (P8) para permitir a triagem e rastreio de contaminantes tendo sido
novamente congeladas em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Essential Médium,
Invitrogen) contendo DMSO (Dimethyl Sulfoxide, Sigma) 10% e FCS (Fetal Calf
Serum, Invitrogen) 40%, em criotubos de 1,5mL contendo 1,5milhões de células,
formando duas séries, uma com e outra sem antibiótico (Penicilina –
Streptomicina 100 U/mL, Invitrogen). A amostra sem antibiótico foi utilizada para
rastreio de contaminantes biológicos, nomeadamente por micoplasma. Para
realizar este teste retirou-se meio de cultura (500µL) das células RM1, na fase de
crescimento confluente. Esta amostra foi centrifugada durante 1 minuto a 13 000
rpm, tendo sido transferido 150µL de sobrenadante para um novo tubo que foi
colocado num bloco de aquecimento a 95ºC durante 5 minutos, para lisar as
células remanescentes e os micoplasmas, após o que foi submetido a nova
centrifugação igual à anterior para transferir, 100µL de sobrenadante para um
novo tubo, utilizado para realizar um teste de PCR (Polymerase Chain Reaction)
utilizando como primers MGSO (5’ TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC 3’)
e GPO1 (5’ ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT A 3’) que permitem amplificar um
fragmento de 717 bp, correspondente a uma região comum de DNA de
micoplasma, e assim, a identificação da sua presença como contaminante na
cultura celular. A análise dos produtos de amplificação foi efectuada detectando a
presença ou ausência da banda de 717bp após separação por electroforese em
gel de 1% de agarose.
Todos os estudos in vitro e in vivo subsequentes foram realizados utilizando
as aliquotas contendo 1,5M de células P8 crio-preservadas em azoto líquido,
seguindo o mesmo procedimento de cultura. Todas as fases foram realizadas
numa câmara de cultura esterilizada (UV e álcool 70%), começando por
40
descongelar a alíquota contendo 1,5 milhões de células na passagem 8 a 37ºC
em banho-maria até cerca de metade do conteúdo ficar derretido e transferindo
gota a gota, com o auxílio de uma pipeta Pasteur esterilizada, para um tubo de
12mL estéril contendo 5mL de meio DMEM completo (Invitrogen) e a mistura foi
de seguida centrifugada a 900rpm durante 3 minutos. O sobrenadante foi
descartado e o pellet, contendo as células, foi ressuspenso em 2,5mL de meio
completo e transferido para um frasco de cultura de 25cm2 contendo 2,5mL de
meio de cultura completo e colocado numa incubadora (Function Line - Heraeus
Instruments) com uma atmosfera a 5% CO2, a 37ºC e humidade constante, de
modo a promover o crescimento celular.
O meio completo DMEM foi preparado a partir de DMEM em pó com glucose
elevada (4500mg/L), dissolvendo 5,05g de DMEM em 250mL de água bidestilada
num goblé em agitação contínua em placa de agitação, tendo sido
posteriormente adicionados 1,85g de bicarbonato de sódio (Sigma) e água
bidestilada até perfazer 500mL. O pH foi ajustado com ácido clorídrico 1N para o
intervalo de 7,0-7,4, de modo a evitar a alcalinização do meio aquando da
libertação de CO2. A solução final foi filtrada em condições de assepsia utilizando
um filtro esterilizado 0,2µm de poro e 47mm de diâmetro (ME 24/21ST, Whatman
– Schleicher & Schuell) previamente autoclavado, ligado a uma bomba de vácuo. A
esta solução filtrada adicionou-se ainda 6,25mL de HEPES 1M (N-(2-
Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid, Invitrogen), 5mL de Penicilina –
Streptomicina 100 U/mL (Invitrogen), 5mL de Nistatina 100 U/mL (Sigma) e 58mL
de FBS (Invitrogen). A solução de meio de cultura celular foi conservada a 4ºC até
a sua utilização, por um período máximo de 48h.
O crescimento das células em cultura foi monitorizado e o meio de cultura
mudado regularmente, a 37ºC, para eliminar células mortas em suspensão e
renovar os nutrientes. Sempre que as células atingiram uma confluência de 80%
as células foram individualizadas adicionando 1mL de Tripsina 0,25% (Invitrogen)
à placa de cultura, e lavadas com 2,5mL de PBS (Phosphate Buffered Saline). As
células foram ressuspensas em 1mL de meio de cultura. Para avaliar a viabilidade
celular, foram adicionados 10µL de trypan blue (Sigma) a 10µL de suspensão
celular e a proporção de células coradas (não viáveis) vs não coradas foi contada
com auxilio de uma câmara de contagem Neubauer, tendo sido considerado um
resultado satisfatório sempre que se atingiu uma viabilidade superior a 90%.
41
6. CARACTERIZAÇÃO DA LINHA CELULAR RM1
6.1. Imunocitoquímica para o receptor da leptina
Para verificar a presença da isoforma longa do receptor membranar da leptina
(OBRb) foi realizado um estudo imunocitoquímico (ICQ) das células RM1 obtidas
na 17ª passagem. Para tal 50µL de meio com células em suspensão foram
colocados na cito-centrifuga a 1200 rpm durante 5 minutos (Cytospin 3 -
Shandon) para transferir as células para lâminas tratadas com poli-lisina (Poly-L-
lisine, Sigma) e a preparação celular foi fixada por imersão das lâminas em
formol a 10% durante 10 minutos. A técnica de ICQ consistiu em mergulhar as
laminas numa solução contendo pepsina a 0,1% em HCl 0,01N pH 2,25 durante
10 minutos, de modo a expor o antigénio, seguida de uma incubação em
peróxido de hidrogénio 0,3% durante 5 minutos para bloquear a peroxidase
endógena, após o que se adicionou o anticorpo primário OBR 12-A coelho anti-
ratinho (Alpha Diagnostic International – San António, TX) 1:100 BSA 1%, solução
na qual as laminas foram mantidas durante a noite e a 4ºC até ao dia seguinte,
quando foram incubadas com o anticorpo secundário de porco anti-coelho
(DakoCytomation) 1:100 BSA 1% durante 1h. A reacção imunoquímica foi marcada
adicionando o complexo avidina-biotina (ABC, DakoCytomation) durante 30
minutos seguida de revelação com diaminobenzidina (DAB, DakoCytomation)
durante 7 minutos para obter a coloração castanha das células marcadas. O
controlo negativo interno foi obtido efectuando todo o procedimento descrito
acima apenas omitindo o anticorpo primário. Como controlo positivo e negativo
externo adicional foram utilizadas células de exsudado peritoneal de ratinho,
obtidas por injecção intraperitoneal de 1,5mL de caseína 10% em ratinho
C57BL6/J, incubação durante 5h e lavagem com 5mL de sacarose a 3%.
6.2. Estudo histológico da próstata de ratinho saudável
6.2.1. Processamento da próstata
A próstata de ratinho C57BL6/J normal foi recolhida e após ter sido fixada em
paraformaldeído e ácido pícrico 14%, foi processada e incluída em bloco de
parafina do qual foram efectuados cortes de 3µm seriados e em duplicado para
imuno-histoquímica (IHQ) com e sem contrastação nuclear.
42
6.2.2. Imunohistoquímica para receptor da leptina
Após desparafinar e hidratar os cortes efectuou-se a recuperação antigénica
com solução de pepsina 0,1% em HCl 0,01N pH 2,25 durante 45 minutos a 37ºC.
a inibição da peróxidase endógena foi efectuada por incubação das lâminas em
peróxido de hidrogénio 0,3% durante 5 minutos. Findo este período efectuou-se
bloqueio proteico incubando durante 5 minutos com Protein Block (Novolink
Polymer Detection System) de modo a eliminar toda a inespecificidade da
marcação. Após lavagem com PBS durante 5 minutos as lâminas foram incubadas
durante a noite com anticorpo primário OBR 12-A coelho anti-ratinho (Alpha
Diagnostic International – San António, TX) 1:100 BSA 1% a 4ºC. Lavou-se
novamente com PBS, duas vezes durante 5 minutos, tendo de seguida incubado
as lâminas em Post Primary Block (Novolink Polymer Detection System) durante
30 minutos. As lâminas foram novamente lavadas em PBS e de seguida incubadas
em Polymer (Novolink Polymer Detection System) durante 30 minutos. Efectuou-
se nova lavagem em PBS tendo de seguida efectuado a revelação com DAB
durante 5 minutos. As lâminas foram lavadas em água corrente tendo-se de
seguida efectuado contrastação com hematoxilina, lavado, desidratado e
montado as lâminas. O controlo negativo interno foi obtido como descrito acima
omitindo apenas a incubação com o anticorpo primário.
43
7. EXPRESSÃO DO RECEPTOR DA LEPTINA NAS CÉLULAS RM1
AVALIADO POR RT-PCR (REVERSE-TRANSCRIPTASE POLYMERASE
CHAIN REACTION)
7.1. Extracção de RNA das células em cultura
Células RM-1 em cultura na passagem 11 a 80% confluência, foram
individualizadas após tripsinização e precipitadas por centrifugação. Após
contagem do número de células em câmara Newbauer, foi adicionado ao pellet
1mL de TRIPURE (Roche Diagnostics) / 5x106 células seguido de homogeneização.
Após adição de clorofórmio (0.2 mL / mL TRIPURE) e incubação à temperatura
ambiente 10 minutos, a solução foi centrifugada a 11441 rpm durante 15
minutos, que permite separar a solução em 3 fases: sobrenadante contendo o
RNA, e intermédia contendo o DNA e restante com as proteínas. O sobrenadante
com o RNA foi retirado para um novo tubo ao qual foi adicionado isopropanol
(0.5 mL / mL TRIPURE), e incubado à temperatura ambiente durante 10 minutos
seguido de nova centrifugação a 11441 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante
foi descartado e adicionou-se ao depósito etanol 75% (1 mL / mL TRIPURE),
seguido de nova centrifugação a 9045 rpm durante 5 minutos, o sobrenadante
foi removido e o depósito foi deixado secar ao ar antes de ter sido re-suspendido
em água sem RNases. Após extracção o RNA foi quantificado por fluorimetria
fluorímetro Qubit (Invitrogen) e lida a sua absorvância por espectrofotometria a
260 e 280nm, calculando-se a razão 260/280, para avaliar a qualidade do RNA.
Tendo sido considerado aceitável valores superiores a 1.8, atestando a qualidade
e pureza do RNA.
7.2. Transcriptase reversa (síntese de cDNA)
Para a síntese de cDNA a partir de RNA extraído das células RM-1, foi utilizado
o kit ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen). Foi preparada uma mistura com
primers aleatórios (50 uM Oligo (dT)20, 50 ng/uL), RNA (2 ug), dNTPs (10 mM),
ajustando com água bi-destilada para completar um volume final de 12 uL. De
seguida foi realizada a desnaturação do RNA e dos primers, através da incubação
a 65ºC durante 5 minutos e colocação posterior em gelo.
A mistura matriz (master mix) foi preparada adicionando: solução tampão de
síntese de cDNA (5x), DTT (0.1 M), RNaseOUT (40 U/uL), água tratada com DEPC
44
e transcriptase reversa (RT Thermoscript) (15 U/uL), para um volume final de 8 uL
e pipetada para o tubo refrigerado em gelo, antes de ser colocada no
termociclador, programado para submeter as amostras a uma temperatura de
síntese de cDNA de 50ºC durante 45 minutos e um passo final de 5 minutos a
85ºC. Uma vez terminada a reação foi imediatamente adicionado RNase H (1 µL) e
incubada a amostra a 37ºC durante 20 minutos. O cDNA sintetizado foi
armazenado a -20ºC para posterior utilização.
7.3. Polymerase chain reaction (PCR)
Para estudar a expressão dos genes OBR (isoformas b e a) nas células RM-1,
procedeu-se à realização da amplificação de transcritos a partir de cDNA. Incluiu-
se como gene house-keeper o ACTNB (beta-actina). Os primers e respectivas
temperaturas de annealing (Ta) para cada gene, assim como o peso molecular de
cada fragmento de amplificação esperado estão descritas na Tabela 1.
Gene Fragmento Primers Ta Referência
ObRa 290 bp F: 5’-ATCTGCCGGTGTGAGTTTTC-3’
R: 5’-CCAGTCTCTTGCTCCTCACC-3’
62ºC (Hegyi, Fulop
et al. 2004)
ObRb 375 bp F: 5’-
ATGAAGTGGCTTAGAATCCCTTCG-3’
R: 5’-ATATCACTGATTCTGCATCCTG-
3’
62ºC (Guilmeau,
Buyse et al.
2003)
ACTNB 606 bp F: 5’-
CGAGAAGATGACCCAGATCATG-3’
R: 5’-AGTGATCTCCTTCTGCATCCTG-
3’
62ºC (Guilmeau,
Buyse et al.
2003)
Tabela 1 – Representação dos primers e respectivas temperaturas de anealing.
Para todos os genes, foi usado o seguinte protocolo de preparação de master
mix: solução tampão de PCR 10x (1X), dNTPs 10 mM (0.2mM de cada), MgCl2 50
mM (1.5mM), Primers 10 uM (0.2 uM de cada), Platinum Taq DNA Polymerase
(1U), cDNA (~ 50-100 ng) e água bi-destilada até completar um volume final de
reacção de 50 uL.
45
O protocolo PCR incluiu sempre um passo inicial de desnaturação a 94-95ºC
durante 2-3 minutos, seguido de 3 passos de desnaturação (94-95ºC, 1 minuto),
annealing (56-65ºC, 30 segundos-1 minuto) e extensão (72ºC, 1-2 minutos),
repetidos ao longo de 35-40 ciclos e um passo final de 10 minutos a 72ºC. Os
protocolos foram realizados em duplicado, em experiências independentes,
verificando-se repetibilidade absoluta da expressão de transcritos entre
experiências. Em todos os PCRs incluiu-se o gene house-keeper ACTN.
7.4. Electroforese dos produtos de PCR
Após PCR, cerca de 10 µL do produto foi submetido a electroforese em gel de
agarose a 2%, corado com brometo de etídeo.
46
8. WESTERN-BLOT PARA RECEPTOR DA LEPTINA
8.1. Preparação das amostras
Próstatas obtidas de ratinhos C57BL/6 normais (n=6) removidas após
sacrifício dos mesmos por exposição a CO2 em concentração elevada foram
homogeneizadas no homogeneizador Potter-Elvehjem em PBS. A suspensão
celular assim obtida foi filtrada utilizando pipetas de vidro com gaze de nylon
para remover agregados celulares e vestígios de tecido não homogeneizado.
Células RM1 cultivadas e criopreservadas foram descongeladas à temperatura
ambiente. As suspensões celulares de ambas as amostras, próstata de ratinho e
cultura celular, foram incubadas em gelo durante 1h30minutos em 5mL de
solução de lise (NaCl, 2,68mM KCl, 10mM Na2HPO
4, 1,76mM KH
2PO
4, 1mM EDTA e
inibidor de proteases). A solução obtida após a lise celular foi centrifugada a
25300rpm durante 30minutos a 4ºC. O sobrenadante obtido foi recolhido
constituindo a fracção citosólica e o sedimento obtido foi ressuspenso em 1mL
de solução solubilizante (0,5% N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-
propanesulfonate, 5mM EDTA e inibidores das proteases) e incubado durante
20minutos em gelo, de modo a solubilizar as proteínas de membrana. As
amostras foram centrifugadas a 400rpm durante 10min a 4ºC tendo os
sobrenadantes obtidos, correspondentes à fracção membranar, sido
armazenados a -80ºC para posterior análise.
8.2. Doseamento de proteínas
O doseamento proteico das amostras foi efectuado realizando o método de
Lowry (Lowry, Rosebrough et al. 1951). A curva padrão foi obtida através da
medição das absorvâncias de soluções padrão de concentração conhecida (Padrão
1: 225µL de H20 destilada, 25µL Albumina bovina 0,05%, 750µL de reagente
Cupro-Alcalino; Padrão 2: 200µL de H20 destilada, 50µL Albumina bovina 0,05%,
750µL de reagente Cupro-Alcalino; Padrão 3: 175µL de H20 destilada, 75µL
Albumina bovina 0,05%, 750µL de reagente Cupro-Alcalino; Branco: 250µL de
H20 e 750µL de reagente Cupro-Alcalino) o que permitiu determinar a
concentração proteica das quatro amostras (Amostra 1: 225µL de H20 destilada,
25µL de fracção citosólica de células RM1; Amostra 2: 225µL de H20 destilada,
25µL de fracção membranar de células RM1; Amostra 3: 225µL de H20 destilada,
47
25µL de fracção citosólica de próstata de ratinho; Amostra 4: 225µL de H20
destilada, 25µL de fracção membranar de próstata de ratinho) por interpolação na
curva obtida. Todas as soluções obtidas, padrões, amostras e branco, foram
protegidas da luz, agitadas e depois mantidas em repouso, à temperatura
ambiente, durante 10 minutos. Decorrido este tempo adicionou-se a todos os
tubos 75 µL de reagente de Folin (diluição 1:2) agitou-se e deixou-se a incubar
durante 30 minutos nas mesmas condições. A absorvância foi lida no
espectofotómetro (CECIL 1000 Series) e as concentrações calculadas utilizando a
fórmula: Concentração de amostra = absorvância de amostra x f = mg/mL, sendo
f = (∑concentração dos padrões (0,3) /∑absorvâncias dos padrões) x factor de
diluição.
8.3. Electroforese SDS-PAGE
Para verificar o grau de pureza das amostras proteicas e efectuar o Westenblot
foi realizada, em duplicado, uma electroforese segundo a técnica de SDS-PAGE
(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis), que permite separar
as proteínas constituintes das amostras de acordo com o seu peso molecular. As
amostras foram diluídas 1:4 em tampão de amostra para gel desnaturante (2,5mL
de solução Tris 0,5M, pH 6,8; 4,0mL de SDS 10%; 2,0mL de Glicerol; 0,2mL -
mercaptoetanol; 0,2mg Azul Bromofenol; dH2O até 10mL) e em seguida fervidas
durante 2min. Aplicaram-se as amostras e os padrões de peso molecular
(Rainbow- Amersham Biosciences) nos respectivos poços do gel de poliacrilamida
a 13%. O gel foi corrido a 20 mA utilizando uma fonte de alimentação (Amersham
pharmacia biotech). O término da corrida ocorreu quando o azul de bromofenol
do tampão de amostra se encontrava a cerca de 0,5cm do fim do gel.
8.4. Coloração de prata
A técnica de coloração com prata foi utilizada para visualizar as bandas
proteicas obtidas após a realização da electroforese. Para tal, o gel foi posto
numa solução descorante (etanol 25% e ácido acético 8%), durante 40 minutos.
Em seguida, foi lavado com água destilada, num período de 5 minutos. Depois,
fixou-se durante 30 minutos com glutaraldeido 10% (v/v). Tendo sido lavado
durante uma hora com água quente, substituindo a água de 10 em 10 minutos,
para remover os excessos de glutaraldeido. Colocou-se o gel numa solução de
48
nitrato de prata (2,5mL de NH4OH concentrado, 0,375mL de NaOH 10M em 40mL
de H2O destilada à qual foi adicionada, gota a gota, 7,5mL de solução de AgNO
3
1,2M) durante 10 minutos. E, posteriormente, procedeu-se à sua lavagem 3 x 5
minutos com água destilada. Por fim, o gel foi submerso na solução de revelação
(0,05g de ácido cítrico; 500mL de formaldeído; dH2O até 500mL) até o
aparecimento das bandas. A reacção foi parada com ácido acético 5% e o gel
lavado com etanol 10%. Este foi guardado numa solução de 7% glicerol e 10% de
etanol (v/v).
8.5. Western-blot
As proteínas das amostras depois de separadas por eletroforese SDS-PAGE
foram transferidas para uma membrana de PVDF (Polyvinylidene Difluoride
membrane) durante 2h, a 150mA e a 80V, em tampão de blot (7,3g Tris; 33,8g
Glicina; 600mL metanol; dH2O até 3L). Posteriormente, procedeu-se ao bloqueio
da membrana com TBST (40mL de Tris 1M; 120mL de NaCl 5M; 2mL Tween 20;
dH2O até 4L pH 8) e BSA 1%, durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavou-se
3x5min com TBST e BSA 0,1%. Deixou-se a incubar com o anticorpo primário OBR
12A (Alpha diagnostic) (1:1000) em TBST 0,1%BSA, durante 2 horas. Em seguida,
lavou-se com TBST e 0,1%BSA: 3x5min, 2x10min e procedeu-se à incubação com
o anticorpo secundário (1:20000) (AbDSerotec goat anti-rabbit IgG:HRP) em TSBT
0,1%BSA, durante 1 hora à temperatura ambiente. Voltou-se a lavar com TBST e
0,1%BSA: 4x5min, 2x10min. Após secagem da membrana em papel de filtro,
procedeu-se à reacção de detecção adicionando-se à membrana o substrato TMB
(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine).
49
9. ESTUDOS IN VIVO
Para avaliar o crescimento das células de cancro da próstata murino RM1 in
vivo estas foram inoculadas em diferentes estirpes de ratinhos normoponderais e
obesos.
9.1. Animais
Os animais utilizados neste estudo, nomeadamente ratinhos das estirpes
C57BL/6 normoponderais, DIO (diet induced obesity) C57BL6/J com obesidade
induzida pela dieta), db/db (BKS.Cg-m+/+ Leprdb/J) obesos e diabéticos por
mutação espontânea inactivante do gene do receptor da leptina e ob/ob (B6.V-
Lepob/J) obesos por mutação espontânea do gene da leptina, foram adquiridos de
um produtor comercial (Charles River, Barcelona) (Tabela 2).
Tabela 2: Descrição das estirpes utilizadas neste trabalho.
Ratinho Estirpe Descrição
C57BL/6J
Ratinhos da estirpe selvagem utilizados como controle.
DIO (Diet Induced Obesity) do background C57Bl/6J
Ratinhos da estirpe selvagem C57BL/6J submetidos a dieta hipercalórica ( 45% de lipidos) para induzir obesidade.
ob/ob: B6.V-Lepob/J db/db:BKS.Cg-m +/+ Lepdb/J
Ratinhos ob/ob – obesos, com mutação espontanea do gene que codifica a leptina: défice congénito de leptina. Ratinhos db/db – obesos, com mutação espontânea do gene do receptor da leptina – hiperleptinemicos e diabéticos.
50
Os ratinhos foram mantidos no biotério do ICBAS em condições temperatura
(21+/-1ºC) e humidade constantes, com um fotoperíodo controlado de 12h (das 7
às 19h), tendo tido livre acesso a água e comida, a dieta foi semelhante para
todos os grupos, dieta completa normal (SAFE- Scientific Animal Food &
Engineering), com excepção da ratinhos DIO que mantiveram dieta hipercalórica e
hiperlipidica (dieta hipercalórica 45KJ % Gordura, Charles River) utilizada desde o
desmame.
9.2. Curva dose-resposta em ratinhos C57BL6/J normoponderais
Para avaliação do crescimento das células RM1 in vivo foram utilizados 42
ratinhos C57BL6/J normoponderais, machos adultos com 13 semanas e
distribuídos por 7 grupos (n=6 /grupo). Os animais de cada grupo foram
inoculados na região subcutânea dorsal com 500µL de células RM1 em suspensão
em PBS com concentrações crescentes, nomeadamente: 1,5x105, 3,0x105,
6,0x105, 7,5x105, 9,0x105, 1,2x106, 1,8x106. O crescimento das células e a
evolução tumoral foi monitorizada durante 14 dias após a inoculação, tendo sido
registado o peso corporal dos ratinhos três vezes por semana. Ao fim dos 14 dias
os ratinhos foram sacrificados por exposição uma atmosfera de CO2 (99%) em
câmara fechada, o sangue foi recolhido por punção cardíaca e os tumores
induzidos e a gordura epididimária foram recolhidos e pesados.
O sangue foi recolhido utilizando uma seringa pre-tratada com heparina
sódica 5000U.I./mL (Braun) e imediatamente transferido para microtubos 1,3mL
Lithium Heparin aos quais tinha sido previamente adicionado 20µL de aprotinina
(Trasylol, Bayer). Os tubos foram mantidos em gelo até serem centrifugadosa
3000rpm a 4ºC durante 8 minutos. O plasma foi recolhido e armazenado a -20ºC
para posterior doseamento hormonal.
Os tumores recolhidos foram preservados em paraformaldeído com ácido
pícrico a 14% para posterior processamento histológico.
51
9.3. Crescimento das células RM1 em ratinhos obesos
Para avaliação do crescimento das células RM1 in vivo foram utilizados 24
ratinhos machos adultos do mesmo background genético dos C57BL6/J e
distribuídos por 4 grupos (n=6 /grupo), nomeadamente ratinhos obesos e
diabéticos db/db (n=6), ratinhos obesos ob/ob (n=6), ratinhos C57BL6/J com
obesidade induzida pela dieta (DIO) (n=6), e C57BL6/J normoponderais (n=6),
usados como grupo controle. Os animais de cada grupo foram inoculados ne
região subcutânea dorsal com 500µL de células RM1 em suspensão em PBS na
concentração de 3,0x105, escolhida como a dose ideal após análise da curva
dose-resposta, tendo todo o procedimento sido semelhante ao descrito na
experiência anterior.
52
10. ANÁLISE HISTOLÓGICA DOS TUMORES
10.1. Processamento dos tecidos
Os tumores recolhidos após terem sido fixados em paraformaldeído e ácido
pícrico 14% foram processados e incluídos em blocos de parafina. De cada bloco
foram efectuados cortes de 3µm seriados e em duplicado para coloração com
hematoxilina-eosina (HE) ou imuno-histoquímica (IHQ).
10.2. Imunohistoquímica para Ki-67
Para avaliar o grau de proliferação celular tumoral foi realizado o estudo
imunohistoquímico para o antigénio nuclear Ki-67 que é expresso pelas células
em proliferação durante as fases G1, S, M e G2 do ciclo celular.
Para tal os cortes foram recolhidos em lâminas tratadas com poly-L-lisina,
desparafinados em xilol e re-hidratados utilizando álcoois de graduação
decrescente. Lavou-se com tampão PBS durante 5 minutos efectuando-se de
seguida a recuperação antigénica por microondas a 900W durante 20 minutos em
solução tampão citrato 0,01M (pH 6,0). A peroxidase endógena foi neutralizada
com peróxido de hidrogénio (Labvision) durante 10 minutos. Seguidamente, após
arrefecimento, os cortes foram lavados em PBS (pH 7,4) durante 5 minutos e
incubados com soro normal ultra block (Labvision) durante 5 minutos de modo a
bloquear marcação inespecífica, seguido do anticorpo primário Ki-67 humano
com reactividade cruzada para o ratinho (Novocastra, NCL-L-Ki67-MM1) na
diluição 1:30 a 25ºC durante 60 minutos,
Findo o tempo de incubação efectuou-se uma lavagem de 5 minutos em
tampão PBS. Incubou-se com o anticorpo secundário Biotinylated Goat Anti-
polyvalent (Labvision) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Lavou-se
novamente com PBS durante 5 minutos. Incubação das lâminas com o complexo
enzimático Streptavidina HRP – polivalent (LabVision) durante 15 minutos seguido
de uma lavagem de 5 minutos em PBS. A revelação das lâminas foi efectuada
utilizando o substrato DAB (Diaminobenzidine tetrahydrochloride, Sigma) e
deixando actuar durante 10minutos. Enxaguaram-se as lâminas em água. A
contrastação nuclear foi realizada com hematoxilina Harris durante 1 minuto
tendo-se de seguida desidratado, e montado as lâminas.
53
Controlo negativo interno utilizado para verificar a especificidade da marcação
foi realizado preparando lâminas de acordo com o descrito a cima omitindo
apenas a incubação com o anticorpo primário. O controlo positivo foi interno foi
obtido por observação de não marcação de células musculares nas mesmas
lâminas.
10.3. Imunohistoquímica para caveolina
Para avaliar o grau de proliferação vascular foi realizado o estudo
imunohistoquímico para o antigénio caveolina que é expresso pelas células
endoteliais.
O método utilizado foi semelhante ao descrito para o Ki-67 variando
unicamente o anticorpo primário, anticorpo da caveolina (BD Biosciences)
utilizado na diluição de 1:400.
O controlo negativo foi obtido do mesmo modo como descrito para o Ki-67.
O controlo positivo utilizado foi externo obtido através da obtenção de uma
amostra de pâncreas de ratinho e verificando a ausência de marcação nas células
glandulares.
Para cada anticorpo, as amostras foram processadas no mesmo dia e em
simultâneo para diminuir a variabilidade.
54
11. MORFOMETRIA
A análise morfométrica foi realizada em fotografias digitais de 10 campos de
400x (10x ocular, 40x objectiva) por lâmina seleccionados por varrimento
periférico do tumor, evitando as áreas de necrose central. O cálculo da área e
contagem de estruturas marcadas em cada campo foi efectuada com auxílio do
software (Leica Qwin, Leica Microsystems) devidamente calibrado, do computador
acoplado à máquina.
Em cada campo foram efectuadas contagens de mitoses e núcleos marcados
com Ki67 ou vasos marcados com caveolina, foram contabilizados todas as
marcações que se encontravam totalmente dentro da área seleccionada
(45672,8µm2).
55
12. DOSEAMENTOS HORMONAIS
Os doseamentos hormonais foram efectuados recorrendo a kits de ELISA de
insulina e de leptina (Linco research) que permitem avaliar a concentração destas
hormonas no plasma sanguíneo por reacção colorimétrica, actividade enzimática,
quantificada espectrofotométricamente, uma vez que o aumento da absorvância é
directamente proporcional tanto à quantidade de leptina como de insulina das
amostras é possível, por interpolação da curva padrão obtida com as soluções de
concentração conhecida (padrões), determinar a concentração das hormonas em
estudo.
As amostras de plasma obtidas aquando do sacrifício foram descongeladas à
temperatura ambiente, no decorrer dos preparativos para o início do estudo.
Todos os reagentes usados foram colocados à temperatura ambiente
imediatamente antes do início.
12.1. Doseamento da leptina
Os níveis plasmáticos de leptina foram doseados por ELISA recorrendo a um
kit comercial (EZML-82K, Linco Research), conhecido pela técnica de ELISA
“sandwich”, seguindo as instruções do produtor. Resumidamente a técnica
consiste em colocar 10µL de amostra a analisar em contacto com uma placa de
ELISA revestida com anticorpos mono-clonais anti-leptina de ratinho, de modo a
que as moléculas de leptina presentes na amostra se liguem a esses anticorpos
ficando retidas nos poços. Adicionou-se 50µL de antisoro de leptina de ratinho a
cada poço que se deixou incubar durante 2h, seguido de uma incubação com
100µL de anticorpo de detecção durante 1h, sempre à temperatura ambiente e
em agitação constante (450rpm) de modo a que se formasse o complexo
imunológico (leptina – anticorpo de detecção) que se pretende quantificar. Após
lavagem, eliminando-se tudo o que está livre, adicionou-se, a cada poço 100µL de
solução de enzima (Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate) tendo-se
estabelecido ligação aos anticorpos de detecção ligados à leptina (anticorpos
biotininados) para, após adição do substrato (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)
ocorrer reacção colorimétrica. A actividade emzimática foi determinada no
espectrofotometro de placas (Multiskan EX, Thermo) através da leitura das
absorvâncias a 450nm e a 570nm (factor de correcção) após adição da solução de
paragem (HCl 0,3M) por acidificação do meio e calculada a diferença entre os dois
56
valores obtidos. As concentrações finais foram calculadas por extrapolação de
uma curva de concentrações conhecidas.
12.2. Doseamento da insulina
Os níveis plasmáticos de insulina foram doseados por ELISA recorrendo a um
kit comercial (EZMI-13K Linco Research) seguindo as instruções do produtor. O
método utilizado foi semelhante ao descrito para o doseamento da leptina
variando apenas no revestimento das placas ser com anticorpo monoclonal anti-
insulina e de se adicionar anticorpo de detecção de insulina de ratinho logo após
a adição das amostras e dos padrões ficando a incubar durante 2h de modo a
ocorrer a ligação à insulina existente nas paredes de cada poço. A actividade
enzimática foi determinada como descrito para a leptina.
57
13. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
Para cada grupo foram calculadas as médias e o erro padrão da média (SEM) e
analisada a normalidade e homogeneidade das variâncias. A diferença entre as
médias foi avaliada pelos testes de ANOVA, seguido de correcção post-hoc de LSD
(least square difference) ou pelo teste de Kruskal-Wallis, e nos estudos de
correlação foram utilizados os testes de Pearson e Spearman, consoante aplicável
de acordo com a presença ou ausência de normalidade na distribuição das
amostras, respectivamente. Um valor de p<0.05 foi considerado estatisticamente
significativo. Todas as análises estatísticas foram realiadas com o auxílio do
software SPSS (versão 16) para o Windows.
58
Capítulo 4
RESULTADOS
59
RESULTADOS
14. CARACTERIZAÇÃO DA LINHA CELULAR – RM1
14.1. Imunocitoquímica para receptor de leptina
No estudo de imunocitoquímica utilizando o anticorpo primário Anti-OBR
específico para o receptor da leptina OBR (OBRb - isoforma longa) observou-se a
presença de marcação positiva, i.e., coloração castanha, à periferia das células
RM1 (Figura 1 A), correspondente à presença da isoforma longa do receptor da
leptina na membrana celular. Como controlos positivo e negativo para avaliar a
especificidade da reacção do anticorpo para o receptor da leptina, o mesmo
estudo imunocitoquímico foi realizado em células de exudado peritoneal de
ratinho C57BL6/J, tendo-se verificado marcação apenas dos macrófagos, que
como é sabido expressam a isoforma longa do receptor da leptina, ao contrário
dos neutrófilos, (O'Rourke, Yeaman et al. 2001) como se pode observar na figura
1B.
A
B
Figura 1 – Imunocitoquímica obtida utilizando como anticorpo primário anti-ObR. As
células RM1 (1A) apresentam uma coloração castanha à periferia correspondente à
localização membranar dos receptores de leptina. Na Figura 1B pode ser observada a
marcação dos macrofagos (com coloração castanha) e a ausência de marcação nos
neutrófilos (com coloração azul). (A) e (B) 100X.
60
14.2. Imunohistoquímica da próstata de ratinho para receptor da
leptina
No estudo de imunocitoquímica efectuado para verificar a presença de
receptores de leptina na próstata de ratinho verificou-se marcação positiva para
OBR, receptor longo e receptor curto da leptina, no epitélio ganglionar (Figura 2).
14.3. Expressão do receptor de leptina nas células RM1 avaliado por
RT-PCR
Para confirmar o resultado obtido no estudo imunocitoquímico, foi realizado o
estudo molecular da expressão do receptor da leptina por RT-PCR
Da análise das bandas de electroforese dos produtos da PCR dos genes em
estudo, (Figura 3), verifica-se que as células RM1 expressam apenas a isoforma
curta do receptor da leptina, OBRa com 290 bp e não expressam a isoforma longa
do receptor (OBRb 375 bp).
A
B
Figura 2 - Cortes histológicos de próstata normal de ratinho C57BL6/J marcados com
anticorpo OBR 12-A. Na figura observa-se marcação positiva nas células epiteliais dos
lóbulos da próstata (A) e o respectivo controlo negativo (B).
61
Figura 3 – Imagem da electroforese dos produtos de RT-PCR. Verifica-se que as células
RM1 expressam a isoforma curta do receptor da leptina OBRa (290 bp), mas não
expressam a isoforma longa, OBRb. Na imagem podem ainda observar-se as bandas
correspondentes à expressão da β-Actina (ACTNB 606 bp), gene housekeeper utilizado
como controlo interno e do marcador de 100 (M100), utilizado como escala de pares de
bases.
62
14.4. Western-blot para receptor da leptina
Para confirmar a presença do receptor da leptina nas células RM1, foi
efectuado o estudo molecular por Western-blot da electroforese das proteínas das
fracções membranar e citolólica das células RM1, assim como de homogeneizado
de próstata de ratinho C57Bl6/J.
Na electroforese das proteínas coradas com solução de prata (Figura 4A) foi
possível observar para o homogeneizado celular (RM1), por comparação com o
padrão de pesos molecular (B1) uma banda mais acentuada tanto para a fracção
membranar como citossólica (B2 e B3) correspondente ao peso molecular 66 kDa.
O homogeneizado de prostata apresenta, tanto na fracção membranar (B4) como
na fracção citossólica, marcação mais acentuada nas bandas com pesos
moleculares 36 kDa, 66 kDa e 97 kDa. Sabendo que os valores dos pesos
moleculares da isorforma curta (OBRa) e da isoforma longa (OBRb) para receptor
da leptina são, respectivamente, 80 kDa e 130 kDa (Zeidan, Purdham et al. 2005)
efectuou-se o Western-blot para a presença da proteína do, receptor da leptina,
nas amostras de células RM1 e de homogeneizado de prostatas de C57BL6/J,
utilizando como anticorpo primário o anticorpo anti-ObR, sendo possível
observar, por comparação com o padrão de pesos molecular, a presença de três
bandas mais visíveis com pesos moleculares entre 31 e 38 kDa, entre 52 e 76
kDa e entre os 76 e os 102 kDa, tanto na fracção citossólica (D2) como
membranar (D3) do homogeneizado da próstata, e, uma banda mais acentuada,
tanto na fracção citossólica como membranar do homegeneizado das RM1,
correspondente a um peso molecular compreendido entre 52 e 76 kDa (Figura
4D) parecendo estar de acordo com as bandas obtidas por electroforese (Fig 4A).
63
200 kDa - Myosin, porcine heart 116 kDa - β-Galactosidase, E. coli
97 kDa - Phosphorylase B, rabbit muscle
84 kDa - Fructose-6-phosphate Kinase
66 kDa - Albumin, bovine serum
55 kDa - Glutamic dehydrogenase, bovine liver
45 kDa - Ovalbumin, chicken egg
36 kDa - Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase, rabbit muscle
29 kDa - Carbonic anhydrase, bovine
erythrocytes
24 kDa - Trypsinogen, bovine pancreas
20 kDa - Trypsin inhibitor, soybean
14,2 kDa - α-Lactalbumin, bovine milk
6,5 kDa - Aprotinin, bovine lung
A
B
B1 B2 B3 B4 B5
C
D
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7
Figura 4 – Resultados obtidos por electroforese e Western-blot para receptor da
leptina. “Espectro” proteico de cada amostra, padrão de pesos moleculares (B1),
fracção membranar (B2) e citossólica (B3) do homogeneizado de células RM1 e de
próstata de ratinho (B4 – fracção membranar e B5 – fracção citossólica) na Figura 4B e
padrão dos pesos moleculares utilizado (Figura 4A). Padrão de pesos moleculares
multicolor (rainbow) (Figura 4C) usado para comparar os resultados obtidos por
Western-blot para o receptor da leptina OBRb (Figura 4D) para a fracção citossólica
(D2) e membranar (D3) do homogeneizado da próstata, da fracção citossólica (D4) e
membranar (D5) do homogeneizado das células RM1 e controlos negativos para a
fracção membranar do homogeneizado da próstata (D6) e das células RM1 (D7) não se
tendo observado marcação.
64
15. AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS CÉLULAS TUMORAIS RM1 IN
VIVO
15.1. Curva dose-resposta em ratinhos C57BL6/J normoponderais
O crescimento dos tumores induzidos de células RM1 14 dias após a
inoculação na região subcutânea dorsal de células RM1 em concentrações
crescentes, nomeadamente: 1,5x105, 3,0x105, 6,0x105, 7,5x105, 9,0x105,
1,2x105, 1,8x105, em ratinhos C57BL6/J normoponderais (n=42 divididos em 7
grupos com n=6/grupo) foi proporcional à concentração do inoculo (Gráfico 1),
Verificou-se que a dose 3,0x105 células/500µL de PBS se associava a uma menor
variabilidade nas dimensões do tumor obtido (erro padrão da média), assim como
a análise histológica dos tumores em HE (Figura 3), nomeadamente a menor
extensão de necrose e uma densidade mitótica elevada, levou a que se optasse
por esta concentração de inoculo para realizar os estudos subsequentes.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
1,50E+05 3,00E+05 6,00E+05 7,50E+05 9,00E+05 1,20E+06 1,80E+06
concentração do inóculo
Méd
ia p
eso
do tu
mor
(g)
Gráfico 1 - Curva dose-resposta: crescimento tumoral (média do peso tumoral em g) em
função do tamanho do inoculo de células tumorais RM1.
À dose escolhida corresponde um menor erro padrão (SE=0,242), uma fase
mitótica mais acentuada e necrose praticamente inexistente, tudo factores
propícios à obtenção de tumores adequados ao estudo por serem menos freáveis
e estarem numa fase de crescimento favorável.
65
15.2. Crescimento das células RM1 em ratinhos obesos
O estudo final foi realizado, inoculando a dose escolhida como sendo a ideal
da curva dose-resposta em ratinhos obesos com diferentes ambientes hormonais
endógenos, constituindo três grupos de estudo, os ratinhos ob/ob, os ratinhos
db/db e os ratinhos DIO. O grupo controle constituído por ratinhos C54BL/6J
normaponderais corresponde ao grupo inoculado com a dose ideal na primeira
parte do trabalho. O desenvolvimento tumoral foi acompanhado durante os 14
dias através do registo diário do peso corporal tendo-se verificado que no inicio
do estudo, os ratinhos obesos ob/ob e os ratinhos diabéticos db/db
apresentavam pesos semelhantes, cuja média era de 51,7g e 46,2g
respectivamente, sendo significativamente superiores (p<0,001 em ambos os
casos) ao dos ratinhos controle que, apresentam um peso médio igual a 27g e
próxima da dos DIO que apresentavam peso médio igual a 28,3g (gráfico 2).
Gráfico 2 – Peso dos ratinhos, nos diferentes grupos, no início do estudo. Verificaram-se
diferenças estatísticamente significativas nos grupos db/db e ob/ob relativamente ao
grupo controlo. (ANOVA ***P<0,001).
0
10
20
30
40
50
60
Controlo dbdb obob DIO
Grupo
Pes
o (g
) Controlo
dbdb
obob
DIO(n=6)
***
***
66
No estudo terminal determinou-se o peso médio final dos diferentes grupos
em estudo verificando-se que o peso médio dos ratinhos ob/ob (57,5g) e db/db
(47g) é superior ao dos ratinhos controle (31,7g) sendo esta diferença
estatisticamente significativa com um valor de p<0,001 (gráfico 3). A diferença de
pesos entre os ratinhos DIO (30,2g) e os controle (31,7g) não apresentava
diferença significativa..
0
10
20
30
40
50
60
70
controlo db db ob ob DIO
Grupo
Pes
o (g
)
controlo
db db
ob ob
DIO
***
***
(n = 6)
Gráfico 3 – Peso final dos ratinhos, 14º dia após inoculação, nos diferentes grupos.
Verificaram-se diferenças estatísticamente significativas nos grupos db/db e ob/ob
relativamente ao grupo controlo. (ANOVA ***P<0,001).
A percentagem de gordura epididimária por peso corporal, utilizada como
marcador indirecto do conteúdo corporal em matéria gorda, foi
significativamente superior nos três grupos de ratinhos obesos, db/db, ob/ob e
DIO, relativamente ao grupo controle sendo o valor mais elevado nos db/db e
ob/ob (gráfico 4) apresentando, ambos, um p<0,01 e os DIO um p<0,001( Gráfico
4).
67
0
1
2
3
4
5
6
controlo db db ob ob DIO
Grupos
Per
cent
agem
da
gord
ura
epid
idim
ária
(%)
controlo
db db
ob ob
DIO
***
****
(n=6)
Gráfico 4- Comparação da percentagem de gordura epididimária entre os diferentes
grupos de ratinhos. Verificou-se que todos os grupos de animais obesos apresentavam
uma percentagem de gordura epididimária significativamente superior quando
comparados com o grupo controle (ANOVA **P<0,01, ***P<0,001).
Relativamente ao peso dos tumores verificou-se que quando comparados com
o grupo controlo, os tumores do grupo ob/ob e DIO apresentavam maiores
dimensões (p<0,001 em ambos os casos), enquanto os do grupo db/db eram
significativamente menores (p<0,05) como se pode observar no gráfico 5.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
controlo db db ob ob DIO
Grupo
Pes
o do
tum
or (
g) controlo
db db
ob ob
DIO
***
*
***
(n = 6)
Gráfico 5 - Peso do tumor nos diferentes grupos de ratinhos. Os ratinhos ob/ob e DIO
apresentam tumores significativamente maiores enquato os ratinhos db/db apresentam
tumores significativamente menores quando comparados com o grupo controlo. (ANOVA
*P<0,05, ***P<0,001)
68
16. ESTUDO MORFOMÉTRICO
O estudo morfométrico realizado nos cortes de tumores marcados por
imunocitoquímica utilizando como marcadores os anticorpos anti-Ki-67 para o
estudo da proliferação celular e anti-caveolina, para o estudo da angiogenese,
revelou relativamente à proliferação celular que o número de núcleos marcados
de castanho, o que indica que as células se encontram em proliferação foi maior
no grupo dos ratinhos ob/ob (figura 5C) e DIO (figura 5D) e menor no grupo
db/db quando comparados com o grupo controlo (figura 5B).
A
B
C
D
Figura 5 - Fotografias de imunohistoquímica realizada em cortes de tumor para
quantificação da proliferação celular utilizando como marcador o Ki-67. Verifica-se
uma menor marcação no grupo db/db (B) quando comparado com o grupo controle
(A). Os grupos ob/ob (C), DIO (D) apresentam valores muito próximos não sendo
estatisticamente diferentes do grupo controle. (400x)
69
No entanto a diferença apenas foi estatisticamente significativa para o grupo
db/db, quando comparado com o grupo controle (p<0,001) (gráfico 6) .
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
controlo db db ob ob DIO
Grupo
Den
sida
de M
itótic
a
controlo
db db
ob ob
DIO
***
(n = 6)
Gráfico 6 - Densidade nuclear determinada por contagem de núcleos marcados com Ki-
67. Quando comparados os grupos db/db, ob/ob e DIO com o grupo controle verificou-se
que o grupo db/db apresentava um grau de proliferação celular significativamente menor
(ANOVA ***P<0,001).
O índice mitótico determinado por contagem do número de mitoses
observadas nas lâminas marcadas com anticorpo anti-Ki67 por permitir uma boa
visualização dos núcleos em mitose (figuras 6A-D), foi. Semelhante nos tumores
dos ratinhos ob/ob e DIO.
70
A B
C
D
Figura 6 – Fotografias de IHQ realizada em cortes de tumor para determinação do
índice mitótico utilizando como marcador o Ki-67. O índice mitótico muito semelhante
entre os grupos ob/ob (C), DIO (D) e controle (A). O grupo db/db (B) apresenta índice
mitótico praticamente inexistente quando comparado com o controlo. (400x)
Enquanto que os tumores dos ratinhos db/db apresentavam um número
significativamente menor quando comparado com os do grupo controle(
p<0,001) (gráfico 7).
71
0
20
40
60
80
100
120
controlo db db ob ob DIO
Grupo
Den
sida
de d
e nú
cleo
s m
arca
dos
com
Ki-6
7controlo
db db
ob ob
DIO
***
(n = 6)
Gráfico 7 - Densidade mitótica, nos diferentes grupos em estudo, determinada por
contagem do número de mitoses observadas nas lâminas marcadas com KI-67. Os
ratinhos db/db apresentam uma densidade mitotica significativamente menor quando
comparada com o grupo controle (ANOVA ***P<0,001).
Relativamente à densidade vascular verificou-se que esta foi significativamente
maior nos tumores dos ratinhos db/db (p<0,05), enquanto nos tumores dos
ratinhos ob/ob e DIO apesar de superior não foi significativamente diferente da
observada no grupo controle ,como se pode observar nas Figuras 7 A-D e no
Gráfico 8.
72
A B
C
D
Figura 7 – Fotografias de imunohistoquímica realizada em cortes de tumor para
quantificação da angiogénese utilizando caveolina como marcador do endotélio.
Verifica-se uma maior marcação no grupo db/db (B) quando comparado com o grupo
controle (A). Os grupos ob/ob e DIO apresentam marcação semelhante. (400x)
0
2
4
6
8
10
12
14
controlo db db ob ob DIO
Grupo
Den
sida
de d
e va
sos
mar
cado
s po
r ca
veol
ina
controlo
db db
ob ob
DIO
*
(n = 6)
Gráfico 8 - Resultados obtidos na determinação da angiogénese tumoral através de
contagem de vasos marcados por caveolina. Observa-se diferença estatísticamente
significativa entre o grupo db/db e o grupo controle apresentando o primeiro maior
número de vasos marcados. (ANOVA *P<0,05)
73
17. DOSEAMENTOS HORMONAIS
Os níveis plasmáticos de leptina dos ratinhos do grupo ob/ob foram
praticamente nulos, enquanto dos ratinhos do grupo db/db foram
significativamente mais elevados quando comparados com os do grupo controle
(p<0,001) (gráfico 9).
0
5
10
15
20
25
30
35
controlo db db ob ob DIO
Grupos
[Lep
tina]
(ng
/mL)
controlo
db db
ob ob
DIO
***
(n = 6)
Gráfico 9 - Representação gráfica da concentração da leptina plasmática determinada
por ELISA nos diferentes grupos em estudo. Verificou-se que os ratinhos db/db
apresentam níveis significatiamente mais elevados que os do grupo controlo. (ANOVA
***P<0,001).
Quanto aos níveis plasmáticos de insulina verificou-se que o grupo ob/ob
apresentava níveis plasmáticos significativamente mais elevados que o grupo
controle (p<0,01). Como se pode observar no Gráfico 10 verificou-se que os
níveis plasmáticos de insulina dos outros grupos, db/db e DIO, foram
semelhantes aos do grupo controle.
74
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
controlo db db ob ob DIO
Grupo
[Insu
lina]
(ng
/mL) controlo
db db
ob ob
DIO
**
(n = 6)
Gráfico 10 - Níveis de insulina plasmática dos diferentes grupos em estudo. Os
ratinhos do grupo ob/ob apresentaram uma concentração de insulina significativamente
mais elevada quando comparada com o grupo controlo. (ANOVA **P<0,01).
75
18. CORRELAÇÕES
Após análise estatística dos resultados obtidos determinou-se a correlação
entre a leptina, o principal factor em estudo, e o peso do tumor e todos os
parâmetros morfométricos avaliados. Relativamente à relação entre leptina e peso
do tumor (gráfico 11), verificou-se existir uma correlação negativa
estatisticamente significativa (r=-0,642, p<0,001), ou seja, ratinhos com níveis
plasmáticos elevados de leptina desenvolveram tumores de menores dimensões.
Gráfico 11 - Representação gráfica da relação entre os níveis de leptina plasmáticos e o
peso do tumor tendo-se verificado uma correlação negativa entre estes dois parâmetros
(r=-0,642, p<0,01).
No que diz respeito à relação entre níveis plasmáticos de leptina e a
densidade de núcleos marcados por anticorpo anti-Ki67 também se verifica uma
correlação negativa estatisticamente significativa (r=-0,795, p<0,001), (gráfico
12), o que indica que níveis elevados de leptina se associação a um menor índice
de proliferação celular.
76
Gráfico 12 – Representação gráfica da relação entre concentração de leptina plasmática e
a marcação nuclear por Ki-67, observando-se uma correlação negativa estatisticamente
significativa (r=-0,795, p<0,001).
Assim como também foi encontrada uma correlação negativa estatisticamente
significativa (r=-0,646, p<0,01), (gráfico 13) entre os níveis plasmáticos de leptina
e o número de mitoses.
Gráfico 13 - Representação gráfica da correlação negativa entre níveis plasmáticos de
leptina e o índice mitótico (r=-0,646, p<0,01).
77
Capítulo 5
DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÃO
78
DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÃO
A obesidade tem sido considerada, com alguma controvérsia, um factor de
risco para carcinoma da próstata (Giovannucci, Rimm et al. 2003; Baillargeon,
Platz et al. 2006). Uma das principais moléculas apontada como potencial
responsável por esta associação tem sido a leptina (Mistry, Digby et al. 2007),
uma hormona produzida principalmente pelo adipócito e cuja concentração
plasmática está aumentada na obesidade em proporção à massa gorda
(Frederich, Hamann et al. 1995; Maffei, Halaas et al. 1995). A leptina, após a sua
ligação ao receptor membranar OBR, activa diversas vias intracelulares, tais como
a JAK2/STAT3, MAPK/ERK, PI-3K/Akt (Baumann, Morella et al. 1996; Nakashima,
Narazaki et al. 1997) que promovem a anti-apoptose, a proliferação celular, a
mitognese e angiogenese estando, potencialmente envolvidas no
desenvolvimento e proliferação tumoral. Existem várias isoformas do receptor da
leptina, sendo a isoforma longa OBRb, localizada na membrana celular, a
principal responsável pela activação das vias acima referidas. Estudos in vitro em
que foram cultivadas linhas celulares humanas de cancro da próstata, androgénio
independentes, nomeadamente as DU 145 e PC-3 (Somasundar, Yu et al. 2003;
Deo, Rao et al. 2008; Hoda and Popken 2008) e de uma linha celular androgénio
dependente, a LNCaP, (Deo, Rao et al. 2008) na presença de leptina para avaliar o
crescimento celular e a activação das vias de sinalização intracelular,
demonstraram que a leptina induz um aumento da proliferação celular e
diminuição da apoptose nas linhas celulares androgénio independentes (DU 145 e
PC-3) por activação das vias PI3-K e MAPK (Somasundar, Frankenberry et al. 2004;
Hoda and Popken 2008). Deo e colegas verificaram a activação das vias de
sinalização STAT-3 e MAPK tanto nas linhas androgénio independentes como nas
células androgénio dependentes (LNCaP) embora mais lenta na última linha. No
entanto, quando cultivadas na presença de doses de concentração crescente de
leptina, as linhas celulares DU 145 e PC 43, não apresentam aumento do índice
proliferativo verificando-se o contrário na linha celular LNCaP (Deo, Rao et al.
2008). Estes resultados são controversos aos apresentados em 2003 por Onuma
e colegas, que demonstraram o aumento da proliferação celular das células
androgénio independentes mencionadas na presença de leptina, não verificando
qualquer alteração na proliferação das células LNCaP (Onuma, Bub et al. 2003).
O objectivo deste estudo foi avaliar o efeito da leptina no crescimento de
células de carcinoma da próstata in vivo. Para tal foi utilizada uma linha celular de
79
carcinoma da próstata androgénio independente murina, RM1; foi escolhida uma
linha celular androgénio independente de modo a excluir os níveis de
androgénios das variáveis, uma vez que estes podem estar diminuídos na
obesidade proporcionalmente à massa gorda e poderiam constituir uma variável
de confundimento e murina para permitir a realização do estudo in vivo no
ratinho.
Uma vez que não havia referência ou publicações com informação sobre as
características das células RM1 quanto à presença de receptores para a leptina, a
primeira fase deste estudo consistiu na realização de um estudo imuno-cito-
químico (ICQ) e estudos moleculares para caracterizar a linha celular quanto à
presença do OBR. No estudo ICQ anti-OBR, utilizando um anticorpo anti-OBR,
específico para a isoforma longa do receptor da leptina (OBRb), as células RM1
revelaram a presença de uma marcação positiva para a isoforma longa do
receptor OBR (Malendowicz, Rucinski et al. 2006). Este resultado que foi
corroborado pelos resultados do estudo ICQ para o mesmo receptor realizado
com numa amostra de exsudado peritoneal de ratinho, em que se verificou, como
esperado, a presença de marcação positiva nos macrófagos, que expressam a
isoforma longa do receptor da leptina (O'Rourke, Yeaman et al. 2001), e negativa
nos neutrófilos, que apenas expressam a isoforma curta (Bruno, Conus et al.
2005), utilizados como controlos positivo e negativo, respectivamente. No estudo
de imuno-histoquímico para o OBRb realizado em cortes de próstata de ratinho
normal, as células do epitélio glandular também apresentaram uma marcação
positiva para o receptor da leptina, à semelhança dos resultados previamente
publicados por Malendowicz et al, que encontrou marcação positiva para a
isoforma longa do receptor de leptina no epitélio glandular da próstata nos
lóbulos dorsal, ventral e laterais da próstata (Malendowicz, Rucinski et al. 2006).
Apesar destes resultados serem positivos quanto à presença da isoforma
activa do receptor da leptina nesta linha celular e favoráveis à sua utilização nos
estudos in vivo que pretendíamos efectuar, decidimos confirmar os resultados
com a realização de estudos moleculares, nomeadamente detectando a presença
do receptor no homogeneizado celular por Western Blot e a expressão do gene
do receptor por RT-PCR.
Para detectar a presença do receptor da leptina por Western blot, foram
realizados homogeneizados celulares de células RM1 e de próstata de ratinho
normal, seguidos de separação das fracções membranar e citosólica, esta última
realizada para verificar a ocorrência de perdas membranares aquando da
80
homogeneização celular e prostática, tendo sido detectada a presença de um
grande número de bandas no Western-blot à semelhança das obtidas na
electroforese do espectro proteico das amostras, mas nenhuma das bandas
correspondente ao peso molecular esperado para os receptores da leptina,
nomeadamente aos 80 kDa da isoforma curta do receptor OBRa e 120 kDa da
isoforma longa do receptor OBRb, resultados estes que não nos permitem
concluir quanto à presença de receptores OBR nas células RM1. Estes resultados
foram inesperados, uma vez que Zeidan et al, num estudo em que procuraram
avaliar o efeito trófico da leptina nas células do músculo liso vascular, tendo
utilizado o mesmo anticorpo obtiveram bandas de pesos moleculares
correspondentes às isoformas longa (120 kDa) e curta (80 kDa) do receptor da
leptina (Zeidan, Purdham et al. 2005). No entanto, também não é possível excluir
que algumas das bandas encontradas, nomeadamente na zona dos pesos
moleculares de 52 kDa – 76 kDa e 76 kDa – 102 kDa, que embora correspondam
a pesos moleculares mais baixos possam corresponder ao receptor OBRa e OBRb,
respectivamente, resultantes da possível clivagem proteolítica do antigénio
ocorrida no decorrer da preparação das amostras, amostra insuficiente, ou a
eventuais erros no decorrer do Western-blot tal como fraca especificidade, má
qualidade ou deterioração do anticorpo primário que passou a ligar-se
inespecificamente sendo responsável pelo aparecimento das múltiplas bandas, ou
mesmo devido ao o método colorimétrico usado para detecção da reacção
antigénio-anticorpo, por ser pouco sensível ao contrário de outros métodos de
detecção tais como a quimioluminescência e a quimiofluorescência, e pouco
adequado para detectar bandas contendo uma pequena quantidade de proteína.
No estudo de RT-PCR realizado para detectar a expressão do gene do receptor
da leptina nas células RM1, apenas foi detectada positividade para a expressão da
isoforma curta do receptor de leptina (OBRa) mas não da isoforma longa (OBRb).
Uma vez que a técnica de RT-PCR apresenta uma sensibilidade elevada,
permitindo estudar a expressão de genes em amostras muito pequenas, este
resultado em simultâneo com os resultados obtidos por Zeidan e tal nos estudos
de Western-blot, põem em causa a especificidade do anticorpo utilizado (OBR 12-
A, Alpha Diagnostics) para a isoforma longa do receptor.
Também não se pode excluir que a isoforma activa nas células da próstata de
ratinho seja a isoforma curta (OBRa) podendo ser responsável pela a activação de
vias de sinalização que promovam a proliferação celular e angiogénese.
Murakami em 1997 verificou que cultivando células CHO-OBR, expressando
81
receptores OBRa e OBRb, em presença de leptina ambos os receptores eram
activados promovendo vias de sinalização ocorrendo expressão de genes c-fos, c-
jun e jun-B actuando no núcleo celular (Murakami, Yamashita et al. 1997).
Segundo a Fruhbeck a isoforma curta do receptor da leptina participa na
activação da via Ras/Raf/MAPK podendo levar à fosforilação do JAK2 associado à
activação do receptor podendo levar a uma expressão final de genes alvo como c-
fos e egr-1 que promovem a proliferação e diferenciação celular (Bjorbaek, Uotani
et al. 1997; Fruhbeck 2006). Assim sendo, foi decidido prosseguir com os
estudos in vivo.
Para avaliar o efeito da leptina no crescimento das células RM1 in vivo, estas
foram inoculadas em ratinhos obesos com diferentes ambientes hormonais
endógenos.
A primeira fase do estudo consistiu em determinar a dimensão ideal do
inóculo de células RM1 para induzir o desenvolvimento dos tumores, realizando
uma curva dose-resposta em ratinhos controle normoponderais. Para tal, o
crescimento dos tumores de células RM1 em ratinhos C57BL6/J foram
acompanhados durante 14 dias após a inoculação de 7 concentrações conhecidas
de células na região subcutânea do dorso (Voeks, Martiniello-Wilks et al. 2002),
seguida de uma avaliação histológica dos tumores obtidos, de modo a permitir a
escolha da dose ideal a utilizar nos estudos subsequentes tendo em consideração
a área de necrose, o índice mitótico e o menor coeficiente de variação intra-
grupo. Verificou-se, à semelhança dos resultados obtidos por Voeks, que as
células RM1 quando inoculadas subcutaneamente, têm um crescimento rápido
(Voeks, Martiniello-Wilks et al. 2002), conduzindo no nosso estudo ao
aparecimento de tumores de 5 + 5, 10, da classificação de Gleason, uma vez que
as células apresentam um grau de anormalidade elevada e são muito pouco
diferenciadas (McNeal and Gleason 1991). Após análise histológica dos tumores
induzidos nos diferentes grupos, foi seleccionada a dose de
3,0x105células/500µL de PBS, por corresponder à dose que produzia tumores
com um índice mitótico numa fase de aumento exponencial, com um grau de
necrose estava praticamente ausente e nos quais se observou um menor
coeficiente de variação intra-grupo (pequeno valor de erro padrão) permitindo
deste modo a obtenção de tumores com as condições ideais para a avaliação do
grau de proliferação e angiogénese, uma vez que inóculos menores produziam
tumores de dimensões reduzidas e inóculos maiores produziam tumores de
grandes dimensões, muito friáveis e com uma área de necrose extensa o que
82
dificultaria a obtenção de uma área de tumor sólido suficiente para a realização
dos estudo morfométricos.
Para avaliar o crescimento das células RM1 em animais obesos com diferentes
ambientes endógenos quanto aos níveis e sensibilidade à leptina, estas foram
inoculadas em diferentes estirpes de ratinhos obesos, nomeadamente em
ratinhos com deficiência congénita de leptina por mutação inactivante do gene
ob, gene que codifica a leptina, os ratinhos ob/ob (Chua, Chung et al. 1996); em
ratinhos obesos e diabéticos, hiperleptinémicos por resistência congénita à
leptina devida a uma mutação espontânea do gene que codifica o receptor da
leptina, os ratinhos db/db (Zhang, Proenca et al. 1994; Chua, Chung et al. 1996)
e em ratinhos C57BL6/J com obesidade induzida pela dieta (DIO), alimentados
com uma dieta hipercalórica e hiperlipídica (45% gordura) iniciada logo após o
desmame com o objectivo de induzir obesidade e aumento dos níveis de leptina
em animais com receptores da leptina funcionais; ratinhos C57BL6/J
normoponderais foram utilizados como controle.
De acordo com o esperado, o peso corporal dos ratinhos db/db e ob/ob, com
obesidade de causa monogenética, era significativamente e superior quando
comparado com o dos ratinhos do grupo controle, enquanto que o peso dos
ratinhos submetidos a dieta hipercalórica não era apresentava uma diferença
estatisticamente significativa quando comparado com o do grupo controle,
possivelmente devido a período durante o qual foram submetidos a esta dieta (16
semanas) ter sido de curta duração e ao facto de a dieta também não ter sido
suficientemente hipercalórica para induzir um aumento ponderal significativo
num curto espaço de tempo, se tivesse sido utilizada uma dieta hipercalórica com
60% de gordura teria tido maior probabilidade de induzir obesidade mais
rapidamente. No entanto, quando avaliada a composição corporal relativa destes
animais, observou-se que a percentagem de gordura epididimária, um indicador
secundário do conteúdo corporal em massa gorda visceral (Monteiro, Monteiro et
al. 2006), verificou-se que esta era significativamente superior não só nos
ratinhos ob/ob, db/db, como esperado, mas também nos ratinhos DIO quando
comparados com o grupo controle, o que permite afirmar que na realidade os
ratinhos DIO, apesar de terem um peso corporal semelhante ao dos ratinhos
controle, têm uma percentagem superior de massa gorda e são mais obesos que
os ratinhos controle.
Quanto aos níveis plasmáticos de leptina dos ratinhos de cada grupo, como
esperado, verificou-se que os ratinhos do grupo ob/ob apresentavam níveis
83
indoseáveis de leptina e que os ratinhos do grupo db/db apresentavam níveis
significativamente mais elevados do que os do grupo controle; enquanto que os
ratinhos do grupo DIO, embora apresentassem níveis de leptina plasmática mais
elevados do que os do grupo controle, estes não foram significativamente
superiores, possivelmente devido aos motivos que já foram mencionados acima
para o peso corporal.
No que diz respeito ao crescimento tumoral, os ratinhos com deficiência de
leptina (ob/ob) desenvolveram tumores de dimensões significativamente
superiores, enquanto que os ratinhos com níveis elevados de leptina (db/db)
desenvolveram tumores de dimensões significativamente menores do que os
observados nos ratinhos do grupo controle, ao contrário do que seria de esperar
se a leptina funcionasse como um estimulante do crescimento e desenvolvimento
tumoral como defendem alguns autores (Chang, Hursting et al. 2001;
Somasundar, Yu et al. 2003; Somasundar, Frankenberry et al. 2004; Mistry, Digby
et al. 2008). Chang e colegas procuraram, com este estudo, relacionar níveis
elevados de leptina plasmática com o volume tumoral em indivíduos submetidos
a prostectomia total e indivíduos apresentando tumores comparando volume
tumoral e verificando, após estratificação por idade, níveis de testosterona, peso
corporal e IMC, que indivíduos com níveis elevados de leptina apresentam risco
aumentado de desenvolver tumor de volume superior assim como homens
apresentando níveis elevados de leptina e testosterona (Chang, Hursting et al.
2001). Verificando assim que níveis elevados de leptina plasmática, em
indivíduos com cancro da próstata, se associam a risco aumentado de
desenvolver carcinoma mais volumoso (Chang, Hursting et al. 2001). Enquanto,
outros autores em estudos in vitro verificaram o aumento da proliferação celular
tanto de células PC3 (Somasundar, Yu et al. 2003; Somasundar, Frankenberry et
al. 2004; Hoda and Popken 2008; Mistry, Digby et al. 2008) como em células DU
145 (Somasundar, Yu et al. 2003; Somasundar, Frankenberry et al. 2004), ambas
linhas celulares de carcinoma da próstata humanas androgenio independentes,
quando cultivadas na presença de leptina. Pelo contrário, os resultados obtidos
no nosso trabalho estão de acordo com os resultados de outros autores,
nomeadamente Stattin et al, que num estudo epidemiológico não encontraram
qualquer relação significativa entre os níveis de leptina plasmática e risco de
desenvolver cancro da próstata e pelos resultados obtidos por Hsing et al em
estudos in vitro em que avaliaram o crescimento das linhas celulares PC3 e DU
145 (androgénio independentes) na presença de leptina não tendo encontrado
84
qualquer relação estatisticamente significativa entre os níveis de leptina e a
proliferação celular (Hsing, Chua et al. 2001; Onuma, Bub et al. 2003; Stattin,
Kaaks et al. 2003; Deo, Rao et al. 2008). A dimensão dos tumores obtidos nos
ratinhos DIO, foi semelhante à obtida nos ratinhos ob/ob e significativamente
superior à dos ratinhos do grupo controle, apesar dos níveis plasmáticos de
leptina não serem significativamente mais elevados. Após avaliação do grau de
mitogenese e proliferação tumoral verificou-se que em ambientes endógenos
pobres em leptina, encontrados nos ratinhos ob/ob, a proliferação celular foi
elevada, pelo contrário, ambientes ricos em leptina, como os encontrados em
ratinhos db/db, estiveram associados a uma diminuição da proliferação celular
parecendo mesmo que este factor participa como repressor do desenvolvimento
tumoral observando-se uma correlação negativa e estatísticamente significativa
entre os níveis plasmáticos de leptina e o grau de proliferação celular e
mitogénese nos tumores induzidos. De igual modo, por análise dos nossos
resultados, não foi encontrada qualquer correlação entre os níveis de leptina e o
grau de angiogénese, contrariando os resultados obtidos por Sierra-Honigmann
et al que efectuaram estudos cultivando células endoteliais humanas da veia
umbilical (HUVECs) na presença de leptina, após terem verificado a expressão de
receptores OBRb por imuno-histoquímica e verificado que o receptor estava
funcional determinada pela ocorrência de fosforilação da tirosina do OBRb assim
como detectando o aumento do factor STAT3 por SDS-PAGE e Imuno-bloting, A
acção da leptina na angiogénese foi determinada in vitro, por avaliação da
migração celular através de uma membrana porosa em resposta à leptina, tendo
sido verificado que as células HUVECs formavam túbulos semelhantes a capilares
num gel tridimensional de colagénio na presença de leptina, e in vivo
implantando polímeros com leptina na córnea de ratos normais e com deficiência
em receptores de OBR (ratos fa/fa Zucker), após o que se verificou uma resposta
angiogénica vigorosa nos ratos normais e ausência de resposta ratos fa/fa
apoiando assim uma acção favorável da leptina na angiogénese (Sierra-
Honigmann, Nath et al. 1998). Bouloumie et al efectuaram estudos com esta
mesma linha celular, tendo verificado a expressão do receptor OBR por RT-PCR e
efectuado estudos in vitro e in vivo, após o que obtiveram resultados
semelhantes que apoiam a acção da leptina como factor pró-angiogénico
(Bouloumie, Drexler et al. 1998).
Admitindo a presença de receptores da leptina activos nas células RM1, pelos
resultados obtidos no nosso estudo, a leptina não parece ter qualquer acção
85
promotora do desenvolvimento tumoral, podendo mesmo sugerir que a leptina
possa funcionar como inibidor da proliferação das células RM1. No entanto, não
podemos deixar de referir que houve uma discordância nos resultados obtidos na
imuno-citoquímica para o OBRb, cujo resultado foi positivo e na análise molecular
por RT-PCR na qual não foi possível detectar a presença da isoforma longa dos
receptores de leptina nas células RM1, pelo que sendo este um método mais
sensível, não se pode excluir a hipótese da leptina não ter apresentado um efeito
trófico nas células tumorais por estas células não expressarem a forma activa do
receptor. Em alternativa, também não pode ser excluída a possibilidade da leptina
activar ou inactivar vias de sinalização que estimulam a proliferação celular ao
actuar através da isoforma curta do receptor da leptina OBRa. No sentido de
esclarecer o papel dos receptores OBRa e OBRb na activação de vias de
sinalização de proliferação celular pela leptina nas células RM1, será pertinente a
realização de outras experiências futuras, nomeadamente cultivar as células RM1
na presença de leptina para verificar o comportamento celular in vitro e estudar a
activação das vias de sinalização intracelular nas células RM1 doseando os
mediadores intra-celulares destas cadeias de sinalização, tais como a via MAPK,
STAT3 e a via PI3-K à semelhança do que foi realizado para outras linhas celulares
(Deo, Rao et al. 2008; Hoda and Popken 2008).
Os resultados obtidos no nosso trabalho não apoiam a hipótese da leptina
promover a proliferação e angiogenese no tecido tumoral de células murinas de
carcinoma da próstata, à semelhança dos resultados encontrados por Hsing et al
e Stattin el al em estudos clínicos envolvendo doseamento plasmáticas em
amostras de sangue de indivíduos com cancro da próstata e indivíduos saudáveis
(controlo) não tendo encontrado relação estatisticamente significativa entre os
níveis de leptina e o risco de desenvolver cancro da próstata (Hsing, Chua et al.
2001; Stattin, Kaaks et al. 2003), que por sua vez atribuem o risco aumentado de
carcinoma da prostata na obesidade a outros factores circulantes que se
encontram frequentemente aumentados, nomeadamente a insulina e o IGF-1
(Hsing, Chua et al. 2001). Hoda et al em estudos realizados in vitro utilizando
duas linhas celulares humanas, de carcinoma da prostata androgénio
independentes, DU145 e PC-3, cultivadas na presença de leptina verificou um
aumento da proliferação celular e uma redução da apoptose (Hoda and Popken
2008), por outro lado Deo et al, que também cultivou as linhas celulares
androgénio independentes já mencionadas e de uma linha celular humana
androgénio dependente, LNCaP, na leptina apenas verificou que a leptina
86
aumentou a proliferação das células androgénio dependentes (Deo, Rao et al.
2008).
Nunez et al com o objectivo de dissociar os efeitos da obesidade e hormonas
derivadas do tecido adiposo da carcinogénese realizaram um trabalho recorrendo
a ratinhos transgénicos lipodistróficos “Fatless A-ZIP/F-1”, com tecido adiposo
branco praticamente inexistente, níveis de leptina muito baixos e insulino-
resistência, tendo verificado que os ratinhos deste modelo desenvolveram mais
tumores mamários do que a estirpe selvagem sugerindo que o factor
determinante da associação entre a obesidade e o cancro, não são os níveis de
leptina nem a massa gorda, mas sim outros factores circulantes que estão
frequentemente alterados na obesidade e que são resultantes da resistência à
insulina ou do estado pró-inflamatório, tais como níveis elevados de insulina, IGF-
1 e IL-6 (Nunez, Oh et al. 2006). Ablamunits et al com o objectivo de estudar os
efeitos da leptina e do tecido adiposo no desenvolvimento tumoral recorreu a
ratinhos ob/ob e ratinhos A-ZIP/F-1 induziu nestes dois modelos papilomas
cutâneos tendo verificado que ratinhos com deficiência em leptina (ob/ob) não
apresentavam carcinogénese aumentada quando comparados com os controle
enquanto que os ratinhos com lipodistrofia e consequente deficiência em leptina
apresentavam carcinogénese aumentada o que os levou a sugerir que o tecido
adiposo possa funcionar como factor protector da carcinogénese (Ablamunits,
Cohen et al. 2006).
No nosso estudo e de acordo com o esperado, os níveis de insulina plasmática
dos ratinhos ob/ob, hiperfágicos, obesos e insulino-resistentes foram
significativamente mais elevados que os ratinhos do grupo controle, enquanto
que os níveis de insulina dos ratinhos db/db, também hiperfágicos, obesos e
insulino-resistentes, mas com falência relativa da célula beta pancreática e
diabéticos, não foram significativamente diferentes dos ratinhos controle.
Cox demonstrou a presença de receptores de insulina em tumores de
carcinoma da próstata primários humanos tendo sugerido que a hiperinsulinémia
associada à obesidade poderá ser um efeito adverso no desenvolvimento deste
carcinoma (Cox, Gleave et al. 2009). A insulina após ligação ao receptor da
insulina (IR) activa as vias RAS/RAF/MEK/ERK levando à estimulação da
mitogenese e a Akt por fosforilação do PI-3 inibindo a apoptose e promovendo a
carcinogenese (Frasca, Pandini et al. 2008). A insulina também actua ao nível do
sistema nervoso autónomo, pelo que em situações que cursam com
hiperinsulinemia observa-se um aumento da actividade do sistema nervoso
87
simpático levando à estimulação da produção de catecolaminas que podem ter
um efeito trófico nas células tumorais e levar a uma diminuição do processo
apoptótico (Nandeesha 2008).
Leitzmann et al realizaram um estudo epidemiológico prospectivo seguindo
uma cohort de 33088 homens com idades compreendidas entre os 55 e 74 anos
durante 8,9 anos tendo verificado uma relação inversa entre diabetes e o risco
de desenvolver cancro da próstata, risco total (forma não agressiva e agressiva) e
risco de forma não agressiva, o que sugere que a diabetes possa actuar como
protector nos estados iniciais de cancro da próstata (Leitzmann, Ahn et al. 2008).
Uma vez que não está descrita a presença de receptores de insulina na linha
celular RM1 seria pertinente em experiências futuras explorar esta via de
sinalização, nomeadamente caracterizar a expressão dos receptores na linha
celular e avaliando o papel da insulina na proliferação celular in vitro e in vivo.
A obesidade é um estado patológico que cursa com alteração dos níveis de
diversos factores circulantes com potencial influência na proliferação celular e
dado os resultados obtidos neste trabalho de investigação, não podemos excluir
a hipótese de outros factores tais como a adiponectina, o IGF-1, a IL-6 e o TNF-α
cuja avaliação não fez parte do âmbito deste estudo, possam estar envolvidos na
tumorigenese, e como tal mereceriam ser investigados com maior detalhe em
estudos posteriores.
A adiponectina é uma adipocina produzida pelo adipócito que está
inversamente relacionada com a obesidade (Kershaw and Flier 2004) e com a
insulino-resistência (Kershaw and Flier 2004; Lihn, Pedersen et al. 2005), cujo
papel desempenhado na oncogenese da próstata ainda não é muito claro. Vários
autores encontraram uma associação entre a baixa concentração de adiponectina
plasmática e o cancro da próstata (Goktas, Yilmaz et al. 2005; Mistry, Digby et al.
2006; Michalakis, Williams et al. 2007). Goktas et al realizaram um estudo clínico
em que dosearam a adiponectina plasmática em indivíduos com cancro da
próstata maligno, hiperplasia benign,a e indivíduos saudáveis, tendo observando
que indivíduos com cancro da próstata apresentam os níveis de adiponectina
mais baixos (Goktas, Yilmaz et al. 2005). Michalakis et al também dosearam os
níveis de adiponectina em indivíduos com cancro da próstata maligno e
hiperplasia benigna tendo obtido resultados semelhantes ao estudo anterior
assim como avaliaram a expressão de receptores de adiponectina em amostras
de tecido normal, hiperplasia benigna e tecido tumoral maligno, tendo verificado
88
menor expressão de receptores nos tecidos tumorais malignos (Michalakis,
Williams et al. 2007).
O factor de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), é um mediador
endócrino produzido no fígado que apresenta uma homologia de 50% com a
insulina (Khandwala, McCutcheon et al. 2000; Frasca, Pandini et al. 2008) e cujos
níveis se encontram frequentemente elevados na obesidade. Vários autores têm
estudado os seus efeitos como promotor do desenvolvimento do cancro
modulando a proliferação e diferenciação celular e apoptose (Onuma, Bub et al.
2003; Frasca, Pandini et al. 2008; Wigle, Turner et al. 2008).
A obesidade está associada a um estado inflamatório crónico de baixa
intensidade, que se caracteriza pelo aumento dos níveis circulantes de IL-6 (Fried,
Bunkin et al. 1998; Mistry, Digby et al. 2007; Stienstra, Duval et al. 2007),
citocina pro-inflamatória produzida pelos macrofagos residentes no tecido
adiposo. Níveis elevados de IL-6 parecem estar relacionados com cancro da
próstata promovendo a carcinogenese (Onuma, Bub et al. 2003; Mistry, Digby et
al. 2007).
Os resultados controversos obtidos neste trabalho podem, também, dever-se
ao facto de os modelos animais obesos escolhidos, divergirem não só no que diz
respeito aos níveis e sensibilidade à leptina, mas também de outros factores
circulantes com potencial para interferir no crescimento tumoral, tais como a
insulina. Em estudos futuros, seria pertinente a realização deste estudo utilizando
ratinhos normoponderais mas hiperleptinemicos, de modo a permitir avaliar a
acção da leptina na proliferação tumoral independentemente dos outros factores
que se encontram alterados na obesidade. Tal poderia ser realizado utilizando
ratinhos C57BL6/J com uma bomba infusora de leptina Alzet implantada na
cavidade peritoneal de modo a reproduzir os níveis de leptina observados nos
ratinhos db/db.
Em resumo, este trabalho realizado com o objectivo de avaliar a influência da
obesidade e da leptina no crescimento e angiogénese tumoral de células de
carcinoma da prostata, permitiu verificar que células RM1 de carcinoma da
próstata murinas androgeneo-independente quando injectadas em ratinhos
obesos e hiperleptinemicos, induziram o desenvolvimento de tumores de
menores dimensões e com um menor índice de proliferação celular e
angiogénese do que os observados nos ratinhos controle normoponderais,
enquanto que nos ratinhos obesos e com deficiência de leptina, desenvolveram
89
tumores de maiores dimensões e com maior índice de proliferação celular,
sugerindo que concentrações elevadas de leptina não são favoráveis ao
crescimento desta linha celular de carcinoma da próstata androgéneo-
independente, podendo mesmo ter um papel supressor do crescimento celular.
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