Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Ciências Biomédicas

CARACTERIZAÇÃO MORFO-FUNCIONAL E MOLECULAR DAS CÉLULAS MESENQUIMAIS DO ESTROMA DO TECIDO ADIPOSO E SUA POSSÍVEL IDENTIDADE COM O ESTROMA DA MEDULA ÓSSEA

LEANDRA SANTOS BAPTISTATESE SUBMETIDA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

MORFOLÓGICAS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO,

VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR.

ORIENTADORES: PROFA. MARIA ISABEL DORIA ROSSI - PROF. RADOVAN BOROJEVIC

Março de 2008

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i

Examinadores:

Profa. Nance Nardi (Dept. de Genética, UFRGS)

Prof. José Mauro Granjeiro (Centro de Estudos Gerais, Instituto de Biologia, UFF)

Profa. Tatiana Lobo Coelho de Sampaio (Dept. Histologia e Embriologia, UFRJ)

Prof. César Cláudio-da-Silva (Dept. de Clínica Médica, Faculdade de Medicina, UFRJ)

como suplente externo.

Prof. Leonardo Rodrigues Andrade (Dept. Histologia e Embriologia, UFRJ), como

revisor e suplente interno.

Orientadores:

Profa. Maria Isabel Doria Rossi (Dept. Histologia e Embriologia, UFRJ).

Prof. Radovan Borojevic (Dept. Histologia e Embriologia, UFRJ).

Prof. Vivaldo Moura Neto (Coordenador do Curso de Pós-graduação em Ciências

Morfológicas (PCM).

ii

Baptista, Leandra Santos. Caracterização Morfo-Funcional e Molecular das Células Mesenquimais do Estroma do Tecido Adiposo e sua possível Identidade com o Estroma da Medula Óssea/ Leandra Santos Baptista. Rio de Janeiro: UFRJ/Pós-graduação em ciências morfológicas, 2008. xii 113p. Tese – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Pós-graduação em ciências morfológicas, 2008. 1. Células-tronco 2. Tecido adiposo 3. Multipotencialidade – Tese.

iii

"O prazer no trabalho aperfeiçoa a obra." Aristóteles

"Procure ser um homem de valor em vez de ser um homem de sucesso."

Albert Einstein

“A vida não passa de um instante, mas basta este instante para empreendermos coisas eternas.”

E. Bersot.

iv

Aos meus pais, Divino e Sônia Baptista, pela eterna dedicação aos filhos.

v

AGRADECIMENTOS Aos meus pais por todo apoio e fé, a vida sem vocês com certeza seria uma

jornada mais difícil. AMO MUITO VOCÊS!

Ao meu irmão e melhor amigo, Raphael, por todo carinho. TAMBÉM TE AMO

MUITO!

Ao meu marido Daniel, primeiro por ouvir todos os dias as minhas derrotas e

vitórias; alegrias e tristezas; e segundo por me ajudar nos layouts dos meus trabalhos

com o seu talento inconfundível. NEM PRECISO DIZER QUE TE AMO!

A minha orientadora e amiga, Isabel, que me acolheu desde as minhas

primeiras “pipetadas” e me acompanhou com muita dedicação e carinho até aqui, me

ensinando muito mais do que ciência. Nunca vou me esquecer das nossas conversas

bem humoradas, científicas ou não. Tenho muito orgulho de ter aprendido com você.

Ao meu orientador Prof. Radovan, por ser um grande exemplo de professor,

pesquisador e pessoa.

AOS DOIS MUITO OBRIGADA PELA CONFIANÇA!

As minhas primeiras e únicas alunas, Carolina e Karina. Acho que não tenho

palavras para agradecer tamanha dedicação. Desejo a vocês toda felicidade e

sucesso do mundo; e saibam que ganharam uma grande amiga para todas as horas!

JÁ ESTOU COM SAUDADES ...

Ao meus grandes amigos e colaboradores, Cesar e Marcelo, sem vocês

simplesmente este trabalho não teria acontecido!

Ao meu revisor, Prof. Leonardo Andrade, pela tese, trabalhos desenvolvidos

em colaboração e companheirismo.

As minhas amigas do banco de células, Daiana, Danielle, Carolina, Karina,

Natália (a equipe exclusivamente feminina da Prof. Isabel) pela grande ajuda e

principalmente pelos grandes congressos e nights! Ah, não posso esquecer da

Karlinha, que apesar de não ser do banco, também é do nosso grupo de tecido

adiposo. Ainda teremos muitas estórias!

A equipe do banco de células e do transplante de medula óssea pelos vários

quebra-galhos, em especial ao Prof. Hélio Dutra.

Ao pessoal do laboratório de proliferação e diferenciação celular e de patologia

celular, em especial a Virgínia e a Prof. Valéria pela grande ajuda.

Ao pessoal da excellion, em especial ao Hamilton e a Kelly, pelos anticorpos e

análises de citometria.

A Edna e Gorete grandes desatadoras de nós! Muito obrigada.

A todos aqueles que de alguma maneira colaboraram para este trabalho.

vi

RESUMO As células-tronco mesenquimais (MSCs) podem ser isoladas de praticamente

todos os tecidos adultos e fetais com posterior expansão in vitro. O tecido adiposo

subcutâneo está principalmente envolvido na estocagem de energia além de ser

considerado como um órgão endócrino em adultos. Sua fração estromal-vascular

contém células-tronco multipotentes que dividem com a MSC da medula óssea a

capacidade de diferenciação em diferentes linhagens mesenquimais além do efeito

imunomodulador. Em vista disso, o tecido adiposo pode representar uma fonte

abundante de MSC e o potencial de aplicação destas células como uma fonte

alternativa as MSCs da medula óssea é de grande interesse. O objetivo deste trabalho

foi isolar e avaliar a multipotencialidade das MSC do tecido adiposo assim como as

suas similaridades com as MSCs da medula óssea. As MSCs do tecido adiposo foram

isoladas de lipoaspirados ou do tecido adiposo subcutâneo por digestão enzimática e

caracterizadas por citometria de fluxo. Também foram investigados o potencial de

diferenciação para as linhagens mesodérmicas e a capacidade de sustentação da

hematopoiese in vitro. A população de células derivada do tecido adiposo era

heterogênea, constituída por pré-adipócitos, MSCs, células endoteliais maduras e

células hematopoiéticas. O potencial de diferenciação em adipócitos, osteoblastos,

condroblastos e células endoteliais foi confirmado in vitro, embora um aparente

comprometimento para a linhagem adipogênica tenha sido observado através de

análises morfológicas e pela expressão constitutiva do gene PPARγ2. Além disso,

assim como as MSCs da medula óssea, as de tecido adiposo foram capazes de

sustentar a hematopoiese in vitro, embora uma tendência de geração de macrófagos

a partir de progenitores hematopoiéticos tenha sido observada, o que se assemelha ao

desenvolvimento do quadro de obesidade. Contudo, quando as MSC do tecido

adiposo foram induzidas para o fenótipo osteoblástico elas foram capazes de sustentar

a célula-tronco hematopoiética (HSC) in vitro. Estes resultados sugerem que o

comprometimento adipogênico, provavelmente ditado pelo microambiente do tecido

adiposo, pode ser superado pela indução osteogênica.

vii

ABSTRACT Mesenchymal stem cells (MSC) can be isolated from virtually all adult and fetal

tissues and expanded in vitro. Adipose subcutaneous tissue is mainly involved in

energy storage and also considered as an endocrine organ in adults. The stromal

vascular fraction contains multipotent stem cells that share with bone marrow

mesenchymal stem cell (BM-MSC) not only the capacity to differentiate into different

mesenchymal lineages, but also an immunomodulatory effect. In view of this, adipose

tissue could represent an abundant source of MSCs and the potential application of

these cells as an alternative source to bone marrow MSCs has raised great interest.

The objective of the present work was to isolated and evaluate the multipotentiality of

MSCs from adipose tissue as well as their similarities with MSCs from bone marrow.

Adipose MSCs were isolated from lipoaspirates or subcutaneous fat tissue by

enzymatic digestion and characterized by flow cytometry. The potential to differentiate

in vitro towards mesodermal lineages and the capacity to support hematopoietic

progenitors were investigated. Adipose tissue-derived cell population was

heterogeneous and contained preadipocytes, MSCs, mature endothelial cells and

hematopoietic cells. The potential to differentiate into adipocytes, osteoblasts,

condroblasts and endothelial cells was confirmed in vitro, although an apparent

commitment to adipogenic lineage was observed in morphological analyses and by the

constitutive expression of PPARγ2 gene. Besides, as bone marrow MSCs, adipose

tissue-derived MSCs were able to support hematopoiesis in vitro, although a trend to

induce proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells toward

macrophages were observed, resembling the obesity scenario. However, when

adipose tissue MSCs were induced to the osteoblast phenotype they were able to

sustain the hematopoietic stem cells (HSC) in vitro. These results suggest that the

adipogenic commitment, probably dictated by the adipose tissue microenvironment,

could be bypassed by osteogenic induction.

viii

LISTA DE ABREVIATURAS AGM = (aorta-gonad-mesonephros)

α-SMA = (alpha smooth muscle actin)

Ang = (Angiopoietina)

BMP (bone morphogenetic protein)

CD = (cluster of differentiation)

CFU-F = (colony-forming units–fibroblastic)

CFU-GM = (colony unit formation of granulocytes and macrophages)

CFU-S = (colony unit formation of spleen)

CLP = (commun lymphoid progenitors)

CMP = (commun myeloid progenitors)

Flk-1 = (Vascular endothelial growth factor receptor)

GM-CSF = (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)

G-CSF = (Granulocyte colony-stimulating factor)

GvHD = (Graft-versus-host disease)

HSC = (Hematopoietic stem cell)

HUVEC = (human umbilical cord endothelial cells)

IL = (Interleukin)

KDR = (Vascular endothelial growth factor receptor 2)

LIF = (leukemia inhibitory factor)

LTBMC = (long-term bone marrow culture)

LTC-IC = (long term clonogenic- initiating cell)

MAPC = (multipotent adult progenitor cells)

MCP-1 = (monocyte chemotactic protein-1)

M-CSF (Macrophage colony-stimulating factor)

MGG = (May-Grünwald – Giemsa)

MO = (medula óssea)

MSC = (Mesenchymal stem cell)

OPG = (osteoprotegerin)

PDGF = (platelet-derived growth factor)

PECAM-1 = (platelet endothelial cell adhesion molecule-1)

PPARγ2 = (peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-2)

RANKL = (Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)

SCF = (stem cell factor)

SDF-1α = (Stromal derived factor- 1alpha)

TA = (tecido adiposo)

ix

TAB = (tecido adiposo branco)

TAM = (tecido adiposo marrom)

Tal-1 = (T-cell acute lymphocytic leukemia 1)

TGFβ = (Transforming growth factor-beta)

TNF-α = (tumor necrosis factor-alpha)

Tie-2 = (Angiopoietin-1 receptor)

VCAM = (vascular cell adhesion molecule)

VE (vascular–endothelial)-caderina VEGF = (Vascular endothelial growth factor)

vWf = (von-Willebrand factor)

x

1. INTRODUÇÃO 1.1. CÉLULAS – TRONCO .............................................................................................1 1.1.a. CÉLULAS – TRONCO PLURIPOTENTES ...........................................................1 1.1.b. POTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS – TRONCO NO ORGANISMO ADULTO ..................................................................................................2 1.2. MEDULA ÓSSEA (MO) ...........................................................................................4 1.2.a. MICROAMBIENTE MEDULAR .............................................................................4 1.2.b.HEMOPOIETINAS, QUIMIOCINAS E MATRIZ EXTRACELULAR........................7 1.2.c. CÉLULAS-TRONCO HEMATOPOIÉTICAS (HSC) ..............................................9 1.2.d. CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS (MSC) ..................................................10 1.3. TECIDO ADIPOSO (TA) ........................................................................................12 1.3.a. TECIDO ADIPOSO (TA) COMO UM ÓRGÃO ENDÓCRINO ............................12 1.3.b. MSC DE TECIDO ADIPOSO (TA) .....................................................................14 1.4. ONTOGENIA DAS MSC ........................................................................................16 1.4.a. PERICITOS ........................................................................................................16 1.4.b. HEMANGIOBLASTOS E CÉLULAS DO SOMITO .............................................16 1.4.c. MESANGIOBLASTO ..........................................................................................19 1.4.d.CÉLULAS DA CRISTA NEURAL ........................................................................20 1.5. MSC NO ORGANISMO ADULTO .........................................................................21 1.5.a. MARCADORES DE SUPERFÍCIE .....................................................................22 1.5.b. DIFERENCIAÇÃO ORTODOXA ........................................................................23 1.5.c. REGULAÇÃO DAS VIAS OSTEOGÊNICA E ADIPOGÊNICA ...........................24 1.5.d. O POTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO DAS DIFERENTES FONTES DE MSC ..............................................................................................................................25 1.5.e. DIFERENCIAÇÃO NÃO-ORTODOXA ...............................................................26 1.5.f. POTENCIAL IMUNOMODULADOR ....................................................................27 1.6. ENSAIOS CLÍNICOS COM MSCs ........................................................................28 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................30 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................30 3. METODOLOGIA 3.1. AMOSTRAS E TÉCNICAS DE ISOLAMENTO .....................................................31 3.1.a. AMOSTRAS E CÉLULAS ..................................................................................31 3.1.b. ISOLAMENTO DE MSCs ...................................................................................31 3.1.c. OBTENÇÃO DE CÉLULAS DO CORDÃO E DO SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL ...................................................................................................................32 3.2. ENSAIOS FUNCIONAIS .......................................................................................33 3.2.a. INDUÇÃO PARA A VIA OSTEOGÊNICA ..........................................................33 3.2.b. INDUÇÃO DE MSCS PARA A VIA ADIPOGÊNICA ..........................................34 3.2.c. INDUÇÃO DE MSCS DE TA PARA A VIA CONDROGÊNICA ..........................34 3.2.d. INDUÇÃO DE MSCS DE TA PARA A VIA ENDOTELIAL .................................35 3.2.e. SUSTENTAÇÃO DA HEMATOPOESE EM CULTURAS DE LONGA DURAÇÃO ...................................................................................................................36

xi

3.3. TÉCNICAS EXPERIMENTAIS ..............................................................................37 3.3.a. CITOMETRIA DE FLUXO ..................................................................................37 3.3.b. SELEÇÃO DAS CÉLULAS DE TA .....................................................................38 3.3.c. HISTOLOGIA, IMUNOFLUORESCÊNCIA E IMUNOHISTOQUÍMICA ..............38 3.3.d. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV)..................................39 3.3.e. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL E SÍNTESE DE cDNA ........................................40 3.3.f. REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA COM TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT– PCR) ....................................................................................................................40 3.3.g. ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................40 4. RESULTADOS 4.1. MORFOLOGIA E FENÓTIPO DAS MSC DE TA. .................................................42 4.1.a. ANÁLISE DA POPULAÇÃO TOTAL (FIG. 12 – 15) ...........................................42 4.1.b. ANÁLISE DE POPULAÇÕES CELULARES SELECIONADAS (FIG. 16 – 20) ...............................................................................................................43 4.2. MULTIPOTENCIALIDADE ....................................................................................50 4.2.a. DIFERENCIAÇÃO PARA AS TRÊS LINHAGENS MESODÉRMICAS: ADIPOGÊNICA, OSTEOGÊNICA E CONDROGÊNICA (FIG. 21 – 31) ..............................................................................................................50 4.2.b. DIFERENCIAÇÃO PARA A LINHAGEM ENDOTELIAL (FIG. 32 – 35) .............58 4.3. POTENCIAL DE SUSTENTAÇÃO HEMATOPOIÉTICA........................................62 4.3.a. CO-CULTURA COM CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL (FIG. 36 – 41) ..........................................................................62 4.3.b. ANÁLISES DO CO-CULTIVO COM CÉLULAS CD34+ DE SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL (FIG. 42 – 45) ..........................................................................70 5. DISCUSSÃO 5.1. FENÓTIPO DAS MSC DE TA................................................................................73 5.1.a. A FRAÇÃO ADERENTE DO TA É CONSTITUÍDA POR CÉLULAS DE ORIGEM ESTROMAL E ENDOTELIAL .......................................................................................73 5.1.b. AS CÉLULAS CD34+ DA FRAÇÃO ADERENTE DO TA ADQUIREM O MARCADOR CD105 IN VITRO ....................................................................................76 5.2. MULTIPOTENCIALIDADE ....................................................................................77 5.2.a. AS MSC DE TA SOB INDUÇÃO ADQUIREM FENÓTIPOS OSTEOGÊNICO, ADIPOGÊNICO E CONDROGÊNICO IN VITRO .........................................................77 5.2.b. AS MSC DE TA SÃO MORFOLOGICA E GENETICAMENTE DIFERENTES DAS MSC DE MO ........................................................................................................78 5.2.c. AS MSC DE TA APRESENTAM UM POTENCIAL ADIPOGÊNICO DIFERENTE DAS MSC DE MO ........................................................................................................79 5.2.d. AS MSC DE TA PARECEM SER COMPROMETIDAS COM A VIA ENDOTELIAL...............................................................................................................81 5.3. POTENCIAL DE SUSTENTAÇÃO HEMATOPOIÉTICA........................................84 5.3.a. AS MSC DE TA APRESENTAM SIMILARIDADES COM AS DE MO ................84 5.3.b. AS MSCS PRÉ-INDUZIDAS PARA AS VIAS ADIPOGÊNICA E OSTEOGÊNICA APRESENTAM PERFIS DE GERAÇÃO DE CÉLULAS HEMATOPOIÉTICAS DISTINTOS ..................................................................................................................85 5.3.c. AS MSCS DE TA QUANDO INDUZIDAS PARA A LINHAGEM OSTEOBLÁSTICA SÃO CAPAZES DE MANTER AS HSCs .......................................87

xii

5.4.CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................89 6. CONCLUSÕES 6.1.FENÓTIPO..............................................................................................................91 6.2.MULTIPOTENCIALIDADE......................................................................................92 6.3.POTENCIAL DE SUSTENTAÇÃO HEMATOPOIÉTICA.........................................92 6.4.CONCLUSÃO FINAL...............................................................................................92 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................93

1

1. INTRODUÇÃO 1.1. CÉLULAS – TRONCO 1.1.a. Células – tronco pluripotentes

As células-tronco são consideradas as unidades responsáveis pelos processos

de geração e de regeneração do organismo adulto (WEISSMAN, 2000). As células-

tronco adultas são definidas pela capacidade de auto-renovação e pela geração de

células maduras de um tecido particular ao longo da diferenciação (REYA et al., 2001).

Mais recentemente, a hipótese de que estas células localizam-se em regiões

específicas, denominadas nichos, nos diferentes tecidos foi amplamente demonstrada

(KAPLAN et al., 2007). Acredita-se que o nicho em que essas células residem é

determinante na regulação das suas propriedades de células-tronco (SPRADLING et

al., 2001).

As células-tronco pluripotentes, teoricamente, podem gerar todos os tipos

celulares e possuem uma alta capacidade de proliferação em um estado

indiferenciado por um período prolongado em cultura. Estas células são derivadas

preferencialmente de tecidos embrionários, principalmente da massa interna do

blastocisto (DONOVAN & GEARHART, 2001). Recentemente, células pluripotentes

têm sido identificadas na medula óssea (MO) adulta (REYES et al., 2001; KUCIA et al.,

2007) e também no sangue de cordão (KUCIA et al., 2007). Células-tronco com estas

características, denominadas de células adultas progenitoras multipotentes (MAPC,

Multipotent Adult Progenitor Cells), expressam marcadores de células embrionárias

(Oct-4, Rex-1, SSEA-1) e quando implantadas no blastocisto foram capazes de gerar

todos os tipos celulares (JIANG et al., 2002). Foi demonstrado, ainda, que as MAPC

também possuem capacidade de reconstituição de longa duração do sistema

hematopoiético (SERAFINI et al., 2007), característica anteriormente atribuída

somente às células-tronco hematopoiéticas (HSC, Hematopoietic Stem Cell)

(WEISSMAN, 2000). Porém, esses trabalhos vêm sendo de difícil reprodução pela

comunidade científica (CHECK, 2007).

As células-tronco embrionárias representam uma importante ferramenta de

estudo do desenvolvimento em diversos tecidos (HIRASHIMA et al., 1999; KEHAT et

al., 2001). Muitos sistemas de diferenciação in vitro têm sido desenvolvidos para as

células-tronco embrionárias murinas, incluindo métodos reprodutíveis de diferenciação

em precursores hematopoiéticos e neurais, cardiomiócitos, células secretoras de

insulina, células endoteliais e vários outros tipos celulares (AMIT & ITSKOVITZ-

ELDOR, 2002).

2

A habilidade das células-tronco pluripotentes de dar origem a um enorme

repertório de células diferenciadas é a razão pela qual elas podem vir a ser úteis em

protocolos de terapias celulares (DONOVAN & GEARHART, 2001). Muitos esforços

têm sido feitos na derivação de novas linhagens de células-tronco embrionárias

humanas (LEVENSTEIN et al., 2006), mas devido a problemas éticos, ao potencial

oncogênico e a rejeição pelo hospedeiro, outras fontes para o uso em terapias

celulares têm sido pesquisadas (WANG et al., 2000).

1.1.b. Potencial de diferenciação das células – tronco no organismo adulto

As células-tronco adultas estão presentes em praticamente todos os tecidos de

animais adultos e contribuem para os processos de reparo e da homeostasia tecidual.

Tais células podem ser multipotentes, gerando várias linhagens de células

diferenciadas, ou oligopotentes, gerando somente uma ou poucas linhagens. Em

tecidos adultos, a população de células-tronco é rara (GOODELL, 2001; KRAUSE,

2002). Estudos recentes (ver abaixo) surpreenderam a comunidade científica, ao

demonstrarem que células-tronco adultas podem adotar perfis de expressão e fenótipo

funcional de células de outros tecidos. Esta propriedade foi denominada plasticidade

(HERZOG et al., 2003).

A primeira evidência de plasticidade das células-tronco adultas veio de estudos

de transplantes de MO em modelos humanos e animais, em que foi possível distinguir

através de diferentes métodos, entre as células do doador e as do recipiente

(GOODELL, 2001). A análise de diferentes órgãos revelou a presença de células

derivadas do doador em tecidos não-hematopoiéticos, incluindo tecidos epiteliais

(KRAUSE et al., 2001), coração (QUAINI et al., 2002), trato gastrointestinal

(OKAMOTO et al., 2002) e músculo esquelético, onde permaneceram enxertadas por

uma década na medula e músculo esquelético do hospedeiro (GUSSONI et al., 2002).

Diversos mecanismos podem ser especulados para a plasticidade de células-

tronco derivadas da MO (Fig. 1): (1) Células-tronco não comprometidas com a

linhagem hematopoiética poderiam se diferenciar nos diversos tipos celulares; (2)

células-tronco já comprometidas poderiam assumir novos fenótipos pelo mecanismo

de transdiferenciação que pode ser direto; (3) ou indireto, onde primeiro a célula-

tronco já comprometida deve passar pelo processo de desdiferenciação; (4) e por

último, as células-tronco poderiam fusionar com as células do tecido residente,

assumindo assim, o novo fenótipo (HERZOG et al., 2003).

Em todos estes casos, o nicho tem papel decisivo no novo comprometimento

dessas células. As células-tronco são capazes de responder a estímulos externos,

3

como por exemplo, ligação a proteínas da matriz específicas para cada tipo de tecido,

que levam ao desencadeamento de diversas vias, que por sua vez poderiam levar a

diferenciação, proliferação ou quiescência (SPRADLING et al., 2001). Além da

composição protéica, a elasticidade da matriz também pode regular as vias de

diferenciação das células-tronco. Foi demonstrado que células-tronco mesenquimais

do estroma da medula quando cultivadas sobre matrizes mais resistentes e pouco

elásticas diferenciam-se para a linhagem osteogênica, enquanto o contato com

matrizes mais flexíveis e maleáveis favorece a diferenciação para a linhagem

neurogênica (ENGLER et al., 2006). Este fenômeno pode estar associado a

modificações da forma celular e do citoesqueleto, como veremos adiante.

Figura 1. Possíveis mecanismos de plasticidade das células-tronco em resposta ao nicho. Fonte: HERZOG et al., 2003.

Vários ensaios in vivo de regeneração tecidual em modelos animais após

trauma ou lesão induzida, obtiveram resultados ambíguos em relação à plasticidade

das células-tronco de MO. Esta discordância de resultados pode ser devida a

problemas técnicos, uma vez que um conjunto de análises e controles experimentais

apropriados são necessários para melhor avaliar os resultados (GROVE et al., 2004).

Ensaios clínicos em protocolos de medicina regenerativa, principalmente na

área de cardiologia, relataram o efeito benéfico das células-tronco de MO na fisiologia

tecidual. Esse efeito pode ter sido alcançado, a exemplo do descrito anteriormente,

através da secreção de fatores, como por exemplo, fatores pró-angiogênicos,

estimulando assim a regeneração tecidual de forma indireta, ou por mecanismos de

diferenciação, transdiferenciação ou fusão celular. Nenhum desses mecanismos foi

comprovado de maneira irrefutável e a proposta mais provável seria que a

regeneração tecidual se daria por uma combinação destes (DIMMELER et al., 2005).

4

1.2. MEDULA ÓSSEA 1.2.a. Microambiente medular

Na MO residem ao menos dois tipos de células-tronco: as HSCs e as células-

tronco mesenquimais (MSC, Mesenchymal Stem Cell); estes dois tipos celulares co-

existem funcional e espacialmente. In vivo, as células hematopoiéticas são

continuamente formadas enquanto as células estromais são mais quiescentes e estão

ligadas à matriz extracelular, formando estruturas complexas, multicelulares (Fig.2)

(BIANCO & ROBEY, 2000).

Figura 2. Estrutura do nicho. (A) Células-tronco quiescentes são estocadas em contato com células do estroma (em azul) responsáveis por sua manutenção. (B) Quando estas células-tronco entram em contato com outros tipos de células estromais (em verde) os mecanismos de diferenciação e/ou auto-renovação são acionados. Adaptado de Wilson & Trumpp 2006.

As células estromais são tanto de origem mesenquimal como hematopoiética e

incluem osteoblastos, células reticulares ou adventiciais, células acumuladoras de

gordura, miofibroblastos, células endoteliais, células musculares lisas da parede

vascular, células dendríticas e macrófagos (BIANCO et al., 2001; VERFAILLIE, 2000).

A primera evidência de um papel importante das células estromais na sustentação da

hematopoese veio da observação de FRIEDENSTEIN et al. (1966), que através do

transplante de células estromais na cápsula renal, mostraram a formação de ossículos

com células hematopoiéticas derivadas do hospedeiro.

5

Dentro da população de células estromais estão as MSCs, que são capazes

de auto-renovação, bem como de diferenciação em muitos tecidos derivados do

mesênquima. As características comuns entre as células referidas por diferentes

pesquisadores como MSC é que elas crescem em cultura como células aderentes e

possuem capacidade de diferenciação assim como as HSCs (KRAUSE, 2002). Um

dos principais mecanismos pelo qual as MSCs regulam a hematopoiese é pela

produção de citocinas, mas não está claro se MSCs de diferentes fontes possuem

perfis de citocinas específicos na regulação de proliferação e diferenciação das células

hematopoiéticas (DAZZI et al., 2006). Acreditava-se que a hierarquia do componente estromal fosse como a do

sistema hematopoiético, rígida, ou seja, o comprometimento das células precursoras

parecia ser progressivo e irreversível. Porém, modelos mais recentes de plasticidade,

sugerem que as MSCs, uma vez que tenham se transformado em células

acumuladoras de gordura, podem reverter o seu fenótipo para um estroma de

sustentação de hematopoiese dependendo das condições fisiológicas do organismo

(BIANCO & ROBEY, 2000).

Durante o desenvolvimento embrionário, o estabelecimento da hematopoese

definitiva está ligado às células endoteliais na aorta dorsal (PIETILÄ & VAINIO, 2005).

A chegada das HSCs ocorre somente depois do desenvolvimento de estruturas

específicas organizadas pelas células vasculares (CHARBORD et al., 1996). Após a

sua formação, as células estromais ainda são responsáveis por prover a maioria dos

fatores requeridos para o ordenado desenvolvimento das células progenitoras

hematopoiéticas (VERFAILLIE, 2000).

A caracterização do papel do microambiente da MO no processo

hematopoiético tornou-se possível com o estabelecimento de culturas dependentes de

estroma, inicialmente desenvolvidas por DEXTER et al. (1985), também nomeadas de

culturas de longa duração de MO (LTBMC, long-term bone marrow culture). Quando a

MO é examinada a partir de aspirados ou biópsia, células hematopoiéticas em

diferentes estágios de diferenciação podem ser encontradas em áreas distintas do

espaço medular (QUESENBERRY et al., 1994). O microambiente hematopoiético

produz e concentra citocinas hematopoiéticas que podem induzir ou inibir a

proliferação e diferenciação de células progenitoras (VERFAILLIE, 2000). As células

hematopoiéticas ao longo do seu comprometimento em células diferenciadas se

encaminham para a parte mais central da MO, caindo nos sinusóides e alcançando a

corrente sanguínea (CHARBORD et al., 1996).

A localização diferenciada dos progenitores hematopoiéticos na MO tem levado

ao conceito de um nicho específico para as HSCs. Por exemplo, as células mais

6

precursoras podem ser encontradas na região subendosteal em proximidade com os

osteoblastos (Fig. 3) (QUESENBERRY et al., 1994). O contato de células primitivas

com um microambiente de sustentação de células-tronco aumenta as divisões

assimétricas de progenitores, tanto primitivos como comprometidos (PUNZEL et al.,

2003).

Dois estudos recentes comprovaram que as células osteoblásticas

representam um componente regulatório do microambiente da MO (Fig. 2). As células

osteoblásticas funcionam como um componente chave na organização dos nichos de

HSC, regulando o tamanho da população de HSC (CALVI et al., 2003; ZHANG et al.,

2003). Na presença de osteoblastos, a maioria dos progenitores hematopoiéticos se

mantém em um estágio imaturo (BALDUÍNO et al., 2005; TAICHMAN et al., 2005).

Além disso, na MO a expressão de osteopontina, uma molécula associada à

manutenção do fenótipo imaturo das células hematopoiéticas, é restrita à superfície

endosteal do osso e as células hematopoiéticas primitivas demonstram adesão

específica a esta proteína (NILSSON et al., 2005). Porém, o nicho subendosteal não é

o único para as HSCs. Estas células também interagem com as células endoteliais dos

sinusóides da MO e de sítios extramedulares. As células endoteliais expressam

fatores que regulam a manutenção e função das HSCs (KIEL et al., 2005), embora

existam evidências de diferenças importantes entre os dois possíveis nichos de HSC

na capacidade de manutenção desta população (HAYLOCK et al., 2007).

Figura 3. Microambiente da MO. Fonte: Dazzi et al., 2006.

7

1.2.b. Hemopoietinas, quimiocinas e matriz extracelular

Desenvolvimento, homeostasia, circulação e capacidade de resposta do

sistema hematopoiético são altamente regulados por uma rede complexa de

comunicações que é mediada por sinais intracelulares. Estes sinais são

desencadeados por contato direto célula-célula ou célula-matriz ou ainda pela

liberação de citocinas solúveis (KURZROCK, 2000). Dentre as vias de sinalização

responsáveis pela manutenção da capacidade tronco do sistema hematopoiético, as

proteínas da via de Wnt (VAN DEN BERG et al., 1998), assim como a via de notch

com o seu ligante delta-1 são potencialmente importantes, tanto na expansão dos

progenitores mielóides como dos linfóides (OHISHI et al., 2002). O papel de Wnt na

hematopoiese foi mais bem descrito pela purificação da proteína Wnt3a, a qual induz a

auto-renovação das HSCs (WILLERT et al., 2003).

Muitos destes fatores de crescimento hematopoiético são produzidos pelas

células estromais da MO, as quais residem em proximidade com os precursores

hematopoiéticos (KURZROCK, 2000). Em geral, dois ou mais tipos de citocinas são

necessárias para cada linhagem hematopoética completar seu potencial de

desenvolvimento (WEISSMAN, 2000). As células estromais produzem fatores de

crescimento a partir da adesão de progenitores. Esta adesão pode ocorrer através da

expressão de ligantes na superfície da célula, tais como a molécula de adesão celular

vascular (VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1), com a expressão na superfície

celular de fatores de crescimento, como, por exemplo, fator de crescimento de células

tronco (SCF, stem cell factor), ou por componentes da matriz extracelular, secretados

pelas células de estroma (KOVACH et al., 1995). Em culturas de MO de longa

duração, colágeno, fibronectina e laminina são secretados inicialmente, e a deposição

extracelular destas proteínas coincide com uma hematopoiese ativa (ABBOUD &

LICHTMAN, 2001).

Os osteoblastos humanos expressam várias moléculas conhecidamente

capazes de modular a hematopoiese, como o fator de estimulação de granulócitos (G-

CSF-granulocyte colony-stimulating factor), o fator de estimulação de granulócitos e de

macrófagos (GM-CSF-granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), o fator de

estimulação de macrófagos (M-CSF-macrophage colony-stimulating factor), a

interleucina 1beta (IL-1β-interleukin-1beta), a interleucina 6 (IL-6-interleukin-6), a

interleucina 7 (IL-7-Interleukin-7), o fator inibitório de leucemia (LIF-leukemia inhibitory

factor), a osteoprotegerina (OPG-osteoprotegerin), o receptor ativador do ligante do

fator nuclear kappa B (RANKL-receptor activator of nuclear factor kappa B ligand), o

fator derivado de estroma (SDF-1α-stromal derived factor- 1alpha), o fator de necrose

8

tumoral alpha (TNF-α-Tumor necrosis factor-alpha) e o fator de crescimento vascular

endotelial (VEGF-vascular endothelial growth factor) (GREENFIELD et al., 1996;

TAICHMAN & EMERSON, 1998; HOLFBAUER et al., 2000; PONOMARYOV et al.,

2000). A quimiocina SDF-1α é particularmente importante na interação HSC-

osteoblasto, além de ser responsável pela retenção dos progenitores hematopoéticos

na medula (HAMADA et al., 1998; WANG et al., 1998; PELED et al., 1999).

A célula acumuladora de gordura é a célula estromal mais abundante na MO

adulta, onde o seu verdadeiro papel ainda gera controvérsias. Existem algumas

hipóteses para sua função: (1) As células acumuladoras de gordura possuem um

papel passivo, ocupando o excesso de espaço na cavidade medular (GIMBLE et al.,

1996); (2) podem possuir um papel ativo no metabolismo lipídico sistêmico; (3) são

responsáveis por prover um reservatório energético localizado na MO (YOKOTA et al.,

2002); e (4) podem contribuir diretamente na promoção da hematopoiese e influenciar

a osteogênese (GIMBLE et al., 1996).

Uma das principais proteínas secretada pelas células acumuladoras de gordura

é a leptina, que promove a formação de osteoblastos e hematopoiese, ao mesmo

tempo em que inibe a adipogênese (UMEMOTO et al., 1997; LAHARRAGUE et al.,

1998; THOMAS et al., 1999). Outras proteínas produzidas por essas células, com

papel ativo na hematopoiese, são as adiponectinas (DIMASCIO et al., 2007), responsáveis por bloquear a mielopoiese em ensaios clonais de precursores de

células hematopoiéticas (LAHARRAGUE et al., 2000; YOKOTA et al., 2000).

Adicionalmente, foi descrito que as HSC expressam duas classes de receptores para a

proteína adiponectina e a ligação destes promove a proliferação das HSC, avaliado

por ensaios in vitro e in vivo (DIMASCIO et al., 2007).

A diferenciação para a via adipogênica se acompanha de redução da

expressão constitutiva de M-CSF, SCF, IL-6, LIF, osteopontina e osteocalcina

(UMEZAWA et al., 1991; GIMBLE et al., 1992; DORHEIN et al., 1993), e o seu

potencial de sustentação hematopoiética pode estar relacionado com a diferenciação

para as linhagens mieloíde e linfóide (células B) de progenitores hematopoiéticos

CD34+ (CORRE et al., 2004).

Curiosamente, células fibroblastóides derivadas de órgãos não hematopoéticos

liberam frequentemente os mesmos tipos de citocinas, mas não são capazes de

manter a hematopoiese, sugerindo que as células fibroblastóides derivadas de órgãos

hematopoéticos podem expressar moléculas importantes para a hematopoese que

ainda não foram descritas (VERFAILLIE, 2000). Por exemplo, fibroblastos da derme

não expressam VCAM-1 (CD106), e isto é responsável pela incapacidade destes

fibroblastos de manter a hematopoese de células B (Burger et al., 2001).

9

1.2.c. Células-tronco hematopoiéticas

Todos os tipos de células sanguíneas derivam de um precursor comum, a

HSC. Estas células são definidas como as únicas células capazes de reconstituição de

longo prazo de todo o sistema hematopoiético, após uma irradiação letal (BONIFER et

al., 1998). A reconstituição de longo prazo de hospedeiros irradiados e os posteriores

transplantes para hospedeiros secundários representam os principais critérios para a

demonstração das propriedades das HSC; que são a auto-renovação e a

diferenciação para as diferentes linhagens do sangue (KRAUSE et al., 2001). No

sangue circulante existe uma pequena proporção destas células (tronco e

progenitoras), que podem ser isoladas por técnicas especiais (QUESENBERRY &

COLVIN, 2001).

TILL & MCCULLOUGH (1961) comprovaram a existência das HSCs através de

um ensaio in vivo de colônias capaz de identificar células-tronco multipotentes, a

unidade formadora de colônias do baço (CFU-S-colony unit formation of spleen).

Posteriormente, foram descritos ensaios de colônia in vitro para células progenitoras

hematopoiéticas (BRADLEY & METCALF, 1966), como a unidade formadora de

colônias de granulócitos e de macrófagos (CFU-GM-colony unit formation of

granulocytes and macrophages). Os ensaios clonogênicos levaram à descrição de

moléculas que inibiam ou estimulavam o crescimento de células hematopoiéticas

(PLUZNIK & SACHS, 1965). Outro ensaio in vitro, denominado de célula iniciadora de

culturas de longo prazo (LTC-IC-Long Term Culture-Initianting Cell), baseado nas

culturas de longa duração desenvolvidas por Dexter et al., (1965) e que se baseia na

capacidade de manter a produção de células hematopoiéticas por longos períodos,

permitiu caracterizar a população de HSC humana (CROISILLE et al., 1994). O

desenvolvimento destas técnicas levou ao desenho de um modelo hierárquico para o

sistema hematopoiético, onde as HSC de reconstituição de longo prazo dão origem a

HSC de reconstituição de curto prazo, que por sua vez dão origem a progenitores

multipotentes, os quais irão gerar progenitores comprometidos com linhagens únicas

(Fig. 4) (REYA et al., 2001). A diferenciação dos progenitores hematopoiéticos é regulada por fatores de

transcrição; não apenas pela ausência ou expressão do fator, mas em alguns casos

pela baixa ou alta expressão do mesmo, como o que ocorre com o fator de trancrição

hematopoiético - PU.1, que, em baixas concentrações induz a diferenciação de

progenitores jovens para linfócitos B e em altas concentrações para macrófagos

(DEKOTER & SINGH, 2000).

10

1.2.d. Células-tronco mesenquimais No estroma da MO existe uma subpopulação de células não-hematopoiéticas

que foram denominadas - MSCs ou células-tronco estromais. Estas células podem ser

expandidas ex vivo e induzidas tanto in vitro como in vivo, para fenótipos

terminalmente diferenciados que incluem osteoblastos, condrócitos, adipócitos,

tenócitos (células do tendão), células musculares e para um estroma sustentador de

hematopoiese (MINGUELL et al., 2001). Ainda não há um consenso entre os

pesquisadores sobre a definição da MSC ou sobre como elas devem ser isoladas e

expandidas in vitro. Além disso, diferentemente das HSCs, nenhum perfil específico de

expressão de marcadores de superfície capazes de identificar em definitivo tal célula

foi descrito (HERZOG et al., 2003).

Figura 4. As HSC podem ser subdivididas em células de auto-renovação de longo prazo, de curto-prazo e em progenitores multipotentes (as setas vermelhas indicam a auto-renovação). Os progenitores multipotentes dão origem a progenitores linfóides e a progenitores mielóides. Fonte: Reya et al., 2001. As células-tronco estromais da MO foram primeiramente isoladas e

caracterizadas através dos trabalhos de FRIEDENSTEIN et al. (1966 e 1968). Eles

caracterizaram essas células como aderentes, clonogênicas, não-fagocíticas, com

morfologia fibroblastóide, definida como a unidade formadora de colônias

fibroblastóides (CFU-F-colony forming units fibroblastic). Essas colônias

fibroblastóides, sob condições experimentais apropriadas dão origem a um grande

espectro de células diferenciadas de tecidos conjuntivos (FRIEDENSTEIN et al.,

1974).

11

Figura 5. Durante o desenvolvimento na medula óssea, as MSCs se tornam comprometidas com a linhagem osteogênica sob influência do fator de transcrição CBFA-1, de modo que as células adquirem um fenótipo de osteoblastos. Quando há formação óssea, estas células se diferenciam em um estroma medular primitivo de sustentação da hematopoese. Na vida pós-natal as MSCs se diferenciam em células acumuladoras de gordura, podendo reverter seu fenótipo para ambos os tipos celulares de acordo com a necessidade do organismo. Fonte: Bianco & Robey, 2000.

Uma única colônia de CFU-F gera ossículos idênticos aos gerados por

linhagens estromais não-clonais, as quais provavelmente representam células de

fenótipos múltiplos e diferenciados. Porém CFU-Fs são heterogêneos em relação à

capacidade osteogênica. Nesse estudo, em torno de 50% das colônias demonstraram

potencial osteogênico, onde algumas desenvolveram osso e tecido hematopoiético,

outras desenvolveram somente osso sem hematopoiese, e até nenhum osso, avaliado

por ensaios in vivo (KUZNETSOV et al., 1997). Baseado na diversidade de clones de

CFU-F, foi desenvolvido o conceito de que cartilagem, osso, e outros tecidos

conjuntivos derivam de um ancestral comum, a célula-tronco estromal ou MSC. Essas

células-tronco permanecem no organismo pós-natal e residem no organismo adulto

(Fig. 5) (BIANCO & ROBEY, 2000). No entanto, só recentemente, a propriedade de

auto-renovação, uma característica de células-tronco, das MSC de MO foi

demonstrada. SACHETTI et al. (2007) demonstraram que células da MO humana,

isoladas de CFU-F e que expressam CD146, um marcador característico de células

perivasculares, têm propriedade de auto-renovação e multipotencialidade.

12

1.3. TECIDO ADIPOSO (TA)

Na maioria dos mamíferos, estão presentes dois tipos de tecido adiposo:

marrom (TAM) e branco (TAB). Os dois tecidos possuem papel ativo na regulação da

homeostase energética através do metabolismo (HAHN & NOVAK, 1975) e da

liberação de várias moléculas bioativas, chamadas de adipocinas (TRAYHURN, 2005).

Particularmente em humanos, o único tipo de TA que persiste ao longo da vida pós-

embrionária é o TAB. Este ainda pode ser dividido em dois tipos: subcutâneo e

visceral (WAJCHENBERG et al., 2000). As diferentes localizações do TAB também

correspondem a diferentes propriedades metabólicas e funções, o que representa um

importante foco no mundo científico atual (PRUNET-MARCASSUS et al., 2006). O

TAB visceral participa da patogênese de desordens metabólicas (WAJCHENBERG et

al., 2000) enquanto que no subcutâneo foi demonstrada a presença de células com

múltiplo potencial de diferenciação (ZUK et al., 2001; BAPTISTA et al., 2007).

O desenvolvimento do TAB em humanos tem início no segundo terço do

período gestacional com a agregação de uma densa massa de células mesenquimais

indiferenciadas, orquestrada com o início da organização vascular. As células desses

agregados diferenciam para células adiposas primitivas, adjacentes a capilares

(HAUSMAN & RICHARDSON, 2004). Estágios mais avançados do desenvolvimento

do TAB estão relacionados ao crescimento dos agregados e a maturação das células

adiposas. Assim como a medula óssea, o TAB é um derivado do mesoderma

embrionário e gera, quando colocado em cultura, uma fração celular aderente, um

estroma (AILHAUD et al., 1992).

A fração estromal do TAB é constituída de pré-adipócitos, células endoteliais,

macrófagos e fibroblastos (CASTEILLA et al., 2004). Existem diversas evidências de

relações parácrinas e/ou autócrinas entre as células endoteliais e os pré-adipócitos

(HAUSMAN & RICHARDSON, 2004). Os pré-adipócitos progressivamente acumulam

lipídios e adquirirem características de adipócitos maduros (AILHAUD et al., 1992).

Esse tipo celular, pré-adipócito, é pouco caracterizado, não existindo nenhum

marcador antigênico específico, por isso sua localização no TAB ainda é desconhecida

(CASTEILLA et al., 2004). 1.3.a. Tecido Adiposo como um órgão endócrino

O conceito do TAB como um órgão endócrino é recente e talvez a simplicidade

aparente deste tecido (constituído de adipócitos em sua maioria) tenha sido o principal

motivo para que muitos pesquisadores o tenham tido somente como um local de

13

reserva, síntese e quebra de lipídios (HAHN & NOVAK, 1975; TRAYHURN, 2005). O

TAB é responsável pela secreção de inúmeros fatores envolvidos em processos

fisiológicos e metabólitos – as adipocinas. Estes fatores possuem um papel relevante

nas patologias associadas à obesidade (FRÜHBECK et al., 2001; RAJALA &

SCHERER, 2003). As adipocinas incluem citocinas clássicas (TNF-α e IL-6), fatores

de crescimento tais como o fator de crescimento transformador beta (TGF-β -

transforming growth factor-beta), o hormônio leptina, proteínas envolvidas na

homeostase vascular (ativador do inibidor do plasminogênio-1), na regulação da

pressão sanguínea (angiotensinogênio), metabolismo lipídico (proteína ligada a retinol)

e na homeostase de glicose (adiponectina), além de fatores angiogênicos (VEGF).

Desta forma, se torna evidente que o TAB é um órgão secretório complexo integrado

com outros tecidos tais como cérebro, músculo esquelético (TRAYHURN, 2005), osso

e o sistema vascular (KOSHIYAMA et al., 2006).

Estas características fazem do TAB um excelente cenário para eventos

inflamatórios. Durante o desenvolvimento da obesidade, além de ocorrer hiperplasia e

hipertrofia de células adipóciticas (LEHRKE & LAZAR, 2004), mudanças inflamatórias

são geradas pelos adipócitos, células endoteliais e os pré-adipócitos (WELLEN &

HOTAMISLIGIL, 2003). A secreção de adipocinas irá levar a um quadro de inflamação

crônica (LEHRKE & LAZAR, 2004), que é agravado pela infiltração macrofágica (Fig.

6) (WEISBERG et al., 2003; XU et al., 2003).

Figura 6. O tecido adiposo obeso é caracterizado pela inflamação e progressiva infiltração por macrófagos concomitante ao desenvolvimento da obesidade. Mudanças no tamanho do adipócito e gordura leva a mudanças físicas na área adjacente e modificações da função parácrina do adipócito, células endoteliais e pré-adipócitos. Fonte: Wellen & Hotamisligil, 2003.

14

As MSCs que geram os pré-adipócitos no TAB participam de todas as etapas

do processo de obesidade, seja de maneira direta, pelo acúmulo lípidico

intracitoplasmático (LEHRKE & LAZAR, 2004) e pela transdiferenciação em

macrófagos (CHARRIÈRE et al., 2003), ou de maneira indireta, através da secreção

de adipocinas, que além de estimular a angiogênese e a adipogênese no TAB (ZHOU

et al., 2007) estimulam a infiltração monocítica (CURAT et al., 2004) e macrofágica

(ZHOU et al., 2007).

1.3.b. MSC de Tecido Adiposo

Estudos recentes demonstraram que no TA subcutâneo assim como na MO,

residem células progenitoras mesodermais multipotentes (ZUK et al., 2001), sendo

assim, excelentes candidatas para protocolos de medicina regenerativa de osso,

cartilagem, distrofias musculares e reconstrução de tecidos moles (SCHÄFFLER &

BÜCHLER, 2007). Esses progenitores multipotentes estão presentes em praticamente

todos os órgãos do organismo adulto (DA SILVA MEIRELLES et al., 2006) e, por isso,

podem ser a razão da integração do TAB com os outros órgãos (KOSHIYAMA et al.,

2006). Fatores transcricionais expressos por estas células, como o receptor

peroxissomo de ativação de proliferação (PPARγ-peroxisome proliferator-activated

receptor-gamma) e CBFA-1, regulam a sua diferenciação para as vias adipogênica e

osteogênica, respectivamente, podendo desta forma estar envolvidos em patologias

(osteoporose e obesidade visceral) em que esse balanço é rompido (NUTTALL &

GIMBLE, 2004; KOSHIYAMA et al., 2006). O procedimento cirúrgico simples, o fácil e repetitivo acesso ao TA subcutâneo

assim como a baixa complexidade dos procedimentos enzimáticos de isolamento

fazem desta fonte de MSC a mais atrativa para pesquisadores e clínicos (CASTEILLA

et al., 2005). O ponto crítico é a ausência de uma caracterização tanto molecular como

celular das células-tronco multipotentes dentro do estroma do TA e apesar de terem

surgido muitos trabalhos visando alcançar esse objetivo, ainda não há um consenso

sobre a verdadeira identidade das MSC do TA (SCHÄFFLER & BÜCHLER, 2007).

Muitos pesquisadores acreditam que essas células são bastante semelhantes às MSC

de MO (ZUK et al., 2001; WAGNER et al., 2005; IZADPANAH et al., 2006; KERN et

al., 2006), e alguns acreditam em suas propriedades únicas, principalmente em

relação ao potencial adipogênico (CASTEILLA et al., 2004; LIU et al., 2007; BAPTISTA

et al., 2007).

CASTEILLA et al. (2004) defendem a hipótese de que as MSC do TA são na

verdade pré-adipócitos plásticos. Esses pré-adipócitos poderiam assumir fenótipos de

15

osso, cartilagem, músculo esquelético (ZUK et al., 2001) e até de células estromais

capazes de sustentar a hematopoese in vitro (CORRE et al., 2006; BAPTISTA et al.,

2007), características marcantes de progenitores estromais da MO (BIANCO &

ROBEY, 2000). O verdadeiro papel dos pré-adipócitos na homeostase do TA seria o

comprometimento e posterior diferenciação tanto em células endoteliais como em

adipócitos (Fig. 7) (PLANAT-BENARD et al., 2004a), ambos os tipos celulares

necessários no processo de desenvolvimento da obesidade (WELLEN &

HOTAMISLIGIL, 2003). Alguns trabalhos também demonstram a diferenciação desses

pré-adipócitos em macrófagos (COUSIN et al., 1999; CHARRIÈRE et al., 2003;

SCHÄFFLER et al., 2007), o que não é surpreendente já que o próprio pré-adipócito

possui características macrofágicas (CASTEILLA et al., 2004) e expressam

constitutivamente receptores toll-like, que desempenham um papel crucial na

imunidade (SCHÄFFLER et al., 2007). Essa possível transdiferenciação aumentaria o

quadro inflamatório estabelecido na obesidade (COUSIN et al., 2001).

Figura 7. Plasticidade das linhagens de células adipocíticas em células endoteliais. Progenitores adipocíticos possuem a habilidade de se diferenciar em adipócitos e também de adquirir um fenótipo endotelial funcional. Adipócitos maduros podem se de-diferenciar e reverter para um fenótipo bi-potente. A identificação de vias que regulam esses processos poderia levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o controle do desenvolvimento do tecido adiposo e para angiogênese terapêutica. Fonte: Planat-Benard et al., 2004.

16

1.4. ONTOGENIA DAS MSC 1.4.a. Pericitos

O estroma medular primitivo é estabelecido no desenvolvimento através de

uma série de eventos complexos que se iniciam com a diferenciação de células

osteogênicas primitivas que irão formar rudimentos ósseos, estes rudimentos são

posteriormente invadidos por vasos sanguíneos (CHARBORD et al., 1996). No

organismo pós-natal, a rede vascular medular, assim como no sistema circulatório de

outros órgãos, é delimitada por uma camada contínua de células endoteliais e pericitos

subendoteliais. As células estromais da MO, com características de MSC, residem na

orientação abluminal dos sinusóides e podem ser classificadas como pericitos

especializados (BIANCO et al., 2001; SACCHETTI et al., 2007). O nicho perivascular

também foi descrito especificamente em MSC de polpa dentária e de tecido adiposo

(SHI & GRONTHOS, 2003; ZANNETTINO et al., 2008) e, em praticamente todos os

órgãos no organismo adulto (SILVA MEIRELLES et al., 2006; ZENGIN et al., 2006),

podendo ser prontamente mobilizados em casos de lesão tecidual (SILVA

MEIRELLES et al., 2006; LAMAGNA et al., 2006). Porém sua função melhor descrita

na literatura é a estabilização mecânica de microvasos. Através da emissão de

prolongamentos citoplasmáticos, os pericitos estabelecem contatos focais com as

células endoteliais (VON TELL et al., 2006).

Os pericitos isolados da microvasculatura da retina bovina retêm um fenótipo

de célula-tronco multipotente para as linhagens osteogênica (SCHOR et al., 1990),

condrogênica e adipogênica (FARRINGTON-ROCK et al., 2004) e também para um

estroma sustentador de hematopoese (TINTUT et al., 2003). Outra característica

comum entre as células-tronco estromais da MO e os pericitos é a positividade para

fosfatase-alcalina e para alpha actina de músculo liso (α-SMA-alpha smooth muscle

actin) (BIANCO et al., 2001); apesar da expressão deste último marcador ser

heterogênea nos diversos tecidos (NEHLS et al., 1991).

1.4.b. Hemangioblastos e células do somito

Um dos primeiros passos durante o desenvolvimento vascular é a

diferenciação de células-tronco pluripotentes em células endoteliais. Os fatores de

transcrição específicos que medeiam esses eventos ainda não foram identificados,

mas a expressão de marcadores específicos para as células endoteliais tais como

CD31 ou molécula de adesão celular endotélio plaquetas-1 (PECAM-1 - platelet

endothelial cell adhesion molecule-1) é determinante para o início do processo

17

(OETTGEN, 2001). As células endoteliais se diferenciam dos angioblastos no embrião,

mas também dividem uma origem comum com as células hematopoiéticas (Fig. 8)

(CARMELIET, 2003).

Experimentos de transplante de células de codorna para pintos demonstraram

que as células endoteliais embrionárias se originam de duas linhagens mesodermais.

Uma do mesoderma da esplancnopleura, que também exibe um potencial

hematopoiético e dá origem à rede endotelial dos órgãos viscerais; e a outra dos

somitos, que é puramente endotelial e dá origem a vasculatura das paredes do corpo

(PARDANAUD et al., 1996).

A possível existência de um progenitor comum para as linhagens endoteliais e

hematopoiéticas, o hemangioblasto, foi originalmente sugerida por causa da íntima

associação das células hematopoiéticas com as células endoteliais nas chamadas

“blood islands” (ilhotas sanguíneas) do embrião em desenvolvimento (PIETILÄ &

VAINIO, 2005). Essas ilhotas sanguíneas derivam de agregados de células

mesodermais que colonizam o saco vitelino aproximadamente sete dias pós-

fecundação. As células do centro desses agregados dão origem a células

hematopoiéticas embrionárias enquanto a população periférica se diferencia em

células endoteliais, formando a primeira estrutura vascular (WAGNER, 1980).

Figura 8. Formação da rede vascular. Os progenitores endoteliais se diferenciam em células endoteliais arteriais e venosas, formando um capilar primitivo. Os vasos emitem brotamentos e são estabilizados pelos pericitos, que se diferenciam dos seus próprios progenitores. HSCs contribuem para a angiogênese indiretamente pela diferenciação para leucócitos ou plaquetas. Flk-1, Vascular endothelial growth factor receptor 2; Tie-2, Angiopoietin-1 receptor; Ang-1 ou 2, Angiopoietinas; Shh, Sonic hedgehog; Grdl, Gridlock; Mφ, macrófago. Fonte: Carmeliet, 2003.

18

A existência do hemangioblasto ganhou maior suporte a partir de observações

de que as linhagens hematopoiéticas e endoteliais compartilham a expressão de

alguns genes (ASAHARA et al., 1997). Posteriormente essa célula foi identificada em

estudos in vitro a partir de células-tronco embrionárias (CHOI et al., 1998) e também

no organismo pós-natal, pela expressão dos marcadores de superfície CD34 e do

receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (KDR-Vascular endothelial

growth factor receptor 2) (PELOSI et al., 2002). A hematopoiese gerada pelo saco vitelino, um sítio extra-embrionário, não é

definitiva e sim transitória. HSCs derivadas do saco vitelino não são capazes de

repopular a MO adulta (PIETILÄ & VAINIO, 2005). A verdadeira fonte da

hematopoese definitiva no adulto é a região da aorta-gônada-mesonefros (AGM -

aorta-gonad-mesonephros), a qual em estágios mais anteriores do desenvolvimento é

representada pela esplancnopleura (MEDVINSKY & DZIERZAK, 1996; GODIN &

CUMANO, 2002). As HSCs depois de colonizar a AGM se localizam especificamente

adjacentes a camada endotelial da parede da aorta dorsal (DE BRUIJN et al., 2002) e

adquirem o potencial para repopular o fígado e a MO adulta (PIETILÄ & VAINIO,

2005). A origem das células endoteliais a partir dos somitos está relacionada com a

aorta da região da AGM, que é um dos primeiros vasos a se formar no embrião. Antes

da sua fusão, as células endoteliais que a compõem se originam da esplancnopleura.

Logo após a sua fusão, o teto da aorta começa a ser colonizado por células endoteliais

que se originam nos somitos enquanto as das paredes e do chão permanecem como

células endoteliais da esplancnopleura (POUGET et al., 2006). As da esplancnopleura,

como já mencionado, vão então gerar um sítio hematopoiético embrionário, onde as

células endoteliais perdem os seus marcadores e adquirem marcadores

hematopoiéticos (JAFFREDO et al., 1998). Quando a hematopoiese é completada, as

células endoteliais originárias dos somitos substituem as da esplancnopleura

(POUGET et al. , 2006).

A subseqüente maturação do vaso requer o recrutamento de células

mesenquimais ou pericitos e sua posterior diferenciação em células musculares lisas.

Isto ocorre através da liberação de fatores de crescimento específicos, sendo o

principal o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF-platelet-derived growth

factor) (OETTGEN, 2001). Ainda não está comprovada a origem dessas células

perivasculares. Uma das hipóteses é que elas possam ter origem nos somitos, pois as

células recrutadas durante o desenvolvimento da aorta são α-SMA positivas (POUGET

et al., 2006).

19

1.4.c. Mesangioblasto

A noção de que as HSCs se originam de um local específico, constituída por

progenitores endoteliais da esplancnopleura (JAFFREDO et al., 1998), levam a

algumas hipóteses especulativas de que outros progenitores/células-tronco possam

ser gerados na mesma região (COSSU & BIANCO, 2003). Análises clonais de

rudimentos de órgãos explantados levam a uma identificação positiva, na aorta dorsal

embrionária, de uma população celular que expressa simultaneamente marcadores de

origem endotelial e miogênica e ainda são capazes de diferenciação miogênica in vitro

(DE ANGELIS et al., 1999).

Transplantes de células não cultivadas da aorta dorsal de codorna, no broto da

asa de embriões de galinha, demonstram a geração de músculo esquelético com as

células do doador. Além disso, células diferenciadas de diversos tecidos conjuntivos

também foram observadas nesses experimentos, levando a possibilidade de que

esses progenitores associados com a aorta dorsal não são somente miogênicos.

Quando esses progenitores foram co-cultivados in vitro com células hematopoiéticas

totais da MO, há uma expansão de células CD45+ (MINASI et al., 2002), o que revela

mais uma característica de progenitor mesenquimal (BIANCO & ROBEY, 2000). Esses

progenitores também foram encontrados em organismos pós-natal (COSSU &

BIANCO, 2003). As células progenitoras identificadas na região da aorta dorsal foram nomeadas

de “mesangiblastos”, nome escolhido para indicar um progenitor comum para os

derivados vasculares e extra-vasculares mesodermais (Fig. 9) (COSSU & BIANCO,

2003). Os clones de mesangioblastos recém isolados em cultura expressam diversos

marcadores endoteliais tais como Flk-1, CD34, VE (vascular–endothelial)-caderina

(MINASI et al., 2002). Mas, diferentemente do hemangioblasto, esses progenitores

não geram células hematopoiéticas (COSSU & BIANCO, 2003).

Curiosamente, os mesangioblastos expressam receptores da família do TGFβ

/BMP (bone morphogenetic protein) e se diferenciam de maneira eficiente em células

do músculo liso, em resposta a TGFβ, e em osteoblastos em resposta a BMP

(TAGLIAFICO et al., 2004). Esses dados se correlacionam com a grande proporção de

mesangioblastos recém-isolados que expressam α-SMA em níveis altos, característica

de células precursoras de músculo liso e pericitos (COSSU & BIANCO, 2003). Recentemente, também foram identificadas MSCs na região da AGM que

surgem de forma simultânea às HSCs (MENDES et al., 2005; DURAND et al., 2006).

Contudo, neste estágio de desenvolvimento, a presença das MSC é independente da

atividade das HSC. Elas aumentam numericamente durante o desenvolvimento até

20

encontrar um platô na MO adulta (MENDES et al., 2005). As MSCs da região da AGM

possuem diversos potenciais de diferenciação, tornando o microambiente altamente

complexo (DURAND et al., 2006). Por exemplo, progenitores osteogênicos e

condrogênicos estão ambos localizados na aorta dorsal, mesênquima e na região

urogenital, enquanto os progenitores adipogênicos estão presentes somente na região

urogenital (MENDES et al., 2005). Estes dados corroboram com alguns estudos que

demonstraram uma independência precoce na ontogenia da linhagem mesenquimal

adipogênica, quando comparada com as osteogênica e condrogênica (BANFI et al.,

2000).

Figura 9. Esquema que sugere uma possível origem do mesangioblasto. Influências ventralizantes do ambiente direcionam a um potencial hematopoiético nos angioblastos. Influências desconhecidas preservam um potencial para a diferenciação em linhagens mesodermais em outra população de angioblastos. Divisões assimétricas segregam a progênie hematopoiética do hemangioblasto na espaço luminal e a progênie de mesoangioblastos no subendotelial, espaço abluminal. Flk-1 – progenitor mesodermal; Tal-1(T-cell acute lymphocytic leukemia 1) – progenitores hematopoiéticos. Fonte: COSSU & BIANCO, 2003. 1.4.d. Células da Crista Neural

A crista neural produz células pluripotentes dotadas de propriedades

migratórias (LE DOUARIN et al., 2004). Essas células migram para a região da AGM

através de influências dorsalizantes e podem secretar sinais que influenciam o

desenvolvimento das HSCs (PIETILÄ & VAINIO, 2005). As células da crista neural

21

dão origem a neurônios, glia, melanócitos, células endócrinas e a diversos derivados

mesenquimais (LE DOUARIN et al., 2004).

A crista neural cefálica provê pericitos e células do músculo liso para todos os

vasos sanguíneos da face e do cérebro anterior (ETCHEVERS et al., 2001). O

mesênquima do mesoderma cefálico é o sítio de ondas sucessivas de determinação e

diferenciação celular. Células expressando Flk-1 se tornam as células endoteliais dos

vasos em desenvolvimento. Deste estágio em diante, elas se associam a células da

crista neural que se diferenciam em pericitos e em tecido muscular e conjuntivo da

face externa das paredes dos vasos (COULY et al., 1996).

Curiosamente, MSCs da polpa dentária exibem características fenótipicas

diferentes das de MO, remetendo ou a duas origens diferentes na ontogenia, ou a

especificações ditadas pelos diferentes microambientes (SHI & GRONTHOS, 2003).

Recentemente, também foi demonstrado que MSCs da MO e do maxilar/mandíbula,

do mesmo indivíduo, são diferentes quanto ao tipo de osso que elas formam após

transplantes in vivo (AKINTOYE et al., 2006). As MSCs da polpa dentária assim como

as do maxilar e mandíbula poderiam ter origem a partir de células da crista neural, e

as da MO a partir de progenitores mesodermais da região AGM (ROBEY & BIANCO,

2006).

1.5. MSC NO ORGANISMO ADULTO MSCs têm sido descritas por estarem presentes principalmente na MO

(PROCKOP, 1997), mas também têm sido isoladas de diferentes tecidos tais como o

TA (ZUK et al., 2001), na articulação sinovial (DE BARI et al., 2001), no músculo

esquelético (DELLAVALLE et al., 2007), na polpa dentária e no ligamento periodontal

(SHI & GRONTHOS, 2003), no maxilar e na mandíbula (AKINTOYE et al., 2006), na

placenta (KÖGLER et al., 2004), no couro cabeludo humano (SHIH et al., 2005) e em

baixo número no sangue de cordão umbilical (WANG et al., 2004) e no sangue

periférico (KUZNETSOV et al., 2001). Se as MSCs derivadas dessas diferentes fontes

representam fundamentalmente tipos celulares similares, ainda não está claro.

Também foi demonstrado que as MSCs podem residir em todos os tecidos do

organismo adulto (SILVA MEIRELLES et al., 2006). Todas as fontes de MSC possuem

similaridades e diferenças em relação à expressão de marcadores de superfície.

Porém, diferentemente das HSCs humanas que são definidas principalmente pela

expressão de CD34 (KRAUSE et al., 2001), ainda não há um marcador único que

defina a população de MSC. A característica fenótipica em comum das diferentes

fontes de MSC é a adesão ao plástico de cultura (JAVAZON et al., 2004).

22

1.5.a. Marcadores de superfície

Um dos primeiros marcadores descritos para a identificação de células

precursoras estromais foi o STRO-1 (SIMMONS & TOROK-STORB, 1991a), que por

outro lado é expresso por 5% da população de CFU-F positiva para CD34 (SIMMONS

& TOROK-STORB, 1991b). As diferentes populações STRO-1+ ou STRO-1- também

exibem características intrínsecas na sustentação da hematopoese (BENSIDHOUM et

al., 2004). Atualmente sua expressão ainda é reportada (GONÇALVES et al., 2006;

ZANNETTINO et al., 2008) ou não (COLTER et al., 2001; DE UGARTE et al., 2003) em MSC, sendo variável também para diferentes fontes (GRONTHOS et al., 2001).

As características que definem a MSC são inconsistentes entre os

pesquisadores. Muitos laboratórios têm desenvolvido métodos para o isolamento e

expansão das MSCs, os quais invariavelmente possuem diferenças sutis e,

ocasionalmente, diferenças significantes (JAVAZON et al., 2004). Para resolver essas

diferenças a Sociedade Internacional para Terapia Celular (ISCT) propôs uma série de

padrões que definem uma MSC. Além da aderência ao plástico e o potencial de

diferenciação multipotente para as linhagens mesodérmicas, as MSC devem

expressar os marcadores de superfície: CD105, CD73 e CD90; e não devem

expressar CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA de classe II

(DOMINICI et al., 2006). A última coleção de marcadores representa

preferencialmente células de origem hematopoiética (LODIE et al., 2002; LEE et al.,

2004). Apesar da expressão de CD105 ser um consenso para a maioria dos

pesquisadores (GRONTHOS et al., 2001; LODIE et al., 2002; BANAS et al., 2007;

FALANGA et al., 2007; ZANNETTINO et al., 2008), o mesmo não ocorre em relação à

expressão de CD34. A maioria dos autores demostraram que ele não é expresso,

principalmente nas MSC de MO e sangue de cordão umbilical (LODIE et al., 2002 e

LEE et al., 2004; TONDREAU et al., 2005; FALANGA et al., 2007). Outros trabalhos

demonstram a expressão deste marcador somente em MSC de TA (GRONTHOS et

al., 2001; DE UGARTE et al., 2003; PLANAT-BENARD et al., 2004a; BAPTISTA et al.,

2007), onde esse marcador possivelmente representa um fenótipo de células

progenitoras endoteliais, em contraposição a um fenótipo de endotélio maduro,

representado pela falta de expressão de CD31 (PLANAT-BENARD et al., 2004a). Estudos recentes têm demonstrado que MSCs positivas para os marcadores

de superfície citados acima e que são multipotentes para as linhagens mesodérmicas,

podem ser enriquecidas do sangue de cordão umbilical e periférico pela seleção de

CD133 (TONDREAU et al., 2005) e da MO pela seleção para SSEA-1 (ANJOS-

23

AFONSO & BONNET, 2007), SSEA-4 (GANG et al., 2007), ou para o receptor do fator

de crescimento de nervos (CD271) (QUIRICI et al., 2002).

Outros estudos encontraram marcadores específicos de pericitos tais como

CD146 e 3G-5 em MSC derivadas de MO (SHI & GRONTHOS, 2003), o que é consistente com a hipótese de que pericitos vasculares especializados na MO

representam a população de MSC in vivo (BIANCO et al., 2001; BRACHYOGEL et al.,

2005). Recentemente, foi demonstrado que MSC de TA também expressam esses

marcadores de células perivasculares (ZANNETTINO et al., 2007). A molécula de adesão ALCAM – CD166 também foi sugerida como marcador

de MSC derivadas do pericôndrio da MO de membros fetais em camundongos,

participando ativamente na formação desse órgão hematopoiético (ARAI et al., 2002).

Esta molécula também parece participar na vasculo-angiogênese e na sustentação da

hematopoiese embrionárias (OHNEDA et al., 2001), sendo também expressa em MSC

de TA (GRONTHOS et al., 2001) e de MO (MARESCHI et al., 2006).

As MSCs de MO assim como as HSCs também expressam o receptor para a

quimiocina SDF-1α, CXCR4 (PONTE et al., 2007). Estas células pós-transplante

migram especificamente para a MO através da ativação desses receptores (WYNN et

al., 2004).

1.5.b. Diferenciação Ortodoxa As MSCs podem assumir diferentes fenótipos tais como condrócitos,

osteoblastos, adipócitos ou células endoteliais. Este comportamento, ambos in vitro e

in vivo, foi o primeiro vislumbre da propriedade que agora é referida como plasticidade

(GOODELL, 2001). Um tecido derivado do mesoderma pode conter alguns desses

tipos celulares em diferentes estágios de comprometimento, ou até todos, como é o

caso da MO. A noção de que cada um desses fenótipos celulares pode mudar para

outro sob circunstancias específicas é consistente com o desenvolvimento e a

manutenção do órgão do qual estas células derivam. Desta forma este tipo de

plasticidade é ortodoxa, significando que ela permanece dentro do contexto da

homeostasia tecidual (BIANCO et al., 2001).

Já foi demonstrado, por exemplo, que linhagens clonais de células

acumuladoras de gordura da MO podem ser direcionadas para uma diferenciação

osteogênica e formam ossos genuínos em ensaios in vivo (BENNETT et al., 1991;

BERESFORD et al., 1992). Anteriormente, também já havia sido notada a habilidade

de células estromais, responsáveis pela sustentação da hematopoese, de se converter

em células acumuladoras de gordura (BIANCO et al., 1988). Os condrócitos também

podem se desdiferenciar em cultura para um fenótipo osteogênico (GENTILI et al.,

24

1993). Todos esses resultados realçam a natureza não irreversível da diferenciação

desses tipos celulares, levando à noção de que o comprometimento e a diferenciação

possivelmente não são processos unidirecionais e terminais, como é mostrado em

sistemas de multi-linhagens dependentes de uma única célula-tronco (BIANCO et al.,

2001).

Cada via de diferenciação ativa a expressão de genes e proteínas particulares.

O processo de diferenciação osteogênica pode ser dividido em três estágios distintos:

(1) Proliferação celular; (2) Maturação da matriz e (3) Mineralização. Um número de

genes, incluindo fosfatase alcalina, colágeno do tipo I, sialoproteína, osteopontina e

osteocalcina, são expressos em altos níveis por períodos determinados durante a

diferenciação (BECK, 2003). Os eventos que definem a maturação de condrócitos

dividem características comuns com a osteogênese, tais como a expressão de

fosfatase alcalina, a formação de matriz, a deposição do mineral hidroxiapatita e o

requerimento do fosfato inorgânico (WUTHIER, 1993). As moléculas específicas

expressas nessa via de diferenciação compreendem as proteínas de matriz

extracelular tais como colágeno do tipo II, agrecan e decorina (WINTER et al., 2003).

A primeira marca do processo adipogênico é a alteração dramática no formato

celular, que é convertido de um aspecto fibroblastóide para um formato esférico

(MCBEATH et al., 2004). Os eventos requeridos para essa alteração morfológica

incluem a degradação proteolítica da matriz extracelular pelos pré-adipócitos, a

expressão de gens adipocíticos, o acúmulo de lipídeos (GREGOIRE, 2001) e

alterações no citoesqueleto (MCBEATH et al., 2004). Os fatores de transcrição críticos

na adipogênese incluem C/EBPα e/ ou PPARγ (GREGOIRE, 2001).

1.5.c. Regulação das vias osteogênica e adipogênica

As vias osteogênica e adipogênica são balanceadas fisiologicamente através

da expressão de fatores de transcrição (NUTTALL & GIMBLE, 2004) e por proteínas

do citoesqueleto (MCBEATH et al., 2004). Desordens nesse balanço podem levar a

quadros patológicos, como a osteoporose. Os mecanismos transcricionais na

regulação da adipogênese e osteogênese dependem em parte, de receptores

nucleares hormonais e seus ligantes. Um destes receptores é o PPARγ2, cujos

ligantes incluem ácidos graxos de cadeia longa, derivados oxidados dos ácidos

graxos, e compostos de thiazolidinediona (NUTTALL & GIMBLE, 2004).

Os ligantes para PPARγ2 promovem adipogênese nas células estromais da MO

e inibem a osteogênese (Fig. 10). Estes agentes não ativam somente o receptor

nuclear PPARγ2, mas também suprimem as ações da proteína regulatória

25

transcricional – CBFA-1 (LECKA-CZERNIK et al., 2002). Em modelos animais o mais

potente ligante para PPARγ2 - rosiglitazona, aumenta o volume do tecido adiposo na

MO enquanto reduz a densidade mineral óssea e a área trabecular do osso (RZONCA

et al., 2004).

Os osteoblastos também são responsáveis pela secreção de adiponectinas

(BERNER et al., 2004), proteínas antes atribuídas somente aos adipócitos do TA

subcutâneo (MAEDA et al., 1996). As adiponectinas estão presentes na MO e regulam

negativamente a diferenciação adipogênica (YOKOTA et al., 2002) assim como a

diferenciação de progenitores mielóides (YOKOTA et al., 2000). Este último dado é

conflitante com a observação de que essas proteínas promovem a proliferação de

células osteoblásticas (BERNER et al., 2004), já que o principal nicho das HSCs é o

subendosteal (TAICHMAN, 2005). Novas avaliações do papel das adiponectinas na

MO e no balanço das vias adipogênicas e osteogênicas são necessárias, já que

recentemente também foi descoberto que as HSCs expressam receptores para essas

proteínas (DIMASCIO et al., 2007).

Figura 10. Modelo proposto para as mudanças na MSC no comprometimento para as vias adipogênica e osteogênica. Quando fatores de transcrição da família dos PPARγ são ativados, a diferenciação osteogênica cessa, sendo substituída pela via adipogênica. Adaptado de McBeath et al., 2004.

1.5.d. O potencial de diferenciação das diferentes fontes de MSC Mesmo na MO existem populações de MSC funcionalmente heterogêneas

(MURAGLIA et al., 2000; COLTER et al., 2001) e que contêm progenitores não

diferenciados com potenciais de diferenciação variados (KUZNETSOV et al., 1997).

Também no TA subcutâneo foi demonstrado MSC em diferentes estágios de

diferenciação (ZUK et al., 2002). As diferenças entre sub-populações encontradas no

26

mesmo órgão também podem refletir em diferenças encontradas entre diversos

órgãos. As diferentes fontes de MSC anteriormente mencionadas possuem

populações de MSC que não são funcionalmente equivalentes em relação ao potencial

de diferenciação (PHINNEY & PROCKOP, 2007).

Além da MO, as principais fontes de MSC são o TA e o sangue de cordão

umbilical. Em 2005, através de ensaios de avaliação da expressão global de genes

(RNA-microarray), foram detectadas diferenças na expressão de genes mesodérmicos

entre as MSC das fontes citadas, o que pode estar correlacionado com diferentes

ontogenias. Curiosamente, as MSC de sangue de cordão, quando comparadas com as

de MO e TA, apresentam um baixo (WAGNER et al., 2005) ou nenhum potencial

adipogênico, além de um baixo rendimento no momento do isolamento (KERN et al.,

2006).

Ainda em relação ao potencial adipogênico, as MSC de TA são mais

competentes, enquanto as MSC de MO são mais comprometidas para as vias

osteogênica e condrogênica (LIU et al., 2007), característica que pode estar

relacionada com o microambiente tecidual em que essas células residem (BAPTISTA

et al., 2007). As MSC de TA possuem expressão constitutiva para subtipos do gene

PPARγ (ZUK et al., 2002; BAPTISTA et al., 2007) e somente as MSC de MO, quando

cultivadas em um sistema tridimensional induzidas para a via condrogênica, modulam

os genes relacionados de forma eficiente (WINTER et al., 2003). Apesar do seu

comprometimento com a via adipogênica, as MSC de TA, quando cultivadas em

biomateriais de hidroxiapatita para implantação in vivo, são capazes de formar uma

matriz osteóide (HICOK et al., 2004).

1.5.e. Diferenciação Não-Ortodoxa Vários estudos têm indicado ou implicado que progenitores com um aparente

potencial de diferenciação não-ortodoxo podem ser encontrados em tecidos no

organismo adulto (BIANCO et al., 2001). Primeiro foi mostrado que a MO contém

progenitores miogênicos sistematicamente transplantáveis (FERRARI et al., 1998), em

seguida que células da MO poderiam gerar hepatócitos (LAGASSE et al., 2000) e por

último, que as MSC da MO poderiam ter um potencial neurogênico in vivo (KOPEN et

al., 1999).

Em relação ao potencial neurogênico, diversos grupos obtiveram resultados

positivamente semelhantes tanto para as MSC de MO (GROVE et al., 2004), quanto

para as de TA (SCHÄFFLER & BÜCHLER, 2007). Porém, os métodos utilizados para

promover a diferenciação neural in vitro e acessar a biologia das células diferenciadas

27

são fragmentados e inconsistentes (PHINNEY & PROCKOP, 2007). Os agentes

indutores frequentemente promovem o rompimento da rede de filamentos de actina

levando a uma retração citoplasmática, que se assemelha ao brotamento de neuritos

(NEUHUBER et al., 2004). Porém, na presença de matrizes frouxas, ou seja com

menor elasticidade, que mimetizam o microambiente do tecido nervoso, as MSC de

MO emitem prolongamentos e a dinâmica do brotamento é claramente o oposto da

retração do corpo celular induzido por DMSO, um agente frequentemente utilizado

como indutor neurogênico (ENGLER et al., 2006).

Recentemente, foram encontrados em uma baixa freqüência clones na

população de MSC de TA cultivadas em matriz semi-sólida de metilcelulose, com

potencial de diferenciação espontânea para cardiomiócitos funcionalmente

competentes (PLANAT-BÉNARD et al., 2004b). Agentes demetilantes também são

capazes de induzir mudanças nas propriedades eletrofisiológicas das MSC de MO,

mas não há a geração de cardiomiócitos funcionais (BALANA et al., 2006).

As MSC de MO após uma administração sistêmica, são capazes de se

diferenciar em vários tipos celulares do epitélio (KRAUSE et al., 2001). Essas células

quando co-cultivadas com células epiteliais das vias aéreas adquirem a expressão de

diversos marcadores epiteliais (SPEES et al., 2003).

Em termos de ontogenia não é surpreendente que esses progenitores

mesodérmicos possuam potencial epitelial, pois todo o mesênquima é derivado do

epitélio (PÉREZ-POMARES & MUÑOZ-CHÁPULI, 2002). Já em relação ao potencial

miogênico, foi demonstrada a colonização da aorta da região da AGM pelas células do

somito (POUGET et al., 2006), local onde também foram descritos os mesangioblastos

(MINASI et al., 2002), o que torna bem provável a diferenciação em células do

músculo esquelético.

Como mencionado anteriormente, as células da crista neural dão origem tanto

a componentes celulares do sistema nervoso como a componentes do sistema

cardiovascular (LE DOUARIN et al., 2004). Como a origem das células perivasculares

não é unilateral (ROBEY & BIANCO, 2006), é possível que os potenciais

cardiogênicos e neurogênicos variem de acordo com a fonte de MSCs.

1.5.f. Potencial Imunomodulador As MSCs além da multipotencialidade para linhagens mesodérmicas, têm

propriedade imunomoduladora, o que pode auxiliar no tratamento de doenças auto-

imunes e em transplantes de MO (ZHAO et al., 2004). A associação de MSCs com a

MO total a ser transplantada tem sido utilizada na clínica e além de reduzir o tempo de

28

enxerto, diminui a incidência da doença enxerto versus hospedeiro – GvHD (Graft-

versus-host disease) (LE BLANC & RINGDÉN, 2006).

As principais fontes de MSC já testadas tanto em modelos animais de GvHD

(FANG et al., 2006; YAÑEZ et al., 2006), quanto no tratamento de pacientes

(RINGDÉN et al., 2006) demonstram resultados promissores. Exceto as MSCs de

sangue de cordão, que parecem não ter efeito imunomodulador (TISATO et al., 2007).

Os mecanismos de imunomodulação exercidos pelas MSCs ainda não foram

totalmente elucidados, mas já foi descrito que essas células alteram o perfil de

secreção de citocinas de células dendríticas, células T efetoras e células Natural Killer

para um fenótipo mais anti-inflamatório ou tolerante (AGGARWAL & PITTENGER,

2005).

1.6. ENSAIOS CLÍNICOS COM MSCs

Devido ao grande potencial terapêutico das MSC na medicina regenerativa, o

Comitê de células mesenquimais e células tronco teciduais da Sociedade Internacional

para Terapia Celular, propôs recentemente critérios mínimos para a definição das

MSC humanas. Três características principais definem a MSC: (1) Aderência ao

plástico in vitro; (2) Expressão de antígenos de superfície específicos; (3) Potencial de

diferenciação para as três principais linhagens mesodermais: osteoblastos, adipócitos

e condrócitos (DOMINICI et al., 2006).

As MSCs de MO foram primeiramente utilizadas em ensaios clínicos no

tratamento da osteogenesis imperfecta (HORWITZ et al., 2001) em

mucopolisacaridoses e leucodistrofias metacromáticas, as quais levam a defeitos

ósseos e neurológicos (KOÇ et al., 2002), em GvHD (RINGDÉN et al., 2006), em

esclerose múltipla (MOHYEDDIN BONAB et al., 2007), no infarto do miocárdio

(SCHÄCHINGER et al., 2006) e em outras doenças. Alguns trabalhos sugerem o

potencial neurogênico das MSC (PHINNEY & PROCKOP, 2007) e o seu uso clínico

em pacientes com autismo têm sido defendido, pois esta patologia está

frequentemente associada a anormalidades do sistema imunológico e a hipoperfusão

neural (ICHIM et al., 2007).

Em humanos, as limitações biológicas para a regeneração cardíaca criaram

oportunidades para novos ensaios clínicos. A área cardíaca foi uma das pioneiras em

protocolos de terapias celulares com células de MO (DIMMELER et al., 2005), sendo

primeiramente utilizadas células mononucleares (STRAUER et al., 2002; PERIN et al.,

2003; WOLLERT et al., 2004). A partir desses ensaios foram propostas as primeiras

hipóteses para os mecanismos de ação das células de MO, mas provavelmente ocorre

29

uma sinergia entre os diversos mecanismos (Fig. 11) (DIMMELER et al., 2005).

Posteriormente, com a descoberta da multipotencialidade das MSC e seu potencial de

diferenciação também para cardiomiócitos e vasos sanguíneos (PITTENGER &

MARTIN, 2004), essa fonte de células da MO passou a ser utilizada em ensaios

clínicos (SCHÄCHINGER et al., 2006).

As MSCs de MO, devido ao seu grande potencial osteogênico, é a fonte mais

indicada para tratamento de defeitos críticos ósseos (ROBEY & BIANCO. 2006), mas

as MSCs de TA também podem ser utilizadas neste e em outros protocolos em

medicina regenerativa (SCHÄFFLER & BÜCHLER, 2007). O primeiro ensaio clínico a

utilizar essa nova fonte de MSC, foi o tratamento de fístulas geradas pela doença de

Chron, uma patologia essencialmente de caráter auto-imune (GARCÍA-OLMO et al.,

2005). As propriedades imunossupressoras das MSCs de TA permitem a sua

utilização em diversos ensaios clínicos, tais como no tratamento de GvHD, que

demonstra excelentes resultados tanto em modelos animais (YAÑEZ et al., 2006),

como em um estudo piloto em um paciente em estágios iniciais da doença (FANG et

al., 2006).

Figura 11: Mecanismos de ação. Células progenitoras podem facilitar a recuperação funcional do miocárdio infartado por vários mecanismos, incluindo o aumento da neovascularização de maneira direta ou indireta. Fatores parácrinos liberados pelas células progenitoras podem inibir a apoptose dos cardiomiócitos, afetar o remodelamento, ou aumentar o reparo endógeno (por exemplo, através de progenitores residentes). A diferenciação em cardiomiócitos pode contribuir para a regeneração cardíaca. A extensão pelas quais esses diferentes mecanismos estão ativos pode depender criticamente do tipo de injúria tecidual, tais como aguda ou crônica. Fonte: Dimmeler et al., 2005.

O uso das MSCs também tem sido proposto em protocolos de bioengenharia

de pele (BURD et al., 2007), onde modelos animais revelam que somente as MSCs de

MO e não as HSCs, são capazes de adquirir marcadores de superfície específicos de

30

queratinócitos e de formar estruturas glandulares, sugerindo uma contribuição direta

para a regeneração cutânea (WU et al., 2007). Resultados semelhantes foram

observados na regeneração de feridas de camundongos diabéticos (JAVAZON et al.,

2007) e o uso das MSC de MO associadas à biomateriais de colágeno também já foi

testado em pacientes diabéticos (VOJTASSÁK et al., 2006).

As MSC de TA já foram utilizadas no tratamento de rítides (STASHOWER et

al., 1999) e o nosso grupo tem tido excelentes resultados para preenchimentos

cutâneos com a associação dessas células ao ácido hialurônico (dados não

publicados). O uso dessa nova fonte de MSC em protocolos de terapias celulares

ainda é restrito, mas sua multipotencialidade e similaridades com as MSC de MO faz

dessa fonte de fácil acesso, uma excelente candidata para protocolos em medicina

regenerativa (FRASER et al., 2006). Desta forma, é importante aprofundar o

conhecimento sobre a biologia das MSCs de TA, assim como testar sua semelhança

com as MSCs de MO, para que cada tipo celular seja indicado da melhor maneira para

os diversos protocolos de terapias celulares.

2.OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral Analisar os componentes celulares do tecido adiposo subcutâneo humano,

avaliando a multipotencialidade da sua fração mesenquimal in vitro.

2.2. Objetivos Específicos 1 – estabelecimento da técnica e cultivo das MSCs de TA subcutâneo humano.

2 – caracterização morfológica e fenotípica das MSCs de TA, através de

técnicas de microscopia e citometria de fluxo.

3 – avaliação in vitro do potencial de diferenciação paras as vias adipogênica,

osteogênica, condrogênica e endotelial das MSCs de TA, através de ensaios

funcionais e expressão de marcadores específicos.

4 – avaliação do potencial de sustentação hematopoiética das MSCs de TA

induzidas ou não para as vias adipogênica e osteogênica, em comparação com as

MSCs de MO, através de ensaios de co-cultivo, expressão gênica e de quantificação

de progenitores hematopoiéticos.

31

3. METODOLOGIA

3.1. AMOSTRAS E TÉCNICAS DE ISOLAMENTO.

3.1.a. Amostras e células.

As amostras de MO foram obtidas de aspirados da crista ilíaca de doadores

voluntários da Unidade de Transplante de Medula Óssea do Serviço de Hematologia

do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF), da Universidade Federal

do Rio de Janeiro (UFRJ). Amostras de TA subcutâneo ou de lipoaspirado, ambos da

parede abdominal, foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia estética no

HUCFF. A mediana da idade dos pacientes foi de 41,8 ± 2,1, totalizando vinte, todos

do sexo feminino. Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em

Pesquisa (CEP) deste hospital – portaria: 088/04. Todos os pacientes leram,

concordaram e asinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

As amostras de cordão e de sangue de cordão umbilical humanos foram

coletadas em solução salina tamponada com heparina (20 UI/mL; Liquemine, Roche),

na Maternidade-escola Pró-Matre no Rio de Janeiro. A obtenção destas amostras foi

aprovada pelo comitê de ética desta instituição.

Fibroblastos de pele humana (FPH) e a linhagem estromal de MO murina –

MS5 foram fornecidos pelo Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ), HUCFF,

UFRJ.

3.1.b. Isolamento de MSCs.

Obtenção de MSCs de MO.

Os aspirados de MO foram submetidos à hemossedimentação com Hespan®

(hidroxietil de amido McGaiy Inc., Irvine, CA) na diluição de 1:6. Em seguida, as

células foram lavadas com tampão fosfato salino (PBS), centrifugadas a 500 g

(gravidades) por 15 minutos, ressuspensas em Iscove´s (Gibco BRL, Rockville, MD)

ou Dulbecco’s modified Eagle Medium-Low Glicose (DMEM, LGC, Cotia, SP)

suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB, Cultilab, Campinas, SP), 100 U/ml

de penicilina sódica e 100 μg/mL de estreptomicina) e 10 mL de suspensão com 1-2 x

106 células/mL foram distribuídos em garrafas de cultura de 25 cm2. As células foram

mantidas em estufa a 37ºC com 5% de CO2 por três a quatro dias. Após este período

as células não aderentes foram retiradas e a monocamada foi lavada com PBS e

mantida nas mesmas condições para expansão. Quando confluentes, as células foram

dissociadas com solução de tripsina 0,125% (Gibco) e 0,78 mM de EDTA (Invitrogen,

32

Gibco) e distribuídas numa densidade de 0,8 – 1,3 x 104 células/cm2 para expansão. A

dissociação enzimática da monocamada confluente seguida de redistribuição para

expansão foi denominada, neste trabalho, de passagem.

Obtenção de MSCs de TA.

Pequenos fragmentos de TA foram obtidos após a retirada de vasos

sanguíneos e do excesso de tecido conjuntivo. Estes fragmentos ou o material obtido

da lipoaspiração foram submetidos à digestão enzimática com 1 mg/mL de colagenase

IA (Sigma Chemical Co, St Louis, MO.) por 20 minutos a 37ºC. A suspensão obtida foi

filtrada em malha de nylon com poro de 150 μm, centrifugadas a 300 g por 10 minutos

e lavada duas vezes com PBS. As células foram ressuspensas em DMEM com 10%

de SFB e antibiótico e 5 mL de suspensão com 105 células/cm2 foram distribuídos em

garrafas de cultura de 25 cm2, que foram mantidas em estufa a 37ºC com 5% de CO2.

Após aproximadamente 16 horas, as células não aderentes foram retiradas e a fração

aderente foi lavada com PBS, sendo mantida a 37ºC com 5% de CO2 para expansão.

Quando confluentes, as células foram dissociadas como descrito, sendo redistribuídas

em uma densidade de 0,8 – 1,3 x 104 células/cm2 para expansão, caracterizando uma

passagem.

3.1.c. Obtenção de células do cordão e do sangue de cordão umbilical.

Obtenção de células endoteliais maduras do cordão umbilical – HUVEC (human

umbilical cord endothelial cells). A veia do cordão umbilical foi canulada em ambas as extremidades. Por

intermédio das cânulas o cordão foi lavado com PBS pelo menos duas vezes e

incubado com a solução de colagenase IA (Sigma Chemical Co.) 1 mg/mL por 10

minutos a 37ºC. A suspensão foi então recolhida e centrifugada a 300 g por 10

minutos. As células de cada cordão foram ressuspensas em 5 mL de Endothelial Cell

Basal Medium 2 (EBM-2 - Cambrex Biosciesnce, Walkersville, MD) suplementado com

Endothelial Growth Medium 2 (EGM-2 – Cambrex Bioscience), distribuídas em uma

garrafa de cultura de 25 cm2 e mantidas em estufa a 37ºC com 5% de CO2. Após

aproximadamente 16 horas, as células não aderentes foram retiradas e a fração

aderente foi lavada com PBS, sendo mantida a 37ºC com 5% de CO2 para expansão.

Quando confluentes, as células foram dissociadas como descrito, e utilizadas para os

experimentos.

33

Obtenção de células mononucleares e CD34+ do sangue de cordão umbilical.

As células mononucleadas foram obtidas por centrifugação em gradiente de

Ficoll-Paque TM Plus (Amersham Biosciences, Auckland, CA). Para tanto, as amostras

foram diluídas em PBS na proporção de 1:4, aplicadas lentamente sobre a solução de

Ficoll-Paque e, em seguida, centrifugadas a 500 g por 15 minutos. O anel de células

mononucleares foi retirado e lavado com PBS. As células foram ressuspensas em

DMEM com 10% de SFB e antibiótico para quantificação em hemocitômetro,

utilizando-se líquido de Turk. Após a quantificação, as células foram novamente

centrifugadas e ou foram congeladas em meio de criopreservação, ou seja, DMEM

contendo 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma Chemical Co) e 50% de SFB ou

procedeu-se o isolamento de células CD34+ por microesferas magnéticas (CD34

Progenitor Cell Selection System – Dynal Biotech, Bromborough, Wirral). Para tal, foi

seguido o protocolo recomendado pelo fabricante. O grau de pureza dos isolamentos

variou na faixa de 70 – 90%, avaliado por citometria de fluxo. As células CD34+ foram

então congeladas ou utilizadas para os experimentos.

3.2. ENSAIOS FUNCIONAIS.

3.2.a. Indução para a via osteogênica.

A diferenciação osteogênica das células expandidas até a terceira passagem

foi induzida através de cultura em meio osteoindutor, ou seja, DMEM suplementado

com 10% SFB, 5 X 10-6M de ácido ascórbico (Sigma Chemical Co), 10-8M de

dexametasona (Sigma Chemical Co) e 10-2M de β-glicerofosfato (Sigma Chemical Co)

por até quatro semanas. Controles pareados foram mantidos em meio não indutor

(DMEM suplementado com 10% SFB e antibióticos). Esta diferenciação foi

acompanhada pela revelação de depósitos de cálcio, através da coloração de Von

Kossa modificado (ZUK et al., 2001). As análises foram feitas em microscópio invertido

(Leika DC300). Durante o período de indução, amostras (106 células) foram retiradas e

as células foram lisadas em 1 mL de TRIZOLTM Reagent (Invitrogen) para posterior

isolamento do RNA total. As MSC induzidas por apenas uma semana foram

denominadas neste trabalho de pré-osteoblásticas.

As MSCs também foram distribuídas, na concentração de 2 X 105 células,

sobre pastilhas ou amostras porosas de hidroxiapatita, com área aproximada de 1,88

cm2, que foram fornecidas pelos Dr. Marcelo Prado do Instituto Militar de Engenharia

(IME) e Dr. Alexandre Rossi do Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF). As

células foram mantidas por até uma semana ou em DMEM com 10% de SFB e

34

antibióticos ou em meio osteoindutor, e posteriormente fixadas para análise por

microscopia eletrônica de varredura (MEV). A expressão de osteopontina foi avaliada

por imunofluorescência em microscópio confocal a laser (LSM META 510 - Zeiss).

3.2.b. Indução de MSCs para a via adipogênica.

A diferenciação adipogênica foi induzida através da incubação das células

expandidas até a terceira passagem em DMEM com 10% de SFB, suplementado com

10 μM de Insulina (Biohulin®, Montes Claros, MG), 0,5mM de Isobutilmetilxantina

(IBMX, Sigma Chemical Co), 1 μM de dexametasona (Sigma Chemical Co) e 200 μM

de Indometacina (Sigma Chemical Co) por até seis semanas. Controles pareados

foram mantidos em meio não indutor (DMEM suplementado com 10% SFB e

antibióticos). A presença de acúmulos lipídicos citoplasmáticos foi evidenciada através

da coloração de Oil Red O (PROPHET et al., 1994). Em seguida, as lamínulas foram

contracoradas com Hematoxilina de Harris (Merck) e seladas em glicerol (Sigma

Chemical Co) para posterior análise morfológica ao microscópio óptico (Nikon Eclipse

E400). Durante o período de indução, amostras (106 células) foram retiradas e as

células foram lisadas em 1 mL de TRIZOLTM Reagent (Invitrogen) para posterior

isolamento do RNA total. As MSC induzidas por apenas uma semana foram

denominadas neste trabalho de pré-adipocíticas.

3.2.c. Indução de MSCs de TA para a via condrogênica.

As MSCs de TA expandidas até a passagem três foram cultivadas em

condições padrão para a formação de esferóides (SCHIPANI et al., 2001; ROSSI et

al., 2005, INDOVINA et al., 2007). Em seguida, os esferóides foram mantidos em

DMEM com 10% de SFB suplementado com 2,5 x10-4M de ácido ascórbico (Sigma

Chemical Co), 10-7M de dexametasona (Decadron, Roche, Rio de Janeiro, RJ) e 10

ng/ml de TGF-β1 (Transforming Growth Factor-β; R & D Systems, Minneapolis, MN). O

meio foi renovado semanalmente, com reposição de ácido ascórbico a cada três ou

quatro dias, durante 28 dias. Controles pareados foram realizados mantendo os

esferóides em meio não indutor (DMEM suplementado com 10% SFB). Após este

período os esferóides foram fixados e incluídos em parafina. Os cortes de esferóides

foram corados pelo método de Alcian Blue (Merck, Whitehouse Station, NJ) em pH 1,0

(BANCROFT & STEVENS, 1996).

35

3.2.d. Indução de MSCs de TA para a via endotelial.

Ensaios em sistema de esferóides.

As MSC de TA foram cultivadas em sistema de esferóides em EBM-2

suplementado com EGM-2 ou em DMEM com 10% de SFB e antibióticos, por até dez

dias sem troca de meio. Após este período, os esferóides foram retirados para cultura

em gel de colágeno ou para análise morfológica. Neste caso, foram fixados e

processados para inclusão em parafina ou congelados. A diferenciação para a

linhagem endotelial foi acompanhada pela expressão de CD31, VEGF e vWF (fator de

von Willebrand), avaliada por imunofluorescência de cortes congelados ou por

imunohistoquimica. Para verificar a expressão de genes envolvidos na diferenciação

endotelial, cerca de dez esferóides foram lisados em 0,5 mL de TRIZOLTM Reagent

(Invitrogen) para posterior isolamento do RNA total.

Co-cultivo com HUVECs.

As MSC de TA e HUVECs foram cultivadas simultaneamente em igual

concentração de células – 104 células/poço em placas de 24 poços, e acompanhadas

por até dez dias. Após este período, as células foram fixadas em paraformaldeído a

4% tamponado por uma hora a temperatura ambiente e a expressão de CD31 foi

avaliada por imunofluorescência. A análise foi realizada em microscópio de

imunofluorescência (Nikon Eclipse E400).

Para avaliar a interação das MSCs de TA com as HUVECs em modelo

tridimensional, que favorece a formação de estruturas tubulares (Kelm et al., 2005), as

células foram cultivadas em modelo de esferóide multicelular. Após a formação de

esferóides de TA, as HUVECs foram distribuídas sobre estes, mantendo-se uma

relação destas células de 1:2 (esferóides mistos). Após dez dias, foi seguido o

protocolo de fixação e inclusão em parafina. Os cortes foram analisados em

microscópio óptico (Nikon Eclipse E400) através da coloração de Hematoxilina e

Eosina (H-E).

Brotamento em Gel de Colágeno.

Após a formação dos esferóides de MSC de TA, HUVEC e mistos, estes foram

inseridos em gel de colágeno do tipo I extraído da cauda de rato em pH 3,85 na

concentração de 14,3 mg/mL e posteriormente diluído em ácido acético (Merck) 3,5 X

10-13 N para uma concentração final de 0,6 mg/mL. Para verificar a formação de

brotamentos a partir dos esferóides, como descrito (KORFF & AUGUSTIN, 1999),

estes foram mantidos na presença de VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)

recombinante humano (Sigma Chemical Co) na concentração final de 2,5 ng/mL ou

36

uma monocamada de MSC de TA na concentração de 5 X 103 células/poço. O padrão

de brotamento dos esferóides foi analisado por até três dias em microscópio invertido

(Leica DC300).

3.2.e. Sustentação da Hematopoese em Culturas de Longa Duração.

Co-cultivo com células mononucleares de sangue de cordão.

Culturas de longa duração foram estabelecidas pela modificação do método de

Dexter (DEXTER & TESTA, 1976). As MSC de MO e de TA induzidas ou não por uma

semana para as vias adipogênica e osteogênica, e os FPH foram cultivadas em

garrafas de 25 cm2, em triplicata. Após o estabelecimento da monocamada, as células

mononucleares de sangue de cordão foram distribuídas sobre os estromas na

concentração de 5 X 105 células/mL. As co-culturas foram mantidas em estufa a 37ºC

com 5% de CO2 por até 32 dias em meio Iscove’s suplementado com 12,5% de SFB e

12,5% de soro de cavalo (Sigma Chemical Co), 10-6 M de hidrocortisona (Sigma

Chemical Co) e antibióticos. A cada três dias, alíquotas do sobrenadante foram

retiradas, quantificadas em hemocitômetro com azul de Trypan, sendo que parte das

células foi usada para a confecção de citocentrifugados, corados pelo método de May

Grunwald-Giemsa (MGG).

Semanalmente, metade do meio era trocado, retirando-se as células do

sobrenadante, que foram utilizadas em ensaios de formação de colônia de granulócito

e macrófago em meio semi-sólido (CFU-GM, granulocyte-macrophage colony forming

unit) (DUTRA et al., 1997). Resumidamente, o meio semi-sólido consistia de duas

camadas com os seguintes reagentes: 20% de Iscove`s Modified Dulbecco`s Medium

1X (IMDM - GIBCO®) + 30% de IMDM 2X + 20% de SFB + 30% de solução de ágar

1,8% em água destilada (Sigma Chemical Co). Após o plaqueamento e polimerização

da primeira camada, foi adicionada a segunda acrescida das células hematopoiéticas

(5 X 104 células) e do sobrenadante da linhagem de carcinoma de bexiga (5637) –

enriquecido em hemopoietinas, principalmente GM-CSF. Ao final de 12 dias de

incubação em estufa a 37ºC com 5% de CO2, as placas foram fixadas em vapor de

formol 10% (Merck) e o número de colônias (grupo de células com mais de 50 células)

formadas foi quantificada com o auxílio de microscópio invertido (Nikon - TMS).

Co-cultivo com células CD34+ de sangue de cordão. As MSC de MO não induzidas e as de TA induzidas ou não por duas semanas

para a via osteogênica, foram distribuídas em placas de 24 poços em triplicatas e as

37

células CD34+, isoladas magneticamente, como descrito anteriormente, do sangue de

cordão, foram distribuídas em uma concentração de 2 X 104 células/poço. As co-

culturas foram mantidas em estufa a 37ºC com 5% de CO2 por até 21 dias em Alpha-

Medium (α-MEM - GIBCO®) suplementado com 12,5% de SFB e 12,5% de soro de

cavalo (Sigma Chemical Co), 10-4 M de β-mercaptoetanol (Merck) e antibióticos

(CROISILLE et al., 1994). A cada três dias, as células hematopoiéticas eram retiradas

dos poços para a quantificação em hemocitômetro com azul de Trypan, sendo que

parte das células foi usada para a confecção de citocentrifugados e a outra parte para

análise em citometria de fluxo. Após uma semana, parte das células foi utilizada em

ensaios de LTC-IC (long term clonogenic- initiating cell) e de CFU-GM. Os ensaios de

LTC-IC foram realizados como previamente descrito (ISSAAD et al., 1993).

Resumidamente, as células hematopoiéticas foram retiradas e distribuídas, em

diluição limitante (50 a 400 células/poço), sobre monocamada de linhagem de estroma

medula murino, a MS5, preparada 24h antes em placa de 96 poços, tendo sido

utilizados 30 poços/diluição. As placas foram mantidas em estufa a 33ºC com 5% de

CO2 por até quatro semanas, com troca semanal de meio de cultura. Todos os poços

foram examinados pelo menos uma vez por semana e a presença de colônias de

células hematopoiéticas foi assinalada.

3.3. TÉCNICAS EXPERIMENTAIS.

3.3.a. Citometria de fluxo.

As células em suspensão foram lavadas em tampão de FACS (PBS contendo

3% de SFB e 0,1% de Azida Sódica) e incubadas por 30 minutos a 4ºC com

anticorpos monoclonais conjugados aos fluorocromos FITC, PE, PerCP, PE-Cy5 e

APC. Foram analisados os seguintes marcadores de superfície: CD105 (clone 166707;

R & D Systems), CD34 (clone 8G12; Becton & Dickinson, Franklin Lakes, NJ), CD45

(clone H130; Becton & Dickinson), CD13 (clone TÜK 1; Caltag Lab), CD14 (clone TÜK

4; Caltag Lab), CD146 (clone P1H12; Becton & Dickinson), CD31 (clone L133.1;

Becton & Dickinson), CD90 (clone 5E10; Becton & Dickinson), CD44 (clone G44-26;

Becton & Dickinson) e CD49d (clone 9F10; Becton & Dickinson). Após a incubação

com os anticorpos, quando necessário, as hemácias foram lisadas pela incubação, por

15 minutos a temperatura ambiente com a solução de lise (FACSTM lysing solution -

Becton & Dickinson) conforme as recomendações do fabricante, e a suspensão celular

foi lavada com tampão de FACS e adquirida em citômetro FACScalibur, equipado com

o programa Cell Quest 3.1 (Becton & Dikinson) ou em citômetro FACScanto, equipado

com o programa FACS Diva Software 4.0.

38

3.3.b. Seleção das células de TA.

As células de TA recém-isoladas foram incubadas, como descrito acima, com

os anticorpos monoclonais CD105, CD34 e CD45, conjugados diretamente com os

fluorocromos FITC, PE e PE-Cy5, respectivamente. A suspensão foi lavada e as

células sorteadas em Mo-Flo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) - Dako

Cytomation equipado com o programa Summit 4.3 para aquisições e análises. Após a

seleção, foi feita avaliação da pureza das populações e da viabilidade, pelo Azul de

Trypan. As populações celulares selecionadas foram distribuídas separadamente em

placas de cultura com DMEM com 10% SFB e antibióticos e mantidas em estufa a

37ºC com 5% de CO2.

3.3.c. Histologia, Imunofluorescência e Imunohistoquímica.

Para análise histológica dos esferóides, estes foram fixados em

paraformaldeído 4% em PBS por pelo menos seis horas. Em seguida, parte dos

esferóides foi incubada em soluções seriadas de sacarose 15% e 30% em água

destilada por 6h cada, incluída em OCT (Optimal Cutting Temperature – Tissue-Tek Ò

– Gentaur, Bruxelas) e congelada. Os blocos foram armazenados em freezer -70°C e

posteriormente cortados com espessura de 3 – 5 μm em criostato (Leica CM 1850).

Outra parte dos esferóides foi processada rotineiramente para inclusão em

parafina. Foram realizados cortes com 5 μm de espessura em micrótomo (LUPE, 820

Spencer) que foram corados por Hematoxilina e Eosina (H-E) e selados em Entellan

(Merck) para posterior análise ao microscópio óptico (Nikon Eclipse E400).

As análises por imunofluorescência foram realizadas em cortes congelados ou

em citocentrifugados ou, ainda, em células cultivadas sobre hidroxiapatita. A

diferenciação para a linhagem endotelial em sistema de esferóides foi acompanhada

por com o anticorpo primário de camundongo anti-CD31 humano (Dakocytomation,

Fort Collins, Colorado) na diluição de 1:40 seguido da incubação com o secundário de

cabra anti-IgG conjugado a FITC (CALTAG, Invitrogen) na diluição de 1:100. Para a

marcação nuclear foi utilizada solução de DAPI 1:5000 em PBS. As observações

foram realizadas em microscópio confocal a laser (LSM META 510 - Zeiss). Já nos

citocentrifugados a marcação para CD31 foi acompanhada com o anticorpo primário

de cabra humano (Sigma Chemical Co) na diluição de 1:100 seguido da incubação

com o secundário de camundongo anyi-IgG conjugado a Rodamina (Sigma Chemical

Co). As observações foram realizadas em microscópio óptico de fluorescência (Nikon

Eclipse E400). Ensaios de imunofluorescência também foram realizados nas MSC

cultivadas em arcabouços porosos de hidroxiapatita. Para o acompanhamento da

39

diferenciação osteogênica, foi utilizado o anticorpo primário policlonal anti-

osteopontina (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) na diluição 1:500 incubado a 4°C por 12

horas após o bloqueio com PBS-3%BSA. Em seguida as amostras foram incubadas

com o anticorpo secundário conjugado a TRITC na diluição 1:1000 por uma hora, para

a revelação da marcação. Os fragmentos do arcabouço de hidroxiapatita foram

analisados em microscópio confocal a laser (LSM META 510 - Zeiss).

A reação imunohistoquímica foi realizada após desparafinização dos cortes,

seguida da recuperação antigênica com solução de ácido cítrico pH 6,0 em panela de

pressão por cinco minutos. Após dois bloqueios seguidos, o primeiro com cloreto de

amônio 50 mM pH 8,0 por 30 minutos e o segundo para sítios inespecíficos, com uma

solução de PBS/BSA 5% por 1 hora, os anticorpos primários de coelho anti-vWF

(DakoCytomation) na diluição de 1:50 e de camundongo anti-VEGF (Santa Cruz) na

diluição de 1:100 foram adicionados sobre os cortes que foram incubados a 4°C por 12

horas. Depois de sucessivas lavagens com PBS/Tween 0,25% por 5 minutos, foi

realizada a inativação da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 70% em

metanol por 15 minutos (protegido da luz). Os cortes foram então novamente lavados,

revelados com o kit de estreptavidina (LSAB, DakoCytomation) por uma hora e meia,

contracorados com hematoxilina, desidratados rapidamente e selados em Entellan

(Merck) para posterior análise ao microscópio óptico (Nikon Eclipse E400).

3.3.d. Microscopia eletrônica de varredura (MEV).

As células cultivadas em arcabouços porosos de hidroxiapatita foram, após a

retirada do meio de cultura e de sucessivas lavagens com PBS, fixadas em

glutaraldeído a 2,5% (Ted Pella Inc, Redding, CA) em tampão cacodilato de sódio

(Sigma Chemical Co) 0,1M por duas horas. Após três lavagens com o mesmo tampão,

o material foi pós-fixado em Tetróxido de Ósmio 1% (E.M.S) por 40 minutos, na

ausência de luz, e novamente lavado para a desidratação com banhos sucessivos de

10 minutos, cada, com álcool 35%, 50%, 70%, 95% e 100%. Em seguida, o material

foi seco pelo método de ponto critico e posteriormente recoberto (BAL-TEC/ SCD

O5O) com fina camadas de ouro para a metalização. Finalmente, as amostras foram

transferidas para suportes de alumínio (“STUBS”) sobre fita de carbono para a

visualização em microscópio eletrônico de varredura (Jeol 5310), operado em 20 kv.

Foram obtidas imagens digitais com programa SEMafore com resolução de 1024 X

960 Pixels.

40

3.3.e. Extração de RNA Total e Síntese de cDNA.

As amostras foram lisadas com TRIZOLTM Reagent e o RNA total foi extraído

seguindo-se as recomendações do fabricante. O RNA total foi diluído em água com

0,1% de DEPC (Dietil-pirocarbonato) e a relação entre ácido nucléico e proteína foi

determinada em espectrofotômetro, em comprimento de onda de 260 nm (nucleotídeo)

e 280 nm (proteínas). As amostras que apresentaram uma relação entre RNA e

proteínas acima de 1,6 foram utilizadas na síntese de cDNA. Para a síntese de 20 µL

de cDNA, 2 μg de RNA foram utilizados, sendo o volume ajustado com água DEPC,

para 11 µL. A este volume foi adicionado 1 μL de Oligo DT primer 500 μg/mL (Gibco) e

a mistura foi incubada a 68°C por 4 minutos. Após este período, adicionou-se 4 μL do

tampão da enzima transcriptase reversa (Invitrogen), 2 μL de 0,1 M de DTT

(Invitrogen), 1 μL de 10 mM de mistura de nucleotídeos (Invitrogen) e 1μL da enzima

de transcrição reversa, (M-MLV RT 200 U/mL; Invitrogen). A mistura foi incubada a

39°C por 2 h. Em seguida, foi colocada a 90 °C por 10 minutos e armazenada a –

20°C.

3.3.f. Reação de polimerase em cadeia com transcrição reversa (RT– PCR), Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction).

Para as reações de RT-PCR, 2 μL de cDNA foram adicionados a 20 μL de uma

solução contendo os primers (mix de PCR, anexo) e 0,3 μL de Taq Polimerase 5U/µL

(Cenbiot Enzimas, Campus do Vale da UFRGS). Após 30 segundos a 98ºC, foram

realizados 34 ciclos de 96°C por 45 segundos seguidos de 1 minuto a temperatura

média de anelamento para cada primer (Tab.1) e 72°C por 1 minuto para

alongamento. Ao final, um ciclo a 75ºC por 5 minutos. Os primers utilizados estão

listados na tabela 1. O produto amplificado foi submetido a eletroforese em gel de

agarose 1,2% e posterior coloração com brometo de etídeo 0,17 µg/mL de TAE (Tris-

Acetato-EDTA). A visualização foi realizada com o auxílio de um transiluminador.

3.3.g. Análise Estatística.

Foi utilizado teste não paramétrico, não pareado, de Mann-Whitney para a

análise de significância estatística nos experimento de CFU-GM. Foi considerado

significativo p< 0,05.

A freqüência de LTC-IC foi calculada usando o método estatístico de Poisson

(SUTHERLAND et al., 1990).

41

Tabela 1. Primers utilizados, temperatura média de anelamento e tamanho do produto amplificado (pb, pares de bases).

Sequência TM Produto

ANG-1 5’GTGGAATCTGTCATATACTGTGAA3’ 3’ACTGTGCAGATGTATATGAAGC5’ 54°C 326pb

Delta-1 5’CCACGCAGATCACGAACACC3’ 3’TTGCTATGACGCACCATCC5’ 55°C 335pb

FLT3L 5’AACAACCTATCTCCTCCTGCT3’ 3’GGCACATTTGGTGACAAAGTG5’ 55°C 306pb

G-CSF 5’GCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTC3’ 3’GTGTGTCCAAGGTGGGACCCAACT5’ 64°C 300pb

GM-CSF 5’CAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAAC3’ 3’ACAAGCAGAAAGTCCTTCAGGTTC5’ 64°C 289pb

HGF 5’GAGGGACATAAGAAAAGAAGA3’ 3’GTGTGGTATCATGGAACTCCA5’ 55°C 386pb

IL-6 5’AACTCCTTCTCCACAAGCGCCTT3’ 3’CCGAAGAGCCCTCAGGCTGG5’ 64°C 626pb

IL-7 5’ATGAGAGTGTTCTAATGGTC3’ 3’GGAGCATTCAGTTTCCATTG5’ 51°C 619pb

KL/SCF 5’GACAGC TTGACTGATCTTCTGGAC3’ 3’ACTGCTGTCATTCCTAAGGGAGCT5’ 58°C 359pb

LIF 5’TGAACCAGATCAGGAGCCAA3’ 3’TCGGTTCACAGCACACTTCA5’ 55°C 505pb

M-CSF 5’TGTTGTTGGTCTGTCTCCTGG3’ 3’TTCTCCAGCAACTGGAGAGGT5’ 58°C 384pb

SDF-1 5’CCGCGCTCTGCC TCAGCGACGGGAAG3’ 3’CTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT5’ 64°C 226pb

TGF- β1 5’TGAACCGGCCTTTCCTGCTTCTCATG3’ 3’GCGGAAGTCAATGTACAGCTGCCGC5’ 64°C 151pb

TNF- α 5’ACAAGCCTGTAGCCCATGTT3’ 3’AAAGTAGACCTGCCCAGACT5’ 55°C 427pb

TPO 5’TGCTCCGAGGAAAGGTGCGTT3’ 3’GGGAAGAGCGTATACTGTCCA5’ 59°C 459pb

VEGF 5’AGACCCTGGTGGACATCT TC3’ 3’TGCATTCACATTTGTTGTGC5’ 51°C 224pb

CBFA-1 5’ CTCACTACCACACCTACCTG3’ 3’CAATATGGTCGCCAAACAGATTC5’

57ºC 319 pb

Osteocalcina (OC) 5’ATGAGAGCCCTCACACTCCTC3’ 3’GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC5’

64ºC 294 pb

Osteopontina (OP) 5’CCCTTCCAAGTAAGTCCAACGAAAGC3’ 3’CTGGATGTCAGGTCTGCGAAACTTC5’

62ºC 323 pb

PPARγ2 5’GCTGTTATGGGTGAAACTCTG3’ 3’ATAAGGTGGAGATGCAGG5’

53ºC 330 pb

Leptina 5’GGCTTTGGCCCTATCTTTTC3’ 3’GCTCTTAGAGAAGGCCAGCA5’

56ºC 316 pb

GAPDH 5’ATCACCATCTTCCAGGAGCG3’ 3’CCTGCTTCACCACCTTCTTG5’

57,5ºC 587 pb

42

4. RESULTADOS 4.1. MORFOLOGIA E FENÓTIPO DAS MSC DE TA. 4.1.a. Análise da população total.

Após a digestão enzimática do TA, a população celular obtida foi heterogênea

(Fig. 12), com presença de células hematopoiéticas, evidenciadas pela expressão de

CD45. As células CD45 representam a população hematopoiética residente e/ou

circulante do TA. Ensaios clonogênicos de CFU-GM foram realizados com a fração

celular imediatamente pós-digestão, porém não foram encontradas colônias positivas,

o que pode indicar células hematopoiéticas no TA em estágios mais avançados de

diferenciação (dados não mostrados). A população de células hematopoiéticas foi

excluída e os outros marcadores foram analisados na população da região 3 (Fig.

12D). Verificou-se que a população CD45- é heterogênea quanto a expressão de

CD34, CD105, CD146, CD31 e CD90 (Fig. 12 E-K). A maioria das células CD45-

expressa CD34 com intensidade variável e uma pequena população (de 7 a 10%)

destas expressa também CD105 (endoglina) (Fig. 12E). A análise da expressão de

CD146 e CD105 (Fig. 12F) demonstrou a presença de células CD146+CD105-,

CD146+CD105+ e CD146-CD105+. Ainda, a análise da expressão de CD146 e CD34

na população CD45- (Fig. 12G) permitiu subdividir esta população em células

CD146+CD34-, CD146+CD34+ e CD146-CD34+, sendo que esta incluía a população

CD34Hi. Deve ser notada que intensidade de fluorescência para CD146 variou, ou

seja, pode-se observar uma população com alta expressão (CD146Hi) e outra com

baixa expressão (CD146Lo) deste marcador. Embora não tenha sido possível verificar

a co-expressão de CD146, CD105 e CD34 em função dos fluorocromos conjugados a

estes anticorpos, a intensidade de fluorescência permite supor que as células CD34Hi

constituem uma população negativa tanto para CD105 quanto para CD146. Além

disto, com o auxílio do marcador CD31 (PECAM-1), foi observado que as células

endoteliais maduras estão presentes na população CD34+ e CD105+, e representam

cerca de 10% da população CD34+ (Fig. 12H) e 7% da população CD105+ (Fig. 12I).

No entanto, o percentual de células CD31+ pode variar de acordo com a amostra

analisada (Fig. 12J). Além disto, a população CD34+ é homogeneamente positiva para

CD90 (Fig. 12K), sendo que duas subpopulações de células, que variavam quanto a

intensidade de fluorescência para CD44 (Fig. 12L) foram encontradas nesta fração.

Após adesão em plástico por 18 horas, as células hematopoiéticas são

perdidas, restando células aderentes pequenas, que ainda não espraiaram (Fig. 13A).

Esta morfologia é mantida por até três dias e está relacionada com a manutenção da

expressão de CD34 (Fig. 14D). Após expansão, na fase de pré-confluência, as células

43

adquirem morfologia fibroblastoíde (Fig. 13B) e há uma diminuição na expressão de

CD34 que é concomitante ao aumento da expressão de CD105 (Figs. 14D e E). A

fração aderente torna-se homogeneamente positiva para CD49d, CD13 (Figs. 14G e

H), CD105, CD90 (Figs. 15C e D) e negativa para CD34 somente após a terceira

passagem (Fig. 14F), além de aumentar de tamanho (Figs. 14A e B). Esses dados

permitem inferir que a morfologia fibroblastóide está relacionada a uma mudança de

expressão entre os marcadores CD34 e CD105. Não se pode afirmar, no entanto, que

a população CD34+, adquiriu a expressão de CD105, pois pode ter ocorrido apenas

uma seleção populacional in vitro. Parte da população CD105 também é positiva para

o marcador CD146 (Fig. 15B), mas somente a população com alta expressão para

este marcador é CD90 negativa (Fig. 15C). De acordo com o padrão de expressão

para CD146, a população CD90-, possui o mesmo perfil da população CD34+CD146+

pós-digestão (Fig. 15C).

4.1.b. Análise de Populações Celulares Selecionadas

Com o objetivo de averiguar se a perda do marcador CD34 e o ganho de

CD105 nas células aderentes ocorria em função de seleção in vitro, as células obtidas

após digestão enzimática de TA foram sorteadas para esses marcadores,

selecionando-se duas populações: CD34+CD105+CD45- (Fig. 16B) e CD34+CD105-

CD45- (Fig. 16C). A análise após o procedimento mostrou bom grau de pureza, 90% e

95%, respectivamente (Figs. 16B e C), com boa viabilidade celular (<90%) (não

mostrado).

As duas populações foram distribuídas em placas de cultura, mostrando

morfologia arredondada (Fig. 17). A população CD34+CD105+CD45- não proliferou in

vitro, mas a população CD34+CD105-CD45- apresentou um padrão morfológico com

três dias de cultura semelhante à fração aderente do TA (Fig. 17B). Após sete dias, a

população CD34+CD105+CD45- morreu e a CD34+CD105-CD45- atingiu a confluência.

Análises por citometria de fluxo revelaram que 73,05% da população CD34+CD105-

CD45- adquiriu o marcador CD105 (Fig. 18B) durante a expansão. As células CD34+CD105+ são maiores (Figs. 18C e D), quando comparadas com as células

CD34+ (Figs. 18E e F). Esses dados comprovam que a mudança morfológica se deve

a uma modulação da expressão de CD34 e CD105 pelas células durante sua

expansão e não por seleção de uma subpopulação.

44

Figura 12. Fenótipo da população celular isolada de tecido adiposo subcutâneo. (A) Tamanho (FSC) e complexidade (SSC) das células de TA pós-digestão enzimática. As análises foram realizadas na região 2 (R2). (B-C) Controle de auto-fluorescência. (D – K) Os gráficos demonstram a intensidade dos marcadores celulares ativados por fluorescência. (D) Expressão de CD34 e CD45. A população não hematopoiética (CD45 negativa) foi selecionada (R3) para análise. (E-L) Expressão de diferentes marcadores na população CD45-. Notar que o percentual de células CD105+CD31+ varia em diferentes amostras (I, J). (L) Histograma mostrando a expressão de CD44 na população CD34+CD90+ (R4) (linha sólida). Controle de auto-fluorescência (linha pontilhada).

Figura 13. Aspecto das células aderentes isoladas de tecido adiposo e mantidas in vitro. (A) Após 18 h de adesão. Notar a morfologia arredondada predominante na cultura. (B) Após uma semana em cultura as células apresentam morfologia fibroblastóide. Contraste de fase, aumento original 100X.

45

Figura 14. Fenótipo das células aderentes isoladas de TA. Perfil de tamanho (FSC) e complexidade (SSC) das células aderentes de TA após três dias de cultura (A) e após atingir confluência (B). Notar o aumento no tamanho e o aspecto mais homogêneo da população. (C) Ambas as populações (A, B) não apresentam o marcador de superfície CD45, excluindo uma possível contaminação com células hematopoiéticas. (D-E) Análise da expressão de CD34 (D) e CD105 (E) com três dias de cultura (histograma sólido) ou após a confluência (histograma vazio). (F) Análise da expressão de CD34 em células na primeira (linha sólida) e na terceira (linha cinza) passagens. Expressão de CD49d (G), CD13 (H) e CD14 (I) em células expandidas até a terceira passagem. As linhas pontilhadas indicam os controles de auto-fluorescência.

46

Figura 15. Análise da expressão de CD146 em MSC de TA ex-vivo e in vitro. (A-D) Análise na população recém isolada. (A) As células CD45

negativas (R2, cinza) foram selecionadas e a expressão de CD146 nesta população foi avaliada (B), separando-se três subpopulações que se diferenciaram quanto a intensidade de expressão e a complexidade, a saber: Células CD146-/Lo de baixa complexidade (R4, verde); células CD146int de baixa complexidade (R5, vermelho) e CD146Hi mais complexas (R3, azul). A expressão de CD34 (C) e CD105 (D) foram avaliadas nas populações descritas. (E-F) Análise na população expandida in vitro até a confluência. Os gráficos são representativos da região um (P1). (E) Perfil de tamanho (FSC) e complexidade (SSC) das MSCs de TA. (F) Parte da população CD105 é positiva para o marcador CD146. Esse marcador apresentou dois padrões de marcação: uma fraca (P6 – verde) e uma forte (P5 - lilás). (G) A população em P6 é positiva para CD90, diferente da população em P5. (H) A população aderente é homogeneamente positiva para CD105 e CD90.

47

Figura 16. Sorteamento de células de TA obtidas pós-digestão enzimática. (A) Aspecto da população total: (A.1) FSC e SSC; (A.2) CD34-PE e CD45-PECy5; (A.3) CD34-PE e CD105-FITC nas células CD45- (R3). (B) Análise após seleção da população CD34+CD105+ (R5 em A.3): (B.1) FSC e SSC; (B.2) CD34-PE e CD45-PECy5; (B.3) CD34-PE e CD105-FITC. (C) Análise após seleção da população CD34+CD105- (R4 em A.3): (C.1) FSC e SSC; (C.2) CD34-PE e CD45-PECy5; (C.3) CD34-PE e CD105-FITC.

Figura 17. Morfologia das células sorteadas em cultura. Após três dias em cultura as populações CD34+CD105+CD45- (A) e CD34+CD105-CD45- (B). Somente em (B) podemos observar células aderidas ao plástico. Notar a presença de abundantes restos celulares nas culturas da população CD105+ (A-setas). Contraste de fase, aumento original 200X.

PRÉ-SELEÇÃO

PÓS-SELEÇÃO

48

Na segunda passagem as células CD34+CD105- já são homogeneamente

positivas para CD105 (Figs. 19 B e C), perfil também encontrado em células não

sorteadas do mesmo paciente, na mesma passagem (Figs. 19D e E). A morfologia das

duas culturas também é bastante semelhante neste momento (Figs. 20A e B).

Figura 18. As células CD34+CD105- adquirem CD105 após sete dias em cultura. (A) Perfil de tamanho (FSC) e complexidade (SSC) da população CD34+CD105-CD45- após sete dias de cultura. As células CD34+ adquiriram o marcador CD105 in vitro (D). As células menores (região marcada em B) são predominantemente CD34+CD105- (E), enquanto as células maiores e mais complexas (região marcada em C) são CD34+CD105+ (F).

49

Figura 19. O ganho do marcador CD105 ocorre semelhantemente nas populações total e selecionadas. (A) Perfil de tamanho (FSC) e complexidade (SSC) da população CD34+CD105-CD45- sorteada após duas passagens. (B-C) As células sorteadas para CD34 na passagem dois são homogeneamente positivas para o marcador CD105. (D-E) Células do mesmo paciente na mesma passagem não sorteadas mostram o mesmo perfil de marcação.

Figura 20. O aspecto fibroblastóide é semelhante tanto para a cultura sorteada como para a cultura total. (A) Células sorteadas para CD34 na segunda passagem. O aspecto da cultura já se mostra homogeneamente fibroblastóide. (B) Células do mesmo paciente na mesma passagem não sorteadas mostram a mesma morfologia; ambas com 2 semanas de manutenção in vitro. Contraste de fase, aumento original 100X.

50

4.2. MULTIPOTENCIALIDADE 4.2.a. Diferenciação para as três linhagens mesodérmicas: adipogênica, osteogênica e condrogênica

Após o estabelecimento da monocamada de células do estroma do tecido

adiposo (MSCs de TA), as células foram expandidas até a terceira passagem e foram

realizados ensaios de diferenciação in vitro. As células foram cultivadas com os meios

indutores específicos (vide metodologia) para a diferenciação nas três linhagens

mesodérmicas – osso, adipócitos e cartilagem. Os ensaios para a via osteogênica e

adipogênica foram realizados em cultura convencional, bidimensional, ou seja, na

monocamada aderida ao plástico, e, após uma semana, as células já apresentavam

mudanças morfológicas (Figs. 21 A, B e C). As células induzidas para a via

adipogênica mudaram sua morfologia para um aspecto menos fusiforme (Fig. 21B),

em comparação às células induzidas para a via osteogênica (Fig. 21C), que por sua

vez se mostraram semelhantes ao controle (Fig. 21A). Na indução adipogênica foi

possível observar uma menor densidade celular, provavelmente acarretada pela

inibição da proliferação. Após quatro semanas de indução, verificou-se a presença de

células contendo vacúolo único com afinidade pelo corante Oil Red O (células

univacuoladas) na diferenciação adipogênica (Fig. 22A) e depósitos de cálcio,

evidenciados pela coloração de Von Kossa, na diferenciação osteogênica (Fig. 22B). A

indução para cartilagem foi realizada em um sistema de cultura tridimensional, do tipo

esferóide (vide metodologia). Após a formação dos esferóides, estes foram incubados

em meio indutor, contendo TGF-β, por até quatro semanas. A análise histológica dos

esferóides mostrou deposição de matriz extracelular, revelada pelo corante alcian blue

(pH ácido), que possui afinidade por glicosaminoglicanos e proteoglicanos ácidos (Fig.

22C).

51

Figura 21. Mudanças morfológicas nas MSC de TA induzidas. (A) Na presença de meio não indutor, (B) Na presença de meio adipogênico, (C) Na presença de meio osteogênico por uma semana. Contraste de fase – 100 X.

Figura 22. Potencial de diferenciação das células mesenquimais do estroma do TA expandidas até a terceira passagem. As células foram cultivadas na presença de meio indutor para a linhagem adipogênica (A), ou para a linhagem osoteogênica (B) ou em micromassa na presença de TGF-β para diferenciação condroblástica (C). Controles pareados (D-F) foram mantidos na ausência de meio indutor. Coloração de Oil Red O contracorada por hematoxilina. Aumento original 400X (A, D), Von Kossa contracorada por eosina. Aumento original 400X (B, E) e coloração de Alcian Blue contracorado com fast red. Aumento original 400X (C, F).

52

Durante a expansão in vitro das MSC de TA, verificou-se que sua morfologia

era bem semelhante à de MO em baixa confluência (Figs. 23 A e B). Porém, após a

confluência notou-se que algumas células da monocamada de MSCs de TA

acumulavam lipídeos espontaneamente (Fig. 23C). Este acúmulo lipídico foi

acompanhado de mudanças morfológicas na monocamada, observadas pela

microscopia eletrônica de varredura. Nas áreas de maior confluência, algumas células

de TA assumiram uma morfologia mais arredondada, característica de adipócitos (Fig.

23E), enquanto as MSC de MO permaneceram fibroblastóides (Fig. 23F). As análises por RT-PCR revelaram diferenças na expressão de genes

envolvidos na diferenciação adipogênica entre as MSCs de TA e de MO. Mesmo sem

indução para a via adipogênica, as MSCs de TA expressaram o gene PPARγ2

(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-2), além dos genes envolvidos com

a diferenciação osteogênica, que são constitutivamente expressos também pelas

células de MO (Fig. 24). Portanto, ou as MSCs de TA apresentam um maior

comprometimento com a via adipogênica, ou a monocamada é heterogênea, com

presença de células comprometidas com a linhagem adipogênica, possivelmente pré-

adipócitos, e células mais indiferenciadas multipotentes.

Para testar se o potencial de diferenciação para a linhagem adipogênica e

osteogênica diferia entre as MSCs de TA e de MO, foi feita uma análise comparativa.

Assim, durante a indução adipogênica, a intervalos semanais, a monocamada foi

fixada, corada pelo Oil Red O e o percentual de células, multivacuolares e

univacuolares, acumuladoras de lipídeos foi determinado (Figs. 25 e 26). O potencial

osteogênico foi também determinado em monocamada (Fig. 28) ou sobre

hidroxiapatita (Fig. 30). Ao mesmo tempo, foram retiradas amostras para análise, por

RT-PCR, da expressão dos genes envolvidos na diferenciação para estas linhagens

(Figs 27 e 29).

Em relação ao potencial adipogênico, foi possível notar uma rápida

diferenciação das MSCs de TA em relação as da MO (Figs. 25 e 26), pois após quatro

semanas já se notava a presença de mais de 50% de células univacuoladas (Fig.

26B). Já nas MSC de MO, o estágio final da diferenciação adipocítica só foi alcançado

em seis semanas. Esta diferença na resposta ao meio indutor pode ser explicado pela

expressão de PPARγ2, que, nas MSCs de MO, ocorreu somente após uma semana de

indução (Fig. 27A). Curiosamente, observou-se uma expressão constitutiva de leptina

nas células de MO, enquanto que nas MSCs de TA a expressão deste gene só

ocorreu após quatro semanas de indução (Fig. 27B).

53

Figura 23. MSC de TA e de MO em cultura sem agentes indutores. (A, C, E) MSC de TA em subconfluência, e em hiperconfluência coradas por Oil Red O e hematoxilina e analisadas por microscopia eletrônica de varredura, respectivamente. Setas indicam acúmulos lipídicos em C. (B, D, F) MSC de MO nas mesmas condições. (A - D) Contraste de fase – aumento original 100 X. Figura 24. Expressão de CBFA-1/RUNX-2, osteocalcina, osteopontina, e PPARγ2 nas MSC de MO e de TA. O RNA total das células expandidas foi isolado, e o cDNA amplificado com primers específicos. Os produtos do RT-PCR foram analisados por gel de agarose corado por brometo de etídeo. O tamanho do produto amplificado se encontra abaixo dos genes respectivamente.

TA MOTA MO

54

Figura 25. Diferenças no acúmulo lipídico entre as MSCs de TA e de MO. MSC de TA (A – C) e de MO (D – F) induzidas para a via adipogênica por duas (A, D), quatro (B, E) e seis (C, F) semanas. Após os tempos determinados as células foram fixadas e coradas por Oil-Red O e hematoxilina. Notar a presença de células univacuoladas em duas semanas somente nas MSC de TA (A- seta). Aumento Original 400 X.

Figura 26. A diferenciação adipogênica das MSCs de TA evolui mais rapidamente quando comparada com a da MSC de MO. MSCs de TA e de MO induzidas para a via adipogênica por duas (A), quatro (B) e seis (C) semanas. Após os tempos determinados as células foram fixadas e coradas por Oil-Red O e o percentual de células sem vacúolo, com um único vacúolo ou com múltiplos vacúolos foi avaliado por microscopia. Os gráficos representam contagem de 100 células em triplicatas de um experimento representativo de dois experimentos independentes.

A B C

M0

T

A

2 SEMANAS 4 SEMANAS 6 SEMANAS

55

Figura 27. Análise da expressão de mRNA de genes ligados à diferenciação adipogênica. (A) PPARγ2, 330pb; (B) Leptina, 326pb; (C) GAPDH, 587pb. (A e B): Linha 1: Padrão de peso polecular 100pb; Linha 2: controle da reação de PCR(cPCR); Linha 3: MSC de MO não induzida; Linha 4 e 5: células de MO induzidas por 1 e 4 semanas, respectivamente; Linha 6: MSC de TA não induzida; Linhas 7 e 8: MSCs de TA induzidas por uma e quatro semanas, respectivamente. (C): Linha 1: Padrão de Peso Molecular 100pb; Linha 2: MSC de MO não induzida; Linha 3 e 4: Células de MO induzidas por uma e quatro semanas, respectivamente; Linha 5: MSC de TA não induzida; Linhas 6 e 7: Células de TA induzidas por uma e quatro semanas, respectivamente.

Quanto ao potencial osteogênico, verificou-se que as MSCs de TA e de MO,

expandidas até a terceira passagem e mantidas por até três semanas na presença de

meio osteoindutor, mostram depósitos de cálcio na monocamada, de forma muito

semelhante (Fig. 28). A análise da expressão gênica também revelou padrões

semelhantes, a não ser pela perda de osteopontina pelas MSC de TA em três

semanas (Fig. 29). As MSCs de TA também foram cultivadas por até duas semanas

em esponjas de hidroxiapatita, um biomaterial osteocondutor utilizado em diversos

protocolos de bioengenharia óssea (ROBEY & BIANCO, 2007). Após uma semana, foi

possível notar a intensa proliferação das células de MO (Fig. 30B), quando comparado

com as de TA (Fig. 30A), pois o número de células iniciais foi o mesmo. A morfologia

também se apresentou ligeiramente diferente, notando-se, em especial, uma

morfologia mais miofibroblastóide nas células de MO (Fig. 30 C e D). O aspecto

morfológico encontrado nas esponjas de hidroxiapatita foi bem similar ao encontrado

na monocamada confluente (Fig. 23E-F), ambos analisados por microscopia eletrônica

de varredura. Análises por microscopia confocal revelaram marcação positiva para

osteopontina, idêntica para ambas as células (Fig. 30E-F).

Para verificar se a população celular aderente recém-isolada do TA era

heterogênea quanto ao potencial de diferenciação para a linhagem adipogênica e

osteogênica, estas foram cultivadas em meio indutor misto (vol/vol de meio

osteogênico e adipogênico) por até dez dias e a monocamada foi corada com Oil Red

O e Von Kossa. Verificou-se a presença tanto de depósitos de cálcio, quanto de

células acumuladoras de lipídeos (Fig. 31A). No entanto, foi observado um maior

número de células induzidas para a via adipogênica (Fig. 31B).

56

Figura 28. As MSCs de TA e de MO apresentam depósitos de cálcio de forma semelhante. MSCs de TA (A) e de MO (B) induzidas para a via osteogênica por três semanas. As células foram fixadas e coradas pelo método de Von Kossa. Aumento Original 400 X.

Figura 29. Análise da expressão de mRNA de genes ligados à diferenciação osteogênica. (A) CBFA-1, 319pb; (B) Osteocalcalcina, 294pb; (C) Osteopontina, 323pb; (D) GAPDH, 587pb. (A-C): Linha 1: Padrão de peso molecular 100pb; Linha 2: cPCR; Linha 3: MSC de MO não induzida; Linha 4 e 5: células de MO induzidos por 1 e 4 semanas, respectivamente; Linha 6: MSC de TA não induzida; Linhas 7 e 8: Células de TA induzidas por uma e quatro semanas, respectivamente. (D): Linha 1: Padrão de Peso Molecular 100pb; Linha 2: MSC de MO não induzida; Linha 3 e 4: Células de MO induzidas por uma e quatro semanas, respectivamente; Linha 5: MSC de TA não induzida; Linhas 6 e 7: Células de TA induzidas por uma e quatro semanas, respectivamente. Figura 30. Cultura de MSCs de TA e de MO em arcabouços de hidroxiapatita. MSC de TA (A, C e E) e de MO (B, D e F) foram distribuídas sobre arcabouços porosos de hidroxiapatita e mantidas em cultura por uma semana. Notar o maior recobrimento da superfície do biomaterial pelas células de MO (B) quando comparadas com as de TA (A). Detalhe do aspecto miofibroblastóide das células de MO (D) na hidroxiapatita. Expressão de osteopontina nas células de TA (E) e de MO (F) cultivadas em hidroxiapatita. (A-D) Microscopia eletrônica de varredura. Barra = 500μm (A E B) e 10μm (C e D). (E-F) Microscopia confocal. Dimensões = 230,34 μm x 230,34 μm. Figura 31. MSC de TA na presença de meio indutor misto diferenciam para as linhagens osteogênica e adipogênica. No momento do estabelecimento da cultura, as células foram incubadas em meio indutor misto por até 10 dias, fixadas e coradas pelos métodos de Oil Red e Von Kossa e contracoradas por hematoxilina. (A) Notar a presença de depósitos de cálcio expressivos – seta, circundados por células com acúmulos lipídicos multivacuolados. (B) Representação de vários campos, onde o número de células comprometidas para a linhagem adipogênica é expressivamente maior do que para a linhagem osteogênica. Aumento original 200X.

57

Figura 30. Figura 31.

TA MO

58

4.2.b. Diferenciação para a linhagem endotelial O papel das MSCs de TA na angiogênese tem sido amplamente relatada

(FUKUMURA et al., 2003; KUBIS et al., 2007; MIRANVILLE et al., 2004; MOON et al.,

2006, PLANAT-BENARD et al., 2004a; SUMI et al., 2007; WOSNITZA et al., 2007),

mas, embora não haja dúvida sobre o efeito estimulador destas células na

angiogênese, a observação de uma diferenciação direta para a linhagem endotelial é

controversa. Para testar a capacidade das MSCs isoladas de TA humano de se

diferenciarem em células endoteliais ou de interagirem com endotélio maduro, à

semelhança de pericitos, modelos de cultura tridimensional do tipo esferóide foram

desenvolvidos. Os esferóides são agregados de células responsáveis tanto pela

geração de um centro de hipóxia, como pela síntese de proteínas da matriz

extracelular. Desta forma este sistema é descrito como modulador positivo da

agiogênese em células endotelais maduras ou ainda em células comprometidas com

esa via (KELM et al., 2005).

O sistema de cultivo em esferóide utilizado permitiu a diferenciação das MSCs

de TA para a linhagem endotelial, mesmo na ausência do meio próprio para células

endoteliais. No interior dos esferóides foram observadas estruturas que se

assemelhavam a vasos (Figs. 32A e B) e que serão investigadas posteriormente

através de microscopia eletrônica de transmissão. Os esferóides também

apresentaram células positivas para CD31 (Figs. 33A e B) e vWf (Fig. 32D) e secretam

a proteína VEGF (Fig. 32C). O mesmo não ocorreu para as MSC de TA cultivadas em

monocamada (Figs. 33C, D e E). Curiosamente, este sistema de cultivo tridimensional

induziu a expressão gênica de angiopoietina-1 (Ang-1) pelas MSCs de TA. Este gene

possui um papel importante na formação de vasos (SURI et al., 1996) e não é

expresso pelas MSC de TA cultivadas em monocamada (Fig. 33F). A expressão de

VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) e SDF-1α (Stromal Derived Factor-1), que

também têm papel importante na angiogênese (FIEDLER & AUGUSTIN, 2006), parece

ser constitutiva, tendo sido observada tanto nas células cultivadas em modelo de

esferóide, como nas mantidas em monocamada (Figs. 33G e H).

Devido à diferenciação obtida para a via endotelial em sistema de esferóides,

foi investigado se as MSCs de TA seriam capazes de modular células endoteliais

maduras humanas (HUVEC). As MSCs de TA foram co-cultivadas com as HUVEC em

monocamada sem meio de cultura endotelial por até quatro dias. Após 24 horas de

cultura, já foi possível observar a emissão de prolongamentos das MSCs de TA em

torno das HUVEC, que, caracteristicamente, formam grupamentos de células

poligonais (Fig. 34A). Esta interação parece ter favorecido a manutenção das

59

HUVECs, pois após quatro dias os ninhos de células endoteliais permaneceram

estáveis (Fig. 34C), o mesmo não ocorrendo quando as HUVEC foram cultivadas na

ausência de meio de endotélio ou de MSCs de TA (Fig. 34B, D). A interação das MSC

de TA com as HUVEC aparentemente não foi capaz de modular positivamente a

expressão de CD31 nas MSCs de TA, pois a marcação ficou restrita a ílhotas

pequenas de células poligonais (Fig. 34E), diferentemente do que foi visto em sistema

de esferóides. Nos esferóides mistos notou-se uma segregação das duas populações

celulares. As HUVECS formaram um esferóide que ficou excentricamente disposto,

mas circundado pelo esferóide de MSCs de TA (Fig. 34F).

Além disto, as MSCs de TA também foram capazes de estimular o brotamento

de esferóides de HUVEC em gel de colágeno (Fig. 35A) com padrão semelhante ao

estímulo de VEGF (Fig. 35B). Os esferóides de MSC de TA também responderam ao

VEGF, mas de maneira contrária aos de HUVEC. Ou seja, seu brotamento

espontâneo (Fig. 35C) cessou na presença do fator (Fig. 35D), o mesmo sendo

observado quando os esferóides mistos foram colocados em gel de colágeno (Fig.

35E).

Figura 32. Os esferóides de MSC de TA apresentam estruturas semelhantes a vasos. Cortes de parafina de esferóides de MSC de TA expandidas até a terceira passagem sem indução. (A, B) Aspecto histológico dos esferóides de MSCs de TA, mostrando detalhe (B) de estrutura com luz central (seta). H-E, aumentos originais de 400X e 1000X, respectivamente. (C) Imunohistoquímica para VEGF. Notar a presença do fator de crescimento VEGF preferencialmente no interior dos esferóides. Aumento original 200 X. (D) Imunohistoquímica para vWf. Aumento original 400 X.

60

Figura 33. Diferenciação espontânea das MSC de TA para a via endotelial. (A, B) Expressão de CD31 (verde) em cortes de esferóides de MSCs de TA expandidas até a terceira passagem. Núcleo corado com DAPI (azul). Barra=20μm. (C, E) Expressão de CD31 (vermelho) em HUVEC (C) e MSCs de TA (D) em monocamada. Notar que as MSCs de TA não apresentaram marcação para esse antígeno. Núcleo corado com DAPI (azul). Aumento original 400X. (F-H) Análise da expressão gênica das MSCs de TA. As Linhas: 1, 2, 3 e 4 correspondem, respectivamente a: GAPDH em esferóide de MSC de TA, GAPDH em monocamada de MSC de TA, cPCR. e padrão de peso molecular (600pb). As linhas 5-7 correspondem respectivamente a: expressão de Ang-1 (326pb) (F) ou SDF-1α (226pb) (G) ou VEGF (224pb) (H) em esferóides de MSCs de TA, em monocamada de MSCs de TA e, finalmente, controle negativo da reação.

61

Figura 34. As MSC de TA interagem com células endoteliais maduras. MSC de TA co-cultivadas com HUVECs em monocamada, (A) após 24 horas e (C) após quatro dias. Notar a presença de ninhos de HUVECs, indicados pelas setas, contornados por células fusiformes (MSCs de TA). (B, D) HUVECs cultivas na ausência da MSC de TA, ao invés da formação de ninhos, há morte celular após 4 dias. A – D – barra 20 μm. (E) Imunofluorescência para CD31 na co-cultura de HUVEC com MSC de TA é restrita aos ninhos de células endoteliais. (F) MSCs de TA co-cultivadas com HUVECs em sistema de esferóide. Notar o limite entre o esferóide mais interno de HUVEC (seta) e o de MSCs de TA. H-E. E, F - Aumento original 100X.

62

Figura 35. As MSC de TA assim como as HUVECs respondem a VEGF. Sistema de cultivo de esferóides em gel de colágeno. (A) Esferóides de HUVEC co-cultivados com monocamada de MSC de TA e (B) na presença de VEGF. Notar o brotamento de células após 5h e 36h respectivamente (setas). (C-D) Esferóides de MSC de TA após 48h de cultivo sem (C) e (D) na presença de VEGF, onde o brotamento é inibido. (E) Esferóides mistos da MSC de TA e HUVEC após 48h de cultivo. Notar a inibição do brotamento (seta). Contraste de fase – Aumento original 100 X. 4.3. POTENCIAL DE SUSTENTAÇÃO HEMATOPOIÉTICA 4.3.a. Co-cultura com células mononucleares de sangue de cordão umbilical Células mononucleares de sangue de cordão (SC) foram co-cultivadas com a

monocamada de MSC de MO e de TA e como controle negativo com fibroblastos de

pele humana (FHP). Logo no início da cultura foi possível observar interação das

células hematopoiéticas com os estromas de TA e de MO, formando as cobblestone

areas (Fig. 36). A contagem das células hematopoiéticas no sobrenadante, ao longo

do co-cultivo, revelou uma expansão similar entre as MSC de MO e de TA, o mesmo

não ocorrendo para os fibroblastos de pele humana (Fig. 37A).

A expansão de progenitores mielóides nas co-culturas com os diferentes

estromas foi avaliada em ensaios clonogênicos de CFU-GM (granulocyte and

macrophage - colony unit formation). Para tanto, ao longo da cultura, as células do

sobrenadante foram retiradas e cultivadas em ágar semi-sólido na presença de meio

condicionado rico em GM-CSF (granulocyte and macrophage-colony stimulating

factor). Verificou-se que, ao contrário dos FHP, tanto as MSCs de TA, quanto as de

63

Mo foram capazes de expandir significativamente (p<0,01) os progenitores mielóides

presentes no sangue de cordão (Fig. 37B). A diferença no número de colônias gerado

pelas monocamadas de MSCs de MO e de TA nos dois pontos analisados não foi

significativa (p>0,05).

A análise diferencial dos citocentrifugados revelou uma geração de células

hematopoiéticas pelas MSCs de TA com a mesma dinâmica das células de MO (Figs.

37C e D). No entanto, observou-se uma diferença no perfil hematopoiético gerado por

essas duas monocamadas no final do co-cultivo (28 dias), caracterizada pelo pico

expressivo de células mono-macrofágicas nas MSCs de TA (Fig. 37C). Estas células

são provavelmente derivadas de precursores monocíticos que podem ser detectados

após 10 dias de co-cultura com as MSCs de TA (Fig. 38D). No mesmo tempo de co-

cultivo, as MSCs de MO geraram um pico de polimorfonucleares (Fig. 38C).

No microambiente da medula óssea, as diferentes populações estromais

derivadas das MSCs parecem ter papel específico. Com o objetivo de investigar esses

dados, as monocamadas de ambas as células (MSCs de TA e de MO) foram induzidas

por uma semana para as linhagens adipocítica ou osteogênica, denominadas neste

trabalho de pré-adipócitos e pré-osteoblastos. Através da contagem das células

hematopoiéticas geradas nessas co-culturas foi possível observar uma expansão

destas em contato com as monocamadas de pré-adipócitos de TA e de MO,

contrastando com a manutenção das células hematopoiéticas nas co-culturas com

pré-osteoblastos derivados de MSCs de TA (Fig. 28A) e de MO (Fig. 39B). Esses

dados são sustentados pelas contagens de colônias CFU-GM, que revelaram uma

expansão de progenitores mielóides nos estromas de pré-adipócitos, novamente de

maneira semelhante para as MSCs de TA e de MO (Fig. 39C), sendo que o maior

número de colônias geradas foi nos estromas induzidos para a linhagem adipogênica.

A análise diferencial dos citocentrifugados demonstrou uma expansão

preferencial de progenitores comprometidos com a série mielóide após oito dias nos

estromas de pré-adipócitos. Essa expansão foi acompanhada por um aumento no

percentual das células macrofágicas e diminuição de blastos (Figs. 40 A e B). Essas

observações são complementares a contagem de CFU-GM, que foi relativamente

expressiva em oito dias (Fig. 39C). Outro dado importante foi o aumento, em torno de

10%, no percentual de macrófagos após 14 dias de co-cultura com estroma de pré-

adipócitos derivados de MSCs de MO (Fig. 40B).

Nos estromas pré-osteoblásticos, o perfil de geração de células

hematopoiéticas é completamente diferente dos estromas pré-adipocíticos. Em oito

dias há uma discreta manutenção de células blásticas na MSC de TA (Fig. 40C) e

expansão das mesmas nas células de MO (Fig. 40D). Em nenhum momento de co-

64

cultivo há a expansão de progenitores mieloídes, correlacionando com a escassez de

colônias de CFU-GM nesse co-cultivo (Figs. 39 C e D). Apesar da falta de expansão

de progenitores, no final do co-cultivo há a geração de células hematopoiética

terminalmente diferenciadas – os polimorfonucleares (Figs. 40 C e D).

Análises por RT-PCR de genes envolvidos em hematopoiese revelam perfis

muito semelhantes para as MSs de TA e de MO, ambas sem indução. A indução para

as duas vias, adipogênica e osteogênica, são capazes de modular as hemopoietinas

de maneira particular (Fig. 41 e Tab. 2). Dentre elas, GM-CSF (Granulocyte-

macrophage colony-stimulating factor) é regulada positivamente na indução

osteogênica e LIF (leukemia inhibitory factor) negativamente na indução adipogênica

(Fig. 41).

Figura 36. Interação das células hematopoiéticas com estromas de TA e de MO. Após quatro dias de co-cultivo as células mononucleares de sangue de cordão interagiram com as MSCs de TA (A) e de MO (B), formando cobblestone areas. Contraste de fase. Aumento Original 200 X.

65

Figura 37. Análise das células mononucleares de sangue de cordão ao longo das co-culturas com as MSCs de MO, de TA e fibroblastos de pele humana (FPH). (A) As células hematopoéticas foram quantificadas em hemocitômetro ao longo das co-culturas pelo método de exclusão do azul de trypan e o número de células viáveis totais no sobrenadante foi determinado. (B) O número de colônias CFU-GM das co-culturas foi quantificado em ensaio de ágar semi-sólido. SC (Sangue de Cordão). (C-D) O percentual das

populações hematopoiéticas geradas sobre a monocamada de MSCs de TA (C) e de MO (D) foi determinado por contagem diferencial nos citocentrifugados corados pelo MGG. Notar o pico de macrófagos ao final da co-cultura com MSC de TA e de segmentado com MSC de MO.

66

Figura 38. Morfologia das células hematopoiéticas geradas ao longo das co-culturas de MSCs de TA e de MO. Células mononucleares de sangue de cordão foram co-cultivadas com MSCs de MO (A, C e E) e de TA (B, D e F) e as células não aderentes foram recolhidas após quatro (A, B), 10 (C, D) e 18 (E, F) dias de co-cultivo para análise morfológica. Notar a predominância de bastos no início da cultura (setas) (A-B) e a presença, após 10 dias, de precursores monocíticos (seta) nas co-culturas com MSC de TA (D) e de polimorfonucleares (setas) nas co-cultura com células de MO (C). Após 18 dias, a população hematopoiéticas no co-cultivo com a MSC de TA apresenta macrófagos (F), enquanto que sobre as MSCs de MO ainda é possível observar alguns segmentados (E). MGG (May-Grünwald – Giemsa). Aumento Original 1000 X.

67

Figura 39. Quantificação de progenitores e células hematopoiéticas geradas ao longo de co-culturas com estromas de TA e de MO previamente induzidos para as linhagens adipogênica ou osteogênica. (A-B) As células hematopoéticas foram quantificadas em hemocitômetro ao longo das co-culturas pelo método de exclusão do azul de trypan e o número de células viáveis totais no sobrenadante das co-culturas com MSCs de TA (A) ou de MO (B) foi determinado. Notar a manutenção do número de células geradas em contatos com os estromas de pré-osteoblastos. (C) O número de colônias CFU-GM das co-culturas foi quantificado em ensaio de ágar semi-sólido. Notar que o número de colônias CFU-GM nos estromas de pré-osteoblastos é praticamente igual ao número presente na população mononuclear de sangue de cordão antes da co-cultura. (*) Diferença não significativa (p>0,05). Resultado representativo de 1 entre 3 experimentos, onde p é a média padrão dos três experimentos.

TA MO

Osteogênica Adipogênica

68

Figura 40. Os estromas pré-adipocíticos e pré-osteoblásticos induziram perfis hematopoiéticos distintos. Contagem diferencial dos citocentrifugados corados pelo método de MGG (May-Grünwald – Giemsa). (A, B) O perfil das células hematopoiéticas geradas ao longo do co-cultivo pré-adipocítico é preferencialmente macrofágica. (C, D) Os estromas pré-osteoblásticos não expandem células comprometidas com a linhagem mielóide. Figura 41. Análise da expressão de mRNA de genes ligados à hematopoiese. O RNA total das células expandidas foi isolado, e o cDNA amplificado com primers específicos. Os produtos do RT-PCR foram analisados por gel de agarose corado por brometo de etídeo. O tamanho do produto amplificado está respectivamente ao lado dos genes. Linhas 1 e 2: MSC de MO e de TA sem indução, respectivamente. Linhas 3 e 4: MSC de MO e de TA pré-osteoblásticas, respectivamente. Linhas 5 e 6: MSC de MO e de TA pré-adipocíticas, respectivamente.

69

Figura 41.

Tabela 2. Perfil da expressão gênica de hemopoietinas nos diferentes estromas de MSC de TA e de MO. + Presença de expressão; - Ausência de expressão.

M-CSF

HGF

VEGFSDF-1TGF-SCFIL-7IL-6TPOFLT3L

Delta1Jagged 1GAPDH

GM-CSFG-CSF

LIF

ANG1

TA TA Pré-adipo TA Pré-osteo MO MO Pré-adipo MO Pré-osteo

70

4.3.b. Análises do co-cultivo com células CD34+ de sangue de cordão umbilical Com o objetivo de investigar se o fenótipo osteoblástico induzido nas MSCs de

TA era capaz de levar à manutenção das HSCs, mimetizando o nicho da MO in vivo

(TAICHMAN, 2005), a monocamada foi induzida por até duas semanas para posterior

co-cultura com células CD34+. Periodicamente, as células hematopoiéticas geradas

nas co-culturas foram quantificadas e analisadas por citometria de fluxo. Quando

comparadas com a MO, as MSCs de TA apresentaram um número absoluto

semelhante de células CD34+, assim como de células totais, geradas ao longo da co-

cultura (Fig. 42). Em sete dias, o percentual de células comprometidas com a linhagem

mielóide, identificadas pelo marcador de superfície CD13, foi maior nas MSC de TA

(Tab. 3). Nas co-culturas com MSC de TA, somente 17,5% das células mielóides

expressavam CD34, enquanto que nas co-culturas com MSC de MO, este percentual

foi de 40,9%, sugerindo uma diferenciação precoce dos progenitores mielóides em

contato com as MSC de TA. Já o percentual de células comprometidas com a

linhagem monocítica/macrofágica (CD14) foi semelhante (dado não mostrado). No

entanto, uma diferença na intensidade de fluorescência deste marcados foi observada

(Tab. 3). As células geradas nas co-culturas com MSCs de MO apresentavam uma

intensidade de fluorescência para CD14 maior, possivelmente indicando um outro tipo

de população de células CD14+.

A análise das co-culturas de células CD34+ sobre MSCs de TA induzidas por

duas semanas para a linhagem osteogênica mostrou um perfil semelhante em relação

ao percentual de células CD34+ (Fig. 43A). Porém, verificou-se um aumento no

número absoluto de células CD34+ em quatro dias nas MSCs de TA induzidas, que,

em sete dias, se equiparou ao observado nas MSCs não induzidas (Fig. 43B). A

análise diferencial, nos citocentrifugados de células não-aderentes produzidas nestas

culturas, evidenciou uma diferença marcante na população de blastos e mieloblastos

após sete dias, ressaltando-se a predominância de mieloblastos nas co-culturas com

MSCs de TA não induzidas (Fig. 44).

Para verificar a freqüência de células com propriedade de HSC, foi realizado o

ensaio de LTC-IC (Long Term Culture- Initiating Cell), que permite quantificar in vitro

células capazes de reconstituição hematopoética de longo prazo (CROISILLE et al.,

1994), ou seja com características de HSC. Assim, as células hematopoiéticas

geradas nos co-cultivos após sete dias foram recolhidas, quantificadas e distribuídas,

em diluição limitante, sobre monocamada de uma linhagem de estroma murino, a MS-

5. Utilizando o método estatístico de Poisson (SUTHERLAND et al., 1990), os

resultados preliminares permitiram verificar que, após quatro semanas, a freqüência

71

de LTC-ICs nas co-culturas com MSCs induzidas foi maior, em torno de 1:150, quando

comparado com as co-culturas com MSC de TA não induzidas (Fig. 45A).

Inversamente, a análise do conteúdo de CFU-GM mostrou que este é

significativamente maior (p<0,001) nas co-culturas com MSCs de TA sem indução

quando comparado com as MSCs de TA induzidas (Fig. 45B). No entanto, após as

quatro semanas do ensaio de LTC-IC, o número de CFU-GM gerados nas co-culturas

com MSCs de TA induzidas permaneceu constante (Fig. 45C), indicando a

manutenção de células progenitoras hematopoiéticas in vitro.

Figura 42. Co-cultura de células CD34+ com MSCs de TA e de MO. (A) O percentual de células CD34+ nas co-culturas foi determinado por citometria de fluxo. (B) As células hematopoiéticas viáveis nas co-culturas foram quantificadas pelo método de exclusão do azul de trypan. O gráfico é representativo de 3 experimentos independentes com triplicatas. Tabela 3. Perfil da expressão de marcadores das células hematopoiéticas geradas ao longo de co-culturas com MSC de TA e de MO.

TA MO % CD34+CD13+ 14 27 % CD13+ Total 80 66 MIF Células CD14+ 849,2 1444,9

% - percentual; MIF – Delta da mediana da intensidade da fluorescência.

72

Figura 43. Co-cultura de células CD34+ com MSCs de TA induzidas ou não para a linhagem osteogênica. (A) Percentual e (B) número absoluto de células CD34+ analisadas por citometria de fluxo. Notar que em quatro dias as MSCs de TA induzidas geraram um maior número de células CD34+. O gráfico representa 1 experimento com triplicata.

Figura 44. Análise morfológica das células hematopoiéticas nas co-culturas com MSCs de TA induzidas e sem indução. (A, C) As diferentes populações hematopoiéticas nas co-culturas com MSCs de TA sem indução (A) ou induzidas (C) foram quantificadas em citocentrifugados. (B, D) Citocentrifugados representativos das células presentes nas co-culturas com MSCs de TA sem indução (B) ou induzidas (D). MGG. Aumento original 1000X.

73

Figura 45. Freqüência de LTC-IC e CFU-GM nas co-culturas com MSCs de TA induzidas e sem indução. (A) As células hematopoiéticas co-cultivadas por sete dias com MSCs de TA induzidas ou sem indução foram cultivadas, em diluição limitante (50 a 400 células; trinta poços para cada diluição), por até quatro semanas sobre estroma de MS-5 e a freqüência de LTC-IC foi calculada usando o método estatístico de Poisson O gráfico é representativo de dois experimentos independentes. (B) Conteúdo de progenitores mielóides, por ensaio clonogênico de CFU-GM, nas co-culturas com MSCs de TA sem indução (vermelho) e induzidas (azul), antes (PRÉ) e depois (PÓS) do ensaio de LTC-IC.

5. DISCUSSÃO

5.1. FENÓTIPO DAS MSC DE TA 5.1.a. A fração aderente do TA é constituída por células de origem estromal e endotelial. Após a digestão do TA, a população celular obtida é constituída por células

hematopoiéticas, células estromais e/ou perivasculares e endoteliais. A população

hematopoiética presente no TA não é constituída por células progenitoras, conforme

verificado por ensaios de CFU-GM (dados não mostrados). Não foram realizadas

análises mais detalhadas destas células e embora elas possam ser contaminantes do

sangue periférico, também é possível que representem populações de linfócitos e de

células da linhagem monocítica/macrofágica, pois são células que participam

ativamente da função neuro-imune-endócrina desempenhada pelo TA (CURAT et al.,

2004; CASPAR-BAUGUIL et al., 2005; TRAYHURN, 2005). As células estromais e/ou

perivasculares e os progenitores endoteliais são CD45-, ou seja, não fazem parte da

população hematopoiética, e representam uma população única dentro do TA,

constituída em sua maioria por células CD34+. As células perivasculares ou pericitos

foram identificadas pelo marcador de superfície CD146 (SHI & GRONTHOS, 2003;

BRACHYOGEL et al., 2005; ZANNETTINO et al., 2008) e apesar de ter sido

recentemente demonstrado a baixa expressão deste marcador em células

74

perivasculares do músculo esquelético (DELLAVALLE et al., 2007), na MO são

responsáveis pela organização do microambiente hematopoiético (SACCHETTI et al.,

2007). No TA, células positivas para este marcador estão presentes em ambas as

frações celulares: CD34+CD45- e CD34-CD45- e são homogeneamente positivas para

CD105. As células endoteliais maduras identificadas pelo marcador CD31, assim

como as células CD146+, estão presentes na população CD34+CD105+, mas o seu

percentual de expressão é bastante variável de acordo com a amostra analisada.

A população CD34+ também é homogeneamente positiva para CD90, marcador

considerado característico de MSC na MO (DOMINICI et al., 2006). Desta forma, no

TA subcutâneo reside uma população de MSC identificada pelos marcadores CD105 e

CD90, mas diferente da MO, esta população também é positiva para CD34.

Recentemente foi identificada uma pequena população de MSC na MO oriundas da

fração CD34+CD45+, embora a maioria tenha sido obtida da fração duplamente

negativa (KAISER et al., 2007). Em nosso trabalho, na população de células CD34+,

foram identificadas duas subpopulações CD44+ (Fig. 12L). Esta molécula de adesão já

foi identificada em diferentes fontes de MSC (HUANG et al., 2007; JO et al., 2007;

JONES et al., 2007; KAISER et al., 2007; ZANNETTINO et al., 2008), e também

parece estar relacionada à população de células estromais e/ou perivasculares, assim

como CD105 e CD90 (ZANNETTINO et al., 2007). Como em nosso trabalho foi

encontrada uma expressão heterogênea para este marcador, e células progenitoras

mesodermais do TA expressam duplamente CD44 e CD34 (GESTA et al., 2007),

talvez essas subpopulações possam indicar células com multipotencialidade distintas.

Outro marcador analisado que revelou heterogeneidade populacional, foi a molécula

de CD146. Todas as três subpopulações identificadas são CD105+ (Fig. 15D), mas

somente a população com alta expressão para CD146 é homogeneamente positiva

para CD34 (Fig. 15C). Esta observação talvez seja mais um indício de que no TA

possa existir progenitores tantos de origem endotelial (CD146+CD34+, CD146-CD34+),

como estromal e/ou perivascular (CD146+CD105+). Análises de multipotencialidade e

auto-renovação destas diferentes populações são necessárias para tentar definir a

possível identidade das MSC no TA.

A partir das análises fenotípicas descritas acima, podemos definir que a fração

aderente do TA é constituída essencialmente por duas subpopulações de células

CD45-CD90+CD44+, que se distinguem pela expressão de CD34 e CD105: as células

CD34+CD105-CD146- e as CD34+CD105+CD146+. Antes de atingir a confluência, a

morfologia é predominantemente arredondada, diferente das células estromais de MO

que possuem morfologia fibroblastoíde desde o estabelecimento do cultivo

(FRIEDENSTEIN et al., 1974; BIANCO & ROBEY, 2000). A morfologia fibroblastoíde é

75

alcançada pela fração aderente do TA somente após a confluência e se mantêm ao

longo das passagens. A mudança para uma morfologia mais fibroblastóide foi

acompanhada pela perda gradual da expressão de CD34 e o concomitante aumento

na expressão de CD105 (Figs. 14D e E), até que após a terceira a passagem, a fração

aderente se torna homogeneamente CD105+CD49+CD13+. O aumento de marcadores

estromais juntamente com a perda de CD34 também foi observado em outro modelo

de MSC de TA (MITCHELL et al., 2006) e demonstrado em progenitores vasculares da

parede da aorta humana (ZENGIN et al., 2006). Os progenitores da adventícia da

aorta média e de coração de murinos também são morfologicamente heterogêneos,

com células arredondadas e fibroblastóides (HU et al., 2004). Essas duas

características, morfológicas e fenotípicas, inerentes às células de TA e similares a

progenitores vasculares residentes, nos levaram a investigar um possível

comprometimento angiogênico dessas células e também a idéia de uma localização

perivascular desses progenitores no TA, posteriormente confirmada por outros

pesquisadores (ZANNETTINO et al., 2007). A perda do marcador de superfície CD34 também é acompanhada por um

discreto aumento na população CD146 e CD90 positivas. Esses dois marcadores

estão presentes na população CD105+, mas uma subpopulação com uma maior

expressão para CD146 é CD90 negativa (Fig. 15G). Como já anteriormente

mencionado, o marcador de superfície CD146 foi recentemente utilizado para a

identificação de uma população de MSC na MO, com capacidade de auto-renovação

(SACCHETTI et al., 2007). Já a molécula de CD90 além de ter sido proposta como um

dos marcadores característicos de MSCs (DOMINICI et al., 2006), representa a

molécula de Thy-1, uma glicoproteína de membrana, inicialmente descrita em

populações de HSCs capazes de reconstituição hematopoiética de longa duração

(MULLER-SIEBURG et al., 1986). Uma população de MSCs duplamente positiva para

os marcadores CD146 e CD90 também foi encontrada na MO humana (MÜLLER et

al., 2006), mas não há relatos de uma subpopulação CD146+CD90-. Quando

comparada com outras fontes de MSC, somente a MO possui uma população

homogênea com alta expressão para CD146 sem a presença de populações com

menor expressão (SACCHETTI et al., 2007), diferente do que foi encontrado em nosso

trabalho.

A partir das análises fenotípicas das células obtidas pós-digestão enzimática e

da fração aderente in vitro do TA e também da comparação com os trabalhos que

utilizam MSC de MO, podemos concluir que, apesar das similaridades entre essas

duas fontes de MSC, no TA existem subpopulações que diferem do perfil fenótipo

encontrado na MO. Somente no TA foi observada a presença de uma população

76

positiva para marcadores tanto de células estromais e/ou perivasculares (CD105,

CD146, CD90 e CD44) como de origem endotelial (CD34 e CD31), o que nos remete a

progenitores essencialmente endoteliais neste tecido (ASAHARA et al., 1997; ZENGIN

et al., 2006).

5.1.b. As células CD34+ da fração aderente do TA adquirem o marcador CD105 in

vitro.

Os marcadores que melhor definiram duas sub-populações distintas na fração

aderente do TA, CD34+CD105-CD45- e CD34+CD105+CD45-, foram utilizados para a

sua seleção imediatamente após a digestão do tecido. As células foram cultivadas por

três dias, após os quais a população CD34+CD105-CD45- se apresentou

morfologicamente semelhante as culturas de TA não selecionadas (Fig. 17B), diferente

da população CD34+CD105+CD45-, que mostrou uma morfologia não usual para

células aderentes (Fig. 17A). Curiosamente, Ogawa e colaboradores em 2006,

relataram que células fibroblastóides, capazes de geração de CFU-F, poderiam ser

derivadas de HSCs da MO (EBIHARA et al., 2006; LARUE et al., 2006) e uma

subpopulação de progenitores endoteliais KDR+, mobilizados do sangue periférico de

pacientes tratados com G-CSF, expressam simultaneamente marcadores monocíticos

(CD45 e CD14) e endoteliais (CD31 e CD105) (BRUNO et al., 2007). Também

recentemente alguns trabalhos mostraram que as células monocíticas dividem alguns

marcadores com progenitores endoteliais. Esses marcadores podem ser modulados in

vitro em condições angiogênicas, com perda simultânea dos marcadores monocíticos,

mas essas células não são capazes nem de formar redes vasculares (ROHDE et al.,

2006) e nem de gerar colônias de progenitores endoteliais (LÓPEZ-HOLGADO et al.,

2007). Em nosso trabalho, as células com marcadores endoteliais e de origem não-

hematopoiética (CD34+CD105+CD45-) apresentaram uma morfologia de célulasainda

não descrita, mas a cultura morreu rapidamente não permitindo a caracterização desta

população. Não é possível, neste momento, afirmar se a morte da cultura se deveu ao

fato desta população celular ser terminalmente diferenciada, ou seja, com baixa

capacidade proliferativa ou ao processo de seleção utilizado (sorteamento em alta

pressão).

A população CD34+CD105-CD45- foi expandida em cultura e também

apresentou uma cinética de ganho do marcador CD105. As células CD105+

representam a população de maior tamanho, enquanto as CD34+ as menores (Fig.

18). Essa observação é consistente com a hipótese da relação entre o ganho do

marcador CD105 e a mudança para uma morfologia mais fibroblastoíde, pois as

77

células com aspecto fibroblastoíde são maiores do que as com aspecto arredondado

do início da cultura. Assim como na cultura com a população total do TA, após duas

passagens, a população sorteada para CD34 se torna homogeneamente positiva para

CD105 e adquire uma morfologia fibroblastoíde. Essa regulação positiva do marcador

CD105 in vitro também foi descrita para progenitores vasculares da parede da aorta

humana, mas não foram investigadas correlações funcionais atribuídas ao ganho

deste marcador (ZENGIN et al., 2006). O ganho do marcador CD105 na população

CD34+ ressalta o que nós e outros pesquisadores (MITCHELL et al., 2006) já

havíamos observado em relação à regulação positiva de marcadores estromais in vitro

nas MSC de TA. São necessários testes funcionais de diferenciação in vitro e in vivo,

para avaliar se a verdadeira população de MSC in vivo é CD105-; sendo assim este

marcador seria somente um artefato adquirido in vitro.

5.2. MULTIPOTENCIALIDADE

5.2.a. As MSC de TA sob indução adquirem fenótipos osteogênico, adipogênico e condrogênico in vitro.

A partir do estabelecimento da monocamada derivada de células do TA, foram

realizados testes da sua multipotencialidade ortodoxa. As MSC de TA com apenas

uma semana de indução já apresentaram mudanças na morfologia. A indução

adipogênica acarretou em uma morfologia mais arrendondada, ao contrário da

osteogênica em que as células se apresentaram com um aspecto morfológico

semelhante as células não induzidas. Esta mudança de morfologia está de acordo

com os estudos de diferenciação de MSCs que demonstraram a necessidade da

ativação da via de RhoA para o comprometimento para a via osteogênica, e a sua

desativação para a via adipogênica. O formato celular mais arredondado é o principal

responsável pela inibição da via de RhoA (MCBEATH et al., 2004). Após quatro

semanas de indução, parte das células MSC de TA se tornam terminalmente

diferenciadas para ambas as vias. A ausência de diferenciação em grande parte da

monocamada é explicada pela heterogeneidade dos estromas tanto de MO como de

TA. O estroma de ambas as fontes é composto por células multipotentes,

oligopotentes e unipotentes para as diversas vias de diferenciação (KUZNETSOV et

al., 1997; ZUK et al., 2002).

A indução condrogênica foi realizada em sistema de esferóides, que, em

função da geração de um centro de hipóxia e do seu arcabouço em três dimensões,

facilita a diferenciação das MSCs em condroblastos através da expressão de

78

moléculas específicas e também de mecanoreceptores (SCHIPANI et al., 2001). Após

quatro semanas, foi possível notar um aumento no acúmulo de matriz extracelular e

proteoglicanos, porém sem mudanças morfológicas. As MSC de MO quando induzidas

para essa via em sistema tridimensional, apresentam mudanças morfológicas para

células condroblásticas e também marcação para colágeno do tipo II, específico para o

tecido cartilaginoso (MURAGLIA et al., 2003). Os esferóides de TA em nosso trabalho

também apresentaram marcação para colágeno do tipo II, porém pouco expressiva

(dados não mostrados). Outros trabalhos comparando a diferenciação de MSC de MO

e de TA relatam uma ativação da expressão de genes que caracterizam uma

diferenciação completa para a via cartilaginosa somente nas células de MO (WINTER

et al., 2003; HENNIG et al., 2007). A capacidade condrogênica reduzida das MSC de

TA parece ser compensada pela aplicação exógena de fatores, tais como BMP-6

(HENNIG et al., 2007).

5.2.b. As MSC de TA são morfologica e geneticamente diferentes das MSC de MO.

Em baixa densidade, a monocamada de células já expandida dessas duas

diferentes fontes, MO e TA, é morfologicamente semelhante. Porém, quando o estágio

de confluência é atingido, as MSC de TA começam a acumular gotículas de lipídeos

espontaneamente (Fig. 23C). Análises de microscopia de varredura demonstraram um

formato mais arrendondado nas áreas de maior confluência da monocamada de TA,

ao contrário do aspecto miofibroblastoíde característico das células estromais de MO

(Fig. 23E, F). Um dos primeiros passos para a diferenciação adipogênica é a mudança

para uma morfologia mais arredondada (GREGOIRE, 2001), que in vitro é facilitada

pela confluência (MCBEATH et al., 2004). Alguns estudos discutem a hipótese de que

a alta densidade da monocamada de MSC acarreta em uma perda da sua

multipotencialidade (COLTER et al., 2001). Desta forma, as células poderiam se

diferenciar espontaneamente na linhagem para a qual se encontram mais

comprometidas. As análises moleculares revelaram um padrão de expressão gênica

semelhante para genes envolvidos na osteogênese, apesar das MSCs de MO

aparentarem uma maior expressão. A diferença marcante foi em relação à

adipogênese, já que somente as MSCs de TA expressam o gene PPARγ2 (Fig. 24),

principal responsável pelo comprometimento de células para essa via. Isto explica em

parte, o acúmulo espontâneo de microvesículas de lipídeos. Alguns trabalhos, através

de análises de microarray, revelaram um comprometimento osteogênico e

condrogênico das MSC de MO, e adipogênico das de TA (LIU et al., 2007). O grau de

79

comprometimento dessas diferentes fontes de MSC pode estar diretamente

relacionado com o microambiente em que elas estão inseridas in vivo. O

microambiente hematopoiético é complexo, onde o osso é constantemente

remodelado e possui um papel determinante na manutenção das HSCs (TAICHMAN,

2005), assim como as células do estroma subendotelial as quais são as maiores

secretoras de Angiopoietina-1 (SACCHETTI et al., 2007). Já o microambiente do TA é

constituído basicamente por pré-adipócitos, adipócitos e células endoteliais, sendo a

angiogênese um processo determinante na expansão e/ou retração desse tecido

(CASTEILLA et al., 2004). Se realmente essas duas diferentes fontes de MSC

possuem uma origem embriológica comum (COSSU & BIANCO, 2003), é razoável

atribuir essa diferença de comprometimento observada em nosso trabalho e por outros

pesquisadores, aos diferentes microambientes. Além disso, seguindo uma hipótese de

heterogeneidade da população de MSC no TA, junto com o fato destas células

apresentarem potencial osteogênico, talvez a expressão gênica de PPARγ2 esteja

somente em parte desta população. Ensaios clonais com análises posteriores de

diferenciação e expressão gênica estão sendo realizados para a comprovação desta

hipótese.

5.2.c. As MSC de TA apresentam um potencial adipogênico diferente das MSC de MO.

A adipogênese nas MSCs de TA apresentou uma evolução mais rápida,

quando comparada com as MSCs de MO. Em duas semanas, as células de TA que

entraram nessa via de diferenciação, já haviam fundido suas gotículas lipídicas,

alcançando assim o fenótipo de adipócito maduro (Figs. 25A e 26A). Já as MSCs de

MO não apresentaram células univacuoladas em duas semanas (Figs. 25D e 26A), e

em quatro semanas a maioria das células ainda era multivacuolada, com o citoplasma

bastante hipertrofiado (Figs. 25E e 26B). A expressão de PPARγ2, diferente da

expressão constitutiva do TA, nas MSC de MO é regulada positivamente somente

após uma semana de indução. Isto pode explicar o atraso na diferenciação em células

univacuoladas. Já a expressão de leptina é constitutiva nas células de MO e parece

aumentar após quatro semanas de indução. A leptina aumenta a proliferação das

HSCs e consequentemente a hematopoiese (LAM & LU, 2007), desta forma é

coerente sua expressão constitutiva nas MSC de MO. Nas MSC de TA a expressão de

leptina é regulada positivamente somente após quatro semanas de indução

adipogênica, provavelmente por causa do grande aumento em células univacuoladas.

No TA, os adipócitos são os grandes responsáveis pela secreção de leptina (CAO,

80

2007), que, além de estimular a proliferação de monócitos e macrófagos, é um dos

fatores responsáveis pelos eventos pró-inflamatórios desencadeados no

desenvolvimento da obesidade (LAM & LU, 2007). Em seis semanas a maioria das

MSC de TA era univacuolada, mimetizando o microambiente deste tecido in vitro. Já

as células estromais de MO ainda apresentavam mais da metade das células ou

multivacuoladas ou não diferenciadas. As diferenças morfológicas observadas na

adipogênese desses dois tipos de células, ainda não foram descritas na literatura. Os

trabalhos de comparação dessa via de diferenciação não reportam diferenças entre

essas duas fontes de MSC. Isto pode ser explicado em alguns casos pela falta de

acompanhamento da adipogênese in vitro (GRONTHOS et al., 2001; LEE et al., 2004),

ou ainda porque análises funcionais bioquímicas não demonstram diferenças entre

esses dois tipos de células acumuladoras de gordura (DICKER et al., 2005). Talvez a

principal e única diferença seja mesmo na evolução da adipogênese, que é mais

rápida nas MSC de TA constitutivamente PPARγ2 positivas.

Ambas as MSC apresentaram um padrão semelhante de calcificação in vitro

(Fig. 28), assim como o perfil de expressão gênica para a via osteogênica (Fig. 29). As

MSCs de TA parecem apresentar níveis menores de expressão, quando comparadas

com as de MO, porém ensaios quantitativos são necessários para a confirmação

desses resultados. Curiosamente, a expressão de osteopontina foi regulada

negativamente após quatro semanas de indução somente nas MSC de TA, e, além

disso, estas células mesmo sem indução osteogênica expressam CBFA-1, o gene

indispensável para a via osteogênica, junto com a expressão de PPARγ2. Esta

expressão simultânea é curiosa, já que agentes indutores de adipogênese,

responsáveis pela ativação da transcrição de PPARγ, inibem a expressão e as ações

de CBFA-1 (NUTTALL & GIMBLE, 2004). A partir de modelos murinos, foi descrito

uma cinética temporal e espacial na secreção de proteínas envolvidas na

osteogênese. A presença de ácido ascórbico, um dos agentes indutores desta via,

aumenta a síntese de colágeno e durante este estágio, outras proteínas acumulam na

matriz recém-sintetizada tais como a sialoproteína do osso, osteopontina e

osteocalcina. O aumento nos níveis de osteocalcina regula negativamente os de

osteopontina e vice-versa (BECK, 2003). Muito provavelmente não foi isto que ocorreu

na regulação negativa de osteopontina nas MSC de TA, já que os níveis de

osteocalcina permaneceram constantes e essa regulação não foi observada nas

MSCs de MO. Zuk et al. (2002) também não observaram essa expressão temporal de

proteínas em ambas as fontes de MSC humanas. Além disso, a osteopontina não é

uma proteína específica de osteogênese; seus níveis também aumentam durante

processos de cicatrização, inflamação (GIACHELLI & STEITZ, 2000), obesidade

81

(NOMIYAMA et al., 2007) e esta proteína ainda é responsável por compor o nicho

subendosteal da MO (NILSSON et al., 2005).

Como não foram vistas diferenças marcantes na osteogênese, tanto a nível

celular como molecular entre as duas fontes de MSC, ambas as células tiveram seu

potencial testado na presença de um biomaterial ósseo composto de hidroxiapatita.

Após sete dias de cultura, foi possível notar intensa proliferação das MSCs de MO na

superfície do arcabouço de hidroxiapatita, ao contrário das MSCs de TA (Figs. 30A e

B). No interior do material, as MSCs de TA, na maioria das áreas analisadas,

encontrava-se com um aspecto menos espalhado enquanto as de MO tinham aspecto

miofibroblastoíde (Fig. 30C, D). Apesar das diferenças morfológicas, ambas as células

marcaram positivamente para osteopontina, o que novamente pode indicar a falta de

especificidade desta proteína para a via osteogênica. É importante ressaltar que

essas diferenças morfológicas e proliferativas encontradas entre as células na

presença de um material com propriedades osteocondutoras e osteoindutoras

(SPIVAK & HASHARONI, 2001; HASEGAWA et al., 2007; INANÇ et al., 2007), reforça

a hipótese do maior comprometimento das MSCs de TA para a via adipogênica e das

de MO para a via osteogênica. Para que as MSCs de TA demonstrem mais afinidade

com o biomaterial ósseo, talvez seja necessária uma indução osteogênica prévia, ou

ainda aumentar o tempo de contato com biomateriais de hidroxiapatita.

Com o objetivo de ratificar o maior comprometimento adipogênico das MSCs

de TA, a monocamada recém-isolada foi incubada por até dez dias em meio indutor

misto para as linhagens adipogênica e osteogênica. Foi possivel observar pequenas

áreas de deposição de cálcio, circundadas por células com acúmulos lipídicos

citoplasmáticos (Fig. 31). Apesar de o número de células diferenciadas para a via

adipogênica não ter sido quantificada, as áreas com marcação para Oil Red O foram

maiores do que as com depósito de cálcio, o que indiretamente revela uma população

heterogênea com um maior número de células comprometidas para adipócitos.

Provavelmente, essa população de células é responsável pela expressão constitutiva

de PPARγ2 nos cultivos de MSC de TA.

5.2.d. As MSC de TA parecem ser comprometidas com a via endotelial Além da expressão de marcadores de superfície de progenitores de células

endoteliais, as MSC de TA quando cultivadas em sistema de esferóides regulam

positivamente e de maneira rápida marcadores mais tardios para essa via. Após dez

dias de incubação em meio não indutor, os esferóides de MSC de TA apresentaram

marcação para CD31; o mesmo não ocorrendo quando essas células são mantidas

82

em monocamada. Apesar de uma fração das células de TA apresentarem este

marcador endotelial no momento do isolamento, ou ele é regulado negativamente,

possivelmente juntamente com o CD34, após a expansão in vitro, ou esta população

representa células endoteliais maduras que não se expandem no sistema de cultura

convencional. O sistema tridimensional também é responsável pela regulação positiva

do gene angiopoietina-1, diretamente envolvido em processos angiogênicos (FIEDLER

& AUGUSTIN, 2006) e regulador do nicho hematopoiético na MO (SACCHETTI et al.,

2007); e também pela expressão gênica e síntese de VEGF; e de vWf. Alguns

trabalhos também já haviam relatado essa diferenciação aparentemente espontânea,

porém em sistema de matrigel, o qual é composto por diversos fatores desconhecidos

incluindo angiogênicos (PLANAT-BENARD et al., 2004a; MOON et al., 2006). Também

em sistema de matrigel, células da MO CD34-CD146+ adotam preferencialmente um

fenótipo de células perivasculares ao invés de endoteliais (SACCHETTI et al., 2007). A

regulação positiva de angiopoietina-1 é consistente com o fenótipo de células

perivasculares, pois sua ligação com o receptor Tie-2, comumente expresso em

células endoteliais, ativa a formação de vasos sanguíneos (SURI et al., 1996).

Os esferóides de TA também apresentaram estruturas semelhantes a vasos

(Figs. 33A e B), já observadas em outro trabalho que utilizou células tumorais de

mama (TIMMINS et al., 2004). O mais intrigante é que de acordo com a literatura, as

células perivasculares não dão origem a células endoteliais, pois possuem origem

embriológica distinta (OETTGEN, 2001). Isto nos leva a duas hipóteses: (1) As MSCs

de TA somente apresentam marcadores de células perivasculares, mas não são

pericitos funcionais; (2) ou podem ser pericitos em um estágio de ativação distinto dos

já descritos, particular para o TA subcutâneo. Esta última hipótese é sustentada por

um trabalho recente que demonstrou que as células perivasculares podem ser

derivadas de progenitores de células endoteliais in vitro, e que não somente

estabilizam os capilares, mas também participam do remodelamento vascular in vivo

(HAGEDORN et al., 2004).

9 Com o objetivo de investigar sua possível identidade com as células

perivasculares, o efeito das MSCs de TA em células endoteliais maduras (HUVEC)

também foi analisado. As MSC de TA quando co-cultivadas em monocamada com as

HUVEC, interagem intimamente com estas células formando estruturas similares as de

células perivasculares (Figs. 34A e C). Além disso, são capazes de promover a

sobrevivência das HUVEC, já que quando estas células são cultivadas sem a

presença das MSC de TA e nas mesmas condições de cultivo, predomina intensa

morte celular. A secreção de fatores angiogênicos e anti-apoptóticos já havia sido

descrita para as MSCs de TA (REHMAN et al., 2004), porém acreditamos que além

83

dessa regulação parácrina, haja moléculas de adesão específicas envolvidas dada a

interação particular dessas células com as HUVEC. Este padrão de interação se

repetiu no sistema de esferóides, onde as MSC de TA, através da emissão de

prolongamentos, circundou o ninho de HUVEC formado (Fig. 34F). É importante

ressaltar que este padrão de interação não é comumente descrito na literatura.

Normalmente, em sistema de co-cultivo com HUVEC em esferóides, essas células

tendem a se localizar somente na superfície externa (KELM et al., 2005). Somente um

trabalho descreveu um padrão de interação semelhante ao nosso, e este foi atribuído

indiretamente a maior produção de proteínas envolvidas com o processo de hipóxia, e

diretamente a ligação diferenciada dessas células a proteínas da matriz extracelular,

as quais permanecem desconhecidas (TIMMINS et al., 2004). Células de MO CD34-

CD146+ em matrigel também apresentam um padrão de interação com HUVEC similar

as de células perivasculares (SACCHETTI et al., 2007). Porém, essas duas fontes de

MSC, MO e TA, diferem na expressão de CD34, e talvez esta molécula possa estar

relacionada à diferenciação endotelial alcançada somente pelas células de TA. A

expressão da molécula de CD31 novamente não foi regulada positivamente em

monocamada, ainda que na presença da HUVEC, o que reafirma o papel de fatores

liberados durante a condição de hipóxia nos esferóides de TA para a diferenciação

endotelial.

O papel da liberação de fatores angiogênicos também foi avaliado em gel de

colágeno, frequentemente utilizado para a quantificação de brotamento de capilares

em esferóides (JAKOBSSON et al., 2007). Na presença de VEGF os esferoídes de

HUVEC emitem brotamentos após três dias (Fig. 35B), enquanto na presença da

monocamada das MSC de TA foi possível observar brotamentos semelhantes em

apenas cinco horas (Fig. 35A). Estes dados confirmam a hipótese de secreção de

fatores angiogênicos e anti-apoptóticos pelas MSC de TA, e que estes fatores são

capazes de estimular células endoteliais maduras. Diversos trabalhos demonstram a

importância de fatores secretados pelos pericitos na promoção da migração de células

endoteliais e também na morfogênese durante os estágios iniciais da

neovascularização (WATANABE et al., 1997; FUKUSHI et al., 2004). Estes dados

estão de acordo com os nossos resultados, e somente um trabalho observou um efeito

inibitório promovido por estas células perivasculares (MCILROY et al., 2006). Os

esferóides das MSC de TA em condições padrões de cultura, são capazes de emitir

prolongamentos celulares em gel de colágeno, porém tanto na presença de VEGF

quanto na de HUVEC, esses prolongamentos cessam. Essa capacidade migratória

das MSC de TA pode ser atribuída à expressão de CD34 por dois motivos: (1) em

células-tronco embrionárias o brotamento em gel de colágeno pode ser atribuído

84

diretamente a este marcador (MCCLOSKEY et al., 2006); (2) as MSC de MO, que não

expressam este marcador, quando plaqueadas nas mesmas condições, não são

capazes de emitir prolongamentos (dados não mostrados). A inibição da emissão de

prolongamentos só permite inferir que tanto fatores angiogênicos, quanto contatos

celulares com células endoteliais inibem a característica migratória das MSC de TA.

Apesar de já ter sido identificado um inibidor de migração de células murais

especificamente produzido por células endoteliais, a VE-estatina (SONCIN et al.,

2003), normalmente o VEGF é responsável pela migração de pericitos (LIU et al.,

2005). De acordo com esses dados preliminares, só podemos concluir que, se

realmente as MSCs de TA representam uma população de pericitos, estes pericitos

são distintos dos já descritos. Ensaios in vivo são necessários para a descoberta da

verdadeira identidade das células progenitoras do TA.

5.3. POTENCIAL DE SUSTENTAÇÃO DA HEMATOPOIESE. 5.3.a. As MSC de TA apresentam similaridades com as de MO.

Após quatro dias de co-cultivo com células mononucleares de sangue de

cordão, já foi possível observar “cobblestone areas”, interação característica de

progenitores hematopoiéticos com o estroma. Seguido desta interação, houve a

expansão de células hematopoiéticas, somente nos estromas de MSC de MO e de TA.

Nas co-culturas com FPH, essas células se esgotam em apenas quatorze dias. O

esgotamento das células foi confirmado por ensaios clonogênicos de CFU-GM, onde,

comparada com as células mononucleares antes do cultivo, o FPH não foi capaz de

expandir clones comprometidos para as linhagens granulocítica e macrofágica, ao

contrário das MSC de MO e de TA (Fig. 37B). A diferença no número de colônias

geradas em uma semana de cultivo entre as MSCs não foi estaticamente significativa.

Após três semanas, não houve geração de colônias CFU-GM nesses cultivos (dados

não mostrados), o que correlaciona diretamente com o perfil de geração de células

hematopoiéticas. Nestes cultivos a diminuição significativa de células progenitoras

comprometidas com a linhagem mielóide (mieloblastos) acontece de forma simultânea

ao aumento de células diferenciadas (meta, bastão e segmentados) entre quinze e

vinte dias (Fig. 37C, D).

Curiosamente, após aproximadamente vinte dias de cultivo, particularmente

nas MSC de TA, houve uma geração preferencial de células macrofágicas em

detrimento de segmentados, provavelmente derivadas de precursores monocíticos

detectados em dez dias de co-cultivo (Fig. 38D). O macrófago é um tipo celular

funcionalmente integrado com o osso, sistema vascular e o TA. Esta célula pode se

85

diferenciar em osteoclastos no tecido ósseo e também é capaz de infiltrar o sistema

vascular e o TAB, levando a quadros de inflamação crônica, os quais podem causar

ateroesclerose ou resistência a insulina secundária à obesidade (KOSHIYAMA et al.,

2006). No caso da obesidade, o papel do macrófago foi recentemente descoberto

(WEISBERG et al., 2003; XU et al., 2003) e, atualmente, foi evidenciado o

envolvimento do fator transcricional PPARγ na ativação destas células e na indução de

resistência a insulina (ODEGAARD et al., 2007). As MSC de TA, diferentemente das

de MO, expressam constitutivamente o gene PPARγ2 e, provavelmente, esta seja a

causa da expansão preferencial de células macrofágicas. Durante o desenvolvimento

da obesidade, a infiltração do TA por macrófagos pode se dever a mobilização de

monócitos com posterior diferenciação em macrófagos in situ (CURAT et al., 2004) ou

a transdiferenciação dos pré-adipócitos diretamente em células macrofágicas

(CHARRIÈRE et al., 2003). A migração de monócitos para o TA durante a obesidade

parece ser mediado pela secreção de MCP-1, sintetizado pelos adipócitos

hipertrofiados (WELLEN & HOTAMISLIGIL, 2003). No entanto, nossos dados estão de

acordo com trabalho recente que mostrou que as células progenitoras do TA,

CD34+CD45-, é que secretam altos níveis da quimiocina MCP-1 (monocyte

chemotactic protein-1), diretamente envolvida no recrutamento de macrófagos (ZHOU

et al., 2007). Devido à propriedade destas células de gerar macrófagos a partir de

células hematopoiéticas in vitro, talvez esta diferenciação possa ocorrer no TA in situ

em situações fisiológicas e ser bastante agravada em quadros de obesidade. Com

isso as MSC teriam participação ativa no desenvolvimento do quadro inflamatório da

obesidade.

5.3.b. As MSCs pré-induzidas para as vias adipogênica e osteogênica apresentam perfis de geração de células hematopoiéticas distintos.

Com o objetivo de melhor investigar as propriedades de sustentar a

hematopoiese das MSC de TA, comparando-as às de MO, as duas populações

celulares foram induzidas para os fenótipos adipocítico e osteoblástico, ambos

constituintes do estroma medular. Os estromas pré-adipocíticos foram responsáveis

por uma expansão significativa de células hematopoiéticas, ao contrário dos pré-

osteoblásticos. As análises de CFU-GM também revelaram um maior número de

colônias geradas pelos estromas pré-adipocíticos novamente para ambas as fontes de

células (Fig. 39). Os estromas pré-osteoblásticos não foram capazes de expansão de

colônias de granulócitos e macrofágos, propriedade que foi correlacionada com a

inibição de geração de mieloblastos e a discreta manutenção blástica por mais de

86

vinte dias. Os dados obtidos em nosso trabalho estão de acordo com o papel de

células osteoblásticas na regulação das HSC (CALVI et al., 2003; ZHANG et al., 2003;

BALDUINO et al., 2005) e de células acumuladoras de lipídeos na cavidade medular,

cujo papel ainda é obscuro, mas que parecem estimular a hematopoiese, contribuindo,

principalmente, na geração de células diferenciadas, pois não seriam capazes de

manter as HSC (CORRE et al., 2004). Em nosso trabalho, de fato, o número de

células blásticas caiu precocemente em ambos os estromas pré-adipocíticos, quando

comparados com os pré-osteoblásticos (Fig. 40).

As MSC de TA induzidas para osteoblastos apresentaram um perfil de geração

de células hematopoiéticas semelhante às células de MO, apesar da expressão

constitutiva de PPARγ2 e do microambiente deste tecido não ser constituído por

células osteoblásticas. Porém somente nos cultivos com MSC de MO foi possível

observar uma expansão e manutenção blástica em longo prazo (Fig. 40D). A

plasticidade evidenciada pelas MSC de TA e o fenótipo osteoblástico mais eficiente

das células de MO reforçam a teoria de que estas duas diferentes fontes possuem

uma origem embriológica comum e que suas características intrínsecas seriam

geradas pelos seus respectivos microambientes.

Os estromas diferenciados para a via adipogênica induziram uma diferenciaçãp

preferencial das células hematopoiéticas para a linhagem macrofágica, que foi

novamente mais evidente nas culturas com MSC de TA. Esta maior produção de

macrófagos pelas MSC de MO reforça a idéia de que o fenótipo adipocítico induz

diferenciaçcão preferencial para esta linhagem e é possivelmente também causado

pela expressão de PPARγ2, regulado positivamente após uma semana de indução

adipogênica.

O perfil da expressão gênica de hemopoietinas também é semelhante para

ambas as fontes de MSC, com algumas particularidades (Fig. 41 e Tab. 2). Somente

as MSC de MO expressam o mRNA para angiopoietina-1, que além do seu potencial

angiogênico, é um importante componente dos nichos de HSC (ARAI et al., 2004;

KIEL et al., 2005). Após a indução pré-adipocítica, as MSC de MO regulam

negativamente este fator, o que talvez possa explicar a sua semelhança na geração

de células hematopoiéticas com as MSC de TA sem indução. Outro gene regulado

negativamente durante a pré-indução adipocítica em ambas as fontes de MSC, foi o

LIF. Este fator possui um papel inibitório na proliferação de células hematopoiéticas

(LIEBERMANN & HOFFMAN, 1994), o que, em nosso trabalho, se correlaciona com o

menor número de colônias CFU-GM encontrado nos estromas sem indução e com

indução para a via osteogênica (Fig 39C). Uma possível explicação para a regulação

negativa pós indução adipogênica, seria que a dexametasona em concentração igual à

87

utilizada no meio indutor adipocítico, é responsável por um rápido aumento na taxa de

degradação do mRNA do LIF (GROSSET et al., 1999). O mRNA para G-CSF também

é regulado negativamente na indução pré-adipocítica, mas somente nas MSC de MO.

Como esta hemopoietina exerce o seu papel tanto em células hematopoiéticas

progenitoras (WRIGHT et al., 2002), como em células terminalmente diferenciadas

(LIANG, 2003), a sua ausência nas MSCs de MO pré-adipocíticas pode explicar as

diminuições nos percentuais de células blásticas e segmentadas, em comparação

com as MSC pré-osteoblásticas e não induzidas. Já o mRNA de GM-CSF é regulado

positivamente em ambas as MSCs induzidas para o fenótipo osteoblástico. Esta

citocina possui efeitos similares ao G-CSF (LIANG, 2003), logo sua regulação deve

estar diretamente relacionada à manutenção blástica observada nesses estromas.

5.3.c. As MSCs de TA quando induzidas para a linhagem osteoblástica são capazes de manter as HSCs.

Assim como no co-cultivo com células mononucleares, as MSC de TA são

capazes de expandir células hematopoiéticas CD34 purificadas (Fig. 42 e Tab. 3). As

MSC de TA são capazes de manter as células CD34+ por até 15 dias, mas somente as

de MO expandem o número total de células após esse período. A não expansão de

células progenitoras nas MSC de TA se correlaciona com as análises fenotípicas das

células geradas ao longo do co-cultivo. Em sete dias o percentual de células CD34

comprometidas com a linhagem mielóide (CD13+) é quase o dobro nas células de MO

em comparação com as de TA; o contrário ocorre com células mielóides que já

perderam o marcador de HSCs. Essa diferenciação precoce observada no co-cultivo

com MSC de TA se correlaciona com os resultados anteriores que revelaram uma

maior geração de células mielóides nos estromas adipocíticos e a manutenção blástica

nos osteoblásticos. Como neste ensaio as MSC não foram induzidas para estas vias,

novamente nos parece que as MSC de MO são mais comprometidas com a linhagem

osteoblástica e as de TA com a adipocítica.

Curiosamente, ao final do co-cultivo, o perfil, e não o percentual, de células

monocíticas/macrofágicas (CD14+) é ligeiramente diferente entre as MSC. A média da

intensidade de fluorescência desta população de células geradas em contato com as

MSC de MO é significativamente maior do que com as MSC de TA. Alguns trabalhos

identificaram sub-populações de monócitos baseados na expressão de CD14.

Somente as células monocíticas com alta expressão para este marcador possuem

propriedades inflamatórias e estas gerariam células CD14 com baixa expressão que

adquirem CD16, o receptor da fração constante (Fc) da IgG (FcγRIII) (RANDOLPH et

88

al., 2002; TACKE & RANDOLPH, 2006). Provavelmente, as MSC de TA seriam

capazes de promover a diferenciação in situ de monócitos CD14Hi para macrófagos

CD14LoCD16+. Esta hipótese necessita de ensaios funcionais para a sua

comprovação, mas está de acordo com a descoberta de macrófagos com

propriedades anti-inflamatórias, especificamente residentes no TA em condições

fisiológicas normais (ZEYDA & STULNIG, 2007) e está diretamente correlacionada

com a predominante produção de monócitos somente no co-cultivo com as MSCs de

TA (Fig. 38D).

Seguindo a nossa hipótese de que as propriedades adipocíticas das MSC de

TA foram geradas pelo microambiente, e que por esta razão podem ser reversíveis, as

MSC de TA foram induzidas por até duas semanas para a via osteoblástica, e a

sustentação de progenitores hematopoiéticos foi avaliada. O percentual de células

CD34+ mantidas ao longo do co-cultivo é semelhante para ambas as MSC de TA,

induzidas e não induzidas, porém o número absoluto destas células hematopoiéticas

em quatro dias é maior quando as células de TA são induzidas para o fenótipo

osteoblástico (Fig. 43). As análises morfológicas das células hematopoiéticas também

revelaram um maior percentual de progenitores mielóides nas MSC de TA e de blastos

nas MSC de TA osteoblásticas em sete dias de co-cultivo. Apesar do maior percentual

blástico nas MSCs induzidas para a linhagem osteoblástica, com estes dados não

podemos afirmar que este estroma é capaz de manter e/ou gerar HSCs. Uma das

principais propriedades que definem uma HSC é a sua capacidade de auto-renovação.

Logo, as células hematopoiéticas geradas em sete dias em ambos os co-cultivos

foram cultivadas em um ensaio que permite determinar a freqüência de HSC de longa

duração em uma determinada população – o LTC-IC. Após mais quatro semanas de

cultivo, somente as células geradas no co-cultivo com as MSC de TA induzidas por

duas semanas para linhagem osteoblástica foram capazes de manter culturas

positivas, ou seja, apresentando produção de células hematopoiéticas. A freqüência

de LTC-IC foi calculada segundo o método estatístico de Poisson (SUTHERLAND et

al., 1990), que revelou que em cada 150 células, uma pode ser considerada HSC de

longa-duração. Também foram realizados ensaios de CFU-GM antes e depois do

ensaio de LTC-IC. O número de colônias geradas pelas MSC induzidas para a

linhagem osteoblástica foi praticamente o mesmo, nestes dois momentos (Fig. 45).

Podemos então inferir de maneira indireta que o número de progenitores

hematopoiéticos foi mantido em longo prazo. Novamente, as MSC de TA sem indução

apresentaram um maior número de colônias CFU-GM antes do ensaio de LTC-IC,

revelando um maior comprometimento mielóide. Provavelmente em razão deste

89

comprometimento não foi possível detectar colônias LTC-IC positivas após quatro

semanas.

Outros trabalhos também avaliaram o papel da MSC de TA na sustentação da

hematopoese (CORRE et al., 2006; WAGNER et al., 2007). CORRE e colaboradores

(2006), não observaram a manutenção de blastos em seus co-cultivos com MSC de

TA ainda que induzidas para a via osteogênica. Neste estudo, além de não terem sido

utilizados ensaios de LTC-IC, as MSC de TA foram induzidas por quatro semanas, até

o estágio terminal de diferenciação. Somente os osteoblastos imaturos respondem a

fatores pró-osteogênicos e sustentam os eventos de osteoclastogênese in vitro

(ATKINS et al., 2003) e in vivo (CORRAL et al., 1998). As MSCs de MO cultivadas em

meio osteogênico por mais de duas semanas mostram vários focos de mineralização,

mas perdem a capacidade de sustentação de hematopoese (MIURA et al., 2006). O

outro estudo (WAGNER et al., 2007), utilizou a técnica de LTC-IC para a quantificação

de HSCs, porém em MSC de TA sem indução obtendo resultados semelhantes aos

nossos.

As propriedades hematopoiéticas das MSC de TA mesmo em diferentes

condições, nos levaram a especular se uma vez estas células inseridas no

microambiente medular, elas seriam capazes de se integrar funcionalmente. A

comprovação desta hipótese abre novas alternativas para diversos tratamentos, desde

a redução do tempo de reconstituição hematopoiética pós-transplante de MO até para

casos de aplasia medular.

5.4.CONSIDERAÇÕES FINAIS

As MSC de TA são semelhantes às de MO, mas talvez por possuírem

populações fenotipicamente distintas, também são únicas no seu potencial de

diferenciação mesodérmica e nas propriedades hematopoiéticas. As células de TA são

enriquecidas em progenitores endoteliais (células CD34+), e o marcador CD105,

amplamente descrito para as MSC de MO, foi regulado positivamente dentro da

população de células CD34+, após expansão in vitro. Este dado nos leva a hipótese

de que a molécula CD105 não seja um marcador de MSC no TA. Essas células

também possuem propriedades pró-angiogênicas, adquirem marcadores endoteliais

de maneira espontânea e ainda modulam células endoteliais maduras in vitro. A

capacidade de diferenciação endotelial aparentemente exclui a possibilidade de as

MSC de TA serem células perivasculares in vivo. Porém, essas células PPARγ2+

também são mais comprometidas com a via adipogênica e possuem um baixo

potencial condrogênico, e por isso, podem ser células perivasculares em um diferente

90

estágio de ativação das células de MO. O seu potencial de sustentação da

hematopoiese é fortemente representado pela geração de células macrofágicas após

a grande expansão de células mielóides (Fig. 46).

Todas estas características das populações de células de TA encontradas em

nosso trabalho, remetem a uma memória de microambiente (Fig 47). No TA, durante o

desenvolvimento da obesidade, são formados centros de hipóxia durante a hipertrofia

e/ou hiperplasia das células adipocíticas. Esta hipóxia leva a estímulos de

angiogênese e estes vasos recém-formados passam a ser responsáveis pela nutrição

dos novos adipócitos. Sem angiogênese, não há o aumento da massa do TA, e

consequentemente não há o aumento de peso. As MSC de TA possuem papel tanto

na formação de novos vasos, através de transdiferenciação ou pelo estímulo de

células endoteliais maduras, como na adipogênese. Outro componente celular

importante no processo de obesidade é o macrófago. Apesar de já ter sido

demonstrado que grande parte destas células no TA são oriundas da MO, também é

possível que MSC do próprio tecido estejam promovendo a diferenciação de

progenitores hematopoiéticos circulantes em células macrofágicas. Em nosso trabalho

mostramos diferenciação espontânea para endotélio e adipócitos, além da formação

de macrófagos a partir de progenitores hematopoiéticos. Porém, após a indução para

a via osteogênica, as MSCs de TA foram capazes de manter as HSC in vitro, tornando

possível sua aplicação em casos de reconstituição hematopoiética.

No âmbito da terapia celular, podemos utilizar diferentes fontes de células-

tronco para diferentes terapias, mas a partir do conhecimento da biologia destas

células, seremos capazes de modular o seu fenótipo in vitro para posterior aplicação in

vivo.

Figura 46. A MSC do TA e o seu possível papel pleiotrópico na

adipogênese, angiogênese e geração de células macrofágicas. Além das MSC, as células endoteliais, pré-adipócitos e adipócitos também participam da homeostase tecidual através da secreção de fatores de crescimento, citocinas e hormônios.

91

Figura 47. O TA e sua possível diversidade celular. Esquema representando as populações celulares do TAB subcutâneo já descritas, e a possível infiltração de progenitores hematopoiéticos, atribuindo uma nova função a este órgão endócrino. As MSC com localização perivascular, além da multipotencialidade exercem funções proliferativas e de estímulos de diferenciação nas diferentes populações celulares representadas acima. 6. CONCLUSÕES De acordo com a avaliação dos dados descritos anteriormente, podemos

concluir que no TA subcutâneo residem células-tronco multipotentes com

características únicas, provavelmente ditadas pelo microambiente. As nossas

conclusões e hipóteses geradas a partir dos nossos resultados podem ser separadas

em três tópicos principais.

6.1. Fenótipo A fração aderente das células de TA, que de acordo com a literatura representa

a população de MSC, é heterogênea em relação à expressão de marcadores de

superfície. As MSC do TA podem ser divididas em duas populações principais:

(1)CD34+CD105-CD146-CD90+CD44+CD45-. (2)CD34+CD105+CD146+CD90+CD44+CD45-.

Através da seleção destas populações foi possível comprovar a perda do CD34

com o ganho simultâneo do marcador CD105. Este dado nos levou a hipótese de que

92

a molécula de CD105 não represente a verdadeira população de progenitores

mesodermais no TA, sendo desta forma um artefato adquirido in vitro.

6.2. Multipotencialidade Assim como as MSC de MO, as de TA, embora heterogêneas, são capazes de

diferenciação para as três linhagens mesodérmicas, apesar do baixo potencial

condrogênico e do comprometimento com a linhagem adipocítica confirmado pela

expressão constitutiva do gene PPARγ2.

Os nossos resultados para a via endotelial nos levaram à hipótese de um papel

ativo das MSC de TA na angiogênese através de dois mecanismos: (1) Diferenciação em células endoteliais; (2) Ativação direta e indireta das células endoteliais. 6.3. Potencial de sustentação hematopoiética As MSCs de TA, assim como as de MO, são capazes de geração mielóide in

vitro, mas gerando, preferencialmente, monócitos e/ou macrófagos. A indução para o fenótipo adipocítico induz expansão e diferenciação de progenitores mielóides e favorece a produção de monócitos/macrófagos, e a osteogênica, a manutenção de HSCs. 6.4. Conclusão final Como os nossos resultados foram obtidos a partir da população total de MSC

de TA, talvez a população de pré-adipócitos também seja plástica. Na maioria dos

tecidos existem células acumuladoras de gordura em íntimo contato com as células

estromais de cada órgão. É possível então que estas células possuam papéis na

organogênese e angiogênese de vários órgãos, tornando indispensável a busca pelas

verdadeiras identidade e potencialidade das células estromais que residem no tecido

adiposo.

93

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abboud CN, Lichtman MA. Structure of the marrow and the hematopoietic microenvironment. In: Beutler E, Litchman MA, Coller BS, Kipps TJ, Seligsohn U, Williams Hematology – Sexta edição, McGraw-Hill – New York. 2001. p35. Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood. 2005;105:1815-22. Ailhaud G, Grimaldi P, Négrel R. Cellular and molecular aspects of adipose tissue development. Annu Rev Nutr. 1992;12:207-33. Akintoye SO, Lam T, Shi S, Brahim J, Collins MT, Robey PG. Skeletal site-specific characterization of orofacial and iliac crest human bone marrow stromal cells in same individuals. Bone. 2006;38:758-68. Amit M, Itskovitz-Eldor J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J Anat. 2002;200:225-32. Anjos-Afonso F, Bonnet D. Nonhematopoietic/endothelial SSEA-1+ cells define the most primitive progenitors in the adult murine bone marrow mesenchymal compartment. Blood. 2007;109:1298-306. Arai F, Ohneda O, Miyamoto T, Zhang XQ, Suda T. Mesenchymal stem cells in perichondrium express activated leukocyte cell adhesion molecule and participate in bone marrow formation. J Exp Med. 2002;195:1549-63. Arai F, Hirao A, Ohmura M, Sato H, Matsuoka S, Takubo K, Ito K, Koh GY, Suda T. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 2004;118: 149-61. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997;275:964-7. Atkins, G. J., Kostakis, P., Pan, B., Farrugia, A., Gronthos, S., Evdokiou, A., Harrison, K., Findlay, D. M., and Zannettino, A. C.. RANKL expression is related to the differentiation state of human osteoblasts. J. Bone Miner Res. 2003;18: 1088-98. Balana B, Nicoletti C, Zahanich I, Graf EM, Christ T, Boxberger S, Ravens U. 5-Azacytidine induces changes in electrophysiological properties of human mesenchymal stem cells. Cell Res. 2006;16:949-60. Balduino A, Hurtado SP, Frazão P, Takiya CM, Alves LM, Nasciutti LE, El-Cheikh MC, Borojevic R. Bone marrow subendosteal microenvironment harbours functionally distinct haemosupportive stromal cell populations. Cell Tissue Res. 2005;319:255-66. Banas A, Teratani T, Yamamoto Y, Tokuhara M, Takeshita F, Quinn G, Okochi H, Ochiya T. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 2007;46:219-28. Bancroft JD, Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques. Churchill livingstone, Quarta Edição, 1996, chapter 10, p190.

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