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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
CARACTERIZAÇÃO DE LEVEDURAS TERMOTOLERANTES
PARA PRODUÇÃO DE ETANOL CELULÓSICO
DANIELA ARRUDA COSTA
OURO PRETO
MINAS GERAIS – BRASIL
2011
DANIELA ARRUDA COSTA
CARACTERIZAÇÃO DE LEVEDURAS TERMOTOLERANTES
PARA PRODUÇÃO DE ETANOL CELULÓSICO
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Ouro Preto, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia,
para obtenção do título de Magister Scientiae.
OURO PRETO
MINAS GERAIS – BRASIL
2011
Catalogação: [email protected]
C837c Costa, Daniela Arruda. Caracterização de leveduras termotolerantes para produção de etanol
celulósico [manuscrito] / Daniela Arruda Costa. - 2011. xiii, 61f.: il., color; graf.; tabs. Orientador: Prof. Dr. Luciano Gomes Fietto. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a Processos e
ao Tratamento de Doenças.
1. Fermentação - Teses. 2. Leveduras - Teses. 3. Álcool como combustível - Teses. 4. Biocombustíveis - Teses. I. Fietto, Luciano Gomes. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.
CDU: 582.282.23:620.92
Aos meus pais Elza e Simeão.
Aos meus irmãos, Dri, Fred e Rafa.
DEDICO.
“Sonho que se sonha só,
é apenas um sonho que se sonha só,
mas sonho que se sonha junto é realidade.”
Raul Seixas
AGRADECIMENTOS
À Deus por guiar meus passos nesta caminhada e me iluminar nos momentos
difíceis.
À Universidade Federal de Ouro Preto e ao Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia pela oportunidade e pelo apoio acadêmico e institucional.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular pela acolhida e suporte.
À Capes pela bolsa concedida.
Ao CNPq e FAPEMIG pelo fomento à pesquisa.
Aos meus pais Elza e Simeão, pelo amor, dedicação e por não medirem
esforços para que eu pudesse seguir sempre em frente.
Aos meus irmãos Adriana, Frederico e Rafael, pelo incentivo, amor e alegria de
viver.
Ao Professor Dr. Luciano Gomes Fietto pela orientação, apoio e amizade.
Às professoras Dra. Andréa Barros Ribon e Dra. Juliana Lopes Rangel Fietto,
pela amizade e conselhos para o aprimoramento desde trabalho.
Aos amigos Carlos e Zamira por terem acompanhado todo o trabalho, fazendo
valiosas críticas e sugestões.
À Patrícia e Fernanda, pelo auxílio nos experimentos.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Biotecnologia Molecular, por tornar a
estadia em Viçosa mais agradável: Adíverson, Ananda, Ancély, Aline, Carlos, Daiane,
Danielle, Felipe, Fernanda, Glauco, Héllida, Mary, Mariana, Marina, Mário, Patrícia,
Priscilla, Raphael, Silvana, Zaira e Zamira.
Aos amigos Matheus e Ramon pelo grande incentivo, apoio nos momentos
difíceis e pelos maravilhosos momentos de descontração.
Aos queridos amigos do Mestrado em Biotecnologia: Bruna, Bruno, Cris, David,
Franciny, Iara, Luciana, Rodrigo, Val e Zamira, além da Doutoranda Pauline, pelos
maravilhosos momentos que passamos juntos.
À grande amiga Val e sua família, pelo suporte, companhia e torcida.
À família Toka por estar sempre presente na minha vida.
A todos os meus amigos, pela torcida e apoio em todas as horas.
À Vó Guida, pelo carinho e orações.
À minha família, pelo incentivo e amor concedidos. Em especial aos meus
avós: Vó Surica, Vô Celso e Vô Arruda, saudades eternas.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS ............................................................ vii
RESUMO ..................................................................................................................... ix
ABSTRACT ................................................................................................................. xi
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 3
2.1 Biocombustíveis ............................................................................................. 3
2.2 Etanol celulósico ............................................................................................. 3
2.2.1 Biomassa lignocelulósica ......................................................................... 4
2.3 Processo de obtenção de etanol de segunda geração ................................... 7
2.3.1 Pré-tratamento ......................................................................................... 7
2.3.2 Hidrólise .................................................................................................. 8
2.3.3 Fermentação da biomassa hidrolisada .................................................... 9
2.3.3.1 Hidrólise e fermentação em separado (SHF) ........................................... 10
2.3.3.2 Sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) ...................................... 10
2.4 Micro-organismo fermentador ....................................................................... 11
2.4.1 Fermentação de pentoses e hexoses .................................................... 12
2.4.2 Tolerância a inibidores ........................................................................... 13
2.4.3 Termotolerância ..................................................................................... 13
2.4.4 Tolerância a etanol ................................................................................ 14
2.4.5 Levedura: Saccharomyces cerevisiae ................................................... 15
2.4.6 Levedura: Kluyveromyces marxianus .................................................... 16
3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 18
3.1 Objetivo geral ............................................................................................... 18
3.2 Objetivos específicos .................................................................................... 18
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 19
4.1 Linhagens e meios de cultura ....................................................................... 19
4.2 Identificação molecular da levedura .............................................................. 19
4.2.1 Extração do DNA total ........................................................................... 20
4.2.2 Amplificação utilizando os iniciadores NL1 e NL4 .................................. 20
4.2.3 Purificação dos produtos de PCR e reação de seqüenciamento............ 21
4.2.4 Análise das seqüências ......................................................................... 21
4.3 Fotomicrografias das leveduras .................................................................... 21
4.4 Caracterização fisiológica ............................................................................. 22
4.4.1 Crescimento em placas ......................................................................... 22
4.4.2 Crescimento em microplacas ................................................................. 22
4.5 Ensaios de fermentação ............................................................................... 24
4.5.1 Ensaios de fermentação com glicose .................................................... 25
4.5.2 Ensaios SSF com bagaço de cana de açúcar........................................ 25
4.5.2.1 Pré-tratamento ácido-básico .................................................................... 25
4.5.2.2 Sacarificação e fermentação simultânea a 37°C e a 42°C ....................... 25
4.6 Parâmetros fermentativos ................................................................................ 26
4.7 Métodos analíticos – Concentrações de Glicose e Etanol ......................... 26
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 28
5.1 Identificação molecular da levedura ................................................................. 28
5.2 Fotomicrografia das leveduras ...................................................................... 28
5.3 Avaliação do crescimento das leveduras em meio sólido ................................. 29
5.4 Avaliação do crescimento das leveduras em meio líquido .......................... 312
5.5 Ensaios de fermentação em glicose ................................................................. 44
5.6 Ensaios de SSF com bagaço de cana de açúcar ............................................. 48
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 53
7. ANEXO ................................................................................................................ 60
vii
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS
Figura 1 – Esquema estrutural simplificado das fibras do material lignocelulósico . ...... 5
Figura 2 – Estrutura química da celulose . .................................................................... 6
Figura 3 – Componentes da fração da hemicelulose . .................................................. 6
Figura 4 – Estrutura química do furfural e 5- hidroximetil-furfural .................................. 8
Figura 5 – Esquema mecanístico da hidrólise enzimática da celulose. ......................... 9
Figura 6 – Desenho experimental do crescimento em placas. .................................... 22
Figura 7 – Representações esquemáticas das microplacas geradas pelo programa SoftMax Pro 5.3.. ........................................................................................................ 24
Figura 8 – Fotomicrografias utilizando o microscópio óptico Nikon Eclipse Ti-S com objetiva de 100X e abertura numérica de 1.4.. ............................................................ 29
Figura 9 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 37°C. .................. ............................................................. 33
Figura 10 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 42°C. .................. ............................................................. 35
Figura 11 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 45°C.. ................. ............................................................. 36
Figura 12 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 30°C. ................... ............................................................. 40
Figura 13 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 37°C. ................... ............................................................. 41
Figura 14 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 42°C. ................... ............................................................. 42
Figura 15 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 45°C. ................... ............................................................. 43
Figura 16 - Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). .................................................. 46
Figura 17 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). .................................................. 47
viii
Tabela 1 – Linhagens de leveduras utilizadas............................................................. 19
Tabela 2 - Velocidade específica de crescimento (µ) e D.O.(600) máxima em microplacas contendo meio YPD 4% em diferentes temperaturas. ............................. 38
Tabela 3 – Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 0,1, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). ............................................. 44
Tabela 4 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 0,1, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). ............................................. 45
Tabela 5 - Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). .................................................. 48
Tabela 6 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). .................................................. 48
Tabela 7 – SSF a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de bagaço de cana de açúcar 8% (p/v). ................................. 50
Tabela 8 - SSF a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de bagaço de cana de açúcar 8% (p/v). ................................. 50
Tabela 9 - Rendimento em etanol obtido com a utilização de linhagens termotolerantes de K. marxianus e S. cerevisiae, em relação a diferentes biomassas pré-tratada ....... 52
Quadro 1 – Avaliação do crescimento de linhagens de leveduras em meio YP contendo diferentes concentrações de glicose e em diferentes temperaturas *. ......... 30
Quadro 2 - Avaliação do crescimento de linhagens de leveduras em meio YPD 4% contendo diferentes concentrações de etanol e em diferentes temperaturas *............ 30
ix
RESUMO
COSTA, Daniela Arruda, M. Sc. Universidade Federal de Ouro Preto, fevereiro de
2011. Caracterização de leveduras termotolerantes para pr odução de etanol
celulósico . Orientador: Luciano Gomes Fietto.
A conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis é considerada uma
alternativa promissora para aumentar a produção de etanol. Neste contexto tem sido
demonstrado que maiores rendimentos em etanol são obtidos por meio do
acoplamento das etapas de sacarificação e fermentação, processo chamado
sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). No entanto, um dos entraves do
processo é a temperatura ótima para a realização das duas etapas; uma vez que, a
ação ótima das celulases ocorre em torno de 50°C, e nquanto que a maioria dos
organismos fermentativos cresce entre 30° e 37°C. Com o objetivo de viabilizar o
processo SSF foi isolada e identificada uma linhagem termotolerante de
Saccharomyces cerevisiae, denominada LBM-1. A fim de selecionar o micro-
organismo adequado e as condições ideais para a realização do processo SSF, foram
comparadas linhagens de leveduras das espécies S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-
2) e Kluyveromyces marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086), quanto à utilização
de fonte de carbono, tolerância a etanol e termotolerância, por meio da análise do
perfil de crescimento e dos valores da velocidade específica de crescimento. De posse
dos dados de temperatura máxima suportada pelas linhagens testadas, foram
realizados ensaios de fermentação para estabelecer a quantidade ideal de inóculo a
ser utilizada. Estes ensaios foram realizados utilizando glicose como substrato e em
duas temperaturas diferentes, nas quais as leveduras tiveram um bom crescimento.
Sabendo-se a concentração ideal de inóculo a ser utilizada procedeu-se à análise
comparativa do rendimento fermentativo das linhagens testadas em processo SSF
utilizando o bagaço de cana de açúcar como substrato. O seqüenciamento da região
D1/D2 do DNA ribossomal confirmou que o isolado LBM-1 é uma linhagem de
levedura pertencente à espécie S. cerevisiae. Os experimentos realizados mostraram
que as linhagens de S.cerevisiae são mais tolerantes ao etanol, enquanto que as
linhagens de K. marxianus são mais termotolerantes. Além disso, as linhagens de S.
cerevisiae LBM-1, CAT-1 e PE-2 são termotolerantes e possuem a capacidade de
crescer e fermentar a 42°C. Por meio da caracteriza ção fisiológica, foram
estabelecidas duas temperaturas para a realização dos ensaios de fermentação, 37° e
x
42°C, nas quais todas as linhagens apresentaram um bom crescimento. Desta forma,
foram feitos experimentos de fermentação em glicose comparando duas densidades
óticas iniciais a 600 nm (D.O.(600)), 0,1 e 2, para saber qual seria a D.O.(600) ideal para
iniciar a fermentação. Os resultados mostraram que uma D.O.(600) mais alta,
correspondente a 2, favorece um aumento no rendimento do processo. Ensaios de
fermentação em glicose a 37°C apresentaram valores de rendimentos em etanol
próximos ao teórico 0,51. Nos ensaios de SSF com bagaço de cana de açúcar
realizados tanto a 37°C, quanto a 42°C, foram obtid os rendimentos muito similares.
Entretanto, a 37°C houve uma maior concentração fin al em etanol do que a 42°C.
Além disso, os ensaios de SSF juntamente com dados obtidos anteriormente pelo
grupo comprovaram que a fermentação deve ser iniciada após 72 horas de pré-
hidrólise, uma vez que neste tempo ocorre inibição das celulases pelo produto. Com
isto pode-se concluir que todas as linhagens testadas podem ser utilizadas para
viabilizar o processo SSF.
xi
ABSTRACT
COSTA, Daniela Arruda, M. Sc. Universidade Federal de Ouro Preto, February 2011.
Characterization of thermotolerant yeasts for ethan ol cellulosic production .
Advisor: Luciano Gomes Fietto.
The lignocellulosic material conversion, such as sugar cane bagasse, into fermentable
sugars has been considered a promising alternative to increase ethanol production. In
this context, it has been shown that higher ethanol yields are obtained by coupling two
stages, through the simultaneous saccharification and fermentation, process called
simultaneous saccharification and fermentation (SSF). However, one of the barries the
process is the optimum temperature for carrying out the two steps, the optimal action of
cellulases occurs around 50°C, while most of the fe rmentative organisms grows
between 30° and 37°C. Aiming to enable the process SSF has increased considerably
in recent years the isolation of thermotolerant yeasts, especially strains belonging to
the species Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus. In this context,
our group has isolated and identified molecularly a thermotolerant strain of S.
cerevisiae, called LBM-1. In order to select the appropriate micro-organism and the
ideal conditions for the realization of the SSF process, was performed the physiological
characterization of yeast strains of S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 and PE-2) and K.
marxianus (UFV-3, ATCC 8554 and CCT 4086), as to use of carbon source, ethanol
tolerance and thermotolerance by comparing the growth profile and the values of
specific growth rate. Take into account the physiological characterization, fermentation
tests were performed to establish the optimum amount of inoculum to be used and the
micro-organism suitable for fermentation. These tests were conducted using glucose
as substrate and at two different temperatures, in which the yeast had a good growth.
Knowing the optimal concentration of inoculum used to be carried to the fermentation
efficiency comparative analysis of the strains in SSF process using sugar cane
bagasse as substrate. The sequencing of the D1/D2 region confirmed that the isolated
LBM-1 is a yeast strain belonging to species S. cerevisiae. Physiological
characterization showed that strains of S.cerevisiae are more tolerant to ethanol,
whereas the strains of K. marxianus are more thermotolerant. Furthermore, strains of
S. cerevisiae LBM-1, CAT-1 and PE-2 are thermotolerant and have the ability to grow
and ferment at 42°C. The evaluation of stresses at high temperatures and high
concentrations of glucose showed that yeast cells require higher concentrations of
xii
sugar to grow, and this effect was called "cross tolerance". Through the physiological
characterization, both temperatures were established for the testing fermentation, 37°
and 42°C, in which all the strains showed good grow th. Thus, experiments were made
of glucose fermentation in comparing two initial optical densities 600 nm (O.D.(600)), 0,1
and 2, to know what O.D.(600) ideal to start fermentation. The results showed that
O.D.(600) higher, corresponding to 2, favors an increase in process yield. Tests for
glucose fermentation at 37°C showed values of ethan ol yields close to the theoretical
0.51. In tests of the SSF with sugar cane bagasse performed at both 37° and 42°C
were obtained income (YE / C) very similar. However, at 37°C resulted in a higher final
ethanol concentration than at 42 ° C. In addition, the SSF trials together with data
obtained previously by the group showed that the fermentation should be started after
72 hours of pre-hydrolysis, since this time is the product inhibition of cellulases. With
this we can conclude that all tested strains could potentially be upgraded to permit the
SSF process.
1
1. INTRODUÇÃO
As mudanças climáticas e a elevação nos custos do petróleo aliadas às
necessidades estratégicas de produção de energia têm motivado uma corrida sem
precedentes à produção de combustíveis alternativos, preferencialmente de fontes
renováveis. A conversão de material lignocelulósico, como bagaço de cana de açúcar,
em açúcares fermentáveis vem sendo considerada uma alternativa promissora para
aumentar a produção de etanol (Rocha e Buckeridge, 2009). A utilização de materiais
lignocelulósicos para produzir etanol envolve quatro etapas: pré-tratamento, hidrólise
enzimática, fermentação e destilação (Sun e Cheng, 2002). Tem sido demonstrado
que os maiores rendimentos em etanol são obtidos por meio do acoplamento de duas
etapas, por meio da sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) (Ballesteros et al.,
2004; Sanchez e Cardona, 2008). No entanto, um dos entraves do processo é a
temperatura ótima para a realização das duas etapas; uma vez que, a ação ótima das
celulases ocorre em torno de 50°C, enquanto que a m aioria dos organismos
fermentativos cresce entre 30 e 37°C (Olsson et al., 2006).
Com o objetivo de viabilizar o processo SSF tem aumentado consideravelmente
nos últimos anos o isolamento de leveduras termotolerantes, especialmente de
linhagens pertencentes às espécies Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces
marxianus (Singh et al., 1998; Abdel-Fattah et al., 2000; Sree et al., 2000; Hari Krishna
et al., 2001; Basso et al., 2008; Fonseca et al., 2008). Neste âmbito, o grupo de
pesquisa do Laboratório de Biotecnologia Molecular da Universidade Federal de
Viçosa isolou e identificou molecularmente uma linhagem termotolerante de S.
cerevisiae, denominada LBM-1.
A fim de selecionar o micro-organismo adequado e as condições ideais para a
realização do processo SSF, foi feita a caracterização fisiológica de linhagens de
leveduras das espécies S. cerevisiae e K. marxianus, quanto à utilização de fonte de
carbono, tolerância a etanol e termotolerância, por meio da comparação do perfil de
crescimento e dos valores da velocidade específica de crescimento. A comparação foi
feita utilizando três linhagens de leveduras pertencentes a cada espécie, da seguinte
forma:
• Saccharomyces cerevisiae:
o LBM-1: novo isolado a partir de dorna de fermentação de cachaça
obtido pelo Laboratório de Biotecnologia Molecular (Departamento
2
de Bioquímica e Biologia Molecular/ Universidade Federal de
Viçosa);
o CAT-1 e PE-2: linhagens isoladas de usinas de produção de
etanol de primeira geração pela empresa Fermentec, e
amplamente utilizadas por usinas do setor sucro-energético
(Basso et al., 2008);
• Kluyveromyces marxianus:
o UFV-3: linhagem isolada do soro de queijo pelo Laboratório de
Fisiologia de Micro-organismos (BIOAGRO/Universidade Federal
de Viçosa) (Silveira et al., 2005);
o ATCC 8554: linhagem pertencente à coleção biológica American
Type Culture Collection;
o CCT 4086: linhagem pertencente à coleção biológica Coleção de
Culturas Tropicais - André Tosello Tropical Culture.
Para confirmar o isolado LBM-1 como pertencente à espécie S. cerevisiae foi
feita a caracterização molecular por meio do seqüenciamento da região D1/D2 da
subunidade 26S do rDNA.
De posse da caracterização fisiológica, foram realizados ensaios de fermentação
para estabelecer a quantidade ideal de inóculo a ser utilizada e o micro-organismo
adequado ao processo fermentativo. Estes ensaios foram realizados utilizando glicose
como substrato e em duas temperaturas diferentes, nas quais as leveduras tiveram um
bom crescimento. Sabendo-se a concentração ideal de inóculo a ser utilizada
procedeu-se à análise comparativa do rendimento fermentativo das linhagens testadas
em processo SSF utilizando o bagaço de cana de açúcar como substrato.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Biocombustíveis
As mudanças climáticas aliada às necessidades estratégicas de produção de
energia têm motivado uma corrida sem precedentes à produção de combustíveis
alternativos, preferencialmente de fontes renováveis (Rocha e Buckeridge, 2009). Por
meio do uso de recursos energéticos renováveis, o mundo pode encontrar parte da
solução para as suas necessidades energéticas, de uma maneira ambientalmente
sustentável (Hahn-Hagerdal et al., 2006).
O bioetanol é um dos mais importantes combustíveis renováveis, contribuindo
para a redução dos impactos ambientais negativos gerados pela utilização mundial
dos combustíveis fósseis (Cardona e Sanchez, 2007). Isso porque ele é produzido a
partir de biomassa que é uma matéria renovável e não contribui para o acúmulo de
dióxido de carbono na atmosfera terrestre, ou seja, o CO2 liberado durante o uso da
biomassa é absorvido novamente no processo de fotossíntese para a sua formação
(Hall, 1984; Ohgren et al., 2006).
O processo de produção do etanol ocorre por meio da fermentação microbiana
de açúcares derivados de matérias-primas agrícolas, principalmente de amido e de
sacarose. Os Estados Unidos e o Brasil detêm cerca de 70% da produção mundial de
etanol por meio de amido de milho e caldo da cana de açúcar, respectivamente
(Argueso et al., 2009).
O interesse mundial na utilização de bioetanol como fonte de energia tem
estimulado os estudos sobre o custo e a eficiência dos processos industriais para sua
produção (Siqueira et al., 2008). Neste sentido, pesquisas têm sido conduzidas para a
obtenção de eficientes organismos fermentativos, baixo custo de substratos e ótimas
condições ambientais para o processo (Cysewski e Wilke, 1978).
2.2 Etanol celulósico
Neste cenário, o Brasil desponta como o país com as tecnologias e políticas
mais avançadas do mundo devido à pioneira utilização do etanol obtido a partir da
fermentação do caldo da cana (Rocha e Buckeridge, 2009).
4
Na década de 1970, o Brasil iniciou o programa Pró-Álcool a fim de substituir a
gasolina pelo etanol e visando diminuir a dependência política e econômica em
períodos de oferta variável. A cana de açúcar foi escolhida como matéria-prima para
produzir etanol, e como conseqüência, estudos agrícolas e tecnológicos foram
intensificados, levando o Brasil a uma posição muito favorável em termos de
segurança energética. Atualmente, o Brasil possui mais de 80% de seus veículos
rodando com bioetanol, e está desenvolvendo motores para pequenos aviões
utilizarem o etanol como combustível (Soccol et al., 2010).
No entanto, deve-se notar que apenas uma parte da biomassa produzida é
utilizada para a produção de bioenergia; um terço da planta é utilizado para a
produção de álcool, um terço é o bagaço, que é queimado para produção de
eletricidade e o terço restante é deixado no campo, que é decomposta pelos micro-
organismos (Cortez et al., 2008). Portanto, um significativo aumento na produção de
etanol seria possível se tecnologias fossem desenvolvidas para converter em açúcares
fermentáveis os polissacarídeos das folhas, palha e bagaço, que juntos representam
dois terços da biomassa (Soccol et al., 2010). Atualmente, esta tecnologia vem sendo
considerada como uma alternativa promissora para aumentar a produção de etanol
necessária para atender à demanda mundial (Rocha e Buckeridge, 2009).
A implantação da tecnologia de etanol do bagaço de cana no Brasil é favorecida
pelo fato do processo de produção poder ser anexado às unidades já existentes de
indústrias de açúcar e álcool, exigindo investimentos mais baixos, infra-estrutura,
logística e fornecimento de energia. Além disso, o bagaço é gerado nas unidades
industriais, e como tal, livre de custos de transporte. Este é um cenário promissor, pois
a cada 10 milhões de toneladas de biomassa seca, 600 milhões de galões de etanol
poderiam ser produzidos, considerando o uso somente da parte celulósica (Soccol et
al., 2010).
2.2.1 Biomassa lignocelulósica
Existe uma grande variedade de matérias-primas potenciais para a produção de
etanol combustível. Gramíneas, madeiras, subprodutos de colheitas e outros resíduos
que contenham celulose (incluindo resíduos agrícolas, florestais e da indústria de
papel), são todos exemplos de fontes de material lignocelulósico (Figura 1) (Van Maris
et al., 2006; Wilkins et al., 2008). A natureza e disponibilidade de matérias-primas
lignocelulósicas em diferentes partes do mundo dependem do clima e outros fatores
5
ambientais, práticas agrícolas e desenvolvimento tecnológico (Claassen et al., 1999).
A biomassa consiste em um complexo emaranhado composto por três principais
polímeros: celulose, hemicelulose e lignina; dependendo da matéria-prima, também
possui pectina (Van Maris et al., 2006).
A celulose, principal constituinte da biomassa (33-51%), é um polímero linear
composto de milhares de subunidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas β-
(1-4) (Ingram et al., 1999). Normalmente polímeros lineares de celulose ocorrem como
cadeias paralelas com extensas ligações de hidrogênio, como mostrado na Figura 2
(Lee, 1997). A estrutura linear, conferida pela configuração das ligações glicosídicas,
possibilita a formação de ligações de hidrogênio intra e intermoleculares e acarreta na
agregação das cadeias celulósicas em “fibrilas elementares” com alto grau de
cristalinidade. Estes agregados conferem elevada resistência à tensão, tornam a
celulose insolúvel em um grande número de solventes e explicam, pelo menos em
parte, a sua resistência à degradação microbiana (Ding e Himmel, 2006; Matthews et
al., 2006; Canilha et al., 2010; Canilha et al., 2011).
A hemicelulose, o segundo maior constituinte da biomassa (19-34%) mostrado
na Figura 3, é um heteropolissacarídeo complexo composto por hexoses (D-glucose,
D-galactose, D-manose, L-ramnose, L-fucose), pentoses (D-xilose e L-arabinose) e
ácidos urônicos (ácido D-glucurônico e ácido D-galactourônico) (Van Maris et al.,
2006).
Figura 1 – Esquema estrutural simplificado das fibras do material lignocelulósico (Lee, 1997).
6
Figura 2 – Estrutura química da celulose (Morais, 2005).
Figura 3 – Componentes da fração da hemicelulose (Morais, 2005).
A lignina, que constitui 10-20% em peso da biomassa seca, é um polímero
aromático contendo resíduos fenólicos, tais como álcool trans-ρ-coumaril, álcool trans-
ρ-coniferil e álcool trans-ρ-sinápico. A lignina, fração da biomassa não fermentável, é
uma fonte potencial de inibidores da fermentação microbiana (Ingram et al., 1999; Van
Maris et al., 2006).
7
Do ponto de vista tecnológico, os açúcares contidos nas frações celulósicas
(glicose) e hemicelulósicas (xilose, arabinose, glicose, manose e galactose)
representam os substratos que podem ser utilizados para a produção de etanol por via
fermentativa. Entretanto, conforme ilustrado na Figura 1, a íntima associação entre as
três frações principais (celulose, hemicelulose e lignina) é tal que impõe dificuldades
para a recuperação dos monômeros constituintes com elevado grau de pureza (Sun e
Cheng, 2002).
2.3 Processo de obtenção de etanol de segunda geraç ão
Os processos para obter etanol a partir de materiais lignocelulósicos baseados
na hidrólise enzimática são métodos promissores para produzir biocombustíveis. Estes
consistem basicamente em quatro fases: pré-tratamento, hidrólise enzimática,
fermentação e destilação (Tomas-Pejo et al., 2009). O processo biológico para a
conversão de lignocelulose em etanol combustível requer: deslignificação para liberar
a celulose e hemicelulose a partir de seu complexo com lignina, despolimerização da
celulose para produzir açúcares livres e fermentação da misturas de açúcares hexoses
e pentoses para produzir etanol.
2.3.1 Pré-tratamento
O objetivo da etapa de pré-tratamento é remover a hemicelulose e a lignina,
reduzir a cristalinidade da celulose e aumentar a porosidade dos materiais; sem que
haja perda de carboidratos e a formação de bioprodutos que possam inibir os passos
subseqüentes, em especial a fermentação (Sun e Cheng, 2005). Um pré-tratamento
eficiente resulta em um aumento significativo do rendimento em açúcares
fermentáveis.
Existem diversos tipos de pré-tratamentos, com diferentes rendimentos e efeitos
distintos sobre a biomassa e conseqüente impacto nas etapas subseqüentes. No pré-
tratamento ácido, a camada de hemicelulose é hidrolisada, enquanto no pré-
tratamento alcalino, uma parte da lignina é removida e a hemicelulose pode ser
hidrolisada pela utilização de hemicelulases (Hahn-Hägerdal et. al., 2006).
8
2.3.2 Hidrólise
Durante a etapa de sacarificação, a celulose pode ser hidrolisada por
tratamento ácido ou enzimático, liberando as unidades de glicose a serem assimiladas
pela levedura na etapa de fermentação. A hidrólise ácida da celulose foi a primeira
alternativa a ser testada e apresentou inconvenientes como a produção de compostos
furfúricos (Figura 4), inibidores da fermentação e a degradação de açúcares por
exposição prolongada ao meio reacional (Zhang et al., 2006). Frente aos empecilhos
de utilização da hidrólise ácida, a hidrólise enzimática da celulose tem recebido a
atenção dos pesquisadores.
Figura 4 – Estrutura química do furfural e 5- hidroximetil-furfural (Disponível em
http://tecalim.vilabol.uol.com.br/chemitryfood.html acesso 20/01/2011)
A hidrólise enzimática da celulose é catalisada por enzimas altamente
específicas que são chamadas de celulases. A hidrólise enzimática tem apresentado
melhores resultados do que a hidrólise ácida, uma vez que não ocorre a formação de
subprodutos da glicose, embora o processo seja mais lento. A maioria das celulases
comerciais é obtida a partir de Trichoderma reesei, embora uma pequena parcela seja
obtida a partir de Aspergillus niger (Zhang e Lynd, 2004).
Três classes de enzimas constituem o complexo celulolítico: 1) exo-1,4-β-D-
glucanases (EC 3.2.1.91), que hidrolisam a cadeia celulósica a partir de suas
extremidades liberando celobioses, 2) endo-1,4-β-D-glucanases (EC 3.2.1.4), que
hidrolisam a cadeia celulósica internamente de maneira aleatória, e 3) 1,4-β-D-
glucosidases (EC 3.2.1.21), que promovem a hidrólise da celobiose em glicose e
podem também clivar unidades glicosídicas a partir de celuoligossacarídeos (Figura 5).
Coletivamente chamadas de celulases, atuam em sinergia para hidrolisar a celulose
9
criando sítios acessíveis umas para as outras e aliviando problemas de inibição pelos
produtos (Eriksson et. al., 2002; Vialjamae et. al., 2003; Canilha et al., 2010).
Figura 5 – Esquema mecanístico da hidrólise enzimática da celulose (Adaptado de Zhang et al., 2006).
Quando comparada com a hidrólise ácida, a hidrólise enzimática da celulose
geralmente é conduzida em condições mais brandas (pH 4,8 e temperatura entre 45° e
50°C), não causa problemas de corrosão e permite ma iores rendimentos (75- 85%),
além de possibilitar a fermentação simultânea à sacarificação (processo SSF,
sacarificação e fermentação simultâneas) que será discutido posteriormente. Neste
sentido, as pesquisas têm se concentrado em hidrólise enzimática como a chave para
a produção de etanol de segunda geração a um custo competitivo em longo prazo
(Philippidis e Smith, 1995; Lynd et al., 2002; Mosier et al., 2005; Alvira et al., 2010).
2.3.3 Fermentação da biomassa hidrolisada
O processo clássico para a fermentação da biomassa hidrolisada consiste num
processo seqüencial, no qual a hidrólise e a fermentação são realizadas em reatores
diferentes. Este processo é conhecido como hidrólise e fermentação em separado
10
(Separated Hydrolysis and Fermentation – SHF). Uma alternativa ao SHF é a
realização de hidrólise e fermentação em um mesmo reator, processo conhecido como
sacarificação e fermentação simultâneas (Simultaneous Saccharification and
Fermentation – SSF) (Sanchez e Cardona, 2008).
2.3.3.1 Hidrólise e fermentação em separado (SHF)
No processo seqüencial SHF, a fração de material pré-tratado que contém
celulose é submetida à hidrólise (sacarificação) por meio do uso de ácidos ou
enzimas. Uma vez que a hidrólise é completada, o hidrolisado de celulose resultante é
fermentado e convertido em etanol em um reator separado (Sanchez e Cardona,
2008).
A principal vantagem dessa estratégia é permitir que a hidrólise e a fermentação
possam ser conduzidas nas condições ótimas. Geralmente, a temperatura ótima para
as celulases está entre 45°C e 50°C, dependendo do micro-organismo produtor. E a
temperatura ótima para a maior parte dos micro-organismos produtores de etanol está
entre 30°C e 37°C (Olsson et al., 2006).
Por outro lado, a principal desvantagem é a inibição do complexo celulolítico
pelos açúcares liberados na hidrólise, principalmente celobiose e glicose que se
acumulam no meio, conferindo uma hidrólise incompleta da celulose e rendimentos
não muito altos (Wingren et al., 2005). Segundo Taherzadeh e Karimi (2007), outra
desvantagem do SHF é a possibilidade de contaminação. Como o tempo envolvido na
etapa de hidrólise é muito longo, a solução de glicídios torna-se uma fonte disponível
para os micro-organismos indesejados.
2.3.3.2 Sacarificação e fermentação simultâneas (SS F)
O processo SSF apresenta rendimentos mais atraentes do que o SHF, como
maior produtividade em etanol e menor consumo energético. Neste caso, as celulases
e micro-organismos são adicionados ao mesmo reator, permitindo que a glicose
liberada durante a hidrólise enzimática da celulose seja imediatamente convertida em
etanol e que a remoção contínua de glicose do meio minimize a inibição provocada
pelo produto final na atividade das enzimas (Ballesteros et al., 2004; Olsson et al.,
2006; Sanchez e Cardona, 2008).
11
Essa estratégia de processo apresenta inúmeras vantagens, dentre elas: a
redução da inibição das celulases pelos seus produtos de hidrólise, uma vez que os
glicídios não se acumulam no meio; menor complexidade e custo do processo,
comparado ao SHF, pois reduz o número de reatores; minimização dos riscos de
contaminação, devido às baixas concentrações de açúcar livre no meio; e maiores
rendimentos de hidrólise, já que o equilíbrio das reações enzimáticas é deslocado no
sentido de formação de mais produto, visto que a glicose é concomitantemente
consumida (Vasquez et al., 2007).
No entanto, um dos entraves do processo é a temperatura ótima para a
realização das duas etapas; uma vez que, a ação ótima das celulases ocorre em torno
de 50°C, enquanto que a maioria dos organismos ferm entativos cresce entre 30 e
37°C (Hari Krishna et al., 2001; Olsson et al., 2006). Com o objetivo de viabilizar o
processo SSF tem aumentado consideravelmente nos últimos anos o isolamento de
leveduras termotolerantes, especialmente de linhagens pertencentes às espécies
Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces marxianus (Singh et al., 1998; Abdel-
Fattah et al., 2000; Sree et al., 2000; Hari Krishna et al., 2001; Basso et al., 2008;
Fonseca et al., 2008).
2.4 Micro-organismo fermentador
Tanto para a produção de etanol de primeira geração, a partir do caldo da cana
de açúcar, quanto de segunda geração, a partir de biomassas de composição
lignocelulósica, a via fermentativa é a via mais importante para a obtenção do álcool
etílico no Brasil. Um dos fatores que torna a produção de bioetanol por fermentação a
forma mais econômica de sua obtenção, é o grande número de matérias-primas
naturais e residuais, como o bagaço de cana de açúcar, existentes em todo país
(Pereira Jr. et al., 2008).
O micro-organismo predominante no processo de fermentação alcoólica é a
levedura S. cerevisiae, devido à sua capacidade de hidrolisar sacarose presente no
caldo da cana, em glicose e frutose, duas hexoses facilmente utilizadas por esta
levedura, ao alto rendimento fermentativo, mesmo na presença de oxigênio, e ao fato
desta levedura ser muito tolerante ao etanol em comparação com outras leveduras
(Sanchez e Cardona, 2008).
Para tornar viável a produção de etanol de segunda geração, estudos têm sido
feitos na identificação de linhagens de leveduras que sejam termotolerantes, tolerantes
12
ao etanol, resistentes a inibidores liberados durante o pré-tratamento do material
lignocelulósico e capazes de utilizar um amplo espectro de substratos, produzindo
grandes quantidades de etanol na temperatura ótima para a realização da
sacarificação.
Leveduras industriais devem detectar e responder rapidamente às condições de
estresse, adaptando-se aos fatores ambientais adversos por meio do ajuste de suas
atividades metabólicas a fim de evitar uma perda substancial de viabilidade. A
capacidade de tolerar vários estresses é um dos importantes critérios para selecionar
uma linhagem que seja eficiente no processo fermentativo (Zhao e Bai, 2009).
2.4.1 Fermentação de pentoses e hexoses
Linhagens de S. cerevisiae são capazes de fermentar glicose a altas taxas, até
mesmo em condições aeróbicas. Em condições anaeróbicas, a taxa de produção de
etanol em meio definido é tão alta quanto 30 mmol g biomassa -1 h -1 a 30°C (Bakker et
al., 2000). Entretanto, S. cerevisiae são incapazes de assimilar ou fermentar xilose, o
principal constituinte da fração hemicelulósica da biomassa.
As primeiras observações sobre fermentação de xiloses por leveduras datam do
início de 1980, com as espécies Pachysolen tannophilus (Slininger et al., 1982) e
Candida tropicalis (Gong et al., 1981). Pesquisas posteriores demonstraram que
outras espécies de leveduras também são capazes de fermentar xilose em etanol,
incluindo diversas espécies dos gêneros Pichia e Candida bem como algumas
linhagens de Kluyveromyces marxianus (Yablochkova et al., 2003; 2004). Cadete et
al., (2009) descreveram uma nova espécie de levedura fermentadora de D-xilose,
isolada de madeira em decomposição, e nomeada Spathaspora arborariae.
Muitos avanços foram alcançados na engenharia genética de leveduras e
bactérias para a fermentação de xilose e arabinose em etanol e outros produtos como
o ácido láctico. No entanto, a bioconversão de pentoses a etanol é ainda considerada
um desafio econômico e tecnológico (Jeffries e Shi, 1999; Jeffries e Jin, 2004).
Economicamente, é essencial que tanto a glicose quanto a xilose presentes na
biomassa lignocelulósica possam ser fermentados em etanol, para que esses recursos
renováveis possam ser usados como matéria-prima para a produção de combustível
renovável de uma forma viável (Sedlak e Ho, 2004).
13
2.4.2 Tolerância a inibidores
Durante o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica vários subprodutos
químicos são gerados, e estes inibem os micro-organismos fermentativos. Entre
muitos compostos inibidores, o 2-furaldeído (furfural) e o 5-hidroximetil-2-furaldeído (5-
hidroximetilfurfural, HMF) são produzidos durante o pré-tratamento da biomassa,
especialmente com ácido diluído. Estes inibidores danificam as paredes e membranas
celulares, inibem o crescimento celular, reduzem atividades enzimáticas, causam
danos ao DNA, inibem a síntese de proteínas e RNA, e reduzem a produção de etanol
(Liu et al., 2004; Van Maris et al., 2006; Liu et al., 2009).
A maioria das leveduras, incluindo linhagens industriais, é suscetível a furfurais
derivados do pré-tratamento, e especialmente suscetível a combinação destes
inibidores. Embora o furfural seja mais tóxico do que o 5-HMF, ambos compostos
atuam sinergicamente para suprimir o crescimento da levedura. Neste sentido, para
atenuar os efeitos dos inibidores, tratamentos adicionais são requeridos, incluindo
detoxificação química, física ou bioquímica. No entanto, esses passos adicionais
adicionam custo e complexidade ao processo e geram resíduos. Portanto, o
desenvolvimento de linhagens engenheiradas geneticamente com maior tolerância a
inibidores, especialmente aos furfurais, é uma alternativa promissora à etapa de
detoxificação adicional (Liu et al., 2004).
2.4.3 Termotolerância
Uma das principais aplicações propostas para leveduras termotolerantes é o
processo de sacarificação e fermentação simultâneas da biomassa. Linhagens
termotolerantes têm sido isoladas de diversos ambientes, principalmente de regiões
tropicais. Por exemplo, isolados de S. cerevisiae que podem tolerar temperaturas
superiores a 44°C têm sido selecionados com sucesso , entretanto as taxas de
crescimento e de produção de etanol nestes casos são menores nestas temperaturas
(Sree et al., 2000).
Entre as espécies de leveduras conhecidas utilizadas em processos
fermentativos, K. marxianus tem o melhor desempenho em termos de crescimento e
fermentação em altas temperaturas (Singh et al., 1998; Abdel-Fattah et al., 2000;
Ballesteros et al., 2004; Hong et al., 2007; Nonklang et al., 2008; Suryawati et al.,
2008). No entanto, atualmente é difícil determinar qual dessas leveduras iria mostrar o
14
melhor desempenho em termos de fermentação em altas temperaturas, uma vez que
não existem estudos sobre esta comparação. A temperatura parece ser um fator físico
que determina o desempenho do micro-organismo, mas isso varia de acordo com os
biorreatores e incubadoras. Para comparar linhagens candidatas de uma forma mais
precisa condições experimentais controladas de crescimento são essenciais, tal como
o uso dos mesmos biorreatores ou incubadoras (Abdel-Banat et al., 2010).
2.4.4 Tolerância a etanol
O custo efetivo da produção de etanol depende, entre outros fatores, do alto
rendimento e da rápida conversão dos carboidratos a etanol. Entretanto, o etanol
acumulado no meio de cultura pode se tornar um fator de estresse significativo durante
a fermentação (Stanley et al., 2010).
Etanol é um inibidor do crescimento de leveduras em concentrações
relativamente baixas, inibe a divisão celular, diminuindo o volume celular e a
específica taxa de crescimento, enquanto em altas concentrações pode reduzir a
viabilidade celular e aumentar a morte (Birch e Walker, 2000).
Os principais sítios para os efeitos do etanol em leveduras são membranas
celulares, algumas proteínas hidrofóbicas e hidrofílicas e o retículo endoplasmático
(Walker, 1998). A exposição das leveduras ao etanol resulta em um aumento da
fluidez da membrana e conseqüente diminuição da sua integridade (Mishra e Prasad,
1989). A diminuição da disponibilidade de água, devido à presença do etanol causa a
inibição de enzimas chaves na via glicolítica e essas proteínas podem ser
desnaturadas (Hallsworth, 1998).
A pré-exposição das leveduras a uma quantidade subletal do agente causador
de estresse pode estimular uma resposta adaptativa, que resulta em resistência
passageira para níveis mais elevados do estresse em comparação com as células
sem pré-exposição. Esta aquisição de tolerância tem sido associada à ativação de
mecanismos de resposta específica de estresse durante a pré-exposição subletal. No
caso do estresse por temperatura, a aquisição de termotolerância tem sido observada
em leveduras expostas a temperaturas subletais momentaneamente, variando de
37°C a 45°C. Aumentar a magnitude do pré-estresse i nduzido por choque térmico não
somente aumenta a termotolerância da célula, como também leva a uma resposta
mais rápida (Plesset et al., 1982; Sanchez e Lindquist, 1990; Coote et al., 1991;
Stanley et al., 2010).
15
O pré-tratamento das leveduras com baixas concentrações de etanol tem sido
utilizado para aumentar a taxa de adaptação a concentrações mais altas de etanol
(Vriesekoop e Pamment, 2005). Neste contexto, estudos têm se concentrado na
investigação do estresse em etanol usando leveduras mutantes que alteraram sua
tolerância ao etanol devido à pré-exposição (Stanley et al., 2010).
2.4.5 Levedura: Saccharomyces cerevisiae
Devido a sua tradicional importância biotecnológica, como panificação, produção
de cerveja e vinho, as pesquisas historicamente tem se focado em S. cerevisiae
(Barnett, 2003). Desta forma, acumulou-se um profundo conhecimento sobre a
genética, fisiologia, bioquímica, engenharia genética e tecnologia fermentativa desta
levedura (Nevoigt, 2008). A popularidade da pesquisa básica e aplicada em S.
cerevisiae deve-se ao fato de algumas linhagens possuírem um staus GRAS
(generally regarded as safe) de segurança concedido pelo órgão de segurança
alimentar americano U.S. Food and Drug Administration (FDA).
Saccharomyces cerevisiae foi o primeiro organismo eucariótico cuja seqüência
genômica completa foi determinada (Goffeau et al., 1996). Vários bancos de dados
como o Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/) e o
Comprehensive Yeast Genome Database (http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast/) contêm
uma enorme quantidade de informação sobre seus genes, janelas de leituras (open
reading frames – ORFs) e produtos gênicos.
A maioria das linhagens de S. cerevisiae é tolerante a baixos valores de pH,
altas concentrações de açúcares e de etanol, propriedade que contribui para a
diminuição do risco de contaminação durante a fermentação industrial (Nevoigt, 2008).
Linhagens selecionadas de S. cerevisiae são amplamente utilizadas pelo setor
sucro-energético brasileiro, por possuírem uma combinação de alta eficiência
fermentativa com prolongada persistência na safra. Algumas destas linhagens
tornaram-se disponíveis comercialmente no final da década de 1990, e, atualmente,
mais da metade das destilarias brasileiras usam uma, ou mais comumente uma
mistura de duas ou mais, destas linhagens selecionadas para iniciar o processo
fermentativo, produzindo bilhões de galões de etanol por ano. As linhagens mais
amplamente utilizadas pelas usinas brasileiras são PE-2, CAT-1 e BG-1 por
apresentarem uma notável capacidade de competir com linhagens nativas,
sobrevivência e dominância durante o processo fermentativo industrial. Na safra de
16
2007/2008, as linhagens PE-2 e CAT-1 foram usadas em cerca de 150 destilarias,
representando cerca de 60% do etanol combustível produzido no Brasil (Basso et al.,
2008).
Buscando obter importantes informações sobre o micro-organismo adequado ao
processo SSF, foi feito neste trabalho um estudo comparativo entre os dois isolados
mais amplamente utilizados pelas usinas nacionais, PE-2 e CAT-1, e um isolado
obtido de uma destilaria de cachaça pelo Laboratório de Biotecnologia Molecular e
denominado LBM-1. Deve-se ressaltar que as linhagens comerciais PE-2 e CAT-1
utilizadas neste trabalho foram adquiridas junto à empresa Fermentec
(www.fermentec.com.br).
2.4.6 Levedura: Kluyveromyces marxianus
Linhagens pertencentes à espécie K. marxianus têm sido isoladas de uma
grande variedade de habitats, o que resulta em uma alta diversidade metabólica e um
substancial grau de polimorfismo intra-específico. Como conseqüência, diversas
aplicações biotecnológicas têm sido investigadas com esta levedura: produção de
enzimas (β-galactosidase, β-glicosidase, e poligalacturonases, entre outros), de
proteína para alimentação animal ou humana, de compostos de aroma, e de etanol
(incluindo processos SSF a temperaturas superiores a 37°C); redução do teor de
lactose em alimentos; produção de bioingredientes de soro de queijo; biorremediação;
como um agente anticolesterolêmico; e como um vetor para produção de proteína
heteróloga (Fonseca et al., 2008).
Comparando-se K. marxianus e K. lactis, organismo modelo, o conhecimento
acumulado sobre a primeira é muito menor e, aquele existente, se distribui por um
amplo número de diferentes linhagens. Sabe-se que K. marxianus e K. lactis
pertencem à mesma família, Saccharomycetacea, de S. cerevisiae (Llorente et al.,
2000). Uma importante característica de K. marxianus, compartilhada com K. lactis, é
a capacidade de assimilar lactose e usar este açúcar como fonte de carbono. Esta
característica leva à freqüentes isolamentos destas leveduras a partir de fontes de
leite; por exemplo leites fermentados, iogurte e queijos (Fonseca et al., 2008). Neste
contexto, uma linhagem de K. marxianus denominada UFV-3 foi isolada da indústria
de laticínios em Minas Gerais (Silveira et al., 2005).
Muitas vezes, linhagens de K. marxianus, assim como de outras leveduras estão
preservadas e distribuídas em coleções biológicas de leveduras. Estas coleções
17
conservam as linhagens e identificam por meio de métodos moleculares. A fim de
complementar o estudo comparativo realizado no presente trabalho, foram adquiridas
duas linhagens de K. marxianus pertencentes à coleções biológicas, ATCC 8554 e
CCT 4086. Desta forma, foi feita a caracterização de leveduras termotolerantes de S.
cerevisiae (LBM-1, PE-2 e CAT-1) e K. marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086)
em processo SSF para a obtenção de etanol a partir do bagaço de cana de açúcar.
18
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Caracterizar linhagens de leveduras termotolerantes pertencentes às espécies S.
cerevisiae e K. marxianus para produção de etanol celulósico por meio da
sacarificação e fermentação simultâneas.
3.2 Objetivos específicos
• Identificar molecularmente um isolado de S. cerevisiae LBM-1 obtido pelo
Laboratório de Biotecnologia Molecular (Universidade Federal de Viçosa);
• Caracterizar fisiologicamente linhagens das espécies S. cerevisiae (LBM-1,
CAT-1 e PE-2) e de K. marxianus (UFV-3 , ATCC 8554 e CCT 4086), quanto à
utilização de fonte de carbono, termotolerância e tolerância a etanol;
• Comparar as velocidades específicas de crescimento e a capacidade
fermentativa das linhagens testadas em meio com fonte de carbono definida;
• Analisar a capacidade fermentativa de todas as linhagens no processo SSF
utilizando bagaço de cana de açúcar.
19
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Linhagens e meios de cultura
As linhagens de leveduras que foram utilizadas neste experimento estão listadas
na Tabela 1. O meio de cultura para manutenção e ativação foi YPD (2% extrato de
levedura, 1% peptona e 2% glicose (p/v)), se sólido foi acrescentado 2 % ágar (p/v).
Todas as linhagens foram estocadas e mantidas em glicerol 20% a -80°C.
Tabela 1 – Linhagens de leveduras utilizadas.
Linhagem Genótipo Fonte
Saccharomyces cerevisiae LBM-1 Selvagem Laboratório Biotecnologia Molecular - DBB/UFV
Saccharomyces cerevisiae CAT-1 Industrial Fermentec
Saccharomyces cerevisiae PE-2 Industrial Fermentec
Kluyveromyces marxianus UFV-3 Selvagem Laboratório de Fisiologia de Micro-organismos -
BIOAGRO/UFV
Kluyveromyces marxianus ATCC 8554 Selvagem American Type Culture Collection
Kluyveromyces marxianus CCT 4086 Selvagem Coleção de Culturas Tropicais -
André Tosello Tropical Culture
4.2 Identificação molecular da levedura
O grupo de pesquisa do Laboratório de Biotecnologia Molecular (Departamento
de Bioquímica e Biologia Molecular, UFV), sob orientação do Prof. Dr. Luciano Gomes
Fietto, isolou uma linhagem de levedura termotolerante de uma dorna de fermentação
de cachaça de Minas Gerais. Esta levedura foi isolada pelo método descrito por
Oliveira et al. (2008) e denominada S. cerevisiae LBM-1.
Saccharomyces cerevisiae LBM-1 por ter apresentado um perfil termotolerante
foi submetida à análise molecular para identificação por técnica de seqüenciamento da
região D1/D2 da subunidade maior do gene do rRNA (Rosa e Lachance, 1998). Este
experimento foi realizado no Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras
20
(Departamento de Microbiologia, UFMG), sob coordenação do Prof. Dr. Carlos
Augusto Rosa, e o seqüenciamento foi realizado no Laboratório de Biodiversidade e
Evolução Molecular (Departamento de Microbiologia, UFMG).
4.2.1 Extração do DNA total
Para extração do DNA total, uma alçada de levedura foi incubada em tampão de
lise (50 mL de Tris-HCl 1M, pH 8,0; 10 mL de EDTA 0,5M, pH 8,0; 20 mL de NaCl 5M;
50 mL de SDS a 10% (p/v)) a 65°C por um tempo mínimo de 30 minutos. Após este
período foi adicionado 100 µl de fenol:clorofórmio:isopropílico na proporção 25:24:1, a
amostra foi agitada vigorosamente por 3 minutos e submetida à centrifugação a 6.000
g por 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e foi
adicionado um volume de 100 µl de etanol 70% gelado. A amostra foi homogeneizada
por inversão e novamente submetida a centrifugação a 6.000 g por 3 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o tubo contendo o DNA genômico foi deixado a
temperatura ambiente secando por 16 horas. A amostra foi ressuspendida em 100 µl
de tampão TE pH 8,0 (10 mL de Tris-HCL1M, pH 8,0; 2 mL de EDTA 0,5M, pH8,0).
A integridade do DNA genômico foi avaliada em gel de agarose 1% (p/v) em
tampão TBE (54 g de tris-base; 27,5 g de ácido bórico; 20 mL de EDTA 0,5M, pH 8,0).
O gel foi corado com solução de brometo de etídio e visualizado sob luz ultravioleta. O
DNA genômico total foi quantificado em NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies).
4.2.2 Amplificação utilizando os iniciadores NL1 e NL4
A reação de PCR (reação em cadeia da polimerase) foi realizada em um
volume final de 50 µl, utilizando a Taq DNA Polymerase Fermentas e 10 pmoles dos
iniciadores NL1 (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL4 (5’-
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) (MWG Biotech), segundo (Rosa e Lachance, 1998).
A reação de amplificação foi realizada utilizando-se o termociclador PCR Express
(Thermo Hybaid). Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose 1% (p/v),
conforme descrito anteriormente.
21
4.2.3 Purificação dos produtos de PCR e reação de s eqüenciamento
Os amplicons gerados pela reação de PCR com os iniciadores NL1 e NL4
foram purificados por meio da técnica com Polietilenoglicol (PEG), descrita por Santos
(2010). O produto purificado foi quantificado em NanoDrop ND 1000 (NanoDrop
Technologies).
As reações de seqüenciamento foram realizadas utilizando-se o DYEnamicTM
(Amershan Biosciences, USA) em combinação com o sistema de seqüenciamento
automatizado MegaBACETM 1000.
4.2.4 Análise das seqüências
As seqüências de DNA foram analisadas utilizando o programa BLASTn (Basic
Local Alignment Search Tool- versão 2.2.24 do BLAST 2.0) disponível no portal NCBI
desenvolvido pelo National Center for Biotechnology (Altschul et al., 1997). As
seqüências obtidas foram comparadas com as seqüências já depositadas no
GenBank. O alinhamento das seqüências foi realizado por meio do programa CLC
Main Workbench 5.7.1.
4.3 Fotomicrografias das leveduras
As linhagens de S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-2) e K. marxianus (UFV-3,
ATCC 8554 e CCT 4086) foram previamente crescidas em meio YPD2%, sob agitação
de 180 rpm a 28°C. Alíquotas de 20 µL das culturas foram aplicadas em lâminas de
vidro e fotografadas utilizando o microscópio óptico Nikon Eclipse Ti-S com objetiva de
100X e abertura numérica de 1.4. Este experimento foi conduzido no Laboratório de
Física Biológica (Departamento de Física, UFV) sob orientação do Prof. Dr. Márcio
Santos Rocha.
22
4.4 Caracterização fisiológica
4.4.1 Crescimento em placas
O crescimento em placas foi utilizado para fazer testes de tolerância à
temperatura, ao etanol e às concentrações de fonte de carbono. As linhagens de S.
cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-2) e K. marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086)
foram previamente crescidas em meio YPD2%, sob agitação de 180 rpm a 28°C.
Diluições seriadas (1:1, 1:10 e 1:100) foram preparadas, em solução salina (0,85%
NaCl), a partir de culturas com densidade ótica (D.O.) a 600 nm correspondente a 0,5.
Um volume de 5µl de cultura de cada diluição (1:1, 1:10 e 1:100) foi aplicado em
placas YPD sólido, como mostrado na Figura 6. Os testes foram realizados em placas
com diferentes concentrações de fonte de carbono (glicose 2, 4, 8 e 16%) e na
presença ou ausência de etanol (etanol 2, 4, 6 e 8% em YPD4%). As placas foram
vedadas com parafilme e incubadas nas seguintes temperaturas: 28°C, 37°C, 42°C e
45°C por 3 dias.
Figura 6 – Desenho experimental do crescimento em placas.
4.4.2 Crescimento em microplacas
Ensaios de tolerância à temperatura, ao etanol e às concentrações de fonte de
carbono foram realizados em microplacas de 96 poços, como mostra a Figura 7,
incubadas sob agitação. As linhagens de S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-2) e K.
23
marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086) foram previamente crescidas em meio
YPD2%, sob agitação de 180 rpm a 28°C. A partir do pré-inóculo foram feitas diluições
em solução salina para que a D.O(600nm) inicial de todas as linhagens fosse 0,1. Cada
linhagem foi inoculada em condições específicas na microplaca, sendo que o volume
final do meio foi 200 µl e cada ensaio foi feito em triplicata. Os testes foram feitos
variando as concentrações de fonte de carbono (glicose 2, 4, 8 e 16%) e na presença
ou ausência de etanol (etanol 2, 4, 6 e 8% em YPD4%). As placas foram vedadas
usando plástico (Platemax- axysel sealing film, Axygen) e incubadas na leitora
Versamax (microplate reader, Molecular Devices) nas temperaturas de 28°C, 37°C,
42°C e 45°C, por 16 horas.
O programa SoftMax Pro 5.3 utilizado pelo computador acoplado à leitora
Versamax foi o seguinte:
• Comprimento de onda para as leituras de densidade ótica: 600nm;
• Pré-leitura da placa vazia na D.O(600nm);
• Tempo da curva de crescimento: 16 horas;
• Temperatura de incubação definida: 28°C, 37°C, 42° C ou 45°C;
• Leituras da D.O(600nm): a intervalos de 15 minutos;
• Agitação da placa: 5 segundos antes da leitura e 5 segundos entre as
leituras.
A velocidade específica de crescimento da cultura, em cada substrato, foi
determinada pela regressão linear dos valores obtidos pelo logaritmo neperiano da
D.O.(600) na fase exponencial de crescimento, usando pelo menos cinco pontos de um
gráfico D.O.(600) versus tempo; a velocidade específica de crescimento (µ) é o
coeficiente angular da reta obtida pela regressão.
24
Figura 7 – Representações esquemáticas das microplacas geradas pelo programa SoftMax Pro 5.3. A)
Microplaca com as linhagens de S. cerevisiae, e B) Microplaca com as linhagens de K. marxianus.
4.5 Ensaios de fermentação
As linhagens de leveduras utilizadas no presente trabalho foram submetidas a
ensaios de fermentação utilizando como substrato glicose e bagaço de cana de açúcar
pré-tratado, em duas temperaturas diferentes 37°C e 42°C. As linhagens de S.
cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-2) e K. marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086)
foram pré-ativadas pelo crescimento em frascos erlenmeyers de 50 mL contendo 20
mL de meio mínimo de fermentação sob agitação a 180 rpm por 16 horas a 28°C. O
meio mínimo de fermentação é composto por: tampão citrato 50 mM pH 4,8; extrato
levedura (2,5 g L-1); peptona (2,5 g L-1); NH4Cl (2 g L-1); KH2PO4 (1 g L-1); MgSO4.7H2O
(0,3 g L-1) e glicose (20 g L-1). Os ensaios de fermentação foram conduzidos em
agitador horizontal (modelo TE 420, TECNAL) a 180 rpm, a 37°C e 42°C por 12 horas.
25
4.5.1 Ensaios de fermentação com glicose
As leveduras foram testadas quanto à concentração inicial de inóculo, com
D.O.(600) inicial correspondente a 0,1 e a 2, em duas temperaturas diferentes, 37°C e
42°C, utilizando como substrato 4% (p/v) de glicose . As leveduras foram inoculadas
em 50 mL de meio mínimo de fermentação, descrito anteriormente, em frascos
erlenmeyers de 125 mL. Amostras foram retiradas a intervalos de 2 horas, para
posteriores dosagens de glicose e etanol por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE).
4.5.2 Ensaios SSF com bagaço de cana de açúcar
4.5.2.1 Pré-tratamento ácido-básico
O bagaço de cana de açúcar (Saccharum spp.) foi cedido pelo Prof. Dr. Márcio
Henrique Pereira Barbosa (Departamento de Fitotecnia, UFV). O bagaço de cana de
açúcar triturado na concentração 10% (p/v) foi submetido a um pré-tratamento em
solução de ácido sulfúrico 0,5% a 121ºC em autoclave por 30 minutos. Em seguida, o
líquido foi coletado por filtração a vácuo e o resíduo sólido foi submetido ao pré-
tratamento básico em solução de NaOH 4% (p/v) por 30 minutos a 121ºC em
autoclave. Posteriormente o bagaço foi lavado com 500 mL de água deionizada
quente seguido de secagem a 50ºC por 24 horas. O sólido obtido foi denominado
celulose.
4.5.2.2 Sacarificação e fermentação simultânea a 37 °C e a 42°C
Experimentos de SSF foram realizados em frascos erlenmeyers de 125 mL,
cada um contendo 50 mL de meio mínimo de fermentação (sem glicose). A fração
sólida obtida do pré-tratamento ácido/básico foi utilizada como substrato na
concentração 8% (p/v). Inicialmente foi feito uma pré-hidrólise a 50°C por 72 horas,
utilizando enzima comercial (Celluclast 1.5 L) na concentração 15 FPU por grama de
substrato. Após a pré-hidrólise as leveduras foram inoculadas de forma que a D.O.(600)
inicial fosse correspondente a 2. Ensaios SSF foram realizados sob condições estéreis
e a fermentação foi realizada a 37°C e 42°C por 12 horas. Amostras foram retiradas a
26
intervalos de 2 horas, para posteriores dosagens de glicose e etanol por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE).
4.6 Parâmetros fermentativos
O rendimento de etanol por celulose consumida (Y E/C) foi calculado ao final de
12 horas de fermentação dividindo-se a diferença da massa final e inicial de etanol
pela massa inicial de celulose, ambas expressas em gramas (g).
Y E/C= (massa final de etanol (g) – massa inicial de etanol(g))/
massa inicial de celulose (g))
O rendimento de etanol por glicose consumida (Y E/G) foi calculado ao final de
12 horas de fermentação dividindo-se a diferença da massa final e inicial de etanol
pela massa inicial e final de glicose, ambas expressas em gramas (g).
Y E/G= (massa final de etanol (g) – massa inicial de etanol(g))/
massa inicial de glicose (g) – massa final de glicose (g))
4.7 Métodos analíticos – Concentrações de Glicose e Etanol
A quantificação de glicose e etanol foi realizada por cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC), utilizando uma coluna de troca iônica Aminex HPX-87H (Bio-Rad),
mantido a 60°C. O eluente para a separação foi ácid o sulfúrico 5 mM, aplicado a uma
taxa de eluição 0,7 mL min-1. A coluna foi acoplada ao detector de índice de refração
HP 1047 A.
Na montagem dos métodos foram preparados padrões de 5, 6,25, 10, 12,5 e 20
mM para glicose e 10, 12,5, 20 e 40 mM para etanol (Anexos 1 e 2). As amostras,
quando necessário, foram diluídas. As concentrações determinadas permitiram
calcular o consumo de glicose e produção de etanol ao longo do tempo de
fermentação. As dosagens foram realizadas no Laboratório de Fisiologia de Micro-
organismos (Departamento de Microbiologia Agrícola, UFV), sob coordenação da Prof.
Dra. Flávia Maria Lopes Passos, e no Laboratório de Microbiologia de Anaeróbios
27
(Departamento de Microbiologia Agrícola, UFV), sob coordenação do Prof. Dr. Hilário
Cuquetto Mantovani.
28
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Identificação molecular da levedura
Tradicionalmente, a classificação e identificação de linhagens e espécies de
leveduras têm sido baseadas em características morfológicas e habilidades
fisiológicas, sendo um processo laborioso e que consome tempo. Dadas as
dificuldades deste processo, técnicas moleculares utilizando a amplificação de
fragmentos específicos de DNAs têm sido utilizadas como métodos alternativos para
identificação de leveduras (Kurtzman e Robnett, 1998).
Atualmente, o método molecular mais utilizado para estudos em taxonomia e
identificação de leveduras baseia-se na comparação de seqüências da região D1/D2
do gene rDNA 26S e/ou do gene rDNA 18S. Organismos que exibem 99% ou mais de
identidade nesta região são considerados como pertencentes à espécie conhecida e
depositada no GenBank (Kurtzman e Robnett, 1998; Kawahata et al., 2007).
Neste sentido, foi feito o sequenciamento da região D1/D2 da subunidade 26S do
DNA ribossomal do novo isolado LBM-1. O resultado do seqüenciamento foi
submetido à comparação com seqüências do banco de dados GenBank utilizando o
programa BLASTn. A análise confirmou o novo isolado como pertencente à espécie S.
cerevisiae. Outras técnicas para melhor caracterizar o isolado estão em andamento no
Laboratório de Biotecnologia Molecular, como por exemplo, a determinação do
cariótipo.
5.2 Fotomicrografia das leveduras
Buscando conhecer melhor o isolado S. cerevisiae LBM-1 foi feita uma
fotomicrografia das leveduras. Na Figura 9 podem-se observar algumas características
comuns dentro da mesma espécie. As linhagens de S. cerevisiae mostraram-se
agrupadas em cachos, são maiores que as linhagens de K. marxianus e apresentam
morfologia esférica. As células de K. marxianus, apresentaram-se isoladas umas das
outras e com aspecto elíptico.
29
Figura 8 – Fotomicrografias utilizando o microscópio óptico Nikon Eclipse Ti-S com objetiva de 100X e abertura numérica de 1.4. A) LBM-1, B) CAT-1, C) PE-2, D) UFV-3, E) ATCC 8554 e F) CCT 4086.
5.3 Avaliação do crescimento das leveduras em meio sólido
De uma forma geral, a seleção de leveduras é feita por meio da avaliação do
crescimento em diferentes condições utilizando placas contendo meio sólido. Neste
sentido, a caracterização do perfil de crescimento de linhagens selvagens faz-se
necessária para posterior utilização destes parâmetros em experimentos de
melhoramento genético. Sabendo-se das condições limites para desenvolvimento das
leveduras pode-se fazer o melhoramento, realizando os experimentos em placas com
meio sólido para seleção dos mutantes. Além disto, a utilização de meio sólido é bem
mais prática para uma análise inicial e direcionar os parâmetros que serão utilizados
nos experimentos em meio líquido. Geralmente as fermentações industriais de etanol
são realizadas em meios contendo açúcares em concentrações acima de 10% (p/v).
Com o intuito de analisar os efeitos da temperatura e de concentrações de açúcares
no crescimento das leveduras foi realizada uma série de experimentos de crescimento
em meio sólido. Para tanto as leveduras foram plaqueadas em diferentes diluições no
meio contendo diferentes concentrações de glicose e incubadas nas seguintes
temperaturas: 30, 37, 42 e 45°C. Os resultados dest es testes estão apresentados no
Quadro 1.
30
Quadro 1 – Avaliação do crescimento de linhagens de leveduras em meio YP contendo diferentes concentrações de glicose e em diferentes temperaturas *.
Linhagens de
Leveduras
Temperatura 30°C Temperatura 37°C Temperatura 42°C Temperatura 45°C Concentrações de glicose
(p/v) Concentrações de glicose
(p/v) Concentrações de glicose
(p/v) Concentrações de glicose
(p/v) 2% 4% 8% 16% 2% 4% 8% 16% 2% 4% 8% 16% 2% 4% 8% 16%
S. cerevisiae LBM-1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - + +++ +++ S. cerevisiae CAT-1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - ++ +++ S. cerevisiae PE-2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - ++ +++
K. marxianus UFV-3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ K. marxianus ATCC 8554 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ K. marxianus CCT 4086 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Quadro 2 - Avaliação do crescimento de linhagens de leveduras em meio YPD 4% contendo diferentes concentrações de etanol e em diferentes temperaturas *.
Linhagens de
Leveduras
Temperatura 30°C Temperatura 37°C Temperatura 42°C Temperatura 45°C Concentrações de etanol (v/v) Concentrações de etanol (v/v) Concentrações de etanol (v/v) Concentrações de etanol (v/v) 2% 4% 6% 8% 10% 2% 4% 6% 8% 10% 2% 4% 6% 8% 10% 2% 4% 6% 8% 10%
S. cerevisiae LBM-1 +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ ++ - +++ +++ - - - +++ - - - - S. cerevisiae CAT-1 +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ - +++ +++ - - - +++ - - - - S. cerevisiae PE-2 +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ ++ - +++ +++ - - - +++ - - - -
K. marxianus UFV-3 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - +++ + - - - +++ - - - - K. marxianus ATCC 8554 +++ +++ +++ + - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - K. marxianus CCT 4086 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - -
31
Pode-se observar que as linhagens testadas cresceram em todas as diluições e
em todas as concentrações de glicose até 42°C. No e ntanto, a 45°C observa-se que
as linhagens de S. cerevisiae somente foram capazes de crescer em meios com
maiores concentrações de glicose, 8 e 16% (p/v), enquanto as K. marxianus
cresceram nas quatro concentrações de glicose testadas, evidenciando a maior
termotolerância desta espécie (Singh et al., 1998; Abdel-Fattah et al., 2000;
Ballesteros et al., 2004; Hong et al., 2007; Nonklang et al., 2008; Suryawati et al.,
2008).
O fato das linhagens de S. cerevisiae crescerem em meio sólido até 45°C em
altas concentrações de glicose, fato este não relatado ainda para leveduras desta
espécie, nos levou a testar o crescimento destas linhagens em meio líquido com
agitação, uma vez que a agitação provoca um maior estresse nas células, pelo maior
contato delas com o meio e, portanto o efeito osmótico poderia ser mais pronunciado.
Concomitantemente, esta observação foi instigante, uma vez que o aumento da
concentração de açúcares leva a um estresse osmótico das leveduras (Lima et. al.,
2001), apesar de que para as condições testadas este estresse não exerceu um efeito
de inibir o crescimento das leveduras como pode ser observado no Quadro 1.
Curiosamente, quando o experimento foi realizado a 45 °C, foi observado que as
linhagens de S. cerevisiae somente cresciam em concentrações de 8 e 16% (p/v) de
glicose. Este fato pode ter ocorrido devido a um mecanismo chamado de “tolerância
cruzada” (cross-tolerance), no qual um tipo de estresse como o estresse por
temperatura dá uma proteção parcial contra outros estresses como o osmótico ou
salino (Koedrith et al., 2008). Como um dos principais efeitos da temperatura é o
aumento da fluidez da membrana plasmática pode se especular que um meio
hipertônico impeça a entrada de água evitando a lise das leveduras em temperaturas
mais altas, mas este possível mecanismo de tolerância cruzada sugerido pelos
experimentos está sendo investigado.
Assim como descrito anteriormente, foram feitas análises do estresse provocado
pelo etanol nas leveduras em diferentes temperaturas. No Quadro 2 pode-se observar
que o estresse provocado pelo etanol nas leveduras é mais drástico do que o estresse
provocado pela variação na concentração de glicose.
A uma temperatura de 30°C, linhagens de S. cerevisiae apresentaram bom
crescimento até 8% (v/v) de etanol e um fraco crescimento em 10% (v/v) de etanol.
Nesta mesma temperatura, as linhagens de K. marxianus somente cresceram até uma
concentração de 6% (v/v) de etanol, confirmando a maior tolerância de S. cerevisiae
ao etanol em comparação com outras leveduras (Abdel-Banat et al., 2010).
32
No entanto, a combinação do estresse do etanol com a temperatura foi mais
relevante para S. cerevisiae, que teve um decréscimo na tolerância de 10% (v/v) de
etanol a 30°C para 4% (v/v) a 42°C, enquanto que pa ra as linhagens de K. marxianus
foi observado um decréscimo bem menor, de 6% (v/v) de etanol a 30°C para 4% (v/v)
a 42°C. Supõe-se que a combinação dos estresses ten ha um efeito maior para S.
cerevisiae, uma vez que as linhagens de K. marxianus são mais termotolerantes que
as linhagens selvagens de S. cerevisiae, embora a concentração máxima de etanol
suportada pelas linhagens não tenham sido diferentes.
5.4 Avaliação do crescimento das leveduras em meio líquido
Para melhor caracterizar o crescimento destas linhagens em diferentes
condições, foram feitos experimentos em microplacas contendo meio líquido e por
meio destes foram traçadas curvas de crescimento, utilizando o programa SigmaPlot
(versão 11.0). A curva de crescimento permitiu que fosse observado o
desenvolvimento dos micro-organismos em diferentes condições, sob temperatura
controlada e agitação adequada (Hiss, 2001).
A 30°C (Anexo 3) e a 37 °C (Figura 9) todas as linh agens apresentaram um bom
crescimento em todas as concentrações de glicose. Foi considerado bom crescimento,
possuir uma fase lag (fase de adaptação) com um período curto de duração, cerca de
2 horas, seguida de uma fase exponencial com D.O.(600) variando entre 1,0 e 1,5. Era
esperado que todas as linhagens crescessem nestas condições, uma vez que a
maioria dos micro-organismos fermentativos cresce numa temperatura ótima entre
30°C e 37°C (Olsson et al., 2006). Pode-se observar que as linhagens de K. marxianus
crescidas em glicose 16% (p/v) são ligeiramente menos tolerantes ao estresse
osmótico do que as linhagens de S. cerevisiae nestas mesmas condições (Figura 9- D,
E e F). Este efeito foi mais marcante para a linhagem CCT 4086, no qual se pode
observar na Figura 9-F um aumento na fase lag de 3 a 4 horas e uma D.O.(600) máxima
de 0,78 ± 0,038.
33
Figura 9 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 37°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.
34
A 42°C (Figura 10) as linhagens de K. marxianus apresentaram um melhor
crescimento em relação as linhagens de S. cerevisiae comprovando a sua já descrita
termotolerância. As linhagens LBM-1 (Figura 10-A) e CAT-1 (Figura 10-B) não
conseguiram crescer a 42°C em 2% (p/v), de glicose, entretanto, em concentrações de
glicose mais altas, 4, 8 e 16% (p/v), cresceram normalmente. A linhagem PE-2 teve
um crescimento menor quando comparada à LBM-1 e CAT-1, nas mesmas condições
(Figura 10-C). Normalmente, linhagens de S. cerevisiae não são capazes de crescer
em temperaturas maiores que 40°C (Sree et al., 2000), isto faz com que LBM-1, assim
como as linhagens CAT-1 e PE-2, sejam boas candidatas ao processo SSF.
Na Figura 11 pode-se observar que as linhagens de K. marxianus cresceram em
diferentes concentrações de glicose a 45°C, enquant o que as linhagens de S.
cerevisiae não foram capazes de crescer em qualquer concentração de glicose com
exceção de LBM-1 que apresentou um crescimento residual em 4, 8 e 16% de glicose
(Figura 11-A). Para a linhagem UFV-3 (Figura 11-D) foi observado o mesmo fenômeno
descrito para LBM-1 (Figura 11-A) e CAT-1 (Figura 11-B), ou seja, quando há um
estresse por altas temperaturas, as linhagens necessitaram de maiores concentrações
de açúcar para crescer.
A capacidade das linhagens crescerem em altas concentrações de açúcares, até
16% (p/v) de glicose, é uma característica muito desejada em processos industriais,
uma vez que maiores concentrações de açúcares no mosto a ser fermentado
permitem uma elevada taxa de conversão em etanol, aumentando o rendimento da
fermentação por reator e facilitando o processo de destilação.
35
Figura 10 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 42°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.
36
Figura 11 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 45°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.
37
Para verificar a capacidade termotolerante das linhagens, foi feita uma
comparação das velocidades específicas de crescimento (µ h-1) em diferentes
temperaturas. Desta forma, foi escolhida uma concentração de glicose (4% (p/v)) na
qual as linhagens cresceram melhor em diferentes temperaturas para os cálculos dos
valores de µ.
Na Tabela 2 pode-se observar que a velocidade específica de crescimento das
linhagens de S. cerevisiae foi similar a 30°C. À temperatura de 37°C as linha gens
CAT-1 e PE-2 apresentaram o maior valor de µ, 0,368 e 0,318 respectivamente,
quando comparadas a LBM-1. A 42°C as três linhagens de S. cerevisiae apresentaram
comportamento semelhante, com alta velocidade específica de crescimento. A 45°C o
crescimento das linhagens de S. cerevisiae cai substancialmente, sendo que a única
linhagem que ainda apresentou um crescimento foi LBM-1. Com isto, pode-se concluir
que a temperatura máxima tolerada por estas linhagens de S. cerevisiae é 42°C. Outro
fato a ser destacado, é o comportamento termotolerante da linhagem LBM-1. Isto
porque, esta linhagem é um isolado novo, diferentemente das linhagens, CAT-1 e PE-
2, que estão passando por pressão seletiva há muitos anos nos processos
fermentativos industriais.
As linhagens de K. marxianus apresentaram valores de velocidade de
crescimento bem superiores aos das linhagens de S. cerevisiae. A linhagem UFV-3
apresentou valores similares de µ para temperaturas de 30°C, 37°C e 42°C, sendo
que a 45°C apresentou uma diminuição na velocidade de crescimento. Por outro lado,
as linhagens de coleções biológicas ATCC 8554 e CCT 4086 apresentaram valores
similares de velocidade de crescimento independente das temperaturas. Estes dados
de termotolerância estão consistentes com a literatura, uma vez que já foi
demonstrado que K. marxianus cresce rapidamente mesmo em temperaturas acima
de 40°C (Fonseca et al., 2008).
A termotolerância observada nas linhagens testadas é de extrema importância
para viabilizar o processo SSF a partir do bagaço de cana de açúcar. Dessa forma,
decidimos selecionar duas temperaturas, 37°C e 42°C , nas quais todas as linhagens
testadas foram capazes de crescer para realizar os ensaios de fermentação e de SSF.
38
Tabela 2 - Velocidade específica de crescimento (µ) e D.O.(600) máxima em microplacas contendo meio YPD 4% em diferentes temperaturas.
Linhagens Velocidade de
Crescimento µ h-1
D.O.(600)
Temperaturas Temperaturas
30°C 37°C 42°C 45°C 30°C 37°C 42°C 45°C
LBM-1 0,126 0,218 0,274 0,114 1,18 1,08 0,61 0,15
CAT-1 0,181 0,368 0,230 0,033 1,28 1,24 0,86 0,15
PE-2 0,151 0,318 0,195 0,055 1,27 1,10 0,34 0,13
UFV-3 0,456 0,401 0,384 0,174 0,79 1,05 0,87 0,34
ATCC 8554 0,407 0,386 0,375 0,317 0,56 0,72 0,75 0,63
CCT 4086 0,358 0,353 0,377 0,332 0,73 0,89 1,17 0,68
Processos fermentativos requerem micro-organismos que possuam boa
capacidade fermentativa e que sejam tolerantes a altas concentrações de etanol.
Dessa forma, experimentos de caracterização quanto a tolerância ao etanol foram
realizados em microplacas e por meio destes foram feitas curvas de crescimento,
utilizando o programa SigmaPlot (versão 11.0).
A Figura 12 mostra a variação do crescimento em diferentes concentrações de
etanol em função da temperatura 30°C. As linhagens de S. cerevisiae apresentaram
um perfil de tolerância até 8% (v/v), de etanol sendo que o novo isolado LBM-1 (Figura
12-A) mostrou-se tão tolerante ao etanol quando as linhagens industriais CAT-1
(Figura 12-B) e PE-2 (Figura 12-C). Por outro lado, as linhagens de K. marxianus
apresentaram uma menor tolerância ao etanol, sendo que as linhagens de coleções
biológicas ATCC 8554 (Figura 12-E) e CCT 4086 (Figura 12-F) toleraram
concentrações mais altas de etanol, até 6% (v/v), do que a linhagem UFV-3 (Figura
12- D), crescendo somente até 4% (v/v) de etanol.
Na Figura 13 pode-se verificar que o aumento da temperatura para 37°C não
alterou significativamente o crescimento das linhagens de S. cerevisiae (Figura 13-A,
B, C), entretanto quando o crescimento foi avaliado em temperaturas mais elevadas,
42°C (Figura 14- A, B, C) e 45°C (Figura 15-A, B, C ), pode-se observar uma grande
redução no crescimento das mesmas, sendo que a 42°C nenhuma linhagem
conseguiu crescer nas concentrações mais altas de etanol, 6 e 8% (v/v). Portanto, a
45°C o ensaio não foi realizado nestas condições (F igura 15-A, B, C). As linhagens de
K. marxianus mostraram-se menos tolerantes ao etanol em comparação com as
39
linhagens de S. cerevisiae, (Figuras 12 a 15). Estes dados corroboram com a
literatura, que demonstram que S. cerevisiae tolera maiores concentrações de etanol,
enquanto K. marxianus toleram temperaturas mais altas (Fonseca et al., 2008).
40
Figura 12 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 30°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.
41
Figura 13 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 37°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.
42
Figura 14 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 42°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.
43
Figura 15 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 45°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.
44
5.5 Ensaios de fermentação em glicose
Diversos fatores afetam o rendimento da fermentação, tais como a temperatura,
a concentração de nutrientes, a presença de inibidores e o micro-organismo
fermentador. As leveduras afetam diretamente o desempenho do processo
fermentativo, seja pela concentração a ser inoculada, pela espécie, linhagem e até
mesmo por sofrer contaminação bacteriana. Maiores concentrações de levedura na
dorna permitem fermentações mais rápidas, com maior produtividade e maior controle
sobre as bactérias contaminantes, além de restringir o crescimento da própria
levedura, favorecendo a fermentação (Lima et. al., 2001).
A fim de estabelecer a quantidade ideal de inóculo a ser utilizada e o micro-
organismo adequado ao processo fermentativo foi feita a comparação de linhagens de
S. cerevisiae e K. marxianus, em diferentes concentrações de inóculo, D.O.(600)= 0,1 e
D.O.(600)= 2, em 50 mL de meio mínimo de fermentação, contendo 4% (v/v) de glicose,
e em condições controladas durante 12 horas de fermentação.As tabelas 3 e 4
mostram as concentrações final e inicial de glicose e etanol e os rendimentos obtidos,
após 12 horas de fermentação começando com D.O.(600) inicial correspondente a 0,1.
Nas duas temperaturas testadas, 37°C (Tabela 3) e 4 2°C (Tabela 4), foram verificadas
uma grande quantidade de glicose residual, mostrando que nestas condições a
fermentação tem que ser conduzida por um período superior a 12 horas para obtermos
o máximo de conversão. Além disto, parece que uma menor quantidade de leveduras
no meio desvia parte dos carbonos para produção de biomassa o que é sugerido pelo
baixo rendimento em etanol comparado com o valor teórico 0,51.
Tabela 3 – Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 0,1, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (p/v).
Linhagem
de levedura
Glicose
inicial
(g L -1)
Glicose
final
(g L -1)
Etanol
inicial
(g L -1)
Etanol
final
(g L -1)
Y E/G
(g etanol/
g glicose)
LBM-1 47,81 26,52 0 4,54 0,21
CAT-1 47,81 27,08 0 4,46 0,22
PE-2 47,81 30,27 0 4,34 0,25
UFV-3 47,81 30,41 0 2,96 0,17
ATCC 8554 47,81 29,66 0 2,74 0,15
CCT 4086 47,81 30,13 0 2,34 0,13
45
Tabela 4 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 0,1, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (p/v).
Linhagem
de levedura
Glicose
inicial
(g L -1)
Glicose
final
(g L -1)
Etanol
inicial
(g L -1)
Etanol
final
(g L -1)
Y E/G
(g etanol/
g glicose)
LBM-1 43,17 28,21 0 5,27 0,35
CAT-1 43,17 31,58 0 4,40 0,38
PE-2 43,17 29,13 0 3,81 0,27
UFV-3 43,17 24,69 0 4,11 0,21
ATCC 8554 43,17 19,25 0 6,20 0,26
CCT 4086 43,17 28,86 0 3,71 0,26
As figuras 16 e 17 representam o perfil fermentativo das linhagens em 50 mL de
meio de fermentação acrescido de glicose 4% em D.O.(600) correspondente a 2, a 37°C
e 42°C respectivamente. A 37°C pode-se observar que tanto as linhagens de S.
cerevisiae quanto as linhagens de K. marxianus consumiram toda a glicose presente
no meio, produzindo em média 20 (g L-1) de etanol, fazendo com que o rendimento
fermentativo das linhagens fosse muito parecido nesta temperatura (Figura 16 e
Tabela 5).
A 42°C as linhagens apresentaram entre si um compor tamento similar,
entretanto ocorreu um aumento da glicose residual para as linhagens LBM-1, CAT-1,
PE-2 e UFV-3, enquanto ATCC 8554 e CCT 4086 consumiram toda a glicose do meio
(Figura 17). A produção final de etanol foi muito similar para todas as linhagens, com
valores maiores para ATCC 8554 e CCT 4086, 12,11 (g L-1) e 12,06 (g L-1) de etanol
respectivamente (Tabela 6). Entretanto, o rendimento final da fermentação não foi
substancialmente maior para estas linhagens, assim ATCC 8554 e CCT 4086
utilizaram a glicose para produzir biomassa, enquanto que as outras linhagens
favoreceram a fermentação, produzindo mais etanol. As K. marxianus são
conhecidamente leveduras crabtree negativas tendo um metabolismo respiro-
fermentativo o que leva a um menor rendimento de etanol em aerobiose quando
comparado a linhagens de S. cerevisiae.
Desta forma, estes ensaios mostraram que iniciar a fermentação com uma
D.O.(600) mais alta, correspondente a 2, favorece um aumento no rendimento do
processo. A elevada concentração de leveduras na cultura diminui substancialmente a
46
fase inicial, caracterizada por intensa multiplicação celular, o que permite que se entre
rapidamente na fase fermentativa (Lima et. al., 2001).
Figura 16 - Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v).
47
Figura 17 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v).
48
Tabela 5 - Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (p/v).
Linhagem
de levedura
Glicose
inicial
(g L -1)
Glicose
final
(g L -1)
Etanol
inicial
(g L -1)
Etanol
final
(g L -1)
Y E/G
(g etanol/
g glicose)
LBM-1 47 0,041 0 21,7 0,46
CAT-1 47 0 0 22,77 0,48
PE-2 47 1,20 0 22,24 0,49
UFV-3 47 1,93 0 18,53 0,41
ATCC 8554 47 0 0 19,66 0,42
CCT 4086 47 0 0 18,1 0,39
Tabela 6 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (p/v).
Linhagem
de levedura
Glicose
inicial
(g L -1)
Glicose
final
(g L -1)
Etanol
inicial
(g L -1)
Etanol
final
(g L -1)
Y E/G
(g etanol/
g glicose)
LBM-1 47 10,35 0 10,64 0,29
CAT-1 47 9,82 0 9,92 0,27
PE-2 47 17,19 0 8,47 0,28
UFV-3 47 16,11 0 7,24 0,23
ATCC 8554 47 0,33 0 12,11 0,26
CCT 4086 47 0,05 0 12,06 0,26
5.6 Ensaios de SSF com bagaço de cana de açúcar
A fim de analisar a capacidade fermentativa das linhagens termotolerantes em
processo SSF, foram feitos ensaios com bagaço de cana de açúcar utilizando
parâmetros definidos na caracterização fisiológica e nos ensaios de fermentação.
Por meio de uma comunicação pessoal (Carlos Joulbert Alves de Souza,
mestrando do Laboratório Biotecnologia Molecular/UFV), foram estabelecidas as
condições de realização do processo SSF. Neste sentido, os experimentos de SSF
foram realizados em duas temperaturas, 37°C e 42°C, e utilizando uma concentração
inicial de inóculo correspondente a D.O.(600) igual a 2. Inicialmente, o bagaço, 8% (p/v),
foi submetido a uma pré-hidrólise por 72 horas a 50°C utilizando 15 FPU por grama de
49
substrato de celulases comerciais. Após a pré-hidrólise, as leveduras foram inoculadas
e a fermentação seguiu-se por 12 horas. A função da pré-hidrólise é fornecer uma
fonte inicial de carbono para a levedura, uma vez que a celulose não é uma fonte de
carbono diretamente fermentável.
Nas tabelas 7 e 8 estão descritas as concentrações e os rendimentos obtidos
pelo processo SSF em difrentes temperaturas para as linhagens analisadas. Em
ambas as temperaturas, foram calculados de duas formas diferentes o rendimento do
processo.
O rendimento (Y E/G) em função da concentração de glicose incial foi
considerado a partir da concentração de glicose existente no meio no momento do
inóculo da levedura. No entanto, para processo SSF esta não é uma forma correta de
se calcular o rendimento, uma vez que a hidrólise acontece simultânea à fermentação.
Portanto, a liberação de glicose continua ocorrendo no meio enquanto a levedura está
utilizando-a para crescer e/ou fermentar.
O rendimento (Y E/C) em função da concentração de celulose foi considerado a
partir da biomassa, ou seja, do bagaço de cana pré-tratado utilizado na concentração
de 8% (p/v). Neste sentido, o cálculo do rendimento a partir do bagaço é mais correto.
Entretanto, como alguns artigos ainda calculam o rendimento do SSF a partir da
glicose inicial decidiu-se estabelecer esta comparação.
De acordo com os dados obtidos nas tabelas 7 e 8, Y E/G é muito superior a Y
E/C nas linhagens avaliadas, entretanto esta forma de calcular Y E/G faz com que o
rendimento seja até maior que o rendimento teórico do processo, que corresponde a
0,51.
Trabalhos anteriores realizados por Carlos Joulbert Alves de Souza analisaram a
influência do tempo de pré-hidrolise no rendimento em etanol pelas linhagens LBM-1 e
UFV-3 (dados não publicados). Em seus experimentos, o pesquisador concluiu que
72 horas seria o tempo ideal de pré-hidrólise para início da fermentação. No entanto,
não foi possível concluir se com 72 horas as celulases perdiam a atividade enzimática
ou se neste momento as enzimas passavam a sofrer inibição pelo produto. As tabelas
5, 6, 7 e 8 mostram que iniciando ambos os processos com cerca de 40 g L-1, obtém-
se uma concentração maior de etanol no processo SSF, demonstrando após as 72
horas iniciais de pré-hidrólise, as celulases pararam de agir por inibição pelo produto.
50
Tabela 7 – SSF a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de bagaço de cana de açúcar 8% (p/v).
Linhagem
de levedura
Celulose
inicial
(g L -1)
Glicose
inicial
(g L -1)
Etanol final
(g L -1)
Y E/C
(g etanol/
g celulose)
Y E/G
(g etanol/
g glicose)
LBM-1 80 32,56 22,24 0,28 0,68
CAT-1 80 33,36 21,08 0,26 0,63
PE-2 80 32,93 19,43 0,24 0,59
UFV-3 80 36,64 22,62 0,28 0,62
ATCC 8554 80 35,38 22,32 0,28 0,63
CCT 4086 80 35 21,48 0,27 0,61
Tabela 8 - SSF a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de bagaço de cana de açúcar 8% (p/v).
Linhagem
de
levedura
Celulose
inicial
(g L -1)
Glicose
inicial
(g L -1)
Etanol final
(g L -1)
Y E/C
(g etanol/
g celulose)
Y E/G
(g etanol/
g glicose)
LBM-1 80 37,11 16,63 0,21 0,47
CAT-1 80 38,99 22,84 0,29 0,59
PE-2 80 37,3 20,31 0,25 0,54
UFV-3 80 32,6 16,12 0,20 0,51
ATCC 8554 80 41,03 16,95 0,21 0,43
CCT 4086 80 35,1 13,30 0,17 0,41
Nos últimos anos têm-se isolado e caracterizado leveduras termotolerantes,
visando sua utilização em processos SSF. A tabela 9 mostra o rendimento de etanol,
obtido com a utilização de linhagens termotolerantes, em relação a diferentes
biomassas pré-tratadas. Nota-se que algumas dessas linhagens são capazes de
fermentar na temperatura de 45°C. Entretanto, rendi mentos maiores em etanol são
obtidos quando o processo é realizado a 37° e 42°C. Acima de 40°C, a viabilidade das
culturas de leveduras diminui consideravelmente, o que afeta a produção de etanol
(Suryawati et al., 2008).
Analisando os valores de rendimento em etanol obtidos neste experimento
(Tabelas 7 e 8), nota-se que os valores foram próximos aos isolados de S. cerevisiae e
51
K. marxianus já descritos na literatura. Os elevados rendimentos observados nos
experimentos de Rudolf et al. (2007), 0,35 e 0,36 (Tabela 9) devem-se ao uso de uma
maior carga enzimática na hidrólise, principalmente de β-glicosidase, visando diminuir
a inibição das celulases pelo acúmulo de celobiose. A quantidade e custo das enzimas
impactam significativamente o processo.
Comparando-se o rendimento obtido por Santos e colaboradores (2010), com os
rendimentos obtidos pelo presente trabalho, nota-se a importância do uso de
leveduras termotolerantes para o processo SSF (Tabela 9). Por utilizar uma linhagem
de S. cerevisiae não termotolerante, os autores observaram que foi necessário
aumentar a carga enzimática da pré-hidrólise e resultando num rendimento final de
0,15, rendimento muito inferior ao obtido pelo presente trabalho (Tabelas 7 e 8).
Os ensaios de SSF tanto a 37°C, quanto a 42°C, most raram valores de Y E/C
muito similares. Por outro lado, os ensaios a 37°C apresentaram uma produção maior
de etanol que a 42°C, fato que pode ser relacionado à maior capacidade fermentativa
das linhagens nesta temperatura. Com isto pode-se concluir que todas as linhagens
utilizadas podem ser utilizadas para viabilizarem o processo SSF.
52
Biomassa Cepa de levedura
Temperatura (°C) Carga enzimática
Concentração de etanol
(g L -1)
YE/B Tempo de fermentação
(horas)
Fonte
80 g L-1 Bagaço de cana
S. cerevisiae 32 30 FPU/g celulases 20 CBU/g β-glicosidase
12 0,15 72 Santos et al., 2010
75 g L-1 Panicum virgatum
K. marxianus IMB3 45 15 FPU/g celulases 19,43 0,26 168 Faga et al., 2010
72,44 g L-1 Panicum virgatum
K. marxianus IMB4 37 15 FPU/g celulases 12,3 0,17 72 Suryawati et al., 2008
72,44 g L-1 Panicum virgatum
S. cerevisiae D5A 37 15 FPU/g celulases 14 0,19 72 Suryawati et al., 2008
72,44 g L-1 Panicum virgatum
K. marxianus IMB4 41 15 FPU/g celulases 14,8 0,2 72 Suryawati et al., 2008
50 g L-1 Bagaço de cana
S. cerevisiae TMB3400
37 12 FPU celulases 12 IU β-glicosidase
18,2 0,36 90 Rudolf et al., 2007
75 g L-1 Bagaço de cana
S. cerevisiae TMB3400
37 12 FPU celulases 12 IU β-glicosidase
26 0,35 90 Rudolf et al., 2007
75 g L-1 Celulose cristalina
K. marxianus CECT 10875
42 15 FPU/g celulases 26,1 0,35 72 Tomás-Pejó et al., 2008
100 g L-1 Bagaço de cana
S. cerevisiae NRRL-Y-132
40 40 FPU/g celulases 25 0,25 72 Hari et al., 2001
80 g L-1 Bagaço de cana
S. cerevisiae LBM-1 37 15 FPU/g de celulases 13,78 0,15 80 Este trabalho
80 g L-1 Bagaço de cana
K. marxianus UFV-3
42 15 FPU/g de celulases 15,98 0,18 80 Este trabalho
Tabela 9 - Rendimento em etanol obtido com a utilização de linhagens termotolerantes de K. marxianus e S. cerevisiae, em relação a diferentes biomassas pré-tratadas.
53
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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60
7. ANEXO
y = 24204x + 3100,3R2 = 0,9993
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0 5 10 15 20 25
Concentração mM
Áre
a
Anexo 1 - Curva-padrão de glicose: concentração de glicose x área.
Anexo 2 - Curva-padrão de etanol: concentração de etanol x área.
61
Anexo 3 – Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 30°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.