caracterização de isolados de vírus coletados em melancia no

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

CAMPUS DE GURUPI

MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL

CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE VÍRUS COLETADOS EM

MELANCIA NO ESTADO DO TOCANTINS E SUA

SINTOMATOLOGIA EM CUCURBITÁCEAS

ALINE TORQUATO TAVARES

GURUPI-TO

DEZEMBRO DE 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

CAMPUS DE GURUPI

MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL

CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE VÍRUS COLETADOS EM

MELANCIA NO ESTADO DO TOCANTINS E SUA

SINTOMATOLOGIA EM CUCURBITÁCEAS

Orientador: Prof° Dr. Ildon Rodrigues do Nascimento

Co-orientador: Prof° Dr. Gil Rodrigues dos Santos

GURUPI-TO

DEZEMBRO DE 2012

Dissertação apresentada à

Fundação Universidade Federal

do Tocantins, como parte das

exigências do curso de

Mestrado em Produção Vegetal,

para obtenção do título de

“Mestre”.

i

Dedico aos meus pais José Torquato de Sousa Netto

e Eliene Tavares de Alvarenga Torquato,

às minhas irmãs Priscilla, Marta, Angélica e Angela.

ii

Dissertação de Mestrado realizada junto ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da

Universidade Federal do Tocantins, sob orientação do professor e pesquisador Dr. Ildon

Rodrigues do Nascimento. Apoio financeiro do CNPq e CAPES.

Banca examinadora:

____________________________________________

Prof. Dr. Ildon Rodrigues do Nascimento

Universidade Federal do Tocantins (Orientador)

____________________________________________

Prof. Dr. Gil Rodrigues dos Santos

Universidade Federal do Tocantins (Co-Orientador)

____________________________________________

Dr. Mateus Figueiredo dos Santos

Centro Nacional de Pesquisas de Hortaliças CNPh (Examinador externo)

____________________________________________

Prof. Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar

Universidade Federal do Tocantins (Examinador)

GURUPI-TO

DEZEMBRO DE 2012

iii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pois sem ele não conseguiria concluir mais essa etapa da

minha vida, pela proteção, saúde, força de vontade, capacidade e dedicação;

Aos meus pais José Torquato e Eliene pelo incentivo, amor, confiança, por me ensinar a ter

os pés no chão, força de vontade e determinação e me espelhar em vocês;

Agradeço às minhas irmãs Priscilla e Marta pelo carinho, amor e incentivo;

Ás minhas irmãs de coração Angélica e Angela pelo amor, companheirismo, conselhos,

palavras e ombro amigo;

Aos meus irmãos de coração Wanderson, Wesley e José Walle pelo amor e compreensão;

À família Carvalho, especialmente a Dona Conceição e Francisco (Seu Dr.) que considero

muito, como pais mesmo, pelo amor e incentivo;

Aos meus amigos Ronice, Sérgio, Ariádila, Marielle, Elcione, Maíra, Ana Paula, André

Fróes e Prínscilla Pâmela pelos momentos compartilhados;

Ás minhas princesas sobrinhas Laura e Katarine e ao príncipe sobrinho Valdir Neto

À Diná que sempre torceu por mim em todos os momentos da minha vida, estava lá sempre

presente (in memória);

Á toda a minha família pelo apoio e momentos compartilhados;

Agradeço ao meu orientador Professor Ildon Rodrigues do Nascimento pelos ensinamentos,

paciência e motivação durante esse tempo;

Aos colegas da turma do Programa de Pós Graduação em Produção Vegetal;

Ao grupo NEO pela ajuda;

Aos membros da banca pela contribuição nesse trabalho;

A CAPES, pela concessão da bolsa de estudos e auxílio financeiro.

iv

SUMÁRIO

RESUMO GERAL ........................................................................................................... 8

ABSTRACT ...................................................................................................................... 9

1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 10

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Cultura da melancia ..................................................................................................... 11

2.2 Cultura da abóbora ....................................................................................................... 12

2.3 Cultura do melão .......................................................................................................... 13

3. Principais viroses que acometem as cucurbitáceas......................................................... 15

3.1 Mosaico-da-abóbora .................................................................................................... 16

3.2 Mosaico-amarelo-da-abobrinha-de-moita ................................................................... 17

4. Infecção mista ................................................................................................................ 19

5. Teste DAS-ELISA ......................................................................................................... 19

6. PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................................................................... 20

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 22

CAPITULO II - CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ISOLADOS DE

VÍRUS COLETADOS EM PLANTIOS COMERCIAIS DE MELANCIA EM

VÁRZEA TROPICAL NO ESTADO DO TOCANTINS

RESUMO........................................................................................................................... 32

ABSTRACT....................................................................................................................... 33

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................. 34

2. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 35

2.1 Coleta, identificação, preservação e multiplicação das amostras................................ 35

2.2 Identificação Sorológica e molecular (RT-PCR) dos isolados ................................... 37

2.3 Extração de RNA total dos isolados............................................................................. 38

2.4 Síntese do cDNA.......................................................................................................... 39

2.5 Reação de amplificação (PCR) ................................................................................... 39

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................... 39

4. CONCLUSÕES.............................................................................................................. 44

v

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................... 45

CAPÍTULO III - REAÇÃO FENOTÍPICA DE PLANTAS DE ABÓBORA E

MELÃO À INFECÇÃO POR ISOLADOS SIMPLES DE ZYMV E MISTO DE

ZYMV+SQMV

RESUMO ........................................................................................................................... 48

ABSTRACT ....................................................................................................................... 49

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 50

2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 51

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 52

4. CONCLUSÕES ............................................................................................................. 59

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 60

vi

ÍNDICE DE TABELAS




Tabela 1- Codificação utilizada para identificação de isolados de vírus coletados em

plantas de lavouras comerciais de melancia sob condições de várzea tropical nos

municípios de Formoso do Araguaia e Lagoa da Confusão................................................. 30

Tabela 2 - Identificação sorológica DAS-ELISA de amostras foliares de melancia com

sintoma de virose coletadas em áreas de produção comercial de melancia no estado do

Tocantins ............................................................................................................................. 33



ZYMV+SQMV

Tabela 1- Sintomas exibidos por abobrinha (Cucurbita pepo) cultivar „Caserta‟

inoculadas com Zucchini yellow mosaic vírus (ZYMV) em experimento de casa de

vegetação. Isolados 1F a 11F oriundos do município de Formoso do Araguaia-TO e os

demais isolados oriundos do município da Lagoa da Confusão, Estado do Tocantins .... 46

Tabela 2- Sintomas exibidos por abobrinha (Cucurbita pepo) cultivar „Caserta‟

oriundos do município da Lagoa da Confusão em quatro genótipos de melão (Cucumis

melo) induzidos pela combinação de (ZYMV+SqMV)....................................................... 50

ÍNDICE DE FIGURAS




Figura 1- Mapa do estado do Tocantins indicando as regiões onde foram coletadas as

amostras de plantas com sintoma de virose ........................................................................ 29

vii

Figura 2- Análise eletroforética de bandas amplificadas com o primer para Zucchini

yellow mosaic virus (ZYMV). M1: Marcador 1Kb DNA ladder; 1F a 11F amostras 2-

FA; 3-FA; 4-FA; 5-FA; 6-FA; 7-FA; 8-FA; 9-FA; 10-FA e 11-FA representam isolados

de Formoso do Araguaia; 1 ao 5 amostras: 1-LC; 2-LC; 3-LC; 4-LC e 5-LC,

representam isolados da Lagoa da Confusão; CP (Controle Positivo); CN (Controle

Negativo) e M2: Marcador 100 pb....................................................................................... 35

Figura 3- Análise eletroforética das bandas amplificadas com primer para Zucchini

yellow mosaic vírus (ZYMV). M1 e M2: Marcador 100pb; 1 a 9: amostras 6-LC, 7-LC,

8-LC, 9-LC, 10-LC, 11-LC, 12-LC, 13-LC e 14-LC provenientes da Lagoa da Confusão.

CP: Controle Positivo, CN: Controle Negativo .................................................................. 35

Figura 4- Análise eletroforética das bandas amplificadas com o primer para Zucchini

yellow mosaic virus. M1 e M2: Marcador 100pb; 1 a 14: amostras: 15-LC, 16-LC, 17-

LC, 18-LC, 19-LC, 20-LC, 21-LC, 22-LC, 23-LC, 24-LC, 25-LC, 26-LC, 27-LC e 28-

LC provenientes da Lagoa da Confusão. CP: Controle Positivo, CN: Controle Negativo. 36



ZYMV+SQMV

Figura 1 – Sintomas induzidos por Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) em plantas

de abóbora cultivar „Caserta‟: (B, F, H, J, M, P) e (Q) isolados 2-FA, 6-FA, 8-FA, 10-

FA, 11-FA, 20-LC e 21-LC respectivamente com nervuras paralelas como principal

sintoma; (A, C, D, E, K, L) e (O) isolados 1-FA, 3-FA, 4-FA, 5-FA, 11-LC, 4-LC e 17-

LC respectivamente, com mosaico; (G, I) e (R) isolados 7FA, 9FA e 22-LC,

respectivamente, com bolhosidade e (N) e (S) isolados 13-LC e 23-LC, respectivamente,

com deformação foliar ........................................................................................................ 47

Figura 2 – Sintomas induzidos por isolado misto de Zucchini yellow mosaic virus

(ZYMV) e Squash mosaic vírus (SqMV) em plantas de abóbora cultivar „Caserta‟ e

quatro genótipos de melão induzidos pela infeção mista de Zucchini yellow mosaic virus

(ZYMV) Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) e Squash mosaic vírus (SqMV) : (A, B,

D, G, J) e (P) isolados 1-LC, 3-LC, 6-LC, 9-LC, 14-LC e 28-LC respectivamente com

mosaico, deformações foliares e nervuras paralelas como principais sintomas; (C, F, I,

K, e O) isolados 5-LC, 8-LC, 12-LC, 15-LC, e 24-LC respectivamente com deformação

foliar e enação; (E) e (H) isolados 7-LC e 10-LC respectivamente com estreitamento e

enrolamento foliar; (N) isolado 19-LC com bolha como sintoma mais evidente e (M)

isolado 18-LC com mosaico e crescimento do limbo foliar no pecíolo da folha (esporão).

Em genótipos de meloeiro (Cucumis melo): (Q) „Sunshine‟ e (R) „Amarelo‟ com bolhas

e deformações foliares; (S) „Eldorado‟ com mosaico e (T) „Valenciano‟ não apresentou

sintoma ................................................................................................................................ 49

8

RESUMO GERAL

As cucurbitáceas podem ser afetadas por várias doenças, dentre elas as viroses, as quais

podem provocar perdas significativas na produção, isso porque plantas afetadas por vírus

apresentam mosaico, redução do limbo foliar e deformação nas folhas e frutos, podendo a

sintomatologia variar com o hospedeiro e o isolado. O Estado do Tocantins possui condições

climáticas favoráveis ao surgimento de viroses. O trabalho foi realizado com a finalidade de

identificar por meio de avaliação sorológica e molecular, isolados de vírus coletados em

plantas de lavoura comercial de melancia em área de várzea. Foram avaliadas também as

reações fenotípicas de 19 isolados de ZYMV e 16 isolados de ZYMV+SqMV inoculados em

plantas de abóbora cv. „Caserta‟ e cultivares de melão. As amostras foram coletadas no

município da Lagoa da Confusão e Formoso do Araguaia. Foram realizados teste sorológico

DAS-ELISA com antissoros específicos e teste molecular RT-PCR. As espécies de vírus

predominantes nas regiões produtoras de melancia do Estado do Tocantins foram ZYMV e

SqMV e a ocorrência de infecção mista (ZYMV+SqMV) foi verificada em 35% das amostras

do município da Lagoa da Confusão. No município de Formoso do Araguaia predominou o

ZYMV. Os sintomas mais comuns observados pela infecção por ZYMV foram mosaico e

nervuras paralelas. A sintomatologia das plantas de abóbora inoculadas com ZYMV+SqMV

foi mais agressiva no decorrer das avaliações, evoluindo para deformações e estreitamentos

foliares, além de bolhosidade, nervuras paralelas e esporão, comprometendo grande parte da

área foliar.

Palavras-chave: Cucurbitáceas, Viroses, Identificação, ZYMV, SqMV

9

ABSTRACT - The cucurbits can be affected by various diseases, including the viruses,

which can cause significant losses, because plants affected by mosaic virus present, reduction

of leaf blade and leaf and fruit deformation, the symptoms may vary with the host and the

isolated. The State of Tocantins has favorable climatic conditions to the emergence of viruses.

The study was conducted in order to identify by serological and molecular evaluation, virus

isolates collected from plants of commercial farming of watermelon in floodplain area. We

also evaluated the phenotypic reaction of 19 ZYMV isolates and 16 isolates of

ZYMV+SqMV inoculated in pumpkin plants cv. 'Caserta and melon cultivars. The samples

were collected in the municipality of Lagoa da Confusão and Formoso do Araguaia. DAS-

ELISA serological tests were done with specific antisera and RT-PCR molecular test. The

predominant species of virus in watermelon producing regions of the State of Tocantins were

ZYMV and SqMV and the occurrence of mixed infection (ZYMV+SqMV) was achieved in

35% of the samples in the municipality of Lagoa da Confusão. In the municipality of Formoso

do Araguaia predominated ZYMV. The most common symptoms observed by the infection

with ZYMV were mosaic and parallel veins. The symptoms of pumpkin plants inoculated

with ZYMV+SqMV was more aggressive during evaluations, progressing to narrowing and

leaf deformation, besides blistering, parallel ridges and spurs, committing much of the leaf

area.

Keywords: Cucurbits, Viruses, Identification, ZYMV, SqMV

10

1. INTRODUÇÃO GERAL

As cucurbitáceas destacam-se pela importância econômica e social entre as famílias

botânicas utilizadas para a produção de alimentos, desde a geração de empregos diretos e

indiretos, ligados à necessidade de grande número de mão de obra do cultivo, até a

comercialização. O cultivo de cucurbitáceas é praticado tanto em pequenas propriedades, em

regime de agricultura familiar, quanto em grandes propriedades. As espécies com maior

expressão econômica no Brasil são as pertencentes aos gêneros Citrullus (melancia), Cucumis

(pepino, maxixe e melão), Cucurbita (moranga, abóbora e abobrinha), Lagenaria (cabaça-

caxi) e Sechium (chuchu) (PINTO, 2003).

As cucurbitáceas podem ser afetadas por várias doenças, dentre elas as viroses, que

podem levar a perdas significativas na produção. As plantas afetadas por vírus podem

apresentar mosaico, redução do limbo foliar e deformação nas folhas e frutos, podendo a

sintomatologia variar tanto com o hospedeiro infectado, quanto com a ocorrência de infecções

mistas (RAMOS et al., 2003). Sabe-se que a ocorrência de viroses depende de inúmeros

fatores, como a época do ano, o local de plantio, a presença e a preferência de vetores, dentre

outros. Dessa forma, o monitoramento da ocorrência de vírus em cucurbitáceas torna-se

necessário, não só em campos de produção, mas como forma de se evitar que estas constituam

hospedeiras alternativas de viroses, que também afetam economicamente culturas vizinhas.

Dentre os vírus que causam problemas nas cucurbitáceas estão o Zucchini yellow

mosaic virus- ZYMV, Papaya ringspot virus– type watermelon – PRSV-W (LIMA, et al.

1996), Squash mosaic virus– SqMV (ALENCAR et al. 2012), Watermelon mosaic virus–

WMV (SÁ & KITAJIMA, 1991) e Cucumber mosaic virus– CMV (NAGATA & PETERS,

2001), todos de importância econômica para as cucurbitáceas, causando prejuízos nos cultivos

do melão, da melancia e da abóbora. O Estado do Tocantins tem apresentado uma grande

incidência de viroses no campo devido às condições climáticas serem favoráveis, por isso faz-

se necessário estudos para a identificação e avaliação dessas doenças na região para que se

possam tomar as estratégias corretas de controle.

Em razão da frequente ocorrência de danos causados pelos vírus nos plantios comercias

de cucurbitáceas no Estado, o trabalho tem como objetivo fazer a identificação sorológica e

molecular de amostras coletadas de plantas de melancia de lavouras comerciais em condição

de várzea úmida tropical, nos municípios de Formoso do Araguaia e Lagoa da Confusão.

Foram avaliadas também as reações fenotípicas de isolados de ZYMV e isolados misto de

11

ZYMV+SqMV inoculados em plantas de abóbora cv. „Caserta‟ e também a reação fenotípica

de um isolado misto em quatro genótipos de melão.

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1- Cultura da melancia

A melancia Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai pertence à família

Cucurbitaceae, gênero Citrullus, espécie lanatus, tem sua origem nas regiões secas da África

tropical. Foi introduzida no continente americano pelos escravos e colonizadores europeus no

século 16. A espécie se difundiu pelo mundo inteiro e é cultivada nas regiões tropicais e

subtropicais do planeta (DIAS & REZENDE 2010).

É uma planta anual herbácea, de porte rasteiro ou trepador. O caule compõe-se de ramos

primários e secundários, que podem ter disposição radial (ramos de tamanho similar partindo

da base da planta) ou axial (um ramo mais longo com derivações opostas e alternadas em cada

nó). Até o terceiro nó, surge uma folha e uma gavinha. A partir do terceiro nó surge também

uma flor. O caule é fino, angular, provido de gavinhas para fixação no solo. A folha é

peciolada, pinada, dividida em três ou cinco lóbulos. O sistema radicular da melancia é mais

profundo do que o das demais cucurbitáceas, sendo do tipo pivotante muito. (NASCIMENTO

et al., 2011).

As melancias possuem variedades que se diferem quanto à origem e utilidade, as de

polpa amarga são cultivadas na África e suas sementes são fritas antes de serem consumidas.

As melancias forrageiras (Citrullus lanatus var. citroides), também conhecidas como

melancia-de-cavalo, melancia do mato ou melancia-de-porco possuem polpa branca,

consistente (com um teor elevado de matéria seca) e não açucarada (baixo teor de sacarose),

portanto não possui boa aceitação para o consumo humano, sendo utilizada na alimentação

animal. As melancias de polpa açucarada (Citrullus lanatus var. lanatus), de cor vermelha,

laranja ou amarela, rica em água, são consumidas como alimento humano no mundo todo

(SOUZA, 2011).

Segundo Filgueira (1981, 2000), o fotoperíodo ideal para o cultivo da melancia visando

à obtenção de bons frutos e alta produtividade é de dias longos e quentes e noites quentes,

caracterizando verão quente e seco. A umidade do ar elevada afeta negativamente a qualidade

dos frutos, sendo que as melancias produzidas em regiões mais secas têm mais sabor, além de

conter menor incidência de doenças fúngicas ou viróticas, que podem acometer as folhas,

reduzindo a fotossíntese e a qualidade dos frutos. Segundo dados da FAO (2010), a melancia

12

foi a segunda fruta mais produzida no mundo, com 89.004.814 toneladas de frutos, ficando

atrás apenas da banana com 102.114.819 toneladas de frutos. A China, Turquia, Irã e Brasil

são os países de maiores produções mundiais.

A atividade produtiva de melancia no Brasil apresenta um perfil predominante pela

produção familiar por sua rusticidade, pelo menor investimento de capital e retorno em torno

de 85 dias em relação às outras oleráceas (DIAS & REZENDE 2010). A área plantada ou

destinada a colheita de melancia no país em 2011 foi de 98.501ha e a quantidade produzida

foi de 2.198.624 toneladas de frutos (IBGE, 2011).

Os principais pólos produtores de melancia no país estão no sul, onde os Estados do Rio

Grande do Sul e de São Paulo representam quase a metade da produção e no nordeste, mais

precisamente na Bahia e em Pernambuco, onde as áreas irrigadas do Vale do Rio São

Francisco são responsáveis por cerca de um quarto do total produzido. Parte dessa produção

destina-se à exportação, especialmente para alguns países da própria América do Sul. O

Estado do Tocantins tem se destacado na produção de melancia. De acordo com a Secretaria

da Agricultura da Pecuária e do Desenvolvimento Agrário (SEAGRO, 2012) a expectativa de

produção de frutos para a safra de 2012 no estado foi de cerca de 90 mil toneladas de

melancia em uma área plantada de 3.600 hectares.

2.2- Cultura da abóbora

As abóboras e as morangas pertencem à família Cucurbitaceae, gênero Cucurbita,

originário das Américas. Considera-se que o gênero Cucurbita seja formado por cerca de 15

espécies, sendo C. argyrosperma, C. ficifolia, C. máxima, C. moschata e C. pepo as cinco

espécies domesticadas e, dentre essas, apenas as três últimas são cultivadas no Brasil com

finalidade comercial. Os frutos são consumidos imaturos ou maduros, sob diversas formas

(cozidos, refogados, assados, enlatados, “baby food” ou doces). Ápices caulinares e flores são

consumidas como hortaliça no sul e leste da África e regiões Latino Americanas (FONTES,

2005).

As abóboras e morangas domesticadas são mesófitas, sensíveis à geada, têm sistema

radical fibroso, caule com gavinhas e crescimento rasteiro ou trepador e, em tipos

subarbustivos, com gavinhas de tamanho reduzido. Todas as espécies do gênero têm como

expressão do sexo a monoicia, ou seja, flores unissexuais em pontos separados na mesma

planta. As flores são grandes, vistosas e alaranjadas ocorrendo isoladas em axilas foliares e

normalmente as flores masculinas surgem primeiro e em maior número que as femininas; esta

13

relação também pode ser alterada por condições de cultivo. As anteras são mais ou menos

unidas e produzem quantidade abundante de pólen pegajoso e pesado (FONTES, 2005).

O fruto é uma baga indeiscente (pepônio) e varia muito em forma, coloração interna e

externa, firmeza da casca e da polpa, forma de consumo e tamanho. Os tipos de cultivares de

abóboras e morangas maduras são: Tipo Seca (Carioca, Seca CAC, Goianinha, Mammoth e

Menina Brasileira); Tipo Butternut (Butternut, Bárbara, Atlas e Poliana); Tipo Tetsukabuto

que é a moranga ou abóbora híbrida é resultante do cruzamento entre moranga (Cucurbita

máxima Duch.), como genitor feminino, com a abóbora (Cucurbita moschata Duch.), como

genitor masculino. O primeiro híbrido comercial foi obtido no Japão, o qual recebeu a

denominação de Tetsukabuto (significa “capacete de aço”). Introduzido no Brasil,

inicialmente no município de Barbacena-MG, na década de 1960, os frutos ganharam com

exceção do Estado do Rio de Janeiro, grande aceitação popular nos mercados centro-sul; Tipo

Abóbora Verde (Sandy, Novita, Samira, Yasmim, Abobrinha tronco branca, Menina

Brasileira, Caserta, Anita, Clarita, Princesa e Formosa) (FONTES, 2005).

2.3 - Cultura do melão

O meloeiro é uma dicotiledônea da família Cucurbitaceae. É perene na natureza, sendo

explorada como planta anual. Os diferentes tipos de melões (Cucumis melo L.) foram

originados na Índia ou na África. No Brasil, o meloeiro é conhecido desde o século XVI,

quando foi trazido, provavelmente, pelos escravos. Posteriormente, no século XIX, houve

outra introdução, desta vez pelos imigrantes europeus, quando se iniciou, de fato, a expansão

da cultura nas regiões Sul e Sudeste chegando por volta da década de 1960 ao nordeste. Nas

últimas décadas o Brasil passou de importador a grande exportador dessa hortaliça devido,

principalmente, às condições climáticas favoráveis existentes na região Nordeste (FONTES &

PUIATTI, 2005).

A produção de melão no Brasil é estimada em cerca de 478 mil toneladas de frutos ano-

1, em uma área correspondente a 18.870 ha (IBGE, 2010). Todas as regiões brasileiras

produzem melão, sendo cerca de 94,3% no Nordeste, 5,1% no Sul, 0,5% no Sudeste, e 0,1%

no Norte e Centro-Oeste (AGRIANUAL 2012). Os estados do Rio Grande do Norte, Ceará e

Bahia são os maiores produtores com respectivamente, 50,6%, 32% e 7,6% (IBGE, 2010).

O meloeiro é planta de clima quente e seco. Períodos chuvosos, sobretudo durante a

maturação dos frutos favorecem às doenças que podem desfolhar as plantas. Como resultado,

14

há formação de frutos com baixo teor de sólidos solúveis (açucares), pequenos, pobremente

reticulados (melões rendilhados) e de tamanho despadronizado (FONTES & PUIATTI, 2005).

O sistema radicular é superficial e praticamente sem raízes adventícias, tendo baixa

capacidade de regeneração quando danificado. O caule é herbáceo, de crescimento rasteiro ou

prostrado, provido de nós com gemas. A partir dessas gemas desenvolvem-se gavinha, folha e

novo caule ou ramificação. As folhas são de tamanho variado, alternadas, simples, ásperas,

providas de pêlos, limbo orbicular, reniforme, pentalobulares, com as margens dentadas. As

flores são amarelas e constituídas por cinco pétalas. O meloeiro possui flores imperfeitas

(apenas um órgão sexual em uma flor) e perfeitas ou hermafroditas (órgãos masculino e

feminino na mesma flor) localizadas em pontos diferentes na planta. As flores femininas e

mesmo as perfeitas, necessariamente devem ser polinizadas por insetos polinizadores,

normalmente abelhas melíferas, pois os grãos de pólen são pesados e pegajosos formando

grumos e dificultando o transporte pelo vento. Como o fruto do melão não se desenvolve em

partenocarpia, é grande e contém muitos óvulos, se fazem necessárias frequentes visitas de

insetos polinizadores à flor feminina, caso contrário o fruto tende a ficar pequeno e deformado

(FONTES & PUIATTI, 2005).

O fruto é uma baga carnuda (pepônio), de tamanho, aspecto, forma e cores variadas. Os

frutos dos diversos grupos botânicos de melão variam quanto ao sabor (doce, picante,

insípido), forma (redondo, oval, oblongo, comprido), comprimento (10 a 90 cm), peso (0,6 a

2,5 Kg), coloração da casca (creme, cinza, verde, amarelo, alaranjado e preto), textura da

casca (lisa, verrugosa, rendilhada), intensidade do rendilhamento (intensa e saliente ou fina e

superficial) linhas de sutura na casca (presença ou ausência), tipo de polpa (crocante e

dissolvente), coloração da polpa (salmão ou alaranjada, clara, esverdeada) e aroma da polpa

(sem aroma – inodor – até intensamente almiscarado). Cada fruto produz de 200 a 600

sementes, dispostas simetricamente na parte interna da polpa sendo, em média 20 a 30

sementes por grama (FONTES & PUIATTI, 2005).

O grupo Inodorus é representado pelos melões do grupo Cantalupensis que não

possuem aroma, todavia apresentam maior período de armazenamento. Os frutos geralmente

não se destacam do pedúnculo quando maduros. O grupo Cantaloupensis são os melões

aromáticos, os verdadeiros cantaloupes são comuns na Europa, porém ainda pouco cultivados

no Brasil (FONTES & PUIATTI, 2005).

O melão é rico em vitaminas A, B, B2, B5 e C, sais minerais como Potássio, Sódio e

Fósforo, apresentam valor energético relativamente baixo; podendo ser consumido in natura

15

ou na forma de suco. O fruto maduro tem propriedades medicinais, sendo considerado

calmante, refrescante, diurético e laxante. (SENAR, 2007).

O continente asiático apresenta 68,37% de produção mundial de melão, seguido pela

América com 13,90%, Europa 11,11%, África 6,24% e Oceania 0,38%. A China ocupa a

primeira posição em produção mundial de melão, com 11.333.747 toneladas, apresentando

uma área colhida de 365.566 ha, seguido pela Turquia com 1.611.700 toneladas e o Iran, com

1.317.600 toneladas. (FAO, 2010).

Na América dentre os principais países de produção de melão destacam-se os EUA,

México, Guatemala, Brasil, Venezuela, Costa Rica, Honduras e Panamá. No continente

europeu, temos a Espanha, Itália, França e Romênia. Na África, o Egito e Marrocos, e na

Oceania, a Austrália, com uma produção de 76.300 toneladas. (FAO, 2010).

3. Principais viroses que acometem as cucurbitáceas

A disseminação de virose em plantas está associada a fatores bióticos e abióticos, que

influenciam diretamente na população dos vetores (MOURA, 2003; SANTOS et al., 2005).

Em cucurbitáceas, a incidência de viroses cultivadas é dinâmica, podendo variar em função da

espécie de vírus e suas estirpes, do reservatório do vírus, da população e migração dos

vetores, das espécies e cultivares utilizadas e das condições climáticas (MOURA et al., 2001).

Desse modo, além da redução direta na produção da planta, a ocorrência de viroses reduzem o

tamanho e aspecto morfológico do fruto, depreciando completamente seu valor comercial.

Dentre os vírus encontrados e relatados em regiões brasileiras destacam-se os a)

membros da família Potyviridae, gênero Potyvirus: vírus da mancha-anelar do mamoeiro

(Papaya ringspot vírus - PRSV), estirpe W (PRSV - W) e estirpe P (PRSV-P), vírus do

mosaico da melancia (Watermelon mosaic virus– WMV) e vírus do mosaico amarelo da

abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus– ZYMV); b) na família Bunyaviridae,

gênero Tospovirus: o Zucchini lethal chlorosis virus– ZLCV (BEZERRA et al., 1999;

POZZER et al., 1996); c) na família Bromoviridae, gênero Cucumovirus: vírus do mosaico do

pepino (Cucumber mosaic virus– CMV); d) na família Comoviridae, gênero Comovirus: vírus

do mosaico da abóbora (Squash mosaic virus– SqMV) (MOURA et al., 2001; OLIVEIRA et

al., 2000); e) vírus do amarelão, cuja etiologia ainda não está definida, possivelmente um

novo vírus da família Flexiviridae, gênero Carlavirus (NAGATA et al., 2003; 2005) ou da

família Closteroviridae, gênero Crinivirus (LIMA et al., 2002).

16

Em estudo realizado com amostras de diferentes espécies de cucurbitáceas no Estado de

Mato Grosso do Sul, Stangarlin et al. (2000) verificaram que o PRSV-W e o ZYMV foram os

vírus de maior incidência, seguidos pelo ZLCV. Posteriormente, avaliando a incidência de

virose em ensaios de genótipos de abóboras e pepino. Nessa mesma região, Stangarlin et al.

(2001) verificaram que os vírus mais comuns foram o PRSV-W, o ZLCV e o ZYMV com

incidências médias de 63,4%, 56,1% e 41,4%, respectivamente.

Yuki et al., (2000) em estudos sobre a incidência de vírus infectando cucurbitáceas no

Estado de São Paulo indicaram que os mais frequentemente encontrados foram o PRSV-W e

o ZYMV, com incidências médias de 48,3% e 24,5% respectivamente de um total de 614

amostras analisadas. ZLCV, CMV e WMV-2 foram detectados em 7,7%, 5,9% e 4,4% das

amostras respectivamente.

No estado do Tocantins tem sido realizados estudos para a identificação biológica e

molecular de vírus detectados em espécies de cucurbitáceas. Segundo Alencar et al. (2012)

dos 25 isolados de abóbora e melancia coletados em diversos municípios do estado, catorze,

ou seja 56% foram identificados com SqMV tendo sete deles sido provenientes de abóbora

„Caserta‟ e sete de melancia. Os demais isolados foram identificados como Zucchini yellow

mosaic virus (ZYMV). Ao contrário do que ocorre em outras regiões brasileiras, o SqMV foi

o vírus com maior incidência nas amostras coletadas em Tocantins, indicando a sua

importância para a região.

Nascimento et al. (2012) avaliaram a resistência fenotípica e o padrão de sintomas

apresentados por genótipos de abóbora (Cucurbita spp.) ao PRSV-W. Todas as progênies

endogâmicas oriundas do acesso ABTO#01 avaliadas foram resistentes ao PRSV-W e,

portanto, constituem progênies promissoras para serem utilizadas em programas de

melhoramento genético da abóbora para a região do Tocantins.

3.1 Mosaico-da-abóbora

O Mosaico-da-abóbora é uma virose causada pelo vírus Squash mosaic virus (SqMV),

foi descrito por Freitag (1941, 1956), Lindberg et al. (1956), é membro do gênero Comovirus,

da família Comoviridae e pode ser transmitido pelas sementes. Blancard et al. (1996)

verificaram que o vírus do mosaico da abóbora pode ser transmitido por meio de sementes

comerciais num percentual de até 10%, podendo ser transmitido também por besouros

crisomelídeos (Diabrotica spp. e Acalymma spp.) (FREITAG, 1956; LASTRA, 1968;

17

SITTERLY, 1960; STONER, 1963), por um besouro coccinelídeo (COHEN & NITZANY,

1963) e por cigarrinha (STONER, 1963), sendo capaz de infectar a maioria das plantas no

gênero Cucurbita e Cucumis (HAUDENSHIELD & PALUKAITIS, 1998; NELSON &

KNUHTSEN, 1973). Assim como outros Comovirus, o SqMV tem um genoma de RNA

bipartido senso positivo com RNA1 e RNA2, os quais estão separadamente encapsidados em

partículas isométricas de 28 nm de diâmetro.

O vírus do mosaico em abóbora foi relatado pela primeira vez em 1934, no estado norte-

americano da Califórnia, sendo posteriormente encontrado nas Américas do Norte e do Sul,

na Europa e na Austrália (SHERF & MACNAB, 1986). No Brasil, ocorre com mais

frequência no Distrito Federal e nas regiões norte e nordeste, incluindo os estados do Ceará e

do Rio Grande do Norte (VIANA et al., 2001).

Os sintomas produzidos pelo SqMV em abobrinha (Cucurbita pepo) são mosaico severo

e deformações foliares e, em Cucumis sativus, são clorose sistêmica nas nervuras e manchas

amareladas (RAMOS et al., 2003).

Os isolados de SqMV podem ser separados em dois grupos com base na sorologia,

o grupo I infecta melancia, causa sintomas severos em melão „Cantaloupe‟ e sintomas

moderados em abóboras; o grupo II não infecta melancia, causa sintomas moderados em

melão „Cantaloupe‟ e sintomas severos em abóbora. Em pepino-africano (Cucumis

metuliferus), a infecção com SqMV resulta em lesões locais e este resultado pode ser

utilizado para a identificação biológica deste vírus (SHERF & MACNAB, 1986).

3.2-Mosaico-amarelo-da-abobrinha-de-moita

No Brasil, essa virose foi detectada em 1992 no Estado de São Paulo, em melancia, e no

Estado de Santa Catarina, em pepino. Posteriormente, essa doença foi diagnosticada em

melões na Região Nordeste: no Estado do Rio Grande do Norte, em 1996; e no Estado do

Ceará, em 1998. Doença causada pelo ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus), o qual é

transmitido de modo não persistente, por pulgões, principalmente dos gêneros Aphis e Myzus.

O vírus Zucchini yellow mosaic vírus (ZYMV), é classificado taxonomicamente como

uma espécie do gênero Potyvirus, da família Potyviridae. Suas partículas são alongadas,

flexuosas, medindo aproximadamente 760-800 nm de comprimento por 12 nm de diâmetro. O

genoma é constituído por uma molécula de RNA de fita simples senso positivo que sintetiza

uma poliproteína que após clivagens que dá origem à proteína capsidial e a diversas proteínas

18

não estruturais com diferentes funções (LISA, 1981; LECOQ, 1991; PURCIFULL et al.,

1984; DESBIEZ & LECOQ, 1997).

Na natureza este vírus é transmitido por diversas espécies de afídeos, sendo a relação

vírus-vetor do tipo não persistente ou estiletar. Perring et al. (1992) relataram 9 espécies de

afídeos vetores deste vírus, dentre elas as espécies destacam-se Aphis gossypii Glover,

que representa uma praga para algumas cucurbitáceas (GALLO et al., 2002) e Myzus

persicae Sulzer, considerada uma das espécies mais eficientes na transmissão de vírus de

plantas.

Os relatos sobre a transmissão do ZYMV pelas sementes são conflitantes. Greber et

al.(1988) e Schrijnwerkers et al. (1991) demonstraram que o ZYMV foi transmitido por

sementes de C. pepo, com taxas de 1,0% e 0,047%, respectivamente. Schrijnwerkers et al. (1991)

sugeriram que o vírus estava presente apenas externamente nas sementes. Ausência de

transmissão pela semente foi relatada em testes com Cucurbita maxima Duch. Ex Lam., C.

moschata Duch., Cucumis melo L. e C. sativus L. (DESBIEZ & LECOQ, 1997).

O ZYMV induz a má formação foliar, além da deformação e escurecimento dos frutos

(LECOQ & LEMAIRE, 1991; LISA & LECOQ, 1984). As plantas afetadas,

especialmente de abobrinha-de-moita, cessam a produção de frutos uma a duas semanas

após a infecção, resultando em perdas significativas na produção. Quanto mais cedo ocorrer a

infecção, maiores serão essas perdas.

O ZYMV induz a formação de inclusões cilíndricas, do tipo catavento, em plantas

afetadas, que são geralmente do tipo I, de acordo com a classificação de (EDWARDSON &

CHRISTIE, 1978).

A transmissão de vírus do gênero Potyvirus por pulgão está relacionada à presença de

uma proteína não estrutural, denominada componente auxiliar “Helper Component-Protein”

(HC-Pro) (FROISSART et al., 2002). Esta proteína pode ser encontrada em plantas afetadas e

está ausente em plantas sadias (PIRONE, 1981). A HC-Pro atua como componente auxiliar na

transmissão por afídeos, como proteinase, sendo, também, fator auxiliar na replicação do

RNA viral, e constituindo fator acessório nos movimentos célula-a-célula e à longa distância.

A HC-Pro é fator de transmissão por semente e inibidor da resposta da planta (ZERBINI &

MACIEL-ZAMBOLIM, 1999).

19

4. Infecção mista

Infecções com duas ou mais espécies de vírus diferentes sabidamente podem ocorrer na

natureza como também em cultivo. Essas são chamadas infecções mistas podem resultar em

novas combinações virais e originar novas variantes dos vírus. Os vírus podem realizar

interações de complementação quando um dos vírus é deficiente em um dos seus produtos

gênicos, interação de recombinação genética que é a troca de um segmento de material

genético entre dois cromossomas virais em locais onde existe grande homologia (WISE,

2005).

Dentre os vírus que se destacam em infectar plantas são os potyvírus que podem causar

infecções isoladas e mistas, que são observadas com relativa frequência em condições

naturais. Nas infecções mistas podem acontecer relações sinérgicas, causando aumento ou

decréscimo na concentração dos vírus na planta, modificação nos sintomas da doença e/ou

alteração na movimentação sistêmica dos vírus (OLIVEIRA et al., 2000).

Lima (2011) em levantamento de vírus em cucurbitáceas no Brasil abrangendo sete

estados, além do Distrito Federal, detectou infecção mista em 31,4% das amostras

analisandas, ocorrendo em combinações de dois, três ou mesmo de quatro vírus na mesma

planta. Em levantamento sorológico de vírus em espécies de cucurbitáceas na região do

submédio São Francisco Silveira et al. (2009) observaram que o vírus PRSV-W predominou

seguido por WMV e ZYMV, ocorrendo infecções mistas em todas as espécies. Rodrigues

(2011) em diagnose de viroses em cucurbitáceas realizado em algumas regiões produtoras no

estado do Tocantins verificaram que as infecções mistas de maior ocorrência foram entre

PRSV-W+WMV, PRSV-W+ZLCV e ZLCV+WMV.

5. Teste DAS-ELISA

As técnicas sorológicas constituem uma ferramenta de grande valor, pois são

imprescindíveis no diagnóstico e na detecção de fitopatógenos, em qualquer programa de

produção e certificação de sementes, bulbos, tubérculos e explantes obtidos por meio de

micropropagação. Desta maneira, a disseminação de vírus pode ser monitorada e controlada

(EIRAS & CHAVES 2011).

O teste de “ELISA” (do inglês “Enzyme Linked Immunono Sorbent Assay) é uma

técnica que se destaca, não somente por se basear em reações enzimáticas, mas também por

20

permitir a análise de diversas amostras simultaneamente, apresentar alta sensibilidade,

facilidade na preparação dos reagentes, rapidez e reprodutibilidade dos resultados. Devido à

sua sensibilidade, é possível identificar uma proteína específica presente em uma amostra com

uma população de outras proteínas. Para a realização o teste, utiliza-se como base sólida uma

placa de microtitulação (de polyestireno) constituída de noventa e seis orifícios (pocinhos)

cujas paredes apresentam afinidade a moléculas como proteínas e anticorpos.

O princípio básico da técnica consiste na utilização de uma enzima (normalmente a

fosfatase alcalina) conjugada ao anticorpo ou imunoglobulina, esse conjugado reage com um

substrato incolor (que nesse caso é o p-nitrofenilfosfatodissódico), originando uma coloração

específica que permite evidenciar (indiretamente) a presença ou ausência do antígeno. As

leituras de absorbância para cada orifício são feitas em um colorímetro (EIRAS & CHAVES

2011).

Existem diferentes variantes do ELISA e usualmente, em virologia vegetal, as técnicas

denominadas como ELISA-direto (DAS-ELISA, Double Antybody Sandwich-ELISA) e o

ELISA-indireto são as mais utilizadas para a identificação de espécies e até mesmo de estirpes

de vírus. No DAS-ELISA, utiliza-se uma imunoglobulina específica para a proteína de

interesse (normalmente a capa proteica viral) (EIRAS & CHAVES 2011).

O teste tem como vantagem, a alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades

mínimas do antígeno ou anticorpo pesquisados. O Elisa detecta moléculas na ordem de

nanogramas, tendo menor risco de falsos-negativos; permite que várias amostras sejam

testadas ao mesmo tempo e realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio

em comparação com as outras técnicas de imunodiagnóstico. A desvantagem seria a

necessidade de mão de obra especializada; alguns reagentes podem degradar-se com

facilidade, com exposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas e por ser uma técnica

altamente sensível e específica, é muito susceptível a erros de pipetagem, variações nos

tempos de incubação e lavagens e alterações nos reagentes (SENA, 2010).

6. PCR (Polymerase Chain Reaction)

A técnica de PCR foi desenvolvida no final da década de 1980, rendendo o prêmio

Nobel ao seu inventor, o pesquisador norte americano Kary B. Mullis. A técnica que

revolucionou a biologia molecular é baseada na amplificação do ácido nucleico (DNA) ou de

porções da sequência de interesse flanqueadas por dois oligonucleotídeos (primers) utilizados

em reações catalisadas por uma DNA polimerase. A PCR é altamente sensível, rápida e

21

versátil, permitindo a utilização de variantes que se adequam às diferentes situações de

diagnóstico (EIRAS & CHAVES 2011).

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como

pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases

nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers (também chamados de oligonucleotídeos

ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é

colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos

exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por pouco tempo para

que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das pontes de

hidrogênio). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60°C dependendo da

quantidade de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os primers se anelem

(emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura

é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão),

em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada

reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2 ciclos

.

O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de

poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.

Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, assim

poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado.

No Brasil, a técnica de PCR, em termos de fitovírus tem sido utilizada na obtenção de

clones genômicos, na seleção inicial de plantas transgênicas, na produção de sondas

moleculares específicas e na diagnose, sendo registrada, no país, para diferentes espécies

virais (BRIOSO, 1999; EIRAS et al., 1998; MEISSNER FILHO, 1996; SILVA et al., 1997).

A técnica de “immunocapture PCR” ou de “immunocapture RT-PCR” é uma variação

da técnica de PCR. Após a obtenção do extrato da planta infectada, é feita uma mini-

purificação e as partículas do vírus podem então ser “capturadas”, através da utilização de

anticorpos específicos contra a proteína capsidial do vírus em questão. O DNA das partículas

virais capturadas pelos anticorpos pode em seguida ser amplificado através da reação de PCR

ou RT-PCR. Na prática esta técnica consiste na fusão das técnicas de ELISA e PCR

(ZERBINI et al., 2001).

22

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32

CAPÍTULO II - CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ISOLADOS DE VÍRUS

COLETADOS EM PLANTIOS COMERCIAIS DE MELANCIA EM VÁRZEA

TROPICAL NO ESTADO DO TOCANTINS

RESUMO - As cucurbitáceas estão sujeitas a várias doenças causadas por vírus e a

identificação das espécies que predominam em uma região é de grande relevância para

direcionar as estratégias de controle. O trabalho teve por objetivo diagnosticar por meio de

teste DAS-ELISA e RT-PCR isolados de vírus coletados em plantios comerciais de melancia

em várzea tropical no Estado do Tocantins. Foram coletadas 20 amostras foliares do

município de Formoso do Araguaia e 46 amostras foliares da Lagoa da Confusão. As

amostras foram acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados e transferidas

para o Departamento de Fitopatologia DFP/UFLA e/ou armazenadas em refrigerador a -80°C.

As amostras foram multiplicadas em casa de vegetação em plantas de abóbora Curcubita pepo

cv. Caserta. O teste sorológico DAS-ELISA e as avaliações moleculares foram realizadas no

Laboratório de Virologia da Universidade Federal de Lavras. Nenhuma amostra reagiu com o

antissoro para o vírus do mosaico do pepino (CMV), por outro lado dezesseis reagiram para o

vírus do mosaico-da-abóbora (SqMV). Os vírus predominantes nas regiões produtoras de

melancia cultivada em várzea tropical do Estado do Tocantins foram ZYMV e SqMV e a

ocorrência de infecção mista (ZyMV+SqMV) foi verificada em 35% das amostras do

município da Lagoa da Confusão. No município de Formoso do Araguaia predominou

ZYMV.

Palavras-chave: Citrullus lanatus; Identificação de viroses; SqMV; ZYMV.

33

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF VIRUS ISOLATED COLLECTED IN

COMMERCIAL PLANTINGS OF WATERMELON IN THE STATE OF TROPICAL

VÁRZEA TOCANTINS

ABSTRACT – The cucurbits are subject to various diseases caused by viruses and the

identification of species that predominate in one region has great importance to direct the

control strategies. The study aimed to diagnose by DAS-ELISA and RT-PCR tests virus

isolates collected in commercial plantations of lowland tropical watermelon in the State of

Tocantins. Were collected 20 leaf in the municipality of Formoso do Araguaia and 46 leaf

samples from Lagoa da Confusão. The samples were packed in plastic bags properly

identified and transferred to the Department of Plant Pathology DFP / UFLA and / or stored in

a refrigerator at -80 ° C. The samples were grown in a greenhouse for plants pumpkin

Curcubita pepo cv. Caserta. The DAS-ELISA test serology and molecular evaluations were

performed at the Virology Laboratory of the Federal University of Lavras. No sample reacted

with the antiserum for the cucumber mosaic virus (CMV), on the other hand reacted to sixteen

mosaic virus-of-pumpkin (SqMV). The predominant virus in producing regions of

watermelon grown in lowland tropical rainforest in the state of Tocantins were ZYMV and

SqMV and the occurrence of mixed infection (ZYMV+SqMV) was achieved in 35% of

samples in the municipality of Lagoa da Confusão. In the municipality of Formoso do

Araguaia prevailed ZYMV.

Keywords: Citrullus lanatus; Identification of the viruses; SqMV; ZYMV.

34

1. INTRODUÇÃO

No Estado do Tocantins, as cucurbitáceas constituem importante fonte de renda para

agricultores, sendo a melancia [Citrullus lanatus (Thunb) Matsum & Nakai] a principal

espécie cultivada. As principais regiões produtores são solos de várzea nos municípios de

Formoso do Araguaia e Lagoa da Confusão, que comercializam os produtos para os principais

centros das regiões Centro-Oeste e Sudeste do país, garantindo renda e emprego às

populações locais. Para safra de 2012, a produção foi estimada em cerca de 90 mil toneladas

de melancia numa área aproximada de 3.600 ha (SEAGRO, 2012). As temperaturas que

predominam durante o cultivo são elevadas, mesmo na entressafra (outono-inverno), que

apesar de extrapolar os limites considerados ideais para o desenvolvimento da melancia,

conseguem-se elevadas produtividades, que é atribuído ao uso de subirrigação que propicia

presença de umidade constante no sistema radicular das plantas, o que faz com que esse efeito

seja atenuado. Com solos de boa fertilidade, clima favorável e água suficiente para todo o

ciclo da cultura, a colheita é realizada com cerca de 70 dias após o plantio (SANTOS et al.,

2001).

Apesar dessas vantagens, é notório que mesmo com o uso de tecnologia que propicia a

mecanização do plantio e dos tratos culturais nas várzeas tropicais, tem sido observado que os

problemas de natureza fitossanitária, em especial a ocorrência de viroses, têm dificultado o

cultivo nessa região.

Os vírus que atacam cucurbitáceas nessas condições causam sintomas que são

caracterizados visualmente pela presença de mosqueado, mosaico, deformações foliares e

redução no desenvolvimento da planta. Dentre as espécies de vírus que ocorrem, o vírus da

mancha anelar do mamoeiro, estirpe melancia (Papaya ringspot virus– type watermelon –

PRSV-W), o vírus do mosaico amarelo da abobrinha de moita (Zucchini yellow mosaic virus–

ZYMV) e o vírus do mosaico da melancia (Watermelon mosaic virus– WMV) do gênero

Potyvirus (família Potyviridae) são os mais importantes. O vírus do mosaico do pepino

(Cucumber mosaic virus– CMV) pertencente ao gênero Cucumovirus, (família Bromoviridae)

e o vírus do mosaico da abóbora (Squash mosaic virus– SqMV), do gênero Comovirus

(família Comoviridae) também podem ocorrer (LIMA, 2011).

Lima & Alves (2011) realizaram levantamento de vírus em cucurbitáceas no Brasil em

21 municípios, no período de 2008 a 2010, em um total de 564 amostras exibindo ou não

sintomas suspeitos de viroses. Foi verificada a presença desses vírus por meio de dot-ELISA,

utilizando-se anticorpos policlonais. Os resultados dos testes sorológicos indicaram a

35

presença de vírus em 323 (57,3%) das plantas. Entre os potyvirus, o PRSV-W foi detectado

em 182 (32,3%), WMV em 156 (27,7%) e ZYMV em 156 (27,7%) das amostras. CMV foi

encontrado em 121 (21,5%) das plantas enquanto que ZLCV ocorreu em 74 (19,8%). Infecção

mista com o envolvimento de mais de uma espécie de vírus na planta foi identificada em

31,4% das amostras. Os três potyvirus e o CMV foram detectados em lavouras de todos os

estados amostrados e também no Distrito Federal. A incidência desses vírus variou de 8,7%

(DF) a 85,7% (MG) para o PRSV-W; de 6,3% (TO) a 71,4% (BA) para WMV; de 8% (AM) a

66,7% (RJ; MG) para ZYMV e, de 4% (AM) a 85,7% (MG) para o CMV. O ZLCV foi

detectado em amostras coletadas em áreas dos Estados de Pernambuco (6,7%-47,6%), Bahia

(11,8%-71,4%), Tocantins (28,1% a 38,1%), além do Distrito Federal (3,0%-27,3%); Estes

resultados confirmam a ampla disseminação desses vírus em plantios de cucurbitáceas no

Brasil.

Alencar et al., (2012) em identificação biológica e molecular de vírus detectados em

espécies de cucurbitáceas provenientes do Estado do Tocantins, coletaram em diversos

municípios do estado 25 isolados de abóbora e melancia que apresentavam sintomas

característicos de virose. Catorze dos 25 isolados estudados, ou seja, 56% foram identificados

como Squash mosaic virus (SqMV), tendo sete deles sido provenientes de abóbora „Caserta‟ e

sete de melancia. Os demais isolados foram identificados como Zucchini yellow mosaic virus

(ZYMV). Ao contrário do que ocorre em outras regiões brasileiras, o SqMV foi o vírus com

maior incidência nas amostras coletadas em Tocantins, indicando a sua importância para a

região.

A presença de condições climáticas favoráveis a ocorrência de viroses, tem dificultado o

manejo dessas doenças nos plantios comerciais que são realizados nas várzeas. Dessa forma, a

caracterização molecular de isolados de vírus coletados em plantios comerciais de melancia

em várzea tropical no Estado do Tocantins, representam um importante subsídio para os

programas de melhoramento desenvolvidos na Universidade Federal do Tocantins (UFT) e

também para o manejo e controle dessas viroses pelos produtores da região.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Coleta, identificação, preservação e multiplicação das amostras

O trabalho foi conduzido nas dependências do Laboratório de Virologia Molecular, no

Centro de Indexação de Vírus de Minas Gerais e nas casas de vegetação do Departamento de

Fitopatologia (DFP) da Universidade Federal de Lavras (UFLA).

36

Foram coletadas sessenta e seis amostras foliares de plantas de melancia com sintoma

de virose, oriundas de plantios comerciais de produtores em condições de várzea, sendo 20 do

município de Formoso do Araguaia e 46 do município da Lagoa da Confusão (Tabela 1). As

amostras foram acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados com data e local

de coleta e posteriormente armazenadas em refrigerador a -80°C.

Figura 1- Mapa do estado do Tocantins indicando as regiões onde foram coletadas as

amostras de plantas com sintoma de viroses.

Os isolados coletados foram multiplicados por meio de inoculação mecânica, sendo feita com

o extrato de folhas jovens, das plantas afetadas, obtido por maceração em almofariz de

porcelana na presença de tampão fosfato 0,01 M, pH 7,0 acrescido de sulfito de sódio na

mesma molaridade, na proporção de 1:10 (peso/volume). O extrato foi friccionado as folhas

das plantas-teste receptoras, previamente polvilhadas com o abrasivo carbureto de silício

(Carborundum) e, em seguida, as plantas foram lavadas com água corrente e mantidas em

casa de vegetação em telado a prova de afídeos. Para cada amostra coletada foram utilizadas

três repetições.

37

Tabela 1. Codificação utilizada para identificação de isolados de vírus coletados em plantas

de lavouras comerciais de melancia sob condições de várzea tropical nos municípios de

Formoso do Araguaia e Lagoa da Confusão.

Isolado Local de coleta Isolado Município de coleta

1-FA Formoso do Araguaia 14-LC Lagoa da Confusão




















1-LC Lagoa da Confusão 34-LC Lagoa da Confusão













2.2. Identificação Sorológica e molecular (RT-PCR) dos isolados

Após o aparecimento dos sintomas nas plantas inoculadas, as folhas foram coletadas e

submetidas ao teste de diagnose DAS-ELISA (Clark & Adams 1977) com antissoros

específicos para SqMV e CMV, produzidos pela Agdia® e o procedimento foi segundo a

38

recomendação do fabricante. A amostra foi considerada positiva no teste DAS-ELISA quando

o valor da leitura da absorbância foi pelo menos duas vezes superior ao valor médio da

absorbância registrada para o extrato de planta sadia utilizada como controle negativo.

Na diagnose com RT-PCR foram utilizados primers desenhados com base nos genomas

dos vírus do mosaico da abóbora (SqMV: Foward: 5'- TTTGACGGCATGGTC 3' e Reverse:

5' GGAAAGAAGCCACAAC 3'), do vírus do mosaico amarelo da abóbora (ZYMV: Foward:

5‟ GATTTGAATGAGCAACAGATGG-3‟ e Reverse: 5‟- CTCCGCTGCATCTGAGAAGT-

3‟) e vírus da mancha anelar do mamoeiro estirpe W (PRSV-W: Foward: 5‟-

GATTTGAATGAGCAACAGATGG -3‟ e Reverse: 5‟- CTCCGCTGCATCTGAGAAGT -

3‟). O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir do RNA total extraído, usando o

primer Reverse 5‟CTCCGCTGCATCTGAGAAGT-3‟ e a enzima M-MMLV reversa

transcriptase (Promega, São Paulo/SP-Brasil) de acordo com as recomendações do fabricante.

2.3. Extração de RNA total dos isolados

Para análise de RT-PCR a extração de RNA total das amostras foliares dos isolados foi

realizada pela maceração de 0,2g de folhas jovens com aproximadamente dez dias e com

sintoma característico de virose de cada isolado em almofariz na presença de nitrogênio

líquido e ao produto obtido adicionou-se a solução de Trizol® (solução aquosa contendo 38%

de fenol saturado, 0,8M de guanidinathiocianato, 0,4M de amônio thiocianato e 0,1M de

acetato de sódio, pH 5,5% de glicerol), na proporção de 1g10mL. Posteriormente, os

microtubos (2 mL) foram incubados em temperatura ambiente, por 5 minutos, e centrifugados

a 12.000 RPM, por 10 minutos, a 4ºC. O precipitado obtido foi descartado, adicionando-se

300 μl de clorofórmio a cada microtubo que, posteriormente, foi agitado no vórtex e deixado à

temperatura ambiente por 3 minutos. Após a incubação, os microtubos foram centrifugados

novamente, a 12.000 rpm, por 10 minutos, a 4ºC e o sobrenadante obtido foi transferido para

outro microtubo, adicionando-se a metade do seu volume de isopropanol e 0,8M de citrato de

sódio/1,2M de NaCl. Os tubos foram cuidadosamente misturados por inversão e deixados à

temperatura ambiente por 10 minutos, para que houvesse a precipitação do RNA. Passado

esse tempo, os microtubos foram centrifugados, a 12.000 rpm, a 4ºC, por 10 minutos,

descartando-se, posteriormente, o sobrenadante. O precipitado foi lavado com etanol 75%

gelado, centrifugado a 12.000 rpm, a 4ºC, por 10 minutos. Descartou-se o sobrenadante e o

tubo foi secado a vácuo. O pellet obtido foi ressuspendido em 25μL de água ultrapura tratada

39

com dietilpirocarbonato (DEPC). O RNA total extraído foi visualizado em gel de agarose a

0,7%.

2.4. Síntese do cDNA

A transcrição reversa foi feita empregando-se 0,5 µL do primer reverse, 1,0 µL do RNA

extraído e 4,0 µL de água ultrapura tratada com DEPC em um microtubo que foi inicialmente

incubado, por 5 minutos, a 75°C e, após este tempo, foi imediatamente transferido para o

gelo. Em seguida, acrescentaram-se 2,0 µL de tampão da transcriptase reversa (RT M-MLV

buffer da USB), 0,5 µL de dNTP a 10 mM, 0,2 µL da enzima RT (USB) e 1,8 µL de água

ultrapura tratada com DEPC. Os tubos foram incubados, a 42ºC, por 30 minutos, depois a

95oC, por 5 minutos e transferidos para o gelo.

2.5. Reação de amplificação (PCR)

Em seguida foi feita a amplificação por PCR feito com tampão, MgCl2 (25 mM),

dNTP10 mM, primer senso (primer forward) e antissenso (primer reverse), enzima Go Taq

Flexi DNA polimerase utilizando-se uma desnaturação inicial de 95ºC por 2 minutos, seguida

de 35 ciclos: 95ºC por 45 segundos, 50,7ºC por um minuto, 72ºC por 1 minuto, e extensão

final a 72ºC por 5 minutos. O produto obtido foi analisado por eletroforese em gel de agarose

0,7%, corado com Gel Red (Biotium®).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

No teste DAS-ELISA realizado, nenhuma das amostras reagiram com o antissoro para o

vírus do mosaico do pepino (CMV) nos dois municípios. Por outro lado, dezesseis das 46

amostras do município da Lagoa da Confusão, ou seja, 35% foram identificadas como vírus

do mosaico-da-abóbora (SqMV) (Tabela 2), esse resultado é preocupante já que há poucos

anos atrás não havia relatos desse vírus na região e como a disseminação do vírus é realizada

por algumas espécies de insetos, besouros crisomelídeos (Diabrotica spp. e Acalymma spp.),

por um besouro coccinelídeo, por cigarrinha e via sementes Lima & Amaral (1985), aumenta-

se o alerta quanto à origem do material plantado nessas regiões, pois pode estar havendo uma

introdução a longa distância via semente, já que em outros estados vizinhos sua presença foi

diagnosticada.

40

Tabela 2 - Identificação sorológica DAS-ELISA de amostras foliares de melancia com

sintoma de virose coletadas em áreas de produção comercial de melancia no estado do

Tocantins

Local de coleta

Nº de

amostras

testadas

Nº de

amostras

negativas

Nº de amostras com vírus e

Percentagem de incidência

CMV SqMV

Lagoa da Confusão 46 30 0 (-) 16 (35)*

Formoso do Araguaia 20 20 0 (-) 0 (-)

Total 66 50 0 (-) 16 (35)*

*() percentagem de amostras com vírus

Em trabalhos realizados por Oliveira et al. (2000), Moura et al. (2001), Halfeld-Vieira et

al. (2004) e Silveira (2009) não foram observados ocorrência do mosaico da abóbora em

valores expressivos. Ao avaliar amostras foliares de cucurbitáceas provenientes da região sul

do estado do Tocantins, Alencar et al. (2012) verificaram a ocorrência do SqMV em 56% das

amostras analisadas, corroborando com os dados desse trabalho.

O SqMV tem sido considerado de menor importância no território brasileiro, de

modo que, em algumas regiões, como no nordeste do Brasil, considera-se que os

programas de melhoramento devem considerar apenas o PRSV, estirpes W e P, e o

ZYMV. Entretanto, os resultados aqui obtidos mostraram que essa não é a mesma

realidade que ocorre no Estado do Tocantins, onde uma parcela relevante das amostras

estava afetada com esse vírus. Isso demonstra que o SqMV pode ter encontrado as

condições ideais, na região do Tocantins, para se disseminar e infectar as hospedeiras

locais.

O SqMV pode ser transmitido por meio de sementes comerciais num percentual de até

10% (BLANCARD et al. 1996). No estado do Rio Grande do Norte, o SqMV provavelmente

foi introduzido por intermédio de sementes comerciais importadas (FLORINDO & LIMA

1993). Esse fato pode ter ocorrido, devido a utilização de sementes não certificadas oriundas

de outras regiões.

Apesar de somente a minoria das interações patógeno hospedeiro resultar no processo

de infecção, a transmissão de vírus via sementes pode ser considerada importante com

consequências econômicas sérias para o produtor. A taxa baixa de transmissão não constitui

um bom indicador epidemiológico, já que, em conjunto com a presença de vetores na área

cultivada, podem resultar na introdução de vírus em novas áreas, gerando epidemias e

causando a disseminação para locais mais distantes. Por exemplo, no caso do vírus do

41

mosaico da alface (potivírus), cujo vetor transmite o vírus de modo não persistente, a

incidência de 0,001% de sementes afetadas pode levar ao comprometimento da cultura. Nesse

caso, além da perda de produtividade, ocorre também a perda de qualidade do produto. Por

isso, ao contrário de outras doenças causadas por patógenos, as viroses são doenças que não

podem ser controladas por defensivos quando já estão presentes no campo. Assim, o uso de

sementes certificadas, comprovadamente livres de vírus, representa medida de controle mais

eficiente e de forma preventiva, visando impedir ou retardar ao máximo a entrada do vírus em

uma região de produção (MACHADO, 2010).

No diagnóstico através do teste molecular com RT-PCR, onze amostras provenientes do

município de Formoso do Araguaia amplificaram bandas que caracterizam a presença de

ZYMV (bandas de 200 pb), representando 55% do total de amostras desse município e 17%

do total analisado. Das cinco amostras do município da Lagoa da Confusão, somente a

amostra 2-LC não amplificou banda que caracterizam esse vírus (Figura 2).

Todas as 66 amostras, embora tenham sido testadas com primers para PRSV-W e

SqMV, mostraram resultado negativo, não havendo amplificação de bandas para nenhuma

dessas viroses.

Vinte e sete amostras do município da Lagoa da Confusão amplificaram bandas com o

par de primers empregados para ZYMV, representando 59% das amostras do município e

41% do total (Figura 2, 3 e 4).

42

Figura 2- Análise eletroforética de bandas amplificadas com o primer para Zucchini yellow

mosaic virus (ZYMV). M1: Marcador 1Kb DNA ladder; 1F a 11F amostras 2-FA; 3-FA; 4-

FA; 5-FA; 6-FA; 7-FA; 8-FA; 9-FA; 10-FA e 11-FA representam isolados de Formoso do

Araguaia; 1 ao 5 amostras: 1-LC; 2-LC; 3-LC; 4-LC e 5-LC, representam isolados da Lagoa

da Confusão; CP (Controle Positivo); CN (Controle Negativo) e M2: Marcador 100 pb.

Figura 3- Análise eletroforética das bandas amplificadas com primer para Zucchini yellow

mosaic vírus (ZYMV). M1 e M2: Marcador 100pb; 1 a 9: amostras 6-LC, 7-LC, 8-LC, 9-LC,

10-LC, 11-LC, 12-LC, 13-LC e 14-LC provenientes da Lagoa da Confusão. CP: Controle

Positivo, CN: Controle Negativo.

43

Figura 4- Análise eletroforética das bandas amplificadas com o primer para Zucchini yellow

mosaic virus. M1 e M2: Marcador 100pb; 1 a 14: amostras: 15-LC, 16-LC, 17-LC, 18-LC,

19-LC, 20-LC, 21-LC, 22-LC, 23-LC, 24-LC, 25-LC, 26-LC, 27-LC e 28-LC provenientes da

Lagoa da Confusão. CP: Controle Positivo, CN: Controle Negativo.

O ZYMV foi identificado em outras regiões do país. Em Roraima Halfeld-Vieira et al.

(2004), Amazonas Lima et al. (2010), na região do Submédio do São Francisco Silveira et al.

(2009) e no Maranhão Moura et al. (2001). Recentemente Alencar et al. (2012) encontraram

44% das amostras foliares de cucurbitáceas no estado do Tocantins com a presença de

ZYMV, corroborando com os resultados desse trabalho.

Dezesseis amostras oriundas da Lagoa da Confusão que foram positivas para antissoro

do SqMV no teste DAS-ELISA também foram positivas no teste molecular RT-PCR para o

vírus ZYMV, constatando assim infecção mista em 24% do total de amostras e 35% das

amostras do município da Lagoa da Confusão. Dikova & Hristova (2002) ao avaliarem a

presença dos vírus ZYMV, SqMV e CMV em sementes de cucurbitáceas, verificaram a

presença bastante significativa, chegando a 91% de ZYMV e SqMV e 95% de CMV em uma

variedade comercial.

Ramos et al. (2003) afirmam que as estratégias para convivência com essas viroses

oriundas de infecção mista não devem considerar os vírus isoladamente, uma vez que os dois

estão ocorrendo de forma simultânea e podem causar maiores prejuízos quando afetam uma

mesma planta ao mesmo tempo.

Halfeld-Vieira et al. (2004) analisando amostras coletadas em épocas diferentes nos

anos de 2003/2004 no Estado de Roraima verificaram a presença de PRSV-W, WMV e

ZYMV em infecções simples e mista.

A infecção mista encontrada pode ser proveniente da interação de vírus de gêneros

diferentes, que são transmitidos por insetos de maneiras diferentes, sendo o ZYMV

44

transmitido de maneira não persistente por afídeos. Com relação ao SqMV que é transmitido

de modo semi-persistente por afídeos e também por sementes, mesmo assim esses dois vírus

encontraram meios para sua disseminação na região do Tocantins.

A transmissão do SqMV ocorre por meio de insetos da ordem Coleoptera, dos gêneros

Diabrotica (D. speciosa, D. bivitula) e Epilachma (Epilachma cacica), de maneira persistente

ou circulativa (ZITTER et al., 1996), por besouros crisomelídeos (Diabrotica spp. e

Acalymma spp.) (FREITAG, 1956; LASTRA, 1968; SITTERLY, 1960; STONER, 1963), por

um besouro coccinelídeo (COHEN, NITZANY, 1963) e por cigarrinha (STONER, 1963).

Tem sido evidenciado que todos as viroses transmitidas pela semente também o são

pelo grão de pólen ou pelo óvulo. O pólen como veículo de vírus implica na produção de

sementes contaminadas e na infecção de plantas livres de vírus e os insetos contribuem para

essa disseminação.

As viroses prejudicam substancialmente a produtividade de melancia, portanto, os

produtores da região avaliada, que representa a principal região produtora de melancia no

Estado do tocantins, precisam tomar medidas preventivas, como por exemplo, o uso de

sementes certificadas para amenizar os prejuízos provocados pela ocorrência de viroses.

4. CONCLUSÕES

As viroses predominantes em melancia cultivada em várzea tropical do Estado do

Tocantins são ZYMV e SqMV.

A infecção mista (ZYMV+SqMV) representou 35% das amostras do município da

Lagoa da Confusão.

No município de Formoso do Araguaia predomina ZYMV.

45






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48

CAPÍTULO III- REAÇÃO FENOTÍPICA DE PLANTAS DE ABÓBORA E MELÃO À

INFECÇÃO POR ISOLADOS SIMPLES DE ZYMV E MISTO DE ZYMV+SQMV

RESUMO - Com esse trabalho, objetivou-se verificar através da inoculação artificial, a

reação fenotípica de plantas de abóbora cv. „Caserta‟ a isolados de ZYMV e ZYMV+SqMV e

também verificar a reação fenotípica em quatro genótipos de melão de um isolado misto

(ZYMV+SqMV), ambos oriundos de regiões produtoras de melancia no Estado do Tocantins.

O trabalho foi realizado em casa de vegetação com telados a prova de afídeo. O delineamento

experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com cinco plantas por parcela e três

repetições. As plantas inoculadas foram observadas quanto ao aparecimento de sintomas aos

28, 33 e 38 dias após a germinação. Nas plantas de abóbora, inoculadas com o isolado

simples, os sintomas predominantes exibidos foram mosaico e nervuras paralelas. Nas

infecções mistas houve maior agressividade dos sintomas, evoluindo para deformações e

estreitamentos foliares, além de bolhosidade, nervuras paralelas e esporão, comprometendo

grande parte da área foliar das plantas avaliadas. Nos genótipos de melão, os sintomas

observados foram mais agressivos nos genótipos Sunshine e Amarelo. No genótipo Eldorado

observou-se apenas mosaico e no melão Valenciano não foi observado sintomas.

Palavras-chave: Curcubita sp., Cucumis melo, infecção mista, sintomatologia

49

PHENOTYPIC REACTION OF PUMPKIN AND MELON PLANTS TO INFECTION

OF ISOLATED SINGLE AND MIXED ZYMV ZYMV+SqMV

ABSTRACT – With this work, aimed to verify through artificial inoculation, the phenotypic

response of plants pumpkin cv. 'Caserta' to isolates of ZYMV and ZYMV+SqMV and also

check the phenotypic reaction in four genotypes of melon from an isolated mixed

(ZYMV+SqMV), both coming from watermelon producing regions in the state of Tocantins.

The study was conducted in a greenhouse with a screened proof aphid. The experimental

design was completely randomized with five plants per plot and three replications. The

inoculated plants were observed for symptoms as at 28, 33 and 38 days after germination.

Pumpkin plants, inoculated with simple isolate, the predominant symptoms exhibited were

mosaic and parallel veins. In mixed infections there were more aggressive symptoms,

progressing to narrowing and leaf deformation, and bubbles, parallel ridges and spur,

compromising much of the leaf area of plants evaluated. In melon genotypes, the symptoms

observed were more aggressive in Sunshine and Yellow. Genotypes in Eldorado genotype

was observed only mosaic and melon Valenciano was not observed symptoms.

Keywords: Curcubita sp., Cucumis melo, mixed infection symptoms

50

1. INTRODUÇÃO

A família Cucurbitaceae caracteriza-se por ser um grupo de plantas com relativo valor

comercial, tendo destaque as abóboras (Cucurbita spp.), melancia [Citrullus lanatus (Thunb)

Matsum & Nakai] e melão (Cucumis melo L.) que, na região Norte do Brasil, apresentam alto

potencial de produção devido às condições climáticas favoráveis, como temperatura elevada e

altos níveis de insolação, fatores preponderantes no desenvolvimento dos frutos dessas

espécies.

Segundo Vieira et al. (2005), as cucurbitáceas estão sujeitas a várias doenças causadas

por vírus que podem reduzir substancialmente a sua produtividade, tanto quantitativa como

qualitativamente. No caso da melancia e do melão, já foram relatados várias espécies de vírus

em plantios comerciais no Brasil, causando redução na qualidade e a quantidade dos frutos,

podendo limitar o cultivo em algumas regiões (LIMA et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2002;

LIMA et al., 2012).

Mais de 20 vírus podem infectar naturalmente plantas da esta família Cucurbitaceae

(Finetti-Sialer et al., (2012), sobressaindo-se aqueles pertencentes ao gênero Potyvirus, sendo

eles: vírus da mancha anelar do mamoeiro (Papaya ringspot virus type watermelon – PRSV-

W), vírus do mosaico da melancia (Watermelon mosaic virus - WMV) e vírus do mosaico

amarelo da abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus - ZYMV), todos de

importância econômica para as cucurbitáceas pela interferência nos cultivos do meloeiro, da

melancia e da abóbora. A patologia dessas espécies e dos vírus, de um modo geral, pode ser

observada por uma série de sintomas, que incluem mosqueado, mosaico, clorose, deformação

foliar e de frutos (OLIVEIRA et al., 2000).

Outro vírus motivo de preocupação na região Norte do país é Squash mosaic virus

(SqMV), pertencente à família Comoviridae, gênero Comovirus. Uma característica

preocupante desse vírus é o fato de ser transmitido por sementes, propiciando a sua introdução

em áreas onde este vírus ainda não ocorre, se tornando um meio de disseminação tanto a curta

quanto a longa distância. Em estudos recentes, Alencar et al. (2012) verificaram a presença de

56% desse vírus nas amostras analisadas. Esse vírus ocorre mundialmente causando o

mosaico da abóbora em cucurbitáceas e tem sido detectado no Brasil, em áreas produtoras de

estados das Regiões Norte e Nordeste e também no Distrito Federal (KUROSAWA et al.,

2005).

O SqMV é, ainda, transmitido de maneira persistente por insetos da ordem Coleoptera,

entre os quais destacam-se as seguintes espécies: Diabrotica speciosa, D. bivitula e

51

Epilachma cacica. Embora o vírus não se multiplique no vetor, pode ser recuperado de

fluidos de regurgitação, fezes e hemolinfa dos insetos vetores (PROVVIDENTI e

HAUDENSHIELD, 1996). A transmissão pode se dar, também, por inoculação mecânica,

mas não pelo contato entre plantas (VIANA et al., 2003; KUROZAWA & PAVAN, 1997).

Segundo Santos & Zambolim (2011), as plantas afetadas por potyvirus exibem nas

folhas sintomas de mosaico, em alguns casos amarelo, acompanhado por deformações foliares

e redução no desenvolvimento das plantas, podendo surgir também bolhas verde-escuras nas

folhas com mosaico, dependendo do potyvirus.

Os sintomas causados pelo vírus-do-mosaico-da-abóbora são variáveis e dependem da

cultivar ou híbrido e da natureza do isolado. As plantas afetadas, geralmente, apresentam

folhas com manchas anelares, mosaico severo e protuberâncias pequenas e alongadas sobre a

superfície da folha As plantas severamente afetadas produzem frutos variegados e

malformados (VIANA et al., 2003).

O objetivo do trabalho foi verificar através da inoculação artificial, a reação fenotípica

de plantas de abóbora cv. „Caserta‟ a isolados de ZYMV e ZYMV+SqMV e também verificar

a reação fenotípica em quatro genótipos de melão de um isolado misto (ZYMV+SqMV),

ambos oriundos de regiões produtoras de melancia no Estado do Tocantins.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Virologia Molecular, no Centro de

Indexação de Vírus de Minas Gerais e também em casas de vegetação localizadas no

Departamento de Fitopatologia (DFP) da Universidade Federal de Lavras (UFLA) e Estação

Experimental da Universidade Federal do Tocantins, Campus de Gurupi, setor de

Olericultura.

Foram utilizados isolados caracterizados previamente, sendo dezenove de ZYMV e

dezesseis de (ZYMV+SqMV) obtidos de lavouras comerciais de produção de melancia na

várzea, dos municípios de Formoso do Araguaia e Lagoa da Confusão.

Os isolados foram inoculados em plantas de abóbora cv. „Caserta‟ e um isolado misto

em quatro cultivares de melão, Sunshine®

Tecnoseed; Amarelo da Syngenta; Eldorado 300®

cultivar lançada em 1987 a partir de uma parceria entre a Embrapa Hortaliças e a Embrapa

Semi-Árido para a incorporação de genes de resistência ao vírus PRSV-W (Papaya ring spot

virus, strains W) no genoma da cultivar Valenciano Amarelo e o Valenciano.

52

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com três

repetições. Cada parcela foi formada por cinco plantas de cada tratamento, totalizando quinze

plantas por tratamento. O experimento foi conduzido em casa de vegetação, com temperatura

variando de 26 a 38ºC. Em todos os casos, o plantio foi realizado em vasos de polietileno de

12 cm de diâmetro, com capacidade de 2 Kg, contendo uma mistura de terra, areia e esterco,

na proporção 2:2:1.

Foram feitas duas inoculações artificiais, a primeira na fase cotiledonar e a segunda dois

dias depois usando como inóculo tecido foliar infectado de folhas de plantas de abobrinha cv.

„Caserta‟, dos respectivos isolados, usando como meio solução tamponada obtida de extrato

de folhas jovens, das plantas afetadas, por meio de maceração em almofariz de porcelana na

presença de tampão fosfato 0,01 M, pH 7,0 acrescido de sulfito de sódio na mesma

molaridade, na proporção de 1:10 (peso/volume). O extrato foi friccionado nas folhas das

plantas de abóbora e de melão previamente polvilhadas com abrasivo carbureto de silício

(Carborundum) e, em seguida, as plantas foram lavadas com água corrente.

Foram realizadas três avaliações aos 28; 33 e 38 dias após a germinação caracterizando-

se o padrão de sintoma observado.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nas avaliações fenotípicas todas as plantas de abóbora cv. „Caserta‟ apresentaram

sintomas após a inoculação dos isolados de ZYMV ou em combinação com SqMV. Esse

resultado comprova a eficiência da inoculação, pois a cv. „Caserta‟ é um genótipo

conhecidamente suscetível aos vírus, sendo por isso muito utilizada nos trabalhos de avaliação

de virulência de isolados (OLIVEIRA et al. 2000).

Os sintomas exibidos pelas plantas de abóbora em relação à inoculação simples com

ZYMV evoluíram de mosaico leve, subdesenvolvimento das plantas, estreitamento foliar e

enrolamento foliar à mosaico severo, nervuras paralelas, enação, bolhosidade, bordas

franzidas e deformação foliar, sintomas característicos da presença de ZYMV Zucchini yellow

mosaic virus (Tabela 1). Segundo Ramos et al. (2003) e Lopes et al. (2008) as plantas afetadas

por esse vírus podem apresentar mosaico, redução do limbo foliar, deformação nas folhas e

frutos, necrose e bolhas, podendo os sintomas variarem conforme o hospedeiro infectado e o

isolado utilizado.

53

Tabela 1. Sintomas exibidos por abobrinha (Cucurbita pepo) cultivar „Caserta‟ inoculadas

com Zucchini yellow mosaic vírus (ZYMV) em experimento de casa de vegetação. Isolados

1F a 11F oriundos do município de Formoso do Araguaia-TO e os demais isolados oriundos

do município da Lagoa da Confusão, Estado do Tocantins.

Sintomatologia*ZYMV

1ª avalição 2ª avaliação 3ª avaliação

Abóbora cv. Caserta Aos 28 dias Aos 33 dias Aos 38 dias

Isolado 1-FA M, Ef, Bl M, Df, Ef, Bl M, Df, Ef, Bl

Isolado 2-FA M, Np M, Np M, Np, Et

Isolado 3-FA M M M

Isolado 4-FA M M M

Isolado 5-FA M M M

Isolado 6-FA M M, Np M, Np

Isolado 7-FA M M, Bl M, Bl

Isolado 8-FA M M, Np, En M, Np, En

Isolado 9-FA M, Bl M, Bl, Bf, Ef M, Bl, Bf, Ef

Isolado 10-FA M M M, Np

Isolado 11-FA M M M

Isolado 4-LC M M M

Isolado11-LC M M, Df, Np M, Df, Np, Sd

Isolado 13-LC Df, Et, Bf Df, Et, Bf, Sd, En Df, Et, Bf, Sd, En

Isolado 17-LC M M M

Isolado 20-LC M, Np M, Np M, Np


Isolado 22-LC M M, Bl M, Bl

Isolado 23-LC Df, Et, Bf, Ef Df, Bf, Ef, En Df, Et, Bf, Ef, En *Bf: bordas franzidas; Bl: bolhosidade; Et: estreitamento foliar; Cs: cordão de sapato; Df: deformação foliar; Ef:

enrolamento foliar; En: enação; M: mosaico; Np: nervuras paralelas; Sd: subdesenvolvimento; S/S: sem

sintomas.

Nas três avaliações realizadas foram observado aumento da agressividade dos sintomas

no decorrer dos dias de avaliação. O isolado 8-FA (Figura 1H) de Formoso do Araguaia

causou mosaico já na primeira avaliação, avançando para enação e nervuras paralelas (Tabela

1). Por outro lado, para os isolados 3-FA, 4-FA, 5-FA, 11-FA, 4-LC e 17LC foram

observados nas três avaliações somente a ocorrência de mosaico (Figura 1C, D, E, K, L e O;

Tabela 1).

54

Figura 1– Sintomas induzidos por Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) em plantas de

abóbora cultivar „Caserta‟: (B, F, H, J, M, P) e (Q) isolados 2-FA, 6-FA, 8-FA, 10-FA, 11-

FA, 20-LC e 21-LC respectivamente com nervuras paralelas como principal sintoma; (A, C,

D, E, K, L) e (O) isolados 1-FA, 3-FA, 4-FA, 5-FA, 11-LC, 4-LC e 17-LC respectivamente,

com mosaico; (G, I) e (R) isolados 7FA, 9FA e 22-LC, respectivamente, com bolhosidade e

(N) e (S) isolados 13-LC e 23-LC, respectivamente, com deformação foliar.

Os isolados 1-FA, 2-FA, 8-FA e 9-FA (Figura 1A, B, H e I; Tabela 1) todos oriundos de

Formoso do Araguaia foram os que apresentaram três ou mais tipos de sintomas. O mosaico

foi comum a todos os isolados para esse município, já na Lagoa da Confusão, nos isolados 13-

55

LC e 23-LC (Figura 1N e S) não foi percebido esse sintoma, porém foram os que exibiram o

maior número de sintomas ao fim da terceira avaliação, predominando deformação e

estreitamento foliar, bordas franzidas, subdesenvolvimento e enação. Os isolados 2-FA, 6-FA,

8-FA, 10-FA, 11-FA, 20-LC e 21-LC exibiram nervuras paralelas como principal sintoma

(Figuras 1B, F, H, J, M, P e Q; Tabela 1).

Moura et al. (2005) analisando reação de acessos de Curcubita sp. ao ZYMV

verificaram que o vírus provoca forte desorganização no arranjo e na forma das células

epidérmicas e do parênquima paliçádico, induzindo hiperplasia nas células (multiplicação

exagerada das células) causando deformação foliar, sintoma verificado em algumas plantas de

abóbora inoculadas com os isolados 1FA, 11LC, 13LC e 23LC (Figuras 1A, K, N e S, Tabela

1). Esse padrão de sintoma também foi verificado na infecção mista e com maior

agressividade nos isolados 3-LC, 5-LC, 9-LC, 10-LC, 12-LC, 15-LC, 19-LC e 24-LC (Figuras

2B, C, G, H, I, K, N e O, Tabela 2). Os genótipos de melão „Sunshine‟ e „Amarelo‟

apresentaram deformação foliar (Figuras 2Q e R). As deformações foliares causam graves

consequências para o desenvolvimento da planta, pois afetam sua fotossíntese por diminuir a

área exposta, consequentemente interferindo na produtividade.

56

Figura 2– Sintomas induzidos por isolado misto de Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) e

Squash mosaic vírus (SqMV) em plantas de abóbora cultivar „Caserta‟ e quatro genótipos de

melão induzidos pela infeção mista de Zucchini yellow mosaic virus(ZYMV) Zucchini yellow

mosaic virus (ZYMV) e Squash mosaic vírus (SqMV) : (A, B, D, G, J) e (P) isolados 1-LC, 3-

LC, 6-LC, 9-LC, 14-LC e 28-LC respectivamente com mosaico, deformações foliares e

nervuras paralelas como principais sintomas; (C, F, I, K, e O) isolados 5-LC, 8-LC, 12-LC,

15-LC, e 24-LC respectivamente com deformação foliar e enação; (E) e (H) isolados 7-LC e

10-LC respectivamente com estreitamento e enrolamento foliar; (N) isolado 19-LC com bolha

como sintoma mais evidente e (M) isolado 18-LC com mosaico e crescimento do limbo foliar

no pecíolo da folha (esporão). Em genótipos de meloeiro (Cucumis melo): (Q) „Sunshine‟ e

(R) „Amarelo‟ com bolhas e deformações foliares; (S) „Eldorado‟ com mosaico e (T)

„Valenciano‟ não apresentou sintoma.

57

Nas infecções mistas podem ocorrer relações sinérgicas, causando aumento ou decréscimo na

concentração dos vírus na planta, modificação nos sintomas da doença e/ou alteração na

movimentação sistêmica dos vírus (OLIVEIRA et al., 2000). Ramos et al. (2003) ao

analisarem os efeitos da interação de alguns vírus, verificaram que ao serem inoculados com

ZYMV e WMV os híbridos de meloeiro exibiram, desde o inicio da infecção, sintomas mais

severos que os das plantas com infecções isoladas, evidenciando interação sinérgica entre os

dois vírus em questão.

Tabela 2. Sintomas exibidos por abobrinha (Cucurbita pepo) cultivar „Caserta‟ oriundos do

município da Lagoa da Confusão em quatro genótipos de melão (Cucumis melo) induzidos

pela combinação de (ZYMV+SqMV).

Sintomatologia*ZYMV+SqMV

1ª avalição 2ª avaliação 3ª avaliação

Abóbora cv.

Caserta Aos 28 dias Aos 33 dias Aos 38 dias


Isolado 3-LC M, Np, Sd, Et, Ef M, Np, Sd, Et, Df, Ef M, Np, Sd, Et, Df, Ef

Isolado 5-LC M, Df, Et, Sd M, Df, Et, Sd, En, Ef M, Df, Et, Sd, En, Ef

Isolado 6-LC Np, Sd Np, Sd Np, Sd

Isolado 7-LC M, En, Ef M, En, Sd, Et, Ef, M,En,Sd, Et, Ef

Isolado 8-LC M, Sd, Et, En M, Sd, Et, En M, Sd, Et, En

Isolado 9-LC M, Np, Df M, Np, Df, Sd M, Np, Df, Sd

Isolado 10-LC M, Df, Et M, Df, Et, Bf, Ef, Cs M, Df, Et, Bf, Ef, Cs

Isolado 12-LC M, Df, Bl, En M, Df, Bl, Sd, En, Ef M, Df, Bl, Sd, Em, Ef

Isolado 14-LC M, Bl, Bf, Ef M, Bl, Bf, Ef M, Bl, Bf, Ef

Isolado 15-LC M, Df, Et M, Df, Et, Bf, Ef M, Df, Et, Bf, Ef

Isolado 16-LC M, Np, Bf M, Np, Bf, En M, Np, Bf, En

Isolado 18-LC M, Et, Es M, Et, Es M, Et, Es

Isolado 19-LC M,Bl,Np,Df, Bf M,Bl,Np,Df, Bf M,Bl,Np,Df, Bf

Isolado 24-LC M, Df, Sd, Ef M, Df, Sd, Et, Ef M, Df, Sd, Et, Ef

Isolado 28-LC M, Np, Bf M, Np, Bf M, Np, Bf

Melão

Melão Sunshine M, Bl, Df M, Bl, Df M, Bl, Df

Melão Amarelo M, Bl, Bf, Df M, Bl, Bf, Df M, Bl, Bf, Df

Melão Eldorado M M M

Melão Valenciano S/S S/S S/S *Bf: bordas franzidas; Bl: bolhosidade; Es: esporão; Et: estreitamento foliar; Cs: cordão de sapato; Df:

deformação foliar; Ef: enrolamento foliar; En: enação; M: mosaico; Np: nervuras paralelas; Sd:

subdesenvolvimento; S/S: sem sintomas.

58

A agressividade do isolado de ZYMV constatada em infecções simples e dupla já foi

relatada por Provvident et al. (1984) e Oliveira et al. (2000), sendo a doença ocasionada por

esse vírus considerada uma das viroses mais destrutivas em cucurbitáceas, ocorrendo, tanto

nos trópicos, como em regiões temperadas.

Rodrigues (2011), analisando a sintomatologia de amostras foliares de melancia de

algumas cidades do estado do Tocantins verificou a presença de mosaico e bolhosidade,

enquanto que em combinação com outros vírus como PRSV-W, ZLCV, CMV e WMV os

sintomas foram bem mais severos como bolhosidade, subdesenvolvimento, estreitamento

foliar, deformação foliar e necrose. Os isolados 12-LC, 14-LC e 19-LC (Figuras 2I, J e L,

Tabela 2) também exibiram no limbo foliar essas saliências de aparência bolhosa. Na infecção

simples houve a presença de bolhas em dois isolados 7-FA e 22-LC (Figuras 1G e R, Tabela

1).

O crescimento do limbo foliar no pecíolo da folha (esporão) (Figura 2M), sintoma típico

em infecções mistas foi encontrado no isolado 18-LC do município da Lagoa da Confusão. O

mesmo sintoma foi caracterizado em trabalho de Ramos et al 2003 ao analisar os efeitos da

interação do ZYMV com os vírus WMV e PRSV em híbridos de meloeiro, variedades de

melancia e abobrinha, o que vem a aumentar o sinergismo e interação do ZYMV com outros

vírus.

Quando ocorre sinergismo entre os vírus em infecção mista podem acontecer alterações

nos sintomas da doença (RAMOS et al., 2003). É importante salientar que hospedeiros

diferentes, mesmo dentro de uma mesma espécie, podem apresentar reações sintomatológicas

diferenciadas dependendo da combinação de vírus que estão causando a infecção. Dessa

maneira, as estratégias para convivência com essas viroses não devem considerar os vírus

isoladamente, uma vez que os dois estão ocorrendo de forma simultânea e podem causar

maiores prejuízos quando afetam uma mesma planta ao mesmo tempo, como pode ser

observado nesse trabalho.

Os sintomas induzidos pela infeção mista de ZYMV+SqMV em abóbora cultivar

„Caserta‟ se apresentaram de forma mais intensa, com um número maior de sintomas se

comparado aos verificados na infeção simples. Nos isolados 1-LC, 3-LC, 6-LC, 9-LC, 14-LC

e 28-LC (Figura 2A, B, D, G, J e P, Tabela 2) respectivamente exibiram mosaico,

deformações foliares e nervuras paralelas como principais sintomas. Foi verificado nos

isolados 5-LC, 8-LC, 12-LC, 15-LC, e 24-LC (Figura 2C, F, I, K, e O, Tabela 2) deformação

foliar e enação. Verificou-se também estreitamento e enrolamento foliar nos isolados 7-LC e

59

10-LC (Figuras 2E e H). Embora as plantas não sejam destruídas pelos vírus, os cultivos

infectados têm o processo de produção severamente interrompido, produzindo frutos anormais

e/ou deixando de produzir (CLOUGH, 1995).

No melão Amarelo foram observados os sintomas mais agressivos. O genótipo

„Eldorado‟ (Figura 2S) exibiu apenas mosaico, já o melão „Valenciano‟ apresentou-se

assintomático, sendo possivelmente tolerante aos vírus inoculados. Na década de 80 esse

genótipo foi alvo de estudos para a incorporação de genes de resistência a vírus, método que

poderia ter uma abrangência maior já que vem dando resultados (LOPES, 1997).

Como os isolados de ZYMV e SqMV foram coletados de lavouras comerciais de

melancia da região sul do Estado do Tocantins, é de suma importância a preocupação dos

produtores com a qualidade fitossanitária das sementes que estão utilizando nas suas lavouras,

não utilizando sementes de frutos produzidos na região, pois essas possuem um maior risco de

estarem contaminadas com vírus, já que o SqMV é transmitido via semente e os sintomas

ocasionados pela combinação dos dois vírus foram bastante agressivos, por isso a importância

de se tomar medidas preventivas antes de iniciar um plantio e uma decisão simples e correta

como se plantar apenas sementes certificadas pode garantir uma lavoura livre de sintomas tão

prejudiciais à cultura.

4. CONCLUSÕES

Os sintomas mais comuns observados pela infecção por ZYMV foram mosaico e

nervuras paralelas.

A sintomatologia das plantas de abóbora em relação à inoculação pelos vírus

ZYMV+SqMV foi mais agressiva no decorrer das avaliações, evoluindo para deformações e

estreitamentos foliares, além de bolhosidade, nervuras paralelas e esporão, comprometendo

grande parte da área foliar.

Nos genótipos de melão, somente o Melão Valenciano não apresentou sintomas

característicos de vírus.

60






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caracterização de isolados de vírus coletados em melancia no