Universidade Federal do Rio de Janeiro

Thiago Britto Borges

Caracterização da Cu(I)-ATPase de fígado de

rato e efeito da diabetes mellitus no transporte

ativo do íon cobre

Rio de Janeiro

2012

ii

Thiago Britto Borges

“Caracterização da Cu(I)-ATPase de fígado de rato e efeito da diabetes mellitus no transporte ativo do íon cobre”

Dissertação de Mestrado desenvolvida no Laboratório de Físico-Química Biológica Aída Hassón-Voloch (Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil), sob a orientação da Professora Jennifer Lowe, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica). O apoio financeiro para a realização desta dissertação foi concedido pelas agências de fomento: Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, programa Bolsa Nota 10) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Orientadora: Jennifer Lowe

Rio de Janeiro

2012

BRITTO-BORGES, Thiago

Caracterização da Cu(I)-ATPase de fígado de rato e efeito da diabetes mellitus no transporte ativo do íon cobre. / Thiago Britto Borges. Rio de Janeiro: 2012.

73 páginas, 17 ilustrações e referências da p. 55 a p. 73.

Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas: Biofísica) – Universidade Federal do Rio de Janeiro / IBCCF, 2012.

Orientadora: Jennifer Lowe

1. Cu(I)-ATPase. 2. Cinética enzimática. 3. Diabetes mellitus. 4. Homeostasia do cobre. 5. Insulina.

I. Lowe, Jennifer (Orientadora). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Biofísica. III. Título

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço a minha família, em especial aos meus irmãos (João Victor e João Gabriel, Igor, Flávia e Junior) pela competição saudável (eu ainda sou o mais inteligente ) e aos meus pais (André e Marcia) por manterem uma estrutura familiar razoavelmente estável, que foi essencial para meu amadurecimento.

Gostaria agradecer também a Nadja, minha namorada, pelo diversos auxílios prestados (como me dar foco, corrigir meu português e fazer a sobremesa) e pelos bons momentos.

Agradeço a professora Jennifer, não apenas pelos dois anos de orientação e por fazer um esforço descomunal para me por na linha. Agradeço pela amizade, pelas dicas e pelo convívio agradável e carinho. Agradeço também aos professores Marcelo Einicker-Lamas e o professor Rafael Valverde pelo convívio, amizade e pela força. Agradeço também ao Professor Adalberto Vieyra por ter me aceito no laboratório de Físico-Química Biológica, por ter me corrigido e muito me ensinado. Sem vocês eu não teria ido a lugar algum, obrigado. Agradeço ao pessoal do LFQB, a todos sem distinção. Gostaria de agradecer a uma série de professores, que tiveram diferentes papéis que vieram a convergir no meu amadurecimento científico: ao professor Wagner Dias. à professora Lucienne Morcillo. à professora Débora Foguel. ao professor Paulo Bisch. ao professor Manuel Gustavo. à professora (em breve) Juliana Adão-Novaes. ao professor Rodrigo Fortunato. à professora Claudia Janot. Um agradecimento especial à professora Eleonora Kurtenbach, minha madrinha científica e uma amiga incrível, muito obrigado. Monique Judice por me guiar ao induzir a DM. Ao Stephan por me auxiliar na dosagem de insulina. Agradeço aos membros da banca, ao aceitarem o convite: Wagner Barbosa Dias, Mauro Sola-Penna, Isis Hara Trevenzoli, Alfred Sholl Franco (desculpe pelo trabalho!) e Lucienne da Silva Lara Morcillo.

Agradeço ao pessoal do Instituto de Biofísica: alunos, professores, secretárias e moças da limpeza. Presto um agradecimento especial aos meus colegas de graduação Amanda, André, Camila, Carolina, Eduardo, Elmo, Estefania, Fernando, Frederico, Gabriela, Ivan, Juliana, Luana, Luís Felipe, Mainá, Maíra, Marcelo, Paulo, Pedro, Rafael, Renato, Ricardo, Rodrigo, Sonia e Thaís. Não sei por onde andam muitos de vocês. Entretanto por outros, considero amigos de uma vida inteira. Queria agradecer por ter sido exatamente da forma como foi, valeu! Daniel, Manuela, Thiago e Kissney que em diferentes momentos nos ajudaram durante a graduação e depois, é de vocês que lembro e agradeço, valeu!

Marcelo, Rafa, Rafael, Karine, Milene, Elaine, Luzia, Rose, André, Luiz Fernando, Fernando, Flávio, Nat, Camila, Wendel, Ju, Guilherme, Rodrigo, João, Cris, Ju, Raiane, Fabricio, Pierre, Diego, Filipe, Eduardo, Natália, Re e Stephany. Aos amigos com quem a tempos não tenho contato, desculpem-me pela ausência, sei que vocês entenderão. Possivelmente eu esqueci alguém.

Agradeço a natureza por ser algo tão interessante a ponto de ocupar quase todo meu tempo.

v

I know the pieces fit 'cause I watched them fall away

JONES, A.; CAREY, D.& KEENAN, M.J. da banda Tool

vi

RESUMO

O fígado é responsável pela distribuição e excreção (do excesso) do íon cobre, sendo considerado o órgão mais importante na homeostase deste metal graças à expressão de Atp7b, a Cu(I)-ATPase hepática. Além disso, é também um dos órgãos centrais no metabolismo energético, controlando os níveis sanguíneos de glicose, através da ação de hormônios como insulina e glucagon. Estes hormônios, tendo o fígado como alvo, sinalizam sobre o estado nutricional disparando diferentes vias de sinalização envolvendo cinases (PKA, PKC e tirosina cinase). Estudos recentes do nosso grupo demostraram que a PKA fosforila resíduos específicos modificando o comportamento catalítico da Cu(I)-ATPase de levedura, Ccc2, quando expressa heterologamente em células Sf9 e em frações de membrana enriquecidas com vesículas do complexo de Golgi de hepatócitos porcinos. O presente trabalho tem por objetivo caracterizar a Cu(I)-ATPase de rato, e avaliar a interação entre o metabolismo energético e a homeostase do cobre em um modelo de diabetes mellitus in vivo. Frações de membrana enriquecidas em complexo de Golgi foram obtidas de fígado de ratos Wistar controle e após 14 dias de diabetes mellitus, condição induzida pela injeção intraperitoneal de 65 mg/kg p.c. de estreptozotocina. Os resultados da atividade específica (médias ± desvio padrão) foram medidos pela diferença entre a presença e ausência de 0,3 mM ácido batocuproínodissulfônico (BCS), um quelante de íons Cu(I). O pH ótimo, concentração de BCS, quantidade de proteína e curva de ATP foram determinados mostrando que a liberação máxima de Pi ocorre em pH ácido (5,0 tampão acetato) com 50 µg de proteína e 5 mM de ATP. A atividade Cu(I)-ATPásica foi de 20, 3 ± 8,9 nmol Pi × mg-1 × min-1 (N=9) no grupo controle e 20,0 ± 9,8 nmol Pi × mg-1 × min-1 (N=12) no grupo diabético. Apesar de não haver diferença entre as atividades ATPásica de Atp7b dos fígados de animais controle e de animais diabéticos, ainda há detalhes acerca ao transporte ativo do cobre a serem pesquisados. Múltiplas fosforilações regulatórias em resíduos inibitórios e ativatórios, simultaneamente, explicam a mesma atividade em fígado de animais controle e diabéticos, de modo que não se pode afirmar que não há diferenças de regulação. Além disso, 14 dias talvez não seja tempo suficiente para evolução da doença ou ainda, a localização subcelular da ATPase possa estar alterada, de forma que estudos futuros serão necessários para determinar possíveis mecanismos na interação entre o metabolismo energético e a homeostasia do cobre.

vii

ABSTRACT

The liver is responsible for copper distribution and excretion of its excess, being the most important organ in mammals for copper homeostasis due to the expression of Atp7b, the hepatic Cu(I)-ATPase. Likewise, this organ is also central in energetic metabolism, controlling glucose levels in response to insulin- and glucagon- triggered signaling pathways depending on the nutrition state. These hormones are known for activating different kinase-mediated pathways that includes PKA, PKC and tyrosine kinases. Recent studies of our group demonstrated that PKA phosphorylates specific residues that modifies catalytic behavior of yeast Cu(I)-ATPase when heterologously expressed in a Sf9 cells and in pig liver enriched Golgi membrane fractions. The present work focuses not only in rat Cu(I)-ATPase characterization, but seek also to further understanding of an in vivo animal model of interaction between energetic metabolism and copper homeostasis, that was demonstrated in

vitro. Golgi-enriched membrane fractions were obtained from Wistar rat liver of control and 14 days diabetic animals, induced by 65 mg/kg streptozotocin intraperitoneal injection Cu(I)-ATPase specific activity was evaluated by release of Pi from ATP. The results (means ± standard deviation) were obtained by the difference in the absence and presence of 0.3 M bathocuproinedisulfonic acid (BCS), a specific Cu(I) chelator. Optimal pH, BCS concentration, protein amount and ATP curve were determined, showing that the maximum Pi release was obtained in acidic pH (5.0) with 50 mg of total protein and 5 mM of ATP. The Cu(I)-ATPase activity for control group was 20.3 ± 8.9 nmol Pi × mg-1 × min-1 (N=9) and diabetic group 20.0 ± 9.8 nmol Pi × mg-1 × min-1 (N=12). Atp7b is a P-type ATPase, responsible for active copper transport to the lumen of trans-Golgi network. In vitro studies shows that insulin is responsible for stimulation of Atp7b activity and therefore the kinases-mediated regulatory phosphorylations are being studied in this in vivo model. The absence of difference between control and diabetic Cu(I)ATPase activity indicates that there is a counterbalancing regulatory mechanism maintaining basal levels of ATP hydrolysis or that the 14 days pathology is not enough to modify Atp7b behavior. One last hypothesis concerns in Atp7b traffics being truncate in diabetes mellitus. Future perspectives rely in researching liver molecular mechanistic understandings and its cellular localization in this pathogenesis.

viii

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1. DISTRIBUIÇÃO DAS CU(I)-ATPASES EM HUMANOS. ................................................. 14 FIGURA 2. OS PRINCIPAIS DESTINOS CELULARES DO COBRE EM CÉLULAS HUMANAS. ................ 16 FIGURA 3. ESTRUTURA ESQUEMÁTICA DE ATP7B. ..................................................................... 19 FIGURA 4. A FUNÇÃO DE ATP7B, A CU(I)-ATPASE DE FÍGADO NOS MAMÍFEROS....................... 23 FIGURA 5. ESTRUTURA CELULAR E MICROAMBIENTE DOS HEPATÓCITOS.. ................................. 29 FIGURA 6. DESENHO EXPERIMENTAL. ....................................................................................... 37 FIGURA 7. ATIVIDADE CU(I)-ATPÁSICA DAS FRAÇÕES DE MEMBRANA DE RATOS CT MOSTRA

UM PADRÃO LINEAR ATÉ 50 ΜG DE PROTEÍNA POR TUBO.. .................................................. 44 FIGURA 8. ATIVIDADE CU(I)-ATPÁSICA EM DIFERENTES TAMPÕES REVELAM HIDRÓLISE

MÁXIMA EM PH 5,0 (TAMPÃO ACETATO).. .......................................................................... 45 FIGURA 9. ÁCIDO BATOCUPROÍNODISSULFÔNICO INIBE A HIDRÓLISE DE ATP DE UMA FORMA

DOSE DEPENDENTE. A HIDRÓLISE DE ATP FOI REALIZADA COM TAMPÃO ACETATO (PH

5,0), A 37ºC POR 10 MIN. .................................................................................................... 47 FIGURA 10. MASSA CORPÓREA ANTES E DEPOIS DA INDUÇÃO DA DM.. ..................................... 48 FIGURA 11. ÍNDICE GLICÊMICO ANTES E APÓS A INDUÇÃO DA DM.. .......................................... 49 FIGURA 12. DIMINUIÇÃO DA INSULINA CIRCULANTE NOS ANIMAIS DM CONFIRMA

HIPOINSULINEMIA... ........................................................................................................... 50 FIGURA 13. ÍNDICE HEPÁTICO ................................................................................................... 51 FIGURA 14.HIPOINSULINEMIA INDUZ A ATIVIDADE DE PKA NO FÍGADO.. ................................. 53 FIGURA 15. PRESENÇA DA PKA EM PREPARAÇÕES DE MEMBRANA DE RATOS CT E DM.. ......... 53 FIGURA 16. ATIVIDADE CU(I)-ATPÁSICA DE FRAÇÕES DE MEMBRANA DE RATO CT E DM NÃO

APRESENTAM DIFERENÇA.. ................................................................................................. 54 FIGURA 17. FLUXOGRAMA DE CONCLUSÕES.. ............................................................................ 63

ix

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AGE – (advanced glication end-products) produtos de glicação avançados AMPc – adenosina monofosfato cíclico ATP – adenosina trifosfato Atp7a – enzima Cu(I)-ATPase humana relacionada com a doença de Menkes ATP7A – gene que codifica Atp7a Atp7b – enzima Cu(I)-ATPase humana relacionada com a doença de Wilson ATP7B – gene que codifica Atp7b BCS – ácido batocuproínodissulfônico BSA – (bovine serum albulmine) albumina de soro bovino Ccc2 – enzima Cu(I)-ATPase de Saccharomyces cerevisiae DM – diabetes mellitus DTT – ditiotreitol DMT – (divalent metal transporter) – transportador de metais divalentes DPM/DP – desvio padrão da média/desvio padrão ×g – vezes a força da gravidade MOPS – ácido 3-[N-morpholino]propanosulfônico MRC – meio de reação comum NAD(P)H – Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reduzido Na

+,K

+-ATPase – Sódio, potássio-ATPase

PI3K – fosfatidilinisitol-3-cinase PKA – proteína cinase dependente de AMPc PMCA – Ca2+-ATPase de membrana plasmática RI – receptor de insulina RAGE – (advanced glication end-products receptors) receptor de produtos de glicação avançados SDS – dodecil sulfato sódio TCA – ácido tricloroacético TETA – trietilenotetramina

x

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ........................................................................................................... iv

RESUMO ................................................................................................................................. vi

ABSTRACT ............................................................................................................................ vii

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ............................................................................................... viii

LISTA DE ABREVIAÇÕES .................................................................................................. ix

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 11

1.1. O ÁTOMO COBRE E SUAS PROPRIEDADES QUÍMICAS ..................................................... 11 1.2. HOMEOSTASE DO COBRE EM HUMANOS ....................................................................... 13 1.3. ESTRUTURA, MECANISMO E REGULAÇÃO DE ATP7B .................................................... 18 1.4. DOENÇAS RELACIONADAS AO METABOLISMO DO COBRE: DOENÇAS DE WILSON E DE

MENKES ................................................................................................................................. 24 1.5. O FÍGADO E SUA UNIDADE FUNCIONAL, O HEPATÓCITO ............................................... 26 1.6. INSULINA: SÍNTESE E AÇÃO .......................................................................................... 28 1.7. A DIABETES MELLITUS .................................................................................................. 32 1.8. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 34

2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 35

3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 36

3.1. REAGENTES ................................................................................................................. 36 3.2. INDUÇÃO DE DM ......................................................................................................... 36 3.3. PREPARAÇÃO DAS FRAÇÕES DE MICROSSOMAS ........................................................... 38 3.4. DOSAGEM DE PROTEÍNAS TOTAIS PELO MÉTODO DE LOWRY MODIFICADO .................. 39 3.5. DOSAGEM DE INSULINA NO SORO DOS ANIMAIS ........................................................... 39 3.6. IMUNODETECÇÃO POR SDS-PAGE SEGUIDO DE WESTERN BLOTTING .......................... 40 3.7. ATIVIDADE CU(I)-ATPÁSICA ...................................................................................... 40 3.8. ATIVIDADE DA PKA .................................................................................................... 42 3.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................. 42

4. RESULTADOS ................................................................................................................ 43

4.1. CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE CU(I)-ATPÁSICA ................................................... 43 4.2. INDUÇÃO DE DM ......................................................................................................... 46 4.3. MODULAÇÃO DA PKA PELA INSULINA ........................................................................ 52 4.4. ATIVIDADE CU(I)-ATPÁSICA DE FÍGADO DE RATOS DM E CT .................................... 52

5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 55

REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 64

11

1. INTRODUÇÃO

1.1. O átomo cobre e suas propriedades químicas

O cobre é um metal de transição que além de estar presente na natureza em sua forma

inorgânica, também é encontrado na matéria viva, independente do grau de complexidade e

etapa de evolução (CUILLEL, 2009). Em mamíferos, este metal é classificado como elemento

traço essencial. Essa classificação se deve às características químicas do elemento e às

propriedades biológicas que delas emergem. O cobre, assim como o ferro, transita facilmente

entre diferentes estados de oxidação (Cu(I) e Cu(II) no ambiente celular), por sua grande

capacidade de transferir, tanto doar quanto receber, elétrons em reações de oxirredução. Em

seu estado metálico, sua distribuição eletrônica no orbital d (4s2 3d9) é incompleta, o que o

caracteriza como metal de transição (KAIM & RALL, 1996). No estado padrão, o cobre tem

os potenciais de oxirredução mais próximo de zero, como nas reações:

Cu(I) + e- ↔ Cu (0,52 V, no estado padrão)

Cu(II) + e- ↔ Cu(I) (0,153 V, no estado padrão)

Já que a energia necessária para as transições é muito próxima ao zero, a frequência

com que ocorrem é alta. Desta forma, a natureza priorizou os chamados centros de ferro e/ou

cobre em enzimas que possuem atividade oxirredutora (Tabela 1). Essas enzimas são críticas

para vida na presença de oxigênio (O2), tornando a deficiência do cobre um destino inviável –

o que acontece na doença de Menkes, que será descrita em tópico 1.4. Por isso, o cobre é

classificado como elemento essencial. No entanto, o mesmo cobre (em excesso) catalisa

reações de oxirredução em cascata, que geram radicais livres de forma inespecífica e

desregulada, culminando na inativação – via oxidação – de lipídios, proteínas e ácidos

nucleicos (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1984).

12

Tabela 1. Cuproenzimas essenciais. Relação entre as enzimas que necessitam do cobre em sua estrutura e a sua função nos organismos em que são expressas. (Modificado de TAPIEIRO et al., 2003)

13

O excesso do íon cobre é observado na doença de Wilson, que pode levar à morte por

deficiência hepática se não for devidamente tratada. Já os organismos com conteúdo corporal

do cobre na faixa da normalidade possuem quase nenhum cobre citoplasmático livre (RAE et

al., 1999). Além disso, a força da evolução priorizou os sistemas biológicos que pudessem

diferenciar os estados de oxidação de diversos metais (LEWINSON et al., 2009),

possibilitando a captação dos metais essenciais e inibindo a entrada inespecífica de metais

tóxicos. Concluindo, em sistemas biológicos o papel do cobre é antagônico: essencial em

baixas concentrações, entretanto deletério em excesso (KAIM & RALL, 1996).

1.2. Homeostase do cobre em humanos

A homeostase do cobre é compreendida pela absorção, distribuição, armazenamento e

excreção do metal (FIGURA 1). A recomendação de ingestão do cobre é de 1,5 a 3,0 mg/dia,

para um adulto, do quais 50% são absorvidos pelo sistema digestório (TAPIERO et al., 2003).

A absorção do cobre varia com diversos fatores e é diminuída com a ingestão de outros

cátions divalentes, antioxidantes (como a vitamina C) e fibras. Se a absorção do cobre

aumentar, a excreção também aumentará. A absorção ocorre prioritariamente no intestino

delgado. Duas hipóteses acerca do mecanismo de transporte entre lúmen do intestino e o

enterócito ainda são controversas, pois ainda não foi identificada a proteína responsável por

este transporte (ARREDONDO et al., 2003; MARYON et al,. 2007; WEISS et al., 2008;

ZIMNICKA et al., 2011). Uma das possibilidades, e a mais aceita atualmente, é que a difusão

do Cu(II) seja facilitada por transportadores passivos de cátions divalentes (como Dmt1),

presentes na membrana de borda em escova (apical) dos enterócitos (ARREDONDO et al.,

2003).

Dentro do enterócito, duas outras proteínas são essenciais para o fenômeno de

absorção do metal: Ctr1 e Atp7a. Ambas são enzimas transportadoras de Cu(I), sendo Ctr1

14

Figura 1. Distribuição das Cu(I)-ATPases em humanos. Atp7a é expressa em quase todos os tecidos, com exceção do fígado. Esta enzima está envolvida com a absorção intestinal do cobre e na entrega do mesmo as cuproenzimas recém-sintetizadas. Já a Atp7b (hepática) é responsável pela excreção do excesso do metal no organismo. Alguns tecidos, como o renal, pulmonar e mamário, placentar e cardíaco, expressam as duas proteínas. CP: ceruloplasmina. Adaptado de Lutsenko et al., 2007.

15

um transportador passivo encontrado na membrana basolateral do enterócito (KAPLAN &

LUTSENKO, 2009). Já a Atp7a é um transportador ativo de Cu(I), responsável pela secreção

desse metal por exocitose. Atravessando a membrana basolateral do enterócito, o cobre ganha

a corrente sanguínea e chega ao fígado pela veia porta. Esse órgão é central na homeostase do

cobre, uma vez que está envolvido tanto no armazenamento e distribuição, como na excreção

do metal.

O armazenamento do cobre acontece no fígado, mas também no intestino e em outros

orgãos (LUTSENKO et al., 2007). Ao entrar no citosol, ao menos metade do metal é

rapidamente fixado pela glutationa e por metalotioneínas (TAPIERO et al., 2003), peptídeos e

proteínas de baixo peso molecular, ricos em cisteínas. Outra fração do cobre é quelado por

metalochaperonas1. Em mamíferos, existem três metalochaperonas que se diferenciam pelo

subcompartimento (FIGURA 2) ao qual irão endereçar o metal, possuindo estruturas

exclusivas (BANCI et al,. 2009). A Cox17 é responsável pela entrega na mitocôndria

(BANCI et al., 2008), onde o cobre será adicionado à citocromo c oxidase e participará da

respiração celular. Ccs é outra metalochaperona que garante a entrega do cobre à Sod1

(BROWN et al., 2004) para participar da manutenção do nível fisiológico de espécies reativas

de oxigênio. Já Atox1 endereça o cobre para a região trans do complexo de Golgi, onde o

metal será adicionado à estrutura de diversas proteínas (TABELA 1). Atox1 entrega

diretamente o metal para as Cu(I)-ATPases, os transportadores ativos de Cu(I), os quais, por

sua vez, possuem altíssima afinidade pelo metal (HILÁRIO-SOUZA et al., 2011) e realizam

seu transporte contra o gradiente eletroquímico do cobre à custa da hidrólise de uma molécula

de ATP. Em humanos são expressas duas Cu(I)-ATPases: Atp7a e Atp7b,que tiveram seus

1 As chaperonas são uma família de proteínas responsáveis pelo correto enovelamento proteíco. Já metalochaperonas é um termo genérico para proteínas cuja função é quelar metais, sendo os quelantes biológicos dos mesmos (ROBINSON & WINGE, 2010).

16

Figura 2. Os principais destinos celulares do cobre em células humanas. Após entrar na célula pelo transportador passivo Ctr1, o metal possui três destinos subcelulares: (1) será carreado até a mitocôndria pela Cox17 e participará da respiração celular quando incorporado à estrutura da citocromo c oxidase (Cco); (2) Graças à metalochaperona Ccs, é disponibilizado para a superóxido dismutase, a qual é responsável por controlar o excesso de espécies reativas de oxigênio; (3) o cobre é entregue, pela metalochaperona Atox1, ao complexo de Golgi onde é ativamente transportado por Atp7a ou Atp7b e para incorporado em diferentes cuproproteínas (TABELA 1), dependendo do tipo celular.

17

genes descritos durante a década de 90 (ATP7A: CHELLY et al., 1993; MERCER et al.,

1993; VULPE et al., 1993; ATP7B: REED et al., 1995; WU et al., 1994). Apesar da alta

homologia estrutural, estas ATPases possuem funções independentes e complementares:

enquanto a Atp7a é necessária para a entrada do cobre nos órgãos, a Atp7b está relacionada à

distribuição do metal e à excreção do eventual excesso do cobre no organismo, através da

bile.

No fígado, Atp7b garante que a ceruloplasmina receba 6 a 7 íons cobre durante sua

síntese. Essa proteína carreia 80% do cobre sérico, sendo a fonte deste metal em todo o corpo.

Além de servir de fonte do metal, essa proteína extracelular detém atividade peroxidase, neste

ponto a homeostasia dos íons cobre e ferro se sobrepõe e converge: a ceruloplasmina é

necessária para a oxidação do íon Fe+2 (ferro ferroso) em Fe+3 (ferro férrico), processo

essencial para sua incorporação na transferrina (LEYENDECKER et al., 2011).

A excreção do cobre é tida como ponto chave na regulação do seu nível corpóreo

(TURNLUND et al., 1989). É neste ponto que o mecanismo se ajusta de modo a manter a

quantidade corpórea do cobre no limiar entre o tóxico e o essencial. A secreção do metal na

bile torna o fígado o principal órgão na homeostase deste metal. O evento é totalmente

dependente da enzima Atp7b (HERNANDEZ et al., 2008), a qual também é necessária para a

saída do metal no cérebro. Outros órgãos como rim, glândulas salivares e sudoríparas também

excretam o metal, mas em menores quantidades (LUTSENKO et al., 2007).

A homeostase intracelular do cobre é mantida por um sistema de elementos em rede,

com vias conectadas entre si (LUTSENKO, 2010), além de ser determinada por um gradiente

de afinidade ao metal (BANCI et al., 2010). A afinidade das cuproproteínas pelo o cobre é

crescente, de modo que a afinidade de Ctr1 é < afinidade das metalochaperonas < afinidade

18

das Cu(I)-ATPases < afinidade nas cuproenzimas. Dessa forma, o metal é diretamente

direcionado por um fluxo de afinidades. Além disso, a função das duas ATPases

transportadoras é considerada o principal ponto de controle da homeostase do cobre, devido a

sua especificidade no transporte de Cu(I) e não possuindo substituto com função redundante

(LUTSENKO et al., 2007). A ausência da função destas enzimas leva a sérios distúrbios

como os observados nas doenças de Menkes e Wilson.

1.3. Estrutura, mecanismo e regulação de Atp7b

As ATPases que formam um intermediário fosfo-enzima, acoplando a translocação de

cátions através de compartimentos celulares à hidrólise de ATP são denominadas ATPases do

tipo P (ou P-ATPases). A subfamília responsável pelo transporte de metais pesados estão

agrupadas no grupo I das P-ATPases (LUTSENKO & KAPLAN, 1995) e dentro deste as

Cu(I)-ATPases são classificadas como do grupo B. Atp7b é então classificada com uma P1B-

ATPase responsável pelo transporte do cobre em mamíferos. Esta enzima, de 148,3 kDa,

possui oito hélices transmembrana, uma região N-terminal que apresenta papel regulatório,

dotada de 6 domínios de ligação de metal (região consenso com o motivo CxxC, onde x é um

aminoácido qualquer, LUTSENKO et al., 2007). O fenômeno de transporte ocorre graças a

três domínios com funções preservadas entre as P-ATPases: domínio N, domínio P e domínio

A (FIGURA 3). O ciclo catalítico se dá pela transição entre 4 estados em que a enzima possui

diferentes propriedades

19

Lúmen do Golgi

Citoplasma

Figura 3. Estrutura esquemática de Atp7b. Domínios de ligação do metal (1-6) na região N-terminal de Atp7b, que está conformacionalmente próxima aos domínios citoplasmáticos da enzima, podendo modular a sua função. Cilindros representam as oito hélices transmembrana. Domínio A (atuador) responsável pela etapa de hidrólise do ciclo catalítico. Domínio N (nucleotídeo) região de coordenação da molécula de ATP. Domínio P (fosforilável) contém o ácido aspártico presente em todas as ATPases do tipo P. (retirado de LUTSENKO et al., 2010)

20

(FATEMI & SARKAR, 2002). No estado inicial, Atp7b possui alta afinidade pelo metal em

seu sítio de transporte, que é formado por diversos aminoácidos das hélices transmembrana,

mas principalmente pelo motivo CPC (LOWE et al., 2004). Com o metal ocluído entre as

hélices transmembranares, o ATP coordenado no domínio N se aproxima do domínio P que

possui o ácido aspártico invariante nas P-ATPases, que no caso de Atp7b humana é a Asp1027

e assim este aminoácido é auto-fosforilado. Na etapa seguinte o intermediário fosfo-enzima é

nomeado de composto de alta energia, devido o acúmulo de energia química. Esta energia é

necessária para o transporte contra gradiente eletroquímico do Cu(I), e é armazenada na

ligação acilfosfato (entre o Asp1027e o fosfato-γ proveniente do ATP). Concomitante com a

translocação do cátion para o lúmen do complexo de Golgi a energia da ligação acilfosfato

decaí e este intermediário é denominado fosfo-enzima de baixa energia. Este intermediário é

suscetível a autodesfosforilação pelo domínio A. Após a desfosforilação a enzima retorna para

etapa inicial, pronta para realizar um novo ciclo catalítico (LOWE et al., 2004).

Diversas formas de regulação pós-traducional são conhecidas, modificando funções

enzimáticas de modo que podem até alterar o destino celular (HUBER & HARDIN, 2004).

Dentre as modificações mais comuns estão: acetilação, fosforilação, glicosilação, proteólise,

ubiquitinação, entre outras (WALSH et al., 2005). Estas modificações são responsáveis por

alterar a função de enzimas e outras proteínas modificando (a) localização subcelular, (b)

meia vida funcional e (c) afinidade por substratos e outros ligantes. Os principais pontos de

controle da homeostase celular do cobre são as modificações pós-traducionais nos

transportadores passivos Ctr1 e Ctr2 e nos transportadores ativos Atp7a e Atp7b (VAN DEN

BERGHE & KLOMP, 2010). Apesar da única modificação pós-traducional relatada no banco

21

de dados Universal Protein Resource (UniProt2) ser a fosforilação regulatória, existem relatos

da ubiquitinação de Atp7b (DE BIE et al,. 2007). Esta modificação está relacionada com a

estabilidade do transportador, diminuindo sua meia vida funcional por aumentar a sua taxa da

degradação proteassomal. Essa degradação está relacionada às mutações em resíduos críticos

para estrutura terciária de Atp7b, que levariam a sua retenção no retículo endoplasmático e

baixa tráfego para complexo de Golgi (DE BIE et al,. 2007). Outras modificações não

covalentes, como interações proteína-proteína alteram a função e estruturadas Cu(I)-ATPases.

Diversos parceiros já foram determinados para Atp7b, alguns transientes e outros interagindo

de modo mais duradouro. Atox1, uma das metalochaperonas intracelulares do cobre, entrega o

metal diretamente a Atp7b no Golgi, sendo então a interação entre estas proteínas essencial

para translocação do cobre do citoplasma para o complexo de Golgi (WALKER et al., 2002).

Essa parceria se deve a interação proteína-proteína que acontece entre Atox1 e o N-terminal

de Atp7b, que garante que o Cu(I) seja endereçado diretamente ao complexo de Golgi, após

entrar na célula. Outra classe de proteínas, que modulam a atividade de Atp7b, são as

glutaredoxinas, que mantém os grupamentos tióis das cisteínas em seu estado reduzido, de

forma que estes grupamentos (presentes no N-terminal de Atp7a, Atp7b e diversas outras

cuproproteínas) possam coordenar o Cu(I) (LIM et al., 2006). Uma terceira proteína que

interage com Atp7b e vem chamando a atenção de pesquisadores por ainda não possuir

função conhecida, além de participar da homeostase do cobre, é a COMMD1 (VONK et al.,

2011). Sabe-se apenas que esta proteína liga cobre e que esta ligação está aumentada em casos

que há mutações relacionadas à doença de Wilson, sugerindo que COMMD1 esteja

relacionada com a estabilidade de Atp7b (DE BIE et al,. 2007). A modulação de função

fisiológica das Cu(I)-ATPases mais bem compreendida é sua resposta adaptativa ao aumento

do cobre intracelular que induz o relocalização subcelular da enzima para permitir a retirada 2http://www.uniprot.org/uniprot/Q9QUG4 acessado em 15 de fevereiro de 2012.

22

de excesso de metal pesado da célula (FIGURA 4). Já foi demonstrado que Atp7a também

migra para a região perimembranar de macrófagos em resposta à hipóxia (WHITE et al.,

2009) levando a um aumento na atividade bactericida destas células. Além disso, insulina e

estrogênio aumentam a expressão de Atp7a, estimulando seu tráfego para a membrana

plasmática. Em contrapartida, esses hormônios diminuem a expressão de Atp7b e a retém no

complexo de Golgi (HARDMAN et al., 2007) em células placentárias. Nestas células

polarizadas, ambas Atp7a e Atp7b são expressas, sendo a primeira responsável pelo

suprimento de cobre no feto em desenvolvimento, enquanto Atp7b elimina o excesso do

metal, retornando-o para circulação maternal. Então este tipo celular é um bom exemplo de

como as funções de Atp7a e Atp7b são complementares no corpo humano, protegendo-o dos

efeitos deletérios, mas garantindo a quantidade necessária para sua incorporação nas

cuproproteínas.

Atualmente, o evento de fosforilação regulatória vem sendo estudado para um melhor

entendimento da regulação da Cu(I)-ATPase hepática. Esse evento consiste na transferência

do fosfato-γ (terminal) da molécula de ATP para a cadeia lateral de um resíduo de serina,

treonina ou tirosina da proteína alvo, por uma proteína cinase (SHABB, 2001). Esta

fosforilação é denominada uma ligação do tipo éster-fosfato, diferente da ligação acil-fosfato

que ocorre durante o ciclo catalítico de todas as ATPases do tipo P, em um resíduo de

aspartato. Alguns resíduos de Atp7b foram identificados como fosforiláveis por cinases,

através de métodos de espectrometria de massas: Ser478, Ser481, Ser1121 e Ser1453

(PILANKATTA et al., 2009). O mesmo grupo sugeriu, em outro trabalho, que a proteína

cinase D (PKD) seria responsável por essa fosforilação, e que ela regularia o tráfego da

ATPase (PILANKATTA et al., 2011). Outro grupo (BARTEE et al., 2009) identificou outros

23

Figura 4. A função de Atp7b, a Cu(I)-ATPase de fígado nos mamíferos. Esta enzima, em condições normais (Cu↓), transporta o cobre para a região trans do complexo de Golgi, onde o metal será adicionado à ceruloplasmina, que por sua vez será secretada no sangue e o distribuirá pelo corpo. Com o aumento da concentração do cobre citosólico (Cu↑), a proteína é endereçada para vesículas periapicais. Após este evento adaptativo, a enzima possuí uma nova função fisiológica: secretar o metal para o canalículo biliar, excretando-o. Modificado de SHERLOCK & DOOLEY, 2002.

24

três resíduos possivelmente fosforiláveis por uma cinase presa à membrana, todos na região

N-terminal da enzima. Um deles é próximo a primeira hélice transmembrana, a Ser653,

estruturalmente equivalente ao Ser258 de Ccc2, a Cu(I)-ATPase de leveduras, identificada por

Valverde e colaboradores (2008).

Projetos desenvolvidos por nosso grupo já demonstram que há fosforilação direta em

Ccc2, por PKA, sugerindo um papel fisiológico para esta regulação (VALVERDE et al.,

2011). Após identificar resíduos fosforilados, demonstramos que esta fosforilação altera o

ciclo catalítico da enzima e propomos uma hierarquia entre a fosforilação dos diferentes

resíduos (VALVERDE et al., 2008). Demonstramos também que a PKA inibe a atividade

ATPásica de Atp7b de fígado de porco, alterando a afinidade do íon cobre (HILÁRIO-

SOUZA et al,. 2011) e que a insulina, através da inibição da PKA, estimula a atividade da

enzima (HILÁRIO-SOUZA, resultados não publicados). Nosso grupo também vem

investigando quais isoformas de PKC ativáveis por éster de forbol estimulam a atividade

ATPásica da Cu(I)-ATPase de fígado de porco (CARDOSO, resultados não publicados).

1.4. Doenças relacionadas ao metabolismo do cobre: doenças de Wilson e de Menkes

A doença de Wilson (número no banco de dados OMIM3 2779004) é uma desordem

monogênica, que altera o metabolismo do cobre. Historicamente, a doença foi descrita como

uma “desordem familiar” que culmina na cirrose hepática e distúrbios neurológicos como

psicose e “parkisonismo” (HARADA, 2002). Ela é causada por mutações no gene de ATP7B

que codifica a proteína de Wilson (Atp7b ou WND). Esta doença causa acúmulo excessivo do

cobre no fígado e em outros órgãos, como o cérebro, que leva a cirrose hepática e distúrbios

neurológicos como citado acima, além disso, há deficiência na síntese de ceruloplasmina. 3 Extenso banco de dados de fenótipos de doenças herdadas da universidade de Johns Hopkins. 4http://www.omim.org/entry/277900 acessado em 22 de fevereiro de 2012.

25

O gene ATP7B está localizado no cromossomo 13, e já foram catalogadas 1119

mutações causadoras de doença para este gene5. Apesar de pouca relação genótipo-fenótipo

(BURKHEAD et al., 2011), algumas destas mutações são mais recorrentes e melhor

estudadas, como o caso da His1069Gln (HARADA, 2002), encontrada em indivíduos de

origem europeia e que leva à diminuição da meia vida funcional da enzima (PAYNE et al.,

1998) e a localização subcelular anormal (HUSTER et al., 2003). A pouca relação entre as

mutações encontradas e os achados clínicos se devem, provavelmente, a fatores ambientais

(GUPTA et al., 2011) e processos celulares ainda não identificados. A prevalência dessa

doença autossômica recessiva é 1:30.000, mas o número de portadores de mutações pode

chegar a 1 em cada 90 indivíduos (SHERLOCK & DOOLEY, 2002). Considerando que uma

fração dos portadores de Wilson são assintomáticos, testes genéticos não são confirmatórios

(devido a grande quantidade de mutações ainda não relacionadas aos estados patológicos).

Para um diagnóstico ideal, um conjunto de testes é requerido, entre eles quantificação do

cobre hepático (biópsia), determinação de ceruloplasmina e cobre séricos, e mais

recentemente testes radiométricos (PENG el al., 2011). Os anéis de Kayser-Fleischer,

depósitos do metal em torno da córnea, são indicadores clássicos dos casos neurológicos de

doença de Wilson (LUTSENKO et al., 2010). A doença de Wilson não tratada é fatal, pois o

dano no fígado é irreversível (CATANA & MEDICI, 2012). Entre os tratamentos

recomendados estão os quelantes d-penicilamina e trietina (que levam ao aumento da

excreção urinária do cobre) e ingestão de acetato de zinco (que, por competição, diminui a

absorção do cobre ingerido) (SHERLOCK & DOOLEY, 2002).

5http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/database.asp acessado em 4 de janeiro de 2012.

26

A doença de Menkes (OMIN 3094006) é um distúrbio genético recessivo. Nessa

doença o gene ATP7A (ou MNK), presente no cromossomo X, está mutado. Essas mutações

refletem na perda da função de Atp7a e por consequência a perda de atividade das

cuproenzimas. Sem a atividade destas enzimas, diversos são os sintomas observados:

neurodegeneração, estrutura capilar anormal, aneurismas vasculares e tromboses. Em geral, o

portador da doença de Menkes morre nos primeiros anos de vida.

Tanto Atp7a quanto Atp7b são P-ATPases de metais pesados, com 54% de homologia

de sequência primária e extrema similaridade funcional. Ambos os transportadores do cobre

são necessários para a entrega do metal no seu destino final. Entretanto, as doenças de

Menkes e Wilson são essencialmente distintas, sendo a doença de Wilson caracterizada pelo

excesso do metal e a doença de Menkes pela falta de cobre. A simples deficiência do cobre,

causada pela baixa ingestão ou excesso de quelação do metal, leva a sintomas distintos da

doença de Menkes: anemia e disfunção hepática (HARADA et al., 2011). Isso demonstra que

existem detalhes da homeostasia do cobre que ainda não são compreendidos. Além disso,

pouco se sabe sobre a expressão diferencial dos genes ATP7A e ATP7B em humanos. Já foi

constatado que Atp7b de fígado e rim possuem diferenças estruturais que alteram sua

regulação e tráfego (BARNES et al., 2009) e que Atp7b é uma isoforma especificamente

expressa na pineal, tendo propriedades cinéticas diferentes da isoforma hepática (BORJIGIN

et al., 1999).

1.5. O fígado e sua unidade funcional, o hepatócito

Visão macroscópica:

6http://www.omim.org/entry/309400 acessado em 22 de fevereiro de 2012.

27

O fígado é um órgão vital e o maior órgão interno do corpo humano, pesando

aproximadamente 1,3 kg, cerca de 1/50 do peso de um adulto. Possui uma enorme diversidade

funcional, tendo mais de 500 funções bioquímicas diferentes, o que impossibilita sua

substituição por substitutos artificiais existentes (DING & SHI, 2011). Situa-se no quadrante

superior esquerdo do abdômen, estando aderido à superfície exterior do diafragma.

Anatomicamente, o órgão é dividido em quatro lobos, dois principais (direito e esquerdo) e

dois na face posterior (caudado e quadrado). O direito (maior) e esquerdo são unidos pelo

ligamento falciforme que pode ser observado da visão anterior. A vesícula biliar é um órgão

anexo ao fígado e armazena a bile (ROBBINS et al., 2000), um fluido complexo que

transporta, inclusive, diversas substâncias tóxicas, metabolizadas e transformadas no fígado,

para que sejam excretadas nas fezes. A bile também auxilia a digestão, já que forma sais

biliares capazes de emulsificar lipídios, facilitando sua absorção (ZSEMBERY et al., 2000).

Este órgão é altamente vascularizado, sendo constituído por um sistema de veias, cuja

veia porta é a principal, e outro de artérias, cuja artéria hepática é a principal. Tanto veia porta

como a artéria hepática são responsáveis pelo aporte de nutrientes, oxigênio e substâncias que

serão metabolizadas e excretadas pelo fígado. O fígado ainda é o responsável pelo

metabolismo de glicose (e armazenamento de glicogênio), metabolismo de aminoácidos,

síntese de ácidos graxos, metabolismo de lipoproteínas, algumas proteínas séricas importantes

(albumina, proteínas da cascata de coagulação, entre outras), armazenamento de vitaminas A,

B12 e D. O fígado também é capaz de produzir hormônios e autacóides, sendo considerada a

maior glândula do corpo (SHERLOCK & DOOLEY, 2002).

Visão microscópica

28

O hepatócito é a unidade funcional do fígado (FIGURA 5). Este tipo celular mede

cerca de 30 µm e organiza-se em camadas, onde os espaços não ocupados por estas células

estão ocupados por vasos e tecido conjuntivo (KUNTZ & KUNTZ, 2008). Entre as

membranas plasmáticas de hepatócitos vizinhos, pequenos sulcos são formados, o que dá

origem ao lúmen do canalículo biliar. Estas membranas recebem o nome de membrana apical

e possuem constituintes distintos da membrana basolateral (SUTHERLAND el al., 1988).

Assim, os sulcos entre diferentes camadas de hepatócitos através do fígado formam um de

sistema de túbulos denominado os canalículos biliares. Outra célula que participa da gênese

da bile são os colangiócitos, que são as células epiteliais destes canalículos biliares.

Hernandez e colaboradores (2006) relatam que Atp7b é detectada nas junções do tipo apertada

da membrana apical de hepatócitos, o que facilitaria o transporte de cobre do hepatócito para

o lúmen do canalículo, tendo em vista que a junções do tipo apertada permitem que

hepatócitos vizinhos permaneçam unidos, ao entorno do canalículo biliar. Não há relatos da

participação dos colangiócitos na excreção do cobre.

1.6. Insulina: síntese e ação

A insulina é um hormônio peptídico central no metabolismo energético (PLUM et al.,

2006). Mais especificamente, a insulina é responsável por sinalizar a síntese de glicogênio no

fígado, músculo e tecido adiposo, o que acontece no estado de saciedade onde o anabolismo e

os mecanismos de reserva energética são ativados.

Este hormônio é sintetizado como pré-proinsulina, nas células β das ilhotas de

Langerhans do pâncreas. O pré-hormônio é constituído pelas cadeias A, B, C e do peptídeo

sinal, totalizando 110 aminoácidos (STEINER et al., 1967). Depois de traduzida, a pré-

29

Figura 5. Estrutura celular e microambiente dos hepatócitos. O canalículo biliar é formado entre os hepatócitos de uma mesma camada. Acima do hepatócito: tecido endotelial e células estelares hepáticas (responsáveis pela sustentação do parênquima hepático), logo abaixo estão os sinusóides região vascular entre as camadas de hepatócitos, onde se encontram as células de Kupfer (macrófagos locais). Espaço de Disse é o pequeno espaço entre o sinusóides e hepatócito, o qual contém fibras reticulares. Modificado de SHERLOCK & DOOLEY, 2002.

30

proinsulina é carreada até o retículo endoplasmático, onde o peptídeo sinal é excisado por

proteólise. No retículo, a proinsulina terá sua conformação nativa estabelecida, graças às

duasligações dissulfeto entre as cadeias A e B (KATSOYANNIS, 1966). Finalmente, a

proinsulina sofre a última etapa para sua maturação: a dupla clivagem da cadeia C, liberando

o peptídeo C (33 resíduos) e a insulina (51 resíduos). A proconvertase e carboxipeptidase são

famílias de enzimas que catalisam a quebra do pró-hormônio em resíduos específicos, um dos

passos limitantes para a síntese da insulina em sua forma ativa. A expressão dos genes de

ambas as enzimas é diretamente proporcional ao nível sérico de glicose, assim como a

tradução do mRNA da insulina. Logo após sua síntese, a insulina é secretada em grânulos e

chega à corrente sanguínea (GUEST et al., 2002).

A secreção de insulina é iniciada com aumento da concentração de glicose sérica

(MALAISSE et al., 1967). Este evento normalmente acontece após a alimentação e absorção

dos nutrientes. O mecanismo sensor dos níveis séricos de glicose é detido pela mesma célula

que sintetiza a insulina, a célula β. Nela a glicose é transportada pelo transportador passivo

Glut2 e, depois de internalizada, a glicose é fosforilada à glicose-6-fosfato pela glicocinase. O

aumento desse substrato leva à elevação dos níveis celulares de ATP e NAD(P)H, que

inativam canais de potássio e ativam canais de cálcio, elevando os níveis intracelulares de

Ca2+, o que dispara a exocitose dos grânulos contendo insulina. Já se sabe que a via adenilato-

ciclase-cAMP-PKA também está envolvida neste evento, assim como a via fosfolipase-

fosfoinositídio (DING & GROMADA, 1997).

Os efeitos da insulina no corpo são amplos e afetam diversos órgãos. Aqui o foco será

para os efeitos no hepatócito devido às vias de sinalização desencadeadas pela ativação do

receptor de insulina (RI). Este receptor é um tetrâmero constituído de duas subunidades α e

duas subunidades β (MCKERN et al., 2006). As subunidades α são menores e se encontram

31

no exterior da célula. As subunidades β possuem uma pequena região extracelular (194

resíduos), uma região que funciona de âncora na membrana plasmática (23 resíduos), e uma

grande região citoplasmática (403 resíduos) responsável pela sinalização. Sendo da família

dos receptores tirosina cinase, quando o ligante interage com as subunidades α no exterior da

célula, o receptor altera sua conformação estrutural para um estado ativado que desencadeia

diversas reações intracelulares (MCKERN et al., 2006).

Os efeitos da ativação do RI são observados em diferentes compartimentos

subcelulares: membrana plasmática, citoplasma e núcleo. O complexo insulina-RI permite

que o receptor se autofosforile em 3 resíduos de tirosina na porção intracelular das cadeias β

(GAMMELTOFT & VAN OBBERGHEN, 1986). Com esses três resíduos fosforilados, há o

recrutamento dos substratos do receptor de insulina (SRI), que por sua vez são fosforilados

em tirosinas específicas. Os fosfoSRI servem como âncoras para proteínas adaptadoras. Essas,

por sua vez, possibilitarão diversos eventos em cascatas: ativação de proteínas cinases,

proteínas fosfatases, proteínas G e canais iônicos. O evento em si não apenas dependerá do

tipo celular, mas também das proteínas expressas antes da ativação. A cascata clássica

descrita para sinalização via insulina-RI é através da fosfatidilinisitol-3-cinase (PI3K). Essa

enzima fosforila lipídios derivados do inositol (como fosfatidilinositol-4-5-bifosfato e

fosfatidilinositol-4-fosfato) que por sua vez ativam a proteína cinase B, também conhecida

como AKT. Outra via ativada pelo complexo insulina-IR é a das fosfodiesterases. Esta via é

conhecida por diminuir a concentração de monofosfatocíclico de adenosina (AMPc) e, por sua

vez, a atividade da proteína cinase dependente de AMPc (PKA, HOUSLAY &

MARCHMONT, 1981).

32

O efeito celular da insulina é finalizado quando o hormônio é inativado por enzimas

que desfazem a ligação dissulfeto entre as cadeias A e B ou quando é internalizado

juntamente com seu receptor (KNUTSON et al., 1983).

1.7. A diabetes mellitus

A diabetes mellitus (DM) é um complexo distúrbio do metabolismo energético (SAMUEL &

SHULMAN, 2012) que atinge 5,2% da população adulta brasileira (MENDES et al., 2011). O

metabolismo energético é o somatório de diversas reações bioquímicas que geram um fluxo

de energia nos organismos. Essas reações podem ser divididas em dois grupos: catabólicas

(degradação para obtenção de energia) e anabólicas (uso de energia e blocos formadores para

síntese de novos compostos).

Em humanos, diversos hormônios modulam estas reações nos diferentes tecidos e

orgãos. A sinalização por insulina é o eixo afetado na DM. Existem 4 tipos diferentes,

categorizados por sua etiologia7:

DM tipo 1: Causada pela destruição das células β do pâncreas, o que acarreta em

deficiência na síntese e/ou liberação de insulina. Essa incapacidade é de causa autoimune

ou idiopática. Pode ser corretamente diagnosticada pela dosagem do peptídeo C sérico (o

peptídeo que é clivado para maturação do hormônio), que está diminuído na DM do tipo 1.

DM tipo 2: A elevação crônica dos níveis de açúcar leva a uma produção massiva de

insulina, e os altos índices do hormônio leva, por sua vez, a uma dessensibilização dos RI.

Esse tipo de doença é a diabetes mais comum e geralmente encontrado em pessoas obesas

e sendo considerado um grave problema da saúde moderna.

7Segundo a World Health Organization. http://www.staff.ncl.ac.uk/philip.home/who_dmc.htm acessado em 25 de abril de 2012.

33

Diabetes gestacional: elevação da glicemia em mulheres grávidas, geralmente o que ocorre

em mulheres que possuem pré-disposição para acometimento por DM do tipo 2.

Outros tipos específicos de diabetes: Esse tipo de DM tem causa bem conhecida e

englobam os casos genéticos de hiperglicemia crônica como resultado de defeitos nos

genes do RI ou cânceres nas células β.

Defeitos genéticos nas células β pancreáticas;

Defeitos genéticos nos RI;

Endocrinopatias;

Infecção viral no pâncreas;

Outras síndromes (como a síndrome de Down);

Induzida por drogas;

Todas têm como principal problema a hiperglicemia crônica que acelera o processo de

glicação inespecífica e causa anormalidades vasculares e bioquímicas (PEPPA et al., 2003). A

principal causa de morte é microvasculopatia renal, porém sintomas como retionapatia e

neuropatia são observados no estágio avançado da doença. O mecanismo molecular pelo qual

a hiperglicemia crônica leva a estas doenças e até à morte, se não tratada, ainda é discutido

(SINGH et al., 2012). Parece ser a formação de proteínas glicadas que leva ao aparecimento

da maioria dos danos causado durante a doença. A oxidação e glicação inespecífica, devido à

inflamação e hiperglicemia, geram produtos de glicação avançados (AGE do inglês advanced

glication end-products) que ativam receptores específicos (RAGE). A ativação da via AGE-

RAGE já é associada com não apenas os sintomas da DM, mas também com sua causa e

desenvolvimento (RAMASAMY et al., 2011).

34

1.8. Justificativa

Apesar da noção do envolvimento dos metais de transição na DM, o exato papel de

Atp7b e do próprio cobre nessa doença ainda são discutidos. Dois trabalhos na década 80

mostraram o acúmulo de metais pesados (cobre ferro e zinco) no fígado e o aumento da sua

excreção renal em animais acometidos por DM induzida por estreptozotocina (LAU &

FAILLA, 1984). O aumento da excreção urinária do cobre e seu conteúdo hepático são

revertidos com insulina, demonstrando que este hormônio é capaz de modular algum ponto na

homeostase deste metal. Ainda, o mesmo grupo determinou a cinética do acúmulo dos metais

no fígado, rim e duodeno de ratos diabéticos. Os dados apresentados mostram que a partir de

sete dias de DM o conteúdo de cobre já se mostra aumentado no fígado e rim, enquanto o

nível no duodeno se mostra inalterado até 28 dias, tempo máximo observado (FAILLA &

KISER, 1983). Outros relatos sucederam, observando a quantidade de cobre sérico aumentada

em pacientes acometidos por DM do tipo 2 (WALTER et al., 1991), levando um desbalanço

no equilíbrio redox destes pacientes. Como ainda restam dúvidas se a homeostasia de cobre

acelera (ou desacelera) as DM e como o íon cobre poderia estar atuando nessa fisiopatologia.

Além disso, é possível que a sinalização por insulina tenha influência direta na homeostasia

de cobre, tendo em vista que este hormônio é capaz de modular a atividade da Cu(I)-ATPase

de fígado porcino (HILÁRIO-SOUZA, resultados não publicados). Então a necessidade da

compreensão da regulação da atividade Cu(I)-ATPásica hepática justifica esta dissertação de

mestrado. Assim como a melhor compressão molecular das DM.

35

2. OBJETIVOS

Walter e colaboradores (1991) hipotetizaram que alterações na homeostasia do cobre

contribuiriam no avanço da DM. Entretanto nenhum mecanismo molecular foi proposto até o

momento. Assim, o objetivo geral deste trabalho é a caracterização da Cu(I)-ATPase de

fígado de rato para investigar se a insulina regula, in vivo, o transporte ativo do íon cobre no

fígado. Para tal, os seguintes objetivos específicos foram estabelecidos:

Obter os parâmetros cinéticos para Cu(I)-ATPase de fígado de rato, estabelecendo as

condições ótimas para determinação da atividade enzimática, tais como pH, quantidade de

proteína e concentração de quelante de cobre (BCS).

Identificar as proteínas presentes nas frações de membrana enriquecidas em vesículas

de complexo de Golgi, principalmente Atp7b e PKA.

Investigar se há alterações no transporte ativo do cobre em ratos diabéticos, tendo em

vista o acúmulo desse metal no fígado e possível relação com a DM (LAU & FAILLA, 1984).

36

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Reagentes

Soluções, inibidores de protease e ATP foram comprados da Sigma Aldrich. Ureia,

DTT, Tampão Mes, Bis-tris propano e Trizma base foram obtidos da Merck. A membrana de

nitrocelulose, ECLTM e anticorpos secundários são da empresa GE Healthcare. PKAi5-24 foi

obtido da Calbiochem. Anticorpo anti-subunidade catalítica da PKA foi comprado da Santa

Cruz (código H95, contra subunidade catalítica da PKA humana). 32Pi foi obtido pelo

Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares e adicionado ao ADP (MAIA et al., 1983) para

obter o (γ-32Pi)ATP. O (γ-32Pi)ATP já marcado é proveniente da Perkin Elmer. Os animais

foram obtidos de criadouro comercial, devidamente regulamentado pelos órgãos competentes.

3.2. Indução de DM

A metodologia aqui descrita foi aprovada pela Comissão de Ética com Animais de

Experimentação do CCS (CEUA-CCS), cujo número de protocolo é IBCCF122. Ratos Wistar

com 250 g (e em torno de dez semanas) foram randomicamente separados em gaiolas de três

animais. Alimentados com água e ração padrão ad libitum, os animais permaneceram sobre

ciclo claro-escuro (12h-12h), foram acondicionados em condições controladas de temperatura

(20ºC) e com ar da sala renovado de 4 em 4 h (FIGURA 6).

A DM foi induzida por injeção intraperitoneal de estreptozotocina 65 mg por kg

corpóreo, este e outros protocolos foram discutidos por Wu & Huan (2008). Dois grupos

experimentais foram determinados: diabetes mellitus (DM) e controle (CT). A injeção se deu

no dia 0 e, enquanto os animais DM receberam 65 mg/kg de estreptozotocina, os animais CT

receberam apenas 0,5 mL de veículo (4,5 M tampão citrato, pH 4,5). A água dos animais foi

suplementada com sacarose 10% por 24 h após a injeção, de modo a proteger estes animais da

37

Figura 6. Desenho experimental. Protocolo aprovado pela Comissão de Ética com Animais de Experimentação do CCS (CEUA-CCS) IBCCF122.

38

onda de insulina proporcionada pela necrose das células β do pâncreas. Todos os animais

tiveram peso e glicemia acompanhados desde a seleção. A glicemia em jejum de 6 h foi

medida por método da gota caudal utilizando kit comercial (medidor de glicose Johnson &

Johnson OneTouch® Ultra). Nenhum animal teve de ser sacrificado antes do 14º dia por

apresentar perda de peso maior que 30% do peso inicial.

3.3. Preparação das frações de microssomas

Os animais foram sacrificados por decapitação, após jejum de 8 h, medição de

glicemia e peso, os fígados foram excisados cirurgicamente e devidamente pesados e o sangue

colhido e congelado para uso posterior (-20ºC). Os fígados foram pesados e o índice hepático

foi calculado da seguinte maneira: peso do órgão dividido pelo peso corporal do animal antes

do sacrifício. Para a obtenção de microssomas que são sabidamente frações de membrana

enriquecidas em complexo de Golgi, foi modificada a preparação fígado de porco, já

estabelecida no laboratório (HILÁRIO-SOUZA et al., 2011). A preparação de fígado de ratos

foi otimizada e descrita pela primeira vez nesta dissertação. Os fígados foram fatiados e

homogeneizados em 1,5 vol. de tampão de homogeneização gelado [250 mM sacarose, 20

mM Hepes–Tris pH 7.6, 5 mM MgCl2, 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e 0,15

mg/mL inibidor de tripsina]. Todas as homogeneizações (vinte percursos completos)

aconteceram em homogeneizadores do tipo Potter, à 4ºC, após a poterização o

homogeneizado total sofreu uma série de centrifugações, para que a fração de membrana

enriquecida com vesículas de complexo de Golgi fosse obtida. A primeira centrifugação foi

de 10000 ×g por 10 min (rotor SS-34 SORVAL), para que os debris e agregados fossem

sedimentados. Em seguida, o sobrenadante foi reservado e o sedimento foi poterizado e sofreu

nova centrifugação (10000 ×g, por 10 min, em rotor SS-34 SORVAL). Os sobrenadantes da

primeira e segunda centrifugação foram unidos, poterizados e centrifugados a 100000 ×g por

39

1 h (rotor 45Ti, BECKMAN, à 4ºC). O sedimento obtido foi poterizado novamente, para

garantir a homogeneidade das frações de membrana, e centrifugado (100000 ×g por 1 h rotor

45Ti BECKMAN, 4ºC), pela última vez. O sedimento da última centrifugação, que contém

marcadores específicos do complexo de Golgi (HILÁRIO-SOUZA et al., 2011) foi

ressuspenso por poterização em tampão de estocagem [100 mM tampão ácido 3-(N-

morfolino)-propanossulfónico(ou Mops)-KOH (pH 7,0), 40% glicerol (v/v) e 5 mM DTT] e

estocado em N2 líquido (aproximadamente -200ºC) até o momento do uso.

3.4. Dosagem de proteínas totais pelo método de Lowry modificado

As proteínas totais presentes nas frações de membranas foram dosadas segundo o

método de Lowry (LOWRY et al,. 1951), modificado para melhor solubilização das proteínas

de membrana, com a adição de 1% SDS (m/v). Albumina comercial foi utilizada para curva

de calibração (0, 10, 50, 100, 200 e 300 μg). O padrão e as amostras foram analisados no

espectrofotômetro (HITACHI U-2001) à 660 nm.

3.5. Dosagem de insulina no soro dos animais

O soro dos animais foi colhido após o sacrifício e congelado (-20ºC) até o ensaio. A

insulina sérica foi dosada por radioimunoensaio utilizando kit comercial (MP Biomedicals,

número de catálogo 07260102) de acordo com as instruções do fabricante. Este kit foi

gentilmente cedido pelo professor Rodrigo Fortunato e utilizado com o auxilio do aluno

Stephan Frankenfeld, do Laboratório de Fisiologia Endócrina Doris Rosenthal, chefiado pela

professora Denise Pires de Carvalho. A 125iodo-insulina deslocada pela insulina da amostra foi

dosada em espectrômetro gama (Contador gama Wallac1470 Wizard).

40

3.6. Imunodetecção por SDS-PAGE seguido de western blotting

Sessenta ou trinta µg de proteína total foram separados por SDS-PAGE (10%) e

transferidos para uma membrana de PVDF pré-ativada com metanol. A membrana contendo

as proteínas de interesse foi bloqueada com 5% de leite em pó desnatado comercial (sem

cálcio excedente). Em seguida, incubou-se o anticorpo primário monoclonal para PKA

(diluição 1:5000) por aproximadamente 16 horas (overnight), à 4ºC, diluído em TBS-T (salina

tamponada com tris e contendo 1% tween 20) e 5% de leite desnatado. A membrana sofreu

três lavagens de 5 minutos com TBS-T e em seguida foi incubada, por 1 hora, com o

anticorpo secundário (1:10000 anticorpo anti-cadeia pesada de coelho, gerado em coelho).

Após a última incubação, a membrana foi lavada, por três vezes, de 5 minutos, com TBS-T, à

temperatura ambiente. Em seguida, revelou-se a membrana em filme fotográfico utilizando o

sistema ECLTM. Para detectar a Atp7b utilizou-se o anticorpo anti-Atp7b humana (Santa Cruz,

H20 diluições 1:1000, 1:5000 e 1:10000) e anti-Cu(I)-ATPase de levedura (a enzima Ccc2,

marca: Neosystem, França, diluição 1:4000).

3.7. Atividade Cu(I)-ATPásica

A atividade ATPásica foi medida seguindo o método de Fiske & Subbarow (1925)

para medição do Pi liberado durante o ciclo catalítico, modificado para detectar atividade

Cu(I)-ATPásica em concentrações residuais do cobre no meio de reação (LOWE et al., 2004).

Para determinar os parâmetros ótimos desta atividade um parâmetro enzimático (em análise)

era variado, enquanto os outros permaneciam fixos. Melhores condições refletem máxima

hidrólise específica, isto é, nas menores quantidades possíveis de cobre e antes da saturação

que acontecem quando há enzima ou substrato em excesso. Nesta dissertação os parâmetros

analisados foram: quantidade de proteína, pH, curva do quelante de cobre, BCS. A

41

temperatura (37ºC) e tempo (linear de 1 a 30 min) já haviam sido determinados pelo aluno de

iniciação científica Felipe Gomes. Cinquenta µg de proteína total foram incubados em 200 µL

de meio de reação comum (TABELA 2) por 30 minutos, no gelo. A reação foi disparada pela

adição de 50 µL de 5 mM ATP e permaneceu durante 10 min, à 37ºC. Após este tempo, a

reação foi parada com 2,125 mL de uma mistura contendo 5% ácido tricloroacético (TCA) e

27 mM molibdato de amônio. Após a parada, a solução redutora (0,2% 1-amino-2naftol-4-

ácido sulfônico, 1,2% sulfito de sódio e 2,4% bissulfito de sódio) foi adicionada. O conteúdo

de fosfato inorgânico varia linearmente com a intensidade do azul formado e pode ser medido

pelo espectrofotômetro (Hitachi U-2001), no comprimento de 660 nm. A diferença entre a

condição A (atividade ATPásica total) e B (atividade ATPásica Cu(I)-dependente) resulta na

atividade Cu(I)-ATPásica de Atp7b do fígado de rato. A não ser onde diferentemente

indicado, os parâmetros utilizados são: pH 5,0, 10 min, 37ºC, 50 µg de proteína total, 300 µM

de ácido batocuproínodissulfônico (BCS) e 5 mM de ATP.

Composto Concentração

Acetato (pH 5,0) 20 mM

K2SO4 100 mM

MgSO4 10 mM

NaN3 100 mM NaF 10 mM

Glicerol 4% Ascorbato (Cond A) 100 µM

Na2SO3 (Cond A) 1 mM

BCS (Cond B) 300 µM

Tabela 2. Componente do meio de reação do experimento de atividade ATPásica. Atentar que os ascorbato e Na2SO3 só estão presentes na condição de atividade total (condição A, azul) e o ácido batocuproínodissulfônico (BCS) só está presente na condição Cu(I)-dependente (condição B, rosa).

42

3.8. Atividade da PKA

Cem µg de proteína total foram incubados na presença de histonas 2B (CABRAL et

al., 2007), o substrato clássico da PKA, em um meio contendo 10 mM MgSO4 e 50 mM

Mops-KOH. A reação foi iniciada pela adição de 100 µM de [γ-32P]ATP (4,5 µCi/nmol de

ATP), à 30ºC. A reação foi terminada, após 10 min, com a adição de 100 µL TCA (50% m/v).

Em seguida, o conteúdo foi filtrado em membranas de celulose (poros 0,45 µm) e lavados

com 8 mL de TCA (20% m/v) e 2 mL de tampão fosfato 0,2 M. O 32P incorporado às histonas

foi medido por cintilação líquida (Perkin Elmer). A atividade específica de PKA foi obtida

pela diferença entre atividade cinásica total e atividade cinásica na presença de 200 nM do

inibidor específico PKAi5-24.

3.9. Análise estatística

Os experimentos foram realizados em triplicatas e cada número amostral (N)

representa um animal diferente. Os testes utilizados foram o teste t de Student (análise de uma

condição contra o controle), quando mais de uma condição foi analisada utilizou-se o teste

Anova de uma via com os pós-teste de Bonferroni (análise de diversas condições entre si) e de

Dunnett (análise de diversas condições contra o controle). Foi estabelecido P < 0,05 como

estatisticamente significativo. Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão

da média (DPM).

43

4. RESULTADOS

4.1. Caracterização da atividade Cu(I)-ATPásica

Para determinar a atividade Cu(I)-ATPásica em frações de membrana de ratos DM e

CT, primeiramente tivemos que estabelecer os parâmetros cinéticos para dosar a atividade

enzimáticos da Atp7b presente nestas frações de membrana. O primeiro parâmetro analisado

foi a curva de Pi hidrolisado, a partir do ATP em quantidades crescentes de proteína total

(FIGURA 7), que foi ensaiada por 10 min na presença de 250 µM de BCS e pH 7,2 (Mops).

Observa-se que, até 50 µg, a quantidade de Pi liberado é crescente e linear. A partir de 100

µg a região de saturação é alcançada e a quantidade de Pi liberado tende a uma constante com

o aumento da quantidade de proteína total. Para ensaio em estado estacionário é desejável que

não haja saturação da reação enzimática, de modo que a quantidade de 50 µg de proteína total

foi escolhida para os experimentos subsequentes.

Para identificar o ambiente de máxima hidrólise de ATP realizou-se o ensaio de

atividade Cu(I)-ATPásica em diferentes pHs, utilizando tampões que melhor se ajustassem

àquela faixa de pH (FIGURA 8). Os pH/tampões escolhidos foram: 0,5 M de acetato para o

pH 5,0, 0,25M Mes-KOH para o pH 6,0, 0,25 M de Mops-KOH para pH 7,0 e 8,0 e 0,25 M

de Tris-HCl para pH 9,0. As taxas de hidrólise Cu(I)-ATPásica puderam ser agrupadas em 3

grupos: máximas (pH 5,0), médias (pH 6, pH 7,5 e pH 8,0) e mínimas (pH 7,0 e pH 9,0). Para

os ensaios seguintes o tampão acetato (pH 5,0) foi utilizado. Dez minutos de tempo de reação

foram utilizados por estar na parte linear da curva. A linearidade foi obtida até 30 min.

Para determinar a atividade hidrolítica especificamente relacionada ao transporte do

cobre, foi utilizado o quelante específico de Cu(I): BCS, como descrito em Lowe e

44

Figura 7. Atividade Cu(I)-ATPásica das frações de membrana de ratos CT mostra um padrão

linear até 50 μg de proteína por tubo. A atividade foi calculada pela diferença entre a atividade total e a atividade Cu(I)-dependente variando-se a quantidade de proteína. O volume final de cada tubo era de 250 μL. Por conta da baixa atividade o desvio padrão foi omitido neste resultado (N = 3).

45

Figura 8. Atividade Cu(I)-ATPásica em diferentes tampões revelam hidrólise máxima em pH 5,0

(tampão acetato). A atividade ATPásica foi ensaiada em diferentes tampões: 0,5 M de acetato para o pH 5,0; 0,25M Mes-KOH para o pH 6,0; 0,25 M de Mops-KOH para pH 7,0 a 8,0;0,25 M de Tris-HCl para pH 9,0 (Média ± D.P , pH 5,0 N = 9; pH 6,0 N = 9; pH 7,0 N = 9; pH 7,5 N = 8; pH 8,0 N = 9; pH 9,0 N = 10; ANOVA com pós-teste de Bonferroni e P < 0,05). Letras iguais acima das barras representam valores estatisticamente iguais.

46

colaboradores (2004). A capacidade deste quelante em diminuir a atividade Cu(I)-ATPásica é

mostrada na Figura 9.

A presença de um antioxidante (ascorbato) e um agente redutor (Na2SO3) estimula a

atividade Cu(I)-ATPásica, que é inibida pela adição de BCS, tendo o IC50 calculado em 89

µM de BCS. 300 µM foi a quantidade determinada para inibir o processo de transporte do

cobre, inibindo especificamente a Cu(I)-ATPase hepática, Atp7b na presença de 5 mM de

ATP.

4.2. Indução de DM

Os animais foram acompanhados semanalmente tendo suas massas medidas como

forma de mensurar seu crescimento (FIGURA 10). Os animais CT apresentaram crescimento

adequado, com variação de peso positiva (peso inicial – peso final = 25,84g ± 10,28). Os

animais DM apresentaram variação de peso negativa (-44,75 g ± 18,77, diferente do controle

P < 0,01). Os níveis de glicose sérica também foram acompanhados, juntamente com aferição

da massa corpórea. O valor limite máximo do aparelho de aferição de glicose é 600 mg/dL,

muito além da média dos animais controle (78,44 ± 10,56 mg/dL contra 560,92 ± 69,54

mg/dL do DM). Dois dias após a injeção de estreptozotocina já se observa hiperglicemia nos

animais DM (FIGURA 11).

No dia do sacrifício, o sangue colhido foi utilizado para medir a concentração sérica

de insulina em jejum de oito horas (FIGURA 12). Neste dia, os animais DM apresentavam

hipoinsulinemia DM 11,27 ± 3,40 µU/mL (CT 59,04 ± 29,65 µU/mL). Além disso, o índice

hepático (FIGURA 13) confirma hipertrofia hepática (DM = 0,0354, CT = 0,0457, P < 0,01),

contrariando a perda de peso dos animais DM. Estes dados confirmam que a indução da DM

Figura 9. Ácido batocuproínodissulfônico inibe a hidrólise de ATP de uma forma dose

dependente. A hidrólise de ATP foi realizada com tampão acetato (pH 5,0), a 37ºC por 10 min.

Condição A possui antioxidante (ascorbato) e agente redutor (Na2SO3) para garantir que o cobre

presente na amostra esteja no estado Cu(I). Concentrações crescentes de BCS diminuem a atividade

Cu(I)-ATPásica (N = 3 média ± E.P), a curva de inibição está representada no inset do gráfico. O

valor do IC50 encontrado foi de 89 μM de BCS.

48

Figura 10. Massa corpórea antes e depois da indução da DM. No dia 0, os animais DM sofreram injeção de 65 mg/kg de estreptozotocina intraperitoneal, enquanto os animais CT receberam veículo. Não há diferença entre as médias, neste tempo de DM, entretanto observa-se uma tendência dos animais DM perderem massa (Média ± D.P, DM N = 12, CT N = 9). A variação de massa (massa inicial – massa final) por outro lado é diferente e estatisticamente significativa (Média ± D.P, DM N = 12, CT N = 9, P < 0,01 teste T).

49

Figura 11. Índice glicêmico antes e após a indução da DM. Os animais sofreram injeções no dia 0. Dois dias após a indução da DM já se pode detectar hiperglicemia nos animais DM que se mantem até o dia do sacrifício. Atentar para o limite superior do aparelho que mede a glicose no método da gota caudal: 600 mg/dL. O boxplot foi utilizado de forma que se possa acompanhar a dispersão dos dados, a linha mais próxima a zero representa o 1º quartil (25%), a segunda linha representa o 2º quartil (ou mediana) e a linha superior representa o 3º quartil (75%). (DM N = 12, CT N = 9).

50

Figura 12. Diminuição da insulina circulante nos animais DM confirma hipoinsulinemia. O soro dos animais foi obtido logo após o sacrifício e as células foram sedimentadas por centrifugação e a insulina sérica foi medida por radioimunoensaio (CT N = 3, DM N – 6, P < 0,01 test t-Student).

51

Figura 13. Índice hepático. O índice hepático é a razão entre o peso do fígado (g) e peso corpóreo (g). Apesar de não haver diferenças entre as massas dos animais, a relação massa do fígado: massa total está aumentada nos animais DM (média ± D.P.M, DM N = 12, CT N = 9, P < 0,01 teste t-Student).

52

pela injeção com estreptozotocina gera hipoinsulinemia com alteração tanto macroscópica

(índice hepático) como ao nível molecular (hipoinsulinemia).

4.3. Modulação da PKA pela insulina

Testando a hipótese de que a hipoinsulinemia altera a atividade PKA endógena das

frações de membrana de fígados de ratos CT e DM utilizou-se o método de fosforilação de

histonas (FIGURA 14). A atividade média da PKA (na ausência e presença do peptídeo

inibidor específico) proveniente de fígado de ratos DM é 3 vezes maior que a de ratos CT.

Entretanto, um número amostral maior é necessário para sair do campo especulativo e

alcançar a significância estatística. Para confirmar a presença da PKA ancorada nestas frações

de membrana foi imunodetectada uma banda de 34 kDa referente a subunidade catalítica desta

proteína cinase (FIGURA 15).

4.4. Atividade Cu(I)-ATPásica de fígado de ratos DM e CT

Finalmente, mediu-se a atividade Cu(I)-ATPásica de frações de membrana

proveniente de fígado de ratos DM e CT na condições pH 5,0 (tampão acetato), 10 min, 37ºC,

50 µg de proteína total, 300 µM de BCS e 5 mM de ATP. Não há diferença estatística

(FIGURA 16) entre a atividade Cu(I)-ATPásica de frações de membrana de fígado de ratos

CT (20,3 ± 8,9 nmol Pi × mg-1 × min-1, N=9) e DM (20,0 ± 9,8 nmol Pi × mg-1 × min-1,

N=12).

53

Figura 14 Hipoinsulinemia induz a atividade de PKA no fígado. Atividades da PKA presente em preparações de membranas de fígado de rato CT e DM foram testadas quanto a sua capacidade em fosforilar histonas. Observa-se que média da atividade da PKA de fígado de rato DM é 3 vezes maior que a atividade no controle (média de 4 experimentos ± D.P.M.).

Figura 15 Presença da PKA em preparações de membrana de ratos CT e DM.A banda de aproximadamente 34 kDa pode ser imunodetectada em frações de membrana CT e DM separadas por SDS-PAGE e reconhecidas em Western blotting com anticorpo específico para subunidade catalítica de PKA.

34 kDa

54

Figura 16. Atividade Cu(I)-ATPásica de frações de membrana de rato CT e DM não apresentam

diferença.A atividade foi realizada em tampão acetato (pH 5,0), 50 µg de proteína, à 37ºC, durante 10 min e 5 mM de ATP. A atividade total foi subtraída da atividade Cu(I)-dependente (300 µM BCS) para estimar atividade Cu(I)-ATPásica específica (Média ± D.P. de CT N = 9, DM N = 12).

55

5. DISCUSSÃO

O cobre é um bioelemento que só teve sua relevância discutida, em termos biológicos,

nos últimos trinta anos (KAIM & RALL, 1996). Diferente das doenças relacionadas com a

deficiência de ferro (anemias), as doenças relacionadas à homeostase de cobre são

negligenciadas, de modo que a genética dos transportadores de cobre só foi desvendada no

meio da década de noventa e até hoje não foram determinados ligantes que atuem modulando

a homeostasia deste metal. A relação entre homeostasia do cobre e diversos outros processos

patológicos e fisiológicos vem aumentando nos últimos anos (FONTAINE et al., 2010), de

modo que já entende-se que o papel do transportadores ativos de cobre vão além das

fisiopatologias de Menkes e Wilson, mas em processos como angiogênese, câncer,

hipertensão e doenças neurodegenerativas. O uso de modelos biológicos vivos é interessante

para determinar, com o uso conjunto de hormônios ou inibidores farmacológicos de vias de

sinalização, como é, de fato, o mecanismo molecular que responde a alterações em processos

patológicos, como nas doenças de Menkes e Wilson, mas também no câncer, na doença de

Alzheimer e na diabetes mellitus.

Para investigar a modulação de Atp7b é essencial a determinação dos parâmetros

cinéticos para dosagem da taxa de hidrólise de ATP, de modo que a fração sensível ao

quelante de Cu(I) (BCS) é diretamente proporcional a atividade Cu(I)-ATPásica de fígado de

rato. A presença de antioxidante (ascorbato) e agente redutor (Na2SO3) estimula a atividade

Cu(I)-ATPásica (FIGURA 9, condição A), mostrando que quantidades mínimas

contaminantes do cobre, presentes na água e tampões, podem ser reduzidas a Cu(I) (mesmo

em um ambiente na presença de oxigênio), em comparação a condição sem BCS (FIGURA 9,

segundo ponto, sem outras adições). Um empecilho ao se trabalhar com Cu(I)-ATPases é o N-

terminal regulatório, que pode afetar a afinidade aparente por cobre, nestas enzimas. Há

56

relatos que quando todos os domínios ligadores de metal estão associados ao cobre, a

atividade da enzima está reduzida. Quanto ao pH, mostra-se que enzimas ortólogas possuem

propriedades enzimáticas distintas, já que tanto a Atp7b de fígado de porco (HILÁRIO-

SOUZA, 2011) como Ccc2, a Cu(I)-ATPase de Saccharomyces cerevisiae (LOWE et al.,

2004), tem sua atividade máxima em pH fisiológico (pH 7,2). Estudos de Takeda et al.,

(1999) demonstraram que a Cu(I)-ATPase de fígado de camundongo possuí pH ótimo em 5,0,

como em nosso modelo em rato, sugerindo uma similaridade em roedores. Concentrações

acima de 50 µg de proteína levam a altas taxas de hidrólise de ATP, não apenas por Atp7b,

mas por outras ATPases. Assim, nas condições em 10 min, 50 µg de proteína total e pH 5,0

(tampão acetato) pode-se maximizar a hidrólise de ATP, sem atingir pontos de saturação ou

esgotamento do ATP, o que levaria a uma estimativa errônea da atividade enzimática. O uso

de quelantes do íon cobre, descrito por Lowe e colaboradores (2004), do mesmo modo que se

usa quelantes de Ca+2 para inibir o transporte de cálcio acoplado a hidrólise de ATP da Ca+2-

ATPase de membrana plasmática (PMCA, SCHATZMANN et al., 1973) são uteis pois não

há descrito inibidor específico para estas enzimas. Uma abordagem diferente pode ser

empregada para Na+,K+-ATPase e para a Na+,-ATPase que são sensíveis a inibidores com alta

especificidade, a ouabaína (HAMLYN et al., 1991) e a furosemida (PROVERBIO et al,

1986), respectivamente. Neste aspecto, resta apenas identificar o comportamento da enzima

em concentrações mais baixas de ATP (menores que 5 mM), o que pode vir a ser interessante

tendo em vista a flutuação circadiana das concentrações de ATP no fígado

(ATAULLAKHANOV & VITVITSKY, 2002), porém o modelo biológico mais adequado

para observar flutuações de ATP na faixa do μmolares é cultura de células hepáticas, de modo

que o ATP não se extingua rapidamente.

57

Quanto à regulação da homeostasia do cobre por insulina, já foi demonstrado que este

hormônio altera tanto a expressão, quanto o tráfego Atp7a e Atp7b, em cultura de células

placentárias que expressam ambas as ATPases (HARDMAN et al., 2007). Essa sinalização

aumentaria a entrega de cobre ao feto em desenvolvimento e diminuiria o retorno do metal à

corrente sanguínea materna. A insulina também diminui a expressão da ceruloplasmina,

graças à ativação da via PI3K/Akt que permite o fator de transcrição FoxO1 regular diversos

genes ligados ao estresse oxidativo (LEYENDECKER et al., 2011).

O uso de estreptozotocina para a indução de DM do tipo 1 já é bem estabelecido no

meio científico (SCHEIN et al., 1971). Este fármaco é um antimicrobiano, que causa necrose

especificamente das células β do pâncreas graças à capacidade destas células expressarem os

transportadores Glut2 (LENZEN, 2008). Deste modo, considera-se a indução de DM por

estreptozotocina o modelo mais adequado para o estudo in vivo de hipoinsulinemia. A

hipoinsulinemia leva a perda da capacidade de internalizar a glicose em diversos tipos

celulares, de modo que outras fontes de energia são necessárias para a manutenção da vida, ao

que ativa o catabolismo da proteína muscular e da gordura no tecido adiposo, o que explica a

diferença entre a variação de peso nos animais CT e DM. Esta etapa do projeto foi bem

sucedida com a obtenção de hiperglicemia e hipoinsulinemia dos ratos DM após 14 dias de

indução, porém não foi tempo suficiente para diferenciar a massa de ambos os grupos

(FIGURA 10), apesar da diferença na variação de massas (FIGURA 10 inset). As taxas de

insulina presentes no soro não são nulas, apesar de 5 vezes menores que a média dos animais

CT (FIGURA 12). Isto pode ser explicado pela observação da síntese de insulina extra

pancreática, já descrita previamente, no fígado, baço, tecido adiposo e medula óssea de

animais diabéticos, os quais aparentemente respondem aos efeitos da hipoinsulinemia (CHEN

et al., 2010; KOJIMA et al., 2004).

58

A diferença de massas entre fígados de ratos CT e DM foi corrigida durante a

preparação de frações de membrana, entretanto a relação de Atp7b: proteínas totais não pode

ser estimada, tendo em vista a ausência de um anticorpo específico para a enzima de rato, o

anticorpo utilizado é referente a proteína humana que possui apenas 80% de identidade de

sequência primária o que é pouco para proteínas ortólogas. Por isso, se faz necessária a

identificação de um anticorpo capaz de reconhecer, em mínimas diluições, a Cu(I)-ATPase

hepática de rato. FANNI e colaboradores (2005) exemplificam um caso em que o anticorpo

humano para Atp7b é incapaz de reconhecer a proteína de rato.

A falta de um anticorpo específico para Atp7b de rato limita tecnicamente outros

objetivos desta dissertação. A identificação da fosforilação regulatória in vivo requer

imunoprecipitação da enzima, de forma a quantificar a enzima fosforilada lábil em pH

alcalino (no caso da fosforilação catalítica) e não lábil em pH alcalino (no caso da fosforilação

regulatória), o que já foi realizado em sistemas de expressão heteróloga in vitro (BARTEE et

al., PILANKATTA et al., 2009; PILANKATTA et al., 2010; 2009; VALVERDE et al.,

2008). Nestes sistemas pode-se observar as Cu(I)-ATPases sem a presença de outras P-

ATPases (no caso de transfecção em células Sf9) ou grandes quantidades de Cu(I)-ATPase

(quando a proteína de interesse é superexpressa em cultura de células), de forma que o sinal

enzima fosforilada não proveniente de Atp7b é um ruído eliminável. De fato, a detecção de

enzima fosforilada em frações de membrana de fígado de rato é o grande desafio deste

projeto, o que garantiria a confirmação (ou refutação) de que Atp7b é hiperfosforilada (ou

hipofosforilada) por proteínas cinases ou que existam alterações em seu ciclo catalítico em

ratos diabéticos.

De outra perspectiva, sabe-se que a DM altera o balanço entre proteínas cinases de

modo diferente em órgãos distintos (WANG et al., 2012), principalmente as diversas

59

isoformas de PKC (TANG et al., 1993; NIVET et al., 1998). Além disso, muito já foi descrito

acerca do papel da PKC na DM (SINGH et al., 2011), alguns autores chegam a propor que o

desbalanço, induzido pela hiperglicemia, na atividade desta cinase seria a principal hipótese

para o desencadeamento da patologia (BROWNLEE, 2001), uma vez que o inibidor

específico da PKC-β (uma das PKC clássicas, ativadas por Ca2+e DAG) é capaz de reverter os

danos da DM (ISHII et al., 1996). Estes mesmos danos (como albulminúria e aumento do

diâmetro glomerular) podem ser revertidos com o uso de trietilenotetramina (TETA), um

quelante do cobre utilizado no tratamento de doença de Wilson (GONG et al., 2008). Cooper

(2011) sugere que quelantes do cobre possam tratar doenças relacionadas a disfunções no

metabolismo da insulina, como DM e a doença de Alzheimer, sabendo-se que já existem

alguns relatos da correlação entre diabetes e homeostase do cobre (FAILLA & KISER, 1983;

URI-ADAMS et al,. 2005), sem no entanto haver qualquer detalhamento de mecanismo

molecular que determina essa correlação. Como o fígado é um orgão-alvo da insulina e

também o principal órgão relacionado com a excreção do cobre, e tendo em mãos o

conhecimento que a insulina é capaz de regular a atividade de Atp7b via atuação de proteínas

cinases, propomos um modelo in vivo capaz de investigar essa relação: DM induzido por

estreptozotocina.

Quanto à escolha do tempo de hipoinsulinemia, foi escolhido seguindo dados da

literatura existente. Alguns autores se preocuparam em descrever o mecanismo molecular

pelo qual essa modulação acontece, mas esta alteração da atividade varia de tecido para tecido

(VAGUE et al, 2004). A relação entre hormônios do metabolismo energético e modulação de

ATPases do tipo P é relatada pela primeira vez por Fehlmann e Freychet (1981), onde os

autores mostraram que insulina e glucagon aumentam atividade de transporte da Na+,K+-

ATPase em hepatócitos isolados de rato. É conhecida que a hipoinsulinemia, em 10 semanas,

60

gera aumento na fosfo-enzima da Na+,K+-ATPase de nervo ciático, sendo bloqueada com o

inibidor clássico da PKC, a estaurosporina (BORGHINI et al., 1994). Este mesmo inibidor é

capaz de reverter o aumento da atividade ATPásica da Ca+2-ATPase de membrana plasmática

(PMCA) de hepatócito, induzido por uma ou duas semanas de hipoinsulinemia

(TAKAHASHI et a., 1998). Sennoune e colaboradores (2000) mostraram que 8 semanas de

hipoinsulinemia induz a expressão da isoforma β1 da Na+,K+-ATPase de fígado. De fato

Na+,K+-ATPase tem um papel importante na obesidade e, provavelmente, na diabetes, tendo

em vista que é o transporte de Na+e K+ um dos processos mais energeticamente dispendiosos

para o organismo. Nestes termos, Iannello e colaboradores (2006) mostram que a

hiperinsulinemia (2 semanas) desenvolvida por camundongos ob/ob diminui a atividade da

Na+,K+-ATPase do fígado e rim, e que quando tratados com estreptozotocina, os

camundongos ob/ob desenvolviam hipoinsulinemia e concomitante aumento da atividade

ATPásica da Na+,K+-ATPase renal e hepática. Com as variações da atividade enzimática já

são observadas em tempos relativamente curtos (7 a 14 dias) e a observação de um aumento

no acúmulo de cobre no fígado, descrito por Lau & Failla (1984), foi decidido que 14 dias era

tempo suficiente para analisar nossos parâmetros.

Outro ponto a ser discutido é a diferença entre o balanço de PKA e PKC em diferentes

órgãos. Foi descrito (LESAGE et al., 2002) que insulina é capaz de modular a secreção de

sais biliares nos ductos biliares ativando PKC e inibindo a PKA, simultaneamente. Não é um

evento isolado, porque outros autores (PÉREZ et al., 2006) já descreveram o fenômeno de

contrabalanço entre PKA/PKC para a bomba exportadora de sais biliares, Bsep, que tem sua

função ativada por PKC e inibida por PKA. Já Wang e colaboradores (2011) sugeriram que

esse desbalanço entre PKA e PKC explicaria porque o rim (e não cérebro ou o fígado) é o

principal órgão afetado pela microvasculopatia diabética. Demonstrando que no fígado e

61

cérebro o balanço entre as cinases está mantido, o que explicaria o porquê do rim ser o

primeiro órgão afetado, graças à superativação da PKC-βII e a inibição da PKA neste tecido,

em modelo de ratos espontaneamente diabéticos, que desenvolvem diabetes nefrogênica.

A ausência de diferença entre atividade Cu(I)-ATPásica observada nas frações de

membrana CT ou DM pode ser explicada por três hipóteses:

Alteração no tráfego de Atp7b, sem alteração na sua atividade enzimática,

provavelmente sinalizado por fosforilação regulatória que pode alterar sua função celular e

fisiológica, e por isso, não pode ser observada em preparações de fração de membrana.

O tempo de hipoinsulinemia escolhido (14 dias) não foi suficiente para

efetivamente alterar o ambiente molecular dos hepatócitos, de modo que outros tempos devem

ser escolhidos e estudados para entender se, in vivo, a ausência da insulina regula Atp7b em

fígado de ratos. E também investigar o nível em que se dá esta regulação, se é por modulação

da atividade enzimática e/ou localização subcelular.

O balanço entre as fosforilações regulatórias por PKA (regulação negativa

HILARIO-SOUZA, 2011) e PKC (regulação positiva, CARDOSO, 2012) agindo de modo

complementar, o que resulta na manutenção da mesma taxa de hidrólise de ATP por Atp7b. É

importante ressaltar que o experimento de atividade ATPásica é a resultante entre diversas

etapas do ciclo catalítico da ATPase (VALVERDE, 2007), e diversos fatores podem alterar

diferentes etapas deste ciclo, ou seja, a ausência de diferença não implica numa não-regulação

por cinases no caso de 14 dias de hipoinsulinemia. Para confirmar esta hipótese, experimentos

de fosforilação regulatória e catalítica deverão ser realizados com as frações de membrana

provenientes de ratos CT e DM de modo a detectar a fosfoenzima lábil em pH alcalino (acil-

fosfato) e não lábil em pH alcalino (éster-fosfato).

62

O sucesso na caracterização da Cu(I)-ATPase do fígado de rato possibilita o estudo da

homeostasia de cobre em animais, utilizando fármacos no animal inteiro e dissecando

possíveis vias de sinalização que não estariam acessíveis em outros modelos. Esta dissertação

representa mais uma etapa em direção à compreensão da modulação do transporte ativo de

cobre por hormônios e determinar os mecanismos moleculares envolvidos na sua excreção.

63

Figura 17. Fluxograma de conclusões. A caracterização da atividade Cu(I)-ATPásica no fígado de ratos foi bem sucedida no animal controle, entretanto é de interesse que alguns do parâmetros enzimáticos obtidos neste animal sejam observados também no animal DM, de modo que se entenda o efeito da hipoinsulinemia na modulação da Cu(I)-ATPase hepática. Além da hipótese da dupla fosforilação, é possível que a hipoinsulinemia mude também tráfego da enzima o u sua afinidade por cobre ou ATP.

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