Características Microbiológicas e Tipificação Molecular de ...livros01.livrosgratis.com.br/cp036620.pdf · Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Características Microbiológicas e Tipificação Molecular

de uma Cepa de Providencia stuartii Relacionada a Surto

de Infecção Hospitalar

Ana Carolina Mesquita Rocha

2007

1

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Características Microbiológicas e Tipificação Molecular

de uma Cepa de Providencia stuartii Relacionada a Surto

de Infecção Hospitalar


Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências (Microbiologia).

Orientadora: Prof. Beatriz Meurer Moreira

Rio de Janeiro

Abril/2007

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Rocha, Ana Carolina Mesquita Características Microbiológicas e Tipagem Molecular de uma Cepa de Providencia stuartii Relacionada a Surto de Infecção Hospitalar. Rio de Janeiro : UFRJ/IMPPG, 2007. 74p Orientador: Beatriz Meurer Moreira

Tese (Mestrado) – UFRJ/Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, 2006. Referências bibliográficas: f.62-74 1. Providencia stuartii 2. ESBL 3. RAPD-PCR 4. CTX-M – I. Moreira, Beatriz

Meurer (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes. III. Título

3

A Deus pela oportunidade de viver um dia após o outro. Aos meus pais, Paulo Afonso e Rosa Maria pelos exemplos de perseverança e caráter. Ao meu querido companheiro Helvécio, meu grande incentivador, pela compreensão e estímulo constantes.

4

Agradecimentos Às minhas amigas e irmãs Junia e Rosa Paula pela cumplicidade. À Prof. Beatriz Meurer Moreira pela orientação, oportunidade e liberdade de pensamento. A toda a equipe do Laboratório de Epidemiologia Molecular de Infecções Bacterianas e do Laboratório de Patogênese e Resistência de Cocos Gram Positivos pelo compartilhamento de idéias. À Adriana Marcos Vivoni, Adriana Lúcia Pires Ferreira, Luísa Barbosa Gomes dos Santos e Maria Silvana Alves pela amizade. À Semiramis e Sr. Luiz pelo apoio técnico. À Capes – Coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela concessão de bolsa; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT/PRONEX) pelo apoio financeiro. Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG) na pessoa de sua diretora Prof. Agnes Marie Sá Figueiredo; À coordenação do curso de Pós-Graduação do IMPPG, na pessoa de sua coordenadora Prof. Thaís Cristina Soares Souto Padrón À Prof. Ângela Christina Dias de Castro, chefe do Departamento de Microbiologia Médica do IMPPG

5

Trabalho realizado no Departamento de Microbiologia Médica do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da prof. Beatriz Meurer Moreira.

6

Resumo Características Microbiológicas e Tipagem Molecular de uma Cepa de Providencia

stuartii Relacionada a Surto de Infecção Hospitalar


Orientador: Prof. Beatriz Meurer Moreira

Resumo da dissertação de mestrado submetido ao Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de mestre em ciências (Microbiologia)

P. stuartii é um patógeno emergente em infecções nosocomiais. A disseminação de cepas resistentes aos antimicrobianos pode representar um grave problema terapêutico. No presente estudo, foram avaliados aspectos microbiológicos e moleculares de amostras de P. stuartii coletadas de pacientes internados em um hospital privado da cidade de Niterói-RJ, no período de janeiro de 2004 a dezembro de 2005. Durante o estudo, 69 amostras foram obtidas de pacientes internados e uma amostra procedente da superfície de uma sonda utilizada para a realização de ecocardiografia transesofágica. Das 69 amostras iniciais, apenas 63 foram incluídas no estudo pois as 6 amostras restantes não tiveram sua identificação fenotípica confirmada como P. stuartii. As amostras de origem clínica foram isoladas a partir de lavado broncoalveolar (30%), escara de decúbito (27,5%), secreção traqueal (17,5%), ponta de cateter (15%), urina (7,5%) e sangue (2,5%). Todas estas amostras foram inicialmente identificadas como P. stuartii no laboratório de origem pelo sistema automatizado Microscan®. Os objetivos do presente estudo são: 1) confirmar a identificação fenotípica das amostras bacterianas em espécie utilizando métodos convencionais; 2) avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos pelo método de disco difusão de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute e a produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) pelo método de disco-aproximação; 3) analisar a composição clonal das amostras através da tipagem molecular utilizando as técnicas de RAPD com o iniciador 272 e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE); e, 4) determinar a presença de gene para codificação de ESBL do tipo CTX-M. Todas as 63 amostras avaliadas revelaram a produção de ESBL. As técnicas de RAPD e PFGE permitiram a determinação de um grupo clonal principal e a presença de gene codificador de ESBL do tipo CTX-M foi encontrado em todas as 36 amostras avaliadas. No presente estudo, foram apresentadas evidências de que um único grupo clonal de P. stuartii produtora de ESBL foi responsável por todas as infecções por esta espécie em um hospital. Amostra desse mesmo grupo clonal foi detectada como contaminante em sonda de ecocardiografia transesofágica. Palavras-chave: Providencia stuartii, ESBL, RAPD-PCR, CTX-M.

Rio de Janeiro Abril/2007

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Abstract

Microbiological and Molecular Characteristics of a Providencia stuartii Strain Related to an Outbreak of Hospital Infections


Orientador: Prof. Beatriz Meurer Moreira

Abstract da dissertação de mestrado submetido ao Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de mestre em ciências (Microbiologia)

P. stuartii is an emerging nosocomial pathogen. The widespread dissemination of antimicrobial resistant strains can pose a severe therapeutic challenge. In the present study, microbiological and molecular aspects of P. stuartii strains were evaluated. The isolates were obtained from inpatients of a private hospital in Niterói city, Rio de Janeiro, Brazil, from January 2004 to December 2005. During the study, 68 isolates were obtained from inpatients and one isolate was obtained from the surface of a transesophageal echocardiography probe. From these 69 initial samples only 63 were included in the study. The six other were not confirmed as P. stuartii. The clinical isolates were obtained from the following clinical specimens: brochoalveolar lavage (30%), pressure sores (27,5%), tracheal secretions (17,5%), catheter tips (15%), urine (7,5%) and blood (2,5%). All the isolates were initially identified as P. stuartii in the original laboratory by the automated system Microscan. The objectives of the present study were: 1. Confirm the phenotipical samples identification of the isolates using conventional methods; 2. Evaluate the antimicrobial susceptibility using the disc-diffusion method as proposed by the Clinical and Laboratorial Standards Institute; 3. Analyze the clonal composition of the isolates using RAPD-PCR with 272 primer and pulsed field electrophoresis gel (PFGE) techniques; and, 4. Determine the presence of CTX-M type ESBL gene. All the 63 isolates showed ESBL production. RAPD-PCR and PFGE typing revealed the presence of a major clone. The CTX-M type ESBL gene was found in all 36 isolates evaluated. In the present study, we showed that a unique ESBL producing P. stuartii clonal group was responsible for 95% of all infections caused from this specie in one hospital during 24 months. A sample of the same clonal group was found on the surface of a transesophageal echocardiography probe.

Key words: Providencia stuartii, ESBL, RAPD-PCR, CTX-M.

Rio de Janeiro April/2007

8

Índice página

1. Intodução

1.1. Histórico do gênero Providencia..............................................................................01

1.2. Aspectos gerais de Providencia stuartii...................................................................05

1.3. Resistência antimicrobiana.......................................................................................08

1.4. Produção de β-lactamases e resistência aos β-lactâmicos........................................10

1.5. Tipificação de cepas.................................................................................................14

1.6. Emergência de P. stuartii produtora de ESBL em um hospital do Rio de Janeiro..17

2. Objetivos.....................................................................................................................24

3. Material e métodos

3.1. Amostras bacterianas................................................................................................25

3.2. Caracterização fenotípica das amostras....................................................................26

3.2.1. Identificação fenotípica do gênero........................................................................26

3.2.1.1. Teste da desaminação oxidativa da fenilalanina.................................................26

3.2.1.2. Teste da produção de ácido sulfídrico (H2S) e da produção de indol em meio

SIM..................................................................................................................................27

3.2.1.3. Teste da descarboxilação da ornitina..................................................................28

3.2.1.4. Teste para detecção da atividade β-galactosidase (ONPG)................................28

3.2.1.5. Teste de susceptibilidade à polimixina B...........................................................29

3.2.2. Identificação fenotípica da espécie .......................................................................30

3.2.2.1. Teste para utilização do adonitol, ramnose e trealose........................................31

3.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos ........................................................31

3.4. Teste para a verificação da produção de ESBL: método de dupla difusão em

ágar..................................................................................................................................32

9

3.5. Tipificação molecular das cepas...............................................................................33

3.5.1. ERIC-PCR.............................................................................................................33

3.5.1.1. Extração do DNA bacteriano..............................................................................33

3.5.1.2 Amplificação do DNA.........................................................................................34

3.5.1.3 Eletroforese em gel de agarose............................................................................34

3.5.1.4 Interpretação dos resultados................................................................................35

3.5.2. Análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após

tratamento com enzima de restrição e separação por eletroforese em gel de campo

pulsado

(PFGE).............................................................................................................................35

3.5.2.1. Interpretação dos resultados...............................................................................37

3.6. PCR para a pesquisa de genes codificadores de β-lactamase do tipo CTX-

M......................................................................................................................................37

3.6.1.Extração do DNA bacteriano..................................................................................37

3.6.2.Amplificação do DNA............................................................................................38

3.6.3. Eletroforese em gel de agarose..............................................................................38

3.6.4. Interpretação dos resultados.................................................................................39

4. Resultados

4.1. Amostras bacterianas................................................................................................40

4.2. Caracterização fenotípica das amostras....................................................................40

4.2.1. Identificação fenotípica do gênero........................................................................41

4.2.2. Identificação fenotípica da espécie........................................................................42

4.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos.........................................................42


10

ágar..................................................................................................................................42

4.5. Tipificação molecular das amostras.........................................................................43

4.5.1 RAPD-PCR............................................................................................................43

4.5.2. Análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após tratamento com

enzima de restrição e separação através de eletroforese em gel de campo pulsado

(PFGE).............................................................................................................................44

4.6. PCR para a pesquisa de genes codificadores de β-lactamase do tipo CTX-M.........45

5. Discussão.....................................................................................................................54

6. Conclusões..................................................................................................................60

7. Referências bibliográficas.........................................................................................61

11

Lista de siglas e abreviaturas ATS: Ágar tripticaseína soja ATCC: American Type Culture Collection

°C: graus Celsius

CCIH: Comissão de controle de infecção hospitalar

CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute

DNA: ácido desoxirribonucléico

dNTP: desoxinucleotídeo 5’-trifosfato

ECGTE: eletrocardiografia transesofágica

ESBL: β-lactamase de espectro estendido

g: grama

HUCFF: Hospital Universitário Clementino Fraga Filho

IMPPG: Intituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes

Kb: Kilobases

LDG: Leite desnatado + glicerol

LEMIB: Laboratório de Epidemiologia Molecular de Infecções Bacterianas

mm: milímetro

mL: mililitro

μg: micrograma

μL: microlitro

μM: micromolar

ONPG: o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo

pb: pares de bases

PBS: Tampão salina fosfato (phosphate buffer saline)

12

PCR: reação da polimerase em cadeia

PFGE: eletroforese em gel de campo pulsado

pH: potencial hidrogeniônico

PsESBL: Providencia stuartii produtora de ESBL

RAPD: polimorfismo de DNA amplificado de forma aleatória (Random Amplified

Polymorfic DNA)

RVM: revascularização do miocárdio

SIM: ágar sulfeto-indol-motilidade

Taq: Thermus aquaticus

TSI: ágar tríplice açúcar-ferro

UCO: Unidade coronariana

UPGMA: unweighted pair group method using arithmetic averages

UTI: Unidade de tratamento intensivo

UTI-B: Unidade de tratamento intensivo-B

UV: ultravioleta

13

Lista de ilustrações página Tabela 1. Histórico do gênero Providencia.....................................................................21

Tabela 2. Capacidade de fermentação de carboidratos na diferenciação das espécies do

gênero Providencia..........................................................................................................23

Tabela 3. Classificação de β-lactames de bactérias Gram negativas...............................23

Tabela 4. Percentuais de susceptibilidade de 63 amostras de P. stuartii a doze

antimicrobianos...............................................................................................................46

Figura 1. Percentuais dos diferentes espécimes clínicos das 62 amostras clínicas de P.

stuartii incluídas no estudo..............................................................................................47

Figura 2. Distribuição do número de pacientes com isolamento de P. stuartii produtora

de ESBL ao longo do período de estudo.........................................................................47

Figura 3. Teste fenotípico positivo para a produção de ESBL com distância de 30 mm

centro a centro dos discos de antimicrobianos para a amostra 4A de P. stuartii.............48

Figura 4. Teste fenotípico positivo para a produção de ESBL com distância de 28 mm

centro a centro dos discos de antimicrobianos para a amostra 16A de P. stuartii...........49

Figura 5. Dendrograma realizado a partir dos perfis de bandas obtidos pela técnica de

RAPD-PCR para as 63 amostras de P. stuartii...............................................................50

Figura 6. Análise da composição clonal de cinco diferentes colônias de uma amostra

clínica de P. stuartii (14A)..............................................................................................52

Figura 7. Distribuição temporal dos diferentes genótipos de P. stuartii ........................52

Figura 8. Dendrograma realizado a partir dos perfis de bandas obtidos pela técnica de

PFGE para 16 amostras de P. stuartii .............................................................................53

Figura 9. PCR para a verificação da presença de genes codificadores de ESBLs dos

tipos CTX-M2, CTX-M8 e CTX-M16 em amostras de P. stuartii.................................53

14

1. Introdução

1.1 Histórico do gênero Providencia

A taxonomia do gênero Providencia tem sido caracterizada por uma grande

instabilidade. Atualmente, este gênero consiste de cinco espécies: Providencia

alcalifaciens, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia rustigianii e

Providencia heimbachae (Pignato et al, 1999). O gênero Providencia está incluído na

família Enterobacteriaceae e apresenta semelhanças fenotípicas com os gêneros Proteus

e Morganella, também incluídos nessa família. Apesar de tais semelhanças, os três

gêneros, Proteus, Providencia e Morganella não apresentam um grupamento

taxonômico específico. Alguns autores, como Winn e colaboradores (2006), agrupam

de maneira didática estes três gêneros em uma única tribo, Proteeae, a fim de facilitar o

entendimento das características destes microrganismos.

Recentemente, O’Hara, Brenner & Miller (2000) revisaram a taxonomia da tribo

Proteeae. Segundo estes estudiosos, o primeiro relato de um microrganismo relacionado

ao gênero Providencia foi realizado em 1904 por Rettger e colaboradores (Apud

O’Hara, Brenner & Miller 2000), que isolaram um novo agente durante uma epidemia

de cólera em galinhas, para o qual nenhuma nomenclatura foi proposta. Quatorze anos

mais tarde, Hadley e colaboradores (Apud O’Hara, Brenner & Miller 2000) estudaram

estes microrganismos detalhadamente e o denominaram Bacterium rettgeri. Ao longo

dos anos, vários estudos foram sendo realizados sobre microrganismos relacionados ao

gênero Providencia. Um breve histórico da classificação deste gênero conforme

apresentado na revisão de O’Hara, Brenner & Miller (2000) está descrito a seguir e

pode ser encontrado na tabela 1.

15

Em 1920, um grupo de amostras provenientes de intestino humano foi estudado

por Ornstein (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) que as caracterizou como Bacillus

inconstans. Essas amostras seriam posteriormente denominadas como a primeira

descrição de microrganismos do gênero Providencia. Rustigian & Stuart, em 1941,

(Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) designaram como Paracoli anaerogênico

33111 um microrganismo que acabavam de isolar e que apresentava como principal

característica a rápida hidrólise da uréia. Um ano depois, Cope & Kilander (Apud

O’Hara, Brenner & Miller, 2000) publicaram um estudo que incluía 83 microrganismos

atípicos semelhantes bioquimicamente à Shigella paradysenteriae, mas que se

diferenciavam antigenicamente de todas as espécies de Shigella até então conhecidas.

Em 1943, Stuart e Cope (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) concluíram que as

amostras inicialmente identificadas como Paracoli anaerogênico 33111 e Shigella

paradysenteriae se referiam a um mesmo microrganismo. Os autores propuseram que

estes microrganismos fossem incluídos no gênero Proteus, já que eram positivos para os

testes da produção de indol e da hidrólise da uréia. Posteriormente, Stuart e

colaboradores (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) redescreveram estes

microrganismos como Proteus rettgeri. A inclusão de Proteus rettgeri no gênero

Proteus aconteceu mesmo sendo esta nova espécie positiva para a fermentação do D-

adonitol, o que não acontecia para as outras espécies até então existentes neste gênero.

Ainda em 1943, Stuart e colaboradores (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000)

identificaram um novo grupo de microrganismos similar ao Paracoli anaerogênico

33111 descrito em 1941, classificando-o como Paracoli anaerogênico tipo 29911, mas

apesar da similaridade, estes autores não classificaram estes microrganismos como

pertencentes ao gênero Proteus por não responderem a reações com anti-soro específico

16

para este gênero. Em 1944, Gomes (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) descreveu o

microrganismo Eberthella alcalifaciens, que mais tarde se tornaria a amostra tipo do

gênero Providencia.

Em 1951, Kauffmann (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000), estudando os

microrganismos anaerogênicos 29911 de Stuart, os classificou como um novo grupo,

denominado de “grupo Providencia”, que recebeu esta designação devido à cidade de

Providencia onde ele realizou seus estudos. O “grupo Providencia” foi criado para

incluir aqueles microrganismos, que diferentemente daqueles pertencentes ao gênero

Proteus, não eram capazes de decompor a uréia.

Em 1954, Singer e Bar-Chay (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) sugeriram

que o “grupo Providencia” de Stuart fosse incluído no gênero Proteus como Proteus

stuartii, mesmo apresentando teste negativo para a decomposição da uréia. Essa

proposta foi feita devido à similaridade bioquímica entre os microrganismos

anaerogênicos 29911 de Stuart e Proteus rettgeri. Paralelamente, em 1954, Ewing e

colaboradores (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) subdividiram o “grupo

Providencia” em dois subgrupos (A e B) bioquimicamente distintos. Também foi

proposto que o “grupo Providencia” se tratava de um conjunto intemediário de

microrganismos entre as espécies de Proteus morganii e Proteus rettgeri. A única

diferença seria o fato do “grupo Providencia” não realizar a hidrólise da uréia. Porém,

durante 1955, Shaw e Clarke, (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000), utilizando testes

bioquímicos adicionais, reforçaram a correlação entre o “grupo Providencia” e os

microrganismos pertencentes ao gênero Proteus, e sugeriram que o “grupo Providencia”

fosse novamente incluído neste gênero. Eles também afirmaram que a primeira

descrição de um microrganismo relacionado ao “grupo Providencia” foi aquela feita por

17

Ornstein em 1920 (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) onde foram descritos

Bacillus inconstans. Shaw e Clarke (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000), então,

definiram como a amostra tipo do “grupo Providencia” os microrganismos designados

como Proteus inconstans . Contudo, na mesma revista dessa publicação, Proom (1955)

(Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) inovou e propôs a criação de um novo gênero,

Providencia, para incluir amostras do “grupo Providencia” e de Proteus rettgeri.

Entretanto, o novo gênero Providencia só foi aceito quando Ewing, em 1958 e 1962,

(Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) revisou a taxonomia da tribo Proteeae e

concluiu que realmente o “grupo Providencia” não poderia ser incorporado ao gênero

Proteus. Apesar da criação deste novo gênero, as amostras de Proteus rettgeri

continuaram sendo incluídas no gênero Proteus e denominadas desta mesma maneira.

Em 1962, uma amostra original de Eberthela alcalifaciens caracterizada por Gomes em

1944 foi estudada por Ewing. Ele demonstrou uma grande similaridade entre essas

amostras e aquelas classificadas no novo gênero Providencia. Como essas amostras se

apresentavam como sendo o primeiro relato de isolamento de microrganismos do

gênero Providencia elas foram classificadas como amostras tipo de Providencia

alcalifaciens. Assim, o antigo subgrupo A de “Providencia” ficou conhecido como

Providencia alcalifaciens e o antigo subgrupo B como Providencia stuartii. Em 1972,

Ewing, Davis e Sikes, subdividiram essas duas espécies em biogrupos, quatro para P.

alcalifaciens e dois para P. stuartii de acordo com algumas características fenotípicas

particulares. A definição deste novo gênero e a identificação dessas novas espécies

permitiu que a taxonomia de outros microrganismos previamente classificados fosse

revisada. Em 1977, por exemplo, Farmer e colaboradores propuseram que o biogrupo 5

de Proteus rettgerii, descrito por Penner e colaboradores (1977), fosse reclassificado

18

como Providencia stuartii urease positiva. Finalmente, num estudo baseado na

hibridização de DNA, publicado por Brenner e colaboradores em 1978, Proteus rettgeri

foi definitivamente classificado como Providencia rettgeri, e o seu biogrupo 5

confirmado como Providencia stuartii. Esta mesma técnica permitiu, em 1983, a

reclassificação do biogrupo 3 de Providencia alcalifaciens em Providencia rustigianii.

Essas quatro espécies de Providencia descritas até então poderiam ser diferenciadas de

acordo com sua habilidade em hidrolisar a uréia e produzir ácido a partir da utilização

de i-inositol, adonitol, D-arabitol, trealose e D-galactose.

Mais tarde, ainda em 1983, Müller propôs uma nova espécie pertencente ao

gênero Providencia, P. friedericiana. Três anos depois, constataram que P.

friedericiana era idêntica a P. rustigianii, cujo nome permanece até hoje. Em 1986,

Muller e colaboradores propuseram novamente uma nova espécie, Providencia

heimbachae, obtida de fezes de pingüins. Esta sim, se tratava de uma nova espécie, que

ficou assim denominada em homenagem a Friederike Heimbach, que caracterizou as

doze amostras originais. Desta maneira, o gênero Providencia ficou definido e suas

espécies caracterizadas.

1.2 Aspectos gerais de Providencia stuartii

As amostras pertencentes à espécie P. stuartii apresentam-se como bastonetes

Gram-negativos e anaeróbios facultativos, que normalmente revelam motilidade a 20-

25°C devido à presença de flagelo peritríqueo. A expressão do flagelo em amostras de

P. stuartii, bem como nas outras espécies do gênero, pode ser inibida quando salicilato

de sódio estiver presente no meio de cultura (Kunin, Hua Hua & Bakaletz, 1995). Este

composto tem a capacidade de impedir a formação da flagelina, principal proteína

19

envolvida na composição do flagelo. Além disso, a motilidade destes microrganismos é

menos evidente a 37°C. Amostras de P. stuartii podem ser facilmente reconhecidas pela

formação de colônias amarelas ou alaranjadas em ágar citrato desoxicolato, devido à

precipitação do hidróxido férrico presente neste meio, que ocorre em conseqüência do

pH alcalino gerado durante seu crescimento (Senior, 2005)

Assim como toda a tribo Proteeae, P. stuartii possui a enzima

responsável pela desaminação oxidativa da fenilalanina, e a enzima triptofanase que

atua no metabolismo do triptofano produzindo indol. A capacidade de desaminação de

aminas aromáticas faz com que esta espécie esteja envolvida no desencadeamento da

síndrome da bolsa urinária púrpura em pacientes cateterizados. (Dealler, Hawkey &

Millar, 1988). Esta síndrome é uma condição incomum onde a bolsa de coleta urinária

em pacientes cateterizados torna-se púrpura devido a presença de microrganismos

capazes de produzir os corantes índigo e indirrubina à partir do polietileno que compõe

o coletor.

Diferentemente dos outros membros da tribo, P. stuartii não requer a presença

de niacina ou ácido pantotênico no meio de cultivo para o seu crescimento. P. stuartii

não fermenta a lactose, pois não apresenta as enzimas permease e β-galactosidase,

necessárias para essa via metabólica. Este microrganismo se apresenta apto para a

utilização do citrato de sódio como fonte exclusiva de carbono. Outras características de

P. stuartii são: capacidade de crescimento na presença de cianeto de potássio, produção

de ácido, mas não de gás, na fermentação da glicose, e fermentação de i-inositol e

trealose. Os testes para a fermentação destes açúcares são utilizados para a

diferenciação entre as espécies existentes no gênero (Dealler, Hawkey & Millar, 1988),

20

conforme apresentado na tabela 2. Amostras de P. stuartii não são capazes de

descarboxilar a ornitina ou a lisina (Senior, 2005).

P. stuartii pode ser isolada a partir de espécimes obtidos de garganta,

períneo, axila, fezes, sangue, feridas e principalmente de urina de seres humanos.

Apesar de ser um raro uropatógeno de infecções adquiridas na comunidade, tem

participação importante nas infecções do trato urinário adquiridas no ambiente

hospitalar. (Akbas et al, 1998).

Em um estudo realizado por Akbas e colaboradores em 1998, 428 amostras de

urina de pacientes cateterizados foram avaliadas. Foi relatado que espécies de

Providencia foram o quinto agente em frequência causador de infecções urinárias.

Dentre estas infecções, 80% eram causadas por P. stuartii e apenas 20% por P. rettgeri.

A cateterização prolongada de pacientes promove um aumento na incidência de

infecções do trato urinário cujo prognóstico pode evoluir para bacteremia e morte. A

uropatogenicidade de P. stuartii, pode ser comprovada pelo fato delas apresentarem

fímbrias que se ligam fortemente às células uroepiteliais e ao cateter e por normalmente

se apresentarem resistentes à maioria dos antimicrobianos utilizados na terapêutica

clínica (Warren, 1986).

Outra particularidade das amostras de P. stuartii é sua difícil identificação,

principalmente quando são utilizados “kits” comerciais. Essa dificuldade se dá porque

genes para a fermentação da sacarose ou da lactose, ou ainda genes para a hidrólise da

uréia estão frequentemente localizados em plasmídeos que podem ser perdidos (Senior,

2005). Por exemplo, em 1988, Cornaglia e colaboradores avaliaram a habilidade de

diferentes sistemas de identificação utilizados na Europa em identificar corretamente

espécies de Providencia. Neste estudo, os autores investigaram 145 amostras,

21

comparando a classificação obtida através da utilização de dois sistemas miniaturizados

e três sistemas automatizados com aquela obtida através de testes bioquímicos

convencionais. Quatro dos cinco sistemas avaliados falharam na correta identificação de

P. stuartii em 10,0 a 16,3% das amostras.

A eficácia do sistema automatizado Microscan® foi avaliada por O’Hara e

Miller (2000). Os autores estudaram 475 amostras de bactérias pertencentes à família

Enterobacteriaceae, incluindo 14 amostras de P. stuartii. Duas (14%) dentre as

amostras de P. stuartii não puderam ser identificadas corretamente sem o auxílio de

testes bioquímicos adicionais.

O gênero Providencia contêm antígenos O termoestáveis e antígenos H

termolábeis, comuns às enterobactérias. Em 1979, Penner e colaboradores definiram o

antígeno O 17 como o típico de P. stuartii. Não é de nosso conhecimento a publicação

de outros estudos que descrevam a composição antigênica deste microrganismo.

1.3 Resistência antimicrobiana

A emergência de multirresistência dentre os microrganismos Gram-negativos

patógenos humanos tem se mostrado como um grave problema mundial (Goldmann &

Huskins, 1997). O surgimento da resistência aos antimicrobianos, detectada logo após a

introdução desses agentes na terapêutica clínica, está não somente relacionado a fatores

intrínsecos aos microrganismos, mas também à pressão seletiva exercida pelo uso

intenso e indiscriminado destes agentes (Friedrich, White & Bosso, 1999).

A intensa utilização dos antimicrobianos que é verificada atualmente pode ser

explicada por vários fatores. Dentre eles está o emprego empírico de drogas de amplo

espectro de ação para o tratamento de um número cada vez mais elevado de pacientes

22

gravemente doentes e imunocomprometidos admitidos nos hospitais. Como esses

pacientes são susceptíveis a infecções por uma variedade de patógenos, desenvolveu-se

o hábito da prescrição de antimicrobianos de amplo espectro de ação para o tratamento

empírico de infecções presuntivas (Friedrich, White & Bosso, 1999).

A resistência bacteriana pode ser classificada em dois tipos. Num primeiro grupo

estão incluídos os microrganismos que são originalmente susceptíveis aos

antimicrobianos, mas que após prolongada exposição a eles se tornam resistentes pela

presença de mutação cromossômica ou pela aquisição de plasmídeos ou transposons que

carreiam marcadores de resistência. Num segundo grupo estão incluídos os

microrganismos que apresentam resistência intrínseca a uma variedade de agentes

antimicrobianos (Nikaido, 1994).

Amostras de P. stuartii são intrinsecamente resistentes à ampicilina,

amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulânico e cefalosporinas de primeira geração

devido a produção de β-lactamase do tipo AmpC, conforme será discutido no item 1.4.

Estes microrganismos também são intrinsecamente resistentes aos aminoglicosídeos,

com exceção da amicacina, e resistentes à nitrofurantoína, polimixina B e colistina

(Rossi & Andreazzi, 2005).

A resistência natural aos aminoglicosídeos como a gentamicina é conseqüência

da presença de um gene cromossômico que codifica a enzima 2’-N-acetiltransferase

capaz de modificar alguns membros dessa classe de antibióticos. A amicacina não é

afetada por esta enzima e a maioria das cepas se mostra sensível a esta droga (Rather et

al, 1993; Paradise et al, 1998). A resistência à nitrofurantoína é devido à redução ou à

deficiência da atividade da enzima nitrofurantoína redutase-1. Esta enzima é

responsável pela redução dos grupamentos nitritos presentes nas aminas ou seus

23

derivados. As aminas reduzidas interagem com o DNA bacteriano causando a morte

celular (Lorian, 1991). Já as resistências à polimixina B e à colistina não estão bem

esclarecidas, mas sabe-se que estão relacionadas com o conteúdo fosfolipídico da

membrana plasmática destes microrganismos (Lorian, 1991). A resistência encontrada a

outros antimicrobianos ocorre principalmente pela transferência de genes de resistência

através de elementos genéticos móveis, tais como plasmídeos, transposons e integrons.

1.4. Produção de β-lactamases e resistência aos β-lactâmicos

A presença de enzimas capazes de hidrolisar os antibióticos pertencentes à classe

dos β-lactâmicos tem contribuído para o aumento da resistência entre as amostras

bacterianas. Desde o início dos anos 60 quando foram inicialmente descritas, as

amostras de enterobactérias produtoras de β-lactamases têm aumentado em frequência e

se disseminado por todo o mundo, principalmente dentro do ambiente hospitalar

(Medeiros, 1984). Isso fez com que o controle da resistência aos antimicrobianos se

tornasse uma prioridade nos centros de saúde e hospitais. Como parte desse esforço,

vários programas têm sido organizados, tanto em nível nacional como mundiais, para

acompanhar os níveis de resistência aos antimicrobianos.

A primeira β-lactamase foi descrita antes do início do uso terapêutico das

penicilinas, em 1940 (Abraham & Chain,1940, republicado em 1988; Bradford, 2001).

Porém, somente entre os anos 60 e 70, quando penicilinas semi-sintéticas de amplo

espectro de ação e as cefalosporinas de primeira geração começaram a ser usadas na

terapêutica clínica, principalmente contra as bactérias Gram-negativas, que a produção

destas enzimas e suas conseqüências se tornaram mais evidentes (Medeiros, 1997). Foi

neste momento que a disseminação de microrganismos produtores de β-lactamases

24

emergiu como um problema na prática médica. A disseminação das β-lactamases foi

possível porque os genes codificadores para esta enzima podem estar presentes em

plasmídeos e transposons. Nas bactérias Gram-negativas, as β-lactamases mais

comumente encontradas são aquelas classificadas como do tipo TEM e tipo SHV,

isoladas inicialmente a partir de amostras de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae,

respectivamente (Medeiros, 1984). O esquema de classificação das β-lactamases

correlaciona propriedades bioquímicas, a estrutura molecular e a seqüência de

nucleotídeos dos genes codificadores destas enzimas (Ambler 1980; Bush, Jacoby &

Medeiros,1995; Jacoby & Munoz-Price 2005). Na tabela 3 estão apresentadas algumas

β-lactamases descritas em bactérias Gram-negativas.

Sob a pressão seletiva exercida pelo uso indiscriminado das cefalosporinas nas

décadas de 1980 e 1990 surgiram as β-lactamases de espectro ampliado (ESBLs). Estas

β-lactamases podem ser variações dos tipos iniciais TEM ou SHV e apresentam

atividade melhorada contra β-lactâmicos de espectro estendido (Philippon, Arlet &

Lagrange, 1994; Chanal et al., 1994; Knox, 1995; Petit et al., 1995; Sirot, 1995; Chanal

et al., 1996; Huang et al., 1996; Vakulenko et al., 1999). Dentre as ESBLs descritas, a

do tipo CTX-M tem sido a mais amplamente encontrada entre as bactérias Gram-

negativas (Eisner et al, 2006). Os estudos dos genes que codificam as ESBL têm

revelado que a substituição de um a quatro resíduos de aminoácidos diferentes nas β-

lactamases originais são responsáveis pelo fenótipo resultante (Henquell et al., 1995;

Saves et al., 1995; Stapleton et al., 1995; Bret et al., 1997). Desse modo, a partir de uma

β-lactamase do tipo TEM-1 ou SHV-1 podem surgir mutantes apresentando resistência

à inibição de um composto de maior espectro de ação, que podem ser prontamente

selecionados na presença de cefalosporinas de espectro estendido. As ESBLs são

25

capazes de hidrolisar uma variedade de β-lactâmicos, incluindo as cefalosporinas de

terceira e quarta gerações e os monobactâmicos, mas não são ativas contra as

cefamicinas (como por exemplo, a cefoxitina e o cefotetan) e os carbapenemas (Bush,

Jacoby & Medeiros, 1995; Livermore, 1995). A ação hidrolítica dessas enzimas é

bloqueada pelos inibidores de β-lactamase como o ácido clavulânico, sulbactam e

tazobactam (Menezes & Silva, 2000), com exceção de algumas enzimas de espectro

estendido derivadas de OXA que exibem susceptibilidade moderada aos inibidores de β-

lactamase (Tzouvelekis et al., 2000).

A detecção da produção de ESBL por uma amostra bacteriana em laboratórios

clínicos é realizada por meio de métodos fenotípicos de triagem e confirmatórios.

Atualmente, os especialistas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI,

2005) recomendam a realização de testes de triagem para detecção de amostras de E.

coli, K. pneumoniae, K. oxytoca e amostras de Proteus mirabilis com relevância clínica

suspeitas de produção de ESBL e o teste de disco adição para sua confirmação.

Outra metodologia aceita para a detecção dessas enzimas foi proposta por Jarlier

e colaboradores, em 1988. Essa técnica, conhecida por dupla difusão, é mais facilmente

realizada pelos laboratórios clínicos e requer apenas a precisão na distância entre os

discos de antimicrobianos a serem testados. No entanto a produção simultânea de β-

lactamase do tipo Amp C pode dificultar a detecção de ESBL através destas técnicas.

(Thomson, 2001). O teste para detecção da produção de ESBL baseado no efeito

sinérgico entre um inibidor de β-lactamase e um β-lactâmico é mais confiável para

amostras que não co-produzem β-lactamases resistentes ao inibidor, tais como a AmpC.

Para espécies que produzem β-lactamase do tipo AmpC induzível codificada no

cromossomo, como as espécies de Providencia, a utilização de clavulanato no teste de

26

detecção pode induzir a produção de AmpC em alto nível, produzindo um resultado

falso-negativo. A utilização de tazobactam ou sulbactam como agentes inibidores pode

minimizar a interferência da indução da β-lactamase do tipo AmpC no teste de detecção

de ESBL, pois estes antimicrobianos são indutores menos potentes da AmpC. Outra

opção é a adição de um disco de cefepima no teste, pois a produção de AmpC tem um

efeito mínimo na atividade deste antimicrobiano.

Apesar dos especialistas do CLSI (2005) não recomendarem a realização de teste

fenotípico para a triagem da produção de ESBL em amostras do gênero Providencia,

enzimas deste tipo têm sido frequentemente encontradas em amostras de P. stuartii.

Em 1998, Franceschini e colaboradores purificaram e caracterizaram uma ESBL

codificada por plasmídeo de amostras clínicas de P. stuartii. Estas amostras, obtidas da

urina de pacientes hospitalizados em um hospital de Milão na Itália, continham a β-

lactamase do tipo TEM-60 que lhes conferia resistência aos β-lactâmicos de amplo

espectro incluindo os monobactâmicos.

A presença de ESBL em amostras de P. stuartii obtidas a partir de variados

espécimes clínicos como sangue, urina, escarro, ferida e outros também foi avaliada por

Tumbarello e colaboradores em 2004. O período de estudo incluiu os anos de 1999 a

2002 e 223 amostras de P. stuartii foram obtidas de pacientes internados no Hospital

Universitário da cidade de Roma, Itália. Das 223 amostras, 116 (52%) foram produtoras

de ESBL. As β-lactamases do tipo TEM-52 e TEM-72 foram encontradas

exclusivamente dentre as amostras hospitalares e foram caracterizadas através de

técnicas moleculares. Todas as amostras produtoras de ESBL apresentaram perfil de

resistência semelhante, que incluía os β-lactâmicos (amoxicilina + ácido clavulânico e

cefalotina) e as quinolonas como o ciprofloxacino.

27

Em um estudo mais recente, Aubert e colaboradores (2005) isolaram P. stuartii

produtora de β-lactamase a partir de swab retal e nasal de um paciente admitido em um

hospital de Argélia. Nessas amostras foram encontrados genes codificadores das β-

lactamases dos tipos TEM-2, SHV-2 e VEB-1, todos presentes em um mesmo

plasmídeo conjugativo. O perfil de susceptibilidade incluiu resistência à maioria dos β-

lactâmicos testados e susceptibilidade apenas ao ciprofloxacino, ácido nalidíxico e

rifampicina.

1.5. Tipificação das cepas

A tipificação de cepas bacterianas pode ser de grande auxílio na investigação

epidemiológica das infecções nosocomiais (Tenover et al., 1997). Os sistemas de

tipificação são usados para estudar as variações na composição das populações de

microrganismos e a disseminação de certas linhagens na natureza ou em determinados

grupos de seres humanos. Os objetivos específicos do emprego de técnicas de

tipificação incluem o estudo da genética da população bacteriana, o estudo da

patogênese das infecções, a vigilância epidemiológica das doenças infecciosas e a

investigação de surtos (Struelens et al., 1996; Belkum et al., 2001).

Surtos de doenças infecciosas freqüentemente resultam da exposição a um

agente etiológico por meio de uma fonte comum (Olive & Bean, 1999). Podem ser

definidos como surtos, um aumento temporal na incidência de morbidades infecciosas

numa determinada população ou um aumento temporal na freqüência da colonização

por um dado microrganismo (Struelens et al., 1996). O agente etiológico responsável

por um surto pode ser derivado de uma única célula, cuja progênie é geneticamente

idêntica ou intimamente relacionada ao microrganismo fonte. Em termos

28

epidemiológicos, os microrganismos envolvidos neste tipo de surto apresentam uma

relação clonal, ou seja, eles têm uma origem comum (Olive & Bean, 1999).

Os microrganismos que preservam uma relação clonal são membros de uma

mesma espécie que compartilham fatores de virulência, traços bioquímicos e

características genômicas (Olive & Bean, 1999). Esses microrganismos são

indistinguíveis por uma variedade de testes genéticos (Tenover et al., 1995). Por outro

lado, os microrganismos que pertencem a uma mesma espécie, isolados de diferentes

fontes e regiões geográficas, apresentam diversidade suficiente que permite a sua

diferenciação em cepas (Olive & Bean, 1999).

Os sistemas de tipificação são aplicados primariamente para auxiliar estudos

epidemiológicos, permitindo também a formulação de hipóteses sobre: a extensão da

disseminação epidêmica de clone(s) microbiano(s) em uma população exposta; o

número de clones envolvidos na transmissão e infecção; a identificação de fonte(s) de

contaminação e os veículos de transmissão; a identificação e o monitoramento de

reservatórios de clone(s) epidêmico(s) na população ou no ambiente; e a avaliação da

eficácia de medidas de controle visando conter ou interromper a disseminação de

clone(s) epidêmico(s) (Struelens et al., 1996).

Os métodos de tipificação se dividem em duas amplas categorias: métodos

fenotípicos e métodos genotípicos. Os métodos fenotípicos de tipificação são aqueles

que caracterizam os produtos da expressão de genes com o objetivo de diferenciar

cepas. Porém a expressão destes genes pode sofrer variações baseadas em mudanças nas

condições e fases de crescimento, e ocorrência de mutações simultâneas (Tenover et al.,

1997). A tipificação molecular baseada em características genéticas de microrganismos

pode fornecer informações mais precisas sobre a diversidade dos microrganismos em

29

estudo, embora possa ser afetada por inserções ou deleções de DNA no cromossomo,

ganho ou perda de DNA extracromossômico, ou ainda, mutações randômicas que

podem criar ou eliminar sítios de restrição de endonucleases (Tenover et al., 1997;

Wang et al., 1999). Os sistemas de tipificação molecular podem ser caracterizados em

termos de tipabilidade, reprodutibilidade, poder discriminatório, facilidade de realização

e interpretação. A escolha entre os vários métodos depende de fatores tais como os

objetivos do estudo, o poder discriminatório necessário, os tipos de preparações de

DNA, as condições laboratoriais disponíveis e a habilidade técnica das pessoas do

laboratório (Arbeit, 1995; Tenover et al., 1997).

A interpretação dos dados é um aspecto extremamente importante das técnicas

genotípicas. A presença ou ausência, posição e intensidade de bandas, são dados

relevantes nas análises de comparação (Boer et al., 2000). Tenover e colaboradores

(1995) idealizaram um critério para auxiliar na seleção e interpretação de métodos de

tipificação molecular para estudos epidemiológicos. Embora um método de tipificação

particular possa ter um alto poder discriminatório e boa reprodutibilidade, a

complexidade do método, interpretação dos resultados, bem como os custos envolvidos,

podem estar além das possibilidades do laboratório. Por essa razão, a escolha de um

método de tipificação molecular dependerá das necessidades, do nível de destreza e dos

recursos do laboratório (Olive & Bean, 1999).

Algumas dessas metodologias serão utilizadas no presente estudo para a

avaliação de um surto de infecções por P. stuartii produtora de ESBL que ocorreu em

um hospital da cidade de Niterói, RJ, descrito a seguir.

30

1.6. Emergência de P. stuartii produtora de ESBL em um hospital do Rio de

Janeiro

O hospital envolvido no surto é privado, terciário, de 176 leitos, sendo 68

apartamentos, 48 leitos de enfermaria, 32 de unidade de tratamento intensivo (UTI) de

adultos, 13 de unidade coronariana (UCO), 13 de UTI neonatal e dois pediátricos.

Em janeiro de 2004, a comissão de controle de infecção hospitalar (CCIH) deste

hospital identificou pela primeira vez a ocorrência de infecções por P. stuartii

multirresstente em pacientes inicialmente internados na UTI de adultos B (UTI-B) e na

UCO. Num período de 12 meses (janeiro a dezembro de 2004), 38 pacientes

apresentaram pelo menos uma cultura positiva para P. stuartii. Por tratar-se de um

patógeno incomum dentre os recuperados em espécimes clínicos naquele hospital até o

ano de 2003, foi formulada a hipótese de tratar-se de um surto por este microrganismo.

Outro dado relevante para o levantamento desta hipótese foi o fato das amostras

apresentarem perfil de sensibilidade semelhante com resistência às cefalosporinas de 3ª

e 4ª geração, sendo possivelmente produtoras de ESBL.

A primeira amostra de P. stuartii produtora de ESBL (PsESBL) recuperada em

cultura neste hospital foi isolada de uma paciente transferida de outra instituição em

06/01/04, onde havia permanecido internada por aproximadamente um mês em uma

UTI, tendo recebido antibioticoterapia com carbapenem e glicopetídeo. Em 08/01/04,

foi colhida secreção obtida em aspirado traqueal para investigação de pneumonia, onde

foi recuperada PsESBL. Esta paciente encontrava-se internada na UTI-B deste hospital.

Nos dias 24 e 25/01/05 ocorreram dois novos isolamentos de PsESBL em trato

respiratório inferior, em pacientes internados na UCO, e que haviam sido submetidos a

cirurgia cardíaca. Estes dois pacientes realizaram ecocardiograma transesofágico

31

durante as cirurgias realizadas em 15/01/04 e 21/01/04. Ambos desenvolveram

pneumonia no pós-operatório sendo uma por PsESBL e Pseudomonas aeruginosa e a

outra por PsESBL e K. pneumoniae.

A partir do mês de janeiro de 2004, outros casos de infecção por PsESBL

ocorreram tanto na UCO quanto nas demais UTIs, situadas em outros andares. As

cirurgias cardíacas realizadas durante o período de janeiro a dezembro de 2004 foram

acompanhadas pelo Serviço de Controle de Infecção Hospitalar. Neste período, foram

realizados 91 procedimentos cirúrgicos sendo 66 (72,5%) para revascularização do

miocárdio (RVM), 12 (13%) cirurgias para troca ou implantação de válvula cardíaca, 10

(11%) combinadas (válvula e RVM) e 3 (3,5%) outros procedimentos. Sete pacientes

evoluíram para óbito (7,6%) e quinze desenvolveram pneumonia no pós-operatório

(16,4%). Ficou comprovado que ocorreu um aumento importante no número de

pneumonias em 2004 (16,4%) quando comparado a 2003 (9%). Os membros da CCHI

do hospital decidiram então realizar uma investigação mais detalhada do problema.

Durante o ano de 2004, o tempo transcorrido entre a cirurgia e o diagnóstico de

pneumonia variou de 2 a 10 dias (média 3,9 dias). Do total de 15 pacientes que

desenvolveram pneumonia no pós-operatório de cirurgia cardíaca, nove tiveram

PsESBL recuperada do trato respiratório inferior (lavado broncoalveolar ou aspirado

traqueal). Em sete pacientes foi isolado um segundo microrganismo a partir do

espécime clínico em questão.

Como parte da investigação da ocorrência de pneumonias no pós–operatório de

cirurgia cardíaca causadas por PsESBL, em 29 de dezembro de 2004, foi realizado

rastreamento para avaliar a contaminação microbiológica dos seguintes equipamentos:

circuito de anestesia da sala do centro cirúrgico, lâminas de laringoscópio do centro

32

cirúrgico, válvula e circuito do respirador de transporte da UTI e sonda do equipamento

para ecocardiografia transesofágica (ECGTE), antes e imediatamente após limpeza com

clorexidina degermante e enxágüe em água potável não estéril. A coleta dos espécimes

foi efetuada pela microbiologista responsável pelo laboratório clínico que presta serviço

ao hospital. Uma amostra de PsESBL foi recuperada a partir da sonda do ECGTE. Em

5/01/05 também foi realizada coleta da água da torneira e superfície da pia onde é

realizada a limpeza das sondas do ECGTE para análise microbiológica. Nestas amostras

não foi encontrado crescimento de PsESBL.

Após a identificação da contaminação da sonda do equipamento ECGTE, a

CCIH orientou sobre os procedimentos para a correta desinfecção do equipamento

como por exemplo sua imersão em solução de glutaraldeído (Rutala & Weber, 1999),

seguido de enxágüe final com água destilada estéril. Até então, o aparelho era apenas

lavado com água e sabão degermante (clorexidina), não sofrendo qualquer tipo de

desinfecção.

Desde dezembro de 2004 até dezembro de 2005, não foi mais notificada

pneumonia por PsESBL nos pacientes em pós-operatório de cirurgia cardíaca. Também

não ocorreram mais infecções por este microrganismo na UCO. Entretanto, na UTI-B

amostras de PsESBL continuaram a ser isoladas em pacientes com internação

prolongada, tendo este microrganismo se estabelecido de forma endêmica nesta

unidade.

As amostras de PsESBL obtidas no hospital em estudo foram identificadas no

laboratório de origem apenas através da utilização do sistema automatizado

Microscan®, sem confirmação por métodos bioquímicos de referência (Winn et al,

2006; Mac Faddin, 1976). Além disso, para avaliar a relação clonal entre as amostras de

33

origem clínica e a amostra obtida da sonda do equipamento ECGTE é necessária a

aplicação de técnicas moleculares. A investigação destes aspectos é importante para

enriquecer a descrição de um patógeno que recentemente emergiu no ambiente

hospitalar, contribuindo para os avanços no campo de epidemiologia hospitalar e

controle de infecção (Reingold, 1998).

34

Tabela 1. Histórico do gênero Providencia

Data Autor Evento Observações

1918 Hadley e cols Bacterium rettgeri Primeiro relato de um microrganismo relacionado com

o futuro gênero Providencia

1920 Ornstein Bacillus inconstans Posteriormente denominado como a 1ª descrição de

microrganismo do gênero Providencia

1941 Rustigian & Stuart Paracoli anaerogênico 33111 Novo microrganismo descrito com principal

característica a rápida hidrólise da uréia

1942 Cope & Kilander Shigella paradysenteriae atípica Novo microrganismo provavelmente relacionado ao

Paracoli anaerogênico 33111

1943 Stuart & Cope Paracoli anaerogênico 33111 e Shigella paradysenteriae atípica incluídas no gênero Proteus como um único

microrganismo: P. rettgeri

1943 Stuart e cols Paracoli anerogênico 29911 (não inserido no gênero Proteus)

Semelhante ao Paracoli anaerogênico 33111 mas não

respondiam a reações com anti-soro específico para o

gênero Proteus

1944 Gomes Eberthella alcalifaciens Mais tarde considerada a amostra tipo do gênero

Providencia

1951 Kauffmann Paracoli anaerogênico 29911 de Stuart inserido no Grupo

Providencia

Grupo Providencia criado para incluir microrganismos

relacionados ao gênero Proteus mas que não

decompunham a uréia

1954 Ewing e cols Subdivisão do Grupo Providencia Baseada em perfis bioquímicos distintos

35

Tabela 1. Histórico do gênero Providencia (continuação)

Data Autor Evento Observações

1954 Singer & Bar-Chay Inserção do Grupo Providencia novamente no gênero Proteus

1955 Proom Proposta do gênero Providencia para incluir o Grupo Providencia e Proteus rettgeri

1962 Ewing e cols Aceitação do gênero Providencia

Estes estudiosos através de estudos taxonômicos

concluíram que era necessária a criação de um novo

gênero: Providencia

1962 Ewing e cols Eberthela alcalifaciens redescrita como Providencia alcalifaciens

1978 Brenner e cols Proteus rettgeri renomeado como Providencia rettgeri e seu subgrupo 5 como Providencia stuartii

1983 Hickman-Brenner e cols Descreveram o bigrupo 3 de Providencia alcalifaciens como Providencia rustigianii

1986 Müller e cols Providencia heimbachae Obtida de fezes de pinguins e caracterizadas

originalmente por Friederike Heimbach

Fonte: adaptado de O’Hara, Brenner & Miller, 2000

36

Tabela 2. Capacidade de fermentação de carboidratos na diferenciação das espécies do gênero Providencia

Espécies do gênero Providencia Carboidrato

P. alcalifaciens P. rustigianii P. heimbachae P. stuartii P. rettgeri

Inositol

Adonitol

Arabitol

Trealose

Galactose

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

V(46)

+

+

-

+

+

-

-

+

+

+

+

+

-

+

+: 90% ou mais amostras são positivas; -: 90% ou mais amostras são negativas; V(46): amostras com prefil variável sendo cerca de 46 % positivas .

Fonte: adaptado de Winn et al, 2006 Tabela 3. Classificação de β-lactames de bactérias Gram-negativas.

Tipo de enzima

Classe molecular

Inibição pelo clavulanato

Exemplos

AmpC

Espectro ampliado

Espectro estendido

Carbapenemase

C

A

D

A

A

D

B

A

D

0

0

+++

+

+++

+++

+

0

+++

+

ACC-1, ACT-1, CFE-1, CMY, DHA-1, FOX, LAT,

MIR-1, MOX-1 e MOX-2.

TEM-1, TEM-2, SHV-1

OXA

TEM, SHV, CTX-M, BES-1, GES/IBC, PER-1,

PER-2, SFO-1, TLA-1, VEB-1, VEB-2

OXA

IMP, VIM, GIM-1, SPM-1

KPC-1, KPC-2, KPC-3

OXA-23, OXA-24, OXA-26, OXA-27, OXA-40,

0XA-48

Fonte: adaptado de Jacoby & Munoz-Price, 2005.

37

2. Objetivos

O presente estudo foi desenhado para caracterizar amostras de P. stuartii que

estiveram envolvidas em um surto de infecção hospitalar ocorrido em um hospital

privado da cidade de Niterói-RJ. Os objetivos foram:

• Confirmar a identificação das amostras bacterianas por meio de métodos

bioquímicos convencionais.

• Avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos das amostras

bacterianas e realizar testes para verificar a produção de ESBL.

• Realizar a tipificação molecular das amostras bacterianas para avaliação de sua

composição clonal.

• Pesquisar a presença de genes para a codificação de β-lactamase do tipo CTX-M.

38

3. Materiais e métodos

3.1. Amostras bacterianas

No presente estudo, foram avaliadas 68 amostras de P. stuartii obtidas de

variados espécimes clínicos de 36 pacientes internados em um Hospital da cidade de

Niterói-RJ, no período de janeiro de 2004 a dezembro de 2005. Uma amostra obtida da

superfície de uma sonda utilizada para ecocardiografia transesofágica também foi

incluída no estudo.

Todas as 69 amostras bacterianas foram previamente classificadas como P.

stuartii pelo laboratório de origem, utilizando-se o sistema automatizado Microscan®.

Após a realização dos testes bioquímicos convencionais para a identificação fenotípica

das amostras, seis delas (8,7%) foram excluídas do estudo, pois não apresentaram

identificação compatível com P. stuartii. Desta maneira, 63 amostras de P. stuartii

foram incluídas no estudo.

As amostras foram estocadas em duplicata, sob a forma de suspensões densas

em solução contendo leite desnatado (Molico - Nestlé, Araçatuba, São Paulo, SP,

Brasil) a 10% (p/v) acrescido de glicerol (Vetec Química e Representações Ltda., Rio

de janeiro, RJ, Brasil) a 10% (v/v) (solução LDG). Para cada amostra foi preparada uma

suspensão densa (obtida a partir de crescimento de 24 horas) diretamente em 1,0 mL de

solução LDG distribuída previamente em tubos plásticos próprios para congelamento

(Inlab, São paulo, SP, Brasil). A seguir, os tubos foram armazenados em freezer numa

temperatura aproximada de 20°C negativos.

39

3.2. Caracterização fenotípica das amostras

Inicialmente, para a realização dos testes convencionais de identificação

fenotípica das amostras, uma única colônia bacteriana de cada amostra foi selecionada e

utilizada. A observação de resultados não esperados fez com que se suspeitasse de

variação na expressão do fenótipo. Esta suspeita pode ser confirmada quando resultados

divergentes foram encontrados no teste da desaminação oxidativa da fenilalanina

quando testadas cinco diferentes colônias de uma mesma amostra. Desta forma foi

estabelecido que, para a realização de todos os testes convencionais de identificação,

seriam levemente tocadas cinco colônias bacterinas de cada amostra para a inoculação

dos diferentes meios de cultura utilizados, a fim de minimizar o aparecimento de atipias

fenotípicas.

3.2.1. Identificação fenotípica do gênero

Para a realização dos testes de identificação, as amostras recuperadas dos

estoques foram semeadas pela técnica de esgotamento em placas de Petri contendo meio

de ágar tripticaseína (ATS - Difco, Sparks, MD, USA) e incubadas em estufa a 35-37°C

durante 18-24 horas. A identificação das amostras foi realizada segundo protocolos

padronizados (Winn et al., 2006; Mac Faddin, 1976).

3.2.1.1. Teste da desaminação oxidativa da fenilalanina

Para a realização do teste, cinco colônias bacterianas foram levemente tocadas

com o auxílio de uma alça bacteriológica e estriadas na superfície do meio de cultura

em tubo de ensaio 13x100 mm contendo meio para desaminação da fenilalanina (Difco

Laboratories, Detroit, MI, USA). Da mesma maneira, também foram testadas

separadamente cinco diferentes colônias de uma mesma amostra para verificar a

40

variação na expressão do fenótipo. Após incubação a 35-37°C por 18-24 horas foi

realizada a leitura do teste adicionando-se cinco gotas de cloreto férrico a 10% (p/v) na

superfície do meio. O desenvolvimento de coloração verde dentro de 1-5 minutos

indicou teste positivo. Foram utilizadas cepas de Proteus mirabillis (coleção do

laboratório de epidemiologia molecular de infecções bacterianas, LEMIB) como

controle positivo e de Escherichia coli (ATCC 25922) como controle negativo.

3.2.1.2. Teste da produção de ácido sulfídrico (H2S) e da produção de indol em

meio SIM


com o auxílio de uma agulha bacteriológica e inoculadas através de picada central, até

um centímetro abaixo da superfície do meio de cultura, em tubo de ensaio 13x100 mm

contendo meio SIM (Oxoid, Basingstone, Hampshire, England). As culturas foram

incubadas a 35-37°C por 18-24 horas em aerobiose. A observação de um precipitado

preto a partir da reação do ferro peptonado (contido no meio) com o H2S também

contido no meio foi indicativo de teste positivo para produção de gás sulfídrico. Após a

leitura do H2S, foram adicionadas ao meio 15 gotas do reagente de Kovacs (10 g de p-

dimetilaminobenzaldeído dissolvidos em 150 ml de álcool isoamílico e posteriormente

acrescidos de 50 mL de ácido clorídrico concentrado), deixando-as escorrer pela parede

interna do tubo. O desenvolvimento de uma cor vermelho-fúcsia brilhante na interface

do reagente e do meio, segundos após a adição do reagente, indicou a presença de indol

e uma prova positiva. Como controle de qualidade do teste da produção de indol foram

utilizadas as amostras E. coli ATCC 25922, como controle positivo, e Klebsiella

pneumoniae ATCC 700603, como controle negativo. Para o teste da produção de H2S

41

foram utilizadas amostras de P. mirabillis (coleção do LEMIB) e K. pneumoniae ATCC

700603 como controles positivo e negativo, respectivamente.

3.2.1.3. Teste da descarboxilação da ornitina


com o auxílio de uma alça bacteriológica e inoculadas em um tubo contendo meio base

para descarboxilação de aminoácidos segundo Möeller (Vetec Química e

Representações Ltda., Rio de Janeiro, RJ, Brasil) acrescido de L-ornitina (Sigma

Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Um outro tubo contendo meio base para

descarboxilação de aminoácidos segundo Möeller, desprovido de aminoácido, foi

utilizado como controle do meio. Após a inoculação, as superfícies dos meios nos tubos

foram recobertas com uma camada de óleo mineral estéril. As culturas foram incubadas

a 35-37ºC, durante 24-48 horas. O desenvolvimento de coloração púrpura foi indicativo

de resultado positivo, demonstrando que houve produção de aminas alcalinas decorrente

da descarboxilação do aminoácido. Enterobacter cloacae Fer003 (coleção do LEMIB)

foi utilizado como controle positivo, e K. pneumoniae ATCC700603 como controle

negativo.

3.2.1.4 Teste para detecção da atividade β-galactosidase (ONPG)

Para a realização deste teste foram utilizados discos de papel de filtro

impregnados com o reagente o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) (Oxoid,

Basingstone, Hampshire, England). Cinco colônias bacterianas foram levemente tocadas

e inoculadas em 1ml de salina fisiológica em tubo estéril. O disco impregnado foi então

introduzido no tubo de modo que permanecesse em contato com a suspensão bacteriana.

A leitura do teste foi realizada após 20 minutos e em seguida a cada hora até seis horas

42

de incubação a 35-37°C. Os microrganismos negativos após seis horas de incubação

foram reincubados por até 24 horas. O teste negativo foi caracterizado por ausência de

coloração na suspensão bacteriana enquanto o teste positivo foi caracterizado por

aparecimento de coloração amarela na suspensão bacteriana. A leitura dos testes foi

realizada em intervalos de tempo para possibilitar a classificação dos microrganismos

em: fermentadores ativos da lactose (leitura positiva em até 6 horas de incubação),

fermentadores lentos da lactose (leitura positiva entre 7 e 24 horas de incubação) ou não

fermentadores da lactose (leitura negativa com 24 horas de incubação). Como controle

positivo do teste foi utilizada amostra padrão de E. coli ATCC 25922 e como controle

negativo amostra de P. mirabillis (coleção do LEMIB).

3.2.1.5 Teste de susceptibilidade à polimixina B

A susceptibilidade à polimixina B foi avaliada utilizando-se o teste de difusão

em ágar conforme proposto por Gales, Reis e Jones (2001). A partir de culturas

incubadas durante 24 horas a 35-37°C foram preparadas suspensões de cada amostra

bacteriana em salina fisiológica estéril, até a turvação correspondente ao padrão 0,5 da

escala de McFarland. As suspensões bacterianas foram então semeadas, utilizando-se

“swabs” estéreis, na superfície do meio ágar de Mueller-Hinton (Difco, Sparks, MD,

USA). Discos de papel de filtro embebidos com o antimicrobiano polimixina B,

obtidos comercialmente (Oxoid, Basingstone, Hampshire, England), foram aplicados

sobre o meio de cultura. A leitura das zonas de inibição e a interpretação dos

resultados foram realizadas após incubação a 37°C por 16-18 horas seguindo critérios

propostos pelo mesmo grupo de pesquisadores. Para controle do teste foi utilizada

amostra de E. coli ATCC 25922.

43

3.2.2 Identificação fenotípica da espécie

Após a identificação do gênero, foram realizados testes para a utilização de

alguns carboidratos que permitiram a diferenciação das espécies. Para tal, foi utilizado

um protocolo adaptado daquele descrito por Fischer e colaboradores em 1989. Foram

preparadas suspensões de cada amostra bacteriana em salina fisiológica estéril com

turvação correspondente ao padrão 0,5 da escala de McFarland. Dez microlitros dessas

suspensões foram inoculados em meio base para a utilização de carboidratos (Becton

Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, EUA) acrescido de 1% de cada

carboidrato: adonitol (Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Germany), ramnose (Sigma

Aldrich Chemie, Steinheim, Germany), e trealose (Sigma Aldrich Chemie, Steinheim,

Germany). O azul de bromotimol (Vetec Química e Representações Ltda., Rio de

Janeiro, RJ, Brasil) (0,1g de azul de bromotimol dissolvidos em 20 mL de álcool etílico

a 95% quente e posterior adição de água destilada q.s.p. 100 mL) foi utilizado como

indicador de leitura. Cinco gotas de óleo mineral estéril foram acrescentadas à

superfície do meio após inoculação para que o metabolismo fermentativo das amostras

fosse verificado. A primeira leitura foi realizada após incubação das culturas em

aerobiose por 18-24 horas a 35-37ºC. O desenvolvimento de coloração amarela foi

indicativo de teste positivo enquanto que a manutenção da cor verde original do meio

foi indicativa de teste negativo. As amostras que se apresentaram negativas para a

fermentação dos carboidratos foram reincubadas por um período de até sete dias para

que a possibilidade de utilização tardia dos açúcares fosse verificada.

44

3.2.2.1. Testes para a utilização da ramnose, adonitol e trealose

Primeiramente foram realizados os testes para a utilização da ramnose e do

adonitol. Os resultados obtidos nestes testes serviram de triagem para a realização do

teste da utilização da trealose. Para a verificação da utilização da ramnose e do adonitol

foram utilizadas amostras de Citrobacter koseri (coleção LEMIB) como controle

positivo e de P. mirabilis (coleção LEMIB) como controle negativo. Para a realização

do teste da utilização da trealose foram utilizadas amostras de C. koseri (coleção

LEMIB) como controle positivo e de Morganella morganii (coleção LEMIB) como

controle negativo.

3.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos

A susceptibilidade aos antimicrobianos foi avaliada utilizando-se o teste de

difusão em ágar conforme recomendações do CLSI (2005). A partir de culturas

incubadas durante 24 horas a 35-37°C foram preparadas suspensões de cada amostra

bacteriana em salina fisiológica estéril, até a turvação correspondente ao padrão 0,5 da

escala de McFarland. As suspensões bacterianas foram semeadas, utilizando-se

“swabs” estéreis, na superfície do meio ágar de Mueller-Hinton (Difco, Sparks, MD,

USA). Discos de papel de filtro impregnados com os antimicrobianos (Oxoid,

Basingstone, Hampshire, England) foram aplicados sobre o meio de cultura. Os

seguintes antimicrobianos foram avaliados: amicacina (5μg), amoxicilina-clavulanato

(30μg/10μg), aztreonam (30μg), cefalotina (30μg), cefepime (30μg), cefotaxima

(30μg), cefoxitina (30μg), ceftazidima (30μg), ciprofloxacino (5μg), meropenem (10

μg), piperacilina-tazobactam (10 μg) e sulfametoxazol-trimetoprim (25μg). A leitura

das zonas de inibição e a interpretação dos resultados foram realizadas de acordo com

as recomendações do CLSI (2005) após incubação das placas a 37°C por 16-18 horas.

45

Para o controle do teste foi utilizada a cepa padrão de E. coli ATCC 25922.


ágar

Para a realização deste teste foi utilizada a metodologia proposta por Jarlier e

colaboradores (1988). A partir de culturas obtidas pela semeadura em ATS e incubação

durante 18-24 horas, foram preparadas suspensões de cada amostra bacteriana em salina

fisiológica estéril, até a turvação correspondente ao padrão 0,5 da escala de McFarland.

As suspensões foram semeadas, utilizando-se “swabs” estéreis, na superfície do meio

ágar de Mueller-Hinton. Os discos contendo os antimicrobianos ceftazidima (30μg),

cefotaxima (30μg), aztreonam (30μg) e cefepima (30μg) foram então colocados a uma

distância de 25 mm, de centro a centro, de um disco contendo amoxicilina (10μg)

associada ao ácido clavulânico (20μg). As placas foram incubadas em estufa a 35°C por

16-18 horas, em aerobiose. A observação de distorção do halo na região de aproximação

de qualquer um dos antimicrobianos com o disco contendo amoxicilina-clavulanato,

indicando sinergismo, foi considerada como indicativo da produção de ESBL pela

amostra bacteriana.

Para controle do teste, foram utilizadas amostras de E. coli ATCC 25922 como

controle negativo e de K. pneumoniae ATCC 700603 como controle positivo.

46

3.5. Tipificação molecular das cepas

As amostras clínicas e a amostra obtida da superfície da sonda foram

investigadas através da técnica de amplificação de fragmentos de DNA em reação em

cadeia da polimerase utilizando-se iniciador para seqüências aleatórias (RAPD-PCR).

Esta técnica também foi utilizada para a análise da similaridade molecular existente

entre as cinco diferentes colônias de quatro amostras aleatórias que apresentaram no

mínimo duas colônias com variação fenotípica para o teste da desaminação oxidativa da

fenilalanina. A técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) foi utilizada

em 15 amostras clínicas e na amostra obtida da superfície da sonda.

3.5.1. RAPD-PCR

O par de iniciadores utilizado para a realização desta técnica foi o primer 272

(5’-AGCGGGCCAA-3’) descrito por Mahenthiralingam e colaboradores em 1996.

3.5.1.1. Extração do DNA bacteriano

O DNA foi extraído por lise térmica. A amostra bacteriana em teste foi semeada

em placa de ATS pela técnica de esgotamento e as culturas foram incubadas a 35-37°C

por 18-24 horas em aerobiose. A partir deste crescimento, uma suspensão bacteriana foi

preparada em tampão salina-fosfato (“phosphate buffer saline” ─ PBS) pH 7,3, num

volume de 2 mL, até a turvação correspondente ao padrão 2,0 da escala de McFarland.

Um mL desta suspensão foi transferido para eppendorf com capacidade de 1,5-2,0 mL e

centrifugado a 30.000 g durante 6 minutos numa temperatura de 4°C. O sobrenadante

obtido foi desprezado e o depósito ressuspenso em 100µL de água bidestilada. Essa

suspensão foi então submetida à fervura por 10 minutos para rompimento das células.

47

Logo após a fervura, o DNA já extraído, foi submetido a banho de gelo e posterior

congelamento a -20°C por um período mínimo de 30 minutos.

3.5.1.2. Amplificação do DNA

As reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 25 µL que

incluiu 22 µL da mistura de reação previamente preparada e 3 µL do sobrenadante

obtido a partir da centrifugação do DNA extraído. A mistura de reação foi preparada

adicionando-se 15,7 µL de água bidestilada, 2,5 µL de tampão de PCR (Biotools,

Madri, Espanha), 1,5 µL de MgCl2, 2,5 µL de solução de dNTPs diluídos, 2,5 µL do

primer diluído e 5U de Taq polimerase (Biotools, Madri, Espanha). Um controle

negativo sem adição do DNA molde foi incluído em cada experimento para que a

contaminação com DNA indesejado fosse descartada. As misturas de reação foram

então submetidas à amplificação que consistiu de um ciclo inicial de dois minutos a

94ºC, seguido de 30 ciclos de um minuto a 94ºC, um minuto a 36ºC e dois minutos a

72ºC e, posteriormente, um ciclo final de dez minutos a 72ºC.

3.5.1.3. Eletroforese em gel de agarose Dez microlitros dos produtos de amplificação obtidos da reação de PCR,

juntamente com 4µL do marcador de corrida, azul de bromofenol, foram aplicados nos

respectivos orifícios do gel de agarose a 1,5% e submetidos à corrida eletroforétrica.

Para tal, foi utilizado tris-borato EDTA (TBE ─ tris 89mM, ácido bórico 89mM e

EDTA 0,05M; pH 8,2) como tampão de corrida que se estendeu por aproximadamente

duas horas e 30 minutos. A corrida eletroforética foi realizada a 50 volts por 10

minutos, passando para 100 volts até que a corrida fosse finalizada. Como padrão de

tamanho de fragmento de DNA foi utilizado “1Kb ladder” (Invitrogen, Carlsbad, CA,

48

EUA). Após o término da corrida, o gel foi corado com brometo de etídio e fotografado

sob luz ultravioleta.

3.5.1.4. Interpretação dos resultados

Os resultados foram interpretados com o auxílio do programa GelCompar II,

versão 4.0 (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica) utilizando-se o coeficiente Dice de

similaridade e o método “unweighted pair group method using arithmetic averages”

(UPGMA) para análise dos agrupamentos. A partir do dendrograma obtido foram

selecionadas 15 diferentes amostras clínicas e a amostra obtida da superfície da sonda

para avaliação segundo a técnica de PFGE. O critério de seleção de amostras adotado

baseou-se na observação dos grupos clonais encontrados no RAPD-PCR e procurou

abranger a maior variedade possível de perfis.

3.5.2. Análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após tratamento

com enzima de restrição e separação através de eletroforese em gel de campo

pulsado (PFGE)

Para a realização da PFGE foi utilizada uma metodologia adaptada daquela

proposta por Almeida e colaboradores em 2005.

As amostras foram cultivadas em placas contendo ATS e incubadas a 35ºC-

37ºC durante 16h-18h. Uma suspensão foi preparada a partir do crescimento bacteriano

em 300μL de tampão PIV [NaCl 1M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,6)] de forma a se obter

uma turvação semelhante a da escala 6,0 de McFarland. A esse volume foi misturado

um volume igual de agarose de baixa temperatura de fusão (NuSieve GTG; FMC

BioProducts, Rockland, Maine, EUA) a 1,5% e, após homogeneização, distribuído em

moldes e deixado para solidificar a 4ºC por cerca de 15 min. Os blocos de agarose

foram colocados em 2mL de solução de lise [Tris-HCl 6 mM (pH 7,6); NaCl l M;

49

EDTA 100 mM (pH 7,5); Brij 58 0,5%; lauril sarcosinato de sódio 0,5% e lisozima

1mg/mL] e incubados nesta mistura por 18h-24h a 37ºC. Após esse período, os tubos

foram resfriados a 4ºC e a solução foi substituída por 2mL de solução ESP [EDTA 0,5

M (pH 9 a 9,5); lauril sarcosinato de sódio 1%; proteinase K (0,1 mg/mL)]. Esta mistura

foi incubada por 18h-24h a 500C. A seguir, a solução foi substituída por 2mL de tampão

TE [Tris-HCI 10 mM (pH 7,5); EDTA 0,l mM] e incubada a 35ºC-37ºC por 1 hora.

Esse procedimento foi repetido por 4 vezes antes da submissão dos moldes ao

tratamento enzimático. A seguir, os blocos foram incubados durante 1 hora à

temperatura de 50ºC numa solução contendo 250μL de tampão para a enzima de

restrição (tampão H) a 0,1 mg/mL. Após esse período, os blocos foram submetidos ao

tratamento com solução contendo 20U de Sfi (Boehringer Mannheim’s; M.

Biochemicals; Indianapolis, Indiana, EUA) por 24 horas a 50ºC. A seguir, a solução

contendo enzima foi removida, os blocos lavados em 2 mL de tampão TE, fundidos a

650C, e finalmente aproximadamente 30μL foram aplicados no orifício do gel preparado

com agarose (SeaKen GTG; FMC Bioproducts) na concentração de 1,0% em tampão

TBE 0,5X (Tris 0,05 M, EDTA 1,25 mM e ácido bórico 0,05 M). Os fragmentos de

restrição foram separados num sistema de eletroforese em campo pulsado (CHEF DR

III / BioRad Laboratories, Richmond, California, EUA), utilizando-se um tempo de

pulso crescente de 2 seg a 50 seg, por 23h a 6V/cm, na temperatura de 13ºC. Os géis

com os fragmentos de restrição assim separados foram corados com brometo de etídio

durante 30 min e posteriormente descorados em água destilada também por 30 min. A

seguir, foram observados sob luz U.V. e fotografados.

50

3.5.2.1. Interpretação dos resultados

A interpretação das imagens obtidas nos géis foi realizada através de inspeção

visual seguindo os critérios propostos por Tenover e colaboradores (1995), e pela

metodologia automatizada utilizando o programa GelComparII.

3.6. PCR para a pesquisa de genes codificadores de β-lactamase do tipo CTX-M

Uma amostragem que incluiu 35 amostras clínicas e a amostra obtida da superfície

da sonda foi avaliada utilizando-se o par de primers para CTX-M descrito por Arpin e

colaboradores em 2003 (5’-CGCTTTGCGATGTGCAG-3’ e 5’-

ACCGCGATATCGTTGGT-3’). Para controle positivo do teste foram incluídas uma

amostra de E. coli positiva para a presença de gene codificador de ESBL do tipo CTX-

M2, uma amostra de Enterobacter aerogenes positiva para a presença de gene

codificador de ESBL do tipo CTX-M8 e uma amostra de E. coli positiva para a

presença de gene codificador de ESBL do tipo CTX-M16. As três amostras utilizadas

como controles positivos do teste foram gentilmente cedidas pelo Dr. Jorge Sampaio

(Laboratório Fleury, São Paulo, SP).

3.6.1. Extração do DNA bacteriano

Cada amostra bacteriana foi semeada em placa de ATS pela técnica de

esgotamento e as culturas foram incubadas a 35-37°C por 18-24 horas em aerobiose. A

partir deste crescimento, o DNA bacteriano foi extraído através de lise térmica

conforme descrito no item 3.5.1.1.

51

3.6.2. Amplificação do DNA

As reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 40 µL que

incluiu 35 µL da mistura de reação previamente preparada e 5 µL do sobrenadante

obtido a partir da centrifugação do DNA previamente extraído. A mistura de reação foi

preparada adicionando-se 22 µL de água bidestilada, 2,5 µL de tampão de PCR

(Biotools, Madri, Espanha), 1,5 µL de MgCl2, 2,5 µL de solução de dNTPs diluídos ,

3,0 µL de cada primer diluído e 2,5U de Taq polimerase (Biotools, Madri, Espanha).

Um controle negativo sem adição do DNA molde foi incluído em cada experimento

para que a contaminação com DNA indesejado fosse descartada. As misturas de reação

foram então submetidas à amplificação que consistiu de um ciclo inicial de três minutos

a 95ºC, seguido de 30 ciclos de um minuto a 95ºC, um minuto a 57ºC e um minuto a

72ºC e, posteriormente, um ciclo final de cinco minutos a 72ºC.

3.6.3. Eletroforese em gel de agarose Dez microlitros dos produtos de amplificação obtidos da reação de PCR,

juntamente com 4µL do marcador de corrida, azul de bromofenol, foram aplicados nos

respectivos orifícios do gel de agarose a 1,5% e submetidos à corrida eletroforétrica.

Para tal, foi utilizado TBE como tampão de corrida, que se estendeu por

aproximadamente uma hora e 30 minutos. A corrida eletroforética foi realizada a 50

volts por 10 minutos, passando para 100 volts até que a corrida fosse finalizada. Como

padrão de tamanho de fragmento de DNA foi utilizado “1Kb ladder” (Invitrogen,

Carlsbad, CA, EUA). Após o término da corrida, o gel foi então corado com brometo de

etídio e fotografado sob luz ultra-violeta.

52

3.6.4. Interpretação dos resultados A interpretação dos resultados foi realizada através de inspeção visual e

observação de um fragmento de 550 pb.

53

4. Resultados

4.1. Amostras bacterianas

No presente estudo, foram incluídas 62 amostras de P. stuartii obtidas de

variados espécimes clínicos de 36 pacientes internados em um hospital privado da

cidade de Niterói, RJ. Uma amostra obtida da superfície de uma sonda utilizada para a

realização de ecocardiografia transesofágica também foi avaliada. Dentre os espécimes

clínicos envolvidos 34,0% foram provenientes de lavado broncoalveolar, 21,0% de

secreção traqueal, 16,0% de ponta de cateter, 9,7% de urina, 8,0% de escara de

decúbito, 6,5% de sangue e 4,8% de outros espécimes (figura 1).

Para a verificação da distribuição do número de casos de isolamento de

P. stuartii produtora de ESBL, ao longo do período do estudo, que incluiu os anos de

2004 e 2005, foi considerada uma única amostra de cada paciente. A amostra

selecionada foi aquela obtida do primeiro espécime clínico coletado de cada paciente.

A distribuição do número de casos ao longo do período de estudo revelou uma maior

incidência entre os meses de outubro de 2004 e outubro de 2005. O mês que apresentou

o maior número de casos foi fevereiro de 2005 e nos meses de abril, junho, julho, agosto

e novembro de 2004 e; novembro e dezembro de 2005, não foram registrados casos de

isolamento de P. stuartii produtora de ESBL (Figura 2).

4.2. Caracterização fenotípica das amostras

As 69 amostras foram previamente identificadas no laboratório de origem,

através do sistema automatizado Microscan® e reavaliadas no presente estudo através

54

de testes fenotípicos convencionais. Das 69 amostras bacterianas coletadas para o

estudo apenas 63 (91,3%) tiveram sua identificação confirmada como P. stuartii.

4.2.1. Identificação fenotípica do gênero

Para a identificação fenotípica do gênero o primeiro teste realizado foi o teste da

desaminação oxidativa da fenilalanina. Inicialmente este teste foi realizado tocando-se

levemente uma única colônia bacteriana para a inoculação do meio. Quando o teste foi

realizado desta maneira, seis amostras não apresentaram teste positivo como era

esperado e necessário para a classificação do gênero. Suspeitando-se que se tratava de

variação na expressão do fenótipo, o teste foi novamente realizado utilizando-se cinco

diferentes colônias bacterianas, cada uma delas testada separadamente. Como foi

encontrada variação fenotípica entre as cinco diferentes colônias testadas das seis

amostras inicialmente avaliadas, essa metodologia foi então realizada em todas as

amostras do estudo. Das 63 amostras incluídas no estudo, 41 (65%) apresentaram

variação fenotípica no teste da desaminação oxidativa da fenilalanina. Destas, 21

amostras (51,2%) apresentaram uma das cinco colônias avaliadas negativa para o teste,

16 amostras (39,0%) apresentaram duas das cinco colônias avaliadas negativas para o

teste e quatro amostras (9,8%) apresentaram três das cinco colônias avaliadas negativas

para o teste.

Considerando-se que pode ocorrer variação na expressão do fenótipo para qualquer

gene bacteriano, todos os testes fenotípicos convencionais de identificação foram então

realizados tocando-se levemente cinco colônias bacterianas para inoculação dos meios

de cultura. A partir daí, nenhuma outra variação fenotípica foi observada e todas as

amostras apresentaram-se móveis e com teste positivo para a produção de indol. Os

testes para a produção de H2S, descarboxilação da ornitina e detecção da atividade β-

galactosidase (ONPG) se mostraram negativos para todas as amostras. Todas as 63

55

amostras também foram resistentes à polimixina B.

4.2.2. Identificação fenotípica da espécie

Na realização dos testes para a identificação da espécie bacteriana, todas as 63

amostras identificadas como pertencentes ao gênero Providencia puderam ser

identificadas como pertencentes à espécie P. stuartii, já que se mostraram apenas

fermentadoras da trealose.

4.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos

As 63 amostras incluídas no estudo foram avaliadas quanto à susceptibilidade a

12 diferentes antimicrobianos através da técnica de disco difusão em ágar conforme

recomendações do CLSI (2005). Foram encontrados 35 diferentes perfis de resistência..

Todas as amostras se apresentaram sensíveis ao meropenem e resistentes à cefalotina e à

amoxicilina + ácido clavulânico. Duas amostras apresentaram resistência à ceftazidima,

uma amostra apresentou resistência intermediária à amicacina e uma amostra apresentou

resistência total a esse mesmo antimicrobiano. Para os demais antimicrobianos

avaliados os percentuais de resistência variaram e estão representados na tabela 4.


ágar

Todas as amostras incluídas no estudo foram submetidas ao teste fenotípico para

a detecção da produção de ESBL. Resultados positivos foram encontrados em 58

(92%) das 63 amostras, utilizando-se a técnica descrita por Jarlier e colaboradores em

1988. Entretanto cinco amostras (8,0%) só apresentaram resultado positivo quando a

distância entre os discos dos antimicrobianos foi alterada para 30mm, para duas

56

amostras (Figura 3), e 28mm, para três amostras (Figura 4). A modificação foi feita na

distância centro a centro entre as cefalosporinas de amplo espectro e o disco central

contendo o inibidor. Desta forma, todas as 63 amostras (100%) foram produtoras de

ESBL.

A análise dos perfis de susceptibilidade às cefalosporinas permitiu a verificação

de que 58 das 63 amostras (92%) apresentaram-se resistentes ou com resistência

intermediária para cefotaxima, e apenas duas (3,2%) apresentaram-se resistentes à

ceftazidima. Essa observação permitiu que se suspeitasse de que a ESBL produzida

pelas amostras fosse do tipo CTX-M. À partir daí, foi pesquisada a presença do gene

codificador para esse tipo de ESBL.

4.5. Tipificação molecular das amostras

4.5.1. RAPD-PCR

Todas as 63 amostras de P.stuartii foram avaliadas através de RAPD-PCR com

o propósito de analisar a composição clonal da coleção. Cada amostra apresentou de 8 a

18 bandas nítidas ao RAPD-PCR, variando de 506 a 4072 pb. Os resultados obtidos

foram interpretados com o auxílio do programa GelCompar II, que permitiu a

construção de um dendrograma que pode ser observado na figura 5. Nesta figura

observa-se a existência de três grupos clonais que compartilham mais de 90% de

similaridade genotípica. Foi denominado “a” o grupo clonal principal que detém 60

(95,2%) das 63 amostras e “b” e “c” os grupos clonais secundários nos quais estão

inseridas as demais amostras. No clone “b” estão inseridas duas amostras (3,2%) e no

clone “c” uma única amostra (1,6%). As três amostras clínicas que não foram inseridas

no clone principal “a” e mais 13 amostras, 12 clínicas e a amostra da sonda, foram

selecionadas para avaliação segundo a técnica de PFGE.

57

Na análise por RAPD-PCR também foi incluído o estudo das cinco diferentes

colônias de quatro amostras que apresentavam pelo menos duas colônias com variação

fenotípica no teste da desaminação oxidativa da fenilalanina. Três foram provenientes

de espécimes clínicos e uma da superfície da sonda. Os perfis das cinco colônias de

cada uma destas amostras foram idênticos entre si, conforme mostrado na figura 6.

A classificação das amostras em grupos clonais permitiu a construção de um

gráfico onde pode ser observada a distribuição temporal dos diferentes genótipos de P.

stuartii encontrados no período do estudo (Figura 7). Para a construção do gráfico foi

incluída somente a primeira amostra coletada de cada paciente. Como pode ser

observado na figura 7 o clone principal “a” esteve presente em todo o período do estudo

e os clones secundários, “b” e “c” se concentraram nos meses finais deste período.

4.5.2. Análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após tratamento

com enzima de restrição e separação através de eletroforese em gel de campo

pulsado (PFGE)

Na análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após tratamento

com enzima de restrição e separação através de PFGE, pode-se verificar que as 16

amostras avaliadas apresentaram de 4 a 16 bandas que variaram de 48,5 a 388,0 pb.

Com o auxílio do programa Gel Compar II, pode-se construir um dendrograma onde foi

verificada a presença de um grupo clonal principal A e dois outros genótipos B e C

(Figura 8). O percentual de similaridade entre os genótipos foi de 32,23%. O grupo

clonal A incluiu 13 amostras com similaridades entre si maiores do que 90,0%, que

corresponderam a até três diferenças no perfil de bandas. Considerando os critérios

propostos por Tenover e colaboradores em 1995, estas amostras são proximamente

relacionadas. O genótipo B incluiu duas amostras com 80% de similaridade entre si (até

58

três diferenças nos perfis de bandas), e com aproximadamente 32,0% de similaridade

quando comparado com as amostras do grupo clonal A. O genótipo C incluiu uma

amostra com menos de 40,0% de similaridade (mais de sete diferenças nos perfis de

bandas) quando comparado com as amostras do grupo clonal A. As amostras dos

genótipos B e C foram isoladas nos últimos meses do período do estudo.

4.6. PCR para a pesquisa da presença de genes codificadores de β-lactamase do

tipo CTX-M.

Todas as 36 amostras bacterianas avaliadas apresentaram fragmento de 550 pb

correspondente à presença do gene blaCTX-M. Além da presença do fragmento esperado

também pode ser observada a presença de um fragmento de aproximadamente 1000 pb.

Este fragmento também foi encontrado na amostra controle positiva para o gene

codificador de ESBL do tipo CTX-M2 (Figura 9). Este fato permite que se suspeite que

as amostras incluídas no estudo apresentam ESBL do tipo CTX-M2. Porém sua

confirmação só pode ser realizada através do sequênciamento gênico.

59

Tabela 4. Percentuais de susceptibilidade de 63 amostras de P. stuartii a doze antimicrobianos*

Número em cada na categoria (%)

Antimicrobiano resistente sensibilidade

resistência

intermediária

Sulfametoxazol-

trimetoprim 59 (93,6%) 3 (4,8%) 1 (1,6%)

Cefoxitina 50 (79,3%) 11(17,5%) 2 (3,2%)

Ciprofloxacino 51 (81,0%) 5 (8,0%) 7 (11,0%)

Piperacilina-

tazobactam 18 (28,6%) 33 (52,4%) 12 (19,0%)

Cefotaxima 54 (85,7%) 5 (8,0%) 4 (6,3%)

Cefepime 35 (55,5%) 19 (30,2%) 9 (14,3%)

Aztreonam 6 (9,5%) 40 (63,5%) 17 (27,0%)

* Todas as amostras foram sensíveis ao meropenem e resistentes à cefalotina e amoxicilina

+ ác. clavulânico; uma amostra (1,6%) foi resistente à amicacina; uma amostra (1,6%)

apresentou resistência intermediária à amicacina e duas amostras (3,2%) foram resistentes a

ceftazidima.

60

Figura 1. Percentuais dos diferentes espécimes clínicos das 62 amostras clínicas de P. stuartii incluídas no estudo

34,00%

8,00%21,00%

16,00%

9,70%6,50% 4,80%

lavado broncoalveolar

escara de decúbito

secreção traqueal

ponta de cateter

urina

sangue

outros

Figura 2. Distribuição do número de pacientes com isolamento de P. stuartii

produtora de ESBL ao longo do período de estudo

0

1

2

3

4

5

6

jan/04

fev/04

mar/04ab

r/04

mai/04

jun/04

jul/04

ago/0

4se

t/04ou

t/04no

v/04

dez/0

4jan

/05fev

/05

mar/05ab

r/05

mai/05

jun/05

jul/05

ago/0

5se

t/05ou

t/05no

v/05

dez/0

5

nº d

e ca

sos

*

*isolamento da amostra da sonda

61

Figura 3. Teste fenotípico positivo para a produção de ESBL com distância de 30

mm centro a centro dos discos de antimicrobianos para a amostra 4A de P. stuartii

FEP

AMC

CAZ

ATM

CTX

FEP: cefepime; CTX: cefotaxima; ATM: aztreonam; CAZ: ceftazidima; AMC: amoxicilina-clavulanato

62

Figura 4. Teste fenotípico positivo para a produção de ESBL com distância de 28

mm centro a centro dos discos de antimicrobianos para a amostra 16A de P.

stuartii

AMC

CAZ

ATM

FEP

CTX

FEP: cefepime; CTX: cefotaxima; ATM: aztreonam; CAZ: ceftazidima; AMC: amoxicilina-clavulanato

63

Figura 5. Dendrograma realizado a partir dos perfis de bandas obtidos pela

técnica de RAPD-PCR para as 63 amostras de P. stuartii

64

% de similaridade Amostra

“a”, “b” e “c” : grupos clonais

a

c

b

65

Figura 6. Análise da composição clonal de cinco diferentes colônias de uma

amostra clínica de P. stuartii (14A)

1Kb C1 C2 C3 C4 C5 1Kb

1Kb: marcador de tamanho molecular; C1, C2, C3, C4 e C5: colônias 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente.

Figura 7. Distribuição temporal dos diferentes genótipos de P. stuartii

0

1

2

3

4

5

6

jan/04

feb/04

mar/04ap

r/04

may/04

jun/04jul/0

4

aug/04

sep/0

4oct/

04

nov/04

dec/04

jan/05

feb/05

mar/05ap

r/05

may/05

jun/05jul/0

5

aug/05

sep/0

5oct/

05

nov/05

dec/05

Clone "c"Clone "b"Clone "a"

nº d

e ca

sos

66

Figura 8. Dendrograma realizado a partir dos perfis de bandas obtidos pela

técnica de PFGE para 16 amostras de P. stuartii

A. B e C: grupos clonais

% de similaridade amostras

A

B

C

Figura 9. PCR para a verificação da presença de genes codificadores de ESBLs dos

tipos CTX-M2, CTX-M8 e CTX-M16 em amostras de P. stuartii

1Kb 23 27 41 47 72 M2 M8 M16 C- 1Kb

← 550pb

5. Discussão

5. Discussão

1Kb: marcador de tamanho molecular; 23: amostra obtida da sonda; 27, 41, 47, e 72: amostras clínicas; M2: controle (+) para o gene blaCTX-M2; M8: controle positivo para o gene blaCTX-M8; M16: controle positivo para o gene blaCTX-M16; C-: controle negativo da mistura de reação.

67

5. Discussão

A investigação e o estudo dos surtos de infecção hospitalar, além de

contribuírem para a descrição da epidemiologia dessas infecções, fornecem informações

de utilidade para a saúde pública e servem como importantes ferramentas na prevenção

de casos adicionais (Reingold, 1998).

No presente estudo, foram avaliadas 69 amostras de P. stuartii que estiveram em

volvidas em um surto de infecção hospitalar que ocorreu em um hospital privado da

cidade de Niterói, Rio de Janeiro. Todas as 69 amostras foram previamente identificadas

como P. stuartii no laboratório de origem através do sistema automatizado Microscan®.

Das 69 amostras avaliadas apenas 63 (91,3%) foram incluídas no estudo. As demais seis

amostras não tiveram sua identificação fenotípica confirmada como P. stuartii através

dos testes bioquímicos convencionais e por isso foram excluídas do estudo. A eficácia

do sistema automatizado Microscan® na correta identificação de amostras pertencentes

à família Enterobacteriaceae foi motivo de estudo para O’Hara & Miller (2000). Neste

estudo, 14 amostras de P. stuartii foram avalidas e 12 (86%) tiveram a identificação

confirmada em testes bioquímicos. Portanto, o percentual de acerto obtido no sistema

automatizado encontrado no presente estudo pode ser considerado excelente.

Das 63 amostras incluídas no estudo, 62 foram obtidas de variados espécimes

clínicos de pacientes internados no período de janeiro de 2004 a dezembro de 2005 e

uma foi obtida da superfície de uma sonda utilizada para ecocardiografia transesofágica.

Na identificação das amostras através da utilização de métodos bioquímicos

convencionais foram realizados nove diferentes testes. O primeiro realizado foi o teste

da desaminação oxidativa da fenilalanina. Neste teste, amostras pertencentes ao gênero

Providencia bem como aquelas pertencentes aos gêneros Proteus e Morganella

apresentam resultado positivo. Na análise dos resultados obtidos, seis amostras (9,5%)

68

não apresentaram resultado positivo como esperado. Estes resultados levaram à

suspeita de variação na expressão do fenótipo. Tal suspeita foi confirmada quando cinco

diferentes colônias de cada amostra bacteriana foram avaliadas separadamente no teste

da desaminação oxidativa da fenilalanina. Das 63 amostras, 41 (65%) apresentaram

variação fenotípica neste teste. Baseando-se no fato de que a variação na expressão do

fenótipo pode acontecer para qualquer gene e que o percentual encontrado foi elevado,

ficou estabelecido que para a realização de todos os testes convencionais de

identificação fenotípica seriam levemente tocadas cinco diferentes colônias de cada

amostra bacteriana para a inoculação dos meios específicos de cultura. Desta maneira,

não foram encontradas variações fenotípicas em nenhum dos oito testes restantes

realizados. Caso todo o trabalho fosse realizado utilizando-se uma única colônia

bacteriana para a inoculação dos meios, mais de 50% das amostras não teriam sido

identificadas como P. stuartii e teriam sido excluídas do estudo.

A realização de estudos que consideram a ocorrência de variação na expressão

do fenótipo pode contribuir significativamente para a correta identificação dos

microrganismos na rotina laboratorial. Em um estudo realizado por Silva e Rubin em

1977 foram avaliadas 59 amostras de K. pneumoniae. Destas, 18 (31%) apresentaram

variação em testes fenotípicos quando avaliadas cinco diferentes colônias. Os testes para

a produção de indol e utilização de citrato, também incluídos no presente estudo para a

identificação de amostras de P. stuartii, apresentaram variação de 10% e 9%,

respectivamente.

No teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, todas as 63 amostras avaliadas

foram resistentes à cefalotina e à amoxicilina-ácido clavulânico, como esperado para P.

stuartii devido à presença de gene cromossômico de expressão induzível para β-

lactamase do tipo AmpC (Rossi & Andreazzi, 2005). Porém, elevados percentuais de

69

resistência a outros antimicrobianos também foram observados. Todas as amostras

foram produtoras de ESBL, o que as torna resistentes a todos os antibióticos da classe

dos β-lactâmicos com exceção aos carbapenêmicos. Além disso, a resistência a

antimicrobianos não β-lactâmicos também foi freqüente com mais de 84,0% das

amostras resistentes ao ciprofloxacino e sulfametoxazol-trimetoprim. A resistência a

estes antimicrobianos pode ser devida à presença de genes de resistência inseridos no

plasmídeo que codifica a produção de ESBL, conforme descrito em amostras de

Klebsiella spp (Hanson et al, 1999).

Amostras clínicas de P. stuartii multirresistentes já foram relatadas em alguns

estudos como aquele realizado por Tumbarello e colaboradores em 2004 na Itália. Das

223 amostras de P. stuartii avaliadas naquele estudo, 116 (52%) foram produtoras de

ESBL. Esse tipo de resistência é particularmente difícil de ser detectada em amostras de

P. stuartii, já que nenhum critério para a detecção da produção de ESBL foi

estabelecido pelo CLSI para esta espécie. A metodologia para a detecção da produção

de ESBL proposta por Jarlier e colaboradores em 1988, conhecida por dupla difusão,

pode ser facilmente realizada pelos laboratórios clínicos. No entanto, a produção

simultânea de β- lactamase do tipo Amp C pela amostra avaliada pode dificultar a

detecção de ESBL através desta técnica (Thomson, 2001). Todas as 63 amostras

avaliadas foram produtoras de ESBL. Porém, a detecção da produção desta enzima em

cinco amostras só foi possível quando a técnica foi adaptada alterando-se a distância

entre os discos dos antimicrobianos de 25mm para 30mm, para duas amostras e 28mm,

para três amostras. A similaridade nos perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos

apresentada pelas amostras foi um primeiro indicativo da possibilidade de relação clonal

entre elas.

Um surto pode ser definido como um aumento temporal na incidência de

70

morbidades infecciosas ou da colonização por um microrganismo numa determinada

população. Quando a exposição a um agente etiológico ocorre por meio de uma fonte

comum, os microrganismos envolvidos no surto representam uma única população

clonal e compartilham características fenotípicas e genotípicas. No caso do presente

estudo, a sonda utilizada para a realização de ecocardiografia transesofágica, foi

responsável pela propagação do número de casos. Tal afirmação foi possível quando

avaliados os resultados obtidos na tipificação molecular das amostras.

Até os dias atuais, apenas dois estudos relatam a avaliação de amostras de P.

stuartii através da utilização de técnicas moleculares. No estudo publicado por

Tumbarello e colaboradores em 2004 foi utilizado um par de iniciadores denominados

REP1R-I e REP2-I. Estes iniciadores apresentam como principal característica a

presença de uma base nitrogenada modificada, a inosina (I). Esta base apresenta como

característica diferencial a capacidade de pareamento com qualquer uma das quatro

bases nitrogenadas principais: citosina (C), guanina (G), timina (T) e adenina (A). Esta

característica facilita o pareamento entre as bases, principalmente em fragmentos de

DNA que apresentam elevado conteúdo de G-C. Entretanto, a utilização de iniciadores

com bases modificadas aumenta consideravelmente o custo do sistema de tipificação.

Em 2005, Yoh e colaboradores estudaram a importância de espécies de

Providencia como causa da diarréia do viajante. Dentre 130 espécimes fecais avaliados,

Providencia sp. foi recuperada de 23. Dentre estas, cinco amostras eram da espécie P.

stuartii que, assim como as outras do gênero, foram avaliadas quanto à sua composição

clonal. A tipificação das amostras foi realizada através da técnica de RAPD-PCR

utilizando-se os primers 3 (5’GTAGACCCGT) e 5 (5’AACGCGCAAC). Os perfis de

bandas encontrados para P. stuartii não foram apresentados no trabalho. Porém, para as

amostras de P. rettgeri apresentadas foram obtidos perfis de bandas que variaram de três

71

a cinco bandas para cada um dos primers utilizados. Este pequeno número de bandas

pode ser insuficiente para a determinação da composição clonal de um grupo de

amostras, conforme sugerido por Tenover e colaboradores (1995).

No presente estudo foi utilizado o primer 272 descrito por Mahenthiralingam e

colaboradores (1996). Este primer apresenta um elevado número de bases citosina e

guanina, o que provavelmente facilitou o pareamento com fragmentos de DNA de P.

stuarti, já que esta bactéria apresenta elevado conteúdo G-C (39–43 mol%) (Senior,

1995). O primer 272 permitiu a obtenção de 8 a 18 bandas, o que certamente permitiu

melhor discriminação entre os tipos clonais.

Na avaliação do dendrograma obtido para os perfis de bandas da tipificação

molecular das amostras pela RAPD-PCR foi encontrado um grupo clonal principal

denominado “a” e dois genótipos secundários, “b” e ”c”. No grupo clonal “a”, foram

inseridas 59 amostras clínicas e a amostra obtida da superfície da sonda. As três

amostras clínicas que não foram inseridas no grupo clonal “a”, 12 amostras clínicas

inseridas neste grupo e a amostra da sonda foram avaliadas segundo a técnica de PFGE.

Até o presente momento não é de nosso conhecimento relatos da utilização desta técnica

em amostras de P. stuartii. No dendrograma obtido a partir dos resultados do PFGE

também foi encontrado um grupo clonal denominado A e dois genótipos, B e C. As

amostras inseridas nos genótipos “a”,”b” e “c” de RAPD-PCR foram inseridas,

respevtivamente, nos genótipos A, B e C da PFGE. A comparação da técnica de RAPD-

PCR com a técnica de PFGE permitiu concluir que a primeira foi satisfatória para a

tipificação molecular de amostras de P. stuartii. Tal observação é de extrema

importância, já que até o momento, são escassos estudos de tipificação molecular de

amostras de P. stuartii.

A análise da distribuição temporal das amostras incluídas nos diferentes

72

genótipos de RAPD-PCR revela que o gupo clonal “a” esteve presente desde a

introdução deste novo patógeno naquele hospital até o final do período de coleta de

amostras para o estudo. Portanto, não pode ser definido se o surto ainda permanece

naquele hospital. Também pode ser observado que os genótipos “b” e “c” surgiram nos

meses finais do período de coleta. É possível que tais genótipos sejam variações do

grupo clonal “a”, ou sejam casos não relacionados ao surto.

73

6. Conclusões

1. A realização do teste fenotípico para a detecção da desaminação oxidativa da

fenilalanina com cinco diferentes colônias de uma mesma amostra de P. stuartii revelou

a existência de variação na expressão do fenótipo para esta enzima em 65% das

amostras incluídas no presente estudo.

2. A tipificação molecular da coleção de P. stuartii produtora de ESBL proveniente de

um surto ocorrido em um hospital privado do Rio de Janeiro comprovou a

contaminação de uma sonda utilizada para ecocardiograma transesofágica com a cepa

do surto.

3. Um único grupo clonal de P. stuartii ocasionou cerca de 90% de todas as infecções

causadas por este microrganismo em 36 pacientes de um hospital durante 24 meses.

4. A realização de RAPD-PCR com o primer 272 foi utilizado para a tipificação

molecular de amostras de P. stuartii com 100% de tipabilidade. Estes resultados foram

corroborados pela avaliação de um grupo das amostras por PFGE.

74

7. Referências bibliográficas

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Características Microbiológicas e Tipificação Molecular de ...livros01.livrosgratis.com.br/cp036620.pdf · Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade