Caracterização da cinética da reação de hidrólise do p-nitrofenil acetato a p-nitrofenol na ausência e presença da enzima α-quimiotripsina, efeito da temperatura e do pH

A. Alves Rodrigues

A. I. Alves dos Reis Almeida

B. N. Santana Pinto

V. Leite

RESUMO: Para estudar a hidrólise do p-nitrofenil acetato (PNPA) a p-nitrofenol (PNP) em presença e ausência

da enzima α-quimotripsina (α-CT), foram variados alguns parâmetros para determinar as melhores condições da

hidrólise, como pH em 7,4 e 10,0 e a temperatura em 25°C, 35°C 45°C e 60°C. Para fins comparativos foram feitas

análises com soluções de tirosina (Tyr) e triptofano (Trp). Analisou-se a cinética da reação através de duas

técnicas; a espectrometria de absorção UV/Vis e fluorescência. Com os resultados obtidos por essas técnicas, foi

estimada a energia de ativação para o pH 7,4 e 10, a ordem da reação, a velocidade máxima (Vmáx) para a reação

catalisada e a temperatura de desnaturação da α-CT. As temperaturas de desnaturação encontradas foram T =

48,1±0,428 °C para pH 7,4 e T = 48°C para pH 10. Para pH 7,4 sem enzima Ea = 62 kJ/M , com enzima Ea = 22

kJ/M; para o pH 10,0 sem enzima Ea = 8,6 kJ/M, com enzima Ea = 28 kJ/M. A reação é de primeira ordem.

PALAVRAS – CHAVE: α-quimiotripsina, PNPA, PNP, Cinética, pH e Temperatura

1

I. INTRODUÇÃO

O objetivo da pesquisa é realizar um estudo a respeito da hidrólise do PNPA a PNP considerando o efeito da temperatura e do pH. A fim de analisar a eficiência da α-CT como catalizador foi feita a reação na presença e ausência dessa enzima.

A hidrólise do PNPA para PNP ocorre quando uma molécula de água ataca o carbono da carbonila do PNPA, gerando por fim uma molécula de álcool e um ácido carboxílico [Figura 1] [1].

Figura 1 Reação de hidrólise de um éster a acido carboxílico

Essa reação é influenciada pelo pH do meio e pela temperatura. Quando o pH ≥ 7 temos mais íons hidróxidos disponíveis no meio, de forma que a reação é deslocada no sentido dos produtos, logo a velocidade da reação aumenta. Com aumento da temperatura do sistema as moléculas adquirem mais energia cinética, o que aumenta o choque entre elas, consequentemente há maior formação de produtos e aumento da velocidade de reação.

A α-CT é uma proteína encontrada no intestino bovino, é composta por 245 aminoácidos [2] e massa molar de 24800 g/mol [3]. Seu pH de funcionamento ótimo é 8. Essa proteína é capaz de clivar ligações peptídicas entre aminoácidos, onde pelo menos um deles tenha cadeia lateral aromática. A α-CT também pode ser empregada para catalisar reações de hidrólise de p-nitrofenil ésteres [3]. Por ser uma proteína a α-CT tem uma estrutura tridimensional que é mantida por interações fracas do tipo ligações de hidrogênio, pontes dissulfeto, interações hidrofóbicas, forças de van der Waals e interações eletrostáticas (pares iônicos), as quais podem ser rompidas por agentes desnaturamtes, como o pH, temperatura e estresse mecânico. Com o aumento da temperatura a velocidade de vibração molecular aumenta e as interações fracas são rompidas. Alterações no pH modificam o estado iônico das cadeias laterais dos aminoácidos o que interfere nas ligações de hidrogênio e nas interações eletrostáticas [4].

Foram empregadas técnicas de espectrometria de absorção UV/Vis e fluorescência em nossas análises. O PNPA e PNP absorvem em diferentes comprimentos de onda na técnica de espectrometria de absorção UV/Vis, o que possibilita analisar o andamento da hidrólise com a variação da absorvância em um determinado comprimento de onda. A α-CT possui três aminoácidos que são sensíveis a técnica de fluorescência; a tirosina, o triptofano e a fenilalanina, pois estes possuem grupos aromáticos. Assim podemos analisar a desnaturação da α-CT consoante à temperatura empregada.

II. MATERIAIS E METODOS

II.1 Aparelhagem

Nesse experimento foram utilizados: pipetas volumétricas, pipetador automático, béqueres, balões volumétricos, balança analítica, cuvette de quartzo, banho termostático, termômetros, tubos de ensaio, eppendorfs, banho de gelo, espectrofotômetro de absorção UV/Vis, fluorímetro, erlenmeyer.

2

II.2 REAGENTES

Nesse experimento foram utilizados: tampão fosfato 10mM a pH = 7,4 com 0,15M NaCl, tampão fosfato 10mM a pH = 10 com 0,15M NaCl, tampão etanol 95:5 (% v/v) pH = 7,4, tampão etanol 95:5 (% v/v) pH=10, p-nitrofenol 1mM em água:etanol 95:5, p-nitrofenil acetato 10mM em etanol, solução de tirosina, solução de triptofano e solução de α-CT.

II.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A partir da solução de PNP inicial, preparou-se cinco soluções de 5 mL cada, utilizando como solvente o tampão etanol a pH 7,4, com as seguintes concentrações: 1×10-5M, 2.5×10-5M, 5×10-5M, 7.5×10-5M e 1×10-4M. Foram também preparadas as mesmas soluções, porém o solvente era o tampão etanol a pH 10. Utilizando um espectrofotômetro de absorção UV/Vis, foi feita uma varredura de 250nm a 500nm da solução mais concentrada para cada um dos pHs, foi observado para ambos que a maior absorvância ocorria quando λ = 401nm. Esse valor de λ foi fixado e então foi medido a absorvância das cinco soluções em pH 7,4 e para as cinco soluções em pH 10, dessa forma foram obtidas curvas de calibração do PNP.

Para analisar a hidrólise do PNPA a PNPA sem enzima, utilizou-se a solução de PNPA inicial para preparar 2mL de soluções de PNPA em tampão etanol pH 7,4 e tampão etanol pH 10 com as seguintes concentrações: 1,2×10-3M, 0,6×10-3M. As soluções e o tampão foram mantidas no banho de gelo, a fim de evitar que a hidrólise começasse a ocorrer. Essas soluções foram diluídas vinte vezes em tampão arrefecido e foi retirado 1 mL dessas e colocado em um eppendorf no banho de gelo. Os erlenmeyers contendo o restante das soluções foram colocados em banhos térmicos com diferentes temperaturas (25°C, 35°C e 45°C). A tempos predeterminados retirou-se 1 mL de cada solução e colocou-se em eppendorfs numerados no gelo. Esses foram submetidos a análise do espectrofotômetro de absorção UV/Vis para determinar suas absorvâncias.

Além disso, preparou-se 5mL de soluções de α-quimiotripsina, tirosina e triptofano com concentração de 10 µM cada, a solução de α-quimiotripsina foi guardada no gelo. O procedimento foi feito em duas temperaturas diferentes, para isso, tanto as soluções de aminoácidos como a solução de enzima foram dividas em duas frações iguais, sendo uma delas colocada num banho a 25°C e a outra parcela a 60°C. Em seguida foram feitas os espectros de absorção para determinar o λmáx de todas as soluções, como a absorvância foi superior a 0,1 para as soluções de α-quimiotripsina, essas foram diluídas. Todas as soluções foram utilizadas para fazer os espectros de fluorescência, fixando-se o λmáx encontrado.

Avaliou-se também a estabilidade da enzima através de uma rampa de temperatura. Procedeu-se de modo que as mesmas soluções de aminoácidos e enzima utilizadas anteriormente foram submetidas ao Fluorímetro. Com base no λmáx encontrado na fluorescência, fixou-se o par λex/ λem no fluorímetro, variou-se a temperatura de 25°C a 60°C com a velocidade de 1°C/min e em seguida foi feito o arrefecimento até 25°C com a mesma velocidade.

Por fim analisou-se o efeito da α-quimiotripsina na hidrólise do PNPA a PNP. A partir da solução inicial de PNPA preparou-se soluções em etanol com cinco concentrações: 2.5x10-4 M, 6x10-4 M, 1,2x10-3 M, 2,5x10-3 M, 5x10-3 M. A seguir foi preparado 10mL de uma solução de α-quimiotripsina a 200 µM em tampão, todas as soluções foram colocadas em banho de gelo. Uma amostra de tampão foi levada ao banho termostático para cada temperatura utilizada no experimento; 25°C, 35°C e 45°C. Em cada cuvette foi colocado 2,74mL de tampão, 100 µL de α-quimiotripsina 200 µM e após agitar por inversão se adicionou 150 µL da solução de p-nitrofenil acetato em etanol, colocou-se primeiro a solução de PNPA mais diluída e posteriormente repetiu-se para as outras soluções, incluindo a solução inicial de PNPA com concentração 1x10-2 M.

II.4 MÉTODOS

Para as análises foi levado em conta a Lei de Beer- Lambert

A= ɛlc

Onde A = absorvância, ε = coeficiente de absortividade molar (L. mol-1. cm-1), c = concentração (mol.L-1) e l = caminho óptico = 1 cm

Foi empregada a ferramenta Solver do Microsoft Excel 2010 para criar linhas de ajuste para as seguintes equações:

Equação cinética para reações de primeira ordem

3

[PNP]= (1- exp(-kt)) x [PNPA]0

Equação cinética para reações de segunda ordem

[ ] = [ A] [ A]

[ A]

Equação de Michaelis-Meten:

= [ ] [ ]

[ ]

= [ ]

[ ]

Equação de Arrhenius:

l = l A

III. RESULTADOS

Ao fazer a curva de calibração do PNP foi possível obter o valor da absortividade molar que é dada pela inclinação da reta. Todos os resultados obtidos estão expostos na tabela abaixo.

Amostra a pH 7,4 Absortividade molar (ε) Amostra a pH 10 Absortividade molar (ε)

1 12565 5 19216

2 16322 6 18107

3 15196 7 18036

4 16322 --- ---

médio 15759±1770 médio 18107±662

Tabela I: Absortividades molares a pH 7,4 e pH 10

O Gráfico I apresenta a curva de calibração feita para amostra 3, o valor de é obtido pelo coeficiente angular da reta. As outras amostras foram submetidas ao mesmo tratamento.

Gráfico I: Curva de Calibração do PNP para a amostra 3

0,175

0,391

0,781 y = 15196x + 0,0184 R² = 9,99E-01

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0,00E+00 2,00E-05 4,00E-05 6,00E-05

Ab

sorv

ânci

a

Concentração mol/L

Curva de calibração PNP amostra 3

Absorvância

Linear (Absorvância)

4

A partir da Lei de Beer-Lambert obtiveram-se as concentrações de PNP formado ao logo do tempo de hidrólise e criou-se um gráfico. Para descobrir a ordem da reação utilizou-se um modelo de equação de primeira ordem, a ferramenta Solver do Excel ajustou a equação ao gráfico ao variar o valor da constante de velocidade (k). Através desse ajuste obteve-se um valor para a constante de velocidade de primeira ordem e também a soma dos quadrados das distâncias entre os pontos experimentais e os de ajuste.

No Gráfico II e no Gráfico III as concentrações experimentais foram encontradas considerando ε = 15196±1770 L.mol-1.cm-1 na equação de Beer-Lambert.

Gráfico II: Velocidade de hidrólise do PNP para amostra 3 e ajuste de 1ª ordem

Amostra pH K1

1 7,4 1,62E-05

2 7,4 5,08E-05

3 7,4 8,67E-05

4 7,4 7,60E-05

5 10 1,81E-02

6 10 1,88E-02

7 10 1,45E-02

Tabela II: Constantes de velocidade para ajuste de 1ª ordem

Utilizando novamente o Solver fez-se também o ajuste para uma reação de 2ª ordem, que pode ser visto no gráfico abaixo.

0,00E+00

5,00E-06

1,00E-05

1,50E-05

2,00E-05

2,50E-05

3,00E-05

3,50E-05

4,00E-05

0,00 3.000,00 6.000,00 9.000,00 12.000,00

[PN

P]

(M)

Tempo (s)

Velocidade da hidrólise do PNPA

Experimental

Ajuste de 1ª ordem

5

Gráfico III: Velocidade de hidrólise do PNPA para a amostra 3 e ajuste de 2ª ordem

Como a soma dos quadrados das distâncias entre os pontos experimentais e de ajuste para a reação de 1ª ordem é menor do que para a de 2ª ordem, conclui-se que a reação de hidrólise de PNPA a PNP é uma reação de 1ª ordem.

Obteve-se os espectros de fluorescência para a tirosina, o triptofano e a α-quimiotripsina as temperaturas de 25°C e 60°C para os valores de pH 7,4 e 10. Para uma melhor comparação dos resultados juntou-se os espectros a pH 7,4 no Gráfico IV. Para pH 10 os resultados obtidos foram semelhantes aos do pH 7,4.

Gráfico IV: Espectros de Fluorescência da enzima e dos aminoácidos a 25°C e 60°C

A tabela III expressa os valores de λmáx encontrados através da fluorescência. Soluções α-CT Triptofano Tirosina

λmáx a 25°C 337 357 304

λmáx a

60°C 355 357 304

Tabela III: Resultados obtidos a partir dos espectros de fluorescência

Com base nos λmáx obtidos, foram feitas rampas de temperaturas usando fluorescência para as diferentes soluções.

0,00E+00

1,00E-05

2,00E-05

3,00E-05

4,00E-05

0 5000 10000 15000

[PN

P]

(M)

Tempo (s)

Velocidade de hidrólise de PNPA

Ajuste de 2ª ordem

Experimental

0

50

100

150

200

250 290 330 370 410 450 490

Inte

nsi

dad

e (

a.u

.)

Comprimento de onda (nm)

Espectros de Fluorescência a 25°C e 60°C pH = 7,4

a-CT - 2uM - 25°C

Trp - 10uM - 25°C

Trp - 10uM - 60°C

a-CT - 1,4uM - 60°C

Tyr - 10uM - 25°C

Tyr - 10uM- 60°C

6

Gráfico V: Rampa de Temperatura da α-CT e do Trp de 25 a 60°C e de 60 a 25°C

Com base nos pontos obtidos no gráfico acima para a α-CT, foi possível estimar a temperatura de desnaturação e a fração desnaturada utilizando a função distribuição normal como forma de ajuste. Este resultado pode ser visualizado no Gráfico VI.

Gráfico VI: Temperatura de desnaturação e fração desnaturada para a amostra 8

0

20

40

60

80

100

120

140

160

20 30 40 50 60

Inte

nsi

dad

e (

.au

.)

Temperatura

Rampa de Temperatura α-CT 2uM e Trp 10uM pH 7,4

Trp (25°C - 60°C)

Trp (60°C - 25°C)

a-CT (25° - 60°C)

a-CT (60°C - 25°C)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50 60 70

Inte

nsi

dad

e (

a.u

.)

Temperatura (ºC)

Temperatura de desnaturação α-CT 2uM e fração desnaturada pH 7,4

Experimental

Ajuste

Fração desnaturada

7

Gráfico VII: Temperatura de desnaturação e fração desnaturada para a amostra 9

Gráfico VIII: Temperatura de desnaturação e fração desnaturada para a amostra 10

Amostras 8 9 10

pH 7,4 7,4 10

[α-CT] Molar 2,0x10-6 1,0x10-6 1,3x10-6

Temperatura de desnaturação (°C) 47,76 50,45 48,00

% da forma desnaturada a temperatura de

desnaturação (°C)

48,38 52,72 50,88

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50 60 70

Inte

nsi

dad

e (

a.u

.)

Temperatura (°C)

Temperatura de desnaturação α-CT 1uM e fração desnaturada pH 7,4

Ajuste

Experimental

Fração desnaturada

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50 60 70

Inte

nsi

dad

e (

a.u

.)

Temperatura (°C)

Temperatura de desnaturação α-CT 1,3uM e fração desnaturada pH 10

Ajuste

Experimental

Fração desnaturada

8

% desnaturada a 25°C 0,00 0,00 0,00

% desnaturada a 35°C 0,12 0,00 0,05

% desnaturada a 45°C 22,58 7,41 22,49

Tabela IV: Dados obtidos através das rampas de temperatura

Foi feito o estudo da velocidade da hidrólise do PNPA na presença da enzima. Preparou-se soluções com seis concentrações diferentes de PNPA para cada pH a temperaturas predeterminadas e então foi adicionada a enzima. A reação foi acompanhada através de espectrometria de absorção UV/Vis. Com os resultados obtidos, foram construídos gráficos de [PNPA] por tempo para as diferentes soluções, foram considerados os primeiros pontos como pode ser visto abaixo.

Gráfico IX: Velocidade inicial para a hidrólise de PNPA com enzima a temperatura 35°C

Todos os gráficos obtidos apresentaram o mesmo comportamento, mas com velocidades iniciais diferentes, como se pode perceber na Tabela V.

Tabela V: Velocidades iniciais obtidas a diferentes condições de temperatura e pH para seis concentrações de PNPA.

A velocidade inicial corresponde ao valor negativo da inclinação da reta. Utilizando a equação de Michaelis-Menten e os gráficos de velocidade inicial em função da [PNPA] foi possível determinar as constantes k2 e KM.

y = -5,89E-08x + 6,98E-06 R² = 9,98E-01

0,00E+00

2,00E-06

4,00E-06

6,00E-06

8,00E-06

0 20 40 60

[PN

PA

](M

)

Tempo (s)

Velocidade inicial hidrólise PNPA 1,25E-05 M

pH 7,4 35°C com enzima

Experimental

Linear (Experimental)

Amostra 1 pH7,4 25°C Amostra 2 H 7,4 35°C Amostra 3 pH 7,4 45°C Amostra 4 pH 7,4 45°C Amostra 5 pH 10 25°C Amostra 6 pH 10 35°C Amostra 7 pH 10 45°C

[PNPA] Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s)

1,25E-05 5,71E-08 4,14E-08 5,78E-08 7,86E-08 8,53E-08 8,84E-08 1,03E-07

3,00E-05 7,00E-08 5,43E-08 7,97E-08 1,08E-07 7,23E-08 1,50E-07 1,52E-07

6,00E-05 8,25E-08 6,13E-08 1,29E-07 1,31E-07 1,28E-07 6,44E-08 2,21E-07

1,25E-04 8,24E-08 --- 2,00E-07 1,99E-07 1,64E-07 1,52E-07 2,84E-07

2,50E-04 9,28E-08 --- 1,95E-07 1,24E-07 1,81E-07 2,20E-07 3,88E-07

5,00E-04 8,54E-08 6,77E-08 1,98E-07 1,34E-07 2,19E-07 2,28E-07 4,05E-07

9

Gráfico X: Gráfico obtido através da equação de Michaelis–Menten para k2 e KM

Os gráficos para as demais amostras são semelhantes ao anterior, porém os valores de k2 e KM são diferentes. Foi também possível obter a velocidade máxima das reações utilizando a equação de Michaelis-Menten novamente.

Gráfico XI: Gráfico obtido através da equação de Michaelis–Menten para Vmáx

A Tabela VI mostra todos resultados de k2 , KM e Vmáx

Amostra Temperatura

(°C)

pH K2 KM Vmáx

11 25 7,4 1,35E-02 7,49E-06 9,01E-08

12 35 7,4 1,03E-02 8,17E-06 6,86E-08

13 45 7,4 3,00E-02 2,00E-05 2,00E-07

14 45 7,4 2,34E-02 1,08E-05 1,56E-07

0,00E+00

5,00E-08

1,00E-07

1,50E-07

2,00E-07

0,00E+00 1,00E-04 2,00E-04 3,00E-04 4,00E-04 5,00E-04 6,00E-04

Ve

loci

dad

e (

mo

l/s)

[PNPA] (M)

k2 e KM pH 7,4 35oC

Ajuste

Experimental

y = 1,00E+02x + 5,00E+06 R² = 1,00E+00

0,00E+00

3,00E+06

6,00E+06

9,00E+06

1,20E+07

1,50E+07

0,00E+00 2,00E+04 4,00E+04 6,00E+04 8,00E+04 1,00E+05

1 /

V (

s/m

ol)

1 / [PNPA] (mol-1)

Vmax pH 7,4 35o C

Experimental

Linear (Experimental)

10

15 25 10 3,36E-02 4,31E-05 2,24E-07

16 35 10 3,44E-02 3,91E-05 2,28E-07

17 45 10 6,85E-02 6,07E-05 4,46E-07

Tabela VI: Valores de k2, KM e Vmáx para diferentes valores de pH e temperatura

Utilizando os valores de k1 para a reação sem enzima e k2 para a reação com enzima, foi possível descobrir as energias de ativação para pH 7,4 e pH 10. Para tal utilizamos a equação de Arrhenius.

Gráfico XII: Energia de ativação

Descobriu-se que para a reação sem enzima Ea = 61527,09 kJ/M para pH 7,4 e Ea = 8647,05 kJ/M para pH 10. Para a reação com enzima Ea = 22033,35 kJ/M para pH 7,4 e Ea = 27853,48 kJ/M para pH 10.

IV. DISCUSSÃO

A absortividade molar das soluções em pH 7,4 e pH 10 foram diferentes. Isso deve-se ao fato que a valores de pH elevado o grupo hidroxila do PNP pode liberar um próton e ionizar o PNP, dando-lhe uma carga negativa que aumenta a absortividade.

Para a reação sem enzima os valores de k1 em pH 10 são cerca de 1000 vezes maiores do que para pH 7,4. Tal fato ocorre devido a maior quantidade de OH- a pH 10, que chega a ser 800 vezes maior do que em pH 7,4. A reação de hidrólise do PNPA a PNP é dependente do pH, logo como o pH é maior a velocidade da reação aumenta.

De acordo com o Gráfico IV, quanto maior a temperatura menor é a intensidade da fluorescência independentemente do pH. Isso se deve ao fato de que a temperaturas mais elevadas as moléculas podem perder energia de forma não radiativa. Além disso, fica claro que a temperatura de 60°C o λmáx da α-CT se aproxima ao do triptofano. A α-CT possui em sua cadeia polipeptídica resíduos de triptofano, que após a desnaturação são expostos e alteram o λmáx, uma vez que é o principal responsável pela fluorescência dentre os aminoácidos aromáticos que compõem a enzima. Assim a alteração do λmáx é um indicativo da desnaturação da proteína.

Analisando o Gráfico V, observou-se que independentemente do pH a α-CT é desnaturada com o aumento da temperatura e não há renaturação ao retornar a temperatura inicial. Um indicativo desse fato é que a rampa de arrefecimento da α-CT se assemelha a rampa do triptofano. Pelos Gráficos VI, VII e VIII foi possível obter as temperaturas e frações de desnaturação da enzima, não há influência significativa do pH na temperatura de desnaturação. Segundo a literatura [5], era esperado que com o aumento do pH a temperatura de desnaturação fosse menor, devido a ionização da cadeia lateral da tirosina que desestabiliza a estrutura da enzima, porém esse fato não foi observado no experimento. O que pode ser justificado pelo fato da enzima ter um pH ótimo de funcionamento básico e que a ionização da cadeia lateral da tirosina é mais significativa para valores de pH ≥ 10,1 que corresponde ao pKa da tirosina.

Para as reações com enzima, foi verificado que a Vmáx aumenta ao elevar o pH. Entretanto, em pH 10 a velocidade global da reação é maior quando não há enzima. Isso se reflete também nas energias de ativação. A pH 10 há grande quantidade de OH- no meio, de forma que a enzima acaba protegendo o PNPA do ataque da

y = -2,65E+03x + 4,73E+00 R² = 4,70E-01

-5,00E+00

-4,00E+00

-3,00E+00

-2,00E+00

-1,00E+00

0,00E+00

3,12E-03 3,18E-03 3,24E-03 3,30E-03 3,36E-03 3,42E-03

Ln K

2

1 / Temperatura (K-1)

Energia de ativação a pH 7,4

Experimental

Linear (Experimental)

11

hidroxila, pois a velocidade com que a enzima atua no PNPA é muito menor do que a velocidade com que ocorre o ataque da hidroxila.

V. CONCLUSÃO

Percebeu-se que a reação sem enzima é de 1ª ordem. Concluiu-se que o pH não influencia significativamente na temperatura de desnaturação da enzima, e que até a temperatura de 45oC ainda há grande quantidade de enzima na forma nativa, o que possibilita que a reação possa ser catalisada até esse valor de temperatura.

A α-CT é um catalizador eficiente para hidrólise de PNPA em pH 7,4, entretanto a utilização dessa enzima em pH 10 não é interessante.

VI. AGRADECIMENTOS

Agradecemos a Deus pela paciência e graça para realizar este trabalho. Agradecemos aos integrantes dos grupos que disponibilizaram seus dados para nossa pesquisa. Agradecemos a CAPES pela oportunidade de intercâmbio. Agradecemos a Universidade de Coimbra e a professora Maria João pelo auxílio na pesquisa.

VII. BIBLIOGRAFIA

1. Hydrolysis of a Carboxylic Acid Ester: Neutral and Base Enhanced Reaction of p-Nitrophenyl Acetate. Acedido em 02

de Outubro de 2013 em http://web.viu.ca/krogh/chem331/Hydrolysis%20Lab%202006.pdf

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4. Voet, D., Voet, J. (2011). Biochemistry. Hoboken: John Wiley & Sons.

5. Apura J., Mendes M., Uva M., (2012). Estudo da estabilidade da α-quimotripsina numa gama alcalina de pH por

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