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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADE
ANTIFÚNGICA IN VITRO DO POLI (METIL
METACRILATO) MODIFICADO PELO
CINAMALDEÍDO
Taisa Mara dos Santos Sousa
2018
TAISA MARA DOS SANTOS SOUSA
CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO
DO POLI (METIL METACRILATO) MODIFICADO PELO
CINAMALDEÍDO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia, da Universidade
Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Odontologia –
Área de Concentração em Ciências Odontológicas.
Orientador: Prof. Dr. Eliton Souto de Medeiros
Coorientador: Prof. Dr. André Ulisses D. Batista
João Pessoa
2018
S725c Sousa, Taisa Mara Dos Santos. CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO DO POLI (METIL METACRILATO) MODIFICADO PELO CINAMALDEÍDO / Taisa Mara Dos Santos Sousa. - João Pessoa, 2018. 56f. : il.
Coorientação: André Ulisses D Batista. Dissertação (Mestrado) - UFPB/BC.
1. Candidíase oral. 2. poli(metil metacrilato). 3. Candida. 4. cinamaldeído. 5. aparelhos ortodônticos. I. Título
UFPB/BC
Catalogação na publicaçãoSeção de Catalogação e Classificação
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a Deus e aos meus pais por tornarem esse sonho em realidade.
AGRADECIMENTOS
A Deus e a nossa senhora, por estarem comigo, trilhando e iluminando minha vida,
proporcionando bênçãos e força para superar as dificuldades encontradas.
A minha amada família, em especial aos meus pais, por acreditarem em mim e
incentivarem a alcançar esse sonho.
A UFPB pela infraestrutura disponível para concretização dessa pesquisa.
Ao meu Orientador e Coorientador: Eliton S. Medeiros e André Ulisses D. Batista,
por acreditarem em mim, pelo aprendizado, conhecimento compartilhado, reuniões,
orientações e sugestões para elaboração e concretização desse projeto.
A banca pelas valiosas contribuições, correções e sugestões que agregaram e
aprimoraram esse estudo, e em especial ao professor Ricardo Castro por também ter
disponibilizado espaço em seu laboratório.
A todos os docentes que passaram em minha vida, e foram fundamentais para meu
crescimento profissional e acadêmico.
Aos meus colegas do mestrado pelo convívio e momentos maravilhosos
compartilhados tornando esta caminhada mais prazerosa, alguns ficaram marcados.
A Ana Claudia e Rebeca Dantas pela enorme ajuda nas análises microbiológicas,
pelos momentos de convivência e conselhos.
A Lívio por toda compreensão.
Aos colegas do grupo LAMAB, em especial Kaline, pela grande ajuda em entender
algumas análises.
Aos técnicos de laboratório: Lucas, Rebeca e Lília pela disponibilidade, orientação e
apoio na realização de algumas análises.
A empresa VIPI, pelo fornecimento de alguns materiais para a realização dessa
pesquisa.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoas de Nível Superior (CAPES) pela bolsa
concedida.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para concretização deste trabalho.
A minha eterna gratidão!
RESUMO
Considerando a necessidade da prevenção de candidose em usuários de aparelhos
ortodônticos com base acrílica, foi analisado in vitro a atividade antifúngica e
caracterização do poli (metil metacrilato), (PMMA), modificado por cinamaldeído
(CIN). Inicialmente foram determinadas Concentrações Inibitória (CIM) e Fungicida
(CFM) Mínimas do cinamaldeído sobre cepas de Candida albicans ATCC 60193, C.
krusei ATCC 34135, C. glabrata ATCC 2001 e C. tropicalis CBS 94, e seu efeito sobre
biofilme fúngico multiespécie. Após incorporação do fitoconstituinte no PMMA, o
efeito antifúngico foi avaliado por difusão em ágar e inibição de aderência fúngica. Para
o sistema PMMA/CIN foram analisados a rugosidade superficial; microdureza;
comportamento térmico por termogravimetria (TG) e calorimetria exploratória
diferencial (DSC); incorporação do CIN por espectroscopia no infravermelho com
transformada de Fourier (FTIR) e sua liberação controlada, por espectroscopia no
ultravioleta visível (UV/VIS). Os dados foram analisados a partir de estatística
descritiva e inferencial (p=0,05). A CIM e CFM do fitoconstituinte tiveram o mesmo
valor de 125 µg /mL, promovendo inibição do biofilme multiespécie de Candida
(p<0,05). O PMMA modificado pela adição de 24% CIN foi antifúngico apresentando
halos de inibição com 28 mm, e redução na aderência do biofilme na superfície do
PMMA modificado. O PMMA não modificado (controle) ou contendo 12 e 24% CIN
apresentou rugosidade superficial média respectivamente de Sa de 0,23; 0,27 e 0,35m
para 24% CIN (p<0,05), e Sz de 1,72; 2,24; 2,28 m para todos grupos (p<0,05). A
microdureza Vickers apresentou média inicial de 13,87; 13,52; 10,82 e média, após 90
dias, de 15,89; 14,88 e 13,46, respectivamente, para os PMMA sem e com 12 e 24%
CIN. A presença do CIN no PMMA foi confirmada por DSC, TG, FTIR e UV/VIS. O
PMMA contendo 24%CIN apresentou forte potencial antifúngico, sendo considerado
como um método terapêutico promissor na prevenção da candidose.
Palavras-chave: Candidíase oral, poli (metil metacrilato), Candida, cinamaldeído,
aparelhos ortodônticos.
ABSTRACT
In order to be useful in users of acrylic-based orthodontic appliances, the antifungal
activity and characterization of cinnamaldehyde (CIN) modified poly
(methylmethacrylate), (PMMA), was analyzed in vitro. Initially, minimal inhibitory
concentrations (CIM) and Fungicide (CFM) of cinnamaldehyde on strains of Candida
albicans ATCC 60193, C. krusei ATCC 34135, C. glabrata ATCC 2001 and C.
tropicalis CBS 94, and their effect on the multispecies fungal biofilm. After
incorporation of the phytoconstituent into PMMA, the antifungal effect was evaluated
by diffusion into agar and inhibition of fungal adherence. For the PMMA / CIN system
were a surface roughness; microhardness; «Calorific by thermogravimetry (TG) and
differential scanning calorimetry (DSC); incorporation of the CIN by Fourier transform
infrared spectroscopy (FTIR) and its controlled release by visible ultraviolet (UV / VIS)
spectroscopy. Data were analyzed from descriptive and inferential statistics (p = 0.05).
A CIM and CFM made an adjustment with the same value of 125 μg / mL, promoting
the inhibition of Candida multispecies biofilm (p <0.05). PMMA modified by the
addition of 24% CIN was antifungal to 28 mm inhibition halos, and is applied to the
surface of the biofilm on the surface of the modified PMMA. PMMA unmodified
(control) or containing 12 and 24% minimum CIN less than 0.23; 0.27 and 0.35 μm for
24% CIN (p <0.05), and Sz of 1.72; 2.24; 2.28 for all groups (p <0.05). A Vickers
microhardness with the initial average of 13.87; 13.52; 10.82 and mean, after 90 days,
of 15.89; 14.88 and 13.46, respectively, for PMMA without and with 12 and 24% CIN.
The presence of CIN in PMMA was confirmed by DSC, TG, FTIR and UV / VIS.
PMMA containing 24% CIN had a strong antifungal potential and was considered a
promising therapeutic method in the prevention of candidiasis.
Key words: Oral candidiasis, poly (methyl methacrylate), Candida, cinnamaldehyde,
orthodontic appliances.
LISTA DE TABELAS:
Table 1. Valores da CIM (µL/ mL) e CFM (µL/ mL) do cinamaldeído sobre
Candida spp.........................................................................................
13
Table 2. Rugosidade medidas em µm (Sa e Sz) do PMMA sem e com
modificação (PMMA- 12%CIN e PMMA- 24%CIN)
.........................
18
Table 3 . Valores da média da microdureza obtida em Número de Dureza
Vickers (VHN) para os três grupos analisados: grupo controle
(PMMA), PMMA-12%CIN, PMMA- 24%CIN
.................................
20
LISTA DE FIGURAS:
Fig. 1. Atividade anti-biofilme, do cinamaldeído e nistatina em diferentes
concentrações, na aderência do biofilme de Candida spp . (Anova-
Tukey)
15
Fig. 2. Atividade antifúngico dos corpos de provas PMMA-24%CIN) com
mensuração de 28mm de
diâmetro.................................................................
16
Fig. 3 Atividade anti-aderente de biofilme Candida spp. em PMMA modificado
(PMMA-12%CIN e PMMA-24%CIN) ou PMMA puro (Anova e teste de
Tukey post). ..................................................................................................
17
Fig. 4. Topografia mostrando aspecto da superfície do PMMA sem modificação
(A) e a do PMMA modificado pela adição de do cinamaldeído em 12%
(B) e 24% (C) em peso do
cinamaldeído..............................................................
19
Fig. 5. Curvas da TG e DTG para o PMMA sem modificação) e modificado pela
adição do cinamaldeído (PMMA-12%CIN e PMMA-24%CIN)
..................
22
Fig. 6. Curvas do DSC do PMMA sem modificação (a), e modificados (PMMA-
12%CIN e PMMA-24%CIN). ......................................................................
23
Fig. 7. Espectros FTIR do cinamaldeído (a), PMMA puro(b), e modificados
PMMA-12% CIN (c) e PMMA- 24%CIN
(d)................................................
24
Fig. 8. Cinética de liberação in vitro do cinamaldeído no PMMA (PMMA-
12%CIN e PMMA 24%CIN) por 90 dias (2160 h)
........................................
25
LISTA DE SIGLAS, ABREVISATURAS S E SIMBOLOS:
%
H2O
Percentual ou porcentagem
Água
(C = O) Carbonila
(C=C) Alceno
(-CH) Hidrocarboneto
(C-H2) Metileno
(C-O-C) Ester
~ Aproximadamente
> Maior que
≥ Maior ou igual
°C Grau expresso na Escala Celsius
µg Micrograma
µg /mL Micrograma por mililitro
µL Microlitro
µm Micrometro
ANOVA Análise de Variância
ASD Ágar Sabouraud Dextrose
ATCC American Type Culture Collection
C. Candida
CBS Central Bureau voor Schimmelcultures
CFM Concentração Fungicida Mínima
CIM
CIN
Concentração Inibitória Mínima
Cinamaldeído
cm² Centímetro quadrado
CSD Caldo Sabouraud Dextrose
Cut off Ponto de corte (eliminação do comprimento de varredura)
DSC Calorimetria Exploratória Diferencial
et al. e colaboradores, e outros
FTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de
Fourier
g Grama (unidade de medida)
gf Grama força
h Hora
in vitro Experimento desenvolvido em laboratório
min Minuto
mL Mililitro
Mm Milímetro
n Número de amostras por grupo
nm Nanômetro
PBS Phosphate Buffered Saline
PMMA Poli (metil metacrilato)
PMMA - 12% CIN Poli (metil metacrilato) modificado pela adição de 12% do
cinamaldeído em peso do PMMA.
PMMA -24%CIN Poli (metil metacrilato) modificado pela adição de 24% do
cinamaldeído em peso do PMMA.
PMMA puro Poli (metil metacrilato) sem modificação pela adição do
cinamaldeído
r Coeficiente de correlação
Ra Valor médio aritmético da rugosidade: A média aritmética dos
valores absolutos dos desvios do perfil (Zi) da linha média do
perfil de rugosidade
RPM Rotação por minuto
Sa Altura média aritmética da superfície. Este é um parâmetro
3D expandido a partir do parâmetro de rugosidade (2D) Ra.
Ele expressa a média dos valores absolutos de Z (x, y) na área
medida.
spp. Espécie
SPSS Statistical Package for Social Sciences
Sz Soma do maior valor de altura do pico e o maior valor da
profundidade do vale dentro da área definida.
TCT 2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio
TG Termogravimetria
Tmáx Temperaturas máximas da degradações de massa
Tonset Temperaturas de início de perda de massa
UFC Unidade Formadora de Colônias
UFC/ m L Unidade Formadora de Colônias por mililitro
UV Ultravioleta
UV VIS Espectroscopia de ultravioleta visível
VHN Número de Dureza Vickers
X Vezes
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................. 1
2. CAPITULO 1. Caracterização e atividade antifúngica in vitro do
poli (metil metacrilato) modificado pelo cinamaldeído.......................
3
1. Introdução.......................................................................................... 5
2. Experimental...................................................................................... 6
2.1. Materiais.............................................................................................. 6
2.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima
(CIM)..................
7
2.3. Determinação da Concentração Fungicida Mínima
(CFM)................
7
2.4. Atividade anti-biofilme da substância na aderência do biofilme
multiesécie de Candida spp................................................................
8
2.5. Preparação dos corpos de provas ...................................................... 8
2.6. Atividade antifúngica do PMMA modificado pela adição do
cinamaldeído…. ..................................................................................
9
2.7. Atividade anti-aderente de biofilme multiesécie de Candida spp. em
PMMA modificado por cinamaldeído.................................................
10
2.8. Análise da rugosidade superficial....................................................... 10
2.9. Análise de microdureza
Vickers...........................................................
11
2.10. Caracterização por Termogravimetria (TG)...................................... 11
2.11. Caracterização por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
....
11
2.12. Caracterização da Espectroscopia no Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR)... ....................................................
12
2.13. Liberação controlada in vitro (UV-VIS) ............................................. 12
3. Análise estatística .............................................................................. 13
4. Resultados e Discussão...................................................................... 13
4.1. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e
Concentração Fungicida Mínima (CFM) ...........................................
14
4.2. Atividade anti-biofilme da substância na aderência do biofilme
multiesécie de Candida
........................................................................
14
4.3. Atividade antifúngica do PMMA modificado pela adição do
cinamaldeído........................................................................................
15
4.4. Atividade anti-aderente de biofilme multiesécie de Candida spp. em
PMMA modificado por cinamaldeído.................................................
17
4.5. Análise da rugosidade
superficial........................................................
18
4.6. Análise de Dureza de Vickers.............................................................. 20
4.7. Caracterização por Termogravimetria (TG)....................................... 21
4.8. Caracterização por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
....
23
4.9. Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR) .................................................................................................
24
4.10 Liberação controlada in vitro (UV-VIS) .......................................... 25
5. Conclusão............................................................................................ 26
Referências......................................................................................... 27
3. CONSIDERAÇÕES GERAIS.......................................................... 33
4. REFERÊNCIAS*.............................................................................. 34
1
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, há um aumento por cuidados ortodônticos que incluem
alternativas de tratamentos com aparelhos de base acrílica removíveis ou fixos, e o
poli(metil metacrilato), PMMA, utilizado para confeccionar bases de próteses e de
aparelhos ortodônticos continua sendo a melhor opção devido às suas qualidades
estéticas, fácil confecção, habilidades de polimento e baixo custo (LIU et al. 2016). De
modo geral, esses tratamentos ortodônticos são indicados para uma correção oclusal ou
para a retenção dentária, durante um período de tempo, após o tratamento ortodôntico
(LAMAS e REGINA, 2012).
Os micro-organismos do gênero Candida são comensais da cavidade bucal.
Porém, em indivíduos que apresentam fatores predisponentes ou situações específicas
como usuários de próteses totais, parciais, e de aparelhos ortodônticos com placa
acrílica, essas leveduras podem transformar-se na forma parasitária acarretando em
candidoses bucais (GASPARETTO et al., 2005).
A presença de resíduos alimentares alojados no PMMA, acúmulo de
estruturas leveduriformes, células vegetais e fungos em aparelhos ortopédicos fixos
(Haas), mesmo com higiene oral rigorosa, tem sido relatada na literatura, além de uma
área eritematosa no palato duro (MARTINS-ORTIZ, REIS-COSTA e CONSOLARO,
2003).
A resina acrílica dos aparelhos fixos ou removíveis apresenta propriedades
hidrofóbicas favoráveis para o acúmulo do biofilme na região do palato duro e nas
superfícies, contribuído para a elevação da proliferação de C. albicans na cavidade
bucal (WADY et al., 2012). Enfatizando assim, a importância da necessidade de
instruções de higiene oral em pacientes que fazem uso de aparelhos ortodônticos ou
prótese removíveis (LAZARIN, 2012; MEZZARI ,2012).
Recomenda-se que resíduos alimentares alojados entre palato e acrílico em
aparelho fixo de base acrílica sejam removidos com solução contendo água oxigenada,
injetada com seringa hipodérmica sob pressão, na região das rugosidades palatinas, e
sob as áreas soldadas. Todavia o lado negativo seria o risco da deglutição dessa solução,
além da necessidade de cooperação do paciente (TANAKA, ORELLANA, e RIBEIRO,
2004).
Entretanto, considerando-se que os micro-organismos estão presentes tanto
no biofilme superficial como também no interior do PMMA, acredita-se que o impacto
2
da adoção de protocolos para desinfecção de aparelhos ortodônticos removíveis e fixos
ainda não são claro, necessitando de outros estudos com materiais e métodos de
desinfecção (CAMPOS et al., 2007). Assim, a incorporação de um agente
antimicrobiano na resina acrílica para conseguir a redução do biofilme da placa acrílica
é almejado (LIU et al., 2016).
Estudo clínico avaliou a eficácia antimicrobiana da resina acrílica
ortodôntica (PMMA), contendo 5% em peso de metacriloxilato de amónio quaternário
(QAMS), e concluiu que a incorporação de QAMS nas bases acrílicas utilizadas para
contenções ortodônticas, in vivo, permite a morte de micro-organismos em biofilmes
desses PMMA, sem induzir danos à mucosa oral após um período de 48 horas de uso
intra oral (LIU et al., 2016).
Moléculas de origem natural tem um alto potencial antimicrobiano podendo
ser aplicadas no controle da contaminação e na adesão de biofilmes em ambiente
biomédico. Assim, a incorporação do cinamaldeído em materiais poliméricos contra a
formação de biofilmes vem apresentando boas perspectivas de aplicação, estimulando
pesquisadores a trabalhar com diferentes formulações antimicrobianas e poliméricas
(NOSTRO et al., 2012).
O cinamaldeído e seus derivados têm demonstrado atividades biológicas de
interesse médico, bem como efeitos promissores no controle de espécies fúngicas
associadas a infecções da cavidade bucal, além de exibirem baixa toxicidade (SHREAZ
et al., 2016). Estudos in vitro, comprovam que o cinamaldeído na CIM (320 mg/mL)
quando comparado com o fluconazol na mesma concentração, tem toxicidade quase
desprezível contra mioblastos cardíacos de ratos (SHREAZ et al., 2011).
Estudos sobre a atividade antimicrobiana do timol, carvacrol, cinamaldeído
e eugenol quando adicionados em filmes poliméricos, isolados ou combinados,
mostraram inibição em sete micro-organismos, mas o cinamaldeído mostrou ter um
melhor efeito quando utilizado de maneira isolada (DIDRY, DUBREUIL e
PINKAS,1994).
A atividade antifúngica do cinamaldeído (CIN), isolado ou incorporado em
resinas acrílicas sustenta a hipótese de que o PMMA modificado pela inserção desse
fitoconstituinte apresenta efeito inibitório na adesão de micro-organismos e manutenção
de propriedades físicas e mecânicas compatíveis com a sua utilização clínica.
Diante disso, o objetivo deste estudo foi analisar a incorporação do CIN no
PMMA, para obtenção de um material com propriedades antifúngicas, sem prejudicar
3
sua características mecânicas, e que seja prospectivos ao uso em expansores
ortodônticos de base acrílica para prevenção de candidose.
2.CAPÍTULO 1
O manuscrito a seguir será submetido para publicação no periódico
―Material Science and Engineering C‖.
Caracterização e atividade antifúngica in vitro do poli(metil
metacrilato) modificado pelo cinamaldeído
Taisa M.S.Sousa a,b*
, André U.D. Batista a , Ricardo D. Castro
a, Eliton
S. Medeiros b
a Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal da Paraíba
(UFPB), Cidade Universitária, 58.051-900 João Pessoa, PB, Brazil
b Departamento de Engenharia de Materiais (DEMAT), Universidade
Federal da Paraíba (UFPB), Cidade Universitária, 58.051-900 João Pessoa, PB, Brazil
4
RESUMO
Considerando a necessidade da prevenção de candidose em usuários de aparelhos
ortodônticos com base acrílica, foi analisado in vitro a atividade antifúngica e
caracterização do poli(metil metacrilato), (PMMA), modificado por cinamaldeído
(CIN). Inicialmente foram determinadas Concentrações Inibitória (CIM) e Fungicida
(CFM) Mínimas do cinamaldeído sobre cepas de Candida albicans ATCC 60193, C.
krusei ATCC 34135, C. glabrata ATCC 2001 e C. tropicalis CBS 94, e seu efeito sobre
biofilme fúngico multiespécie. Após incorporação do fitoconstituinte no PMMA, o
efeito antifúngico foi avaliado por difusão em ágar e inibição de aderência fúngica. Para
o sistema PMMA/CIN foram analisados a rugosidade superficial; microdureza;
comportamento térmico por termogravimetria (TG) e calorimetria exploratória
diferencial (DSC); incorporação do CIN por espectroscopia no infravermelho com
transformada de Fourier (FTIR) e sua liberação controlada, por espectroscopia no
ultravioleta visível (UV/VIS). Os dados foram analisados a partir de estatística
descritiva e inferencial (p=0,05). A CIM e CFM do fitoconstituinte tiveram o mesmo
valor de 125 µg /mL, promovendo inibição do biofilme multiespécie de Candida
(p<0,05). O PMMA modificado pela adição de 24% CIN foi antifúngico apresentando
halos de inibição com 28 mm, e redução na aderência do biofilme na superfície do
PMMA modificado. O PMMA não modificado (controle) ou contendo 12 e 24% CIN
apresentou rugosidade superficial média respectivamente de Sa de 0,23; 0,27 e 0,35m
para 24% CIN (p<0,05), e Sz de 1,72; 2,24; 2,28 m para todos grupos (p<0,05). A
microdureza Vickers apresentou média inicial de 13,87; 13,52; 10,82 e média, após 90
dias, de 15,89; 14,88 e 13,46, respectivamente, para os PMMA sem e com 12 e 24%
CIN. A presença do CIN no PMMA foi confirmada por DSC, TG, FTIR e UV/VIS. O
PMMA contendo 24%CIN apresentou forte potencial antifúngico, sendo considerado
como um método terapêutico promissor na prevenção da candidose.
Palavras-chave: Candidíase oral, poli(metil metacrilato), Candida, cinamaldeído,
aparelhos ortodônticos.
5
1. Introdução
Atualmente, há um aumento por cuidados ortodônticos que incluem, em
alguns casos, aparelhos de base de resina acrílica [1]. E a utilização desse polímero para
confeccionar bases de próteses e de aparelhos ortodônticos ainda é a melhor opção
devido às suas qualidades estéticas, fácil confecção, habilidades de polimento e baixo
custo [1].
Nas últimas décadas, a busca pela ortodontia está incluindo grupos de riscos
como idosos, pacientes com baixa qualidade de higiene oral ou fumantes, podendo esses
tratamentos ortodônticos serem muito prolongado, desde meses até anos [2].
Os aparelhos ortodônticos com base de resina acrílica, semelhantes às de
próteses dentarias, podem proporcionar áreas de retenção e elevação no acúmulo de
detritos alimentares tornando-se mais propensos a proliferação de Candida [2–4]. E
esses fungos são identificados em aproximadamente 10% de todos os biofilmes das
placas acrílicas [2]. Assim, pacientes que usam esses aparelhos acrílicos são mais fáceis
de desenvolverem um desequilíbrio da microbiota oral comprometendo sua saúde oral
[5,6].
A higienização oral em aparelhos ortodônticos removíveis é mais fácil que
em fixos. Estudos apresentaram o uso de comprimidos com ação de autolimpeza para
aparelhos ortodônticos removíveis como o método preferível na ausência de limpeza
mecânica [7]. Porém, as áreas cobertas por um aparelho são mais propícias a um maior
acúmulo de biofilme necessitando de instruções para higienização dessas áreas [6,8]
Já se analisou, in vivo, a eficácia da desinfecção de placas acrílicas, em
aparelhos ortodônticos removíveis por meio de higienização com escovação associada à
pulverização com Periogard® uma ou duas vezes por semana, ou associado à
pulverização de água potável (controle), concluindo que a desinfecção por meio da
escovação associado ao uso de spray de clorexidina a 0,12% uma vez ou duas vezes por
semana reduziu a contaminação do biofilme na superfícies acrílicas de aparelhos
removíveis [5].
Todavia, considerando-se que os micro-organismos estão presentes tanto no
biofilme superficial como também no interior do PMMA, acredita-se que o impacto da
adoção de protocolos para desinfecção de aparelhos ortodônticos removíveis e fixos
ainda não são claro, necessitando de outros estudos com materiais e métodos de
6
desinfecção [4]. Desta forma, a incorporação de um antimicrobiano na resina acrílica
ortodôntica para conseguir a redução do biofilme da placa acrílica é almejado [1].
Estudo clínico avaliou a eficácia antimicrobiana da resina acrílica
ortodôntica (PMMA), contendo 5% em peso de metacriloxilato de amónio quaternário
(QAMS), e concluiu que a incorporação de QAMS nas bases acrílicas utilizadas para
contenções ortodônticas, in vivo, permite a morte de micro-organismos em biofilmes
desses PMMA, sem induzir danos à mucosa oral após um período de 48 horas de uso
intra oral [1].
Há um reconhecimento de que moléculas de origem natural tem alto
potencial antimicrobiano e pode ser aplicado no controle da contaminação e na adesão
de biofilmes em ambiente biomédico. Assim, a incorporação do cinamaldeído (CIN)
polímeros contra a formação de biofilmes vem apresentando boas perspectivas de
aplicação, estimulando pesquisadores a trabalhar com diferentes formulações
antimicrobianas e poliméricas [9].
A atividade antifúngica do cinamaldeído (CIN), isolado ou incorporado em
resinas acrílicas, sustenta a hipótese de que o PMMA, modificado pela inserção desse
fitoconstituinte, apresenta efeito inibitório na adesão de micro-organismos e
manutenção de propriedades físicas e mecânicas compatíveis com a utilização clínica
dos mesmos.
Diante disso, o objetivo deste estudo foi analisar a incorporação do CIN no
poli(metil metacrilato) (PMMA), para obtenção de um material com propriedades
antifúngicas, sem prejudicar sua características mecânicas, e que seja prospectivos ao
uso em expansores ortodônticos de base acrílica para prevenção de candidose.
2. Experimental
2.1 Materiais
O poli(metil metacrilato), PMMA, resina acrílica autopolimerizável (pó e
monômero), foi a incolor da Orto Cor Mix (VIPI- Indústria Comércio Exportação
Importação de produtos odontológicos Ltda., Pirassununga - SP, Brasil.) indicada para
confecção de aparelhos ortodônticos.
As cepas de Candida spp. utilizadas nos ensaios microbiológicos desse
estudo foram C. tropicalis CBS 94 e da coleção ATCC (American Type Culture
7
Collection) – C. albicans ATCC 60193, C. Krusei ATCC 34135 e C. glabrata ATCC
2001. E o meio de cultura utilizado foi Ágar Sabouraud Dextrose (ASD) (KASVI®,
Kasv Imp E Dist De Prod P/ Laboratorios LTDA, Curitiba, Brasil), o Caldo Sabouraud
Dextrose (CSD) (KASVI®, Kasv Imp e Dist De Prod P/ Laboratórios LTDA, Curitiba,
Brasil) e o chromagar (DIFCO / USA).
O cinamaldeído (SIGMA ADRICH Co. Alemanha) e o antifúngico nistatina
(SIGMA- ALDRICH, São Paulo-SP, Brasil) foram utilizados, respectivamente, como o
fitoconstituinte de interesse e como controle positivo.
2.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi obtida pela técnica de
microdiluição em Caldo Sabouraud Dextrose (CSD). Utilizou-se placas de 96 poços em
fundo U [10], onde 100 µL do inóculo microbiano agregado ao CSD foi ajustado para
obtenção de concentração celular de 2,5 x 103 UFC/mL e adicionado aos poços [10].
Em seguida, adicionou 100 µL do cinamaldeído, o qual foi avaliado em concentrações
que variaram de 1.000 a 15,62µg/mL frente a cepas fúngicas do gênero Candida.
As placas foram incubadas em estufa por 24 h a 35 °C. Em seguida,
realizou-se leitura visual dos resultados a partir da observação da formação de
aglomerados de células fúngicas no fundo dos poços. Para confirmação da presença de
micro-organismos viáveis, foram colocados 50 µL do corante TCT (2,3,5-trifenil cloreto
de tetrazólio) em cada poço da placa e a mesma foi incubada novamente em estufa por
24h a 35°C [10]. E na segunda leitura, considerou os poços contendo micro-organismos
vivos que estavam corados em vermelho [11].
O teste foi realizado em triplicata, em momentos distintos, sendo a CIM
calculada pela moda dos resultados obtidos. O controle positivo utilizado foi a
nistatinaem uma concentração inicial de 25 µg/mL. Também foram realizados controles
de viabilidade das cepas e de esterilidade do meio de cultura.
Foi considerada como a CIM a menor concentração do produto capaz de
inibir visivelmente o crescimento dos micro-organismos.
8
2.3 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
Após determinação da CIM do cinamaldeído, foram subcultivados 50 µL do
conteúdo dos poços referentes a CIM e as duas concentrações imediatamente mais
concentradas (CIMx2 e CIMx4) em placas de Petri contendo Ágar Sabouraud Dextrose
(ASD). Em seguida, as placas foram incubadas em estufa a 35°C por 24h. E após esse
período, foi observado o crescimento fúngico no meio de cultura por meio de leitura
visual.
A CFM foi considerada como a menor concentração capaz de inibir o
crescimento visível do subcultivo [10]. E a relação CFM/CIM foi calculada de forma a
determinar se a substância possui uma atividade fungistática (CFM/CIM ≥ 4) ou
fungicida (CFM/CIM <4) [12].
2.4. Atividade anti-biofilme da substância na aderência do biofilme multiespécie de
Candida spp.
Em uma placa de microdiluição de 96 poços com fundo chato, inseriu-se
100 µL de CSD e 100 µL do inóculo, com 333 µL C. tropicalis CBS 94, 333 µL C.
albicans ATCC 60193, 333 µL C. glabrata ATCC 200, preparado em CSD contendo
2,5 x 105
UFC/mL. Logo após, 100 µL da substância (diluição seriada) em diferentes
concentrações foram adicionados aos poços correspondentes com pipetas milimetradas.
A placa foi incubada por 48h a 35 °C, permitindo que as leveduras ficassem
aderidas ao fundo dos poços. E após esse período, os poços foram lavados duas vezes
com 200 µL de PBS e secos ao ar por 45 min. Em cada poço foram acrescentados 250
µL de solução aquosa de cristal violeta a 0,4%, que permaneceu em contato com o
biofilme por 45 min para a incorporação do corante [13].
Em seguida, os poços foram lavados três vezes com 200 µL de água
destilada esterilizada e imediatamente foram descorados com 200 µL de etanol a 95%.
E após 45 minutos desse último procedimento, 100 µL da solução descorada foram
transferidos para um poço de uma nova placa e a quantidade do cristal violeta
mensurada a 600 nm em um leitor de absorbância (GloMax-Multi) [13].
Os valores de absorbância obtidos nos poços das concentrações testadas e
do controle de crescimento foram utilizados para calcular a porcentagem de inibição (%
inibição) da formação do biofilme decorrente da ação da substância.
9
2.5. Preparação dos corpos de provas
A porcentagem do cinamaldeído incorporado resultou de um cálculo
considerando CIM do cinamaldeído, tempo médio de três meses, que é o tempo em que
um aparelho de Haas fica fixado na boca [14]. A produção das glândulas salivares
menores que é 10% do volume de saliva produzida pela mucosa oral diariamente 1000 a
1500 mL/ dia [15]. A área chapável do palato (20 cm²) convertendo para área do corpo
de prova (1,13cm²). Após cálculo, utilizou-se 48% do peso do cinamaldeído
incorporado PMMA modificado (2470 µL) para liberação 1x CIM diariamente em 100
dias. Porém, estudo piloto comprovou que o PMMA não curava com esse percentual,
optando-se por ½ e ¼ desse percentual.
Os corpos de provas foram produzidos em moldes de silicone de
condensação a partir de padrões cilíndricos de cera 7 (12 x 4mm) acoplados em mufla.
A proporção do PMMA, modificados ou não, foi a indicada pelo fabricante (14 g de pó
/ 7mL do monômero). E adicionou 12% e 24% em peso do cinamaldeído antes da
inserção do monômero no PMMA para confecção dos corpos de provas do polímero
modificados. Em seguida, inseriu a mistura, ainda em fase fluida, nos moldes acoplados
no interior das mufla permanecendo por 24 h em temperatura ambiente, período
padronizado para polimerização total do PMMA.
Após 24 h, realizou –se o acabamento e polimento dos corpos de provas
com lixas d`água, de granulações respectivamente de 200, 400, 600, 1200 e 2000 por 30
segundos para cada granulação em politriz com rotação de 100 RPM. E logo após,
foram submetidos a banho ultrassônico por 60 segundos para remoção dos detritos
resultantes dessas etapas para não interferir na análise de rugosidade, e em seguida,
secos e armazenados em tubos estéreis para cada grupo e mantidos refrigerados até
serem direcionados para esterilização em óxido de etileno [16].
2.6. Atividade antifúngica do PMMA modificado pela adição do cinamaldeído
O inóculo foi preparado utilizando uma suspensão de cepa de Candida
albicans ATCC 60193 com 24 horas em CSD, e sua turbidez ajustada em
espectrofotômetro a 530 nm para se obter um concentração correspondente a 2,5 × 105
UFC/mL, em seguida este inóculo ajustado foi colocado em ASD [17].
10
O ágar inoculado foi vertido em placa de ensaio e deixado arrefecer sobre
uma superfície nivelada. Posteriormente, os corpos de provas estéreis das condições
estudadas (n=3) de 12 mm de diâmetro, modificados ou não pela agregação do
cinamaldeído, foram inseridos nestas placas em triplicata para cada condição, e
incubadas a 35° C durante 24 horas [17]. Após esse período, as placas foram
inspecionadas, e a susceptibilidade antifúngica para cada grupo (n= 3) foi determinada a
partir de três medições do halo de inibição do crescimento fúngico circundando esses
corpos de provas com uma escala milimetrada [18].
Essa análise foi realizada também para os corpos de provas (n= 3) do grupo
PMMA- 24% CIN, após três meses armazenados em placas de 24 poços contendo água
destilada, para observar se esse grupo permaneceu com potencial antifúngico após esse
período.
2.7 Atividade antiaderente de biofilme multiespécie de Candida spp. em PMMA
modificado por cinamaldeído
Para esse ensaio foram reativadas cepas multiespécie de Candida utilizadas.
E inseriu-se 1 mL de CSD e 1 mL do inóculo (2,5 × 105
UFC/mL) contendo 333 µL de
C. albicans, 333 µL de C. glabrata e 333 µL de C. tropicalis em uma placa de 24
poços. Em seguida, os corpos de prova (n= 4) com a parte polida voltada para cima
no fundo dos poços e então, as placas foram armazenadas em estufa (35°C) por 24h,
para formação do biofilme multiespécie inicial.
Após 24 h, os corpos de prova foram retirados e lavados 2 vezes com 2 mL
de água destilada para remoção das células não aderidas. E imediatamente cada corpo
de prova foi colocado em um tubo de ensaio estéril contendo 2mL de solução salina, e
posteriormente submetidos a agitação em aparelho vórtex (FANEM) por 60 segundos.
Realizada essa etapa, procedeu-se diluições seriada em solução salina,
obtendo diluições entre 10-1
a 10-7
para posterior semeadura de 25 µL de cada diluição
em meio de cultura chromagar. E após 24 h, procedeu-se a contagem, visualmente sem
definição por cor, de Unidades Formadora de Colônias e expressas em UFC/mL.
2.8 Análise da rugosidade superficial
11
As amostras (n=20) foram submetidas a análise de superfície para
topografia e mensuração da rugosidade (Sa e Sz) em perfilômetro óptico sem contato
(CCI MP, Taylor Hobson, Inglaterra), conectado a um computador com software
Talysurf CCI (Taylor Hobson, Inglaterra) para obtenção dos dados. Empregou-se um
―cut off “de 0,25 mm com uma lente 20 X, abertura numérica de 0.4 e velocidade de
escaneamento de x no modo xy (resolução 1024 por 1024).
Os parâmetros utilizados foram o Sa [representado pela média aritmética
dos valores absolutos dos desvios de superfície dentro da área de amostragem (picos e
vales)] e o Sz resultante da soma do maior valor de altura do pico e o maior valor da
profundidade do vale dentro da área definida [19].
Realizou-se cinco mensurações para cada corpo de prova (uma na área
central e as demais de acordo com a movimentação da lente 2 mm para cima, para
baixo, para direita e para esquerda) e reportado a média de rugosidade de cada corpo.
Totalizou-se uma média de rugosidade para cada condição estudada do PMMA e
posteriormente comparou- se a média de rugosidade entre esses 3 grupos.
2.9. Análise da microdureza de Vickers
A análise da microdureza de Vickers foi realizado em aparelho de
indentação de microdureza, Microdurômetro Shimadzu (HMV Micro Hardness Test,
Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). E os corpos de prova (n=20) foram submetidos a
três leituras de microdureza (indentações) com carga de 100gf por 30 segundos [20].
A leitura de microdureza consistiu em forçar um indentador piramidal de
diamante na superfície do material a ser testada, e após a remoção do indentador, as
diagonais foram medidas por aplicação de microscópio de luz. Posteriormente, o valor
da microdureza foi calculada a partir da divisão da força pela área obtida das diagonais
de indentação [21]. E em seguida, foi determinada a média do valor da microdureza
para cada condição do PMMA estudada (n=20), e posteriormente, comparou a média do
valor da microdureza entre esses três grupos.
Após três meses armazenados em tubos falcon contendo água destilada sob
temperatura ambiente, simulando o período que aparelho de acrílico permaneceria na
cavidade oral, essas amostras foram submetidas novamente ao teste de microdureza para
observar se houve alteração nas suas propriedades.
12
Desta forma, essa análise foi necessária para avaliar a mudança de
microdureza relacionado ao período de imersão em H2O destilada e ao envelhecimento
das amostras durante o período de liberação [22].
2.10. Caracterização por Termogravimetria (TG)
As amostras das três condições estudadas foram submetidas a caracterização
da TG para verificar a estabilidade térmica das mesmas, utilizou-se em média 10 mg de
amostra em cadinho de alumina, no equipamento da SHIMADZU (DTG-60H), sob
atmosfera de nitrogênio com vazão de 60 mL/min-1
, em uma taxa de aquecimento de
10°C/min-. E o aquecimento foi realizado em temperatura ambiente (~25°C) até 700 °C.
2.11. Caracterização por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
O comportamento da fusão do poli (metil metacrilato) com e sem a adição
do cinamaldeído, foram caracterizados por meio de um calorímetro diferencial de
varredura (SHIMADZU DSC-60Plus), e se utilizou amostras entre 8-9 mg em panelas
de alumínio hermeticamente fechadas, sob atmosfera de Nitrogênio (50 mL/min) a uma
taxa de aquecimento e resfriamento de 2 °C/min, numa faixa de temperatura de 25 °C a
180 °C.
2.12.Caracterização da Espectroscopia por Infravermelho com Transformada de
Fourier (FTIR)
As amostras foram caracterizadas utilizando o acessório SNAP- IN
BASEPLATE (método KBr) em um Espectofotrômetro de Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR) da Shimadzu, modelo IR Prestige-21 IR Affinity-1
FTIR 8400S (Kyoto, Japan), em modo de TRANSMITÂNCIA (KBr), com
comprimento de onda de 4000 a 400 cm-1
, resolução de 4 cm-1
. Cada amostra passou
por 64 varreduras.
13
2.13. Liberação controlada in vitro (UV-VIS)
Para curva de calibração utilizou-se soluções de cinamaldeído em
concentrações de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 e 7,0 μg/m em leitura de comprimento de
onda entre 200 a 400 no espectrofotômetro, resultando em uma regressão linear de y=
0,1098 x + 0,152, e em um coeficiente de correlação (r) ≥ 0,99 [23]. Posteriormente, as
amostras foram pré-pesadas a partir da concentração máxima do CIN obtida pela curva
de calibração (7 μg/mL), quadruplicou essa concentração e diante do resultado, calculou
um peso total dos corpos de provas (5,4 mg para as amostras de PMMA -24%CIN, 10,7
mg para as do PMMA -12% CIN e para o PMMA puro) para que o UV-VIS
conseguisse ler, obtendo um padrão de liberação a 37 °C.
Em seguida, as amostras do PMMA, modificado ou não, foram imersas em
20 mL de PBS com 0,05% de etanol e mantidas em agitação de 100 RPM na Incubadora
Shaker, Modelo SP-222 –SPLABOR (São Paulo, Brasil) a 37 °C com concentração.
Determinou-se a quantidade de liberação do CIN de cada amostra pelo espectro de
absorção do espectrofotômetro (modelo UV-1800 Shimadzu UV Spectrophotometer) na
faixa de comprimento de onda entre 200 nm a 400 nm.
As leituras foram realizadas em caminho óptico de 5 mm das cubeta de
quartzo contendo alíquotas de 1mL da solução para cada condição estudada, e nos
maiores sinais garantindo uma melhor sensibilidade nos períodos de tempos (06, 12, 24,
48, 144, 168, 240, 336, 720, 1440, 2160 h). Adotou-se esse tempo de duração da
análise para identificar se o polímero modificado após 90 dias, ainda proporcionaria
liberação do cinamaldeído e se a concentração liberada após esse período permaneceria
com potencial antifúngico. Utilizando-se como o branco, a amostra de referência, a
solução que o PMMA puro se encontrava imerso.
3. Análise estatística
Considerando-se o nível de significância de 5% para todos as análises, o
Microsoft Windows Office-Excell, SPSS (Statistical Package for Social Sciences)
versão 19.0 e Origin versão 8 foram utilizados para análise estatística e representação
dos resultados. Os resultados da inibição da aderência de biofilme em microdiluição, da
Unidades Formadoras de Colônias e microdureza foram analisados por estatística
inferencial de análise de variância (Anova) em conjunto com Tukey para teste de
14
múltipla comparação, e realizou o teste t pareado para avaliar dois momentos dos
mesmos grupos na análise de microdureza. E na de rugosidade superficial (Sa e Sz),
utilizou-se o teste Kruskal-Wallis em conjunto com Mann-Whitney. Já as
caracterizações do PMMA (TG, DSC, FTIR, e liberação controlada in vitro foram
analisadas no Origin versão 8.
4. Resultados e Discussão
4.1. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Fungicida Mínima (CFM)
A MIC e MFC foi de 125 µL/mL conforme demonstrado na tabela 1,
comprovando ser uma substância fungicida para as cepas estudadas.
Table 1. Valores da CIM (µL/ mL) e CFM (µL/ mL) do cinamaldeído sobre Candida spp.
Cinamaldeído Nistatina
CIM CFM MFC/MIC
Ratio*
CIM CFM
CFM/CIM
Ratio*
C. albicans ATCC (60193) 125 125 1
0.4 0.8 1
C. krusei ATCC (34135) 125 125 1
1.6 1.6 1
C. tropicalis ATCC (750) 125 125 1
0.4 0.4 1
C. glabrataATCC(90030) 125 125 1 0.4 0.8 1 *CFM/CIM Ratio ≥ 4 atividade fungistática, ou < 4 atividade fungicida
Esses microorganismos foram selecionados por ser C. albicans a espécie
mais frequente envolvidos em infecções fúngicas superficiais da mucosa oral, e o C.
tropicalis e C. krusei por também contribuírem para o desenvolvimento da doença. [24].
A união dessas espécies contribiu para formação de um biofilme multiespécie que é
considerado mais resistentes a ação antifúngica.
Acredita-se que a maioria dos óleos essenciais exerça sua atividade
antimicrobiana através de modificações na estrutura da parede celular do
microorganismo, aumentando a permeabilidade da membrana citoplasmática e
promovendo a deterioração de processos essenciais à sobrevivência da célula [25]
15
4.2. Atividade anti-biofilme da substância na aderência do biofilme multiespécie de
Candida spp.
Na figura 1 sugere que o fitoconstituinte na concentração de 625 µg/mL
apresentou uma inibição de biofilme multiespécie acima de 95% sendo considerado
como fungicida nessa concentração, e em 1250 µg/mL apresentou efeito máximo de
inibição de biofilme multiespécie (p< 0,5).
Fig. 1. Atividade anti-biofilme, do cinamaldeído (CIN) e nistatina (NIST) em diferentes
concentrações, na aderência do biofilme de Candida spp. (p>0,05) (Anova- Tukey)
Resultados encontrados, corroboram com outros estudos que apresentaram o
cinamaldeído com atividade fungicida in vitro inibindo a formação de biofilmes de C.
albicans [26–28]. Sugere-se que esse composto tenha efeito contra biofilmes resistentes
de C. albicans contra a anfotericina B e fluconazol [29].
Estudos observaram que o cinamaldeído, em concentrações inibitórias, tinha
um forte efeito sobre os mecanismos de efluxo e ATPase das membranas plasmáticas,
na diminuição da formação de tubos germinativos, nas atividades de proteinase e
fosfolipase da C. albicans [28,30]. Assim, acredita-se que óleos essenciais possam agir
em tais microorganismos nos mecanismos moleculares envolvidos relacionados à
16
ativação da via de transdução de sinal MAP (mitogen- activated protein) Kinase, onde
respostas celulares envolvidas com crescimento invasivo, formação de parede celular,
adaptação ao estresse osmótico e reprodução ocorrem mediante vias de sinalização
intracelular [31].
4.3. Atividade antifúngica do PMMA modificado pela adição do cinamaldeído
A figura 2 apresenta que houve atividade antifúngica representada pelo halo
de inibição com mensuração de 28 mm de diâmetro apenas para o grupo dos corpos de
provas com PMMA- 24%CIN em relação as demais condições analisadas. Confirmando
a liberação desse fitoconstituinte quando incorporado em PMMA. Isso representa uma
possível aplicação desse fitoconstituinte destinado à prevenção e tratamento de
candidose em usuários de aparelhos ortodônticos com base acrílica, após o
desenvolvimento de novos estudos in vivo.
Fig. 2. Atividade antifúngica dos corpos de provas PMMA-24%CIN) com mensuração
de 28 mm de diâmetro.
.
Esses resultados corroboram com os de Shreaz et al. [32] que observaram a
eficiência da atividade fungicida de cinamaldeído em meios sólidos. Isso sugere que o
cinamaldeído pode interferir nas propriedades de adesão de C. albicans, pois esse
17
fitoconstituinte, em concentrações inibitórias, também causa uma redução significativa
na adesão às células epiteliais bucais [28].
Após 90 dias de imersão em água destilada sob temperatura ambiente,
observou-se que a quantidade de cinamaldeído liberada no PMMA-24%CIN não
promoveu halo de inibição do biofilme após 24 h frente a cepas de C. albicans. Isso
sugere que a quantidade do fitoconstituinte liberada, comprovado pela análise de
UV/VIS, era insuficiente para manter o potencial antifúngico dos corpos de provas
dessa condição.
4.4. Atividade antiaderente de biofilme multiespécie de Candida spp. em PMMA
modificado por cinamaldeído
A figura 3 representa que houve redução de aproximadamente 80% na
aderência do biofilme multiespécie superficial do PMMA-24% CIN e de
aproximadamente 23% no PMMA-12%CIN em relação PMMA (controle). Isso mostra
que o PMMA modificado pela adição de adição de 24% do cinamaldeído apresentou um
melhor potencial antifúngico quando comparado as demais condições estudas.
Fig. 3. Atividade antiaderente de biofilme Candida spp. em PMMA modificado
(PMMA-12%CIN e PMMA-24%CIN) comparado ao PMMA puro.
18
Acredita-se que a adesão de Candida spp. à superfície mucosa e à base de
resina acrílica pode estar relacionada à atividade enzimática desse gênero de fungos.
Quanto maior a produção de fosfolipases e proteinases, maior a capacidade de invasão
tecidual desses micro-organismos [33].
A ação antimicrobiana de óleos essenciais pode estar relacionada a
inativações enzimáticas envolvidas na produção de energia e síntese de componentes
estruturais [34]. Outros estudos afirmam ainda que o rompimento da parede celular se
deve ao caráter lipofílico (presença de monoterpenos) dos óleos essenciais que se
acumulam nas membranas [35,36].
4.5. Análise da rugosidade superficial
Na tabela 2 a rugosidade superficial dos corpos de provas com PMMA puro
encontraram-se dentro dos parâmetros de normalidade com limites de rugosidade de
aproximadamente 0,2 μm (p>0,05). Todavia, o aumento de rugosidade superficial dos
corpos de provas com fitoconstituinte encontraram-se atrelados à concentração da
incorporação dos mesmos.
Table 2. Rugosidade medidas em µm (Sa e Sz) do PMMA sem e com modificação
Sa Sz
Grupos (n=20) Average SD Mediana (IQ) Média (Desv. Pad) Mediana (IQ)
PMMA 0,23 0,09 0,20 (0,05) a 1,72 0,20 1,66 (0,11) A
PMMA 12%CIN 0,27 1,30 0,22 (0,16) a 2,24 1,01 1,95 (0,51) B
PMMA 24%CIN 0,36 0,18 0,31 (0,07) b 2,29 0,43 2,16 (0,52) C
As letras minúsculas idênticas indicam ausência de diferenças estatísticas significativas (p>0,05) (Teste
de Kruskal-Wallis).
As letras maiúsculas indicam com diferenças estatísticas significativas (p<0,05) (Teste de Kruskal-
Wallis).
As topografias do PMMA sem incorporação do fitoconstituinte e com
incorporação de 12% e 24% de cinamaldeído são representadas pelas imagens da Figura
4.
19
Fig. 4. Topografia mostrando aspecto da superfície do PMMA sem modificação (A) e a
do PMMA modificado pela adição de do cinamaldeído em 12% (B) e 24% (C) em peso
do cinamaldeído.
Estudos afirmam que o limite aceitável de rugosidade superficial (Ra ou Sa)
para confecção de aparelhos ortodônticos é de 0,2 μm, sendo considerado com valor
insignificante para capacidade de acúmulo de biofilme, e que uma superfície
considerada rugosa é capaz triplicar o aumento da adesão microbiana quando
comparada com uma superfície lisa e polida [37,38].
O PMMA- 24% CIN, considerado com boa atividade antifúngica em relação
ao controle, apresentou rugosidade acima dos parâmetros de normalidade com média
(Sa) de 0,35 μm, e média do Sz de 2,28 (p<0,05). Isso sugere que ficaram passíveis a
20
proliferação de biofilme. No entanto, vale ressaltar que este valor foi obtido após a
preparação em mufla, mas que valores menores podem ser alcançados após polimento
superficial.
4.6. Análise de Microdureza Vickers
Os valores da média e desvio-padrão das três leituras da microdureza
Vickers (VHN) para os grupos Controle (PMMA puro), PMMA- 12%CIN e PMMA-
24%CIN estão representados na Table 3.
Table 3 . Valores da média da microdureza obtida em Número de Dureza Vickers
(VHN) para os três grupos analisados: grupo controle (PMMA), PMMA-12%CIN,
PMMA- 24%CIN .
GRUPOS (N=20) INICIAL APÓS 90 DIAS
EM H2O
DESTILADA
Média (Desv Pad) Média (Desv Pad)
PMMA
(CONTROLE)
13,87 0,35b, A
15,89 0,28c, B
PMMA -12% CIN 13,52 0,28b, A
14,88 0,22b, B
PMMA -24% CIN 10,820,26a, A
13,46 0,18 a, B
Letras minúsculas idênticas indicam ausência de diferenças estatísticas significativas entre os grupos em
cada tempo (p>0,05) (Teste de Anova e Tukey).
Letras maiúsculas idênticas indicam ausência de diferenças estatísticas significativas na análise de
pareamento (antes e depois) dos grupos (p>0,05).
Na primeira análise de microdureza, a redução estatisticamente significativa
da microdureza para a condição (PMMA-24%CIN) com respeito aos demais está
relacionada à quantidade do fitoconstituinte incorporado ao PMMA que agiu como
plastificantes, causando uma alteração na dureza superficial para este grupo.
Após adição de 24% em peso do cinamaldeído no PMMA, este polímero
apresentou menor resistência devido à cura incompleta como resultado da interação dos
monômeros MMA como o CIN, resultando em uma estrutura menos rígida e portanto
numa menor dureza [22,39,40].
21
Após 90 dias imersos em água destilada, os corpos de provas foram
novamente submetidos à análise de microdureza Vickers e observou-se que todos os
grupos de PMMA modificado apresentaram aumento na microdureza, estatisticamente
significativa quando comparado com o PMMA controle. Isso sugere que após período
de imersão em água destilada provoca alterações nas propriedades mecânicas do
material pela liberação do cinamaldeído que agia como plastificante quando
incorporado à estrutura tridimensional reticulada do PMMA, já que quanto mais rígida
for a superfície, maior sua a microdureza [41]. Isto pode ser comprovado, conforme será
visto, pelos testes de liberação controlada e de difusão de disco.
Não existe ainda estudos avaliando a microdureza do PMMA após
incorporação de algum óleo essencial, e nem relatos na literatura do efeito dessa
incorporação. Desta forma não foi possível comparar os resultados dessa análise de
microdureza com estudos prévios e identificar qual impacto essa modificação na
estrutura do PMMA poderia causar clinicamente. Em todo caso, o efeito do aumento da
microdureza é equiparável ao causado pela liberação intraoral do cinamaldeído. Além
disso, o aumento na dureza, como consequência da perda do fitoconstituinte que age
como plastificante, não significa que haja deterioração das propriedades mecânicas do
PMMA durante o seu uso de modo a comprometer a integridade dos aparelhos
ortodônticos.
4.7. Caracterização por Termogravimetria (TG)
Na análise por TG e DTG, representada pela figura 5, confirmou a
incorporação do cinamaldeído no PMMA pela caracterização da perda de massa e na
região de perda de voláteis.
As curvas foram reportadas as temperaturas de onset, temperaturas de máxima
taxa de degradação de cada evento térmico e as respectivas porcentagens das perdas de massa.
E as três amostras se mantiveram em condições térmicas estáveis até cerca de 280°C
[42]. Nota-se que o processo de cura em mufla reduziu consideravelmente o teor inicial
de cinamaldeído incorporado ao PMMA de 12 e 24% para cerca de 8 e 14%.
22
Fig. 5. Curvas termogravimétricas e DTG para o PMMA sem modificação e modificado
pela adição do cinamaldeído (PMMA-12%CIN e PMMA-24%CIN).
Pode-se observar na DTG que a degradação do PMMA ocorre em duas
etapas consecutivas de perda de massa: a primeira, de cerca de 16 % ocorre até
aproximadamente 300ºC, e a segunda, acima de 350ºC. Quando o cinamaldeído foi
incorporado no PMMA, observou-se que houve uma diminuição no primeiro estágio de
degradação e um aumento no segundo estágio, possivelmente devido ao efeito
estabilizante do cinamaldeído na degradação do PMMA.
Nota-se também um estágio de decomposição máxima do polímero entre
300 e 430°C para o PMMA sem modificação (PMMA), corroborando com resultado de
decomposição máxima da massa do polímero em outro estudo [42]. A decomposição
térmica total para as amostras do PMMA modificados pelo cinamaldeído, ocorreu em
uma temperatura máxima de aproximadamente 430°C. Confirmou-se assim, que a
incorporação do cinamaldeído no PMMA estudado, retardou a taxa de decomposição
máxima do polímero. Resultados semelhantes foram encontrados quando o
cinamaldeído foi incorporado em filmes poliméricos de poli (ácido lático) (PLA)[43].
23
4.8. Caracterização por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
Na figura 6, os valores da transição vítrea correspondentes ao PMMA puro,
PMMA modificado, PMMA-12% CIN e PMMA- 24% CIN, foram de 64,7 °C, 59,3 °C
e 55,6°C respectivamente.
Fig.6. Curvas do DSC do PMMA sem modificação (a), e modificados (PMMA-
12%CIN e PMMA-24%CIN).
A diminuição da transição vítrea no DSC está relacionada ao aumento da
incorporação do cinamaldeído no PMMA, e é desencadeada pela ação plastificante do
cinamaldeído, também comprovada pela redução na microdureza, aumentando,
portanto, a flexibilidade do polímero [44,45].
Logo em sequência, observou-se no PMMA modificado (PMMA-12%CIN e
PMMA-24% CIN) pequenos picos e vales exotérmicos do polímero amorfo
comprovando a volatilização do cinamaldeído. Identificou–se, também, um pico
exotérmico entre 140-240oC que aumenta com o aumento no teor de cinamaldeído,
confirmando a existência de cura residual, visível no PMM -24%CIN, pelo efeito
retardante do cinamaldeído que interage com o MMA inibindo a formação de uma
estrutura tridimensional de PMMA em tempos mais curtos.
24
4.9 Caracterização da Espectroscopia por Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR)
A identificação das frequências de absorção dos grupos funcionais
característicos do PMMA e do cinamaldeído estão representados nos espectros de
infravermelho (Fig. 7)
Fig. 7. Espectros FTIR do cinamaldeído (a), PMMA puro(b), e modificados PMMA-
12% CIN (c) e PMMA- 24%CIN (d).
Em todas as amostras do PMMA, foram observadas estiramento de bandas
de absorção, característicos da vibração dos grupos, com número de onda de 2951cm-1
(-CH), 1731 cm-1
(C = O ), 1454 cm-1
(C-H2), e 1130 cm-1
(C-O-C) representando o
grupo éster desse polímero, semelhante aos grupos encontrados por outros autores[46].
Ao observar os espectros dos PMMA modificados, identificou-se, além dos
grupos característicos do polímero estudado, a presença de novos picos próximos as
bandas 1700 - 1600 cm-1
, atribuídos ao grupo aldeído do fitoconstituinte (C = O) e a
vibração do anel aromático do cinamaldeído respectivamente, conforme resultados
semelhantes encontrados por outros autores [43,44,47–49]. Outras bandas a 688 e 748
cm-1
, confirmaram a presença grupo fenila do cinamaldeído. O estiramento da banda em
25
688 cm-1
, foi relatado que seria correspondente à vibração de CH = CH para fora do
plano em alcenos, e o da banda em 748 cm-1
seria a flexão do -CH para fora do anel
benzeno [50,51].
Estes dados comprovam a incorporação ou interação desse fitoconstituinte
no polímero de forma efetiva, não sendo capaz de acarretar alterações no padrão de
vibração no grupo molecular.
4.11. Liberação controlada in vitro
A figura 8 apresenta a cinética da liberação in vitro do cinamaldeído lida no
comprimento de onda (λ) de 288 nm no período de 2160 h (90 dias). E os resultados
dessa análise representa que a cinética de liberação do cinamaldeído foi semelhante para
os dois grupos experimentais no período de 2160 h (90 dias). Observou –se um pico de
liberação nas primeiras 48 horas, e um decréscimo na liberação com 144 h, e se
mantiveram com perfil de liberação estável até 168 h.
Fig. 10. Cinética de liberação in vitro do cinamaldeído no PMMA (PMMA-12%CIN e
PMMA 24%CIN) por 90 dias (2160 h)
26
Com 240 h (10 dias) de liberação, um outro pico de liberação, mais
evidente, foi observado para o PMMA- 24% CIN, seguida de uma liberação gradual até
as 1440 h (60 dias). Isso sugere que as duas condições analisadas apresentaram perfil de
liberação ascendente. As amostras do PMMA-24%CIN, sempre apresentou um teor de
liberação maior, comprovando ter um maior potencial antifúngico para esta condição.
Na leitura com 90 dias (2160 h) de liberação, observou-se que ainda havia
uma pequena concentração de cinamaldeído sendo liberada pelo PMMA-24%CIN,
porém foi considerada insuficiente para atividade antifúngica comprovada pelo teste de
difusão em ágar após 90 dias. Isso sugere que essa concentração liberada foi
proveniente de resíduos do fitocontsituinte localizado da área mais interna do polímero.
Estudo afirma que a liberação inicial de forma rápida permitida pela matriz
polimérica, é relacionada à difusão do fármaco disponível na superfície do polímero, e
acompanhada da liberação progressiva decorrente da exposição por maior tempo ao
meio aquoso [52].
5. Conclusões
O cinamaldeído isolado ou incorporado no polímero da condição PMMA-
24% CIN tem alto potencial antifúngico contra biofilme multiespécie. As
caracterizações do TG, DSC e FTIR confirmaram a incorporação de forma efetiva no
PMMA para condição estudadas. E o FTIR comprovou que as pequenas mudanças
apresentadas na estrutura física (rugosidade e microdureza) do PMMA - 24% CIN não
foi capaz de acarretar alterações no padrão de vibração dos grupos moleculares. Estando
as melhores e mais eficientes concentrações do cinamaldeído liberada (UV-VIS) para a
condição do PMMA- 24%CIN, comprovando seu potencial antifúngico in vitro por 90
dias (2160 h). Desta forma, o PMMA- 24% CIN pode ser considerado como um
terapêutico promissor, e ser potencialmente utilizado na prevenção candidose em
futuras aplicações biomédicas como em expansores ortodônticos basais.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a empresa VIPI pelo fornecimento de
alguns materiais para a concretização dessa pesquisa, e à Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoas de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.
27
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33
3. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Sabe-se que em alguns tratamentos ortodônticos, o paciente é submetido ao uso
de aparelhos com placas acrílicas que ficam obrigatoriamente fixados por meio de
bandas ortodônticas um período mínimo de três meses, ficando impossível a
higienização na região da superfície acrílica que fica próxima a mucosa palatina. Desta
forma, há uma busca por métodos inovadores de intervenções clínicas que possam
prevenir futuras patologias fúngicas a precariedade higiênica dessa área. Como relatada
na literatura e comprovados no resultados in vitro obtidos nesse estudos, o cinamaldeído
é um fitoconstituinte com potenciais antifúngicos promissoras, mostrando-se eficaz em
todos os testes realizados. A modificação do PMMA pela agregação do cinamaldeído
promoveu um aumento da rugosidade e diminuição da microdureza proporcional a
intensidade da concentração adicionada, porém de maneira sutil, pois a análise de DSC,
TG comprovou que a esta união se manteve estável até uma temperatura de ~ 80°C e o
FTIR ratificou que a modificação do PMMA pela interação do cinamaldeído não causou
alterações no padrão de vibração molecular. Representando assim, um estudo de
relevância clínica e científica bastante promissora.
34
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