CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE …repositorio.unicamp.br/jspui/bitstream/REPOSIP/...de extrato, chegando a 98,8% de lise para a amostra SP [2] do lote 2 e 98,5% para

i

DANILO SANTOS SOUZA

CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DA

POLPA LIOFILIZADA ENRIQUECIDA COM O EXTRATO AQUOSO DA

SEMENTE DE TAMARINDO (TAMARINDUS INDICA)

CAMPINAS

2015

ii

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Engenharia de alimentos

DANILO SANTOS SOUZA

CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DA

POLPA LIOFILIZADA ENRIQUECIDA COM O EXTRATO AQUOSO DA

SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica)

Tese apresentada à faculdade de Engenharia

de Alimentos da Universidade Estadual de

Campinas como parte dos requisitos exigidos

para obtenção do título de Doutor em

Ciência de Alimentos.

Orientadora: Profª Drª. Helena Teixeira Godoy

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA

PELO ALUNO DANILO SANTOS SOUZA, E

ORIENTADA PELA PROFª DRª HELENA

TEIXEIRA GODOY

_____________________________________

Assinatura da Orientadora

CAMPINAS

2015

iv

v

BANCA EXAMINADORA

Profª. Drª. Helena Teixeira Godoy

(Orientadora)

Drª. Cláudia Hoffmann Kowalski Schroder

(Membro Titular)

Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO

Dr. Cristiano Augusto Ballus

(Membro Titular)

Departamento de Ciência de Alimentos - FEA - UNICAMP

Drª. Daniele Rodrigues

(Membro Titular)

Universidade Estadual de Londrina - UEL

Profº. Dr. Marcelo Alexandre Prado

(Membro Titular)

Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP

Profº. Dr. Severino Matias de Alencar

(Membro Suplente)

ESALQ - USP

Profª. Drª. Juliana Azevedo Lima Pallone

(Membro Suplente)

Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP

Drª Daniela de Queiroz Pane

(Membro Suplente)

Pesquisadora – São Paulo – SP

vi

vii

ABSTRACT

The seed of tamarind, responsible for the most amount of bioactive compounds of the fruit,

has only been marginally exploited for food purposes. The aim of the present study was to

characterize the fruit (pulp and seeds) regarding their antioxidant properties as well as

produce and characterize a lyophilized product made of pulp and aqueous extract of freeze-

dried tamarind seed, taking advantage of the functional properties (antioxidant) and at the

same time maintaining acceptable sensory characteristics. Tamarind fruits were acquired

from three different states of Brazil (MG, SP e BA). The lots were obtained in 2012 and

2013. The fatty acid profile and tocopherols seeds were also evaluated. The best conditions

for the extraction of bioactive compounds, from tamarind seed in aqueous phase, was set by

Central Composite Rotational Design (CCRD). The best extraction condition consisted of:

80 s of trituration with a ratio (w/v) of 1:3 (seeds:water), were the residue material was

extracted twice under the same conditions. The extracts were added to the pulps at the

concentrations [1] (0.3%), [2] (1.15%) and [3] (2.0%), relative to the in natura hydrated

pulp, to made the mixture (mix). The content of phenolic compounds (FT), antioxidant

capacity (FRAP, DPPH, ABTS and ORAC) and hemolytic activity were determined for the

pulps, seeds, freeze-dried seed extracts and freeze-dried mix of pulp and fruit seed extract.

The results were dependent on the origin of the fruit. The pulp enrichment were satisfactory

with substantial increase of the antioxidant capacity (ABTS∙) by 1910, 1300 and 937% for

mixtures of MG [3] SP [3] and BA [3], respectively. The samples acquired from São Paulo

and Bahia had the highest rates of hemolysis, especially for those in which high amount of

extract was added, reaching 98.8% of cell lysis for the SPsample [2] Lot 2, and 98.5% for

the BA sample [1] lot 1. Ten fatty acids from the seed oil were identified and quantified by

GC-FID technique, and 9 of them were confirmed by GC-MS. The oil seed presented 75%

and 25% of unsaturated and saturated fatty acids, respectively. Linoleic acid (C18:1n-6, cis)

was the major fatty acid (ranging from 145 to 270 mg.g-1

dry mass), followed by oleic acid (31

e 83 mg.g-1

d.m) and palmitic acid (21 to 47 mg.g-1

d.m). Isomers of tocopherols (α, β, γ e δ-

tocopherol) were detected and quantified, where α and γ-tocopherols were present in higher

amount (27 and 25 mg.kg-1

d.m., respectively). Sensory analysis for the difference from the

viii

control test showed that the concentrations 1.15 and 2% of the added extract have altered

the appearance attributes, aroma and taste of the nectar, however, this change was also

related to the origin of the fruits. On the other hand, the acceptance test showed high

variability in scores according to the assessors profile and a trend in reducing the nectar

acceptance when increasing the seed extract concentration.

Keywords: Lyophilization, hemolysis, phenolics compounds, tocopherols and fatty acids

ix

RESUMO

A semente do tamarindo, que possui boa parcela dos compostos bioativos do fruto, é pouco

aproveitada para fins alimentícios. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o

fruto (polpa e semente) com relação às propriedades antioxidantes, bem como elaborar e

caracterizar um produto liofilizado composto de polpa e extrato aquoso da semente de

tamarindo liofilizado de frutos oriundos de três estados do Brasil (MG, SP e BA) em lotes

obtidos nos anos 2012 e 2013, aproveitando assim, as propriedades funcionais

(antioxidante) e ao mesmo tempo que mantivesse as características sensoriais aceitáveis. O

perfil de ácidos graxos e tocoferóis das sementes também foram avaliados. Inicialmente,

foram determinadas as melhores condições para a extração em fase aquosa dos compostos

bioativos da semente de tamarindo por Delineamento Composto Central Rotacional

(DCCR). A melhor condição se deu com 80 s de trituração em uma relação (m/v) de 1:3

(semente:água), sendo o resíduo gerado reprocessado por mais duas vezes nas mesmas

condições. Os extratos foram adicionados às respectivas polpas nas concentrações [1]

(0,3%), [2] (1,15%) e [3] (2,0%) em relação à polpa hidratada in natura, para elaboração da

mistura (mix). O teor de compostos fenólicos totais (FT), a capacidade antioxidante (FRAP,

DPPH, ABTS e ORAC) e atividade hemolítica foram determinados para as polpas,

sementes, extratos liofilizados da semente e mix liofilizado de polpa e extrato da semente

dos frutos. Os resultados foram dependentes da origem dos frutos e o enriquecimento da

polpa se mostrou satisfatório com aumentos substanciais da capacidade antioxidante

(ABTS∙) de 1910, 1300 e 937%, para as misturas de MG[3], SP[3] e BA[3],

respectivamente. As amostras dos estados de São Paulo e Bahia tiveram os maiores índices

de hemólises, principalmente para aquelas em que se adicionaram concentrações elevadas

de extrato, chegando a 98,8% de lise para a amostra SP [2] do lote 2 e 98,5% para a

amostra BA [1] do lote 1. Dez ácidos graxos foram identificados e quantificados pela

técnica de GC-FID no óleo da semente, dentre os quais 9 foram confirmados por GC-MS.

Foram determinados cerca de 75% de ácidos graxos insaturados e 25% por saturados no

óleo da semente. O ácido linoleico (C18:1n-6, cis) foi o predominante com teores que

variaram de 145 até 270 mg.g-1

sólido seco, seguido pelo ácido oleico (31 e 83 mg.g-1

s.s) e ácido

x

palmítico que apresentaram concentrações de 21 à 47 mg.g-1

s.s,. Os quatro isômeros de

tocoferóis (α, β, γ e δ-tocoferol) foram detectados e quantificados, sendo que o α e γ-

tocoferóis se mostraram predominantes, com teores de 27 e 25 mg.kg-1

s.s., respectivamente.

O teste sensorial de diferença do controle mostrou que as concentrações 1,15 e 2% do

extrato adicionado alteraram os atributos de aparência, aroma e sabor do néctar, porém, esta

mudança também foi dependente da origem dos frutos. Por outro lado, o teste de aceitação

apresentou grande variabilidade de notas em função do perfil dos provadores e uma

tendência na redução da aceitação do néctar à medida que se adicionou mais extrato da

semente.

Palavras-chave: Liofilização, hemólise, compostos fenólicos, tocoferóis e ácidos graxos.

xi

SUMÁRIO

ABSTRACT ......................................................................................................................... vii RESUMO .............................................................................................................................. ix INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... 1

Referências .......................................................................................................................... 3 CAPÍTULO I .......................................................................................................................... 5 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 5

1. Tamarindo ....................................................................................................................... 6 2. Capacidade Antioxidante ................................................................................................ 7

3. Compostos fenólicos ..................................................................................................... 10 4. Tocoferóis e ácidos graxos............................................................................................ 12 5. Atividade Hemolítica .................................................................................................... 14

6. Secagem de alimentos por liofilização ......................................................................... 15 7. Análise Sensorial .......................................................................................................... 17 8. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 18

CAPÍTULO II ....................................................................................................................... 29

OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO PARA ELABORAÇÃO DE EXTRATO AQUOSO

LIOFILIZADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica) ......................... 29

RESUMO .......................................................................................................................... 30 1. Introdução ..................................................................................................................... 31 2. Material e Métodos ....................................................................................................... 33

2.1 Obtenção e preparo de amostras ............................................................................. 33 2.2 Reagentes e padrões ................................................................................................ 33

2.3 Ensaios de otimização ............................................................................................. 34 2.4 Determinação de Fenólicos Totais .......................................................................... 34 2.5 Análise estatística .................................................................................................... 35

3. Resultados e Discussão ................................................................................................. 35 4. Conclusão ...................................................................................................................... 43

5. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 43 CAPÍTULO III ..................................................................................................................... 47

INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DO EXTRATO AQUOSO LIOFILIZADO DA SEMENTE

SOBRE O TEOR DE FENÓLICOS TOTAIS, CAPACIDADE ANTIOXIDANTE E

ATIVIDADE HEMOLÍTICA DA POLPA DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) .... 47

RESUMO .......................................................................................................................... 48 1. Introdução ..................................................................................................................... 49 2. Material e Métodos ....................................................................................................... 51

2.1 Reagentes e padrões ................................................................................................ 51 2.2 Obtenção e preparo da matéria-prima ..................................................................... 52

2.3 Extração ................................................................................................................... 52 2.3.1 Preparo do extrato aquoso liofilizado .................................................................. 52 2.3.2 Preparo dos extratos para análises de antioxidantes e fenólicos totais ................ 53 2.3.3. Preparo dos extratos para análise de atividade hemólítica .................................. 53

2.4 Determinação de fenólicos totais ............................................................................ 54 2.5 Capacidade antioxidante ......................................................................................... 54

2.5.1 Ensaios de ABTS (2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina-6-ácido sulfônico)) ........ 54

xii

2.5.2 Ensaios de DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazil) – Sequestro do radical livre ......... 55 2.5.3 Ensaios de FRAP (Poder Antioxidante de Redução do Ferro) ............................ 56 2.5.4 Ensaios de ORAC – Capacidade de Redução do Radical Oxigênio .................... 56 2.6 Atividade hemolítica ............................................................................................... 57 2.7 Análise estatística .................................................................................................... 58

3. Resultados e Discussão ................................................................................................. 59 3.1 Compostos fenólicos totais ..................................................................................... 59 3.2 Capacidade antioxidante ......................................................................................... 62 3.3 Atividade hemolítica ............................................................................................... 74

4. Conclusão ...................................................................................................................... 78

5. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 78 CAPÍTULO IV ..................................................................................................................... 87 PERFIL QUANTITATIVO DE TOCOFERÓIS E ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO

OBTIDO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) PROVENIENTES

DE DIFERENTES ESTADOS DO BRASIL ....................................................................... 87 1. Introdução ..................................................................................................................... 89 2. Material e Métodos ....................................................................................................... 92

2.1 Reagentes e padrões ................................................................................................ 92 2.2 Obtenção e preparo da matéria-prima ..................................................................... 92

2.3 Procedimentos de extração ...................................................................................... 93 2.3.1 Lipídeos por Bligh-Dyer ...................................................................................... 93 2.3.2 Ésteres metílicos de ácidos graxos ....................................................................... 93

2.3.3 Tocoferóis ............................................................................................................ 94 2.4 Métodos de separação ............................................................................................. 95

2.4.1 Ésteres metílicos de ácidos graxos ....................................................................... 95 2.4.1.1 Identificação e quantificação por GC-FID ........................................................ 95 2.4.1.2 Identificação por GC-MS .................................................................................. 96 2.4.2 Tocoferóis ............................................................................................................ 97 2.5 Métodos de validação .............................................................................................. 98

2.5.1 Ácidos graxos ....................................................................................................... 98 2.5.2 Tocoferóis ............................................................................................................ 98

2.6 Análise estatística .................................................................................................. 100 3. Resultados e Discussão ............................................................................................... 101

3.1 Validação dos métodos ......................................................................................... 101

3.1.1 Limites de detecção (LD), quantificação (LQ) e linearidade, ............................ 102 3.1.2 Precisão e recuperação ....................................................................................... 105 3.2 Composição de ácidos graxos ............................................................................... 108 3.3 Composição de tocoferóis ..................................................................................... 115

4. Conclusão .................................................................................................................... 118

5. Referências Bibliográficas .......................................................................................... 119 CAPÍTULO V .................................................................................................................... 127 AVALIAÇÃO SENSORIAL DE NÉCTAR ELABORADO COM POLPA E EXTRATO

AQUOSO LIOFILIZADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) . 127

1. Introdução ................................................................................................................... 129 2. Material e Métodos ..................................................................................................... 131

2.1 Reagentes .............................................................................................................. 131

xiii

2.2 Obtenção da matéria-prima ................................................................................... 131 2.3 Preparo de amostras .............................................................................................. 131 2.4 Acidez total titulável e teor de sólidos solúveis totais .......................................... 132 2.5 Análise sensorial ................................................................................................... 132 2.5.1 Teste de diferença do controle ........................................................................... 133

2.5.2 Teste de aceitação pelos consumidores .............................................................. 134 2.6 Perfil do consumidor de suco ................................................................................ 135 2.7 Análise estatística .................................................................................................. 136

3. Resultados e Discussão ............................................................................................... 136 3.1 Determinação da acidez total titulável, teor de sólidos solúveis totais e ratio ...... 136

3.2 Análise sensorial ................................................................................................... 138 3.2.1 Teste de diferença do controle ........................................................................... 138 3.2.2 Teste de aceitação .............................................................................................. 141

3.3 Perfil do consumidor ............................................................................................. 145 4. Conclusão .................................................................................................................... 152 5. Referências Bibliográficas .......................................................................................... 153

ANEXOS ............................................................................................................................ 157

CONCLUSÃO GERAL ..................................................................................................... 160

xiv

xv

“Tá fechando sete tempo

qui mia vida é camiá

pulas istradas do mundo

dia e noite sem pará...

...tô de volta já faiz tempo

qui dexei o meu lugá

isso se deu cuano moço

qui eu saí a percurá

nas inlusão que hai no mundo

nas bramura qui hai pru lá

saltei pur prefundos poço

qui o Tioso tem pru lá

Jesus livrô derna d'eu môço

do raivoso me paiá

já passei pur tantas prova

inda tem prova a infrentá...”

Cantiga do estradar – Elomar F. Mello

“Determine, rapaz

Onde vai ser seu curso de pós-graduação

Se oriente, rapaz

Pela rotação da Terra em torno do Sol

Sorridente, rapaz

Pela continuidade do sonho de Adão”

Oriente – Gilberto Gil

xvi

xvii

Ao meu filhote Levi e à minha amada esposa Jane,

Aos meus pais Joel (in memorian) e Dilma,

Aos irmãos Jó e Joelson,

Aos meus sobrinhos João Marcelo e Marco Antonio,

Pelo imenso amor, apoio e confiança.

Dedico!

xviii

xix

AGRADECIMENTOS

À Deus, por tornar minha vida um palco de conquistas, possibilitando a realização

de mais um sonho.

À minha família pelo apoio e amor confiados a mim em tempo integral.

Ao cunhado irmão Marcelo pelo imenso incentivo e auxílio em todos os momentos.

Aos sogros D. Lúcia e Sr. Zé, por não hesitar em me ajudar o quanto necessário.

Aos amigos de Tanhas: Cinho, Vinícius, Babá, Júnior, Cassiano, Tonhão, Madson,

Minho e Léo pela amizade e companheirismo prestados mesmo na distância.

Ao grande amigo Janclei pelo incentivo e apoio para enfrentar esta jornada longe do

nosso sertão;

À professora Helena, pelo apoio, incentivo, confiança e por me orientar de forma

segura, sábia e competente.

Aos membros da banca Dr. Cristiano Augusto Ballus, Drª. Daniele Rodrigues, Profº.

Dr. Marcelo Alexandre Prado, Drª. Cláudia Hoffmann Kowalski Schroder, Profº. Dr.

Severino Matias de Alencar, Profª. Drª. Juliana Azevedo Lima Pallone, Drª Daniela de

Queiroz Pane pelo apoio e disponibilidade, fornecendo sugestões essenciais para melhoria

deste trabalho.

Aos amigos do Lab Análise, Alane, Cris, Dani Neves, Well Cabeça, Maria, Thaís,

Tayse, Lenaice, Marcela, Sr. Dirceu, Marla, Léo, Polly, Marcus, Matheus, Adriana,

Stefany, Kleidson, Juzinha, Ana Paula, Alisson, Sheila, Michelly e Suian pela companhia e

tolerância em todos esses anos.

À todos os professores e funcionários da FEA que de alguma forma contribuíram

para que este trabalho se concretizasse.

À FAPESP pelo apoio financeiro ao projeto (Processo: 2012/06806-4) durante todo

este período de doutorado.

À Faculdade de Engenharia de Alimentos e consequentemente à UNICAMP pela

oportunidade, estrutura e recepção.

xx

1

INTRODUÇÃO GERAL

Nos últimos anos, o consumidor vem se conscientizando cada vez mais sobre a

importância da inclusão de alimentos saudáveis na dieta que auxiliam na prevenção de

doenças e melhoria da qualidade de vida, o que resulta em um aumento na demanda destes

produtos no mercado (GURJÃO, 2006). De acordo com Silveira (2005), o Brasil tem se

destacado como importante produtor, consumidor e exportador de frutas tropicais,

expandindo o agronegócio e se adequando ao mercado externo. Segundo Brasil (2007),

tanto o consumo mundial per capita de frutas quanto o brasileiro continuarão crescendo a

taxas superiores à da economia mundial e doméstica.

O tamarindeiro se destaca dentre as várias espécies de árvores frutíferas exóticas

cultivadas no Brasil, pois tem apresentado alta capacidade de adaptação às condições

edafoclimáticas, principalmente nas regiões semi-áridas (PEREIRA et al., 2010). O fruto é

comumente consumido na forma de polpa, sucos, extrato, xarope, balas e outras

formulações para consumo oral, também podendo ser usado como expectorante, laxativo,

carminativo, além de ser indicado para infecções no estômago, fígado e na vesícula biliar

(QUEIROZ, 2010). No entanto, segundo Shiddhuraju (2007), a semente contém uma

importante parcela de compostos (ácidos fenólicos, tocoferóis, ácidos graxos, etc),

responsáveis pelas propriedades funcionais do fruto e geralmente não é reaproveitado para

estes fins nas indústrias de suco.

Boa parcela destes compostos que atribuem o potencial antioxidante aos alimentos

geralmente é degradado ao longo do processamento em razão da sua alta instabilidade

(CAMPOS et al., 2008). Desta forma, é de fundamental importância a escolha de um

2

método adequado para processar e aproveitar tais alimentos, visando conservar o produto e

manter as propriedades antioxidantes do fruto in natura. O método de extração aquosa é

muito empregado nas indústrias de alimentos visando a redução do uso de solventes tóxicos

e aumento da inocuidade dos produtos que consequentemente minimizam os impactos

ambientais e os causados à saúde do consumidor. Geralmente as técnicas de extração

aquosa estão associadas a um método de secagem para obtenção do produto final, a fim de

concentrar os compostos de interesse e melhorar o rendimento.

A secagem é um dos processos industriais que tem se mostrado eficiente para a

conservação de alimentos, uma vez que além de ser prático favorece a estabilidade do

produto. Porém, nem todo método de secagem é efetivo no benefício à manutenção da

qualidade de alimentos, sendo que há a ocorrência de uma série de reações oxidativas e

enzimáticas no produto, principalmente em vegetais (VASQUES et al., 2006). A

liofilização é um dos métodos de secagem que reduz alterações indesejáveis ao produto

como o encolhimento e a migração de sólidos solúveis no interior do material, devido a

ausência de água líquida e as baixas temperaturas requeridas no processo, além de manter a

estrutura porosa no material seco que facilita no processo de reidratação. Em consequência,

a retenção dos compostos bioativos e aromáticos é favorecida, enquanto que as reações

degradativas são minimizadas (MARQUES, 2008). Desta forma, para criar opções de

aproveitamento da semente de tamarindo e minimizar o seu descarte nas indústrias

processadoras do fruto, torna-se necessário elaborar um produto liofilizado conjugado de

polpa e extrato aquoso liofilizado da semente, com grande potencial para favorecer o uso

das propriedades funcionais e sensoriais do fruto, podendo assim, promover benefícios à

saúde do consumidor.

3

Referências

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA. Cadeia produtiva

de frutas. Agronegócios, v.7, f.102, 2007.

CAMPOS, F. M.; MARTINO, H. S. D.; SABARENSE, C. M.; PINHEIRO SANT‘ANA,

H. M.; Estabilidade de compostos antioxidantes em hortaliças processadas: uma revisão.

Alimentos e Nutrição. v. 19, n. 4, p. 481-490, 2008.

GURJÃO, K. C. de O.; Desenvolvimento, armazenagem e secagem de tamarindo

(Tamarindus indica L.). 142f, Tese (Doutorado em Agronomia) – Universidade Federal da

Paraíba – Centro de Ciências Agrárias, Areia, 2006.

IBRAF (INSTITUTO BRASILEIRO DE FRUTAS). Estatísticas. Disponível em:

<http://www.ibraf.org.br/x-es/f-esta.html> Acesso em: 02/05/2005.

MARQUES, L.G., Liofilização de frutas tropicais. 255f. Tese (Doutorado em Engenharia

Química), Universidade Federal de São Carlos – UFSCAR. São Carlos/SP. 2008.

PEREIRA, C. P.; MELO, B. de; FREITAS, R. S. de; TOMAZ, M. A.; FREITAS, C. de J.

P.; Mudas de tamarindeiro produzidas em diferentes níveis de matéria orgânica adicionada

ao substrato. Revista Verde, v.5, n.3, p.152-159, 2010.

QUEIROZ, J. M. de O.; Propagação do tamarindeiro (Tamarindus indica L.). Dissertação

(Mestrado em Ciências Agrárias) – Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Cruz das

Almas/BA. 78f. 2010.

SIDDHURAJU, P.; Antioxidant activity of polyphelolic compounds extracted from

defatted raw and dry heated Tamarindus indica seed coat. LWT, v. 40, p. 982-990, 2007.

4

SILVEIRA, N. S. S. da; MICHEREFF, S. J.; SILVA, I. L. do S. S. da; OLIVEIRA, S. M.

A. de; Doenças fúngicas pós-colheita em frutas tropicais: patogênese e controle. Caatinga,

Mossoró, v.18, n.4, p.283-299, out./dez. 2005.

VASQUES, A. R.; BERTOLI, S. L.; VALLE, R. C. S. C.; VALLE, J. A. B.; Avaliação

sensorial e determinação de vida-de-prateleira de maçãs desidratadas. Ciência e

Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 26, n. 4, p. 759-765, 2006.

5

CAPÍTULO I

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

TAMARINDO (Tamarindus indica): COMPOSIÇÃO E PARÂMETROS QUE

INFLUENCIAM EM SUA QUALIDADE

Danilo Santos Souza, Helena Teixeira Godoy

Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,

Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato, 80, Cidade

Universitária Zeferino Vaz, 13083-862, Campinas, SP, Brasil

6

1. Tamarindo

O tamarindeiro (Tamarindus indica) é uma árvore nativa da África, porém se

desenvolve naturalmente em regiões tropicais e subtropicais, se destacando como um

recurso vegetal importânte como alimento e erva medicinal em diversas partes do mundo

(SIDDHURAJU, 2007; MAHMOUDZADEH-SAGHEB et al., 2010). Por apresentar

excelentes qualidades nutricionais, com agradável aroma e sabor ácido-doce, o fruto é

muito utilizado na fabricação de néctares, sorvetes, pastas, doces, licores, geleias e também

como ingrediente em condimentos e molhos (PEREIRA et al., 2004).

Apesar de bem adaptado, o tamarindo é pouco explorado no Brasil e boa parte da

sua produção é destinada ao consumo interno (BRASIL, 2007). O fruto é bastante utilizado

na medicina tradicional para tratar doenças como diabetes e infecções estomacais

(FERREIRA, 2008). Cada unidade possui de uma a 10 sementes, pesa de 10 a 15 g e suas

partes constituídas de casca, polpa e sementes, contribuem respectivamente com 30%, 30%

e 40% do peso do fruto inteiro (PEREIRA et al., 2010).

A polpa de tamarindo possui uma coloração marrom escura com quantidades

consideráveis de potássio, fósforo, cálcio e vitamina A, o que confere excelentes qualidades

nutricionais (DIALLO et al., 2008). No entanto, mesmo havendo muitas opções de

beneficiamento da polpa para elaboração de produtos alimentícios, as propriedades

funcionais do fruto ainda são pouco investigadas (GURJÃO, 2006).

As sementes que são envolvidas pela polpa, são muito utilizadas como fitoterápicos.

Possuem compostos bioativos, como ácidos graxos insaturados e compostos fenólicos,

como os taninos, em sua composição, aos quais se atribuem atividades antioxidantes,

7

antihepatotóxica, anti-inflamatória, antimutagênica, antidiabética e anti-aterosclerótica

(MAITI et al., 2004). Após processadas, podem ser utilizadas como estabilizantes de sucos

e alimentos industrializados, no entanto, sua grande aplicação é como goma (polissacarídeo

xiloglucona) para tecidos ou papel. A xiloglucona extraída da semente, também tem a

finalidade de substituir carboidratos e consequentemente reduzir o valor calórico de alguns

alimentos, sendo que a semente é a única fonte deste polímero disponível comercialmente.

Também é muito utilizado na indústria farmacêutica para controle de liberação de drogas

(IZYDORCZYK et al., 2005). O óleo presente na semente é composto em maior parcela

por ácido linoleico, caracterizado como um ácido graxo poli-insaturado com alto potencial

bioativo de grande interesse em produtos alimentícios (LUZIA & JORGE, 2011).

2. Capacidade Antioxidante

O estudo da capacidade antioxidante in vitro ou in vivo de compostos presentes

naturalmente no Tamarindus indica vem sendo foco de estudos científicos devido ao seu

potencial para o tratamento e combate a doenças (SIDDHURAJU, 2007; RAZALI et al.,

2012).

Compostos antioxidantes podem ser definidos como quaisquer substâncias que

atrasam ou inibem a oxidação de substrato oxidável de maneira eficaz, mesmo quando

presentes em baixas concentrações (SIES & STAHL, 1995; SHAMI & MOREIRA, 2004).

A utilização de compostos antioxidantes, encontrados na dieta ou mesmo sintéticos, é um

dos mecanismos de defesa contra os radicais livres que podem ser empregados nas

8

indústrias de alimentos, cosméticos, bebidas e também na medicina (DOROSHOW, 1983;

HALLIWELL et al., 1995).

A obtenção de energia para o desenvolvimento dos processos biológicos em seres

vivos depende diretamente do processo oxidativo, porém, produzem radicais livres e outras

espécies de oxigênio altamente reativas. Os produtos dessa oxidação podem reagir

desordenadamente com os lipídeos da membrana celular dentro do organismo humano, e

também com outros compostos como proteínas e ácido desoxirribonucleico (DNA),

favorecendo o desenvolvimento de doenças degenerativas como artrite, aterosclerose,

diabetes e cirrose, além de contribuir para o envelhecimento humano e risco de câncer

(SATO et al., 1996; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).

Os seres humanos, igualmente aos demais seres aeróbicos, conseguem tolerar a

presença dessa oxidação natural graças a mecanismos de defesa adquiridos em muitos anos

de evolução, onde usam sistema de transporte de elétrons e sistemas enzimáticos para

protegerem o organismo como um todo dos efeitos tóxicos do oxigênio, ou seja,

mecanismos de ação antioxidante. O corpo humano, muitas vezes, é submetido a condições

extremas de oxidação, intensificadas pela ação de poluentes e contaminantes químicos, de

modo que a formação de radicais livres estaria muito acima da capacidade das defesas do

corpo humano de removê-las, ocasionando o ―estresse oxidativo‖ (AROUMA et al., 1991).

A principal fonte natural de compostos com ação antioxidante como, por exemplo, o

ácido ascórbico e tocoferol (vitaminas C e E, respectivamente), além de compostos

fenólicos como antocianinas e flavonoides, são os alimentos. Alguns minerais presentes na

alimentação como zinco, selênio e ferro também são considerados antioxidantes, pois são

9

constituintes de algumas enzimas envolvidas na proteção contra o estresse oxidativo

(PRAKASH, 2001; SIMPSON, 2006).

Os vegetais em geral, assim como todos os alimentos e bebidas derivadas destes,

são ricos em vários tipos de antioxidantes, como vitaminas C, α-tocoferol, β-caroteno e

compostos fenólicos, os quais constituem a maioria dos compostos com atividade

antioxidante (MOURE et al., 2001). A maioria dos compostos antioxidantes numa dieta

típica é derivada de fontes vegetais e pertencem a várias classes de compostos com uma

grande variedade de propriedades físicas e químicas. Na ciência de alimentos, os

antioxidantes têm um amplo espectro de atuação, no qual se incluem componentes que

previnem rancidez em óleos, assim como os antioxidantes da dieta (PRAKASH, 2001;

FENNEMA, 2004; SIMPSON, 2006).

Desta forma, o consumo de frutas não está sendo encarado apenas como um gosto

preferencial ou pessoal por parte dos consumidores, mas com o objetivo de manter uma

dieta saudável e rica em nutrientes. Além de compostos essenciais, a maioria das frutas

apresenta quantidades consideráveis de micronutrientes, tais como fibras, minerais,

vitaminas e compostos fenólicos secundários de extrema importância para a saúde humana

(RUFINO et al., 2010).

Alimentos ricos em fenólicos, bebidas e extratos de plantas, tais como vinho tinto,

extratos de semente de uva, chá verde e tamarindo (Tamarindus indica), são apresentados

como fontes promissoras de compostos com tais características, uma vez que eles têm

demonstrado atividade hipolipemiante, anti-aterosclerótica, antioxidante, anti-inflamatória

e imunomoduladora (PAULA et al., 2009).

10

3. Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos podem ser definidos como um conjunto de substâncias

heterogêneas que apresentam em sua estrutura vários grupos benzênicos característicos,

substituídos por grupamentos hidroxilas (SOARES et al., 2008). Eles têm atraído muita

atenção nos últimos anos, devido a sua forte relação no combate a doenças degenerativas e

envelhecimento (GIRI et al., 2012). Agem como antioxidantes não somente pela sua

habilidade em doar hidrogênio ou elétrons, mas também por causa de seus radicais

intermediários estáveis, que impedem a ação de radicais livres no organismo e a oxidação

de vários ingredientes da indústria alimentícia, particularmente de ácidos graxos e de óleos

(TREMOCOLDE, 2011).

Nos vegetais, os compostos fenólicos podem ser divididos em dois grupos: os

flavonoides e os não flavonoides, em que ambos são metabólitos secundários

(DEGÁSPARI & WASZCZYNSKYJ, 2004). Os flavonoides compõem uma ampla classe

de substâncias de origem natural, cuja síntese não ocorre na espécie humana (LOPES et al.,

2012). Englobam uma classe muito importante de pigmentos naturais e têm a estrutura

química C6-C3-C6, sendo que as duas partes da molécula com seis carbonos são anéis

aromáticos (VOLP et al., 2008). Os não flavonoides são classificados como: os derivados

das estruturas químicas C6-C1 específicas dos ácidos hidroxibenzóico, gálico e elágico; os

derivados das estruturas químicas C6-C3 específicas dos ácidos caféico e p-cumárico

hidroxi cinamatos e os derivados das estruturas químicas C6-C2-C6 específicas do trans-

resveratrol, cis-resveratrol e transresveratrol-glucosídio (BURNS et al., 2001).

11

Segundo Shan et al. (2005), os principais compostos fenólicos podem ser divididos

em 4 grupos: os ácidos fenólicos (gálico, protocatecúico, caféico e rosmarínico), diterpenos

fenólicos (carnosol e ácido carnósico), flavonoides (quercetina e catequina) e óleos voláteis

(eugenol, carvacrol, timol e mentol). Os ácidos fenólicos são compostos que possuem

propriedades antioxidantes devido a presença de um ou mais anéis benzênicos, um

grupamento carboxila e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na molécula

(SOARES, 2002). Estão presentes nos alimentos, principalmente vegetais, na forma livre

(agliconas), ésteres, glicosídeos e/ou na forma complexada (ROCKENBACH et al., 2008;

ROSS et al., 2009).

Segundo Robbins (2003), os ácidos fenólicos são uma subclasse de uma larga

categoria de metabólitos comumente conhecidos como ―compostos fenólicos‖.

Ultimamente eles têm recebido uma atenção especial, principalmente em relação às

técnicas de extração e obtenção, devido ao seu papel eficaz na prevenção de várias doenças

humanas nas quais atuam em uma variedade de ações biológicas, tais como radical livre, a

quelação de metais, a modulação da atividade enzimática, a aterosclerose, antimutagênica e

atividade anticancerígena (LAGHARI et al., 2011). Os ácidos fenólicos também são

considerados fortes antioxidantes capazes de prevenir ou retardar a taxa de oxidação para

reações em cadeia nos materiais autoxidáveis, podendo ser identificados por métodos de

separação, como a cromatografia líquida (TARNAWSKI et al., 2006).

Os taninos são componentes polifenólicos encontrados em alimentos, bebidas e

principalmente em vegetais, na qual estão distribuídos nas raízes, casca, seiva, folhas,

frutos e sementes (PANSERA et al., 2003; BATTESTIN et al., 2004). Possuem alto peso

12

molecular, solubilidade em água e têm habilidade para precipitar proteínas formando

ligações cruzadas estáveis (HELBIG, 2000).

Estando na forma não oxidada, os taninos reagem com proteínas por meio de pontes

de hidrogênio ou ligações hidrofóbicas. Por outro lado, quando oxidados, se transformam

em compostos quinonas, formando ligações covalentes com alguns grupos funcionais das

proteínas, principalmente os grupos sulfídricos da cisteína e ω-amino da lisina (NOZELLA,

2001).

Segundo Sigleton & Kratzer (1973), os taninos podem ser classificados como

hidrolisáveis e não hidrolisáveis ou condensados. Os taninos hidrolisáveis quando sofrem

hidrólise ácida produzem ácidos fenólicos: gálico, caféico, elágico e um açúcar

(NOZELLA, 2001). Os taninos não hidrolisáveis ou condensados (proantocianidinas) são

polímeros dos flavonoides formados por unidades de catequina e leucoantocianidina,

presentes em maior quantidade nos alimentos normalmente consumidos (SILVA & SILVA,

1999).

4. Tocoferóis e ácidos graxos

Os tocoferois são considerados os melhores antioxidantes naturais para a indústria e

são amplamente aplicados como meio para inibir a oxidação de óleos e gorduras

comestíveis, prevenindo a oxidação dos ácidos graxos insaturados (RAMALHO & JORGE,

2006). São naturalmente encontrados na maioria dos óleos vegetais, alguns tipos de

pescados e atualmente pode ser obtido por síntese (ZARROUK et al., 2009). Formam um

grupo de quatro (α, β, γ e δ) antioxidantes lipofílicos sintetizados por organismos

13

fotossintéticos, predominando geralmente em folhas e sementes (MUNNE-BOSCH &

ALEGRE, 2002).

A atividade antioxidante dos tocoferóis se dá principalmente pela sua capacidade

em doar hidrogênios aos radicais livres lipídicos, fazendo com que a propagação da

oxidação em cadeia seja interrompida (SZYMANSKA & KRUK, 2008). Por esta razão, são

aplicados para inibir a oxidação de ácidos graxos livres (RAMALHO & JORGE, 2006).

Os ácidos graxos são compostos por uma cadeia carbônica, cujo comprimento varia

de 4 a 36 átomos de carbono, com um grupo metil (CH3) em uma extremidade e um grupo

carboxil (COOH) na outra (LESKANISH & NOBLE, 1997). Estão presentes nas mais

diversas formas de vida, desempenhando importantes funções na estrutura das membranas

celulares e nos processos metabólicos (MARTIN et al., 2006). A presença dos ácidos

graxos, principalmente os poli-insaturados da família do ômega-3 e ômega-6, nos

alimentos, desempenha muitos benefícios à saúde humana (LUZIA & JORGE, 2011).

Ocorrem sob a forma livre ou sob formas covalentemente ligadas a álcoois e a outros

componentes, e podem ser liberados através de hidrólise química ou enzimática (SILVA,

1996). Como fazem parte da fração lipídica, assim como os tocoferóis, são extraídos

juntamente com o óleo nas indústrias, seja por extração a frio, com o uso de prensas ou

solventes orgânicos, ou por extração a quente, sendo que esta última favorece na

degradação destes compostos termolábeis (SOTO et al., 2007).

14

5. Atividade Hemolítica

Atualmente, diversos produtos naturais têm mostrado variadas propriedades

biológicas, algumas das quais são deletérias e outras benéficas para os seres humanos. Os

efeitos biológicos do extrato aquoso de semente de tamarindo ainda são pouco estudados e

não há na literatura dados que caracterizem esse extrato como agente causador da hemólise

celular.

A atividade hemolítica representa um dos vários efeitos biológicos causados por

agentes tóxicos e fatores antinutricionais (WOLDEMICHAEL & WINK, 2001; HASSAN

et al., 2010). Deve-se à capacidade que glicosídeos contidos na amostra têm de se combinar

com as moléculas de colesterol presentes na membrana dos eritrócitos, perturbando seu

equilíbrio célular e promovendo sua ruptura com consequente liberação da hemoglobina

(KAWASHIMA et al., 1972).

A investigação da atividade hemolítica constitui um modelo experimental em

células vermelhas de sangue tendo como alvo as membranas, para compreender melhor o

mecanismo citopático frente a um agente causador da hemólise (CARLI & TASCA, 2002).

Alguns trabalhos associam o efeito tóxico de compostos com o seu potencial em causar

hemólise em células do sangue. Fook et al. (2005), ao avaliar in vitro a influência de

inibidores protéicos encontrados no extrato da semente de tamarindo, não detectaram nem

atividade citotóxica e nem hemolítica. Yu et al. (2007) correlacionaram positivamente os

efeitos tóxicos promovidos pelo veneno de água-viva com sua alta capacidade em provocar

lise nos eritrócitos do sangue. Dharmananda (2000) determinou a toxicidade de saponinas

encontradas em plantas ao perceber que doses elevadas do composto rompiam as células

15

vermelhas do sangue após promover a lise de suas membranas. Desta forma, a atividade

hemolítica vem sendo diretamente relacionada ao estudo da inocuidade do produto, em que

os resultados são interpretados como indicativos de toxicidade.

6. Secagem de alimentos por liofilização

A liofilização é o processo em que a umidade da emulsão congelada é retirada por

sublimação, sob alto vácuo e baixa temperatura. O produto obtido é um tipo de esponja

seca, que pode facilmente ser reduzida a pó (FODA et al., 1972). A mudança de estado

físico da água pode resultar em produtos com maior suscetibilidade a oxidação, uma vez

que propicia o rompimento da matriz de sólidos disponibilizando-os para tais reações

(DESOBRY et al.,1997).

O grande diferencial da liofilização está no fato do produto permanecer no estado

sólido durante todo o processo. A maior parte da água passa do estado sólido para o vapor

sem passar pelo estado líquido, preservando assim a estrutura original do produto, obtendo-

se ao final do processo, um produto poroso e com baixa umidade residual. Modificações

físico-químicas são inibidas, minimizando a perda de constituintes voláteis ou a perda de

atividade biológica ou outra atividade na preservação da estrutura molecular (FORD &

DAWSON, 1994; PITOMBO et al., 1994). Os constituintes não aquosos são concentrados

em uma pequena quantidade de água, resultando em alterações significativas das

propriedades da fase não congelada (pH, acidez titulável, força iônica, viscosidade, ponto

de congelamento, tensão superficial e interfacial, além do potencial de óxido-redução).

Ademais, a estrutura da água e a interação soluto-água podem ser alteradas (PITOMBO,

1994).

16

Segundo Oetjen (2004), um processo de liofilização otimizado pode ser obtido, se as

condições de operação forem controladas, com o objetivo de reduzir o tempo de processo e

consequentemente minimizar o consumo de energia, sem que ocorra a perda na qualidade

do produto liofilizado.

Um dos principais problemas da liofilização é seu alto custo, tanto para o capital de

investimento como para a operação do processo. Outro problema está relacionado ao longo

tempo de secagem que varia de 1 a 3 dias. Isto ocorre devido à baixa transferência de calor

dentro do produto, assim como a baixa pressão de operação do processo. A sublimação

consome quase metade da energia total necessária ao processo (45%). O congelamento

consome pouca energia, 4%, e a redução da pressão e a condensação dividem igualmente o

restante da energia (KHALLOUFI & RATTI, 2006).

Segundo Marques (2009), apesar do alto custo do processo e consequentemente do

produto final, a liofilização preserva as propriedades químicas e/ou físicas do material,

reduz o encolhimento e não ocorre a formação de camadas duras e impermeáveis, além de

ser amplamente difundida e utilizada por indústrias farmacêuticas, alimentícias e institutos

de pesquisa.

A secagem por liofilização ocorre em baixas temperaturas e apesar dos aspectos

positivos de conservação que confere ao produto, pode alterar as características sensoriais e

o valor nutricional de frutos, além disso, o grau de alterações depende de parâmetros

utilizados na elaboração e características particulares de cada produto. As frutas liofilizadas

tendem a preservar o sabor, o aroma, cor e textura originais do fruto fresco, necessitando de

testes sensoriais eficientes para avaliar a intensidade de mudanças ocorridas após o

processo (SOUZA et al., 2014).

17

7. Análise Sensorial

Devido às constantes alterações nos hábitos alimentares, crescente produção e

desenvolvimento de novos produtos alimentícios, a utilização de testes que representam a

opinião do consumidor com segurança e eficiência se torna necessária. Desta forma, testes

sensoriais são realizados em produtos específicos, como frutas desidratadas, para direcionar

o gosto e a preferência do público alvo em questão (SANTOS, 2011).

Os métodos sensoriais são divididos em dois grandes grupos: analíticos e afetivos.

Os métodos analíticos são aplicados em avaliações que necessitam de seleção e/ou

treinamento da equipe, como também se faz necessário avaliar objetivamente os

consumidores onde são consideradas as preferências ou opiniões pessoais dos membros da

equipe (ABNT, 1993). O método se divide em dois grandes grupos: testes discriminativos

(de diferença) e descritivos (FERREIRA et al., 2000).

Os testes afetivos avaliam diretamente a opinião (preferência e/ou aceitabilidade) do

consumidor, sobre características específicas do produto ou ideia sobre o mesmo, sendo

também chamado de teste do consumidor. O teste afetivo se divide em dois: teste de

aceitação e teste de preferência (MEILGAARD et al., 1991). A escolha do teste é

extremamente importante para a avaliação sensorial, pois a correta aplicação definirá a

relevância das respostas obtidas para o sucesso do estudo.

Com a alta suscetibilidade a rejeição sensorial de alimentos ricos em taninos devido

a sua adstringência, a análise sensorial torna-se uma ferramenta essencial e necessária para

avaliar os níveis de aceitabilidade para adição do extrato da semente de tamarindo à

mistura.

18

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28

29

CAPÍTULO II

OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO PARA ELABORAÇÃO DE EXTRATO AQUOSO

LIOFILIZADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica)

OPTIMIZATION OF PROCESS FOR PREPARING AQUEOUS EXTRACT

LYOPHILIZED OF THE TAMARIND (Tamarindus indica) SEED

Danilo Santos Souza1*

, Helena Teixeira Godoy1

SOUZA, D. S.; GODOY, H. T.

1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,

Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato, 80, Laboratório

de Análise de Alimentos – DCA/FEA. Cidade Universitária Zeferino Vaz, 13083-862,

Campinas, SP, Brasil

* Autor para correspondência: [email protected]

Fone: (19) 3521-4023

Colaborador: [email protected]

Manuscrito em preparo para ser submetido ao periódico Food Science and Technology,

Campinas

30

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi determinar a melhor condição de processamento da semente

em que há a maior migração de compostos fenólicos totais para o extrato aquoso obtido. As

variáveis tempo (s) que corresponde ao tempo de trituração da mistura (semente e água) e a

variável m/v, que representa a relação massa de semente (g) fixada em 100 g e o volume

(mL) de água adicionado foram estudadas. A composição de fenólicos totais em

equivalência ao ácido gálico (mgAG/gs.s.) foi utilizado como resposta, a partir do método de

Folin-Coucalteau. A variável tempo (s) exerceu maior influência na extração dos

compostos fenólicos, assim sendo, o ensaio 8 (60 s e 1:3 m/v) respondeu como a melhor

condição de extração com 61,57 mgAG/gs.s., sendo que não houve interação considerável

entre os efeitos principais, porém o modelo foi significativo ao ajustar os dados

experimentais. De forma univariada, o acréscimo do tempo promoveu melhores resultados

de fenólicos (80 e 100 s de trituração), com 67,40±0,68 e 66,80±2,32 mgAG/gs.s.. Desta

forma, estabeleceram-se condições de extração dos compostos fenólicos totais da semente

em uma relação (m/v) de 1:3 de semente e água, a um período de trituração de 80 s em que

o mosto resultante seja processado mais uma vez.

Palavras chave: Extração aquosa, compostos fenólicos, liofilização, superfície de resposta.

31

1. Introdução

A crescente demanda por alimentos mais saudáveis visando favorecer uma melhor

dieta e a melhoria da qualidade de vida vem contribuindo para um aumento significativo

neste segmento da indústria de alimentos (Oliveira et al., 2013). No entanto, a quantidade

consumida destes alimentos está longe de se equiparar ao volume de produção, devido às

dificuldades de escoamento da matéria-prima, transporte inadequado, maus tratos pós-

colheita, déficit de planejamento no preparo e baixa acessibilidade à população. Além

disso, existe uma grande dificuldade em encontrar opções de alimentos que reúnam as

características sensoriais e funcionais aceitáveis. Os alimentos funcionais fazem parte de

uma nova concepção de alimentos e são definidos como qualquer alimento que, além de

possuir as características nutricionais básicas, auxilia na prevenção e redução do risco de

doenças crônicas acarretando em supostos benefícios fisiológicos (Stratton et al., 2015).

O tamarindo é um fruto tropical que possui diversas propriedades funcionais devido

a presença de minerais, açúcares, vitaminas e alguns compostos, como os fenólicos e

tocoferóis, aos quais se atribuem sua atividade antioxidante (Siddhuraju, 2007). No entanto,

as sementes que compõem boa parcela do fruto ainda são pouco reaproveitadas para fins

alimentícios e são consideradas como resíduos em grandes indústrias de suco, sendo

destinada às indústrias têxtil ou simplesmente descartadas, gerando altos custos com

tratamento visando minimizar os impactos ambientais provocados. A semente apresenta

capacidade antioxidante e presença de compostos fenólicos (Tsuda et al., 1994) e

tocoferóis (Luzia & Jorge, 2011) em sua composição. Alguns estudos também mostraram

que o extrato aquoso da semente de tamarindo apresentou consideráveis atividades anti-

32

hiperlipidêmica e antidiabética, reduzindo o açúcar do sangue, colesterol total e triglicerois

em ensaios com ratos (Maiti et al., 2004; Maiti et al., 2005). Para consumo humano, na

Índia alguns povos utilizam a semente de tamarindo torrada e triturada em substituição ao

café, utilizando água quente para obtenção da bebida (Siddhuraju, 2007).

O enriquecimento de alimentos surgiu como estratégia para combater algumas

deficiências nutricionais em populações de risco (Reilly, 1996). No entanto, com a busca

por alimentos mais saudáveis, os consumidores estão dando preferência para alimentos que

além de possuir as qualidades nutricionais, promovam certa funcionalidade, favorecendo

uma melhoria na qualidade de vida.

Considerando todo potencial funcional atribuído à semente de tamarindo, a

elaboração de um produto estável concentrado de bioativos a base de semente pode ser uma

alternativa para o enriquecimento de diversos tipos de alimentos, além de criar novas

formas de utilização da semente, maximizando o aproveitamento do fruto e minimizando a

geração de resíduos. Ferramentas estatísticas multivariadas vêm sendo muito utilizadas na

pesquisa para otimização de diferentes técnicas, sendo muito úteis nos campos da

engenharia e química (Breitkreitz et al., 2009). Diferentes trabalhos utilizando a otimização

multivariada para extração de compostos bioativos podem ser encontrados na literatura

(Kaiser et al., 2013; Sharif et al., 2014; Wong et al., 2015). Desta forma, o objetivo deste

trabalho foi determinar a melhor condição de extração aquosa da semente de tamarindo de

modo a obter um produto liofilizado com o maior teor de compostos fenólicos, e com isso,

favorecer o potencial antioxidante deste produto concentrado.

33

2. Material e Métodos

2.1 Obtenção e preparo de amostras

Os frutos de tamarindo foram adquiridos dos estados de Minas Gerais, São Paulo e

Bahia, das cidades de Patos de Minas (18° 34' S e 46° 31' O), Campinas (22º 49' 3'' S e 47°

4' 11" W) e Tanhaçu (14° 1' 11'' S e 41° 14' 7'' O), respectivamente, nos anos de 2012 e

2013. Após a aquisição, foram descascados e a semente envolvida pela polpa ficou de

molho por 24 hs, para hidratação e facilitar a separação. Posteriormente, a mistura foi

pulsada em liquidificador industrial (modelo AR 2L, Colombo®, 800 W e 60 Hz) e filtrada

em peneira comum para separar a polpa da semente.

Para facilitar o processamento da semente, as amostras homogeneizadas dos 3

estados, foram previamente triturada em liquidificador industrial para romper a camada

rígida da semente e então deixada de molho com água na mesma proporção 1:1 (m/v) por

24 h à 18°C. Após sua hidratação, uma alíquota foi retirada de cada amostra para realização

da análise de umidade em estufa a 105ºC e o restante submetida aos ensaios de otimização.

2.2 Reagentes e padrões

Foram utilizados os reagentes Folin-Ciocalteau (Dinâmica, Brasil), carbonato de

sódio (Synth, Brasil) e o padrão de ácido gálico (Sigma Aldrich, EUA).

34

2.3 Ensaios de otimização

Nos ensaios para o planejamento em Delineamento Composto Central Rotacional

(DCCR) foram estudadas duas variáveis independentes em seus respectivos níveis,

conforme mostrado na Tabela 1. A variável tempo (s) corresponde ao tempo de trituração

da mistura (semente e água) em liquidificador industrial. Por outro lado, a variável m/v,

representa a relação massa de semente (g) fixada em 100 g e o volume (mL) de água

adicionado.

Tabela 1. Distribuição dos níveis para o planejamento experimental.

Fatores

Níveis

-1,42 -1 0 +1 +1,42

Tempo (s) 20 26 40 54 60

m/v (g/mL) 100:100 100:159 100:300 100:441 100:500

Após os ensaios, a mistura obtida foi filtrada em peneira comum com área de malha

de 1 mm2. Posteriormente uma alíquota do extrato foi submetida à análise de compostos

fenólicos totais e o restante ao processo de liofilização para obtenção do pó.

2.4 Determinação de Fenólicos Totais

O conteúdo total de compostos fenólicos do extrato aquoso das amostras foi

determinado pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau (Singleton et al., 1999).

35

Para a realização da análise, o extrato foi filtrado através do papel filtro tipo Watman®

nº1

com auxílio de vácuo e uma alíquota de 25 μL do extrato aquoso foi transferida para

microplaca de 96 poços e adicionado 125 μL do reagente Folin-Ciocalteau, diluído em água

destilada na proporção de 1:10. A mistura permaneceu em repouso por 5 minutos. Em

seguida, foi adicionado 100 μL de carbonato de sódio 4% e deixados em repouso por 2

horas, ao abrigo da luz. A absorbância (740 nm) foi medida em microleitora BMG

Labtech®

modelo Fluostar Omega (EUA). Uma amostra controle e o branco (água

destilada) foram conduzidos nas mesmas condições e os resultados dos compostos

fenólicos totais foram expressos em equivalente de ácido gálico, com base em uma curva

de calibração de ácido gálico variando de 5 a 100 μg/mL.

2.5 Análise estatística

Para determinar os efeitos do processo de preparo do extrato sobre a resposta da

composição de fenólicos totais foi aplicada a análise de variância (ANOVA). Foram

avaliadas a significância dos efeitos principais e a interação entre eles, além da falta de

ajuste do modelo teórico para a superfície de resposta obtida com os dados experimentais

utilizando o software Statistica 7.0.

3. Resultados e Discussão

As distribuições dos experimentos juntamente com os respectivos resultados do teor

de compostos fenólicos totais (FT) para cada ensaio estão apresentadas na Tabela 2.

36

Tabela 2. Distribuição dos ensaios de extração aquosa da semente para o delineamento

composto central.

Experimentos

Tempo

(s)

Relação (m/v)

(g/mL)

FT

(mgAG/gs.s.)

1 26 (-1) 100:159 (-1) 42,81

2 54 (+1) 100:159 (-1) 54,76

3 26 (-1) 100:441 (+1) 33,49

4 54 (+1) 100:441 (+1) 48,61

5 40 (0) 100:100 (-1,42) 47,63

6 40 (0) 100:500 (+1,42) 41,38

7 20 (-1,42) 100:300 (0) 26,19

8 60 (+1,42) 100:300 (0) 61,57

9 40 (0) 100:300 (0) 47,53

10 40 (0) 100:300 (0) 45,60

11 40 (0) 100:300 (0) 49,13

Aplicando a análise de superfície de respostas (Figura 1) é possível observar que a

variável tempo (s) exerceu maior influência na extração dos compostos fenólicos, sendo

que, quanto maior o tempo de trituração com água, maior o conteúdo de fenólicos extraído,

assim como, quanto menor o tempo, menor a eficiência da extração dos fenólicos. Por outro

lado, a relação m/v mostrou não ter tanta influência no processo de extração, porém seu

comportamento indica uma tendência para uma maior extração quando a relação entre

volume e massa for menor. Desta forma, o ensaio 8 se apresentou como a melhor condição

37

de extração, com uma concentração de fenólicos totais de aproximadamente 61,57

mgAG/gs.s. e, o ensaio 7 com o menor teor, ou seja, de 26,19 mgAG/gs.s.

Figura 1. Influência do tempo de trituração (s) e relação volume/massa (mL/g) na extração

de fenólicos totais (FT) obtidos da semente de tamarindo.

A partir da análise de variância (ANOVA) apresentada na Tabela 3 é possível

observar que os efeitos principais foram significativos, a p≤0,05, para o modelo linear (L).

Porém, a variável m/v, apesar de significativa, se manteve próximo do limiar, indicando

que o tempo foi, de fato, o efeito mais significativo no processo. Analisando os efeitos de

interação entre as variáveis, observa-se também que não foram significativos, indicando

que elas não agem em conjunto para melhoria da extração dos compostos fenólicos. Da

mesma forma, nenhum dos efeitos foi significativo para o modelo quadrático (Q), o que

aparentemente aponta uma relação direta na variação dos níveis com a resposta.

38

Tabela 3. Análise de Variância (ANOVA) do delineamento experimental para extração

aquosa de compostos fenólicos totais da semente de tamarindo.

Soma Quadrática GL MS F P

(1)Tempo(s)(L)* 744,1369 1 744,1369 237,5446 0,004183

Tempo (s) 14,3410 1 14,3410 4,5780 0,165761

(2) v/m (L) 73,8176 1 73,8176 23,5642 0,039914

v/m (Q) 9,2459 1 9,2459 2,9515 0,227936

1L x 2L 2,5307 1 2,5307 0,8079 0,463612

Falta de Ajuste 71,6206 3 23,8735 7,6209 0,118202

Erro Puro 6,2652 2 3,1326

Total 916,7274 10

*Valores em negrito foram significativos (p≤0,05).

Também pode ser observado, que a falta de ajuste não foi significativa (p=0,118),

portanto, o modelo linear teórico se ajusta aos dados experimentais, obedecendo a

distribuição normal. Para melhor visualizar o comportamento da resposta sobre as variáveis

e sua interação, os efeitos estão representados na Figura 2.

39

Figura 2. Efeito das variáveis sobre a extração aquosa de compostos fenólicos totais

da semente de tamarindo.

Observa-se que o efeito principal Tempo (s) foi positivo e apresentou maior

significância, ou seja, se o tempo de trituração for aumentado, o teor de compostos

fenólicos totais também aumentará. Já a relação m/v foi significativa, porém, com pouca

relevância e de forma negativa em que a resposta é reduzida se a relação for aumentada. De

forma ilustrativa, também se pode notar que os efeitos principais para o modelo quadrático

e a interação entre eles não foram significativos, sendo que não atingiram valores iguais ou

superiores a 5% de probabilidade.

A partir dos resultados obtidos no planejamento DCCR, observou-se uma tendência

linear positiva na concentração de fenólicos no extrato aquoso à medida que se aumentava

o tempo de trituração, enquanto que a variável relação m/v não apresentou forte

significância no processo de extração. Desta forma, seria necessário aumentar o tempo de

trituração em um experimento univariado, o que levou ao planejamento de um novo

experimento.

40

Como o objetivo era utilizar a menor quantidade de massa possível e o modelo

mostrou que à medida que se aumenta a relação m/v, melhora a eficiência de extração, foi

estabelecido o valor máximo de 100 g para os próximos ensaios univariados a partir do

efeito Tempo (s).

A segunda etapa de otimização consistiu em prolongar o tempo de extração para

mais 5 ensaios em triplicata, a partir do ponto mais eficiente (ensaio 8) obtido no

delineamento experimental DCCR em que usa-se a uma relação m/v de 100:300 e um

tempo de 60 s, e assim avaliar até onde a variável Tempo (s) continuaria apresentando

efeito linear de extração. Foram acrescidos intervalos de 20 s até os 160 s, como mostrado

na Tabela 4, juntamente com as respostas para cada ensaio.

Tabela 4. Influência do tempo de trituração na extração de compostos fenólicos

totais (FT) da semente de tamarindo.

Tempo (s) FT (mgAG/gs.s.) DP

60 61,57ab*

±1,29

80 67,40a ±0,68

100 66,80a ±2,32

120 64,83ab

±3,08

140 60,80ab

±3,64

160 58,49b ±2,47

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não apresentam diferença

significativa entre si a p≤0,05 pelo teste de Tukey; n=3.

41

Pode ser observado que os extratos obtidos dos ensaios em 80 e 100 s de trituração

tiveram os maiores resultados em concentração de compostos fenólicos totais, com

67,40±0,68 e 66,80±2,32 mgAG/gs.s., respectivamente, apesar de mostrarem igualdade

significativa com os tempos 60, 120 e 140 s. A partir de 120 s de trituração a concentração

dos fenólicos começou a diminuir no extrato, sendo que no tempo 160 s já apresentou

diferença significativa dos tratamentos anteriores, com resultado aproximado de 58,49±2,47

mgAG/gs.s.. Sendo assim, o comportamento de extração com o aumento do efeito principal

Tempo (s) em experimento univariado, tende a ter um comportamento quadrático e não

mais linear como visto nos resultados do planejamento DCCR. Pelos tempos de trituração

estudados, apesar de não ser significativo, notou-se um decaimento nos valores de

compostos fenólicos totais a partir de 80 s, tendendo a se reduzir ainda mais com o aumento

do tempo.

Com os resultados obtidos a partir da segunda etapa de extração, em que se estendeu

o tempo de trituração da semente, foi determinado os melhores pontos (80 e 100 s) com

igualdade significativa a p≤0,05 entre ambos, para dar sequência à terceira etapa do

processo de extração, que visa aumentar as etapas de trituração e melhorar a eficiência na

retirada dos compostos fenólicos. Já que os ensaios com 80 e 100 s foram

significativamente iguais, escolheu-se o menor valor, tendo como critério a redução do

tempo de experimento e o gasto de energia.

A terceira etapa consistiu em extrair novamente o mosto resultante do ensaio em 80

s de trituração, com o mesmo volume de água adicionado inicialmente (300 mL), por mais

4 vezes, totalizando 5 extrações sucessivas. A Figura 3 apresenta a influência do número de

extrações do mesmo mosto da semente sobre a concentração de FT. Observa-se que houve

42

um decréscimo significativo nos valores de FT à medida que as extrações vão sendo

realizadas, até ficar constante nas últimas etapas. Também se notou que a 2ª extração

representa quase 50% da 1ª e as 3ª, 4ª e 5ª extrações foram significativamente iguais entre

si, porém diferentes das duas primeiras.

1º 2º 3º 4º 5º

0

10

20

30

40

50

60

70

ccc

b

FT

(m

gA

G/g

s.s

.)

Extrações

a

Figura 3. Influência do número de extrações sucessivas sobre o teor de compostos fenólicos

totais extraídos da semente de tamarindo. Médias seguidas pela mesma letra apresenta

igualdade significativa entre si (p≤0,05)

A partir dos resultados obtidos com as etapas de otimização da extração aquosa de

compostos fenólicos da semente do tamarindo, estabeleceu-se as condições que resultaram

na maior eficiência no processo de extração, as quais foram então utilizadas para recuperar

os compostos fenólicos da semente de tamarindo. Tais condições representam uma relação

m/v de 1:3 de semente e água, submetidos a um período de trituração de 80 s em que o

mosto resultante do primeiro processo é utilizado novamente nas mesmas condições de

extração. O extrato líquido foi congelado a -18ºC e submetido ao processo de liofilização

43

por 48 horas a uma pressão de 87 µmHg. O pó obtido após a liofilização teve umidade de 2

g/100 g em base úmida e um rendimento de, aproximadamente 25% de sólidos secos em

relação à semente in natura, ou seja, para cada 100 g de sólidos secos da semente in natura,

têm-se um rendimento de aproximadamente 25 g de sólidos secos do pó.

4. Conclusão

Utilizando o Delineamento Composto Central Rotacional e experimentos

univariados, foi possível estabelecer a melhor condição de extração aquosa da semente de

tamarindo frente ao teor de compostos fenólicos totais. Para uma extração mais eficiente foi

estabelecido condições em que se tenha uma relação (m/v) de 1:3 de semente e água sob

um período de trituração de 80 s, em que o mosto resultante seja novamente processado

mais uma vez. O pó resultante do processo de liofilização poderá ser uma opção de uso

para enriquecer outros alimentos com a função de melhorar a bioatividade com

características sensoriais aceitáveis.


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46

47

CAPÍTULO III

INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DO EXTRATO AQUOSO LIOFILIZADO DA

SEMENTE SOBRE O TEOR DE FENÓLICOS TOTAIS, CAPACIDADE

ANTIOXIDANTE E ATIVIDADE HEMOLÍTICA DA POLPA DE TAMARINDO

(Tamarindus indica L.)

Danilo Santos Souza1*

, Helena Teixeira Godoy1

SOUZA, D. S.; GODOY, H. T.

1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos -

UNICAMP, Brasil.

*Rua Monteiro Lobato, 80, Laboratório de Análise de Alimentos – DCA/FEA. Cidade

Universitária Zeferino Vaz, 13083-862, Campinas, SP, Brasil

* Autor para correspondência: [email protected]

Fone: (19) 3521-4023

Colaborador: [email protected]

Manuscrito em preparo para ser submetido ao periódico Journal of Food Science and

Technology

48

RESUMO

A semente do tamarindo em sua forma natural é rica em compostos fenólicos que

promovem sua funcionalidade. O objetivo do trabalho foi avaliar a influência da adição do

extrato aquoso liofilizado da semente sobre a polpa em resposta ao teor de fenólicos totais,

capacidade antioxidante e atividade hemolítica de frutos oriundos de diferentes regiões do

Brasil (Minas gerais, São Paulo e Bahia), em safras de 2012 e 2013. O extrato aquoso da

semente foi liofilizado para obtenção de um pó, que por sua vez foi adicionado em

diferentes concentrações à polpa (0,3, 1,15 e 2%). O teor de fenólicos totais foi obtido

seguindo o método de Folin-Cioucalteou, sendo que a adição gradativa de extrato aquoso

liofilizado da semente à polpa promoveu um aumento significativo, principalmente para as

amostras adquiridas do estado da Bahia, alcançando 46,88±2,13 mgAG/gs.s. A capacidade

antioxidante pelos métodos DPPH, ABTS, FRAP e ORAC mostraram que a adição de

extrato aquoso liofilizado à polpa elevou de forma considerável a capacidade antioxidante

da mistura, dando destaque para as amostras de Minas Gerais, com aumentos de até 1942%

com o método ABTS na adição de 2% de extrato. A atividade hemolítica das amostras (São

Paulo e Bahia) realizada com eritrócidos de sangue humano apresentou altos índices de

hemólise, chegando a 98,8% de lise para São Paulo (1,15%) do lote 2 e 98,5% para Bahia

(0,3%) do lote 1. Mudanças do local de colheita e diferentes lotes influenciaram na

variações das respostas e o extrato aquoso liofilizado se mostrou eficiente para enriquecer a

polpa com compostos antioxidantes.

Palavras chave: Extrato aquoso, liofilização, fenólicos totais, PCA.

49

1. Introdução

O tamarindo (Tamarindus indica) é um fruto produzido nas regiões tropicais e

subtropicais do mundo e atualmente é um dos mais importantes vegetais utilizados como

fonte de alimentos em algumas regiões (Elumalai et al. 2015). Normalmente a polpa de

tamarindo é consumida na forma in natura ou é usada como matéria-prima para a produção

de bebidas, doces, sorvetes e como temperos para outros tipos de alimentos (Komutarin et

al. 2004). O Brasil é um dos maiores produtores de frutos e, em razão das boas condições

climáticas o tamarindo se adaptou bem ao território, sendo produzido em todas as regiões

do país (Silva et al. 2000). Os estudos farmacológicos da planta revelam que o tamarindo

possui atividades que combatem a ação do veneno de cobra, antibacteriana, antifúngica,

anti-inflamatória, antioxidante, além de atividades hepatoregenerativas (De et al. 2013).

Também é muito utilizado na medicina tradicional para o controle da diabetes mellitus

(Maiti et al. 2004).

O consumo de alimentos que contêm grandes quantidades de compostos com alta

capacidade antioxidante é sugerido como sendo capaz de reduzir riscos de doenças

degenerativas (Li et al. 2015). Alguns trabalhos de pesquisa mostram que a semente de

tamarindo tem apresentado grande potencial antioxidante, sendo que a atividade é atribuída

à forma de componentes antioxidantes isolados, como o 2-hidroxi-30,40-

dihidroxiacetofenona, metil 3,4-dihidroxibenzoato,3,4-dihidroxifenilacetato e (-)-

epicatequina, além de proantocianidinas oligoméricas e taninos poliméricos (Tsuda et al.

1993; Tsuda et al. 1994). Alimentos, bebidas e extratos de plantas ricos em fenólicos, como

o vinho tinto, extrato da semente de uva, chá verde e frutos in natura, vem sendo

50

consumido com mais frequência, pois tem se mostrado ser promissoras fontes de

compostos com tais características, uma vez que eles apresentam atividades hipolipidêmica,

antiaterosclerótica, antioxidante, anti-inflamatórias e imunomoduladoras (Paula et al.

2009).

Os métodos utilizados para determinação da capacidade antioxidante são

classificados de acordo com sua natureza, seja biológica com ensaios realizados em animais

(in vivo) e em sangue (in vitro) ou de natureza química por meio dos mecanismos de ação,

priorizados pela transferência de elétrons ou de hidrogênio (Tsoi et al. 2015; Chisté et al.

2014; Apak et al. 2013). Geralmente, os mais utilizados são os métodos in vitro que se

baseiam na captura ou eliminação de radicais livres gerados na reação ou redução de íons

metálicos (Tsoi et al. 2015). Porém, alguns trabalhos sugerem a utilização e correlação de

diversos métodos em paralelo para determinação da capacidade antioxidante, devido à

geração de resultados distintos produzidos por cada um deles (Pérez-Jiménez et al. 2008;

RUFINO et al. 2010; NIKI 2011; HE et al. 2015).

Para utilizar extratos vegetais na dieta humana como forma de enriquecimento de

alimentos é necessário e essencial avaliar os aspectos de segurança e especialmente o

potencial toxicológico do produto (Liang et al. 2015). A determinação da toxicidade é um

fator importante para distinguir os produtos a serem consumidos, e a atividade hemolítica

representa um ponto de partida fundamental, que fornece uma informação primária sobre a

interação entre as moléculas biológicas do produto com células do sangue (Kumar et al.

2011). Sendo assim, de forma geral, a atividade hemolítica representa um indicador de

citotoxicidade de qualquer composto em relação a células normais e saudáveis do sangue

(Silva et al. 2004). Devido à relevância do potencial bioativo apresentado pela semente de

51

tamarindo em diversos trabalhos encontrados na literatura, decidiu-se obter um extrato

aquoso desidratá-lo por liofilização e adicionar este produto à polpa como forma de

enriquecimento e aproveitamento do fruto. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi

avaliar a capacidade antioxidante, teor de fenólicos totais e atividade hemolítica do

tamarindo, colhido em diferentes estados do Brasil, na forma de polpa e semente, extrato

aquoso liofilizado da semente e sua aplicação em diferentes concentrações na mistura com

a polpa liofilizada.



Foram utilizados os reagentes metanol p.a (Synth, Brasil), etanol p.a (Synth, Brasil),

fosfato de sódio monobásico p.a (Êxodo, Brasil), fosfato de sódio dibásico p.a (Êxodo,

Brasil), cloreto de sódio p.a (Synth, Brasil), Folin-Ciocalteau (Dinâmica, Brasil), carbonato

de sódio (Synth, Brasil), ABTS - 2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina-6-ácido sulfônico

(Sigma Aldrich, EUA), persulfato de potássio p.a (Synth, EUA), DPPH - 1,1-difenil-2-

picrilidrazil (Sigma, Aldrich, EUA), TPTZ - 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine (Sigma Aldrich,

EUA), cloreto férrico p.a (Synth, EUA), acetato de sódio p.a (Nuclear, Brasil), ácido

acético p.a (Synth, EUA), fluoresceína p.a (Synth, EUA), AAPH - 2,2'-azobis(2-metil-

propianamidina)dicloridrato (Sigma Aldrich, EUA), fosfato de potássio monobásico p.a

(J.T. Baker, EUA), fosfato de potássio dibásico p.a (J.T. Baker, EUA), SDS – dodecil

sulfato de sódio p.a (Sigma Aldrich, EUA) e os padrões de ácido gálico (Sigma Aldrich,

EUA) e Trolox (Sigma Aldrich, EUA).

52

2.2 Obtenção e preparo da matéria-prima




2013. Todas as amostras foram colhidas no período de setembro dos respectivos anos. Após

a aquisição, foram descascados e a polpa juntamente com a semente ficou de molho por 24

hs para hidratação e facilitar a separação. Posteriormente, a mistura foi pulsada em

liquidificador industrial (modelo AR 2 L, Colombo®, 800 W e 60 Hz) e filtrada em peneira

comum para separar a polpa da semente. Parte da polpa e semente foram liofilizados e

submetidos à análise de umidade em estufa a 105ºC.

2.3 Extração

2.3.1 Preparo do extrato aquoso liofilizado

O extrato aquoso da semente foi obtido a partir da moagem da semente em uma

relação m/v de 1:3 de semente e água, submetidos a um período de trituração de 80 s em

que o mosto resultante do primeiro processo foi utilizado mais uma vez nas mesmas

condições de extração. O extrato obtido foi congelado em bandejas com 1 cm de espessura

e posteriormente liofilizado em um equipamento da marca Terroni®

modelo LS3000 por

um período de 48 h, até umidade constante de, aproximadamente, 2,00 gágua/100 g.

53

Para obtenção da mistura de extrato aquoso e polpa, as amostras dos respectivos

estados de origem foram homogeneizadas nas concentrações de [1] – 0,3%, [2] – 1,15% e

[3] – 2,0% de extrato liofilizado na polpa in natura. Depois de adicionados, o míx foi

liofilizado e embalado a vácuo sobre o abrigo da luz até o momento da análise.

2.3.2 Preparo dos extratos para análises de antioxidantes e fenólicos totais

Os extratos da polpa, semente, extrato aquoso da semente liofilizado e mistura de

polpa e extrato da semente foram obtidos de acordo a metodologia proposta por

Shivashankara et al. (2004), com algumas modificações. Aproximadamente, 3 g para

amostras úmidas (polpa in natura e semente hidratada) e 0,5 g para amostras liofilizadas

(extrato aquoso e mistura de polpa e extrato) foram homogeneizadas com 20 mL de mistura

metanol:água (80:20) usando Turrax®. A mistura foi sonicada em ultrassom por 45 minutos

e centrifugada a 4200 rpm por 15 minutos à 4°C. O sobrenadante foi coletado e o

precipitado foi extraído mais duas vezes com 5 mL de metanol:água (80:20) nas condições

previamente descritas. Os dois sobrenadantes coletados foram misturados e filtrados em

papel filtro tipo Whatman nº 1.

2.3.3. Preparo dos extratos para análise de atividade hemólítica

Após seguir o mesmo procedimento do item 2.2.1 para antioxidantes e fenólicos, os

filtrados foram concentrados até a secura em evaporador rotativo, e ressuspendidos em 2

54

mL de tampão PBS (tampão fosfato salino) previamente esterilizado. Depois, foram

armazenados à -26°C até o momento das análises de atividade hemolítica.

2.4 Determinação de fenólicos totais

O conteúdo total de compostos fenólicos do extrato das amostras foi determinado

pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau (Singleton et al. 1999). Para a

realização da análise, uma alíquota de 25 µL do extrato metanólico foi transferida para o

poço da microplaca e adicionado 125 µL do reagente Folin-Ciocalteau, diluído em água

destilada 1:10. A mistura permaneceu em repouso por 5 minutos. Em seguida, foi

adicionado 100 µL de carbonato de sódio 4% e a mistura deixada em repouso por 2 horas,

ao abrigo da luz. A absorbância foi medida em microleitora da marca BMG Latech®,

modelo Fluostar Omega. a 740 nm. Uma amostra em branco foi conduzida nas mesmas

condições e os resultados dos compostos fenólicos totais foram expressos em equivalente

de ácido gálico (mgAG/g s.s.), com base em uma curva de calibração de ácido gálico com

concentrações variando de 16 a 72 μg/mL.

2.5 Capacidade antioxidante

2.5.1 Ensaios de ABTS (2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina-6-ácido sulfônico))

A atividade antioxidante foi determinada pelo método ABTS conforme metodologia

descrita por Rufino et al. (2010). O radical ABTS•+

foi formado pela reação de 7 mM de

55

ABTS com 140 mM de persulfato de potássio, armazenado ao abrigo da luz à temperatura

ambiente, por 16 horas. Uma vez formado, o radical foi diluído com etanol até a obtenção

da absorbância de 0,700 ± 0,05 a 734 nm. Cada extrato (polpa, semente, extrato aquoso da

semente liofilizado e mistura de polpa e extrato da semente) foi diluído conforme

necessidade. Em ambiente escuro, uma alíquota de 2,5 µL de cada diluição do extrato foi

transferida para poços de microplaca e uma mistura com 250 µL do radical ABTS•+

também foi adicionada na sequência. As absorbâncias foram então lidas a 734 nm em

microleitora da marca BMG Latech®, modelo Fluostar Omega. , após 6 minutos da reação,

utilizando o etanol como branco. O Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-

carboxílico), foi utilizado como antioxidante padrão para elaboração da curva de

calibração, nas concentrações de 17 a 850 μmol.L-1

, e os resultados foram expressos em

equivalente de μM Trolox/g ss.

2.5.2 Ensaios de DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazil) – Sequestro do radical livre

A determinação da atividade antioxidante utilizando a redução do radical livre

DPPH• foi baseada na metodologia adaptada de Brand-Williams et al. (1995). Uma solução

de metanol contendo 0,06 mmol.L-1

de DPPH• foi preparada. A microleitora foi calibrada

em uma absorbância de 515 nm utilizando o metanol como branco, e uma alíquota de 6 µL

do extrato, obtido anteriormente, foi adicionada a 234 µL da solução de DPPH• ajustada a

absorbância de 0,7±0,05. Após a mistura, a absorbância foi lida após 2 horas de reação

estabelecida em ensaios preliminares até a estabilização da absorbância. O padrão Trolox

56

foi utilizado para elaborar a curva de calibração com concentrações variando de 17 a 850

μmol.L-1

e a atividade antioxidante foi expressa em equivalente Trolox (μM Trolox/g s s.).

2.5.3 Ensaios de FRAP (Poder Antioxidante de Redução do Ferro)

A capacidade antioxidante das amostras estimada pelo ensaio de FRAP foi realizada

baseando-se na metodologia de Benzie and Strain (1996) com algumas modificações. O

reagente FRAP foi preparado na hora da análise com TPTZ, FeCl3 e um tampão acetato

utilizado como branco para calibrar espectrofotômetro a uma absorbância de 595 nm. Uma

mistura foi formada com uma alíquota de 7,35 μL do extrato, 220,6 µL do reagente FRAP e

22,6 μL de água destilada e permanecida em banho-maria a 37°C por 30 minutos antes da

leitura. O padrão Trolox foi utilizado para elaborar a curva de calibração com

concentrações variando de 17 a 850 μmol.L-1

e os resultados foram expressos em

equivalente Trolox (μM Trolox/g ss).

2.5.4 Ensaios de ORAC – Capacidade de Redução do Radical Oxigênio

Este método é baseado na capacidade fluorescente da fluoresceína sódica na

presença de radicais de oxigênio e foi realizado conforme a metodologia de Dávalos et al.

(2004). Primeiramente preparou-se uma solução de tampão fosfato (75 mmol.L-1

, pH 7,4)

que foi utilizada para solubilizar a fluoresceína e o AAPH (2,2'-azobis(2-metil-

propianamidina)dicloridrato). Para a análise, uma mistura de 120 µL de solução de

fluoresceína sódica, 20 µL de extrato e 60 µL de solução de AAPH foram adicionados à

57

microplaca e incubados a 37ºC. A leitura foi realizada em 520 nm de emissão e 485 nm de

excitação, através do decaimento da emissão de fluorescência em função do tempo até a

estabilização. O padrão Trolox foi utilizado para elaborar a curva de calibração com

concentrações variando de 35 a 220 μmol.L-1

e a atividade antioxidante foi expressa em

equivalente Trolox (μM Trolox/g s s.).

2.6 Atividade hemolítica

A atividade hemolítica foi realizada com eritrócitos nativos de sangue venoso

humano, coletados em tubos de vácuo contendo heparina sódica. Aproximadamente 2 mL

de sangue foram transferidos para microtubos e centrifugados a 1500 rpm a 4ºC. O plasma

foi descartado e os eritrócitos foram lavados 3 vezes com PBS (Tampão fosfato, pH 7,4)

estéril. Após a lavagem, preparou-se uma suspensão de 0,5% eritrócitos em PBS. Uma

alíquota de 200 µL de extrato (item 2.3.3) foi adicionada a 300 µL da suspensão de

eritrócitos e posteriormente incubada a 37ºC por uma hora em microplaca para cultura de

células de 48 poços sob agitação linear lenta. Após o período de incubação, a solução foi

transferida para microtubos de 1,5 mL e centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos à 4ºC. A

fase superior (200µL) foi transferida para microplacas de 96 poços, onde foi medida a

absorbância em um comprimento de onda de 540 nm. A atividade hemolítica foi expressa

em porcentagem de hemólise seguindo a equação abaixo.

% de Hemólise = (Absamostra - Absbranco)

Abscontrole - Absbranco x 100

58

Em que, Absamostra é a absorbância da amostra incubada com os eritrócitos, a Absbranco é a

absorbância do PBS incubado com os eritrócitos e a Abscontrole, referente à adição de uma

solução de 1% de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) incubado com os eritrócitos nas mesmas

condições experimentais (Dresch et al. 2005).


Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram

apresentados como a média e seu desvio padrão (DP). Análises de Variância (ANOVA)

foram aplicadas juntamente com o teste de Tukey para identificar se há diferença

significativa entre as médias, usando um software estatístico (Statistica® versão 8.0, EUA).

Diferenças entre as médias no nível de 5% (p≤0,05) foram consideradas significantes. A

Análise de Componentes Principais foi aplicada de forma exploratória, para avaliar

possíveis relações entre amostras de diferentes lotes e regiões do país, bem como a

influência da adição do extrato aquoso liofilizado da semente à polpa sobre o teor de

fenólicos totais e capacidade antioxidante, utilizando o software Pirouette 3.11 (Infometrix,

EUA).

.

59


3.1 Compostos fenólicos totais

O teor de compostos fenólicos do tamarindo em forma de polpa, semente, extrato

aquoso da semente liofilizada e da mistura de extrato e polpa liofilizados podem ser

encontrados na Tabela 1. Nota-se que o extrato aquoso da semente e a semente detiveram

os maiores teores de compostos fenólicos totais dentre as amostras analisadas e à medida

que se aumentou a concentração do extrato aquoso na polpa o teor de fenólicos foi

diretamente acrescido. A polpa teve os menores teores de fenólicos mesmo variando de

região ou ano de colheita.

Em se tratando da polpa, pode-se observar que a região de origem influenciou

significativamente no teor de fenólicos, sendo que a polpa oriunda do estado da Bahia (BA)

apresentou a maior concentração independente do lote, com 21,73±0,22 mgAG/gs.s. para o

lote 1 e 21,35±0,40 mgAG/gs.s. não identificando diferença significativa entre os anos de

colheita. Por outro lado, a polpa do fruto adquirido dos estados de São Paulo e Minas

Gerais apresentaram diferenças dependentes dos anos de colheita. Para PSP lote 1, por

exemplo, o teor de fenólicos totais foi maior (11,49±0,22 mgAG/gs.s.) do que a polpa do lote

2, que teve aproximadamente, 9,14±0,17 mgAG/gs.s. A mesma situação se repetiu para a

polpa do fruto adquirido no estado de Minas Gerais.

60

Tabela 1. Composição de compostos fenólicos totais para a polpa, semente, extrato aquoso

da semente e mix liofilizado de Tamarindo de diferentes estados do Brasil.

Amostras FT (mgAG/gs.s.)

***

Lote 1 Lote 2 Média

PMG**

7,63±0,25cA*

6,94±0,19cB

7,28±0,43c

PSP 11,49±0,22bA

9,14±0,17bB

10,32±1,30c

PBA 21,73±0,22aA

21,35±0,40aA

21,54±0,36a

SMG 281,09±11,09cA

281,29±10,28cA

276,19±9,57c

SSP 326,53±13,05bA

330,20±9,60bA

328,37±10,44b

SBA 359,39±8,56aA

365,16±7,73aA

362,27±7,95a

EMG 346,37±0,25cB*

368,45±4,27cA

357,41±13,35c

ESP 424,83±12,74bA

433,84±0,22bA

429,34±11,65b

EBA 464,73±7,22aA

475, 03±9,08aA

470,02±9,35a

MG [1] 12,28±1,16fA

11,82±1,65fA

12,05±1,29f

MG [2] 26,44±0,86eA

26,07±1,26eA

26,25±0,98e

MG [3] 41,59±2,10cA

40,81±1,94cA

41,20±1,86c

SP [1] 17,58±1,65fA*

13,94±1,57fA

15,76±2,46f

SP [2] 33,40±2,77dA

33,75±2,05dA

33,57±2,19d

SP [3] 53,01±1,99bA

50,68±2,52bA

51,85±2,40b

BA [1] 28,49±2,50deA

25,74±2,21eA

27,12±2,59de

BA [2] 46,18±2,76cA

47,58±1,51bA

46,88±2,13c

BA [3] 63,54±3,33aA

66,08±1,13aA

64,81±2,63a

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não representa diferença

significativa entre si a p<0,05 pelo teste de Tukey. **

P – polpa; S – semente; E - extrato aquoso; MG – Minas

Gerais; SP – São Paulo; BA – Bahia. Concentração de extrato aquoso na polpa: [1] – 0,3%, [2] – 1,15% e

[3] – 2,0%. ***

FT – Fenólicos Totais; AG – Ácido Gálico. n=3.

Para o teor de compostos fenólicos da semente a mesma sequência se repetiu, com a

maior concentração encontrada para as amostras oriundas do estado da Bahia, com

aproximadamente, 359,39±8,56 e 365,16±7,73 mgAG/gs.s. para os lotes 1 e 2,

respectivamente, seguida pelas amostras dos estados de São Paulo e posteriormente Minas

61

Gerais, não apresentando diferença significativa entre si. O extrato aquoso da semente de

tamarindo foi superior às demais amostras em relação ao teor de fenólicos, uma vez que ele

está sendo produzido com o intuito de enriquecer outros tipos de alimentos, inclusive a

polpa do próprio fruto, que apresentou baixo conteúdo de fenólicos. A ordem de grandeza

dos extratos se repetiu da mesma forma que os encontrados para semente e polpa, em que o

extrato elaborado em média com a semente oriunda da Bahia (470,02±9,35 mgAG/gs.s.) se

despontou das demais, seguido pelo extrato da semente de São Paulo e Minas Gerais com,

aproximadamente, 429,34±11,65 e 357,41±13,35 mgAG/gs.s. As misturas obtidas da junção

da polpa com o extrato da semente liofilizado tiveram aumentos significativos no teor de

fenólicos totais para todos os níveis de concentração adicionadas. Quanto maior a

concentração de extrato aquoso adicionado, maior foi o teor de fenólico obtido. Dentre os

tratamentos, destaca-se o mix dos frutos originados da Bahia que tiveram os maiores

resultados. O tratamento BA [2] que possui o segundo nível de adição de extrato aquoso à

polpa foi significativamente igual à MG [3] que possui a maior concentração de extrato do

estado de Minas Gerais, com 46,88±2,13 e 41,20±1,86 mgAG/gs.s, respectivamente. Sendo

assim, fica evidente que o teor de fenólicos pode variar de região para região de origem,

devido às mudanças no clima, principalmente em relação à incidência solar e índices

pluviométricos. Para o tratamento em que se adicionou 0,3% de extrato à polpa, os

aumentos, em média, ocorreram em uma taxa de 60%, 50%, e 28% para os estados de MG,

SP e BA, respectivamente, em relação à polpa in natura. Já para o segundo nível, com

adição de 1,15% do extrato à polpa, os aumentos em porcentagem média dos dois lotes

ficaram em torno de 260%, 265% e 117% para MG, SP e BA, respectivamente. E para o

terceiro nível, os aumentos foram de 465%, 400% e 200% para os estados de MG, SP e

62

BA, respectivamente. Observando os resultados das misturas, não houve diferença

significativa para o teor de compostos fenólicos totais com a variação do ano de colheita.

Alguns trabalhos relataram valores inferiores para os frutos de tamarindo do Brasil em

relação ao teor de compostos fenólicos totais extraídos da polpa, com valor de 3,35±0,02

mgAG/gs.s. (Tril et al. 2014) e para semente teores de 272±18,2 mgAG/gs.s. (Razali et al.

2012), utilizando metanol como solvente extrator.

O conteúdo de fenólicos dos vegetais está diretamente relacionado à sua capacidade

antioxidante, uma vez que a maioria destes compostos desempenha um papel importante na

neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de transição, gerando

intermediários estáveis devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura destas

substâncias (Naczk and Shahidi, 2004, Sousa et al. 2007).

3.2 Capacidade antioxidante

Atualmente, a capacidade antioxidante de materiais biológicos vem sendo estudada

com grande atenção, em que na maioria das pesquisas encontradas utiliza-se de dois ou

mais métodos químicos in vitro, com o objetivo de simular reações de inibição de radicais

responsáveis pela oxidação, através de possíveis antioxidantes presentes nas amostras

(Zulueta et al. 2009; Wang et al. 2010; Rufino et al. 2010; Souza et al. 2015). O grau de

capacidade antioxidante de materiais vegetais pode variar muito, atingindo grandes

discrepâncias devido a vários fatores, inclusive às propriedades dos substratos, condições e

estágios de oxidação, localização dos antioxidantes nas diferentes fases do processo de

oxidação, mesmo se o fruto for colhido da mesma planta e em épocas diferentes (Frankel

63

and Meyer, 2000; Wang et al. 2012). Em razão disto, os resultados para capacidade

antioxidante do tamarindo encontrados na Tabela 2 seguiram a mesma linha, mostrando

que o ano de colheita não implica necessariamente na igualdade dos resultados para frutos

de mesma origem. Observa-se de forma geral que as polpas apresentaram os menores

valores de capacidade antioxidante ao ser comparada com o restante das amostras,

independente do método utilizado. Dentre elas, a amostra originária da Bahia se destacou

alcançando os maiores valores. No entanto, apenas para o método ABTS, o segundo lote

PBA foi significativamente igual à polpa originária de São Paulo, com 29,2 e 25,3

mMTrolox/gs.s., respectivamente. As polpas PSP detiveram a segunda maior capacidade

antioxidante entre os estados, chegando a níveis de 125,4 mMTrolox/gs.s. pelo método ORAC.

Porém, nos ensaios de DPPH estas apresentaram menores desempenhos, também abaixo

das obtidas pelas amostras PMG com potencial variando de 26 mMTrolox/gs.s para o lote1 e

16,9 mMTrolox/gs.s para o lote 2. O método do DPPH é uma forma que se tem para sequestrar

radicais livres específicos, neste caso o próprio DPPH• como radical, se tratando assim de

uma estratégia predominante para identificar a atividade antioxidante dentre os ensaios in

vitro (Sascha et al. 2014). Possivelmente por estas razões, explica-se a igualdade

significativa (p<0,05) obtida entre as amostras PMG e PSP para o Lote 1 nos ensaios de

redução do ferro (FRAP). Ambas tiveram, aproximadamente, 12 mMTrolox/gs.s. de

capacidade antioxidante, representando um potencial 3 vezes menor que o conteúdo

encontrado para PBA, de 40,2 mMTrolox/gs.s. Em comparação aos outros métodos, o FRAP

respondeu com similaridade ao ABTS para PMG, apresentando valores inferiores. Por

outro lado, ao avaliar a PBA, o método também respondeu em conformidade com o DPPH

para ambos os lotes. A mesma relação foi encontrada por Liu et al. (2013) ao estudar a

64

capacidade antioxidante da manga. Para que os compostos presentes no FRAP tenham uma

melhor capacidade para ser relacionado como agente antioxidante, eles devem

necessariamente possuir um potencial padrão de reação para reduzir do Fe3+

para Fe2+

, o

que limita o método de abranger a classe de compostos que possuem capacidade

antioxidante e não são englobadas no método (Benzie and Strain 1999). Esta pode ser uma

possibilidade para os baixos resultados encontrados para a polpa de tamarindo pelos ensaios

de FRAP em comparação com outros métodos. As análises realizadas utilizando o método

de ORAC apresentaram as maiores valores para a polpa entre os ensaios de antioxidante, na

mesma ordem de classificação entre os estados de origem (MG, SP e BA), não havendo

igualdade significativa entre eles. A polpa PBA obteve a melhor resposta ao método, com,

aproximadamente 196 e 186 mMTrolox/gs.s., para lote 1 e lote 2, respectivamente. Na

sequência, a amostra PSP, teve valores equivalentes a, aproximadamente, 118 mMTrolox/gs.s.

para o lote 1 e 125 mMTrolox/gs.s. para o lote 2. Já entre os lotes, apenas as polpas oriundas

do estado de MG (PMG), apresentaram diferença significativa (p<0,05) entre si, com 71,4

mMTrolox/gs.s. e 105,6 mMTrolox/gs.s., para lote 1 e lote 2, respectivamente.

Com relação à semente, como era de se esperar, os métodos responderam de forma

distintas, chamando a atenção para a similaridade nos valores encontrados para os ensaios

realizados com o ABTS e ORAC, que não se repetiu para a polpa. Nota-se que os

compostos presentes na semente reagiram bem aos mecanismos de sequestro do radical

DPPH• e em consequência apresentou os maiores resultados em equivalência ao ácido

gálico.

65

Tabela 2. Capacidade antioxidante em Equivalente Trolox (ET) da polpa, semente, extrato da semente e mix de Tamarindo oriundo de

diferentes estados do Brasil.

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha para cada classe de amostra não representa diferença significativa entre si

a p<0,05 pelo teste de Tukey. n=3. **

P – polpa; S – semente; E - extrato aquoso; MG – Minas Gerais; SP – São Paulo; BA – Bahia. Concentração de

extrato aquoso na polpa: [1] – 0,3%, [2] – 1,15% e [3] – 2,0%. n=3.

Amostra

ABTS

ET (mMTrolox/gs.s.)

DPPH

ET (mMTrolox/gs.s.)

FRAP

ET (mMTrolox/gs.s.)

ORAC

ET (mMTrolox/gs.s.)

Lote 1 Lote 2 Lote 1 Lote 2 Lote 1 Lote 2 Lote 1 Lote 2

PMG**

6,5±0,9cD

13,4±1,7cD

38,7±3,9aC

31,3±1,8aC

12,4±1,8bD

12,9±0,4cD

71,4±5,0cB

105,6±11,6cA

PSP 13,4±0,9bB

25,3±1,0bB

26,0±2,2bB

16,9±1,0cB

12,7±4,7bB

24,0±2,4bB

118,6±10,0bA

125,4±11,7bA

PBA 40,1±3,7aB

29,2±1,5bB

42,0±2,1aB

36,8±1,3aB

40,2±1,5aB

30,4±3,0aB

196,6±6,9aA

186,4±14,6aA

SMG 508,2±57,2bCD

613,4±41,3bBC

1299,0±65,8cA

1321,1±133,2bA

778,6±76,6bB

702,3±41,1bB

526,8±18,7bCD

561,7±31,6aC

SSP 597,2±37,4bC

862,6±70,2aB

1481,7±97,3bA

1614,0±15,8bA

905,6±106,4bB

938,5±19,9aB

885,9±76,6aB

976,3±64,2aB

SBA 991,5±69,1aBC

976,5±51,1aBC

2056,8±39,9aA

2311,4±204,7aA

1229,6±116,3aB

1068,0±7,6aBC

956,7±56,3aC

744,5±40,6bCD

EMG 1718,4±151,8cBC

2200,8±208,4cA

2008,8±17,4bAB

1917,5±211,2cAB

1673,2±275,4cBC

1245,0±28,6bC

1425,4±192,0bC

1662,3±88,2cBC

ESP 2127,5±186,8bAB

2531,6±106,4bAB

1927,2±187,7bBC

2577,8±247,2bA

1922,1±169,6bBC

1384,7±111,1bC

2619,1±358,8aA

2681,5±254,0aA

EBA 2988,6±75,8aAB

3003,8±154,0aAB

2636,4±161,0aBC

3444,4±459,0aA

2554,0±179,6aBC

1806,1±125,3aD

2736,9±243,5aBC

2241±157,4bCD

MG [1] 35,3±9,5gD

41,8±2,0gD

63,7±6,0dC

66,2±10,1eC

37,2±3,7eD

32,3±3,6fD

94,2±5,8eB

119,4±5,9fA

MG [2] 101,0±8,8deD

143,4±4,5eBC

155,7±102,3bcD

119,2±9,9dCD

94,1±7,1cdDE

69,4±5,9deE

154,7±12,6dB

196,4±12,6eA

MG [3] 153,8±38,7cCD

227,6±5,5cAB

192,1±12,2bABC

174,5±27,9cBCD

166,6±7,3bCD

122,7±10,1bD

204,2±13,7cdABC

251,3±30,0cdA

SP [1] 45,0±6,4fgBC

64,2±2,2fB

28,9±2,0eC

53,5±4,3eBC

36,0±4,9eBC

48,9±3,6efBC

163,7±28,5dA

173,5±15,1eA

SP [2] 138,7±4,8cdC

176,3±5,5dB

111,7±3,6cB

136,2±5,4cdB

110,1±8,4cCD

76,3±6,3cdD

242,0±27,7cA

264,5±14,3cA

SP [3] 215,9±7,2bCD

276,3±5,3bB

178,9±15,4bDE

247,4±11,4bBC

172,6±6,1bE

129,7±12,9bF

358,2±19,8bA

376,8±19,1aA

BA [1] 86,4±2,1efB

75,9±4,9fBC

46,5±1,5eD

39,1±3,0eD

78,7±9,4dBC

58,1±5,7deCD

235,2±11,8cA

215,7±14,7deA

BA [2] 209,1±2,5bB

179,6±4,5dBC

137,0±5,8cDE

174,0±14,6cBCD

154,5±10,2bCD

97,5±7,9cE

344,4±31,7bA

321,7±14,3bA

BA [3] 322,0±14,9aC

327,2±14,1aC

245,5±13,6aD

340,1±16,9aC

248,9±14,8aD

174,9±14,6aE

464,5±12,6aA

399,1±16,7aB

66

A diferença de grandeza dos resultados das sementes sobre a polpa no método

DPPH chegou a níveis médios de, aproximadamente 37, 71 e 55 vezes mais, para frutos

oriundos dos estados de MG, SP e BA, respectivamente. Isso representa em termos

percentuais, a uma diferença de, aproximadamente 3700, 7100 e 5500% a mais na ordem

de grandeza para a capacidade antioxidante da semente sobre a da polpa. Tais resultados

revelam o grande potencial antioxidante que a semente de tamarindo possui, mas que não é

aproveitado nas indústrias de beneficiamento do fruto. Levando em consideração a

comparação entre lotes em um método específico, observa-se que a amostra SBA apareceu

com as melhores respostas para a maioria deles, exceto o resultado obtido para o lote 2 na

análise de ORAC, seguido pela polpa de SP e de MG.

A elaboração e aplicação do extrato aquoso como forma de aproveitar melhor o

potencial bioativo de vegetais vêm sendo muito estudado em trabalhos científicos, visto que

extratos produzidos com a maioria dos solventes orgânicos podem apresentar toxicidade e

atribuir prejuízos à saúde do consumidor ou paciente (Adeneye et al. 2006; Ndiaye, et al.

2008; Prudência, et al. 2012; Dias et al. 2015). A determinação da capacidade antioxidante

do extrato aquoso da semente de tamarindo pode favorecer em um melhor aproveitamento

do fruto, visto que o produto pode apresentar um grande potencial a ser utilizado na

indústria de alimentos. Como mostra a Tabela 2, todos os extratos aquosos liofilizados

analisados apresentaram capacidade antioxidante superior à da semente. Isto indica o

quanto o processo de extração foi eficiente em migrar e concentrar os compostos bioativos

da semente para o extrato. O procedimento de extração utilizando a trituração com água e a

liofilização possibilitou a concentração dos compostos no pó resultante, com isso a relação

de compostos e peso do produto favoreceu no aumento da capacidade antioxidante final,

resultando em superioridade aos resultados obtidos da semente. A ordem de grandeza entre

67

a capacidade antioxidante dos extratos seguiu a mesma lógica da semente, sendo que as

amostras obtidas do estado da Bahia (EBA) tiveram as maiores respostas para quase todos

os métodos, exceto para os ensaios de ORAC, em que o lote 1 foi significativamente igual

ao extrato ESP com valores de 2736,9±243,5 e 2619,1±358,8 mMTrolox/gs.s.,

respectivamente. Por outro lado, o lote 2 da EBA (2241,2±157) teve capacidade inferior ao

ESP (2681,5±254,0), mostrando diferença significativa (p<0,05). A aplicação do extrato

aquoso da semente de tamarindo vem sendo muito estudado com sucesso na atualidade,

principalmente em ensaios in vivo envolvendo ratos, na tentativa de atribuir uma relação

com a redução de diabetes melittus nos animais (Maiti et al. 2004; Leite et al. 2007; De et

al. 2013), antibactericida e antifúngico (Elumalay et al. 2015) e no combate ao colesterol

alto (Martinello et al. 2006; Librandi et al. 2007).

As formulações compostas por polpa de tamarindo liofilizada e extrato aquoso da

semente de tamarindo liofilizado mostraram de forma geral que a adição de extrato aquoso

à polpa elevou de forma considerável a capacidade antioxidante da mistura (Tabela 2).

Pode-se notar que, na maioria das vezes, o aumento foi diretamente proporcional à

quantidade de extrato adicionado à polpa e que cada nível de concentração acrescido foi

significativamente diferente dos demais. Os outros métodos também tiveram aumentos

significativos na mesma faixa. Observa-se para o método ORAC, que os resultados foram

superiores aos demais métodos, devido à maior proporção de polpa das amostras como

visto maiores resultados quando se avaliou apenas a polpa in natura. No método FRAP, os

menores valores foram encontrados para o lote 1 da amostra SP [1] com teor de 28,9

mMTrolox/gs.s., seguida pela BA [1] com valor igual a 36,5 mMTrolox/gs.s.., sendo que tais

valores não tiveram diferenças significativas. O mesmo comportamento se repetiu para o

lote 2, com SP [1] apresentando valores de 53,5 mMTrolox/gs.s. e BA [1] de 39,1

68

mMTrolox/gs.s., também sem mostrar diferença significativa entre si (p<0,05). Não foram

encontrados trabalhos na literatura que relataram o uso de extrato aquoso da semente do

tamarindo para fins alimentícios.

Em relação à polpa, o crescimento foi substancial, indicando a eficiência no

enriquecimento do produto com compostos que conferem o poder antioxidante.

Considerando o método regido pelo radical ABTS•, pode-se notar que a adição da maior

concentração de extrato às polpas, obteve-se um resultado com aumento médio de 1910,

1300 e 937%, para as misturas de MG [3], SP [3] e BA [3], respectivamente, em relação às

polpas in natura. Os resultados de percentagem do aumento da capacidade antioxidante das

misturas em relação à polpa podem ser encontrados na Figura 1. A adição de extrato aquoso

liofilizado à polpa surtiu efeito direto no potencial antioxidante para todas as amostras de

tamarindo estudadas. Para a maioria destas, o aumento foi gradual à medida que se

acrescentou maiores concentrações, exceto para as misturas SP[2] e SP[3] que praticamente

não se alterou os níveis da capacidade antioxidante em resposta ao radical ABTS•. No

mesmo método, os aumentos da capacidade antioxidante em relação à polpa chegaram a

329, 1218 e 1942%, para MG[1], MG[2] e MG[3], respectivamente.

69

ABTS DPPH FRAP ORAC

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

Aum

ento

da

Cap

acid

ade

Anti

oxid

ante

(%

)

Métodos

MG[1]

MG[2]

MG[3]

SP[1]

SP[2]

SP[3]

BA[1]

BA[2]

BA[3]

Figura 1. Porcentagem de aumento médio da capacidade antioxidante para os lotes

das misturas de polpa e extrato da semente de tamarindo liofilizado em relação à polpa in

natura.

Os menores aumentos obtidos para o método ABTS foram atribuídos à SP [1] e BA

[1] com 194 e 137%, respectivamente, ainda assim, mostra ser um acréscimo considerável

(Figura 1). Para o método DPPH, a sequência de aumento na percentagem com a adição de

extrato foi proporcional, sendo que as maiores atividades foram obtidas com as maiores

concentrações. Da mesma forma, os menores acréscimos foram atribuídos às menores

quantidades de extrato aquoso adicionado para as misturas SP [1], MG [1] e BA [1], com

valores aproximados de 88, 113 e 8%, respectivamente. Os métodos FRAP e ORAC

seguiram a mesma lógica de proporcionalidade. No entanto, nota-se que a magnitude de

percentagem de aumento gerada pelo método ORAC é inferior aos demais. Isso pode ser

justificado pela afinidade dos compostos antioxidante da polpa em resposta ao método,

como já foi confirmado na Tabela 2. Assim, o aumento da capacidade antioxidante com a

adição do extrato aquoso não teve a mesma proporcionalidade que os outros métodos,

70

porém, o aumento ainda foi substancial, chegando a atingir 162, 201 e 125% para MG [3],

SP [3] e BA [3], respectivamente. A grande variação observada nos valores médios

percentuais dos aumentos da capacidade antioxidante das misturas pode ser atribuída à

diferença nas características dos frutos obtidos do mesmo lote e de épocas de colheita

diferentes, como já foi observada na classificação da Tabela 2.

De maneira geral, os dados dos ensaios para determinar a capacidade antioxidante

do fruto do tamarindo mostra que a semente possui um grande potencial bioativo e seu

extrato aquoso liofilizado consegue manter ou elevar os níveis desta propriedade na mistura

polpa e extrato aquoso liofilizado. Com relação às diferenças encontradas nos valores da

capacidade antioxidante dos frutos para cada estado de origem, pode-se supor que as

condições climáticas influenciaram de forma significativa nas características dos frutos,

como já foi relatado em outros trabalhos científicos (Gao et al. 2011; Teles et al. 2014).

Os coeficientes de correlação entre os métodos para determinar a capacidade

antioxidante das amostras de tamarindo estão apresentados na Tabela 3. Nota-se que as

maiores correlações foram obtidas para a correlação entre o método ABTS e ORAC

(0,963), seguido de ABTS e FRAP (0,941). Nestes casos, a correlação indica o quanto

houve de variação nos valores da capacidade antioxidante, sendo que na maioria das vezes

todos os potenciais eram acrescidos de forma geral quando se analisava matrizes com

maiores capacidades. Porém, ao se avaliar o extrato da semente, o método DPPH teve os

maiores resultados, enquanto que o ORAC apresentou os menores, isso justifica o menor

valor de correlação entre esses dois métodos (0,849). De forma geral, os métodos obtiveram

elevados valores de correlação além de exercerem relação positiva. Entretanto, alguns

trabalhos demonstram que não é possível comparar os diferentes métodos para determinar a

71

capacidade antioxidante, devido às diferentes reações químicas envolvidas nos mecanismos

de inibição de radicais específicos (Huang et al. 2005).

Tabela 3. Coeficientes de correlação (r) entre os métodos de determinação da capacidade

antioxidante da polpa, semente, extrato aquoso da semente e mix liofilizado de Tamarindo.

R ABTS DPPH FRAP ORAC FT

ABTS 1

DPPH 0,918 1

FRAP 0,941 0,920 1

ORAC 0,963 0,849 0,927 1

FT 0,899 0,978 0,936 0,854 1

Em razão da característica de sequestrar radicais específicos, cada método pode

responder de forma diferente à variedade de compostos que desempenham a função

antioxidante. Na maioria das vezes, o perfil de compostos fenólicos e outros antioxidantes

apresentado por cada amostra pode gerar resultados distintos em cada método específico

utilizando a mesma matriz (Liu et al. 2013). Essas variações nas respostas antioxidantes em

diferentes métodos de análises também foram encontradas em trabalhos com diversas

matrizes, como a manga (Mangifera indica L.) (Ribeiro et al. 2007), romã (Punica

granatum L.) (He et al. 2011), limão (Citrus limon) (Dahmoune et al. 2013), tamarindo

(Tamarindus indica) (Tril et al. 2014) e abacate (Persea americana Mill) (Souza et al.

2015). É importante observar nos resultados para capacidade antioxidante, que com a

mudança da matriz analisada, cada método respondeu de forma diferente. Como aconteceu,

por exemplo, nos ensaios de ORAC, as polpas tiveram respostas superiores aos outros

72

métodos para ambos os lotes, porém, quando a matriz foi alterada para semente, os demais

métodos responderam com maior magnitude, o que justifica a possibilidade de cada classe

de compostos reagirem a radicais específicos no processo de inibição.

A análise de componentes principais (PCA) foi aplicada para determinar possíveis

relações entre as amostras frente aos diferentes métodos utilizados para determinar a

capacidade antioxidante e teor de fenólicos totais. Os resultados estão apresentados na

Figura 2.

Figura 2. Gráficos de escores para componentes principais da capacidade antioxidante e

fenólicos totais da polpa, semente, extrato aquoso e mix de tamarindo. (A) PC para todas as

amostras; (B) PC para os métodos correlacionados com todas as amostras, (C) PC da polpa

e mix e (D) PC para os métodos relacionados a polpa e mix.

Por meio da análise de PC1 e PC2 (Figura 2A), foi possível observar que as duas

componentes explicaram 97,9% da variação observada, sendo que o PC1 elucidou 93,49%

A B

C D

73

da variação, promovendo a separação de 3 grandes grupos. O primeiro se refere a todas as

amostras que contém polpa em sua formulação, as quais tiveram menores capacidades

antioxidantes para todos os métodos. O segundo agrupa as sementes de todos os estados,

tanto para o lote 1 quanto para o lote 2, que apresentaram maiores valores de capacidade

antioxidante pelo método DPPH e FT. O terceiro grupo engloba todos os extratos aquosos

liofilizados obtidos das sementes de tamarindo, independente do lote ou estado de origem.

De forma geral, os grupos 2 e 3 se destacaram com capacidade antioxidante e teor

de fenólicos totais muito superiores à das amostras do grupo 1 para todos os métodos

estudados. Possivelmente, a grande diferença na magnitude dos valores de capacidade

antioxidante apresentadas pelas amostras do grupo 1 (polpa e mix), quando comparadas

com os outros grupos (semente e extrato liofilizado), foram fundamentais para promover a

separação.

Em virtude da não separação das amostras que possuem polpa em sua composição,

decidiu-se avaliar as amostras do grupo 1 de forma isolada (Figuras 2C e 2D), excluindo-se

as sementes e extratos aquosos liofilizados da análise. Com isso, observou-se que PC1 e

PC2 conseguiram explicar, aproximadamente, 96,18% das variações observadas, onde se se

notou uma tendência na separação das amostras em relação à adição gradual das

concentrações dos extratos da semente à polpa. Como observado, o enriquecimento da

polpa com extrato aquoso da semente liofilizado, influenciou diretamente no aumento da

capacidade antioxidante para todos os métodos estudados.

Ao aplicar a análise de componentes principais em diferentes métodos in vitro para

determinar a capacidade antioxidante de alguns compostos fenólicos, Hossain et al. (2011)

encontraram correlações significativas entre os métodos de DPPH, FRAP, ORAC e ABTS.

Muitos trabalhos vêm utilizando a PCA como ferramenta para correlacionar resultados

74

obtidos a partir dos métodos in vitro para determinar o potencial antioxidante de diversas

matrizes (Huang et al. 2009; Patras et al. 2011; Fernandes et al. 2013; Casoni and Sârbu,

2014).

3.3 Atividade hemolítica

A atividade hemolítica para avaliar a citotoxidade das amostras de tamarindo foi

analisada em células vermelhas do sangue humano em solução com PBS (Tampão fosfato,

pH 7,4) usando SDS como controle positivo. O estudo da citotoxidade de extratos de

vegetais é de fundamental importância como parâmetro preventivo, pois ainda que o extrato

possua grande potencial bioativo, a sua utilização na culinária ou medicina seria

prejudicada se houvesse a confirmação desses efeitos hemolíticos causados pela presença

de agentes tóxicos, principalmente as saponinas (Zubair et al. 2013). As percentagens de

lise causada nos eritrócitos do sangue humano estão apresentadas na Tabela 4.

75

Tabela 4. Atividade hemolítica em percentagem de hemólise causada pelo extrato da polpa e mix de polpa e extrato aquoso da

semente de Tamarindus indica em diferentes concentrações.

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha para cada classe de amostra não representa diferença significativa entre si

a p<0,05 pelo teste de Tukey. ** Concentração de extrato aquoso na polpa: [1] – 0,3%, [2] – 1,15% e [3] – 2,0%. n=3.

[ ]

(µg/mL)

LT

Hemólise (%)

PMG MG[1]**

MG[2] MG[3] PSP SP[1] SP[2] SP[3] PBA BA[1] BA[2] BA[3]

0,08

L1 1,7±0dC*

1,4±0cC

3,5±1cdC

0,7±0fC

8,0±4dAB

4,9±0deBC

1,1±0fC

2,6±0eC

1,0±0eC

9,7±1gA

4,1±1efBC

2,99±0dC

L2 1,4±0dCD

1,8±0bcCD

1,4±0efCD

1,2±0fCD

5,6±1dB

0,3±0eD

2,5±0fC

2,5±0eC

1,4±0eCD

7,7±1gA

1,4±0eCD

0,7±0dD

38,5

L1 2,1±0cdFG

1,3±0cFG

3,3±0cdeEF

5,2±0cDE

12,6±1dA

7,5±1deCD

5,2±1fDE

10,1±1deB

7,1±1deCD

0,7±0gG

13,5±1eA

7,9±1dBC

L2 1,5±0dEF

1,0±0c 1,7±0

defEF 4,6±0

cCDE 7,7±1

dC 15,6±1

dA 4,2±1

fDEF 15,8±1

deA 14,4±2

cdeAB 11,8±2

gB 11,6±1

eB 5,8±0

dCD

76,9

L1 2,4±0cdE

1,7±0bcE

4,8±0abcE

1,9±0defE

44,8±4bB

58,4±5cA

41,6±3eBC

21,0±2cdD

16,7±4cdD

46,4±2fB

35,6±3dC

41,9±4cBC

L2 1,7±0dE

1,1±0cE

1,0±0fE

1,6±0efE

12,3±2dD

55,9±5cA

56,8±4dA

30,3±3cBC

26,7±3cC

55,3±5efA

25,9±2dC

38,9±4cB

115,3

L1 6,4±1bF

3,5±2bcF

3,6±1cdF

3,4±0cdeF

93,4±3aA

78,3±6bB

59,5±5dCD

51,3±5bDE

66,7±6bBC

63,3±5deCD

46,8±4cE

46,7±6cE

L2 2,1±0cdF

1,5±0cF

5,6±0abF

2,3±0defF

24,6±1cE

65,3±6cAB

65,9±6dA

34,8±3cDE

53,1±6bBC

68,8±6cdA

46,8±4cCD

35,6±6cDE

153,7

L1 10,5±aC

2,9±1bcC

3,9±0bcC

14,6±2aC

94,0±6aA

81,7±5bA

85,3±4bA

65,1±4bB

92,3±5aA

89,1±8abA

67,8±6bB

64,7±5bB

L2 2,8±0cdE

1,8±0bcE

1,9±0defE

9,5±1bE

48,9±3D 74,4±8

bAB 75,7±4

cAB 59,3±8

bCD 83,3±3

aA 78,6±7

bcAB 70,2±7

bABC 69,3±7

bBC

192

L1 12,5±2aB

6,5±1aB

6,5±1aB

3,7±0cdB

93,0±2aA

96,2±3aA

97,7±2aA

89,5±8aA

89,5±7aA

98,5±1aA

97,0±2aA

95,6±4aA

L2 3,9±0cC

4,5±1abC

6,5±1aC

4,5±0cC

93,4±4aAB

89,7±8abAB

98,8±1aA

80,6±9aB

90,0±8aAB

98,0±2aA

98,4±1aA

89,6±7aAB

76

As polpas e mix liofilizado dos estados de São Paulo e Bahia tiveram os maiores

índices de hemólises para a maior concentrações da amostra na solução, chegando a 98,8%

de lise para SP [2] do lote 2 e 98,5% para BA [1] do lote 1. Já as amostras do estado de

Minas Gerais alcançaram no máximo 12% de lise das células para as maiores concentração

de amostra (192 µg/mL), caracterizando um índice bem inferior às amostras dos outros

estados. Para a menor concentração de estudo (0,08 µg/mL), a maioria das amostras

provocaram baixos índices de hemólise nas células, com maiores valores atribuídos para

BA [1] lote 1 e PSP lote 1, causando percentuais de lises de 9,7 e 8,0%, respectivamente.

Exceto para as amostras oriundas do estado de Minas Gerais, o percentual de hemólise sobe

substancialmente a partir da concentração de 76,9 µg/mL na solução, em alguns casos

chegando a ultrapassar 50% de células rompidas. Nesta faixa, SP [1] lote 1 e 2, SP [2] lote2

e BA [1] lote 2, provocaram os maiores percentuais de lise.

Também foi observado na Tabela 4, que à medida que se aumentou a concentração

de extrato aquoso liofilizado à polpa, o percentual de hemólise tendeu a se reduzir. Tal

efeito se torna mais nítido a partir da concentração de 76,9 ug/mL de amostra na solução

(Figura 3). O lote 1 de SP, por exemplo, a polpa sem adição de extrato (PSP) causa,

aproximadamente 44% de rompimento das células, enquanto que SP[1], SP[2] e SP[3]

seguem com 58, 41 e 21% de hemólise, resultados significativamente diferentes (p<0,05).

Para o lote 1 do mix da Bahia, a percentagem de lise teve um aumento significativo de PBA

para BA [1], seguido de um decréscimo para BA [2] e manutenção do valor em BA [3].

Nos ensaios em que a concentração de amostra na solução é de 153,7 ug/mL, este mesmo

comportamento é observado, porém com maior intensidade.

77

[0,08] [38,48] [76,88] [115,28] [153,68] [192]

0

20

40

60

80

100%

Hem

óli

se

(ug/mL)

PMGL1

PMGL2

PSPL1

PSPL2

PBAL1

PBAL2

A

[0,08] [38,48] [76,88] [115,28] [153,68] [192]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

% H

emóli

se

(ug/mL)

MG[1]L1

MG[1]L2

MG[2]L1

MG[2]L2

MG[3]L1

MG[3]L2

B

[0,08] [38,48] [76,88] [115,28] [153,68] [192]

0

20

40

60

80

100

% H

emó

lise

(ug/mL)

SP[1]L1

SP[1]L2

SP[2]L1

SP[2]L2

SP[3]L1

SP[3]L2

C

[0,08] [38,48] [76,88] [115,28] [153,68] [192]

0

20

40

60

80

100

% H

emó

lise

(ug/mL)

BA[1]L1

BA[1]L2

BA[2]L1

BA[2]L2

BA[3]L1

BA[3]L2

D

Figura 3. Perfil de hemólise da polpa (A), mix de Minas Gerais (B), mix de São Paulo (C) e

mix da Bahia (D), em diferentes lotes e concentrações.

A atividade hemolítica para a semente e extrato da semente liofilizado não foi

registrada nos ensaios, pois a absorbância adquirida, independente da concentração, foi

inferior à absorbância do branco (eritrócitos + PBS). Sendo assim, após conversão, eram

obtidos valores negativos em percentagem. O fato pode ser atribuído à precipitação de

proteínas causada pelos taninos presentes nos extratos, uma vez que a semente de

tamarindo é muito rica nesses compostos e a parede celular dos eritrócitos é constituída boa

parcela de proteínas (Cazzola et al. 2011; Canon et al. 2014). Valores negativos para

percentagem de hemólise em células do sangue de coelho também foram registrados

utilizando extratos de Astragalus membranaceus (Yang et al. 2005).

78

4. Conclusão

Os frutos de tamarindo obtidos de diferentes regiões do Brasil apresentaram

distintos comportamentos em relação aos métodos in vitro para determinação da capacidade

antioxidante, bem como, grandes variações foram observadas quando os frutos foram

colhidos em anos diferentes. A polpa apresentou baixa capacidade antioxidante em relação

à semente e ao extrato aquoso liofilizado, porém, quando adicionado diferentes

concentrações do extrato, o potencial da mistura foi acrescido significativamente. Isto

mostra a importância de se aproveitar de forma mais eficiente os compostos bioativos

presentes na semente podendo ser aplicado também em outros tipos de produtos

alimentícios.

A polpa mostrou possuir ação hemolítica à medida que se aumentou a sua

concentração na presença de eritrócitos humanos. No entanto, por se tratar de um fruto

tradicionalmente consumido em diversas regiões do mundo, sua ação hemolítica não deve

ter relação citotóxica como apresentado por saponinas de algumas plantas. Por outro lado, a

ação hemolítica da semente e extrato aquoso liofilizado não foi observada, dando indício de

que a mistura contendo polpa e extrato aquoso liofilizado pode ser consumido.


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87

CAPÍTULO IV

PERFIL QUANTITATIVO DE TOCOFERÓIS E ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO

OBTIDO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.)

PROVENIENTES DE DIFERENTES ESTADOS DO BRASIL

Danilo Santos Souzaa, Cristiano Augusto Ballus

a, Wellington da Silva Oliveira

a, Helena

Teixeira Godoya

a Departamendo de Ciência de Alimentos – FEA, Universidade Estadual de Campinas,

Brasil.

* Autor para correspondência: Rua Monteiro Lobato, 80, Lab Análise, FEA-DCA, CEP:

13083-862, Cidade Universitária, Campinas-SP.

E-mail: [email protected] (Souza, D. S.).

Manuscrito em preparo para ser submetido ao periódico Food Research International

88

RESUMO

Apesar de possuir grande potencial para aproveitamento industrial a semente de tamarindo

ainda é pouco reaproveitada nas indústrias. O objetivo do trabalho foi adaptar e validar um

método para quantificação de tocoferóis, bem como quantificar tocoferóis e ácidos graxos

do óleo da semente de tamarindo colhido em 3 diferentes regiões do Brasil (Minas gerais,

São Paulo e Bahia), das safras de 2012 e 2013. Utilizou-se o método de Bligh-Dyer para

obtenção do óleo da semente. Para análises de tocoferóis (HPLC-FL), cerca de 0,1 g do

óleo foi diluído em 2 mL de n-hexano e injetado em sistema isocrático. O método foi

validado de acordo à precisão, linearidade e recuperação dos padrões de α, β, γ, δ-tocoferol.

Para α e γ-tocoferol, o lote 2 de Minas Gerais apresentou os maiores valores com, 25,5 e

31,1 mg.kg-1 s.s., respectivamente. O menor conteúdo foi encontrado no lote 2 de São

Paulo com, aproximadamente, 16,4 mg.kg-1s.s. Os ácidos graxos do óleo da semente de

tamarindo foram quantificados em GC-FID e confirmados em GC/MS, após esterificação

das amostras. Dez diferentes ésteres metílicos de ácidos graxos do óleo da semente foram

quantificados por padronização interna e 9 confirmados. O ácido linoleico (18:1n-6, cis)

apresentou as maiores concentrações, variando de 145 até 270 mg.g-1

s.s., seguido pelo ácido

oleico que variou de 31 a 83 mg.g-1

s.s. A variação nos resultados mostraram que a origem

dos frutos e os fatores climáticos do local de produção têm grande influências na

composição de tocoferóis e ácidos graxos do óleo da semente de tamarindo.

Palavras chave: Fração lipídica, HPLC, GC-FID, GC-MS, óleo de semente.

89

1. Introdução

Atualmente, um dos principais problemas encontrados pelas agroindústrias em todo

mundo é o destino e tratamento da grande quantidade de resíduos gerados após o

processamento da matéria-prima (Lutterodt, Slavin, Whent, Turner & Yu, 2011). O

acúmulo destes resíduos na natureza gera perda de recursos e principalmente favorece a

degradação ambiental (Domínguez-Bocanegra, Torres-Muñoz & López, 2014). O Brasil é

um dos maiores produtores mundiais de frutos tropicais, em consequência disto, se tornou

um grande polo de processamento destas matérias-primas, que por sua vez gera toneladas

de resíduos agroindustriais diariamente (Silva & Jorge, 2014). O tratamento destes resíduos

para minimizar os impactos ambientais caracteriza perdas consideráveis no rendimento da

empresa e na maioria das vezes a matéria-prima é subutilizada resultando em desperdício

de boa parcela do seu potencial nutricional e industrial (Schieber, Stintzing & Carle, 2001).

O emprego de resíduos na elaboração de biocombustível, aproveitamento de nutrientes,

elaboração de novos produtos, fertilizantes, compostagem e alimentação animal vem sendo

utilizado frequentemente como forma de minimizar as perdas e reduzir os impactos

causados pelas agroindústrias (Lario, Sendra, García-Pérez, Fuentes, Sayas-Barberá,

Fernández-López & Pérez-Alvarez, 2004; Ruiz, Silva, Ruzene, Lima, Vicente & Teixeira,

2012; Crizel, Jablonski, Rios, Rech & Flôres, 2013). Sendo assim, surge a necessidade de

caracterizar a composição dos resíduos (bagaço, cascas e sementes) gerados pelas indústrias

de suco e celulose para direcionar na melhor forma de aproveitamento, até mesmo serem

incorporados na dieta humana (Silva & Jorge, 2014).

90

O Tamarindus indica é pertencente à subfamília das Caesalpiniodeae que por sua

vez pertence à família das Leguminosae (Fabaceae). É uma árvore nativa da África, porém

se desenvolve naturalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo (Siddhuraju,

2007). O tamarindo é bem adaptado ao território brasileiro sendo produzido em todas as

regiões do país, porém, é pouco explorado e boa parte da sua produção é destinada ao

consumo interno (Brasil, 2007). A polpa do fruto possui sabor ácido-doce e é muito

utilizado na fabricação de néctares, sorvetes, pastas, doces, licores, geleias e também como

ingrediente em condimentos e molhos (Pereira, Melo, Frazão & Alves, 2004). As sementes,

envolvidas pela polpa, representam a maior porção do fruto, chegando a 40% do seu peso

total. Por possuir em sua composição compostos bioativos, como tocoferóis, ácidos graxos

insaturados e compostos fenólicos são atribuídos atividades antioxidantes, antihepatotóxica,

anti-inflamatória, antimutagênica, antidiabética e antiaterosclerose são muito utilizadas

como fitoterápicos (Maiti, Jana, Das & Ghosh, 2004). O óleo presente na semente (14%) é

composto em maior parcela por ácido linoleico (18:2 n-6), seguido do ácido oleico (18:1 n-

9) e ácido palmítico (16:0) (Ajayi, Oderinde, Kajogbola & Uponi, 2006). O ácido linoleico

é caracterizado como um ácido graxo poli-insaturado de grande qualidade para qualidade

de alimentos industrializados (Luzia & Jorge, 2011). Pesquisas relacionam o uso do ácido

linoleico à prevenção de doenças, principalmente relacionadas à inibição do processo

cancerígeno (Ip, Singh, Thompson & Scimeca 1994; Yang, Holcroft, Glickman & Boer,

2003). Além de ácidos graxos, a semente também possui grande quantidade de tocoferóis

em sua fração lipídica que confere potencial antioxidante ao fruto (Tsuda, Watanabe,

Ohshima, Yamamoto, Kawakishi & Osawa 1994). Os tocoferóis são classificados como os

mais importantes antioxidantes naturais para produtos alimentícios e estão presentes, na

91

maioria das vezes, em vegetais e seus subprodutos (Górnas, 2015). Existem quatro

isômeros (α-, β-, γ-e δ-tocoferol) diretamente relacionados com a vitamina E, porém, o α-

tocoferol desempenha maior atividade biológica, que por sua vez é muito importante na

dieta humana. (Eitenmiller & Lee, 2004; Karmowski, Hintze, Kschonsek, Killenberg, &

Bohm, 2015). A atividade antioxidante dos tocoferóis se dá principalmente pela sua

capacidade em doar átomos de hidrogênio aos radicais livres lipídicos, fazendo com que a

propagação da oxidação em cadeia seja interrompida (Szymanska & Kruk, 2008).

Atualmente, já são encontrados tocoferóis sintetizados e a sua principal função na indústria

é a de proteger os ácidos graxos poli-insaturados contra oxidação (Ramalho & Jorge, 2006;

Zarrouk, Carrasco-Pancorbo, Zarrouk, Segura-Carretero & Fernández-Gutiérrez, 2009).

Segundo Burton (1994), devido às suas funções de agir como potente antioxidante a nível

molecular acredita-se que os tocoferóis reduzem o risco de doenças cardiovasculares e

certos tipos de câncer. A polpa de tamarindo juntamente com a semente, é usada pela

indústria na prevenção de rancidez (peroxidação de lipídeos), com o objetivo de aumentar a

vida de prateleira de óleo de amendoim e óleo de coco (Siddhuraju, 2007).

Apesar de possuir grande potencial para aproveitamento industrial com alto teor em

matéria graxa e compostos bioativos na fração lipídica, a semente de tamarindo ainda é

pouco reaproveitada após processamento da matéria-prima nas indústrias, tornando seu

potencial subutilizado. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi adaptar e validar um

método para quantificação de tocoferóis, bem como quantificar tocoferóis e ácidos graxos

da semente de tamarindo colhido em 3 diferentes regiões do Brasil, em dois períodos, bem

como avaliar a influência do local de produção do fruto e o seu valor em matéria graxa para

futuramente favorecer novas alternativas de aplicação industrial.

92



Foram utilizados os reagentes metanol p.a (Synth, Brasil), clorofórmio p.a (Synth,

Brasil), sulfato de sódio monobásico p.a (Êxodo, Brasil), hidróxido de sódio (Synth,

Brasil), trifluoreto de boro (Merck, Alemanha), hexano grau HPLC (Macron, EUA),

isopropanol grau HPLC (J.T. Baker, EUA), ácido acético grau HPLC (J.T. Baker, EUA) e

os padrões de tocoferóis – α, β, γ e δ (Supelco, EUA), ésteres metílicos do C4 ao C24

(FAME Mix, Supelco, EUA) e ácido tricosanoico – 23:0 (Supelco, EUA).

2.2 Obtenção e preparo da matéria-prima




2013. Todas as amostras foram colhidas no período de setembro (entre inverno e

primavera) dos respectivos anos. Após a aquisição, foram descascados e a polpa juntamente

com a semente ficou de molho por 24 h para hidratação e facilitar a separação.

Posteriormente, a mistura foi pulsada em liquidificador industrial (modelo AR 2 L,

Colombo®, 800 W e 60 Hz) e filtrada em peneira comum para separar a polpa da semente.

As sementes foram liofilizadas, parte das amostras foi submetida à análise de umidade em

estufa a 105ºC e a outra parte foi triturada em moinho analítico modelo Q-298A (Quimis,

Brasil) e, então submetidas à análise de extração de lipídeos.

93

2.3 Procedimentos de extração

2.3.1 Lipídeos por Bligh-Dyer

A extração de lipídeos pela metodologia de Bligh & Dyer (1959) é uma das mais

versáteis e efetivas. Utiliza-se uma mistura ternária de água, metanol e clorofórmio que tem

a capacidade de extrair tanto os lipídeos neutros quanto os lipídeos polares de forma

eficiente. É um método de extração a frio caracterizado por não causar danos à qualidade da

matéria graxa extraída (Brum, Arruda & Regitano-D‘Arce, 2009). Aproximadamente, 1 g

de amostra foi pesada em tubo de ensaio com tampa. Foi adicionado 5 mL de clorofórmio,

10 mL de metanol e 4 mL de água, formando uma proporção de 1:2:0,8, respectivamente.

Os tubos foram agitados por 15 minutos e posteriormente foi adicionado 5 mL de

clorofórmio e 5 mL de solução aquosa de sulfato de sódio (1,5%). Os tubos foram

novamente agitados por 2 min e centrifugados a 3000 rpm por 5 minutos a 4ºC. O

sobrenadante foi descartado e a fase inferior foi filtrada em papel tipo Whatman nº1, com

aproximadamente, 1 g de Na2SO4 anidro. O filtrado foi evaporado até a secura com N2. O

óleo obtido foi armazenado a -18ºC até o momento da análise.

2.3.2 Ésteres metílicos de ácidos graxos

Inicialmente, 1 mg.mL-1

do padrão interno ácido tricosanoico (23:0) foi adicionado

aos tubos de ensaio e concentrados com H2. Posteriormente, cerca de 25 mg de óleo

extraído da semente foi pesado em tubos de ensaio com tampa e adicionados 4 mL de

94

NaOH 0,5 mol L-1

em solução com metanol. Os tubos foram aquecidos em banho a uma

temperatura de 100ºC por 10 minutos. Posteriormente foram adicionados aos tubos, 3 mL

de BF3 12% em solução com metanol e levados novamente ao aquecimento por 5 minutos.

Depois de resfriados à temperatura ambiente, 4 mL de uma solução saturada de NaCl foi

adicionada no tubo sob agitação. Depois, 4 mL de hexano foi adicionado e submeteu toda a

mistura a agitação vigorosa em vórtex. Os tubos foram repousados até a obtenção da

separação de fases. A fase superior foi recolhida e o resíduo foi lavado com 2 mL de

hexano por 3 vezes. As fases recolhidas foram misturadas e concentradas até a secura em

evaporador rotativo e ressuspendida em 2 mL de hexano. O extrato foi armazenado a -18ºC

até o momento da análise. Todo o experimento foi preparado em triplicata (n = 3). O

procedimento foi uma adaptação do método proposto por Joseph & Ackman (1992).

2.3.3 Tocoferóis

Para análise de tocoferóis, foi aplicada a metodologia utilizada nos trabalhos de

Dionisi, Prodoiliet, Tagliaferri (1995) e Pinheiro-Sant‘anna, Guinazi, Oliveira, Lucia, Reis,

& Brandão (2011). Aproximadamente 20 mg de óleo obtido da semente de tamarindo foi

diluído em 2 mL de hexano contendo 0,01% de BHT. A solução foi filtrada em membrana

PVDF de 0,22 µm (Millipore, USA) e injetada diretamente em coluna no sistema de

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Todos extratos foram preparados em

triplicata (n = 3).

95

2.4 Métodos de separação

2.4.1 Ésteres metílicos de ácidos graxos

2.4.1.1 Identificação e quantificação por GC-FID

Um cromatógrafo a gás modelo 7890A (Agilent, Alemanha) equipado com detector

por ionização em chama (FID), com injetor tipo split/splitless no modo split (1:50) e uma

coluna capilar de sílica fundida com 50% de cianopropil metil polisiloxano modificado (60

m de comprimento x 0,25 mm de diâmetro interno x 0,25 µm de espessura do filme) (Part

number: 122-2362, Agilent, Alemanha) foram usados para determinação de ésteres

metílicos de ácidos graxos (FAMEs). Os parâmetros otimizados foram: temperatura do

injetor (250ºC); temperatura do detector (280ºC); H2 como gás de arraste, taxa de fluxo de

1,0 mL min-1

; taxa do fluxo de gás no detector (H2:N2:ar sintético – 30:30:300 mL min-1

);

programação da temperatura do forno inicialmente de 50ºC por 1 min, aquecendo para

175ºC a uma taxa de 25ºC min-1

e posteriormente aumentando para 230ºC a uma taxa de

4ºC min-1

, totalizando 35,5 min de corrida. A identificação dos compostos foi feita por

comparação dos tempos de retenção dos padrões com os tempos de retenção dos compostos

encontrados nas amostras, nas mesmas condições de separação.

Para quantificação dos ácidos graxos, foi utilizado o método da padronização

interna com um padrão de ácido tricosanoico (23:0) (Sigma, USA) de acordo com a

metodologia de Joseph & Ackman (1992). Para determinação das concentrações de cada

éster metílico, foram utilizados os valores médios do fator de correção experimental (FCE)

96

para o detector por ionização em chamas (FID) a partir de 10 injeções dos padrões de

ácidos graxos FAME mix C4-C24, Supelco - Alemanha, (Sigma-Aldrich, USA)

(Visentainer, 2012). O fator de correção experimental foi calculado de acordo a Equação 1.

FCE = A . Mx

Mp . Ax

(1)

Em que: Ap = área do padrão interno; Mp = massa do padrão interno; Ax = área do éster

metílico de ácido graxo; Mx = massa do éster metílico de ácido graxo.

O teor de ácidos graxos (AG) foi calculado em mg.g-1

de lipídeos totais pela

Equação 2 e convertidos em sólidos secos (mg g-1

s.s.) da semente.

AG = Ax . Mp . FCE

Ap . Mx . FCAE

(2)

Em que: AG = concentração de ácidos graxos (mg.g-1

) de lipídeos totais; Ax = área

do pico para cada composto; Ap = área do pico do padrão interno (C:23); Mp = massa do

padrão interno (C:23) e mg; Mx = massa do óleo (mg); FCE = fator de correção experimental

e FCAE é o fator de conversão éster metílico para ácido graxo.

2.4.1.2 Identificação por GC-MS

Os ésteres metílicos de ácidos graxos foram identificados em cromatógrafo a gás

(GC) 7890A (Agilent, Alemanha) acoplado a um detector de massas (MS) com analisador

de m/z o quadrupolo e impacto de elétrons (EI) como fonte de ionização. Para separação

dos ésteres, utilizou-se uma coluna HP-5 (Agilent, Alemanha) de 30 m de comprimento x

97

0,32 mm com fase estacionária de 0,50 µm de espessura do filme. Os ésteres (1 µL) das

amostras foram injetados em modo split (1:45) à 250ºC no injetor com temperatura inicial

do forno em 50ºC aquecendo a uma taxa de 1ºC/min até atingir uma temperatura de 110ºC.

Posteriormente, aumentou-se a taxa para 3ºC/min até uma temperatura de 310ºC, mantendo

por 3 min, totalizando uma corrida de 129,67 minutos. O fluxo do gás de arraste (He) foi

ajustado para 0,5 mL/min.

O fluxo de saída da coluna do GC para o espectrômetro de massas foi ajustado a

uma temperatura de 250ºC. A fonte de ionização por elétrons (EI) do MS foi ajustada a 70

eV em uma temperatura de 200ºC. O sistema quadrupolo foi operado a uma temperatura de

150ºC no modo scan, em que se monitoraram todos os íons gerados pela fonte EI com

intervalo entre 50 e 500 m/z. O equipamento GC-MS foi acoplado a um PC com software

ChemStation® (USA), utilizado para aquisição e processamento dos dados. A identificação

dos ésteres metílicos de ácidos graxos foi realizada por tentativa em comparação com os

espectros da biblioteca virtual NIST® versão 2011

e de forma positiva na comparação de

espectros com os de padrões analíticos injetados.

2.4.2 Tocoferóis

A separação dos tocoferóis foi possível usando um HPLC Agilent 1100 (Agilent

Technologies, Germany) acoplado a um detector de fluorescência, um sistema de bomba

quaternária, injetor automático e um forno para controle de temperatura da coluna. As

condições do método foram baseadas nos trabalhos de Pinheiro-Sant‘anna, Guinazi,

Oliveira, Lucia, Reis, & Brandão (2011). Um coluna de fase normal com dimensões de 150

98

mm x 4,6 mm x 3,0 µm (Hypersil Silica, Thermo, Germany) foi utilizada. A fase móvel

consistia em um sistema isocrático composto de hexano:isopropanol:acido acético

(98,9:0,6:0,5) com uma vazão de 1,0 mL.min-1

. A temperatura foi mantida a 30ºC, e o

volume de injeção foi de 100 µL. O detector de fluorescência foi ajustado em λex 290 nm e

λem 330 nm. Os compostos foram identificados por comparação com o tempo de retenção

dos compostos encontrados em amostra e padrões de tocoferóis separados nas mesmas

condições. As amostras foram injetadas em triplicata (n = 3).

2.5 Métodos de validação

2.5.1 Ácidos graxos

A precisão do método para separação dos ésteres metílicos de ácidos graxos foram

avaliada por meio da precisão instrumental intra-dia (n=10), com a injeção de padrões de

ésteres metílicos.

2.5.2 Tocoferóis

O método para tocoferóis foi validado de acordo as normas descritas no Guia

Harmonizado para análise e validação de métodos laboratoriais (Thompson, Ellison &

Wood, 2002). O limite de detecção (LD) foi determinado a partir de sucessivas diluições

dos padrões até que a relação da altura do pico originado da massa do padrão (ng)

alcançasse uma razão de três unidades da altura do ruído. O limite de quantificação (LQ)

99

foi determinado a partir de diluições sucessivas até que altura relativa à massa do padrão

(ng) injetado atingisse uma razão de 7 vezes a altura do ruído. A precisão instrumental

intra-dia foi avaliada a partir de 10 injeções da concentração de padrões referente ao LQ. A

linearidade das diferentes concentrações de padrões foi estudada individualmente para cada

composto, com curvas de calibrações distribuídas em 10 pontos elaboradas com a injeção

aleatória de padrões em triplicata. As soluções de α, β, γ e δ-tocoferol, usadas para

elaboração da curva de calibração foram preparadas de acordo com a quantidade esperada

dos compostos na semente de tamarindo. A análise da falta de ajuste foi aplicada para cada

curva de calibração distinta entre os compostos. A precisão instrumental intra-dia foi

determinada com 10 injeções consecutivas de uma solução contendo os 4 tocoferóis (α, β, γ

e δ-tocoferol) em diferentes níveis de concentração para cada composto e a precisão em

amostra com 10 injeções em volumes diferentes. A precisão instrumental inter-dia foi

determinada pela repetição do procedimento de injeção em três dias consecutivos para os

padrões. O primeiro nível (N1) dos tocoferóis consistiu em injetar 47,5 ng de α-tocoferol,

8,0 ng de β-tocoferol, 89 ng de γ-tocoferol e 1,35 ng de δ-tocoferol. Para o nível 2 (N2) foi

injetado 475 ng de α-tocoferol, 80 ng de β-tocoferol, 890 ng de γ-tocoferol e 13,5 ng de δ-

tocoferol. O nível 3 (N3) consistiu em injetar 950 ng α-tocoferol, 160 ng de β-tocoferol,

1780 ng de γ-tocoferol e 27 ng de δ-tocoferol. Para precisão em amostra foram injetados

diferentes volumes de 5 µL para N1, 50 µL para N2 e 100 µL para N3.

Os ensaios de recuperação também foram executados em três níveis diferentes para

estimar a validade da técnica de extração, uma vez que não há materiais de referência

certificados para os compostos em semente de tamarindo. Os valores injetados no primeiro

nível (N1) se repetiram como no procedimento de precisão. Para o N2, foram injetados

100

332,5 ng de α-tocoferol, 56 ng β-tocoferol, 623 ng de γ-tocoferol e 10,2 ng de δ-tocoferol.

No terceiro nível (N3) foram injetados 430,0 ng de α-tocoferol, 90 ng de β-tocoferol, 1000

ng de γ-tocoferol e 20 ng de δ-tocoferol. Para determinar a recuperação dos tocoferóis, o

volume contendo a concentração necessária de cada composto para os respectivos níveis foi

adicionado aos tubos de ensaio antes da pesagem da amostra para o início do processo de

extração de lipídeos pelo método de Bligh & Dyer (1959). Os padrões adicionados foram

concentrados com N2 até a secura e posteriormente as amostras foram adicionadas aos tubos

dando sequência aos ensaios de extração. Foi utilizada a semente do estado de Minas

Gerais (SMG), escolhida aleatoriamente para os ensaios. A recuperação, expressa em %, foi

calculada para cada composto, descontando o conteúdo dos mesmos presentes naturalmente

na amostra. Os ensaios foram realizados em triplicada para cada nível estabelecido (n = 3).


Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram

apresentados como média e seu desvio padrão (DP). Análise de Variância (ANOVA) foi

aplicada juntamente com o teste de Tukey para identificar possíveis diferenças

significativas entre as médias, usando o software Statistica®

versão 8.0 (Statsoft, USA).

Diferenças entre as médias no nível de 5% (p≤0,05) foram consideradas significantes.

101


3.1 Validação dos métodos

Na Figura 1A e 1B estão apresentados os perfis cromatográficos da separação de

ácidos graxos por GC-FID e dos tocoferóis por HPLC-FL obtidos do óleo da semente de

Tamarindus indica. Além do padrão interno (PI) ácido tricosanóico adicionado, foi possível

separar e identificar 10 diferentes ésteres metílicos de ácidos graxos saturados e insaturados

por comparação com tempo de retenção de padrões. Na Figura 1B estão apresentados os 4

isômeros de tocoferóis (α, β, γ e δ-tocoferol) identificados no óleo da semente.

102

Figura 1. Cromatograma da composição de ácidos graxos por CG-FID (A) e tocoferóis por

HPLC-FL (B) do óleo da semente de tamarindo.

3.1.1 Limites de detecção (LD), quantificação (LQ) e linearidade,

Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), assim como a precisão e os

ensaios de linearidade estão presentes na Tabela 1. Os valores de LD para tocoferóis

103

variaram de 0,85 ng para α-tocoferol e 3,03 ng para γ-tocoferol. O β-tocoferol e δ-tocoferol

apresentaram LD de 1,28 e 0,9 ng, respectivamente. Para limites de quantificação (LQ),

considerando a altura do pico 7 vezes maior que a altura do ruído, os valores variaram de

1,98, 2,99, 7,07 e 2,20 ng para α, β, γ e δ-tocoferol, respectivamente.

A linearidade estudada foi testada com 10 diferentes níveis de volume de injeção

executados em triplicata (n = 3) para cada ponto, convertido para nano grama (ng) de

composto injetado. As faixas de trabalho, bem como as equações geradas, o coeficiente de

determinação (r2) e probabilidade de falta de ajuste podem ser observadas na Tabela 1. As

distintas faixas estudadas para cada composto foi aplicada com o intuito de abranger a

maior variação do conteúdo nas amostras. De acordo com os índices de falta de ajuste, os

modelos para os compostos α, β, e δ-tocoferol não apresentaram falta de ajuste significativa

com p>0,05.

Tabela 1. Parâmetros para validação do método de separação de tocoferóis.

Tocoferóis LD*

(ng)

LQ*

(ng)

Precisão

Intra-dia

(%)

Linearidade

(ng) Equação r

2

Falta

de

Ajuste

α-tocoferol 0,85 1,98 3,42 47,5-902,5 y = 4,4317x - 97,64 1 0,073

β-tocoferol 1,28 2,99 3,48 8-152 y = 5,3434x – 20,9284 0,999 0,732

γ-tocoferol 3,03 7,07 3,18 89-1691 y = 3,7832x – 61,9527 0,999 0,001

δ-tocoferol 0,90 2,10 5,12 1,25-25,65 y = 5,2638x – 7,0716 0,996 0,121

* LD – Limite de Detecção; LQ – Limite de Quantificação;

Na validação do modelo para predição de γ-tocoferol, apesar de possuir uma

variação explicada de 99,99%, a equação apresentou falta de ajuste significativa com

104

p<0,05, devido à alta precisão do equipamento (HPLC-FL) utilizado, o que indicou a

possibilidade de o modelo não ser aplicado. Porém, ao analisar a relação entre os valores

preditos e valores reais experimentais (Figura 2 e Tabela 2), nota-se que o erro puro obtido

nos dados experimentos foi muito baixo, com valores estimados pelo modelo muito

próximos dos valores experimentais, caracterizando a falta de ajuste apresentada pela

ANOVA como um resultado falso-positivo.

Figura 2. Valores preditos e valores reais para o modelo matemático e dados experimentais

utilizados para quantificação de γ-tocoferol.

Tabela 2. Análise de Variância para o ajuste do modelo linear utilizados para quantificação

de γ-tocoferol.

Fonte de

Variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Soma

Quadrática

Média

Fcalculado p

Regressão 112238070 1 112238070 780576,6 0,000000

Falta de Ajuste 6148 8 768 5,3 0,001112

Erro Puro 2876 20 144

SQTotal 112247093 29

105

Os valores da Soma dos Quadrados (SQ) da Falta de Ajuste e do Erro Puro são

muito inferiores à SQ da regressão que por sua vez é próxima do valor de SQTotal, ou seja,

o modelo é mais explicado pela regressão linear do que pelos resíduos. Segundo Barros

Neto, Scarminio & Bruns (2010) e Souza & Menezes (2008), quando a magnitude do erro

puro é muito inferior à dos resíduos, o modelo pode apresentar falta de ajuste, no entanto,

ainda sim pode ser utilizado para fins preditivos. Sendo assim, os modelos encontrados para

representar a faixa linear de concentração de cada composto podem ser utilizados para

prever resultados.

3.1.2 Precisão e recuperação

A precisão instrumental intra-dia em termos percentuais de coeficiente de variação

(%) para o método de separação dos padrões de ácidos graxos apresentou valores inferiores

a 1,75% para todos os compostos, sendo que a maioria dos compostos injetados teve uma

precisão inferior a 1%. Os valores de precisão instrumental intra-dia mostram que o método

aplicado apresentou resultados satisfatórios com concordância entre os ensaios

independentes para determinação de ácidos graxos.

As precisões instrumentais intra e inter-dia para padrões de tocoferóis e presentes

nas sementes de tamarindo podem ser observadas nas Tabelas 1 e 3. O maior coeficiente de

variação obtido nos ensaios de precisão intra-dia (n=10), foram atribuídos para o δ-

tocoferol, de aproximadamente, 5%. Para α, β e γ-tocoferol, os coeficientes variaram de

3,42, 3,48 e 3,18%, respectivamente. De acordo com a Tabela 3, observa-se que a precisão

instrumental intra e inter-dia em padrão foi relativamente inferior aos valores dos

106

coeficientes de variação encontrados para precisão em amostra. Para precisão instrumental

intra-dia, considerando os três níveis de concentração de padrões, os valores encontrados

variaram entre 1,88 e 7,6%. Por outro lado, os valores encontrados para os diferentes

volumes de injeção de amostra variaram em uma faixa de 0,63 e 16,81%. De forma geral, a

precisão para o δ-tocoferol alcançou as maiores percentagens de variação, podendo ser

atribuído às menores concentrações trabalhadas em relação aos outros compostos. Nos

ensaios para precisão inter-dia pode ser observado que as percentagens de variação são

superiores às encontradas para precisão intra-dia. Os índices de variação em amostra foram

acrescidos à medida que se reduziu os volumes de injeção. Para precisão instrumental inter-

dia em padrões, os valores variaram de 5,25 % no N2 do β-tocoferol até 10,89% do N2 em

δ-tocoferol. Em amostra, os índices variaram de 2,7% para N3 e 15,9% no N1 do γ-

tocoferol. Outro fato observado para precisão inter-dia em amostras é que o volume de

injeção é inversamente proporcional ao CV, ou seja, quanto maior for o volume de injeção,

maior a precisão em amostra. Na maioria das vezes, nos ensaios inter-dia para padrões o δ-

tocoferol, permaneceu com os maiores índices de variação em relação aos outros

compostos. Este resultado foi diferente do encontrado para precisão em amostras, onde o

comportamento foi bastante variado, principalmente para os ensaios que se trabalhou com o

menor nível (N1).

107

Tabela 3. Precisão instrumental da separação de tocoferóis em mix de padrões e semente de

tamarindo juntamente com os valores de recuperação para o método de extração.

Precisão Tipo Níveis Tocoferóis

α-tocoferol β-tocoferol γ-tocoferol δ-tocoferol

Intra-dia

(%, n=10)

Padrãoa

N1 3,00 2,38 1,84 5,66

N2 2,77 2,82 2,84 7,6

N3 1,98 2,70 2,69 5,88

Amostrab

N1 3,62 5,59 5,82 16,81

N2 0,63 3,11 1,04 9,28

N3 3,98 10,20 4,20 9,30

Inter-dia

(%, n=5)

Padrão

N1 7,08 5,36 9,61 10,60

N2 9,46 5,25 9,02 10,89

N3 10,58 5,57 9,25 10,72

Amostra

N1 15,41 12,05 15,90 14,64

N2 10,60 10,82 11,29 12,31

N3 11,00 5,60 2,70 4,29

Recuperação

(%, media ± DP, n = 3)c

N1 74,39±5,48 75,71±7,35 64,45±3,41 64,54±5,64

N2 87,72±7,31 80,55±7,07 73,02±4,34 66,90±4,03

N3 85,60±3,28 84,15±7,42 75,96±6,76 69,74±3,68

a Concentração dos padrões: N1: 47,5 ng de α-tocoferol; 8,0 ng de β-tocoferol; 89 ng de γ-tocoferol; 1,35 ng

δ-tocoferol. N2: 475 ng de α-tocoferol; 80 ng de β-tocoferol; 890 ng de γ-tocoferol; 13,5 ng de δ-tocoferol;

N3: 950 ng de α-tocoferol; 160 ng de β-tocoferol; 1780 ng de γ-tocoferol; 27 ng. de δ-tocoferol; b Volume de

injeção de amostra: N1: 5µl; N2: 50µl; N3: 100µl. c N1: igual anterior; N2: 332,5 ng de α-tocoferol, 56 ng

de β-tocoferol, 623 ng de γ-tocoferol e 10,2 ng de δ-tocoferol. N3: 430,0 ng de α-tocoferol; 90 ng β-tocoferol;

1000 ng de γ-tocoferol; 20 ng de δ-tocoferol;

Nos ensaios de recuperação, pode-se observar que os resultados variaram de 64 a

87%, dependendo do composto e dos níveis de concentração avaliados. De forma geral,

nota-se que o processo de extração por completo, incluindo o método de Bligh & Dyer

(1959) para lipídeos totais influenciou na redução dos valores de recuperação encontrados

para os compostos estudados. O δ-tocoferol independente da concentração estudada teve os

108

menores índices de recuperação, chegando a 69% no maior nível (N3). Os maiores índices

foram obtidos com o α-tocoferol, que apresentou 74% no N1 e 85% no N3. Os baixos

índices de recuperação obtidos podem estar atribuídos à fase de extração de lipídeos por

Bligh-Dyer que naturalmente apresenta grande variação nas respostas, com baixa exatidão

para quantificação de matéria graxa (Oftedal, Eisert & Barrel, 2014). Trabalhos

encontrados na literatura relataram valores de recuperação superiores, variando de 90 a

110%, ao estudar isômeros de tocoferóis diretamente em óleos, sem incluir a fase de

extração lipídica (Taibi & Nicotra, 2002; Irakli, Samanidou & Papadoyannis, 2011; Ballus,

Meinhart, Campos, Silva, Oliveira & Godoy, 2014).

3.2 Composição de ácidos graxos

A Tabela 4 apresenta os resultados para quantificação de ácidos graxos presentes no

óleo da semente de T. indica colhidos em 3 diferentes estados do Brasil. Dez ácidos graxos

foram identificados e quantificados pelo método de GC-FID, dentre eles estão: ácido

mirístico (14:0), ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1n-9, cis),

ácido linoleico (18:2n-6cis), ácido α-linolênico (18:3n-3cis), ácido araquídico (20:0), ácido

11-eicosenoico (20:1n-9cis), ácido beênico (22:0) e ácido lignocérico (24:0).

109

Tabela 4. Perfil de ácidos graxos presentes na fração lipídica da semente de Tamarindus indica.

Ácidos

Graxos

Teor de ácidos graxos (mg.g-1

s.s.)

SMG SSP SBA

L1 L2 L1 L2 L1 L2

14:0 0,35±0,04eC*

0,32±0,02hiC

0,38±0,05eC

0,80±0,07gB

0,85±0,09dB

1,07±0,04fA

16:0 23,49±2,63cdC

21,50±0,92cdC

23,84±1,33bC

45,27±2,49cAB

38,70±3,36cB

47,28±5,11cA

18:0 14,12±1,48cdeCD

13,76±0,69efCD

10,13±0,48cdD

19,13±0,88efBC

22,65±3,27cdAB

26,03±3,50deA

18:1n9c 45,83±3,76bCD

40,32±1,64bD

31,80±2,03bD

60,97±3,01bBC

78,24±13,80bAB

83,06±9,67bA

18:2n6c 153,76±20,13aB

145,5±7,14aB

145,13±10,20aB

269,0±12,84aA

230,97±44,70aA

230,7±21,40aA

18:3n3 0,40±0,03eC

0,44±0,05hiC

0,42±0,04eC

1,45±0,24gA

0,86±0,11dB

1,06±0,06fB

20:0 5,92±0,64eB

5,75±0,33ghB

5,12±0,38deB

9,83±0,41fgA

9,30±1,69cdA

9,13±0,46efA

20:1n9 2,10±0,21eB

1,99±0,09hiB

1,57±0,14eB

3,12±0,14gA

3,30±0,50dA

3,29±0,07fA

22:0 9,75±0,96deB

8,96±0,54fgB

11,07±1,03cdB

21,22±0,90eA

11,16±1,50cdB

12,09±1,62efB

24:0 14,97±1,39cdeB

16,21±1,05deB

13,34±1,08cB

26,38±1,18deA

24,50±4,46cdA

24,02±1,86deA

Sat (%)**

26,42±1,08bA

27,22±0,33bA

27,44±0,48bA

27,97±0,20bA

26,61±1,42bA

27,31±2,15bA

Ins (%) 73,58±1,79aA

72,78±0,49aA

72,56±0,50aA

72,03±0,22aA

73,39±1,41aA

72,39±2,41aA

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na comparação entre ácidos graxos e maiúscula para comparação entre lotes não representa diferença

significativa entre si a p<0,05 pelo teste de Tukey.** Saturados e Insaturados.

110

De forma geral, o ácido linoleico (18:1n-6, cis) apresentou as maiores concentrações

nas amostras entre todos os ácidos graxos estudados, variando de 145 até 270 mg.g-1

s.s.,

seguido pelo ácido oleico que variou de 31 a 83 mg.g-1

s.s e ácido palmítico, onde foram

encontrados concentrações de 21 à 47 mg.g-1

s.s. Os ácidos mirístico e α-linolênico tiveram

as menores proporções em relação aos outros ácidos graxos encontrados no óleo da

semente de tamarindo, com variações entre 0,35 e 1,07 mg.g-1

s.s e 0,40 à 1,45 mg.g-1

s.s,

respectivamente. Estes resultados estão em conformidade aos encontrados por Luzia &

Jorge (2011) para tamarindos oriundos do estado de São Paulo, em que os ácidos graxos

majoritários variaram nas mesmas proporções. Avaliando o perfil de ácidos graxos do óleo

da semente de T. indica oriundos da Nigéria, Ajayi, Oderinde, Kajogbola & Uponi (2006)

encontraram 11 compostos entre eles os ácidos cis-11,14,17-eicosatrienóico (20:3) e cis-

11,14-eicosadienóico (20:2), não constatados nas sementes oriundas de MG, SP e BA. Em

contrapartida, os autores não observaram a presença do ácido mirístico (14:0) e ácido α-

linolênico (18:3n-3) encontrados neste presente trabalho. Diferente do perfil de ácidos

graxos das sementes estudadas do Brasil, as da Nigéria tiveram similaridades nas

proporções dos ácidos 16:0, 18:1 e 18:2, com 27,41, 24,13 e 24,75%, respectivamente.

Levando em consideração o estado produtor, as sementes dos frutos adquiridos da BA se

destacaram com as maiores concentrações dos ácidos graxos estudados em relação à

matéria seca, exceto quando levado em consideração o ácido beênico (22:0) e o ácido α-

linolênico (18:3n-3, cis), onde as concentrações foram maiores nas amostras SSP. Alguns

autores relataram que a concentração de ácidos graxos depende diretamente do método de

extração do óleo e local de origem da semente (El-Shami, El-Mallah, & Mohamed, 1992;

Lutterodt, Slavin, Whent & Turner, 2011). Por outro lado, as amostras de SMG e lote 1 de

111

SSP se equipararam em concentração para todos os compostos. No entanto, o lote 1 de SSP

obteve valores significativamente maiores em relação às outras amostras. Também pode ser

observado, em relação à comparação entre lotes de cada estado, que não houve variações

significativas (p<0,05) entre as concentrações de todos os ácidos graxos quantificados em

lote 1 e lote 2 do estado de Minas Gerais (MG).

Com relação ao teor de ácidos graxos saturados e insaturados, a Tabela 4 mostra que

o óleo presente na semente de T. indica possui cerca de 75% de ácidos graxos insaturados,

sendo que nesta faixa as maiores parcelas são atribuídas ao ácido linoleico (53%) e ácido

oleico (19%), enquanto que a fração saturada corresponde a apenas 25%. Na parcela da

fração saturada, cerca de metade corresponde ao ácido palmítico, chegando a 10% do total.

Também pode ser observado na Tabela 4 que não houve variações significativas

(p<0,05) entre as proporções de ácidos graxos saturados e insaturados com a mudança do

local e ano de colheita dos frutos, em que a fração insaturada foi significativamente maior

que a parcela saturada. Alguns autores afirmam que a qualidade do óleo vegetal está

diretamente relacionada à grande predominância de ácidos graxos insaturados, uma vez que

o grau de saturação está relacionado à degradação do produto (Lutterodt, Slavin, Whent &

Turner, 2011; Saha & Ghosh, 2011). O consumo de óleo com alto grau de saturação está

diretamente ligado ao aparecimento de doenças no ser humano (Willett, 2012, Ruiz-Núñez,

Kuipers, Luxwolda, Graaf, Breeuwsma, Dijck-Brouwer & Muskiet, 2014). O ácido

linoleico, por exemplo, é sem dúvidas um dos ácidos graxos insaturados mais importantes

na alimentação humana, devido à sua ação preventiva de doenças, redução da pressão

sanguínea e colesterol (Omode, Fatoki & Olaogun, 1995; Walker, Jebb, Calder & Phil,

2013). O ácido oleico também foi citado como sendo importante na dieta humana, com

112

ação redutora da gordura de baixa densidade (LDL), melhorando os sintomas de doenças

inflamatórias e reduzindo a pressão arterial (Hostmark & Haug, 2013). A presença dos

ácidos graxos chamados essenciais, como o linoleico, no óleo da semente de tamarindo faz

com que esta fração lipídica seja interessante do ponto de vista nutricional, uma vez que

este ácido graxo não é produzido pelo organisno, porém é responsável para formação de

membranas celulares, vitamina D e vários hormônios (Veronezi & Jorge, 2015).

A análise por GC-MS de ésteres metílicos de ácidos graxos confirmou a presença

de 9 dos 10 compostos anteriormente detectados no ionizador em chama (FID), como

mostra a Tabela 5.

Tabela 5. Composição de ésteres metílicos de ácidos graxos do óleo da semente de

Tamarindus indica identificados por GC-MS.

Nº Nome Nome usual

Fórmula

Molecular

Massa

molecular

Nº CAS*

1 n-Tetradecanoato Mirístico C15H30O2 242 124-10-7

2 Palmitato Palmítico C17H34O2 270 112-39-0

3 9,12-Octadecadienoico Linoleico C19H34O2 294 112-63-0

4 9-Octadecenoico Oleico C19H36O2 296 112-62-9

5 n-Octadecanoico Esteárico C19H38O2 298 112-61-8

6 cis-11-Eicosenoico 11-eicosenoico C21H40O2 324 2390-09-2

7 Eicosanoico Araquídico C21H42O2 326 1120-28-1

8 Docosanoato Beênico C23H46O2 354 929-77-1

9 Tetracosanoico Lignocérico C25H50O2 382 2442-49-1

* Chemical Abstracts Service

113

Apenas o ácido α-linolênico (18:3n-3) não foi observado pelas condições do

método aplicado, provavelmente sua identificação foi afetada pela condição do método que

não favoreceu a separação do composto que acaba sendo ionizado concomitantemente com

outro de mesma natureza, prejudicando sua identificação. Para melhor eficiência na

detecção individual de cada composto, os ácidos graxos devem estar previamente separados

ou isolados para então serem ionizados na fonte EI, pois a energia da ionização por elétrons

quebra as moléculas do íon molecular em fragmentos distintos que se misturados a outros

compostos de mesmas características (principalmente isômeros) dificultam a identificação

pelo quadrupolo, gerando o mesmo padrão de fragmentação, confundindo o perfil de

intensidade para os íons do analito em questão (Hoffmann & Stroobant, 2001). A

percentagem de similaridade para identificação por comparação dos compostos com a base

de dados (biblioteca virtual NIST®) variou de 76 à 98%.

A Figura 3 mostra os espectros de massas representativos para o ácido esteárico

(18:0), oleico (18:1c) e linoleico (18:2c), saturado, monoinsaturado e di-insaturado,

respectivamente. Apesar da diferença de intensidades apresentadas pelos padrões de

fragmentos dos ésteres metílicos de ácidos graxos, saturados e insaturados, não foi possível

alterar o modo de monitoramento dos íons para melhor detecção, uma vez que os ácidos

graxos possuem os mesmos fragmentos, porém com intensidades diferentes o que geraria

espectros não representativos. Além de ésteres metílicos, foram identificados vários outros

compostos de natureza distinta dos ácidos graxos, mostrando que a boa sensibilidade do

método GC-MS não interferiu na ausência do ácido α-linoléico, reforçando o motivo da

sobreposição de picos da saída do sistema cromatográfico para a fonte EI.

114

Figura 3. Espectro de massas representativo para ésteres metílicos de ácidos graxos. A –

saturado (Esteárico 18:0); B – monoinsaturado (Oleico 18:1 n-9, cis); C – di-insaturado

(Linoleico 18:2 n-6, cis).

115

3.3 Composição de tocoferóis

Os quatro isômeros de tocoferóis (α, β, γ e δ-tocoferol) foram encontrados e

quantificados para todas as amostras do óleo da semente de tamarindo estudadas,

independente da origem do fruto e da época de colheita estudada. Os resultados mostrados

na Tabela 6 revelam que o γ-tocoferol foi o composto predominante encontrado no óleo da

semente com concentração variando de 20 a 27 mg.kg-1

s.s.. Na sequência, o α-tocoferol foi

quantificado nas amostras de semente com relevância entre, aproximadamente, 16 a 25

mg.kg-1

s.s.. Por outro lado, o β e δ-tocoferóis apresentando baixos teores mostrando

diferenças significativas entre si quando comparados em conjunto com os demais para

todos os óleos das sementes. Entretanto, nota-se que o β-tocoferol teve uma maior

predominância em relação ao δ-tocoferol presentes nas amostras, tendo a máxima

concentração encontrada para o lote 1 de SBA, com teor de 2,96±0,18 mg.kg-1

s.s., enquanto

que a máxima obtida para δ-tocoferol alcançou 1,03±0,11 mg.kg-1

s.s.. Os tocoferóis α e γ

são os tocoferóis homólogos mais comumente encontrados em óleos de vegetais (Sen

Khanna, Rink & Roy, 2006). Entretanto, as diferentes proporções destes tocoferóis nos

óleos vegetais são bem apresentadas na literatura. Em trabalhos com azeite de oliva

produzidos em diferentes regiões do Brasil, Ballus, Meinhart, Campos, Silva, Oliveira &

Godoy (2014) detectaram valores de β e γ-tocoferol muito abaixo do α-tocoferol em todas

as amostras, além de não verificar a presença do δ-tocoferol. Kodad, Estopañán, Juan,

Alonso, Espiau & Company (2014) verificaram a maior predominância de α-tocoferol em

óleo de 44 espécies de amêndoas produzidas na Espanha, com baixos teores de β, seguido

de γ-tocoferol e ausência de δ-tocoferol. Nedhi, Sbihi, Tan & Al-Resayes (2014)

116

encontraram grande quantidade de δ-tocoferol em óleo de coral fungo (Ramaria stricta) em

relação aos outros isômeros, porém, o óleo de Girassol mostrou ausência de δ e

predominância de α-tocoferol. Por outro lado, o óleo de soja apresentou grandes

quantidades de γ e δ-tocoferóis em relação aos α e β-tocoferóis.

Tabela 6. Composição de tocoferóis presentes no óleo da semente de Tamarindus indica

oriundo de diferentes estados do Brasil.

Tocof

Teor de tocoferóis (mg.kg-1

s.s.)

SMG SSP SBA

L1 L2 L1 L2 L1 L2

α-toc 21,8±0,98bAB*

25,5±2,69eA

21,3±0,83bABC

16,4±1,90bC

19,4±2,50bBC

17,1±1,66aBC

β-toc 2,3±0,21cC

2,8±0,03cAB

2,3±0,05cC

2,0±0,16cC

3,0±0,18cA

2,4±0,33bBC

γ-toc 27,0±2,58aAB

31,1±1,35aA

25,6±1,22aABC

23,0±2,09aiBC

25,9±2,03aABC

20,4±2,60aC

δ-toc 0,3±0,03cD

0,6±0,07cB

0,5±0,01cBC

0,4±0,01cCD

1,0±0,11cA

0,3±0,02bD

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula para comparação entre tocoferois e maiúscula para

comparação entre lotes e estados não representa diferença significativa entre si a p<0,05 pelo teste de Tukey.

n=3.

Em relação aos lotes, nota-se que houve variações nas intensidades dos compostos,

para a maioria dos casos, quando o fruto foi colhido em diferentes anos. O óleo da semente

oriunda do estado de Minas Gerais teve as maiores concentrações do composto α-tocoferol

de 21,8±0,98 a 25,5±2,69 mg.kg-1

s.s. para L1 e L2, respectivamente, não apresentando

diferenças significativas entre si (p<0,05). Já para as amostras SSP e SBA, a composição de

α-tocoferol não se diferiu entre si (p<0,05). Para β-tocoferol, a maior concentração foi

encontrada para L2 de SMG e L1 de SBA, com valores de 2,8 a 3,0 mg.kg-1

s.s.,

respectivamente. Com relação aos teores de γ-tocoferol, as amostras L1 e L2 de SMG

apresentaram teores significativamente maiores que as demais avaliadas, uma vez que estes

117

resultados alcançaram aproximadamente, 27 e 31 mg.kg-1

s.s., respectivamente. As diferenças

se repetiram para o composto δ-tocoferol, sendo que os menores valores foram encontrados

para L1 de SMG, L2 de SSP e L2 de SBA. O conteúdo de tocoferóis encontrados está

proporcionalmente compatível com os dados da literatura para o óleo da semente de T.

indica, porém, o conteúdo de α e δ-tocoferóis superestimaram os resultados encontrados

por Luzia & Jorge (2011) para o óleo da semente de 12,4±0,16 e 0,2±0,01 mg.kg-1

,

respectivamente. Alguns estudos sugerem que a presença de compostos como flavonoides,

ácido ascórbico, vitamina E, β-caroteno e polissacarídeos em T. indica conferem ao fruto

um poder de proteção à doenças do fígado (Shammi, Choudhry, Khan & Hossain, 2013;

Samal & Dangi, 2014). O uso dos extratos de folhas e sementes de T. indica no tratamento

de doenças relacionadas ao fígado de ratos foram estudadas em trabalhos científicos, onde

se encontrou um efeito significante no combate à doença (Joyeux, Mortier, Pleurentin,

1995; Pimple, Kadam, Badgujar, Bafna & Patil, 2007). Os tocoferóis e tocotrienóis são

derivados naturais da vitamina E e estão quimicamente disponíveis em formas de isômeros

(Sem, Khanna, Rink & Roy, 2007). A efetividade da vitamina E no combate a doenças

hepáticas já foram comprovadas na ciência (Sario, Bendia, Taffetani, Omenetti,

Candelaresi, Marzioni, Minicis & Benedetti, 2005; Aboul-Soud, Al-Othaman, El-Desoky,

Al-Othman, Yusuf, Ahmad & Al-Khedhairy, 2011). Além da importância farmacológica,

os tocoferóis desempenham papéis importantes na conservação de óleos poli-insaturados,

uma vez que os mesmos promovem a estabilidade oxidativa inibindo a ação de radicais

livres.

O δ-tocoferol é pouco encontrado em grande parte dos vegetais e na maioria das

vezes está presente em baixas concentrações (Nehdi, Sbihi, Tan & Al-Resayes, 2014).

118

Wells, Jennings, Rome, Hadjivassiliou, Papas & Alexander.(2010) mencionam que a

presença de δ-tocoferol na dieta retarda muitas atividades inflamatórias e do câncer. A falta

de δ-tocoferol na maioria das formulações de vitamina E pode ser um limitante para

efetividade do produto na promoção da saúde (Salden & Salden, 2005). Assim sendo,

devido à grande predominância dos antioxidantes naturais α e γ-tocoferóis e principalmente

pela presença de δ-tocoferol no óleo, a semente de tamarindo pode ser uma fonte

importante destes compostos a ser explorada industrialmente.

4. Conclusão

A composição de ácidos graxos e tocoferóis do óleo da semente de Tamarindus

indica de três estados do Brasil foi avaliada a partir dos métodos analíticos validados para

cada classe distinta de compostos. A origem e época de colheita dos frutos não

influenciaram na relação de ácidos graxos e tocoferóis identificados no óleo da semente,

porém, provocou variações nas intensidades dos compostos de forma significativa para a

maioria deles.

O perfil de ácidos graxos saturados e insaturados também não sofreu variações e se

mostrou muito favorável para um óleo com característica desejável. Assim sendo, o óleo

obtido da semente de tamarindo sugere possuir grande potencial nutracêutico na fração

lipídica por meio de elevadas concentrações de ácidos graxos insaturados e tocoferóis.

119


Aboul-Soud, M. A., Al-Othaman, A. I., El-Desoky, G. E., Al-Othman, Z. A., Yusuf, K.,

Ahmad, J., Al-Khedhairy, A. A, Hepatoprotective effects of vitamin E/selenium

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127

CAPÍTULO V

AVALIAÇÃO SENSORIAL DE NÉCTAR ELABORADO COM POLPA E

EXTRATO AQUOSO LIOFILIZADO DA SEMENTE DE TAMARINDO

(Tamarindus indica L.)

Danilo Santos Souzaaa*

, Janclei Pereira Coutinhoa, Tayse Ferreira Ferreira da Silveira

a,

Erick Almeida Esmerindob, Helena Maria Andre Bolini

b, Helena Teixeira Godoy

a

a Departamendo de Ciência de Alimentos – FEA, Universidade Estadual de Campinas,

Brasil.

b Departamento de Alimentos e Nutrição – FEA, Universidade Estadual de Campinas,

Brasil.

* Autor para correspondência: Rua Monteiro Lobato, 80, Lab Análise, FEA-DCA, CEP:

13083-862, Cidade Universitária, Campinas-SP.

E-mail: [email protected] (Souza, D. S.).

Manuscrito em preparo para ser submetido ao periódico LWT - Food Science and

Technology

128

RESUMO

A semente de tamarindo que possui boa parcela dos compostos bioativos do fruto é pouco

aproveitada nas indústrias, desta forma, o objetivo do trabalho foi determinar o perfil do

consumidor de suco e elaborar um néctar a base de polpa e extrato aquoso liofilizado da

semente de tamarindo, de modo a aproveitar as propriedades funcionais da semente ao

mesmo tempo em que mantenha características sensoriais aceitáveis. Os frutos foram

adquiridos dos estados de Minas gerais, São Paulo e Bahia. Os néctares foram elaborados a

partir da adição de 0,3, 1,15 e 2% de extrato aquoso liofilizado, em relação a quantidade de

polpa hidratada. O teste sensorial de diferença do controle foi aplicado para 31 julgadores e

o teste de aceitação por 60 consumidores avaliando os atributos de aparência, aroma, sabor

textura e impressão global. Para o atributo sabor no teste de diferença do controle,

observou-se que não houve diferença significativa em relação ao padrão quando se

adicionou a menor concentração de extrato (0,3%). No teste de aceitação, de forma geral

variaram de ―desgostei ligeiramente‖ à ―gostei ligeiramente‖, no entanto, a variância ficou

entre 40 e 50%. A maior nota foi atribuída para a amostra controle da Bahia, com

aproximadamente, 5,44±2,21. Os testes sensoriais mostraram que a concentração do extrato

adicionado altera as características sensoriais do refresco, porém, esta mudança também é

dependente da origem dos frutos. Por outro lado, houve grande variabilidade de notas e

uma tendência em reduzir a aceitação do refresco quando for adicionado mais extrato da

semente.

Palavras chave: Extrato aquoso, escala hedônica, biofortificação, suco, liofilização.

129

1. Introdução

Atualmente, a busca dos consumidores por alimentos mais saudáveis e práticos vem

crescendo a cada dia no Brasil e no mundo, principalmente pela vinculação da alimentação

com a promoção de saúde (Azevedo, 2008). A conscientização sobre a importância da

inclusão de alimentos saudáveis na dieta que auxiliam na prevenção de doenças e melhoria

da qualidade de vida consequentemente resulta em um aumento na demanda destes

produtos no mercado, principalmente de frutas e derivados (Lock, Pomerlau, Causer,

Altmann & MCkee, 2005). O tamarindo é comumente consumido na forma de polpa, sucos,

extrato, xarope, balas e outras para consumo oral, também podendo ser usado como

expectorante, laxativo, carminativo, além de ser indicado para infecções estomacais, no

fígado e vesícula biliar (Queiroz, 2010). O suco da polpa é muito apreciado nos países

tropicais pelo seu sabor agridoce e propriedades refrescantes (Manohar, Ramakrishna &

Udayasankar, 1991). No entanto, a semente, que compõe a maior parcela do fruto, detém

uma importante quantidade de compostos responsáveis pelas propriedades funcionais e

geralmente não é reaproveitada para estes fins nas indústrias de suco, surgindo a

necessidade de se elaborar um néctar conjugado composto de polpa e semente que

aproveite tais propriedades e ao mesmo tempo mantenha características sensoriais

aceitáveis (Shiddhuraju, 2007).

De acordo com o Art. 21 do Decreto nº 6871/2009, néctar ―é a bebida não

fermentada, obtida da diluição em água potável da parte comestível do vegetal e açúcares

ou de extratos vegetais e açúcares, podendo ser adicionada de ácidos, e destinada ao

consumo direto‖. Não é permitida a associação de açúcares e edulcorantes hipoenergéticos

e não-energéticos na fabricação de néctar (Brasil, 2009). O Art. 3º, da Instrução Normativa

130

nº 12, define que: ―o néctar cuja quantidade mínima de polpa de uma determinada fruta não

tenha sido fixada em Regulamento Técnico específico deve conter no mínimo 30% (m/m)

da respectiva polpa, ressalvado o caso de fruta com acidez ou conteúdo de polpa muito

elevado ou sabor muito forte e, neste caso, o conteúdo de polpa não deve ser inferior a 20%

(m/m)‖. O Art. 2º, da Instrução Normativa nº 12, considera o tamarindo ―como frutas

polposas de origem tropical‖, porém só pode ser considerado um suco tropical se a

concentração de polpa tiver um mínimo de 50% (m/m) da respectiva polpa, com ressalvas

no caso de a fruta possuir acidez alta ou conteúdo de polpa muito elevado ou sabor muito

forte que, neste caso, o conteúdo de polpa não deve ser inferior a 35% (m/m) (Brasil, 2003).

Devido aos constantes avanços no desenvolvimento de novos produtos

alimentícios, a utilização de análises que representam a opinião do consumidor com

segurança e eficiência se torna imprescindível (Yoo, Shin & Park, 2015). Assim sendo,

testes sensoriais são realizados em produtos específicos para direcionar o gosto e a

preferência do público alvo em questão. Apesar da grande variedade de frutas tropicais

produzidas no Brasil, não há registro de nenhum néctar de fruta creditado pelos órgãos

competentes que utilizem extratos vegetais como aditivo visando melhoramento das

propriedades funcionais. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver

formulações de néctar de tamarindo que envolva a mistura de polpa liofilizada e extrato

aquoso liofilizado da semente liofilizado em diferentes concentrações, bem como avaliar

suas propriedades sensoriais com testes de diferença do controle e aceitação pelos

consumidores, como forma alternativa de aproveitamento tecnológico da semente de

tamarindo.

131


2.1 Reagentes

Foram utilizados os reagentes hidróxido de sódio p.a (Synth, Brasil) e bifitalato de

potássio p.a (Merck, Alemanha).

2.2 Obtenção da matéria-prima




2013. Todas as amostras foram colhidas no período de setembro (entre inverno e

primavera). Após a aquisição, foram descascados e a polpa juntamente com a semente ficou

de molho por 24 h para hidratação e facilitar a separação. Posteriormente, a mistura foi

pulsada em liquidificador industrial (modelo AR 2 L, Colombo®, 800 W e 60 Hz) e filtrada

em peneira comum para separar a polpa da semente.

2.3 Preparo de amostras

As amostras de néctar de tamarindo foram elaboradas com a polpa e o extrato

aquoso liofilizado da semente. Para cada estado, utilizou-se seu respectivo extrato aquoso

liofilizado da semente em diferentes concentrações, sendo que o controle [0] não foi

adicionado do extrato, a concentração [1] com 0,6gextrato/L, [2] – 2,3gextrato/L e [3] –

4,0gextrato/L que correspondem, respectivamente, a 0,3%, 1,15% e 2%, de extrato liofilizado

132

em relação à polpa hidratada. As amostras foram preparadas imediatamente antes da análise

sensorial na proporção de 7:2:1,3 de água:polpa:açúcar.

O extrato aquoso liofilizado da semente foi obtido a partir da moagem da semente

em uma relação m/v de 1:3 de semente e água, submetidos a um período de trituração de 80

s em que o mosto resultante do primeiro processo foi utilizado mais uma vez nas mesmas

condições de extração. O extrato obtido foi congelado em bandejas com 1 cm de espessura

e posteriormente liofilizado em um equipamento da marca Terroni®

modelo LS3000 por

um período de 48 h, até umidade constante de, aproximadamente, 2,00 gágua/100 g.

2.4 Acidez total titulável e teor de sólidos solúveis totais

A acidez total titulável foi medida conforme a metodologia da Association of

Official Analytical Chemists (AOAC, 2010) e os resultados foram expressos em

equivalência ao ácido tartárico (gácido tartárico/100gss), predominante na polpa de tamarindo.

O teor de sólidos solúveis totais foi determinado pelo método de refratometria

(AOC, 2010) com resultados expressos tem (ºBrix).

O ratio foi calculado por meio da razão entre o teor de sólidos solúveis totais sobre

a acidez total titulável em unidade adimensional.

2.5 Análise sensorial

A análise sensorial é uma ciência que utiliza as qualidades psicológicas e

fisiológicas do ser humano para avaliar e gerar respostas sobre as características de

133

aparência, aroma, sabor e textura de alimentos. Por se tratar de uma análise fundamental no

desenvolvimento de novos produtos e utilizar seres humanos como principal critério de

avaliação, foi solicitado e concedido o consentimento de um comitê de ética para avaliar e

autorizar tais análises (parecer consubstanciado em anexo). Assim, os testes afetivos de

Diferença do Controle e de Aceitação foram realizados seguindo as normas do Comitê e

utilizando os padrões de Boas Práticas de Fabricação (BPF), no Laboratório de Análise

Sensorial do Departamento de Nutrição da Faculdade de Engenharia de Alimentos - FEA –

UNICAMP.

2.5.1 Teste de diferença do controle

Um teste sensorial discriminativo de Diferença do Controle avalia o grau de

diferença entre as amostras com adição de 0,3%, 1,15% e 2%, de extrato liofilizado em

relação à polpa hidratada e o controle que não foi adicionado do extrato. O teste foi

aplicado para 31 julgadores e a ordem de apresentação das amostras foi balanceada em

copos codificados com números aleatórios de três dígitos. A amostra controle foi também

servida entre as amostras codificadas. Foi utilizada uma escala estruturada mista em que 0

(nenhuma diferença do Padrão) e 8 (extremamente diferente do Padrão), conforme consta

na ficha de aplicação do teste (Figura 1). Também foi servido 1 copo com água e bolacha

água e sal para descansar as papilas entre as diferentes amostras.

134

NOME:________________________________________________ DATA: / /

Você está recebendo uma amostra padrão (P) de néctar e mais 4 amostras codificadas.

Primeiramente prove a amostra padrão (P) e em seguida, da esquerda para a direita, prove

cada amostra codificada de néctar. Utilizando a escala abaixo, indique o grau de diferença

quanto à APARÊNCIA, AROMA e SABOR, entre cada amostra codificada e a amostra P.

AMOSTRA APARÊNCIA AROMA SABOR

0 nenhuma diferença ______ ______ ______ ______

1

2 ligeiramente diferente ______ ______ ______ ______

3

4 moderadamente diferente ______ ______ ______ ______

5

6 muito diferente ______ ______ ______ ______

7

8extremamente diferente Figura 1. Ficha de aplicação do Teste Diferença do Controle para néctar de tamarindo.

2.5.2 Teste de aceitação pelos consumidores

O teste de Diferença do Controle mostra se há diferença, e o grau desta diferença,

entre as amostras estudadas e a amostra Padrão. No entanto, as amostras podem ser

diferentes, mas, ainda assim, terem aceitabilidade pelo consumidor. Portanto, utilizou-se

um teste sensorial de aceitação para avaliar a aceitação e/ou rejeição dos consumidores às

amostras de néctar de tamarindo elaborado com a polpa liofilizada e enriquecido com o

extrato liofilizado da semente em diferentes concentrações. Uma amostra de cada estado de

origem sem adição de extrato e mais 3 com adição, totalizando 4 amostras para cada estado

foram avaliadas. Desta forma, o teste de aceitação foi composto de 12 amostras, levando

em consideração os estados de MG, SP e BA.

A aceitação de cada tratamento foi avaliada por sessenta consumidores em uma

ficha de avaliação integrada ao software Fizz by Biosystemes® (EUA). Os julgadores

135

avaliaram todas as amostras, indicando em uma escada hedônica estruturada de 9 pontos, o

quanto gostaram ou desgostaram da aparência, textura, sabor e da amostra de um modo

geral.

Os indivíduos foram ainda questionados quanto à intenção de compra dos produtos,

indicando de acordo com uma escala estruturada de nove pontos, o grau de certeza em que

comprariam ou não o produto. A ordem de apresentação das amostras foi balanceada entre

os julgadores em copos codificados com números aleatórios de três dígitos e as amostras

foram servidas de forma monádica, para evitar o efeito comparativo entre as amostras.

2.6 Perfil do consumidor de suco

O perfil do consumidor foi obtido a partir da aplicação de um questionário

estruturado (Anexo 1) entregue ao provador no intervalo das análises do teste de aceitação

com o intuito de caracterizar a população participante dos testes sensoriais para o néctar de

tamarindo. Foram incluídas perguntas sobre sexo, faixa etária, ocupação e região de

origem. Informações como o modo de consumo de suco, preferências do tipo de suco,

opiniões sobre sua funcionalidade, critério de compra e frequência de consumo também

foram avaliadas. As frutas escolhidas para representar os tipos de sucos foram baseadas nas

mais consumidas no Brasil segundo IBRAF (2006). Os dados sobre o conhecimento do

suco de tamarindo, aliados à nota do quanto o consumidor gosta do suco são de

fundamental importância para explicar os comportamentos nos resultados dos testes. Por

fim, a disposição para o consumidor pagar mais por um produto enriquecido em

propriedade funcional relaciona ao objetivo do trabalho de desenvolver um novo produto à

136

base de polpa e extrato aquoso liofilizado da semente de tamarindo. Os resultados foram

expressos em percentagem através da estatística descritiva utilizando os softwares

Microsoft Office Excel 2010 e o Origin 8.0.


Os resultados do teste de Aceitação foram avaliados por ANOVA e teste Tukey

(p≤0,05) utilizando-se o software SAS 9.0 e os gráficos de frequência foram montados

utilizando-se o software OriginPro® 8.0. Utilizou-se o teste de média Dunnett para a análise

estatística do teste sensorial de Diferença do Controle das amostras de néctar o qual foi

feito pelo software SAS®

9.0.


3.1 Determinação da acidez total titulável, teor de sólidos solúveis totais e ratio

A Tabela 1 apresenta os dados da acidez total titulável, sólidos solúveis totais e

ratio das polpas de tamarindo nos dois lotes oriundas das regiões de Minas Gerais, São

Paulo e Bahia. Observa-se que a polpa proveniente do estado da Bahia apresentou as

maiores médias de acidez e sólidos solúveis totais, seguida do estado de São Paulo e Minas

Gerais, sendo o segundo lote significativamente maior que o primeiro para ambos os

parâmetros. Para acidez, a polpa PBAL1 teve 28,11±2,07 gácido tartárico/100 gss e no segundo

lote 31,01±0,17 gácido tartárico/100 gss. Já PMGL1 e PMGL2 tiveram valores iguais a

137

14,51±0,07 e 16,60±0,51 gácido tartárico/100 gss, respectivamente. Com relação ao teor de

sólidos solúveis totais, PBAL1 e PBAL2 tiveram valores superiores aos demais estados

com 127,26±0,45 e 146,65±1,39 ºBrix, respectivamente. Por outro lado, a PMGL1 e

PMGL2 tiveram maiores concentrações de sólidos solúveis quando comparadas com as

polpas oriundas do estado de São Paulo, com 105,33±1,28 e 93,69±1,17 ºBrix,

respectivamente.

Tabela 1. Acidez Total Titulável, Sólidos Solúveis Totais e Ratio da polpa de tamarindo de

diferentes estados do Brasil normalizados em base seca.

Amostras ATT

(gácido tartárico/100 gss)

SST

(ºBrix)

Ratio

(SST/ATT)

PMGL1** 14,51±0,07e*

105,33±1,28c 7,26±0,19

a

PSPL1 18,91±0,28c 90,94±1,10

d 4,81±0,11

c

PBAL1 28,11±2,07b 127,26±0,45

b 4,54±0,35

c

PMGL2 16,60±0,51d 93,69±1,17

d 5,65±0,20

b

PSPL2 18,69±0,40c 87,46±0,24

e 4,68±0,11

c

PBAL2 31,01±0,17a 146,65±1,39

a 4,73±0,02

c

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não apresenta diferença

significativa entre si a p<0,05. n=3. ** 1 – Lote 1, 2 – Lote 2. PMG – Polpa de Minas

Gerais; PSP – Polpa de São Paulo; PBA – Polpa da Bahia; L1 – Lote 1; L2 – Lote 2;

O ratio que representa a razão entre sólidos solúveis totais e acidez total titulável, é

um indicativo do estádio de maturação dos frutos devido às alterações nos níveis de

carboidratos à medida que os frutos amadurecem. Desta forma, pode-se observar que a

maioria das amostras apresentou o mesmo estádio de maturação, apenas as polpas obtidas

138

do estado de Minas Gerais tiveram valores superiores aos demais estados para ambos os

lotes com valores de 7,26±0,19 para PMGL1 e 5,65±0,20 PMGL2, com estádio de

maturação mais avançado.

3.2 Análise sensorial

3.2.1 Teste de diferença do controle

As notas indicadas para os atributos da aparência, aroma e sabor de néctar de polpa

liofilizada de tamarindo dos estados de Minas Gerais, São Paulo e Bahia enriquecido com

diferentes concentrações de extrato liofilizado estão mostrados na Tabela 2. Nota-se para as

amostras do estado de Minas Gerais que aparência da amostra MG[1] foi a única que não

diferiu do controle, recebendo uma nota aproximada de 1,81±1,42. Já as amostras MG[2] e

MG[3], que possuem maiores concentrações de extrato, tiveram alterações na aparência

como comprova as médias 2,55±1,69 e 3,16±1,90, respectivamente. Com relação ao

atributo aroma, observa-se que o único tratamento que obteve diferença significativa foi o

MG[3] sendo o que possui a maior concentração de extrato liofilizado com média de nota

igual a 2,45±2,13. As amostras MG[2] e MG[3] apresentaram diferenças significativas da

amostra padrão MG[0] com relação ao sabor, enquanto que não foi observada diferença

significativa para a amostra MG[1], de menor teor de extrato.

139

Tabela 2. Grau de diferença entre as amostras de néctar de tamarindo oriundas dos estados

de Minas Gerais, São Paulo e Bahia enriquecidas com extrato da semente.

Amostras

Médias das diferenças1

Aparência Aroma Sabor

MG[0]3 0,87±1,34 1,00±1,34 1,61±1,82

MG[1] 1,81±1,42 1,26±1,32 2,03±1,52

MG[2] 2,55±1,69* 2,00±2,02 2,90±1,56*

MG[3] 3,16±1,90* 2,45±2,13* 4,00±1,90*

M.D.S2 0,836 0,853 0,940

SP[0] 0,74±1,39 0,90±1,14 1,68±1,42

SP[1] 2,10±1,45* 1,19±1,30 2,39±1,63

SP[2] 2,87±1,75* 2,10±1,66* 3,13±1,86*

SP[3] 3,52±1,65* 1,90±1,68* 3,58±1,95*

M.D.S 0,791 0,710 0,980

BA[0] 1,06±1,73 1,00±1,10 1,45±1,59

BA[1] 3,52±2,22* 1,90±1,72 2,58±2,01

BA[2] 3,16±1,86* 2,10±1,78* 2,94±1,95*

BA[3] 4,00±2,07* 2,19±1,96* 4,42±2,01*

M.D.S 0,969 0,771 0,943

10=nenhuma diferença do Padrão; 8=muito diferente do Padrão; *Amostra difere do padrão

(controle) a p<0,05 de significância pelo teste de Dunnett. 2M.D.S = Mínima diferença

significativa. 3[0] – controle, [1] – 0,6gextrato/L, [2] – 2,3gextrato/L e [3] – 4,0gextrato/L. n=31

Para as médias das notas atribuídas às amostras de néctar elaboradas com polpa e

extrato liofilizados oriundos do estado de São Paulo, pode-se notar para o atributo

140

aparência, que todas as amostras diferiram significativamente do controle com a adição do

extrato, sendo que a nota mínima foi dada à amostra SP[1] (2,10±1,45), com menor adição

de extrato e seguindo a ordem, a maior para SP[3] (3,52±1,65) com maior adição de

extrato.

No atributo aroma, apenas a SP[1] não foi significativamente diferente do controle a

p<0,05, com nota igual a 1,19±1,30. Já a SP[2] e SP[3], se mostraram significativamente

diferentes com médias iguais a 2,10±1,66 e 1,90±1,68, respectivamente. Para o sabor

avaliado nas amostras, a igualdade com o padrão também se repetiu para a amostra SP[1],

indicando que a partir de 0,6 g de extrato adicionados a 1 litro de néctar, o sabor começa a

diferenciar da amostra controle. Por outro lado, para as amostras SP[2] e SP[3] foram

notadas diferenças significativas em relação ao controle, com 3,13±1,86 e 3,58±1,95,

respectivamente. O maior valor da mínima diferença significativa foi identificado para o

atributo sabor de 0,98, sendo que para aparência e aroma, os valores foram menores, com

0,79 e 0,71, respectivamente.

Com relação às amostras de néctar elaborado com frutos da Bahia, nota-se que

nenhum dos tratamentos foi classificado com sendo igual à amostra controle para

aparência, obtendo notas de 3,52±2,22, 3,16±1,86 e 4,00±2,07, para BA[1], BA[2] e BA[3],

respectivamente, enquanto que a amostra padrão teve nota igual a 1,06±1,73,

significativamente abaixo das demais. A adição de extrato ao néctar a partir de 2,3 g/L

mostrou que os provadores encontraram diferença na avaliação do atributo aroma, sendo

que a amostra BA[1] que está abaixo disto, com 0,6 gextrato/L, não caracterizou como

significativamente diferente. Com relação ao sabor, seguiu-se o mesmo padrão do atributo

aroma, apenas com a amostra BA[1] recebendo notas que apresentam igualdade

141

significativa com o padrão. As amostras BA[2] e BA[3] com mais concentração de extrato

foram distinguidas do controle pelos provadores, indicando que a adição do extrato causou

diferenças significativas. A maior nota foi atribuída ao tratamento BA[3], com 4,42±2,01 o

que indica maior diferença com o padrão, classificada entre moderadamente diferente e

muito diferente do controle. De forma geral, pode-se observar que à medida que se aumenta

a concentração de extrato liofilizado da semente ao néctar, as notas tendem a ser maiores, o

que indica um aumento do grau de diferença entre os atributos em relação à amostra

controle. Na opinião dos consumidores, todas as médias se apresentaram entre ligeiramente

diferente e moderadamente diferente do padrão para todos os atributos avaliados.

3.2.2 Teste de aceitação

Utilizou-se um teste sensorial de aceitação para avaliar a aceitação e/ou rejeição dos

consumidores em relação às amostras de néctar elaborado de frutos originados de diferentes

estados de origem com adição de diferentes concentrações de extrato aquoso liofilizado da

semente liofilizado. Os resultados podem ser encontrados na Tabela 3.

142

Tabela 3. Notas (médias e desvios padrões) de aceitação para as diferentes formulações de

néctar de tamarindo.

AMOSTRAS APARÊNCIA AROMA SABOR TEXTURA

IMPRESSÃO

GLOBAL

MG[0] 5,46±2,19a 5,38±2,16

a,b 5,60±2,25

a,b 6,13±1,91

a 5,66±2,09

a

MG[1] 5,33±2,13a 5,16±2,35

a,b,c 5,29±2,43

a,b,c 5,90±2,19

a,b,c 5,31±2,23

a,b

MG[2] 5,13±2,09a,b

4,85±2,39a,b,c

4,91±2,44a,b,c

5,57±2,27a,b,c,d

5,05±2,17a,b

MG[3] 5,12±2,26a,b

4,56±2,39c 4,80±2,22

a,b,c 5,09±2,11

c,d 4,80±2,04

b

SP[0] 5,62±2,36a 5,38±2,29

a,b 5,37±2,45

a,b 5,98±2,24

a,b 5,58±2,28

a

SP[1] 5,47±2,24a 5,31±2,60

a,b 5,23±2,59

a,b,c 5,96±2,22

a,b 5,40±2,30

a,b

SP[2] 5,16±2,21a,b

5,14±2,38a,b,c

5,18±2,32a,b,c

5,65±2,32a,b,c,d

5,12±2,27a,b

SP[3] 4,51±2,24b 4,79±2,25

a,b,c 4,37±2,10

c 4,98±2,22

d 4,74±1,96

b

BA[0] 5,43±2,28a 5,44±2,21

a 5,69±2,23

a 6,05±2,07

a 5,74±2,09

a

BA[1] 5,35±2,31a 5,24±2,40

a,b,c 5,69±2,29

a 6,00±2,00

a,b 5,69±2,12

a

BA[2] 5,21±1,95a 4,94±2,32

a,b,c 5,02±2,23

a,b,c 5,70±2,16

a,b,c,d 5,24±2,07

a,b

BA[3] 5,06±2,10a,b

4,69±2,39b,c

4,67±2,40b,c

5,20±2,50b,c,d

4,78±2,30b

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna para cada atributo não

apresentam diferença significativa entre si a p≤0,05. n=60. Descrição

das notas:

1=desgostei muitíssimo, 9=gostei muitíssimo.

Observando as médias para os atributos, de forma geral variaram de ―desgostei

ligeiramente‖ (4) à ―gostei ligeiramente‖ (6), independente do estado de origem ou

quantidade de extrato adicionado. No entanto, a variância ficou em torno de 40 a 50%,

indicando a grande discrepância na preferência dos julgadores. Este dado pode ser

confirmado ao se observar que os tratamentos que não tiveram adição de extratos, também

143

tiveram notas que variaram nesta faixa. Com relação ao atributo aparência, as médias

variaram em torno de ―nem gostei e nem desgostei‖ (5), sendo que o único tratamento que

recebeu a menor nota e diferiu da maioria foi o SP[3], com 4,51±2,24, aproximadamente.

Sendo assim, houve diferença significativa entre os outros tratamentos. Para o aroma, a

menor nota (4,56±2,39) foi dada para o tratamento MG[3], porém, devido a grande

variação de notas, muitos outros tratamentos se igualaram significativamente a ele. A maior

nota foi atribuída para a amostra BA[0], com aproximadamente, 5,44±2,21, mas a maioria

dos outros tratamentos também mostraram similaridade entre si.

Com relação ao atributo sabor, pode-se notar que a maioria dos tratamentos foram

significativamente iguais, no entanto, percebe-se que os tratamentos MG[3], SP[3] e BA[3],

que possuem as maiores concentrações, tiveram as menores médias, com 4,80±2,22,

4,37±2,10 e 4,67±2,40, respectivamente. Por outro lado, não demonstraram diferenças

significativas para vários outros tratamentos. Pode-se deduzir que à medida que se aumenta

a concentração do extrato de tamarindo ao néctar, as notas do atributo sabor tendem a

diminuir. Com relação ao atributo textura, também pode ser observado uma tendência do

consumidor a reduzir a aceitação à medida que a concentração de extrato for sendo

aumentada. Para o atributo impressão global, observou-se a mesma tendência obtida no

aspecto sabor, em que as amostras que tiveram as maiores concentrações de extrato

adicionado, também detiveram as menores médias, indicando a possibilidade de rejeição

por parte dos consumidores.

A Figura 2 mostra o gráfico de frequência de intenção de compra por parte dos

consumidores. Observa-se que a maior porcentagem de distribuição dos dados giram em

torno das notas 2, 3 e 4. Avaliando as notas de rejeição em ―certamente compraria‖ e

144

―possivelmente não compraria‖, observa-se que as amostras de Minas Gerais tiveram as

maiores frequências, seguidas pelos néctares elaborados com os frutos oriundos de São

Paulo. Já para as notas que indicam a possibilidade e certeza de compra, os néctares com

maiores frequências foram o SP[3] e BA[3]. Segundo Reis & Minin (2006), as

metodologias tradicionais para analisar dados de testes afetivos têm mostrado algumas

limitações, uma vez que os dados são analisados conjuntamente por ANOVA ou diferença

entre médias, não levando em consideração a opinião individual de cada provador.

1 2 3 4 5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Fre

quên

cia

(%)

Notas

MG[0]

MG[1]

MG[2]

MG[3]

SP[0]

SP[1]

SP[2]

SP[3]

BA[0]

BA[1]

BA[2]

BA[3]

Figura 2. Histograma de frequência para Intenção de Compra do néctares de tamarindo.

Descrição de notas: 1 - certamente não compraria, 2 - possivelmente não compraria, 3 - talvez

comprasse/talvez não comprasse, 4 - possivelmente compraria, 5 - certamente compraria.

145

O gráfico de frequência de intenção de compra evidencia o grau de incerteza por

parte dos consumidores, pois a discrepância e o desvio entre as notas para todos os

tratamentos foram muito altas. Assim, comparando com as notas obtidas no teste de

aceitação, nota-se que os néctares que receberam as menores notas de aceitabilidade, foram

os que tiveram maiores frequências de possibilidade e certeza de intenção de compra.

3.3 Perfil do consumidor

Na avaliação do perfil de 60 consumidores questionados, foi constatado que a

maioria (65%) pertence à faixa etária de 25 a 35 anos e 29% tem idade entre 36 e 50 anos,

sendo que a maior parcela (52%) é constituída pelo sexo masculino. Dentre os

entrevistados, 76% já possuem graduação completa com pós-graduação em andamento e

15% estão cursando a graduação, os demais 9% distribuíram-se entre cursando ensino

médio, funcionário, professor e outros. Com relação à região de origem, a maioria (52%)

dos provadores pertence à região Sudeste, 30% estão divididos igualmente entre a região

Norte e Sul, 7% são oriundos do Nordeste e 3 e 7% são de origem do Centro-Oeste e

estrangeiros (Peru, Argentina e Chile), respectivamente. A maior parcela característica para

a região Sudeste está diretamente ligada ao fato de o local (UNICAMP - Campinas/SP)

onde foi realizado as análises estar localizada nesta região. Os resultados para o perfil de

consumidores podem ser encontrados na Figura 3. O grau de instrução dos provadores

também está ligado ao fato de as análises terem sido realizadas em um ambiente

acadêmico. Este ponto pode influenciar de alguma forma nas respostas para os

questionamentos relacionados ao critério de compra e funcionalidade do produto. Kotler &

146

Armstrong (2004) afirmam que a tomada de decisão de um consumidor está diretamente

relacionada e sofre grande influência da sua classe social e seu grupo familiar de referência.

Figura 3. Distribuição de frequência para o perfil dos consumidores. A – Faixa etária; B –

Sexo; C – Ocupação; D – Região de origem.

A Figura 4 apresenta os dados de frequência dos consumidores para o critério de

compra do suco e se estão dispostos a pagar mais por um suco que possua uma maior

propriedade funcional. Observa-se que dentre os critérios estudados, a maioria absoluta

(75%), escolhe o produto pelo sabor e a minoria com 20 e 5%, adotam o critério de compra

para os aspectos nutricionais e o preço, respectivamente. Quando questionados sobre a

disposição em pagar mais por um produto de melhor qualidade funcional cerca de 88% dos

29%

65%

3% 3%

< 2525-3536-50> 50

48% 52%

Masculino

Feminino

3%

15%

76%

2% 2% 2%

Ensino médio

Graduação

Pós-graduação

Professor

Funcionário

Outros

15%

8%

3%

52%

15%

7% N

NE

CO

SE

S

Outro

país

A B

C D

147

provadores responderam que ―sim‖, pagaria a mais por uma maior propriedade funcional e

12% responderam que não. Todos os que aceitaram comprar um produto mais caro, desde

que a qualidade funcional seja maior, justificaram que os resultados seriam compensados

no benefício à saúde. Por outro lado, os que negaram pagar mais caro, disseram que

preferiam optar por outro tipo de suco in natura que possua uma qualidade funcional maior,

caso este fosse o intuito. Segundo Cavada, Paiva, Helbig & Borges (2012) e Kleef, Trijp &

Luning (2005), os consumidores estão dando preferência para alimentos relacionados à

saúde. Pesquisas apontam que 44% dos consumidores brasileiros da classe A e B escolhem

seus alimentos com base na relação que eles têm com a saúde, sendo um dos maiores

índices da América Latina (Raud, 2008).

Sabor Aspectos nutricionais Preço0

10

20

30

40

50

60

70

80

%

Critério de Compra

A

Sim Não0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%

B

Figura 4. Frequência dos consumidores para critério de compra do suco (A) e se estão

dispostos a pagar mais por um suco com maior propriedade funcional (B).

A Figura 5A aborda a ordem da forma como os provadores costumam consumir os

5 tipos de suco sugeridos no questionário. Como primeira opção, a maioria (55%) relatou

que consome o suco na forma in natura, seguido do suco industrializado de caixa

148

consumido por 25% dos provadores como primeira opção. A polpa na forma congelada, o

suco artificial e o concentrado são consumidos por uma pequena faixa dos provadores

como primeira opção, com cerca de 8, 6 e 5%, respectivamente.

1 2 3 4 5

0

10

20

30

40

50

60

70

%

Ordem de Frequência do Consumo

innatura

Industrializado de caixa

Polpa congelada

Artificial

Concentrado

A

1 vez 2 vezes 3 vezes 4 vezes 5 vezes 6 vezes Diário

0

5

10

15

20

25

30

%

Consumo Semanal

B

Figura 5. Distribuição de frequência dos provadores para ordem do modo de consumo de

suco (A) e consumo semanal de suco (B). 1 – Primeira opção; 5 – Última opção.

Entre as ordens de frequências 2, 3 e 4, houve uma maior distribuição de frequência

do modo de consumo, para os tipos de suco industrializado de caixa e polpa congelada, não

havendo uma ordem preferencial. Porém, observa-se que a opção por consumir o suco

artificial é cada vez mais direcionada como última opção, ou seja, a maioria dos provadores

consome o suco artificial após o critério ter passado pelos outros tipos de suco. O fato é

evidenciado na opção 5 de consumo, com cerca de 65% dos provadores consumindo o suco

artificial em último caso. Observa-se também que a redução do consumo do suco in natura

está diretamente ligada à diminuição da prioridade de consumo. Isto indica que o suco in

natura está entre os primeiros critérios dos provadores entrevistados. Trabalhos científicos

sugerem um baixo consumo de alimentos naturais entre crianças e adolescentes, como

149

consequência, há um maior consumo de fast-foods, doces e bebidas artificiais com adição

de açúcar, como sucos e refrigerantes (Triches & Giugliane, 2005).

A Figura 5B mostra a frequência do consumo de suco pelos provadores durante a

semana. Nota-se que nenhum provador alegou consumir o produto uma única vez por

semana e à medida que o número de vezes é aumentado a frequência de consumidores

também é acrescida, o que indica que a maioria (28%) utiliza o suco diariamente. Uma

exceção é observada no número 6 de vezes de consumo, em que houve uma redução

drástica de 26% na frequência de 5 vezes para 8% em 6 vezes. De forma geral, o gráfico

mostra a importância de quanto o consumidor está ingerindo suco com mais frequência

uma vez que o consumo de suco é importante como alternativa de aproveitar as

propriedades nutricionais do fruto de forma prática quando esta opção tem por

consequência aumentar disponibilidade e vida de prateleira do produto (Cullen, Himes,

Baranowski, Pettit, Stevens, Slawson, Obarzanek, Murtaugh, Matheson, Sun & Tochon

(2004).

A relação de preferência do consumidor para o tipo de fruta que produz um suco

mais aceitável, saudável e funcional como opção está apresentada na Figura 6. Os escores

da Figura 6A mostram que o suco mais aceito pelos consumidores é o de laranja, com cerca

de 46% dos votos, seguido por maracujá e uva com 20% de aceitação cada. Em menor

escala como primeira opção também foram citados os sucos de abacaxi e tamarindo, além

de outros que englobam melancia, goiaba, cupuaçu e pêssego. Da segunda à quinta ordem

de preferência nota-se que houve um decréscimo substancial na frequência de aceitação dos

sucos de laranja e maracujá, em contrapartida um aumento para o suco de tamarindo. Esta

ordem de critério para o tamarindo pode ter influenciado diretamente nos resultados de

150

aceitação para as diferentes formulações de suco estudadas anteriormente, considerando

também que aproximadamente metade (48%) dos entrevistados nunca haviam provado o

suco do fruto. A variações com tendências para diminuir ou aumentar a frequência para

maracujá, uva e abacaxi não foram observadas entre as opções 3 e 5 de consumo. Os

entrevistados relataram uma série de outros frutos como, pêssego, maçã, melancia, jenipapo

e outros que seriam consumidos em último caso (ordem 6), motivo pelo qual esta

frequência atingiu 65%.

1 2 3 4 5 6

0

10

20

30

40

50

60

%

Ordem de Preferência

Laranja

Maracujá

Uva

Tamarindo

Abacaxi

Outros

A

1 2 3 4 5 6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90%

Ordem de Opinião

Laranja

Maracujá

Uva

Tamarindo

Abacaxi

Outros

B

Figura 6. Ordem de opinião para qual tipo de fruta que produz um suco mais aceitável (A) e

suco mais saudável e funcional (B). 1 – Primeira opção; 6 – Última opção.

A Figura 6B, traz a frequência para a opinião dos provadores sobre qual fruto

apresenta características mais saudáveis e funcionais. Pode ser observado que na opinião da

maioria dos provadores, os sucos de laranja e uva apresentam as melhores qualidades

funcionais com cerca de 35 e 41% dos provadores, respectivamente. Em menores

proporções seguem o suco de tamarindo (8%), abacaxi (6%) e maracujá (5%). Em última

opção outros frutos não sugeridos formaram o maior percentual de hipóteses dos

151

consumidores com um somatório de 83%. Nenhum dos consumidores citou os sucos de

laranja e abacaxi na sexta ordem, sendo que houve uma queda considerável para frequência

dos entrevistados da ordem 5 para ordem 6 de 35% para 6%. A frequência obtida a respeito

da funcionalidade do tamarindo ficou bem distribuída entre as ordens, provando que houve

uma grande variação na opinião dos julgadores sobre o fruto.

A Figura 7 mostra as notas médias atribuídas pelos consumidores de diferentes

regiões para o suco de tamarindo. Nota-se que a média das notas dadas pelos provadores da

região Nordeste ao suco de tamarindo foi significativamente (p<0,05) maior que as notas

ofertadas pelos julgadores do Sudeste e Sul do Brasil. As demais regiões (Norte, Centro-

Oeste e outros países) tiveram notas intermediárias, se igualando significativamente aos

provadores do Nordeste, Sul e Sudeste. Estes comportamentos indicam que a região de

origem dos provadores pode influenciar diretamente nos resultados obtidos para o teste de

aceitação, uma vez que o paladar é formado pelos costumes e cultura regionais (Edwards,

Kipps & Thomson, 1988). O teste de aceitação realizado anteriormente pode ter

apresentado grandes variações nos resultados devido à grande discrepância das notas

atribuídas para cada provador que por sua vez esteve distribuído em diferentes regiões de

origem. Para o atributo sabor, por exemplo, as notas variaram de 4,37±2,10 à 5,69±2,29

com altos valores nos desvios padrões. Observando as notas dos provadores para cada

estado individualmente, também se pode notar que os coeficientes de variações também são

altos, exceto para os julgadores de ―outros países‖ que não apresentaram variação. Este fato

também pode ter colaborado para os resultados obtidos nos testes de aceitação. Porém, de

forma geral, é possível supor que o néctar de tamarindo não teria boa aceitação se

152

comercializados nas regiões Sul e Sudeste, em contrapartida, poderiam ser bem aceito pelos

consumidores das regiões Norte, Nordeste e outros países.

Nor

te

Nor

deste

Cen

tro-o

este

Sudes

te Sul

Out

ro P

aís

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

abb

bab

a

ab

No

ta

A

Figura 7. Notas referentes ao quanto os consumidores de diferentes regiões gostam do suco

de tamarindo. Notas: 0 – 10;

4. Conclusão

Mudanças do local de colheita e os diferentes lotes do mesmo local apresentaram

diferenças nos resultados de acidez total titulável e teor de sólidos solúveis totais. O teste

sensorial de diferença do controle mostrou que a depender da concentração adicionada, o

consumidor passa a notar diferença entre as amostras para os diferentes atributos e a região

de origem do fruto em alguns casos influenciou nesta intensidade. Apesar da similaridade

encontrada entres os resultados de análise sensorial, notou-se que à medida que se adiciona

o extrato liofilizado ao néctar, a rejeição à amostra tende a ser aumentada.

153

De acordo com o perfil do consumidor que avaliou as amostras de néctar de

tamarindo, é possível que os critérios como o conhecimento do fruto e as diferentes regiões

de origem dos provadores tenham influenciado de forma significativa na aceitação do

produto. Desta forma, é levantada a hipótese de direcionamento futuro da produção para

uma região específica de maior aceitabilidade, como ficou evidenciado para o Nordeste.

Certamente os resultados seriam mais favoráveis se o teste fosse realizado com uma

população específica que tem o hábito de consumir o fruto, no entanto, investimentos no

marketing para revelar a importância e as propriedades do néctar de tamarindo também

podem influenciar o aumento do seu consumo nas regiões onde o fruto tem baixa aceitação.


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ANEXOS

158

159

160

CONCLUSÃO GERAL

Com base nos resultados, pode-se concluir que a adição do extrato aquoso

liofilizado da semente de tamarindo, obtido a partir da condição ótima de extração aquosa,

à polpa de tamarindo oriunda de diferentes regiões do Brasil, apresentou efeito significativo

no enriquecimento e aproveitamento do fruto. Com o acréscimo do extrato liofilizado à

polpa, houve um aumento significativo das propriedades antioxidantes do néctar, bem

como uma redução da ação hemolítica provocada nas células, podendo ser indicado como

uma boa opção de enriquecimento.

Da mesma forma, a semente de tamarindo mostrou um alto potencial em matéria

graxa com relação à composição de ácidos graxos insaturados e tocoferóis (considerados

antioxidantes naturais). Assim sendo, a exploração da semente em relação à fração lipídica

é uma alternativa de reaproveitamento de resíduos que pode ser estudada futuramente.

As características sensoriais do néctar elaborado com o extrato aquoso liofilizado da

semente e a polpa liofilizada mostrou possuir diferenças significativas com o néctar sem

adição de extrato, porém, sem prejudicar a sua aceitação. Desta forma, o enriquecimento da

polpa pode ser uma excelente alternativa para o reaproveitamento da semente do fruto. Nas

concentrações utilizadas, os extratos promoveram o aumento das propriedades bioativas,

bem como não provocaram rejeições por parte dos consumidores.

Assim sendo, o extrato aquoso em pó resultante do processo de liofilização do

extrato aquoso da semente de tamarindo poderá ser uma opção de uso para enriquecer

outros alimentos com a função de melhorar a bioatividade e manter as características

sensoriais aceitáveis, bem como melhorar o aproveitamento de resíduos das indústrias

processadores do tamarindo, aplicando o sub-produto para fins alimentícios.

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CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE …repositorio.unicamp.br/jspui/bitstream/REPOSIP/...de extrato, chegando a 98,8% de lise para a amostra SP [2] do lote 2 e 98,5% para