RICARDO DIAS DE CASTRO ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO

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RICARDO DIAS DE CASTRO

ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum

zeylanicum Blume (CANELA) E DE SUA ASSOCIAÇÃO COM ANTIFÚNGICOS

SINTÉTICOS SOBRE ESPÉCIES DE Candida

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA - UFPB

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS

JOÃO PESSOA – PB

2010

1


ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum

zeylanicum Blume (CANELA) E DE SUA ASSOCIAÇÃO COM ANTIFÚNGICOS

SINTÉTICOS SOBRE ESPÉCIES DE Candida

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Produtos Naturais

e Sintéticos Bioativos do Centro de

Ciências da Saúde da Universidade

Federal da Paraíba, como parte dos

requesitos para obtenção do título de

DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS

E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de

concentração: FARMACOLOGIA

Orientadora: Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima

JOÃO PESSOA – PB

Novembro – 2010

2

C355a Castro, Ricardo Dias de.

Atividade antifúngica do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (canela) e sua associação com antifúngicos sintéticos sobre espécies de Candida / Ricardo Dias de Castro. - - João Pessoa: [s.n.], 2010.

168 f.: il. -

Orientadora: Edeltrudes de Oliveira Lima.

Tese (Doutorado) – UFPB/CCS, Programa de Pós-Graduação em Produtos

Naturais e Sintéticos Bioativos.

1. Agentes contra Candida albicans - Canela. 2. Cinnamomum zeylanicum.

3. Canela. 4. Miconazol. 5. Candidíase. 6. Sinergismo Farmacológico.

BS/CCS/UFPB CDU: 615.282.84: 582.677.2(043.2)

BS/CCS/UFPB CDU: 615.282.84:

582.677.2(043.2)

3


ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum zeylanicum

Blume (CANELA) E DE SUA ASSOCIAÇÃO COM ANTIFÚNGICOS SINTÉTICOS

SOBRE ESPÉCIES DE Candida

Tese ________________ em ___/___/______

COMISSÃO EXAMINADORA

______________________________________________

Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima

Universidade Federal da Paraíba – Orientadora

______________________________________________

Prof. Dr. José Pinto de Siqueira Júnior

Universidade Federal da Paraíba – Examinador interno

______________________________________________

Profa. Dra. Margareth Formiga de Melo Diniz

Universidade Federal da Paraíba – Examinadora interna

______________________________________________

Profa. Dra. Lindomar de Farias Belém

Universidade Estadual da Paraíba – Examinadora externa

______________________________________________

Prof. Dr. Thompson Lopes de Oliveira

Universidade Federal da Paraíba – Examinador externo

______________________________________________

Prof. Dr. Alessandro Leite Cavalcanti

Universidade Estadual da Paraíba – Examinador exteno (suplente)

______________________________________________

Profa. Dra. Marianna Vieira Sobral Castello Branco

Universidade Federal da Paraíba – Examinador interno (suplente)

4

A João Tadeu de Castro (pai) e

Maria Cecília Abílio de Castro (filha)

pela representação do sentido da

vida.

5

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra Edeltrudes de Oliveira Lima pela orientação, convívio agradável e pelo

aprendizado imenso que tive ao longo deste trabalho;

Aos docentes do Programa de Pós Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos

Bioativos por todo auxílio e ensinamentos;

Aos docentes, técnicos e pesquisadores do Laboratório de Micologia do

Departamento de Ciências Farmacêuticas pelo apoio e presteza.

Aos familiares, em especial a minha esposa (Gisely Maria Freire Abílio de Castro) e

mãe (Inês Maria Dias de Castro), pelo apoio incondicional na condução e construção

de minha vida profissional.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo fornecimento da bolsa de doutorado

no primeiro ano de estudo.

Aos alunos do curso de graduação em odontologia, especialmente os que integram

o Grupo de Pesquisa em Odontopediatria e Clínica Integrada, que compreenderam

minha ausência em alguns momentos.

Aos professores do Grupo de Pesquisa em Odontopediatria e Clínica Integrada

(GPOCI) pelo apoio e parceria.

Aos integrantes do Grupo de Estudos Culturais Transdisciplinares em Educação e

Saúde (GETES), em especial a Ana Elvira Steinbach Silva Raposo e Eduardo

Antônio de Pontes Costa, pelo apoio, amizade e incentivo.

A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para realização deste

trabalho.

6

CASTRO, R. D. Atividade atifúngica do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume (Canela) e de sua associação com antifúngicos sintéticos sobre espécies de Candida. 2010. 168f. Tese (Doutorado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos – Área de Concentração: Farmacologia) – UFPB/CCS, João Pessoa.

RESUMO

Objetivou-se investigar a ação antifúngica do óleo essencial (OE) de Cinnamomum zeylanicum Blume isolado e associado a antifúngicos sintéticos sobre espécies de Candida. Para tanto, foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), a Concentração Fungicida Mínima (CFM), índice de Concentração Inibitória Fracionada (ICIF), a Curva de Morte Microbiana promovida pelo OE isolado e associado a antifúngicos sintéticos, a ação sobre a parede celular fúngica e a interferência dessa associação sobre a micromorfologia fúngica. Quando avaliados isolados, C. zeylanicum e nistatina apresentaram CIM de, respectivamente, 312,5 µg/mL e 64 µg/mL. Após associação dos produtos avaliados, foi observada diminuição nos valores de CIM para ambas as substâncias, sendo encontrados valores de, respectivamente, 39 µg/mL e 32 µg/mL para o OE e nistatina, sendo verificado o valor do ICIF de 0,6024 (aditividade). Foi observado que em todas as concentrações avaliadas, os produtos isolados e associados foram capazes de reduzir significativamente o número de UFC/mL, quando comparados ao grupo controle a partir de 30 min. Também foi observada redução no desenvolvimento das estruturas morfológicas das células de C. albicans, como pseudo-hifas, bastoconídios e clamidoconídios. Quando associado ao miconazol, foi observado ICIF de, respectivamente, 4,1248 (antagonismo), 1,1248 (indiferença) e 1,1248 (indiferença), para C. albicans, C. tropicalis e C. krusei. Assim, verifica-se que C. zeylanicum exibiu ação sobre cepas de Candida, que essa atividade antifúngica apresentada pelo C. zeylanicum ocorre, provavelmente, por ação do óleo essencial no processo de síntese da parede celular fúngica, que associação do OE de C. zeylanicum e nistatina promoveu potencialização do efeito inibitório sobre o crescimento das cepas de C. albicans, promovendo redução na capacidade de desenvolvimento de estruturas morfológicas das células. Todavia, a associação do óleo essencial de C. zeylanicum ao miconazol não constitui em uma possibilidade vantajosa para inibição de crescimento de Candida spp.

Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum. Nistatina. Canela. Miconazol. Candidíase. Sinergismo Farmacológico.

7

CASTRO, R. D. Antifungal activity of the essential oil of Cinnamomum zeylanicum Blume (cinnamon) and its combination with synthetic antifungals on Candida species. 2010. 168p. Thesis (PhD in Bioactive Synthetic and Natural Products - Concentration Area: Pharmacology) - UFPB / CCS, Joao Pessoa.

ABSTRACT

This study aimed to investigate the antifungal activity of essential oil (EO) of Cinnamomum zeylanicum Blume alone and combined with synthetic antifungal agents against Candida species. For this, it was determined the Minimum Inhibitory Concentration (MIC); Minimum Fungicidal Concentration (MFC); Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI); microbial death curve promoted by the EO alone and combined with synthetic antifungals; action on fungal cell wall and interference of this combination on the fungal micromorphology. When assessed alone, C. zeylanicum and nystatin showed MIC of 312.5 µg/mL and 64 µg/mL, respectively. After combination, there was a reduction in MIC values for both substances, and were found values of respectively 39 µg/mL and 32 µg/mL for the EO and for Nystatin. It was verified a FICI value of 0.6024 (additivity). At all concentrations tested, these products alone and combined were able to reduce the number of CFU/mL, when compared with the control group from 30 min. It was also observed a reduction in the development of morphological structures of C. albicans cells, like pseudohyphae, blastoconidia and chlamydoconidia. When combined with miconazole, FICI values were 4.1248 (antagonism), 1.1248 (indifference) and 1.1248 (indifference), respectively, for C. albicans, C. tropicalis and C. krusei. Thus, it can be concluded that: C. zeylanicum showed activity against the Candida strains; this antifungal activity occurs, probably, by action of the essential oil in the process of fungal cell wall synthesis; the combination between C. zeylanicum EO and nystatin potentiated the inhibitory effect on growth of C. albicans strains, promoting a reduction in the development capacity of cellular morphologic structures. Nevertheless, the combination of C. zeylanicum EO and miconazole is not an advantageous possibility for growth inhibition of Candida spp.

Key-words: Cinnamomum zeylanicum. Nystatin. Cinnamon. Candidiasis. Miconazole. Drug synergism.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µg – Micrograma

AIDS – Síndrome da imunodeficiência adquirida

AMPC – Adenosina monofosfato cíclico

ASD – Agar Sabouraud Dextrose

ATCC – American Type Culture Collection

CCS – Centro de Ciências da Saúde

CDR – Cadmium-inducible

CFM – Concetração Fungicida Mínima

CIM – Concentração Initória Mínima

cm – Centrímetro

FIC – Concentração Inibitória Fracionada

g – Grama

h – Hora

HIV – Vírus da imunodeficiência humana

IgA-S – Imunoglobulina A secretora

IL-1 α – Interleucina 1 alfa

IL-2 α – Interleucina 2 alfa

m – Metro

M – Molar

MAPK – Proteína cinase ativada por mitógeno.

mg – Miligrama

Min – Minuto

mL – Mililitro

mm – Milímetro

9

OE – Óleo essencial

PNPMF – Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos

RR – Risco relativo

SNC – Sistema Nervoso Central

SUS – Sistema Único de Saúde

TCT – Trifenil cloreto de tetrazólio

TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa

UFC – Unidade formadora de colônia

UFPB – Universidade Federal da Paraíba

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Elementos moleculares presentes em mecanismos de transdução

de sinal envolvidos com a formação de fatores de virulência em C. albicans .

21

Figura 2 - Estrutura química da nistatina .......................................................... 25

Figura 3 - Estrutura química do miconazol ....................................................... 28

Figura 4 - Esquema para realização do ensaio de sinergismo pela técnica de

checkerboard. ....................................................................................................

48

Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de

Candida

Figura 1 - Atividade antifúngica dos óleos essenciais sobre C. albicans

ICB-12 (A) e C. tropicalis LM-708 (B). 1 - Matricaria chamomilla; 2 - Eugenia

uniflora; 3 - Cinnamomum zeylanicum; 4 - Citrus aurantifolia; 5 - Mentha

piperita; 6 - Citrus reticulata; 7 - Zingiber officinale ..........................................

61

Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and

nystatin on strains of Candida spp.

Figure 1 - Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under

activity of the products assessed at MIC÷2 (p<0.0001). ……………………….

97


activity of the products assessed at MIC (p<0.0001). ………………………….

97


activity of the products assessed at MICx2 (p<0.0001). ……………………….

98



98



99

Effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential oil

alone and combined with nystatin on micromorphology of Candida

albicans strains.

Figure 11 - Microscopic appearance of C. albicans strain (ATCC 40277): A -

growth control; B - C. activity of C. zeylanicum EO (39 µg/mL) combined with

nystatin (32 µg/ml); C - activity of nystatin (64 µg/ml); D - activity of C.

zeylanicum EO (312.5 µg/mL). ..............................................................

116

11

LISTA DE TABELAS

Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de

Candida.

Tabela 1 - Medida em milímetro dos halos de inibição de crescimento

microbiano produzidos pelos óleos essenciais sobre cepas de Candida. ........

60

Tabela 2 - Concentração Inibitória Mínima do Óleo essencial de C. zeylanicum

e Nistatina sobre cepas de Candida. .................................................................

61

Anti-Candida activity and chemical composition of Cinnamomum

zeylanicum Blume essential oil.

Table 1 - Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal

Concentration (MFC) of C. zeylanicum essential oil, nystatin and miconazole on

Candida strains……………………………………………………………………….

84

Table 2 - Action of the essential oil of C. zeylanicum on the fungal cell

wall………………………………………………………………………………………

85

Table 3 - Chemical characterization of C. zeylanicum leaf essential oil. …........ 86



Table 1 - Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C. zeylanicum essential oil

and Nystatin on strains of C. albicans ATCC 40277. ……………………………...

96

Table 2 - Fractional Concentration Index (FIC) and Minimum Inhibitory

Concentration (MIC) (µg/mL) after combination of C. zeylanicum essential oil

with Nystatin on the strain of C. albicans ATCC 40277. ..…………………………

96


nystatin on strains of non-albicans Candida.


and Nystatin on strains of C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC

40147…………………………………………………………………………………….

123

Table 2 - Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC) after combination

between C. zeylanicum essential oil and Nystatin on C. tropicalis strain ATCC

40042. …………………………………………………………………………………….

125

Table 3 - Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC) after combination

between C. zeylanicum essential oil and Nystatin on C. krusei strain ATCC

40147. …………………………………………………………………………………….

125

12


miconazole on Candida strains.


and miconazole on Candida strains………….........................................................

138

Table 2 - Fractional Inhibitory Concentration index (FIC) and MIC (µg/mL) after

combination between C. zeylanicum essential oil and miconazole against strains

of C. albicans ATCC 40277, C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC

40147…………………………………………………………………………………..…

138

13

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Óleos essenciais utilizados no ensaio para determinação da

atividade anti-Candida. ............................................................................

43

Effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential oil

alone and combined with nystatin on micromorphology of Candida

albicans strains.

Quadro 2 – Micromorphology changes promoted by the products under

testo on C. albicans ATCC. 40277. ..........................................................

115

14

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 15

2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 18

2.1 Geral ................................................................................................................ 18

2.2 Específicos ....................................................................................................... 18

3 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................... 20

3.1 Candidíase ...................................................................................................... 20

3.2 Terapia antifúngica ........................................................................................ 23

3.3 Limitação dos antifúngicos sintéticos ............................................................ 28

3.4 Produtos naturais ........................................................................................... 30

3.5 Cinnamomum zeylanicum .............................................................................. 34

3.6 Associação de drogas antifúngicas ................................................................ 38

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 42

4.1 Local de realização de pesquisa e cepas fúngicas ......................................... 42

4.2 Óleos essenciais ............................................................................................. 42

4.3 Produtos sintéticos .......................................................................................... 43

4.4 Screening para avaliação da atividade antifúngica ......................................... 43

4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ................................ 43

4.6 Deterteminação da Concentração Fungicida Mínima (CFM) .......................... 44

4.7 Ensaio de sinergismo – método checkerboard ............................................... 44

4.8 Estudo do efeito do óleo essencial isolado e associado à nistatina sobre a

cinética do crescimento das leveduras ........................................................................

46

4.9 Estudo do efeito do óleo essencial isolado e associado à nistatina sobre a

micromorfologia de cepas de C. albicans .......................................................

46

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 49

5.1 Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de

Candida.............................................................................................................

50

15

5.2 Anti-Candida activity and chemical composition of Cinnamomum

zeylanicum Blume essential oil. …………………………………………….…….

65

5.3 Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and nystatin

on Candida spp. …………………………………………………………………..…

85

5.4 Efeito do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume sozinho e associado à

nistatina sobre a micromorfologia de cepas de Candida albicans.

...........................................................................................................................

100

5.5 Efeito combinado da ação do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum

Blume e nistatina sobre cepas de Candida não-albicans.

.............................................................................................................................

115

5.6 Efeito combinado do óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum Blume e

miconazol sobre cepas de Candida. ...................................................................

128

6 CONCLUSÕES .................. ................................................................................ 144

REFERÊNCIAS ................................................................................................... 146

16

INTRODUÇÃO

17

1 INTRODUÇÃO

Espécies de Candida têm sido associadas às infecções micóticas

superficiais e sistêmicas, podendo ser isoladas em até 60% da cavidade oral

de adultos, estando Candida albicans e C. tropicalis entre as mais prevalentes

(MARSH; MARTIN, 2005). Tais espécies apresentam fatores de virulência

envolvidos com a formação de biofilmes, sendo os fatores ambientais (saliva,

fluido gengival, pH e nutrientes) favoráveis aos processos de co-agregação e

co-adesão entre Candida e outros microrganismos, incluindo as bactérias

envolvidas com as principais patologias da cavidade oral, cárie dentária e

doenças periodontais (THEIN; SAMARANAYAKE; SAMARANAYAKE, 2006).

Destaca-se que essa habilidade para formação de biofilme está intimamente

associada com a capacidade de causar infecções, representando um aumento

na resistência às drogas antifúngicas e às defesas imunológicas do hospedeiro

(HERIQUES; AZEREDO; OLIVEIRA, 2004; RAMAGE et al., 2005).

Mecanismos moleculares envolvidos com a patogenicidade de espécies

de Candida são elucidados na perspectiva da elaboração de fármacos que

apresentem maior especificidade e, consequentemente, menos efeitos

indesejáveis (OROZCO; ZHOU; FILLER, 2000; MONGE et al., 2006; MÜLLER

et al., 2007). Estes mecanismos estão relacionados à ativação da via de

transdução de sinal MAP (mitogen-activated protein) Kinase, onde respostas

celulares envolvidas com crescimento invasivo, formação de parede celular,

adaptação ao estresse osmótico e reprodução ocorrem mediante vias de

sinalização intracelular (MONGE et al., 2006).

Atualmente, os agentes disponíveis para tratamento de infecções

fúngicas da cavidade oral, caracterizadas como superficiais, são representados

pelos poliênicos (anfotericina B, nistatina, entre outros) e azólicos (fluconazol,

itraconazol, miconazol, cetoconazol, entre outros), sendo estes últimos os

eleitos em primeira instância para tratamento dessas doenças e são

geralmente fungistáticos (WINGETER et al., 2007).

Diante das limitações de uso desses antifúngicos sintéticos,

evidenciadas pelo aumento da resistência pelos microrganismos, bem como

18

pelas reações indesejadas apresentadas pelos usuários, novos agentes são

propostos na tentativa de minimizar tais eventos. A resistência dos

microrganismos vem aumentando em função do uso indiscriminado de

antimicrobianos utilizados no tratamento de doenças infecciosas. Essa situação

tem impulsionado investigadores a estudarem novas substâncias

antimicrobianas de várias fontes, incluindo as plantas medicinais (BANSOD;

RAI, 2008).

A atividade antifúngica de produtos obtidos de plantas medicinais têm

sido cientificamente atribuída aos óleos essenciais, extratos, cumarinas,

terpenos, flavonóides, amidas, imidas e alcalóides (AQUINO et al., 2003;

GAYOSO et al., 2005; MOREIRA et al., 2007).

Nesse sentido, considerando a ampla atividade biológica apresentada

pelos produtos de origem natural, óleos essenciais obtidos a partir de espécies

vegetais têm sido investigados para determinação de suas atividades

antimicrobiana (WILSON; SOLAR; GHAOUTH, 1997; SRINIVASAN et al.,

2001; BONJAR; AGHIGHI; KARIMI, 2004; KONNING; AGYARE; ENNISON,

2004; GIORDANI et al., 2006; LIMA et al., 2006; BANSOD; RAI, 2008; JANTAN

et al., 2008; VIUDAS-MARTOS, 2008).

Assim, diante do aumento do número de indivíduos

imunocomprometidos e desenvolvimento de diversos mecanismos de

resistência por parte dos microrganismos, o propósito desse estudo foi avaliar a

susceptibilidade de espécies de Candida ao óleo essencial de Cinnamomum

zeylanicum Blume isoladamente e associado a produtos sintéticos.

19

OBJETIVOS

20

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Determinar a atividade antifúngica do óleo essencial obtido a partir das

folhas de C. zeylanicum isolado e associado a antifúngicos sintéticos sobre

Candida spp.

2.2 Específicos

Realizar screening com óleos essenciais para determinação da atividade

antifúngica sobre cepas de Candida;

Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Fungicida Mínima (CFM) do óleo essencial obtido de C. zeylanicum

sobre cepas de Candida;

Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Fungicida Mínima (CFM) do óleo essencial de C. zeylanicum associado

a antifúngicos sintéticos sobre cepas de Candida;

Determinar o Índice de Concentração Inibitória Fracionada (método de

associação – checkerboard) do óleo essencial de C. zeylanicum

associado com os antifúngicos sintéticos;

Determinar a curva de morte microbiana promovida pelo óleo essencial

de C. zeylanicum isolado e associado a antifúngicos sintéticos;

Analisar a ação do óleo essencial de C. zeylanicum sobre a parede

celular fúngica;

Avaliar a interferência do óleo essencial de C. zeylanicum isolado e

associado a antifúngicos sintéticos sobre a micromorfologia fúngica.

21

REVISÃO DA LITERATURA

22

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Candidíase

A candidíase é uma infecção fúngica ocasionada pela presença de

leveduras do gênero Candida, que faz parte da família Cryptococcaceae, sendo

reconhecidas cerca de 81 espécies, destacando-se a C. albicans pela sua

virulência e potencial para promover doenças.

C. albicans é um patógeno oportunista que habita o corpo humano de

forma comensal e é a maior causa de infecções fúngicas em humanos. Estas

infecções normalmente ocorrem como consequência de uma alteração na

resposta imunológica e virulência da C. albicans, que apresenta considerável

plasticidade morfológica (MONGE et al., 2006).

Os mecanismos moleculares envolvidos com tal virulência estão

relacionados à ativação da via de transdução de sinal MAP (mitogen-activated

protein) Kinase, onde respostas celulares envolvidas com crescimento invasivo,

formação de parede celular, adaptação ao estresse osmótico e reprodução

ocorrem mediante vias de sinalização intracelular como MKc1, Cek1/2 e HOG1

MAP Kinase (MONGE et al., 2006).

Figura 1. Elementos moleculares presentes em mecanismos de transdução de sinal envolvidos

com a formação de fatores de virulência em C. albicans (MONGE et al., 2006).

A ativação da via MAPK também proporciona a ativação do fator de

transcrição Cph1, responsável pela forma filamentosa, considerada fator de

23

virulência para ocorrência de infecções sistêmicas, e do CLA4, responsável

pela formação do tubo germinativo e hifas. A via de ativação PKA proporciona

a formação de AMPc, que regula o fator Efg1, responsável pela formação de

hifas (PHAN; BELANGER; FILLER, 2000).

Ressalta-se que outras vias de sinalização intracelular, como a p38

MAPK, também estão envolvidas com a patogenicidade da C. albicans

(MULLER et al., 2007). Um vez instalada a infecção, mediadores pró-

inflamatórios, como TNF-α, IL-1α e IL-2α, são sintetizados e,

conseqüentemente, induzem a resposta inflamatória (OROZCO; ZHOU;

FILLER, 2000).

A produção de enzimas extracelulares, como fosfolipases e proteinases,

contribui para a virulência da C. albicans, já que são capazes de promover

destruição dos tecidos do hospedeiro. Menezes et al. (2005) verificaram que

67% e 80% das cepas de Candida isoladas da cavidade bucal de crianças

foram positivas para, respectivamente, fosfolipases e proteinases.

Assim como apresentado na Fig. 1, as vias de sinalização intracelular

podem sofrer interferências, proporcionando às células de C. albicans maior

complexidade na expressão dos seus fatores de virulência (MONGE et al.,

2006). O conhecimento acerca desses mecanismos pode contribuir para a

descoberta de novos agentes anti-Candida.

O papel da imunidade celular no controle da infecção causada por C.

albicans é considerado de extrema importância, pois determina a

susceptibilidade ou resistência dos indivíduos à infecção por este

microrganismo (CARVALHO et al., 2003). Para impedir a proliferação e

progressão de candidíases, o sistema imunológico elabora mecanismos de

defesa específicos e inespecíficos contra as leveduras. Dentre os mecanismos

envolvidos com esta defesa, as imunoglobulinas da classe IgA presentes nas

secreções e saliva desempenham papel fundamental. Nas infecções por

Candida das superfícies epiteliais, a IgA-s (secretora) age promovendo

agregação dos fungos e inibe sua aderência às células epiteliais da mucosa,

impedindo, consequentemente, sua proliferação (BADAUY et al., 2005).

24

Pacientes com candidíase recorrente apresentam uma baixa resposta

imune celular para antígenos de C. albicans. Este fato contribui para o

entendimento acerca da patogênese da cadidíase recorrente, abrindo

perspectivas para a utilização de agentes imunomoduladores com a finalidade

de restaurar a resposta imune destes pacientes (CARVALHO et al., 2003).

Clinicamente, a doença pode surgir como manifestações em mucosas

até quadros sistêmicos, com a invasão de diversos órgãos. As mucosas oral,

vaginal e esofágica são as mais acometidas em quadros de candidíases

(SIDRIM; MOREIRA, 1999).

As infecções sistêmicas, ocasionados pela disseminação hematológica,

podem causar microabscessos por todo corpo. Para disseminação das células

de C. albicans, o endotélio vascular participa ativamente do processo, havendo

interação entre receptores presentes nas células endoteliais e adesinas

expressas pelas leveduras (FILLER et al., 1995; MULLER et al., 2007).

Com relação às infecções superficiais, especialmente as que acometem

a cavidade bucal, objeto de interesse deste estudo, sabe-se que a mucosa

dessa região é o sítio mais frequente de candidíase superficial, e a colonização

por C. albicans ocorre em 10 a 50% dos indivíduos sadios. De forma geral,

essa colonização é controlada por antagonismo competitivo da microbiota

comensal, por competições nutritivas e pela produção de substâncias tóxicas

que podem também interferir no mecanismo de aderência dessas leveduras às

células epiteliais. A produção de ácido lático por essas células ou a

manutenção do pH salivar também são fatores limitantes da colonização

dessas leveduras (LORENZO, 2004).

Em indivíduos imunocomprometidos, especialmente os acometidos pelo

HIV/AIDS, cerca de 74% apresentam lesões na mucosa bucal ocasionados por

infecções causadas por Candida spp. (LASKARIS; HADJIVASSILIOV;

STRATIGOS, 1992; CAVASSANI et al., 2002). Ressalta-se que nestes

indivíduos a candidíase bucal pode funcionar como um marcador da

progressão da doença e preditivo para o aumento da imunossupressão

(MESQUITA; AGUIAR; TARQUINO, 1996). Pozzatti (2007) afirma que, diante

25

desse contexto, a pesquisa de novos agentes terapêuticos torna-se uma

medida de extrema importância.

A candidíase orofaríngea apresenta manifestações clínicas distintas, que

proporcionaram a seguinte classificação: a) pseudomembranosa (caracterizada

pela presença de placas brancas, facilmente destacáveis, que recobrem áreas

eritematosas da mucosa); b) eritematosa (presença de eritema de mucosa e/ou

atrofia de papilas do dorso da língua); c) hiperplásica (placas brancas que são

removidas apenas por leve abrasão); estomatite induzida por dentadura

(consiste em eritema granular confinado à área de palato duro recoberto pela

dentadura e muitas vezes associado à queilite angular. Essa estomatite está

presente em 65% dos portadores de dentaduras).

Essas lesões podem ser assintomáticas ou produzir dor, sensação de

queimação na língua, alteração do gosto, impedimento de fala e deglutição e

pertubação da qualidade de vida (WANNMACHER; FERREIRA, 2007).

Dentre os microrganismos evolvidos com infecções fúngicas superficiais

da mucosa bucal, C. albicans representa o mais frequente. Entretanto, outras

espécies contribuem para o desenvolvimento da doença, como Candida

tropicalis e Candida krusei.

3.2 Terapia antifúngica

A abordagem medicamentosa para tratamento da candidíase inclui

agentes antifúngicos tópicos e sistêmicos (WANNMACHER; FERREIRA, 2007).

As três principais classes de antifúngicos usados, atualmente, no tratamento da

candidíase são os polienos (como nistatina e anfotericina B), os imidazóis

(como clotrimazol e miconazol) e os triazóis (como o fluconazol e itraconazol)

(PAIVA et al., 2009).

Considerando que a candidíase bucal é uma infecção superficial,

geralmente, o tratamento inicial é feito com um agente tópico. Nistatina e

miconazol são as drogas de escolha inicial. Caso a terapêutica tópica não

26

apresente resultados, é iniciado o tratamento sistêmico, sendo o fluconazol a

droga mais prescrita (PAIVA et al., 2009).

A nistatina é um antifúngico extraído de culturas de Streptomyces, foi

descoberta em 1950 e é utilizada há mais de 50 anos na terapêutica. Seu uso é

fortemente influenciado pelo aumento do número de indivíduos

imunocomprometidos (casos de candidíase em pacientes com neoplasias,

AIDS e outros problemas sistêmicos) (TAVARES, 2001; SHIP; VISSINK;

CHALLACOMBE, 2007).

Ela pertence ao grupo dos polienos, classe de substância que se

caracteriza pela presença de átomos de carbono com dupla ligação, e mais

especificamente, aos grupos dos tetraenos, que são polienos com quadro

duplas ligações não saturadas em sequência. Devido a presença de grupos

carboxílicos e amino, que se encontram carregados em pH fisiológico, a

nistatina é considerada uma molécula anfotérica (CROY; KNOW, 2004;

KATZUNG, 2006).

Figura 2. Estrutura química da nistatina (Fonte: SILVA et al., 2003)

No que se refere ao mecanismo de ação, de forma geral, os antifúngicos

imidazólicos e nistatina bloqueiam a síntese do ergosterol, promovendo

defeitos na membrana celular e alterando padrões de permeabilidade, o que

proporciona a morte da célula (WANNMACHER; FERREIRA, 2007).

O aumento da permeabilidade da membrana plasmática, proporcionado

pela nistatina, ocorre devido à formação de canais transmembranares, que

proporcionam a saída de água e íons essenciais, como potássio, amônio,

27

magnésio e fosfato, além de perdas de açúcares, ésteres de fosfato e

nucleotídeos (TAVARES, 2001; CROY; KNOW, 2004; SILVA et al., 2006).

A nistatina também se liga, em menor proporção, ao colesterol presente

na membrana plasmática, promovendo efeitos tóxicos nas células. Por este

fato, ela não é administrada por via parenteral, já que é capaz de promover

hemólise, necrose e abscesso no local da injeção, devido sua ligação à

membrana plasmática das hemácias (TAVARES, 2001; CROY; KNOW, 2004;

KATZUNG, 2006; SILVA et al., 2006).

Devido a este fato, a nistatina é empregada para uso tópico, mesmo

quando utilizada por via oral, buscando-se um efeito superficial na mucosa oral

ou disgestiva (FARAH; ASHMAN; CHALLACOMBE, 2000; TAVARES, 2001;

KATZUNG, 2006).

No tratamento da candidíase orofaríngea, a nistatina se apresenta na

forma de suspensão oral contendo 100.000 UI da droga em cada mL, e deve

ser administrada 3 a 4 vezes ao dia. O paciente deve bochechar o

medicamento por alguns minutos e em seguida deglutí-lo (GILMAN;

HARDMAN; LIMBIRD, 2003).

Bergendal e Isacsson (1980) avaliaram o efeito da nistatina no

tratamento de 48 pacientes com candidíase, que fizeram uso de nistatina três

vezes ao dia durante 14 dias. Os pacientes foram examinados em três

ocasiões distintas, a primeira no início do experimento, a segunda 14 dias após

o início do tratamento e no 28º dia após a suspensão do tratamento. Os

resultados apresentados demonstraram a redução dos aspectos clínicos de

inflamação após os 14 dias de tratamento, porém no 28º dia notou-se a

recorrência dos sinais de inflamação iguais aos encontrados anteriormente ao

tratamento.

Blomgren, Berggren e Jontell (1998) compararam a eficácia clínica do

fluconazol e nistatina no tratamento de 60 pacientes portadores de candidíase

oral. Foram realizados exames clínicos aos sete e vinte e um dias após o

exame inicial, e mensalmente nos seis meses seguintes. Os autores

28

concluíram que não houve diferença nos resultados dos tratamentos com os

dois fármacos, porém a aceitação do fluconazol pelos pacientes foi melhor.

A nistatina tem sido proposta para o tratamento e profilaxia de infecções

fúngicas invasivas em pacientes imunodeprimidos. Em revisão sistemática,

onde foram incluídos 12 estudos (total de 1464 pacientes) que realizaram

experimentos clínicos randomizados que compararam a nistatina com o

fluconazol, anfotericina B e grupo controle não tratado (placebo), os autores

verificaram que o efeito da nistatina na colonização fúngica foi similar àquele

observado para o controle (RR=0,65), não houve diferença estatística

significante entre nistatina e fluconazol sobre a mortalidade dos pacientes e

que o fluconazol foi mais eficaz em impedir a infecção fúngica sistêmica

(RR=0,37). A partir dos dados observados o estudo indica que a nistatina não

deve ser recomendada para tratamento e profilaxia de infecções fúgicas em

pacientes imunocomprometidos (GOTZSCHE; JOHANSEN, 2002).

Em outra revisão sistemática onde foram incluídos 12 ensaios clínicos

controlados e randomizados envolvendo 1606 pacientes, foi verificado que para

profilaxia de infecções fúngicas sistêmicas em pacientes susceptíveis o

fluconazol deve ser prescrito (PLAYFORD et al., 2006).

Ainda na perspectiva da profilaxia de infecções fúngicas, uma revisão

sistemática que avaliou o efeito da nistatina e miconazol (agentes tópicos) na

prevenção de infecções fúngicas sistêmicas em recém-nascidos de baixo peso

identificou apenas 3 estudos clínicos, que apresentaram várias limitações

metodológicas, como ausência de randomização, falta de critérios para

alocamento da amostra, ausência de cegueira na intervenção e avaliação dos

resultados. Diante disso, os autores indicam que existe uma redução no risco

de desenvolvimento de infecções fúngicas sistêmicas nos recém-nascidos

tratados com antifúngicos tópicos. Entretanto, os resultados devem ser

analisados de forma cautelosa, considerando as limitações metodológicas

identificadas nos estudos avaliados (AUSTIN; DARLOW; MCGUIRE, 2009).

No que se refere à eficácia clínica da nistatina para tratamento de

candidíase oral, uma revisão sistemática de ensaios clínicos randomizados

publicados entre 1966 e 2000, 12 estudos foram considerados e sugerem

evidência para eficácia do tratamento de infecções fúngicas orais em pacientes

29

HIV-positivos com a utilização da nistatina, clotrimazol, fluconazol, cetoconazol

e itraconazol (PATTON; BONITO; SHUGARS, 2001).

O miconazol também é utilizado para tratamento das infecções fúngicas

superficiais. Sua atividade contra fungos, incluído Candida spp., é comparável

aos efeitos promovidos pela nistatina (SAWYER et al., 1975).

Figura 3. Estrutura química do miconazol (Fonte: KATZUNG, 2006).

Cardozo et al. (2001) avaliaram a eficácia clínica do miconazol na forma

de gel (Daktarin®) no tratamento de estomatite protética induzida por Candida

em 10 pacientes, que fizeram uso do medicamento quadro vezes ao dia,

durante 21 dias. O estudo indicou que miconazol na forma de gel promove

efetiva redução em todos os casos de infecção fúngica, quando comparada ao

grupo controle, formado por pacientes que não fizeram uso de nenhum

medicamento.

Um estudo clínico controlado randomizado (n=180 pacientes) que teve

como objetivo comparar o cetoconazol sistêmico (400 mg/dia) ao miconazol

mucoadesivo de liberação lenta (10 mg, 1 vez ao dia), foi verificado que em 7

dias a resposta clínica dos dois medicamentos foi semelhante. Entretanto,

associou-se maior ocorrência de reações adversas ao cetoconazol de

utilização sistêmica (VAN ROEV et al., 2004).

Em estudo clínico, randomizado, multicêntrico, comparativo e

classificado como fase III, que teve o objetivo de verificar a eficácia e

segurança de comprimidos mucoadesivos de miconazol (50 mg) com o gel de

miconazol (500 mg) no tratamento de candidíase oral em pacientes submetidos

30

a radioterapia para tratamento do câncer, os autores verificaram que ambos

medicamentos são capazes de tratar a infecção (p<0,0001) (BENSADOUN et

al., 2008).

Como dito anteriormente, a colonização fúngica, especialmente por C.

albicans, em pacientes em mucosa oral de usuários de próteses dentárias,

verifica-se com frequência a infecção, conhecida como estomatite protética.

Para combater tal infecção é proposta, além dos antifúngicos de uso superficial

(nistatina e miconazol) aqui descritos, a utilização de outros agentes químicos,

como hipoclorito de sódio e ácido acético, que são utilizados para emergir as

peças protéticas com a finalidade de desinfecção das mesmas (WEBB;

THOMAS; WHITTLE, 2005; AZUMA et al., 2006; ANDRADE, 2008).

3.3 Limitações dos antifúngicos sintéticos

A resistência fúngica aos agentes terapeuticamente disponíveis vem

aumentando como consequência do crescimento da população

imunocomprometida e do uso cada vez mais frequente de profilaxia e auto-

medicação (WANNMACHER; FERREIRA, 2007). A diminuição da

susceptibilidade de espécies de C. albicans e não-albicans foi inicialmente

relatada em 1970 em pacientes com candidíase mucocutânea crônica com

repetidos e prolongados tratamentos (RAUTEMAA et al., 2007).

O diagnóstico tardio e o relativo número reduzido de classes de

antifúngicos terapeuticamente disponíveis favorecem a mortalidade, que é

atribuída às infecções sistêmicas. Aliado a isso, a resistência fúngica aos

agentes disponíveis torna-se um problema para alguns grupos de pacientes,

especialmente os imunocomprometidos (CANNON et al., 2009).

Na terapia antifúngica de infecções mucocutâneas por via sistêmica, o

cetoconazol foi um dos primeiros a torna-se disponível. Entretanto, com pouco

tempo de introdução desse agente na terapêutica, as experiências clínicas

indicaram aumento na CIM necessária para realização de tratamentos

prolongados. Quanto ao fluconazol, tem sido observado que os portadores de

HIV/AIDS tratados para candidíase orofarígea com envolvimento esofágico

apresentam-se, com frequência, resistentes a este agente antifúngico (SMITH

31

et al. 1986). Em estudo que avaliou 168 amostras clínicas de candidíase oral

crônica foi verificado que 31,4% apresentaram-se resistente ao fluconazol (CIM

de 19,5 mg/mL) (RAUTEMAA et al., 2007).

Smith et al. (1986) apontam que o estudo da resistência das espécies de

Candida frente aos antifúngicos disponíveis deve levar em consideração:

condições clínicas dos pacientes (imunossupressão, possibilidade de interação

medicamentosa, presença de abscessos e cateteres); terapia antifúngica

(droga, dose, duração, via de administração); análise micológica antes e após o

tratamento e o método utilizado para diagnóstico.

Outro fator que pode contribuir para o desenvolvimento de resistência

fúngica é a necessidade de uso prolongado dos agentes antifúngicos. Em

estudo que avaliou a terapia antifúngica para tratamento de candidíase

orofaríngea em 61 pacientes imunocomprometidos, foi verificado que a duração

da terapia com clotrimazol, cetoconazol e fluconazol, variaram de,

respectivamente, 3 a 240, 11 a 44 e 7 a 138 dias (FAN-HAVARD et al., 1991).

Segundo Andes et al. (2006), doses administradas frequentemente

tendem a impedir a seleção de células resistentes aos antifúngicos. Em

contrapartida, regimes posológicos prolongados parecem contribuir para o

desenvolvimento de resistência.

Diante do evidente crescimento do número de patógenos resistentes aos

antimicrobianos atualmente utilizados na clínica, existe uma clara e emergente

necessidade de introduzir novos agentes antimicrobianos no arsenal

terapêutico (KHAN et al., 2009). No que se refere à resistência de cepas de

Candida aos antifúngicos sintéticos azóis, como fluconazol, miconazol e

intraconazol, diversos mecanismos contribuem para o fenômeno de resistência,

entre eles destacam-se: a superexpressão ou mutação do gene ERG11, que

codifica a enzima alvo dos azóis, a lanosterol 14-α-desmetilase (MARICHAL et

al., 1999); a superexpressão de genes CDR1, CDR2 e MDR1 que codificam

bombas de efluxo (PRASAD, 1995; WHINTE et al., 1998; BASSO et al., 2010;

MANOHARLAL et al., 2010); alterações do gene ERG-3 que codifica a enzima

∆5.6 esterol dessaturase, importante na síntese do ergosterol (HOWELL;

MALLET; NOBLE,1990), bem como alterações na composição lipídica da

membrana plasmática fúngica, o que dificulta o influxo do fármaco na célula

32

(LÖFFLER; EINSELE; HEBERT, 2000). Ressalta-se que estes mecanismos

podem ocorrer simultaneamente, contribuindo para ampliar o fenômeno de

resistência.

Segundo Sanglard et al., (1995), a superexpressão do gene BENr, que

codifica a bomba de efluxo, está intimamente relacionada ao mecanismo de

resistência aos agentes antifúngicos azóis apresentado pela C. albicans

isoladas de pacientes com HIV/AIDS.

Para Martel et al., (2010), isolados clínicos de C. albicans podem

apresentar resistência aos azóis (fluconazol, itraconazol, voriconazol,

cetoconazol e clotrimazol) e anfotericina B devido mutação dos genes ERG11

e ERG5, mesmo na presença de inibição de bombas de efluxo. O estudo

mostra que esses genes também estão envolvidos na produção do ergosterol,

alvo para as drogas estudadas. Dunkel et al. (2008) relatam que a expressão

do ERG11 e outros genes envolvidos com a biossíntese do ergosterol depende

da superexpressão do fator de transcrição UPC2P.

Segundo Pozzati et al., (2008), os mecanismos de resistência de

Candida spp. aos azóis podem ser explicados resumidamente da seguinte

forma: o gene EGR11 codifica a enzima alvo para ação do fármaco, lanosterol

14α-demetilase. Assim, quando esse gene sofre mutação, a enzima alvo passa

a não ser reconhecida pelos azóis. Além disso, em células resistentes observa-

se um aumento expressivo na expressão dos genes CDR e MDR que codificam

bombas de efluxo. Mutações em genes que codificam outras enzimas

envolvidas na via da biossíntese do ergosterol, como o ERG3, podem também

contribuir para a resistência.

O conhecimento dos mecanismos genéticos envolvidos com a

resistência de cepas de C. albicans fomenta o desenvolvimento de drogas que

possam atuar em outros alvos celulares.

3.4 Produtos naturais

Há muito tempo os produtos de origem natural são utilizados no mundo

inteiro pela terapêutica alternativa. Estima-se que as comunidades locais

utilizam cerca de 10% das plantas nativas com fins terapêuticos. Entretanto,

33

apenas 1% dos produtos utilizados ganha reconhecimento científico (KHAN et

al., 2009).

Sartorato et al. (2004) destacam que o uso de plantas medicinais é uma

prática rotineira nos países em desenvolvimento, especialmente na África, Ásia

e América Latina, onde existe uma necessidade de utilização da medicina

popular com solução alternativa para problemas de saúde.

Considerando a perspectiva de obtenção de novos fármacos, os

produtos naturais se diferenciam dos sintéticos sob o aspecto da diversidade

molecular. Sabe-se que a diversidade molecular dos produtos de origem

natural é muito superior àquela derivada dos processos de síntese, que, apesar

dos avanços consideráveis, é ainda limitada. Isso proporciona a elaboração de

diversos novos fármacos com funções terapêuticas diversificadas (NISBET;

MOORE, 1997).

No Brasil, país com vasta biodiversidade, experiências atreladas ao

conhecimento popular aproximam a utilização de produtos naturais aos

recursos terapêuticos disponíveis, sendo, inclusive, esta prática recomendada

pelo poder público (ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006). Em 3 de maio de

2006, o Ministério da Saúde, através da Portaria nº 971, aprovou a Política

Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no âmbito do

Sistema Único de Saúde (SUS) (BRASIL, 2006).

Em 2007, O Ministério da Saúde do governo brasileiro lançou a Política

Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF), que visa garantir à

população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e

fitoterápicos, e tem como alguns dos seus objetivos: inserir plantas medicinais,

fitoterápicos e serviços relacionados à fitoterapia no SUS, desenvolver

instrumentos de fomento à pesquisa, desenvolvimento de tecnologias e

inovações em plantas medicinais e fitoterápicos, nas diversas fases da cadeia

produtiva, promover e reconhecer as práticas populares e tradicionais de uso

de plantas medicinais, fitoterápicos e remédios caseiros, bem como

estabelecer uma política intersetorial para o desenvolvimento socioeconômico

na área de plantas medicinais e fitoterápicos (BRASIL, 2007).

34

O documento supracitado apresenta como diretriz o incentivo a

formação e a capacitação de recursos humanos para o desenvolvimento de

pesquisas, tecnologias e inovação em plantas medicinais e fitoterápicos. Para

tanto, reconhece-se a importância do apoio a qualificação técnica dos

profissionais da saúde, e demais envolvidos na produção e uso desses

produtos (BRASIL, 2007).

Essa política de atuação governamental visa enfrentar os empecilhos

para a utilização dos produtos naturais apontados por Oliveira, Oliveira e Diniz

(1997), que levantaram a problemática do desconhecimento dos profissionais

de saúde sobre as indicações e cuidados no uso de plantas medicinais. Do

ponto de vista dos usuários dos serviços de saúde, Ness, Sherman e Pan

(1999) retratam que as plantas medicinais são vistas apenas como uma

alternativa aos elevados custos dos medicamentos convencionais e não como

opção terapêutica devido às suas propriedades curativas das plantas.

Para Borba e Macedo (2006), existe uma clara necessidade de

minimizar a distância entre a técnica e pesquisas científicas das tradições e

crenças populares, proporcionando uma valorização dos conhecimentos

populares, agregando-lhes comprovação científica e, permitindo, assim,

divulgação à população em geral de conhecimentos úteis, antes utilizados

apenas in loco, valorizando tanto a cultura quanto a ciência de um povo.

A escolha da planta para utilização em estudos que avaliam suas

propriedades farmacológicas é feita considerando o uso terapêutico, o estudo

etnobotânico, a presença de determinadas substâncias ou de acordo com a

sua disponibilidade (MACIEL; PINTO; VIEGA, 2002). A abordagem

etnofarmacológica consiste em associar informações obtidas junto as

comunidades locais que utilizam a flora medicinal com estudos químicos e

farmacológicos desenvolvidos em laboratórios especializados (ELISABETSKY;

SOUZA, 2007).

Em pesquisa realizada na cidade de João Pessoa, Paraíba, Brasil, com

o objetivo de realizar um estudo etnobotânico sobre a indicação de plantas

medicinais para tratamento de patologias bucais feita por raizeros e usuários

35

dos serviços odontológicos do serviço público, foi verificado que, na maioria

dos casos, as plantas utilizadas são nativas da flora regional, sendo a Punica

granatum L. (Romã) a mais citada (SANTOS et al., 2009).

Em outro estudo realizado na cidade de Santa Cruz, Mato Grosso,

Brasil, Borba e Maciel (2006) verificaram que, para tratamento e prevenção de

afecções bucais, os habitantes locais citaram 87 espécies nativas do bioma

nativo, estando a Matricaria chamomilla (camomila), Crocus sativus (açafrão) e

Brickelia brasiliensis (arnica-da-serra), entre as lembradas.

Alguns extratos de plantas e metabólitos secundários possuem efeitos

inibitórios e letais dose-dependentes sobre diferentes microrganismos (SMITH-

PALMER; STEWART; FYFE, 1998). Dentre as substâncias extraídas, tomam

destaque os óleos voláteis, que em sua maioria evidencia forte atividade

antibacteriana e antifúngica, atribuídas a presença de monoterpenos, que

representam cerca de 90% dos compostos presentes (POZZATI, 2007;

SIMÕES et al., 2007).

Do ponto de vista das funções biológicas dos óleos essenciais, Harbone

(1993) aponta a existência de funções ecológicas, especialmente como

inibidores da germinação, na proteção contra predadores, na atração de

polinizadores, na proteção contra aumento de temperatura, entre outras. Em

relação às atividades farmacológicas, destacam-se a ação carminativa,

antiespasmódica, estimulante sobre secreções do aparelho digestivo, ação

cardiovascular (aumento do ritmo cardíaco), atividade secretora do epitélio

respiratório, ações sobre o SNC (estimulantes ou depressoras), ação

anestésica local, antiinflamatória e anti-séptica (SIMÕES et al., 2007).

Como reportado anteriormente, a literatura tem evidenciado que os óleos

essenciais apresentam expressiva atividade antifúngica (CHAMI et al., 2004;

GIORDANI et al., 2004; DUARTE et al., 2005; PEREIRA, 2009; CASTRO;

OLIVEIRA, 2010). Palmeira-de-Oliveira et al. (2009) realizaram ampla revisão

da literatura e observaram que a atividade anti-Candida de óleos essenciais

vem sendo extensivamente investigada na tentativa de disponibilizar

alternativas terapêuticas para o tratamento da candidíase. Entretanto, os

36

mecanismos de ação desses compostos e seus constituintes não estão

totalmente elucidados. Especula-se que a maioria dos óleos essenciais exerça

sua atividade antimicrobiana através de modificações na estrutura da parede

celular do microrganismo, aumentando a permeabilidade da membrana

citoplasmática, promovendo a deterioração de processos essenciais à

sobrevivência da célula. Sugere-se também que o rompimento da parede

celular deva-se ao caráter lipofílico (presença de monoterpenos) dos óleos

essenciais, que se acumulam nas membranas (COWAN, 1999; DORMAN;

DEANS, 2000; LAMBERT et al., 2001). Pozzatti (2007) refere-se, ainda, que a

ação antimicrobiana dessas substâncias pode ocorre devido à inativação de

algumas enzimas, incluindo as envolvidas na produção de energia e síntese de

componentes estruturais.

Diante do exposto, evidencia-se que novas pesquisas para avaliar a

atividade antifúngica de óleos essenciais apresentam perspectivas positivas,

representando possibilidades de obtenção de novos fármacos que sejam

utilizados no tratamento contra agentes infecciosos ou outras doenças.

3. 5 Cinnamomum zeylanicum

Cinnamomum zeylanicum, conhecida popularmente como canela, é uma

planta que pertence a família Lauraceae. Trata-se de uma árvore que

apresenta aproximadamente 10-15 m de altura, tem folhas com formato oval-

longo e flores que florescem em pequenos maços, com cor esverdeada e odor

característico.

A família Lauraceae pertence à divisão Magnoliophyta, sendo

considerada uma das famílias mais antigas. As Lauraceae apresentam-se

amplamente distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do planeta, sendo

formadas por 49 gêneros e 2500 a 3000 espécies.

Essa família destaca-se das demais pela sua importância econômica.

Algumas espécies têm sido utilizadas pela indústria para a fabricação de

diversos produtos. Porém, a maioria das espécies tem seu uso restrito às

comunidades tradicionais que detêm o conhecimento empírico da utilização

dessas plantas (MARQUES, 2001).

37

O gênero Cinnamomum contém cerca de 250 espécies, que se

caracterizam por serem arbustos e árvores de pequeno a médio porte. As

espécies são encontradas em florestas tropicais onde crescem em montanhas

e planícies em solos bem drenados. Nas latitudes com circunstâncias

climáticas sazonais, tornam-se excessivamente raras (JANTAM et al., 2003;

JANTAN et al. 2008).

Esse gênero ocorre principalmente no sudeste e na Ásia oriental,

especialmente na Malásia. C. zeylanicum, C. loureirri, C. burmanni e C. cassia

são as espécies mais estudadas e utilizadas pela população. O óleo essencial

obtido das cascas é utilizado como condimento alimentar, na perfumaria e em

preparações farmacêuticas. O óleo da folha do C. zeylanicum apresenta

expressiva quantidade de eugenol (REYNOLDS, 1993).

Marques (2001) destaca que as Lauraceae, incluindo C. zeylanicum,

apresentam, na medicina popular, diferentes funções contra diversas doenças

e que o óleo essencial, armazenado em células secretoras encontradas na

folha e caule, representa um dos principais produtos responsáveis pelas

atividades farmacológicas. Na Europa, o óleo essencial obtido da casca dessa

planta vem sendo utilizado no controle da glicemia em pacientes portadores de

diabetes tipo II (MEADES et al., 2010).

Em relação a estas atividades, as propriedades antimicrobianas,

incluindo a antifúngica, do óleo essencial obtido do C. zeylanicum vêm sendo

amplamente estudadas por diversos pesquisadores (LIMA et al.,1993; BELÉM,

2002; BONJAR; AGHIGHI; KARIMI, 2004; MOREIRA, et al., 2007; ATAYDE et

al., 2008; BANSOD; RAI, 2008; JANTAM et al., 2008; KAHN et al., 2009;

PUANGPRONPITAG; SITTIWET, 2009).

Quale et al (1996) avaliaram a atividade in vitro do óleo essencial de C.

zeylanicum sobre isolados de Candida susceptíveis e resistentes ao fluconazol,

sendo encontradas concentrações inibitórias mínimas (CIM) que variaram entre

0,05 a 30 mg/mL. Esses resultados, segundo os autores, sugerem a realização

de estudos clínicos para tratamento de candidíase de mucosa bucal.

38

De forma semelhante, Pozzatti (2007) avaliou in vitro a atividade

antifúngica do óleo essencial de C. zeylanicum sobre isolados de Candida

comprovadamente susceptíveis e resistentes ao fluconazol. A autora verificou

que o produto testado apresentou CIM e Concentração Fungicida Mínima

(CFM) que variaram entre 200 a 1600 e 800 a 1600 µg/mL, respectivamente.

Carmo et al (2008) verificaram a interferência do óleo essencial C.

zeylanicum sobre o crescimento e morfogênese de algumas espécies de

Aspergillus potencialmente patogênicas. O produto testado apresentou potente

efeito antifúngico demonstrado pela visualização de grandes zonas de inibição

de crescimento de todas as linhagens testadas. Os valores de CIM50 e de

CIM90 foram 40 e 80 µL/mL, respectivamente. Nas concentrações de 80, 40 e

20 µL/mL o óleo demonstrou um significativo efeito fumigante, inibindo o

crescimento micelial radial de A. niger, A. flavus e A. fumigatus ao longo de 14

dias de exposição. A 80 e 40 µL/mL o óleo essencial promoveu inibição de

100% da germinação de esporos, das três espécies de Aspergillus.

Além do óleo essencial do C. zeylanicum, extratos obtidos dessa

espécie vegetal podem apresentar expressiva atividade antifúngica. Mishra et

al. (2009) verificaram que extratos obtidos em diferentes solventes foram

capazes de inibir crescimento de Alternaria solani e Curvularia lunata,

consideras espécies fúngicas capazes de promover infecções dermatológicas.

Lima et al. (2006) verificaram a atividade antifúngica do óleo essencial

de C. zeylanicum sobre 12 cepas de Candida, entre elas C. albicans, C.

guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. stellatoidea e C. tropicalis a partir

da técnica de difusão em meio sólido. Os autores puderam identificar que o

óleo avaliado apresentou destacáveis resultados, uma vez que houve inibição

de crescimento de 58% das cepas ensaiadas e CIM de 4%.

Quale et al. (1996) relata que o óleo essencial de C. zeylanicum

apresenta CIM que pode variar entre 0,03 a 0,5 mg/L sobre isolados clínicos de

Candida resistentes ao fluconazol. Resultados semelhantes foram observados

por Pozzatti et al. (2008).

39

Schmidt et al (2007) avaliaram a atividade antifúngica dos compostos

químicos presentes no óleo essencial de C. zeylanicum. Os autores verificaram

que o referido óleo inibe crescimento de cepas de Candida e que o eugenol,

composto majoritário do produto, apresenta expressiva atividade antifúngica.

Entretanto, os compostos minoritários presentes no óleo participam

decisivamente na atividade anti-Candida.

Em relação à composição química do óleo essencial de C. zeylanicum,

as pesquisas indicam que o eugenol é o principal componente do óleo

essencial de C. zeylanicum (SENANAYAKE; LEE; WILLS, 1978; LORENZI;

MATOS, 2003; POZZATTI, 2007).

Ressalta-se que apesar de todos os órgãos de uma planta poderem

acumular óleos essenciais, sua composição química, características físico-

químicas e odores podem variar segundo sua localização, adubação, solo e

clima. Embora controlada geneticamente, a biossíntese dos constituintes de

uma planta é fortemente afetada pelo ambiente, colheita e pós-colheita,

precipitação pluviométrica, temperatura, luminosidade e umidade (SARMAR;

TRIPATHI, 2008).

O eugenol pertence a um grupo de compostos constituintes de óleos

essenciais originados a partir da redução da cadeia lateral dos ácidos

cinâmicos, que por sua vez são derivados da fenilalanina. Esses compostos

também estão presentes em Syzygium aromaticum (cravo-da-índia), Pimpinella

anisum (erva doce), Foeniculum vulgare (funcho) e Illicium verum (anis-

estrelado) (SIMÕES et al., 2007).

Meades et al. (2010) sugerem que a atividade antibacteriana do óleo

essencial obtido das cascas do C. zeylanicum pode ser decorrente da ação do

Trans-cinamaldeído, composto encontrado em grande quantidade no produto.

Segundo os autores, essa substância pode interagir com Acetil-CoA

Carboxilase das bactérias, provendo sua morte.

Ressalta-se que o estudo da atividade antimicrobiana dos produtos

naturais, incluindo óleos essenciais, deve está, preferencialmente, associado a

análise química dos referidos produtos. Esta prática proporciona identificar as

40

principais substâncias presentes, o que pode sugerir provável atividade

biológica das mesmas.

3. 6. Associação de drogas antifúngicas

O estudo de efeitos interativos entre moléculas tem uma longa história.

Para as drogas antimicrobianas, o uso de duplas ou triplas combinações tem

início com a realização de estudos in vitro que indicam interações positivas

capazes de promover a inibição do crescimento dos microrganismos. Existem

vários modelos experimentais que mensuram os efeitos de combinações de

drogas. Um dos protocolos mais simples e conhecido é o teste chequerboard,

que proporciona uma disposição bidimensional de concentrações diferentes

das substâncias avaliadas. Esse teste permite o cálculo do índice de

Concentração Inibitória Fracionada (CIF) (ODDS, 2003).

Segundo Cuenca-Estrella (2004), os compostos antifúngicos associados

podem promover maior eficácia de cada droga, permitindo, assim, a utilização

de menores doses de cada droga. Para o autor, o método chequerboard e a

curva de morte microbiana são frequentemente utilizados na avaliação in vitro

da atividade de antimicrobianos combinados.

Existem vários mecanismos envolvidos com a atividade sinérgica com a

combinação de antifúngicos: a) inibição de diferentes estágios nas vias

bioquímicas intracelulares fúngicas essenciais a sobrevivência celular; b)

aumento da penetração do agente antifúngico proporcionada pela ação de

outro antifúngico na membrana celular fúngica. Essa interação pode ser

observada com a interação entre anfotericina B ou fluconazol e rifamicina; c)

inibição de proteínas carreadoras. Por exemplo: a anfotericina B inibe a ação

de proteínas de membrana plasmática que teriam a função de promover a

extrusão de flucitocina, que por sua vez permanece no interior da célula e

exerce seu efeito; d) inibição de diferentes alvos celulares simultaneamente.

Esse efeito pode ser observado em drogas que exercem o efeito sobre a

parede celular e outra que atua sobre a membrana plasmática (JOHNSON et

al., 2004).

41

O estudo e a descoberta de produtos naturais com princípios ativos que

apresentem atividade antimicrobiana intrínseca ou combinada com

antibióticos/antifúngicos de uso comum podem representar uma nova forma de

fazer frente aos microrganismos multiresistentes, além de impedir o contato

destes microrganismos com os produtos sintéticos, diminuindo o risco de se

selecionar novos ou melhores mecanismos de resistência. Dessa forma, pode-

se direcionar a indústria farmacêutica de forma a favorecer a produção e o uso

de fitoterápicos como adjuvantes de determinados tratamentos contra agentes

infecciosos ou outras doenças (COUTINHO, 2008).

Zago et al. (2009) destacam a possibilidade do uso de produtos naturais

combinados aos antimicrobianos tradicionais, no intuito de aumentar a

atividade antimicrobiana das drogas. Estes autores relatam que mesmo

produtos naturais que apresentam um efeito antimicrobiano não tão eficiente,

quando associados a produtos sintéticos apresentam sinergismo.

Nascimento et al. (2007) ressaltam que o uso associado de plantas

medicinais e/ou seus subprodutos concomitante ao uso de medicamentos

convencionais podem atuar inibindo, intensificando os efeitos terapêuticos dos

medicamentos ou não interferindo na resposta esperada.

Oliveira et al. (2006) afirmam que tal uso associado em ocasiões

especiais, como na dermatologia, plantas e seus subprodutos juntamente com

os medicamentos convencionais colocam o paciente muitas vezes em risco, já

que pode desencadear fitodermatoses decorrentes de mecanismos de irritação

ou fotossensibilidade.

A associação de produtos naturais a antimicrobianos convencionais tem

sido reportada por alguns autores (NASCIMENTO et al., 2007; COUTINHO et

al., 2009a; COUTINHO et al., 2009b; COUTINHO et al., 2009c; GAMARRA et

al., 2010; ZHAI et al., 2010). Coutinho et al. (2009a) observaram que a

associação do extrato de Hyptis martiusii Benth (cidreira–do-campo) a

clopromazina promove efeito sinérgico sobre cepas de Escherichia coli

resistente a aminoglicosídeos. Coutinho et al. (2010) também observaram que

essa combinação inibe crescimento in vitro de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina.

42

A atividade da combinação do produto de origem natural e antifúngico

convencional foi avaliada por Shiin e Kang (2003). Esses autores avaliaram a

atividade fungitóxica do óleo essencial de Agastache rugosa isolado e

associado ao cetoconazol sobre Blastoschizomyces capitatus, sendo

observada atividade sinérgica dos produtos avaliados sobre o microrganismo.

A associação do beberine, alcalóide presente na Hydrastis canadensis,

ao fluconazol apresentou sinergismo na atividade fungistática contra 40 cepas

de C. albicans resistentes ao fluconazol obtidas de isolados clínicos. Essa

interação sinérgica foi observada a partir da realização da técnica de

microdiluição, difusão em agar e determinação da curva de morte microbiana

(QUAN et al., 2006).

Observa-se na literatura uma escassez de estudos que retratam a

atividade antimicrobiana de óleo essencial de C. zeylanicum associado a

antimicrobianos convencionais. Nuryastuti et al. (2009) verificaram que o óleo

essencial obtido de Cinnamomum bumanni associado ao triclosan, gentamicina

ou clorexidina apresentou excelente atividade antibacteriana sobre isolados

clínicos de Staphylococcus epidermidis.

Shahverdi et al. (2007) verificaram que a ação combinada do trans-

cinnamaldeído, isolado do óleo essencial de C. zeylanicum, com a clindamicina

foi capaz de promover, in vitro, inibição de crescimento do Clostridium difficile

resistentes a clindamicina. O índice FIC foi de 0,312, confirmando a ação

sinérgica da clindamicina e o trans-cinnamaldeído.

Além da combinação de produtos naturais com antimicrobianos

convencionais, alguns autores sugerem a interação benéfica de dois ou mais

produtos de origem natural. Sukatta et al. (2008) verificaram que a associação

dos óleos essenciais obtidos de espécies de Cinnamomum e Syzygium

aromaticum é capaz de promover inibição de crescimento de Aspergillus niger,

Alternaria alternata, Colletotrichum gloeosporioides, Lasiodiplodia theobromae,

Phomopsis viticola e Rhizopus stolonifer.

43

MATERIAL E MÉTODOS

44

4 MATERIAL E MÉTODOS

4. 1 Local de realização da pesquisa e cepas fúngicas

Os ensaios microbiológicos foram realizados no Laboratório de Micologia

do Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde

da Universidade Federal da Paraíba, que disponibilizou as cepas de C.

albicans LM 42V, C. albicans MD 37, C. albicans ICB 12, C. albicans ATCC

40277, C. albicans ATCC 76845, C. tropicalis ATCC 40042, C. tropicalis LM

759, C. tropicalis ATCC 13803, C. krusei ATCC 40147 e C. krusei LM 120.

4. 2 Óleos essenciais

Os óleos essenciais (Quadro 1) que tiveram a atividade antifúngica

avaliada foram obtidos na Ferquima Ind. e Com. Ltda (Vargem Grande

Paulista, São Paulo, Brasil), sendo seus parâmetros físico-químicos descritos

pelo fornecedor, que produz e comercializa óleos essenciais em escala

industrial. A emulsão do óleo essencial foi obtida seguindo as proporções

sugeridas pelo protocolo recomendado por Allegrini et al. (1973).

Quadro 1. Óleos essenciais utilizados no ensaio para determinação da

atividade anti-Candida.

Espécie Família Nome popular Densidade

g/mL

Citrus reticulata Rutaceae Tangerina Cravo 0,844

Citrus aurantifolia Rutaceae Limão Tahiti 0,868

Cinnamomum zeylanicum Lauraceae Canela Folha 1,040

Matricaria chamomilla Asteraceae Camomila Azul 0,916

Mentha piperita Lamiaceae Menta Piperita 0,899

Eugenia uniflora Myrtaceae Pitanga 0,905

Zingiber officinale Zingiberaceae Gengibre 0,970

45

4.3 Produtos sintéticos

Foram utilizados como controle positivo ou droga padrão a nistatina e

miconazol, ambos adquiridos na Sigma-Aldrich (São Paulo), na forma de pó. As

soluções foram preparadas no momento de execução dos testes, para alcance

da concentração desejada nos testes de sensibilidade.

4.4 Screening para avaliação da atividade antifúngica

O ensaio para determinação da atividade antifúngica dos óleos

essenciais foi realizado pelo método da difusão em meio sólido. Em placas de

Petri estéreis foram adicionados 20 mL de agar Sabouraud Dextrose (ASD)

fundido e resfriado a 45-50ºC. Após solidificação do agar, foi inoculado 1 mL da

suspensão fúngica na concentração de 106 UFC mL-1. Em seguida, discos de

papel de filtro estéreis foram embebidos em 50 µL dos óleos essenciais e

colocados sobre o meio de cultura.

Os resultados foram avaliados a partir da mensuração dos diâmetros

dos halos de inibição de crescimento fúngico em milímetros (mm). O ensaio foi

realizado em duplicata, sendo considerada a média aritmética dos valores

obtidos.

4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) – Técnica da

Microdiluição.

A determinação da CIM do óleo essencial foi realizada através da

técnica da microdiluição proposta por Ellof (1998). Inicialmente, foram

distribuídos 100 µL de caldo Sabouraud dextrose duplamente concentrado nos

orifícios das placas de microdiluição. Em seguida, foram distribuídos 100 µL da

emulsão do óleo essencial, a uma concentração inicial de 5.000 µg/mL, que foi

diluída seriadamente, à partir da retirada de uma alíquota de 100 µL da

cavidade mais concentrada para a cavidade sucessora. Nos orifícios de cada

coluna foram dispensadas alíquotas de 10 µL do inóculo correspondente a

cada cepa ensaiada. Paralelamente, foram realizados controle da viabilidade

das cepas de leveduras ensaiadas. Ainda, foi realizado controle de

46

sensibilidade das cepas ensaiadas frente à ação antifúngica da nistatina e

miconazol, considerados padrões na utilização clínica, sendo ensaiados

através da técnica de microdiluição.

Os ensaios foram realizados em triplicata incubados a 35ºC durante 24-

48 horas. A leitura para determinação da CIM do óleo essencial sobre as cepas

de leveduras foi feita a partir do método visual. Foi levada em consideração a

formação ou não de aglomerados de células (“botão”) no fundo da cavidade da

placa. Dessa forma, considerou-se como CIM, a menor concentração do

produto em teste capaz de produzir inibição visível sobre o crescimento das

cepas de leveduras utilizadas nos ensaios microbiológicos.

Para confirmação da presença de microrganismos viáveis nas

concentrações não inibitórias, foi utilizado o corante TCT (2, 3, 5 trifenil cloreto

de tetrazólio) no volume de 10 µL, que reflete a atividade das enzimas

desidrogenases, envolvidas no processo de respiração celular. Isto torna

possível distinguir as amostras vivas, coloridas de vermelho, daquelas mortas

que mantêm a sua cor (GRABE, 1976; DESWAL; CHAND, 1997).

4.6 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)

Após determinação da CIM, a concentração correspondente à inibitória e

as duas concentrações imediatamente mais concentradas, bem como os

controles positivos foram subcultivadas em placas de agar Sabouraud

dextrose. Após 24 horas de incubação a 30ºC, as leituras das CFMs foram

realizadas com base no crescimento dos controles, sendo considerada CFM a

menor concentração da droga que impediu o crescimento visível do subcultivo.

4.7 Ação do óleo essencial de C. zeylanicum sobre a parede celular

fúngica.

A determinação da CIM do óleo essencial de C. zeylanicum, na

presença do sorbitol (0,8M), foi realizada pela microdiluição, utilizando placas

de microtitulação contendo 96 cavidades, com fundo em forma de “U”

(ALAMAR®) e em triplicata. Em cada orifício da placa, foram adicionados 100

µL do meio líquido CSD previamente adicionado de sorbitol de peso molecular

47

de 132,17 g (VETEC Química Fina Ltda – Rio de Janeiro/RJ), ambos

duplamente concentrados. Posteriormente, 100 µL da emulsão do óleo

essencial, também duplamente concentrado, foram dispensados nas cavidades

da primeira linha da placa. E por meio de uma diluição seriada a uma razão de

dois, foram obtidas concentrações de 10.000 µL/mL até 10 µL/mL do óleo

essencial e, no caso do sorbitol, uma concentração final de 0,8 M em cada

cavidade. Por fim, foram adicionados 10 µL do inoculo das espécies nas

cavidades, onde cada coluna da placa refere-se a uma cepa fúngica,

especificamente.

Um controle de microrganismo foi realizado colocando-se nas cavidades

100 µL do mesmo CSD e sorbitol (0,8M) também duplamente concentrados,

100 µL de água destilada estéril e 10 µL do inoculo de cada espécie. Para

verificar a ausência de interferência nos resultados pelo solvente utilizado na

preparação da emulsão, no caso o Tween 80, foi feito um controle no qual

foram colocado nas cavidades 100 µL do mesmo CSD e sorbitol (0,8 M)

também duplamente concentrados, 100 µL de Tween 80 (10% em água

destilada estéril) e 10 µL da suspensão. Um controle de esterilidade também foi

realizado, onde foram colocados 200 µL do CSD em um orifício sem a

suspensão dos fungos. As microplacas foram semeadas e incubadas a 37ºC

por 48 horas para ser realizada a leitura (FROST et al., 1995; ZACCHINO,

2001).

4.8 Análise química do óleo essencial

A análise do óleo essencial de C. zeylanicum foi realizada no Laboratório

de Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil, por

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM), utilizando

o instrumento QP-5050A com um GC-17A (Shimadzu, Japão) (ADAMS, 2001;

MCLAFFERTY; STAUFFER, 1989).

48

4.9 Testes de sinergismo

4.9.1 Ensaio de sinergismo - Método checkerboard

O efeito combinado das duas substâncias (nistatina ou miconazol e óleo

essencial de C. zeylanicum) estudadas foi determinado a partir da técnica de

microdiluição - checkerboard para derivação do índice de concentração

inibitória fracionada (Índice CIF).

A turbidez das suspensões fúngicas foi comparada e ajustada àquela

apresentada pela suspensão de sulfato de bário do tubo 0,5 da escala

McFarland, a qual corresponde a um inoculo de aproximadamente 106

unidades formadoras de colônias/mL (UFC/mL). Foram utilizadas soluções dos

produtos testados em concentrações determinadas a partir de suas respectivas

CIM. Inicialmente, 100 µL do meio de cultura Saboraud dextrose foram

adicionados nos poços da microplaca estéril contendo 96 cavidades, com fundo

em forma de “U” (ALAMAR®). Em seguida, 50 µL de cada produto testado, em

diversas concentrações (CIM÷8, CIM÷4, CIM÷2, CIM, CIM×2, CIM×4 e CIM×8)

foram adicionados no sentido vertical (nistatina ou miconazol) e horizontal (óleo

essencial) da microplaca, assim como mostra a figura 4. Finalmente, o meio de

cultura foi inoculado com 10 µL da suspensão fúngica. O crescimento fúngico

foi evidenciando pelo uso do corante TCT. O ensaio foi realizado em triplicata,

sendo as microplacas incubadas a 37 ºC por 48 horas (ELIOPOULOS;

MOELLERING, 1991; DUTTA et al., 2004).

O índice FIC foi calculado através da soma do FICA + FICB, onde A

representa o óleo essencial e B o miconazol ou nistatina. O FICA, por sua vez,

é calculado através da relação CIMA combinado/ CIMA sozinho, enquanto que o

FICB = CIMB combinado/CIMB sozinho. Este índice foi interpretado da seguinte

forma: sinergismo (<0,5), aditividade (0,5-1,0), indiferença (>1 e <4) ou

antagonismo (>4,0).

49

Ó

leo

ess

en

cia

l d

e C

. zeyla

nic

um

CIM × 8

CIM × 4

CIM × 2

CIM

CIM ÷ 2

CIM ÷ 4

CIM ÷ 8

CIM ÷ 8 CIM ÷ 4 CIM ÷ 2 CIM CIM × 2 CIM × 4 CIM × 8

Nistatina ou miconazol

Figura 4. Esquema para realização do ensaio de sinergismo pela técnica de

checkerboard.

4.7.2 Estudo do efeito do óleo essencial isolado e associado à nistatina

sobre a cinética do crescimento das leveduras

O estudo da interferência do produto teste (OE de C. zeylanicum)

isolado ou associado à nistatina sobre a viabilidade das cepas fúngicas foi

realizado através do método de contagem de células viáveis. Neste ensaio,

frente às concentrações inibitórias mínimas do OE, bem como, de sua

associação com a nistatina, foi observado o comportamento das cepas de

leveduras selecionadas. Inicialmente, 0,5 mL da suspensão de leveduras foi

inoculado em 4,5 mL de caldo Sabouraud contendo concentrações variadas do

OE, nistatina e associação dos produtos (CIM÷2; CIM; CIM×2; CIM×4 e

CIM×8). Nos intervalos 0, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min e 24 h após a

incubação, uma alíquota de 10 µL desse inóculo foi uniformemente inoculada

em placa de Petri contendo Agar Sabouraud dextrose. Também foi realizado o

experimento controle, com crescimento livre de antifúngico.

As placas inoculadas foram incubadas a 35ºC por 48 horas. Após o fim

do período de incubação, foi realizada a contagem do número de células

viáveis, a qual foi expressa em UFC/mL e apresentada sob a forma de gráfico

da curva de morte microbiana (RASOOLI; MIRMOSTAFA, 2002).

50

4.6.3 Estudo do efeito do óleo essencial isolado e associado à nistatina

sobre a micromorfologia de cepas de C. albicans.

Para observação de alterações morfológicas das cepas de C. albicans

ATCC 40277 foi empregada a técnica do microcultivo para leveduras, utilizando

o meio ágar-arroz em câmara úmida (GUNGI; ARIM; BEPPU, 1983;

KURTZMAN; FELL, 1998).

Considerando os estudos previamente realizados por nós para

determinação das concentrações inibitórias mínimas dos produtos avaliados

sobre a mesma cepa deste estudo (CIM do EO de C. zeylanicum isolado =

312,5 µg/mL; CIM do EO de C. zeylanicum associado = 39 µg/mL; CIM da

nistatina isolada = 64 µg/mL; CIM da nistatina associada = 32 µg/mL), foram

adicionadas quantidades suficientes da emulsão do OE de C. zeylanicum e

nistatina, de forma isolada e associada, ao meio de cultura agar-arroz,

buscando-se a obtenção de variadas concentrações dos produtos no referido

meio (CIM, CIM×2, CIM×4 e CIM×8). Foram depositados 3 mL de ágar-arroz,

associados aos produtos teste, nas respectivas concentrações, fundidos sobre

uma lâmina estéril, contida sobre um suporte (outra lâmina) dentro de uma

placa de Petri. Após solidificação do meio, semeou-se a levedura, com auxílio

de uma agulha em “L”, fazendo 02 estrias paralelas. As estrias foram cobertas

com lamínulas esterilizadas. Para evitar ressecamento do meio, fez-se uma

câmara úmida, acrescentando 2 mL de água destilada sobre um pedaço de

papel de filtro (3x3 cm) estéril na placa, durante o período de incubação. A

placa foi fechada e após 24 h, 48 h e 72 h, examinou-se a preparação em

microscópio óptico. Foi observada em cada lâmina a presença de estruturas

características como pseudo-hifas, blastoconídios e clamidoconídios.

51

RESULTADOS E DISCUSSÃO

52

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO


Candida.

5.2 Anti-candida activity and chemical composition of Cinnamomum zeylanicum

Blume essential oil.

5.3 Combined effect of Cinnamomum zeylanicum Blume essential oil and


5.4 Effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential oil alone

and combined with nystatin on micromorphology of Candida albicans strains.


nystatin on strains of non-albicans Candida.


miconazole on Candida strains.

53

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO


Candida

RESUMO

O propósito desse estudo foi identificar a atividade antifúngica de óleos

essenciais sobre cepas de Candida envolvidas com infecções da cavidade

bucal. Foram avaliados óleos essenciais obtidos a partir das seguintes

espécies vegetais: Citrus reticulata (Tangerina Cravo); Citrus aurantifolia

(Limão Tahiti); Cinnamomum zeylanicum (Canela); Matricaria chamomilla

(Camomila Azul); Mentha piperita (Menta); Eugenia uniflora (Pitanga) e Zingiber

officinale (Gengibre). A determinação da atividade antifúngica foi realizada

utilizando a técnica de difusão em meio de cultura sólido, onde discos de papel

de filtro foram embebidos nos óleos e colocados em placas de Petri contendo

agar Sabouraud Dextrose inoculado com cepas de Candida albicans e C.

tropicalis. Também foi observada a concentração inibitória mínima a partir do

método da microdiluição. Os ensaios foram realizados em duplicata. Foi

observada expressiva atividade antifúngica dos óleos essenciais de C.

zeylanicum, C. aurantifolia e M. piperita, que apresentaram halos com

diâmetros de inibição de crescimento microbiano de até, respectivamente, 48

mm, 30 mm e 19 mm. Ainda foi possível identificar que 66,7% das cepas

ensaiadas mostraram-se resistentes aos óleos essenciais de C. reticulata, M.

chamomilla, E. uniflora e Z. officinale. C. zeylanicum e nistatina apresentaram,

respectivamente, CIMs de 312 µg mL-1 e 32 µg mL-1. Os óleos essenciais

avaliados apresentam atividade antifúngica, sendo os melhores resultados

encontrados para C. zeylanicum. Sugere-se a realização de outros ensaios

para avaliação de atividade anti-Candida desse óleo essencial, que pode

apresentar-se como possível agente terapêutico no tratamento de infecções

fúngicas da cavidade bucal.

54

SCREENING DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CEPAS DE Candida1

SCREENING OF ESSENTIAL OILS ANTIFUNGAL ACTIVITY ON Candida

STRAINS

Ricardo Dias de Castro, Aluno do Curso de Doutorado Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos (Farmacologia) da UFPB, Professor Assistente do

Departamento de Clínica e Odontologia Social, Universidade Federal da

Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brasil. [email protected]

Edeltrudes de Oliveira Lima, Doutora, Professora Associada do Departamento

de Ciências Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa,

Paraíba, Brasil. [email protected].

Autor para correspondência

Ricardo Dias de Castro

Departamento de Clínica e Odontologia Social. Centro de Ciências da Saúde.

Universidade Federal da Paraíba, Campus Universitário I, Cidade Universitária,

João Pessoa, Paraíba. CEP: 58059-900.

Telefone: (83) 9317-1071

E-mail: [email protected]

1 Artigo aceito para publicação na Pesquisa Brasileira em Odontopediatria e Clínica Integrada. DOI:

10.4034/1519.0501.2008.0082.0020

mailto:[email protected]

55

SCREENING DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CEPAS DE Candida

SCREENING OF ESSENTIAL OILS ANTIFUNGAL ACTIVITY ON Candida

STRAINS

Resumo

Objetivo: O propósito desse estudo foi identificar a atividade antifúngica de

óleos essenciais sobre cepas de Candida envolvidas com infecções da

cavidade bucal. Método: Foram avaliados óleos essenciais obtidos a partir das

seguintes espécies vegetais: Citrus reticulata (Tangerina Cravo); Citrus

aurantifolia (Limão Tahiti); Cinnamomum zeylanicum (Canela); Matricaria

chamomilla (Camomila Azul); Mentha piperita (Menta); Eugenia uniflora

(Pitanga) e Zingiber officinale (Gengibre). A determinação da atividade

antifúngica foi realizada utilizando a técnica de difusão em meio de cultura

sólido, onde discos de papel de filtro foram embebidos nos óleos e colocados

em placas de Petri contendo agar Sabouraud Dextrose inoculado com cepas

de Candida albicans e C. tropicalis. Também foi observada a concentração

inibitória mínima a partir do método da microdiluição. Os ensaios foram

realizados em duplicata. Resultados: Foi observada expressiva atividade

antifúngica dos óleos essenciais de C. zeylanicum, C. aurantifolia e M. piperita,

que apresentaram diâmetros de halos de inibição de crescimento microbiano

de até, respectivamente, 48 mm, 30 mm e 19 mm. Ainda foi possível identificar

que 66,7% das cepas ensaiadas mostraram-se resistentes aos óleos

essenciais de C. reticulata, M. chamomilla, E. uniflora e Z. officinale. C.

zeylanicum e nistatina apresentaram, respectivamente, CIMs de 312 µg mL-1 e

32 µg mL-1. Conclusão: Os óleos essenciais avaliados apresentam atividade

antifúngica, sendo os melhores resultados encontrados para C. zeylanicum.

Sugere-se a realização de outros ensaios para avaliação de atividade anti-

Candida desse óleo essencial, que pode representar possível agente

terapêutico no tratamento de infecções fúngicas da cavidade bucal.

Descritores: Candidíase bucal, Candida, Óleo essencial

56

Abstract

Purpose: The purpose of this study was to identify the antifungal activity of

essential oils on Candida strains involved in oral cavity infections. Methods:

essential oils obtained from the following species were evaluated: Citrus

reticulata (Cravo Tangerine) Citrus aurantifolia (Tahiti Lime), Cinnamomum

zeylanicum (Cinnamon), Matricaria chamomilla (Blue Chamomile), Mentha

piperita (Mint), Eugenia uniflora (Pitanga) and Zingiber officinale (Ginger). The

determination of antifungal activity was performed using the diffusion technique

on solid medium, where filter paper discs were soaked in oils and placed in

Petri dishes containing Sabouraud dextrose agar inoculated with strains of

Candida albicans and C. tropicalis. It was also observed the minimum inhibitory

concentration from the microdilution method. Tests were performed in duplicate.

Results: We observed significant antifungal activity of essential oils of C.

zeylanicum, C. aurantifolia and M. piperita, which had halos of microbial growth

inhibition with diameters up to 48 mm, 30 mm and 19 mm, respectively. Still, it

was possible to identify that 66.7% of strains tested were resistant to essential

oils of C. reticulata, M. chamomilla, E. uniflora and Z. officinale. C. zeylanicum

and nystatin showed µg mL-1 and 32 µg mL-1 MIC, respectively. Conclusion:

The essential oils tested have antifungal activity, with best results for C.

zeylanicum. It is suggested to conduct other tests for evaluation of anti-Candida

activity of this essential oil, which could represent possible therapeutic agent in

the treatment of fungal infections of the oral cavity.

Descriptors: oral candidiasis, Candida, Essential Oil

Introdução

Cepas de Candida têm sido associadas às infecções micóticas

superficiais e sistêmicas, podendo ser isoladas em até 60% da cavidade bucal

de adultos, estando a Candida albicans e C. tropicalis entre as mais

prevalentes (1). Tais microrganismos apresentam fatores de virulência

envolvidos com a formação de biofilmes, sendo os fatores ambientais (saliva,

fluido gengival, pH e nutrientes) favoráveis aos processos de co-agregação e

57

co-adesão entre Candida e outros microrganismos, incluindo as bactérias

envolvidas com as principais patologias da cavidade bucal, cárie dentária e

doenças periodontais (2). Destaca-se que essa habilidade para formação de

biofilme está intimamente associada à capacidade de causar infecções,

representando um aumento na resistência às drogas antifúngicas e às defesas

imunológicas do hospedeiro (3-4).

Mecanismos moleculares envolvidos com a patogênicidade de espécies

de Candida são elucidados na perspectiva da elaboração de fármacos que

apresentem maior especificidade e, conseqüentemente, menos efeitos

indesejáveis (5-7). Estes mecanismos estão relacionados à ativação da via de

transdução de sinal MAP (mitogen-activated protein) Kinase, onde respostas

celulares envolvidas com crescimento invasivo, formação de parede celular,

adaptação ao estresse osmótico e reprodução ocorrem mediante vias de

sinalização intracelular como MKc1, Cek1/2 e HOG1 MAP Kinase (6).

Atualmente, os agentes disponíveis para tratamento de infecções

fúngicas da cavidade oral, caracterizadas como superficiais, são representados

pelos poliênicos (anfotericina B, nistatina, entre outros) e azólicos (fluconazol,

itraconazol, miconazol, cetoconazol, entre outros), sendo estes últimos os

eleitos em primeira instância para tratamento dessas doenças e são

geralmente fungistáticos (8).

Diante das limitações de uso desses antifúngicos sintéticos,

evidenciadas pelo aumento da resistência pelos microrganismos, bem como

pelas reações indesejadas apresentadas pelos usuários, novos agentes são

propostos na tentativa de minimizar tais ocorrências. Nesse sentido,

considerando a ampla atividade biológica apresentada pelos produtos de

origem natural, óleos essenciais obtidos a partir das espécies vegetais de

Citrus reticulata (Tangerina Cravo), Citrus aurantifolia (Limão Tahiti),

Cinnamomum zeylanicum (Canela), Matricaria chamomilla (Camomola azul),

Mentha piperita (Menta piperita), Eugenia uniflora (Pitanga) e Zingiber officinale

(Gengibre) têm sido investigados para determinação de suas atividades

antimicrobiana (9-17).

58

Assim, foi propósito desse estudo avaliar a susceptibilidade de espécies

de C. albicans e C. tropicalis frente aos óleos essenciais de Citrus reticulata,

Citrus aurantifolia, Cinnamomum zeylanicum, Matricaria chamomilla, Mentha

piperita, Eugenia uniflora e Zingiber officinale.

Metodologia

Local de realização da pesquisa e cepas fúngicas

Os ensaios microbiológicos foram realizados no Laboratório de Micologia

do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba, que

disponibilizou as cepas de C. albicans LM 42V, C. albicans 18F, C. albicans

MD 37, C. albicans LM 968, C. albicans ICB 12, C. albicans ATCC 76845 C.

tropicalis ATCC 13803, C. tropicalis LM 708, C. tropicalis LM 759, C. tropicalis

LM 28, C. tropicalis LM14, C. tropicalis LM 37 e C. tropicalis LM 13.

Óleos essenciais

Os óleos essenciais (Quadro 1) que tiveram a atividade antifúngica

avaliada foram obtidos na Ferquima Ind. e Com. Ltda (Vargem Grande

Paulista, São Paulo, Brasil), sendo seus parâmetros físico-químicos descritos

pelo fornecedor, que produz e comercializa óleos essenciais em escala

industrial.

Quadro 1. Óleos essenciais utilizados no ensaio para determinação da

atividade anti-Candida.

Espécie Família Nome popular Densidade

g/mL

Citrus reticulata Rutaceae Tangerina Cravo 0,844

Citrus aurantifolia Rutaceae Limão Tahiti 0,868

Cinnamomum zeylanicum Lauraceae Canela Folha 1,040

Matricaria chamomilla Asteraceae Camomila Azul 0,916

Mentha piperita Lamiaceae Menta Piperita 0,899

Eugenia uniflora Myrtaceae Pitanga 0,905

Zingiber officinale Zingiberaceae Gengibre 0,970

59

Avaliação da atividade antifúngica

O ensaio para determinação da atividade antifúngica dos óleos

essenciais foi realizado pelo método da difusão em meio sólido (18). Em placas

de Petri estéreis foram adicionados 20 mL de agar Sabouraud Dextrose (ASD)

fundido e resfriado a 45-50ºC. Após solidificação do agar, foi inoculado 1 mL da

suspensão fúngica na concentração de 106 UFC mL-1. Em seguida, discos de

papel de filtro estéreis foram embebidos em 50 µL dos óleos essenciais e

colocados sobre o meio de cultura.

Os resultados foram avaliados a partir da mensuração dos diâmetros

dos halos de inibição de crescimento fúngico em milímetros (mm). O ensaio foi

realizado em duplicata, sendo considerada a média aritmética dos valores

obtidos.

Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) – Técnica da

Microdiluição

A determinação da CIM para o óleo essencial foi realizada através da

técnica da microdiluição, com algumas adaptações, preconizada pelo Método

de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da

Sensibilidade de Leveduras à Terapia Antifúngica (19). Para realização desse

teste, foram escolhidas as cepas C. albicans ATCC 76845 e C. tropicalis ATCC

13803. Inicialmente, foram distribuídos 100 µL de caldo Sabouraud dextrose

nos orifícios das placas de microdiluição. Em seguida, foram distribuídos 100

µL da emulsão do óleo essencial, a uma concentração inicial de 5000 µg mL-1,

que foi diluída seriadamente à partir da retirada de uma alíquota de 100 µL da

cavidade mais concentrada para a cavidade sucessora, gerando uma

concentração final de 39 µg mL-1. Nos orifícios de cada coluna foram

dispensadas alíquotas de 10 µL do inóculo correspondente a cada cepa

ensaiada na concentração de 106 UFC mL-1. Paralelamente, foram realizados

controle da viabilidade das cepas de leveduras ensaiadas. Realizou-se também

teste de sensibilidade das cepas ensaiadas frente à ação do antifúngico

nistatina, considerada droga de escolha na utilização clínica, em concentração

60

inicial de 64 µg mL-1. Para controle de qualidade da metodologia empregada,

foi realizado o teste de esterilidade do meio de cultura empregado.

Os ensaios foram realizados em duplicata e incubados a 35ºC durante

24-48 horas. A leitura para determinação da CIM dos óleos essenciais sobre as

cepas de leveduras foi feita a partir do método visual. Foi levada em

consideração a formação ou não de aglomerados de células (“crescimento

visual”) no fundo da cavidade da placa. Dessa forma, considerou-se como CIM,

a menor concentração do produto em teste capaz de produzir inibição visível

sobre o crescimento das cepas de leveduras utilizadas nos ensaios

microbiológicos (19).

Para confirmação da presença de microrganismos viáveis nas

concentrações não inibitórias, foi utilizado o corante TCT (2, 3, 5 trifenil cloreto

de tetrazólio) no volume de 10 µL, que reflete a atividade das enzimas

desidrogenases, envolvidas no processo de respiração. Isto torna possível

distinguir as amostras vivas, coloridas de vermelho, daquelas mortas que

mantêm a sua cor (20-21).

Resultados

A tabela 1 mostra os resultados do ensaio para determinação da

atividade antifúngica dos óleos essenciais avaliados. Observa-se que todos os

óleos essenciais apresentaram efetividade de inibição de pelo menos uma

cepa fúngica ensaiada, caracterizada pela formação de halos de inibição de

crescimento microbiano igual ou superior a 10 mm. Entre os resultados obtidos,

ressalta-se a atividade anti-Candida evidenciada pelos óleos essenciais de C.

zeylanicum, C. aurantifolia e M. piperita, visto que inibiram o crescimento de

todas as cepas ensaiadas (100%). Esta inibição pode ser verificada quando

observados os diâmetros dos halos de inibição do crescimento das leveduras,

onde foram encontrados valores de 38-48 mm para C. zeylanicum, 10-30 mm

para C. aurantifolia e 10-19 mm para M. piperita, sendo as cepas de C.

albicans 18F, C. albicans ICB 12 e C. tropicalis ATCC 13803 as mais sensíveis.

Os halos de inibição do crescimento fúngico podem ser observados na Figura

1.

61

Tabela 1. Medida em milímetro dos halos de inibição de crescimento microbiano

produzidos pelos óleos essenciais sobre cepas de Candida.

Cepas A B C D E F G H

C. albicans LM 42V 0 0 44 18 10 0 0 37

C. albicans 18F 15 16 48 30 19 10 14 35

C. albicans MD 37 0 0 40 8 11 0 0 39

C. albicans LM 968 12 13 40 20 13 0 10 40

C. albicans ICB-12 0 0 46 18 13 0 0 42

C. tropicalis LM 708 0 0 38 10 11 0 0 38

C. tropicalis LM 759 0 9 38 14 11 0 0 35

C. tropicalis LM 14 0 0 42 14 11 0 0 38

C. tropicalis LM 28 0 0 40 20 10 0 0 39

C. tropicalis ATCC 13803 10 10 42 17 14 0 9 41

C. tropicalis LM37 0 0 40 10 12 0 0 43

C. tropicalis LM 13 10 12 42 22 13 0 11 43

A – Citrus reticulata (Tangerina Cravo), B – Matricaria chamomilla (Camomila), C –

Cinnamomum zeylanicum (Canela folha), D – Citrus aurantifolia (Limão Tahiti), E – Mentha

piperita (Menta piperita), F – Eugenia uniflora (Pitanga), G - Zingiber officinale (Gengibre) e H –

nistatina

62

Fig. 1 Atividade antifúngica dos óleos essenciais sobre C. albicans ICB-12 (A)

e C. tropicalis LM-708 (B). 1 - Matricaria chamomilla; 2 - Eugenia uniflora; 3 -

Cinnamomum zeylanicum; 4 - Citrus aurantifolia; 5 - Mentha piperita; 6 - Citrus

reticulata; 7 - Zingiber officinale.

Por outro lado, 66,7% das cepas ensaiadas mostraram-se resistentes

aos óleos essenciais de C. reticulata, M. chamomilla, E. uniflora e Z. officinale,

estando as cepas de C. tropicalis LM 708 e C. tropicalis LM 759 entre as mais

resistentes. Considerando que óleo essencial de C. zeylanicum apresentou os

melhores resultados no teste de difusão em meio sólido, foi verificada a menor

concentração desse produto capaz de inibir o crescimento fúngico. Assim, foi

observada CIM de 312,5 µg mL-1 sobre as cepas de C. albicans ATCC 76845 e

C. tropicalis ATCC 13803. Por sua vez, a nistatina apresentou uma CIM de 32

µg mL-1 sobre as mesmas cepas (Tabela 2).

Tabela 2. Concentração Inibitória Mínima do Óleo essencial de C. zeylanicum e

Nistatina sobre cepas de Candida.

Cepas CIM (µg mL-1)

C. zeylanicum

CIM (µg mL -1)

Nistatina

C. albicans ATCC 76845 312,5 µg/mL 32 µg/mL

C. tropicalis ATCC 13803 312,5 µg/mL 32 µg/mL

A B

1

2

3

4

5

6

7

1

2

3

4

5

6

7

63

Discussão

Os resultados apontam que os óleos essenciais apresentam, assim

como destaca a literatura (22), atividade antimicrobiana, despontando como

possíveis agentes terapêuticos. Neste estudo, destaca-se a atividade anti-

Candida evidenciada pelo óleo essencial de C. zeylanicum, que promoveu a

formação de halos de inibição do crescimento em até 48 mm sobre as cepas

ensaiadas. Resultado semelhante foi apontado por outro estudo (23), onde foi

encontrado halo de inibição superior a 40 mm quando da avaliação da

atividade antifúngica do extrato etanólico da C. zeylanicum sobre cepas de C.

albicans. Esta expressiva atividade antifúngica da C. zeylanicum também foi

encontrada sobre espécies de Aspergillus, sendo encontrados halos de inibição

de crescimento de até 19 mm (14).

As cepas fúngicas também apresentaram-se sensíveis ao óleo essencial

de C. aurantifolia, sendo encontrados halos de inibição de crescimento de até

30 mm para C. albicans 18F. Estes resultados são semelhantes aos achados

de literatura (24), que evidenciaram que cepas de Candida são sensíveis ao

óleo em concentrações de até 256 mg/mL.

O óleo essencial obtido a partir da M. piperita apresentou atividade sobre

todas as cepas ensaiadas, com halos de inibição de crescimento de até 19

mm. Entretanto, não foi observada na literatura atividade anti-Candida do

extrato etanólico obtido a partir dessa espécie vegetal (25).

A incipiente atividade antifúngica evidenciada pelos outros óleos

essenciais avaliados (C. reticulata, M. chamomilla, E. uniflora e Z. officinale)

também tem sido evidenciada por outros estudos (9,11,15,17,26).

Destaca-se que a avaliação da atividade antimicrobiana de óleos

essenciais apresenta algumas dificuldades, que estão associadas às

características químicas dos mesmos, como: volatilidade, insolubilidade em

água e complexidade, que podem interferir significativamente nos resultados

(22). Por outro lado, a hidrofobicidade apresentada pelos óleos essenciais pode

facilitar sua interação com estruturas celulares que tem constituição lipídica,

64

promovendo aumento da permeabilidade, provocando uma saída extensiva de

eletrólitos, indispensáveis à sobrevivência celular (27).

Assim, deve-se reconhecer que os óleos essenciais obtidos a partir de

plantas são considerados fontes promissoras para elaboração de fármacos

utilizados no tratamento de micoses, mesmo considerando que os fungos

envolvidos em infecções humanas apresentam-se relativamente mais sensíveis

aos antifúngicos sintéticos comerciais (28-29). Porém, considerando a

necessidade de ampliação do arsenal terapêutico antifúngico, devido,

principalmente, ao aumento do número de cepas resistentes aos produtos

comercialmente disponíveis, a busca por novos compostos antifúngicos

mostra-se de relevante significância (15).

Ressalta-se que este estudo representa uma avaliação inicial para

determinação da atividade antifúngica dos óleos essenciais, sendo, portanto,

necessário o desenvolvimento de outros ensaios pré-clínicos, que incluem a

determinação de concentrações fungicida e fungistática, avaliação da curva de

morte microbiana, além do desenvolvimento de estudos sobre o possível

mecanismo de ação e propriedades toxicológicas.

Conclusão

A partir dos resultados obtidos, foi possível observar o potencial

antifúngico dos produtos naturais avaliados, destacando o resultado

apresentado pelos óleos essenciais de Cinnamomum zeylanicum (Canela) e

Citrus aurantifolia (Limão Tahiti), representando uma possível aplicação desses

produtos na prevenção e tratamento de doenças infecciosas ocasioadas por

espécieis de Candida.

Referências Bibliográficas

1. Marsh PD. Dental Plaque as a Microbial Biofilm. Caries Res 2004; 38(1):204-

211.

2. Thein ZM, Samaranayake YH, Samaranayake LP. Effect of oral bacteria on

growth and survival of Candida albicans biofilms. Arch Oral Biol 2006;

51(1):672-680.

65

3. Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Adhesion of Candida albicans and

Candida dubliniensis to acrylic and hydroxyapatite. Biointerfaces 2004;

33(1):235-241.

4. Ramage G, Saville SP, Thomas DP, Lo’pez-Ribot JL. Candida Biofilms: an

Update. Eukaryot Cell 2005; 4(4):633-638.

5. Orozco AS, Zhou X, Filler SG. Mechanisms of the Proinflammatory

Response of Endothelial Cells to Candida albicans Infection. Infect Immun

2000; 68(3):1134-1141.

6. Monge RA, Roma’n E, Nombela C, Pla J. The MAP Kinase signal

transduction network in Candida albicans. Microbiology 2006; 152(1):905-912.

7. Müller V, Viemann D, Schmidt M, Endres N, Ludwing S, Leverkus M, et al.

Candida albicans Triggers Activation of Distinct Signaling Pathways to Establish

a Proinflammatory Gene Expression Program in Primary Human Endothelial

Cells. J Immunol 2007; 179(1): 8435-8445.

8. Wingeter MA, Guilhermetti E, Shinobu CS, Takaki I, Svidzinski TIE.

Identificação microbiológica e sensibilidade in vitro de Candida isoladas da

cavidade oral. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2007; 40(3): 272-276.

9. Jantan IB, Moharam BAK, Santhanam J, Jamal JA. Correlation between

chemical composition and antifungal activity of the essential oils of eight

Cinnamomum species. Pharmaceutical Biology 2008; 46(6):405-412.

10. Viuda-Martos M, Ruiz-Navajas Y, Fernández-Lopéz J, Pérez-Alvarez J.

Antifungal activity of lemon (Citrus lemon L.), mandarin (Citrus reticulata L.),

grapefruit (Citrus paradisi L.) and orange (Citrus sinensis L.) essential oils. Food

Control 2008; 19(1):1130-1138.

11. Konning GH, Agyare C, Ennison B. Antimicrobial activity of some medicinal

plants of Ghana. Fitoterapia 2004; 75(1):65-67.

12. Bonjar GH, Aghighi S, Karimi Nik A. Antibacterial and antifungal survery in

plants used in indigenous herbal-medicine of south east regions of Iran. J Bio

Sci 2004; 4(3):405-412.

13. Srinivasan D, Sangeetha N, Suresh T, Lakshmana P. Antimicrobial activity

of certain Indian medicinal plants used in folkloric medicine. J

Ethnopharmacology 2001; 74(1):217-220.

66

14. Bansod S, Rai M. Antifungal activity of essential oils from Indian medicinal

plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger. WJMS

2008; 3(2):81-88.

15. Lima IO, Oliveira RAG, Lima EO; Farias NMP, Souza EL. Atividade

antifúngica de óleos essenciais sobre espécies de Candida. Rev Bras

Farmacogn 2006; 16(2):197-201.

16. Giordani R, Regli P, Kaloustian J, Portugal H. Potentiation of antifungal

activity os amphotericin B by essential oil from Cinnamomum cassia. Phytother

Res 2006; 20(1):58-61.

17. Wilson CL, Solar JM, Ghaouth AE. Rapid evaluation of plant extracts and

essential oils for antifungal activity against Bortrytis cinerea. Plant Dis 1997;

81(2):204-210.

18. Bauer AWMM, Kirby JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a

standardized single disk method. Am J Clin Pathol 1966; 45(3):493-496.

19. National Committee For Clinical Laboratory Standard. Método de referência

para testes de diluição em caldo para determinação da sensibilidade de

leveduras à terapia antifúngica: norma aprovada – M27-A2, 2.ed., v. 23, n.15,

2002.

20. Deswal DP, Chand U. Standartization of the tetrazolium test for viability

estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Sci Technol 1997;

25(1):409-17.

21. Gabre DF. Manual do teste de tetrazólio. Brasília: Agiplan, 1976. 85p.

22. Nascimento GGF, Locatelli J, Freitas PC, Silva GL. Antibacterial activity of

plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Braz J

Microbiol 2000; 31(1):247-256.

23. Khan R, Islam B, Akram M, Shakil S, Ahmad A, Manazir AS, Siddiqui M,

Khan AU. Antimicrobial activity of five herbal extracts against multi drug

resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin. Molecules 2008;

13(1):1-12.

24. Aibinu I, Adenipekun T, Adelowotan T, Ogunsanya T, Odugbemi T.

Evaluation of the antimicrobial properties of different parts of Citrus aurantifolia

(lime fruit) as used locally. Afr J Trad 2007; 4(2):185-195.

67

25. Duarte MCT, Figueira GM, Sartoratto A, Rehder VLG, Delarmelina C. Anti-

Candida activity of brazilian medicinal plants. J Ethnopharmacology 2005;

97(2):305-311.

26. Onyeagba RA, Ugbogu OC, Okeke CU. Studies on the antimicrobial effects

of garlic (Allium sativum Linn), ginger (Zingiber officinale Roscoe) and lime

(Citrus auratifolia Linn). Afr J Biotechnol 2004; 3(10):552-554.

27. Prabuseenivasan S, Jayakumar M, Ignacimuthu S. In vitro antibacterial

activity of some plant essential oils. BMC Complementary and Alternative

Medicine 2006; 6(39):1-8.

28. Faleiro ML, Miguel MG, Ladeiro F, Venâncio F, Britto JC, Figueiredo AC,

Barroso JG, Pedro LG. Antimicrobial activity of essential oils isolated from

Portuguese endemic species of Thymus. Lett Appl Microb 2003; 29(1):130-135.

29. Shin S, Pyun M. Anti-Candida effects of estragole in combination with

ketoconaloze or amphotericin B. Phytother Res 2004; 18(1):827-830.

68

5.2. ANTI-Candida ACTIVITY AND CHEMICAL COMPOSITION OF

CINNAMOMUM ZEYLANICUM BLUME ESSENTIAL OIL

RESUMO

O objetivo deste estudo foi identificar a atividade anti-Candida e a composição

química do óleo essencial (OE) de Cinnamomum zeylanicum (canela). Para

tanto, foram realizados ensaios para determinação da Concentração Inibitória

Mínima (CIM), Concentração Fungicida Mínima (CFM) e a ação sobre a parede

celular fúngica do OE de C. zeylanicum sobre cepas de Candida albicans, C.

tropicalis e C. krusei. Também foi analisada a composição do OE através de

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. Foi observada

atividade antifúngica do OE sobre as cepas ensaiadas, com 87,5% e 62,5%

das mesmas sensíveis, respectivamente, a uma CIM de 312,5 µg/mL e CFM de

2500 µg/mL. O eugenol (73,27%) e trans-β-cariofileno (5,38%) foram

encontrados em maiores concentrações. Os resultados apontam atividade anti-

Candida do OE analisado e sugerem que a mesma ocorre por ação sobre a

parede celular fúngica.

69

ANTI-Candida ACTIVITY AND CHEMICAL COMPOSITION OF CINNAMOMUM

ZEYLANICUM BLUME ESSENTIAL OIL2

Ricardo Dias de Castro1, Edeltrudes de Oliveira Lima2

1 Federal University of Paraiba, Center for Health Sciences, Department of

Clinical and Social Dentistry, João Pessoa, Paraíba, Brazil. E-mail:

[email protected]

2 Federal University of Paraiba, Center for Health Sciences, Department of

Pharmaceutical Sciences, Mycology Laboratory, João Pessoa, Paraíba, Brazil.


Corresponding to:


Sidney Clemento Dore, 220, Apto 603, Tambaú, João Pessoa, Paraíba.

CEP: 58030-230

Tel.: (83) 9317-1071 (83) 3021-3446


2 Artigo enviado para Brazilian Journal of Infectious Diseases. DOI: 10.1590/S1413-

86702005000100016

70

ANTI-Candida ACTIVITY AND CHEMICAL COMPOSITION OF CINNAMOMUM

ZEYLANICUM BLUME ESSENTIAL OIL

ABSTRACT

Objective: The purpose of this study was to identify the anti-Candida activity

and chemical composition of the essential oil (EO) of Cinnamomum zeylanicum

(cinnamon). For this, tests were conducted to determine the Minimum Inhibitory

Concentration (MIC) and Minimum Fungicidal Concentration (MFC) and the

action of C. zeylanicum EO on the fungal cell wall from strains of Candida

albicans, C. tropicalis and C. krusei. It was also analyzed the EO composition

by gas chromatography coupled to mass spectrometry. Results: Significant

antifungal activity was observed in EO on the strains tested, with 87.5% and

62.5% of them sensitive, respectively, at a MIC of 312.5 µg/mL and MFC of

2500 µg/mL. Eugenol (73.27%) and trans-β-caryophyllene (5.38%) were found

in higher concentrations. Conclusions: The results indicate anti-Candida

activity of the EO analyzed and suggest that it occurs due to the action on the

fungal cell wall.

Keywords: Candidiasis, Cinnamomum zeylanicum, essential oils

INTRODUCTION

Candida species are opportunistic pathogens that inhabit the human

body as commensal microrganisms and are considered the major cause of

fungal infections in humans. Usually, infections caused by Candida spp. are

developed as a result of changes in immune response. The virulence of these

fungi is attributed to their morphological plasticity, because depending on

71

growing conditions they are capable to form hyphae, pseudohyphae and

chlamydospores.1 These fungi are able to inhabit skin surfaces and mucous

membranes, especially genital areas, intestinal tract and oral cavity whose

colonization is determined by their ability to adhere to human tissues as well as

to prosthetic devices and catheters.2,3

Candida albicans is considered the most pathogenic Candida specie.

However, a variety of other genus’ members such as C. tropicalis and C. krusei

have been cited as agents responsible for the significant increase in the number

of infections.4

One of the most important virulence factors of Candida species is their

ability to form biofilm, which has repercussions in the clinical context, because it

is associated with increased resistance to antimicrobial agents.5-8 Biofilms can

be formed by a single microbial specie or a mixture of microrganisms, including

fungi and bacteria. Fungal species that have the ability to form biofilms are

widely studied, especially as regards the action of antifungal agents.9-11

Given the evident growth in the number of pathogens resistant to

antibiotics currently used in the clinic, there is a clear and emerging need to

introduce new antimicrobial agents to the therapeutic arsenal.12 Concerning the

resistance of Candida strains to azole synthetic antifungal (fluconazole,

miconazole, itraconazole), several mechanisms contribute to the phenomenon

of resistance, among them are: the overexpression or mutation of ERG11 gene,

which encodes the azole target enzyme, the lanosterol 14-α-desmetilase13;

overexpression of CDR and MDR genes that encode efflux pumps14,15; changes

in ERG-3 gene that encodes Δ5.6 sterol desaturase enzyme, important in the

synthesis of ergosterol16, as well as changes in lipid composition of the fungal

72

plasma membrane, which hinders the influx of the drug in the cell.17 It is

emphasized that these mechanisms can occur simultaneously, contributing to

enlarge the phenomenon of resistance.

Thus, natural products, especially those derived from plant species, gain

importance due to their availability and basement of popular usage, which often

ensures safety with regard to their toxicology.

Among the plant species with therapeutic potential is Cinnamomum

zeylanicum Blume, popularly known as cinnamon. This is a plant specie from

Lauraceae family, native to Indonesia and cultivated in various regions of the

world. Several biological properties of C. zeylanicum are described: antiseptic,

analgesic, anti-spasmodic, astringent, insecticide and parasiticide.18 Studies

point out that the essential oil obtained from its leaves has broad antimicrobial

activity.12,18 Therefore, the purpose of this study was to evaluate the anti-

Candida activity and to identify the chemical composition of essential oil

extracted from leaves of C. zeylanicum.

MATERIAL AND METHODS

Fungal Strains

Microbiological tests were performed in the Mycology Laboratory of the

Department of Pharmaceutical Sciences of the Center for Health Sciences,

Federal University of Paraíba, which provided the strains of C. albicans ATCC

40277, C. albicans ATCC 40006, C. albicans MD 37, C. albicans ICB 12, C.

tropicalis ATCC 40042, C. tropicalis LM 759, C. krusei ATCC 40147 and C.

krusei LM 120.

73

Essential Oil

The essential oil of C. zeylanicum, which had evaluated the antifungal

activity and chemical composition, was obtained from Ferquima Ind. and Com.

Ltda (Vargem Grande Paulista, São Paulo, Brazil), whose physical and

chemical parameters were described by the supplier, which produces and

markets essential oils on an industrial scale .

The emulsion of essential oil was obtained following the proportions

suggested by the protocol recommended by Allegrini et al.19 , where in a test

tube, were added 0.4 mL of essential oil, 0.04 mL of TWEEN 80 and q.s.

(quantum sufficit) 5 mL of sterile distilled water. This mixture was agitated for

five minutes in Vortex apparatus.

Determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

The MIC of the essential oil was determined through the microdilution

technique proposed by Ellof20. Initially, were distributed 100 µL of Sabouraud

dextrose broth (SDB) doubly concentrated into the microdilution plate wells.

Then, 100 µL of the emulsion of essential oil were distributed, with initial

concentration of 5.000 µg/mL, which was serially diluted transfering an 100 µL

aliquot from the most concentrated well and inserting it into the following one.

In each column’s wells were dispensed aliquots of 10 µL of the inoculum

for each strain tested. In parallel, it was made control of viability of the yeast

strains under study. Moreover, it was made control of sensitivity of the strains

assayed as regards the antifungal effect of nystatin and miconazole, which are

74

considered standards in clinical use, being tested by the microdilution

technique.

The tests were performed in triplicate and incubated at 35°C for 24-48

hours. The reading for MIC determination of essential oil on the yeast strains

was made by the visual method. It was taken into consideration the formation of

cells clusters ("button") at the bottom of the plate well. Thus, it was considered

as MIC the lowest concentration of the product under test capable to produce

visible inhibition on the growth of yeast strains used in the microbiological

assays.

To confirm the presence of viable microrganisms at non-inhibitory

concentrations, it was used 10 µL of the dye 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride

in each well, which reflects the activity of dehydrogenase enzymes involved in

the process of breathing. It makes possible to distinguish the live samples, red-

colored, from the died samples that keep their color.21

Determination of Minimum Fungicidal Concentration (MFC)

After MIC determination, the concentration corresponding to the inhibitory

and the two concentrations immediately more concentrated, as well as the

positive controls were subcultivated on Sabouraud dextrose agar plates in

triplicate. After 24 hours of incubation at 30°C, the readings of MFCs were done

based on growth controls, being MFC the lowest drug concentration that

hindered visible growth of the subculture.

75

Action of C. zeylanicum essential oil on the fungal cell wall

The MIC determination of C. zeylanicum essential oil in the presence of

sorbitol (0.8M), was performed in triplicate by microdilution, using 96-well U-

bottom microtiter plates (ALAMAR ®). In each plate well were added 100 µL of

SDB medium previously supplemented with sorbitol presenting molecular

weight of 132.17 g (VETEC Química Fina Ltda - Rio de Janeiro / RJ), both

doubly concentrated. Subsequently, 100 µL of the emulsion of essential oil, also

doubly concentrated, were dispensed into the wells in the first row of the plate.

And through a serial dilution at a ratio of two, were obtained concentrations from

10,000 µL/mL to 10 µL/mL of essential oil and, in relation to sorbitol, a final

concentration of 0.8 M in each well. Finally, were added 10 µL of inoculum

strains in the wells, where each column of the plate corresponds to a fungal

strain, specifically.

A control of microrganism was performed by inserting 100 µL of the same

SDB and sorbitol (0.8 M) also doubly concentrated, 100 µL of sterile distilled

water and 10 µL of inoculum of each specie. To verify the absence of

interference with the results by the solvent used in emulsion preparation (Tween

80, in this case), it was made a control on which were added into wells 100 µL

of the same SDB and sorbitol (0.8 M) also doubly concentrated, 100 µL of

Tween 80 (10% in sterile distilled water) and 10 µL of suspension. A sterility

control was also conducted, where were placed 200 µL of SDB in a well without

the fungi suspension. The microplates were seeded and incubated at 37°C for

48 hours to accomplish the reading.22

76

Chemical analysis of the essential oil

The analysis of C. zeylanicum essential oil was performed at the

Fundamental Chemistry Laboratory, Federal University of Pernambuco, Brazil,

by gas chromatography coupled to mass spectrometry (CG-EM), by using the

instrument QP-5050A with a GC-17A (Shimadzu, Japan).23,24

RESULTS

All strains tested were sensitive to essential oil obtained from leaves of

C. zeylanicum (Table 1), with MIC values ranging between 312.5 and 625

µg/mL, being 87.5% of Candida strains sensitive to the concentration of 312.5

µg/mL.

The essential oil of C. zeylanicum presented MFC of 2500 µg/mL to

62.5% of the strains tested. The strains of C. albicans ICB 12 and C. tropicalis

LM 759 are among the most sensitive (MFC 625 µg/mL). These data are

present in Table 1.

Table 2 brings MIC values of C. zeynalicum essential oil in presence and

absence of 0.8 M sorbitol osmotic protector. As can be seen, the test suggests

that the sorbitol protected the cells from the inhibitory effects of essential oil,

since there were changes in the MIC of the product analyzed against all strains

tested. The control with sorbitol ensured the reliability of the results and the

methodology since the strains were able to grow in the presence of sorbitol and

lack of essential oil evaluated. These results suggest that the antifungal activity

of essential oil of C. zeylanicum, somehow involves its direct interaction with the

cell wall of yeasts under study.

77

The chemical composition of essential oil from leaves of C. zeylanicum

was determined by gas chromatography coupled to a mass spectrometer (GC-

MS). The phytochemicals and their respective percentage in the essential oil

composition, molecular weights, charge/mass relation and retention times are

shown in Table 3.

DISCUSSION

The data presented in this study are similar to those described by Klan et

al.12 who found, through the test of diffusion in solid medium, halos of growth

inhibition of strains of C. albicans isolated from clinical infections larger than 40

mm and MIC of 780 µg/mL.

Quale et al.25 evaluated the antifungal activity of essential oil of C.

zeylanicum on Candida strains resistant to fluconazole. Were found MIC values

of C. zeylanicum ranging between 50 and 30,000 µg/mL. Another study, carried

out by Hili 26 showed that 72.2% of strains of C. albicans were sensitive to the

essential oil of C. zeylanicum at a concentration of 500 µg/mL.

Pozzatti et al.27 evaluated the susceptibility to the C. zeylanicum

essential oil of 138 strains of Candida, including C. albicans, C. tropicalis and C.

krusei, and was verified MIC ranging between 200 µg/mL and 1600 µg/mL.

However, it is emphasized that most strains requires 1600 µg/mL. For MFC,

variations were observed between 800 µg/mL and 1800 µg/mL.

Nystatin and miconazole, synthetic antifungal agents used as controls,

showed MIC of 64 µg/mL and 32 µg/mL, on, respectively, 87.5% and 75% of

Candida strains. These antifungal agents have been used as reference for the

78

treatment of superficial fungal infections caused by Candida species. The

miconazole is a representative for the azole antifungals whose mechanism of

action consists in inhibiting the synthesis of ergosterol by binding to the enzyme

lanosterol 14-α-demethylase, causing changes in the fungal cytoplasmic

membrane and, then, hindering the fungal development.28

Alves and Cury29 evaluated the susceptibility to the antifungal nystatin of

strains of C. albicans, C. tropicalis, C. krusei and found MIC and MFC values

ranged from, respectively, 0.5 µg/mL to 8 µg/mL and 8 µg/mL to 64 µg/mL.

Wingeter et al.30 assessed the sensitivity of strains of C. albicans and Candida

non albicans isolated from patients with denture stomatitis and observed MIC

values between 2 µg/mL and 64 µg/mL. These results are similar to those found

in this study, in which was observed for nystatin MIC values ranging from 32

µg/mL to 64 µg/mL and MFC of 64 µg/mL.

In relation to miconazole, Batista et al.31 found MIC values between 0.8

µg/mL and 2 µg/mL on 16 strains of C. albicans. Furthermore, the authors found

that the MFC of this azole showed wide variations (2.51 µg/mL to 64 µg/mL).

This study found that miconazole had MFC of 32 µg/mL on all strains tested.

The test with sorbitol, performed in this study, is based on the extent of

damage that products with antifungal activity produce on fungal cell wall

components. If the product acts somehow on the fungal cell wall, it will cause

lysis of their cells when in the absence of an osmotic stabilizer. Thus, this test

compares the MIC of antifungal products in the absence and presence of 0.8 M

sorbitol, an osmotic protector used to stabilize the fungal protoplasts.32

79

Protection with sorbitol is a test that has a broad spectrum of possibilities,

since it allows to detect not only agents that interfere with the synthesis of cell

wall polymers and its vicinity, but also the regulatory mechanisms involved in

these processes that complement each other as microscopic observation of

malformations detected in fungal strains analyzed previously.33 Thus, the results

of this study suggest testing to assess the action of C. zeylanicum essential oil

on fungal micromorphology.

C. zeylanicum is a plant that has significant amount of essential oil in its

leaves. This oil is quoted as having more than 72 substances.34 As shown in

Table 3, the GC-MS analysis resulted in identification of 17 components.

Among the phytochemicals, eugenol presented as major component, with

73.27% of the constituents, followed by trans-β-caryophyllene (5.38%) and

benzyl benzoate (4.04%). These results confirm those of other researchers in

previous reports, where it is recorded that eugenol is the main component of

essential oil of C. zeylanicum.27,34

It is noteworthy that despite all the organs of a plant can accumulate

essential oils, their chemical composition, physico-chemical characteristics and

odor can vary according to its location. Although genetically controlled, the

biosynthesis of the constituents of a plant is strongly affected by the

environment, harvesting and post harvest, rainfall, temperature, light and

humidity.35

Eugenol belongs to a group of essential oils constituents compounds

originated from the reduction of the side chain of cinnamic acids, which are

derived from phenylalanine. These compounds are also present in Syzygium

80

aromaticum (clove), Pimpinella anisum (aniseed), Foeniculum vulgare (fennel)

and Illicium verum (star anise-).36

From the results obtained, it is perceived that C. zeylanicum essential oil

presents itself as a promising product for the treatment of fungal infections

caused by Candida spp. However, it is suggested further microbiological tests

and pre-clinical studies to effectively elucidate the efficacy of this product in

treating candidiasis.

CONCLUSION

Analysis of antifungal activity of C. zeylanicum essential oil allowed to

conclude that this product has potent action on strains of C. albicans, C.

tropicalis and C. krusei, that this activity occurs, probably, by the action of

essential oil in the process of fungal cell wall synthesis and that eugenol

represents the major phytochemical component.

REFERENCES

1. Monge RA, Roma’n E, Nombela C, Pla J. The MAP Kinase signal

transduction network in Candida albicans. Microbiol 2006; 152:905-912.

2. Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Adhesion of Candida albicans and

Candida dubliniensis to acrylic and hydroxyapatite. Colloids Surf B 2004;

33:235-241.

3. Donlan RM. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis

2001; 7:277–81.

4. Gilfillian, D, Sullivan, J, Haynes, K et al. Candida dubliniensis: phylogeny and

putative virulence factors. Microbiol 1998; 144:829-838.

81

5. Henriques H, Azeredo J, Oliveira R. Candida albicans and Candida

dubliniensis: comparison of biofilm formation in terms of biomass and activity.

Br J Biomed Sci 2006; 63: 5-11.

6. Thein ZM, Samaranayake YH, Samaranayake LP. Effect of oral bacteria on

growth and survival of Candida albicans biofilms. Arch Oral Biol 2006; 51:672-

680.

7. Ramage G, Saville SP, Thomas DP, Lo’pez-Ribot JL. Candida biofilms: an

update. Eukaryot Cell 2005; 4:633-638.

8. Mukherjee PK, Chandra J. Candida biofilm resistance. Drug Resist Update

2004; 7: 301–9.

9. El-Azizi MA, Starks SE, Khardori N. Interactions of Candida albicans with

other Candida spp. and bacteria in the biofilms. J Appl Microbiol 2004;

96:1067–1073.

10. Bachmann SP, Walle KV, Ramage G et al. In vitro activity of caspofungin

against Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother 2002; 46:

3591–6.

11. Kuhn DM, Chandra J, Mukherjee PK, Ghannoum MA. Antifungal

susceptibility of Candida biofilms: unique efficacy of amphotericin B lipid

formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother 2002; 46:

1773–80.

12. Khan R, Islam B, Akram M et al. Antimicrobial activity of five herbal extracts

against multi drug resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical

origin. Molecules 2008; 13:1-12.

82

13. Marichal P, Koymans L, Willemsens S et al. Contribution of mutations in the

cytochrome P450 14α-demethylase (Erg11p, Cyp51p) to azole resistance in

Candida albicans. Microbiol 1999; 145:2701-2713.

14. White TC, Marr KA, Bowden RA. Clinical, cellular, and molecular factors

that contribute to antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev 1998; 11:382-

492.

15. Prasad R, Wergifosse P, Goffeau A, Balzi E. Molecular cloning and

characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple

resistance to drugs and antifungals. Curr Genet 1995; 27:320-329.

16. Howell SA, Mallet AI, Noble WC. A comparison of the sterol content of

multiple isolates of the Candida albicans Darlington strain with other clinically

azole-sensitive and -resistant strains. J Appl Microbiol 1990; 69:692-696.

17. Löffler J, Einsele H, Hebert H. Phospholipid and sterol analysis of plasma

membranes of azole-resistant Candida albicans strains. FEMS Microbiol Lett

2000; 185:59-63.

18. Moreira ACP, Lima EO, Souza EL et al. Inhibitory effect of Cinnamomum

zeylanicum Blume (Lauraceae) essential Oil and beta-pinene on the growth of

dematiaceous moulds. Braz J Microbiol 2007; 38:33-38.

19. Allegrini J, Bouchberg MS, Maillols H. Émulsions d’huiles essencielles,

fabrication et applications en microbiogie. Soc Phamc Montp 1973; 33:86.

20. Ellof JN. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal

inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Med 1998; 64:711-

713.

http://www.springerlink.com/content/100408/?p=1c2f280eb096496a90f88508169343ac&pi=0

http://www.springerlink.com/content/q083603l1714/?p=1c2f280eb096496a90f88508169343ac&pi=0

83

21. Deswal DP, Chand U. Standartization of the tetrazolium test for viability

estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed. Sci Technol 1997;

25:409-17.

22. Frost DJ, Brandt KD, Cugier D, Goldman R. A whole-cell Candida albicans

assay for the detection of inhibitors towards fungal cell wall synthesis and

assembly. J. Antibiotic 1995; 28:306-309.

23. Adams RP. Identification of essential oil components by gas

chromatography/mass spectroscopy. Carol Stream, Illinois: Allured Publishing

Corporation, 1995.

24. McLafferty FW, Stauffer D. The wiley/NBS registry of mass spectral data.

New York: John Wiley Sons, 1989.

25. Quale JM, Landman D, Zaman MM et al. In vitro activity of Cinnamomum

zeylanicum against azole resistant and sensitive Candida species and a pilot

study of cinnamon for oral candidiasis. Am J Chin Med 1996; 24:103-109.

26. Hili P, Evans CS, Veness RG. Antimicrobial action of essential oils : the

effect of dimethylsulphoxide on the activity of cinnamon oil. Lett Appl Microbiol

1997; 24:269-275.

27. Pozzatti P, Scheid LA, Spader TB et al. In vitro activity of essential oils

extracted from plants used as spices against fluconazole-resistant and

fluconazole-susceptible Candida spp. Can J Microbiol 2008; 54:950-956.

28. Chen A, Sobel JD. Emerging azole antifungal. Expert Opin Emerg Drugs

2005; 10:21-33.

29. Alves SH, Cury AE. Candida from câncer patients: susceptibility in vitro to

polyene antifungal agents. Rev Insti Med Trop 1992; 34:251-254.

84

30. Wingeter MA, Guilhermetti E, Shinobu CS et al. Microbiological identification

and in vitro sensitivity of Candida isolates from the oral cavity of HIV positive

individuals. Rev Inst Med Trop 2007; 40: 272-276.

31. Batista JM, Birman EG, Cury AE. Susceptibility to antifungal drugs of

Candida albicans strains isolated from patients with denture stomatitis Rev

Odontol Univ São Paulo 1999; 13:343-348.

32. Pereira FO. Atividade antifúngica do oleo essencial de Cymbopogon

winterianus Jowitt ex Bor sobre dermatófitos do gênero Trichophyton. [Tese de

doutorado]. João Pessoa: Departamento de Ciências Farmacêuticas,

Universidade Federal da Paraíba, 2009.

33. Lesage G, Bussey H. Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae.

Microbiol Mol Biol Res 2006; 70: 317-343.

34. Senanayake UM, Lee TH, Wills RBH. Volatile constituents of cinnamon

(Cinnamomum zeylanicum) oils. J Agric Food Chem 1978; 26:822-824.

35. Sharmar N, Tripathi A. Effects of Citrus sinensis (L.) Osbeck epicarp

essential oil on growth and morphogenesis of Aspergillus niger (L.) Van

Tieghem. Microbiol Res 2006; 163:337-344.

36. Rastogi N, Domadia P, Shetty S, Dasgupta D. Screening of natural phenolic

compounds for potential inhibit bacterial cell division protein FtsZ. Indian J Exp

Biol 2008; 46:783-787.

85

Table 1. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal Concentration

(MFC) of C. zeylanicum essential oil, nystatin and miconazole on Candida strains.

C. zeylanicum Nystatin Miconazole

Strains MIC

(µg/mL)

MFC

(µg/mL)

MIC

(µg/mL)

MFC

(µg/mL)

MIC

(µg/mL)

MFC

(µg/mL)

C. albicans ATCC 40277 312.5 2500 64 64 32 32

C. albicans MD 37 312.5 2500 64 64 8 32

C. albicans ICB 12 625 625 64 64 32 32

C. albicans LM 42V 312.5 1250 64 64 32 32

C. tropicalis ATCC 40042 312.5 2500 64 64 32 32

C. tropicalis LM 759 312.5 625 64 64 32 32

C. krusei ATCC 40147 312.5 2500 64 64 32 32

C. krusei LM 120 312.5 2500 64 64 32 32

86

Table 2. Action of the essential oil of C. zeylanicum on the fungal cell wall.

Controls

Strains

MIC –

without

sorbitol

(µg/mL)

MIC – with

sorbitol

(µg/mL)

Sorbitol

Sterility

C. albicans ATCC 40277 312,5 625 + -

C. albicans MD 37 312,5 625 + -

C. albicans ICB 12 625 625 + -

C. albicans LM 42V 312,5 625 + -

C. tropicalis ATCC 40042 312,5 625 + -

C. tropicalis LM 759 312,5 625 + -

C. krusei ATCC 40147 312,5 625 + -

C. krusei LM 120 312,5 625 + -

+ presence of strain growth

- absence of strain growth

87

Table 3. Chemical characterization of C. zeylanicum leaf essential oil.

Peaks Retention time (min)

Compound % in the formulation

Molecular weight

charge/mass Relation

1 5.644 α-pinene 1.31 136 93.15

2 6.017 Camphene 0.45 136 93.10

3 6.218 Benzaldehyde 0.25 106 77.10

4 6.792 β-pinene 0.48 136 93.10

5 7.641 α-phellandrene 1.29 136 93.15

6 8.293 p-cymene 1.24 134 119.15

7 8.471 β-phellandrene 1.57 136 93.10

8 11.164 Linalool 3.31 136 71.10

9 14.217 4-terpineol 0.12 154 71.10

10 19.133 Safron 1.76 162 162.15

11 23.633 Eugenol 73.27 164 164.15

12 25.217 Trans-β-caryophyllene

5.38 204 41.05

13 26.133 Cinnamic alcohol acetate

2.53 176 43.00

14 26.498 α-humulene 1.01 204 93.10

15 29.511 Eugenol acetate 1.06 206 164.15

16 31.708 Caryophyllene oxide

0.92 177 43.05

17 38.655 Benzyl benzoate

4.04 212 105.10

88

5.3. COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume ESSENTIAL

OIL AND NYSTATIN ON STRAINS OF Candida spp.

RESUMO

Objetivou-se investigar a ação antifúngica do óleo essencial (OE) de

Cinnamomum zeylanicum Blume isolado e associado à nistatina sobre cepas

de Candida albicans ATCC 40277. Para tanto, foi determinada a Concentração

Inibitória Mínima (CIM) de ambos os produtos avaliados, o índice de

Concentração Inibitória Fracionada (FIC) e o efeito do óleo essencial sozinho e

associado a nistatina sobre a cinética do crescimento das leveduras. Quando

avaliados isolados, C. zeylanicum e nistatina apresentaram CIM de,

respectivamente, 312,5 µg/mL e 64 µg/mL. Após associação dos produtos

avaliados, foi observada diminuição nos valores de CIM para ambas as

substâncias, sendo encontrados valores de, respectivamente, 39 µg/mL e 32

µg/mL para o OE e nistatina. O valor do índice de concentração fracionada

(CIF) foi de 0,6024. Foi observado que em todas as concentrações avaliadas,

os produtos avaliados isoladamente e associados foram capazes de reduzir o

número de UFC/mL, quando comparados ao grupo controle (p<0,0001), a partir

de 30 min. Os resultados indicam haver efeito aditivo da associação de C.

zeylanicum e nistatina para inibição de crescimento de cepas de C. albicans.

Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum, Nistatina, Produto Natural,

Candidíase

89

COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume Essential Oil And

Nystatin On Strains Of Candida spp.3

Ricardo D. Castro*, Federal University of Paraiba, Center for Health Sciences,

Department of Clinical and Social Dentistry, João Pessoa, Paraíba, Brazil. E-

mail: [email protected]

Edeltrudes de Oliveira Lima, Federal University of Paraiba, Center for Health

Sciences, Department of Pharmaceutical Sciences, Mycology Laboratory, João

Pessoa, Paraíba, Brazil. E-mail: [email protected]

Fillipe de Oliveira Pereira, Federal University of Paraiba, Center for Health



Corresponding to:


Sidney Clemento Dore, 220, Apto 603, Tambaú, João Pessoa, Paraíba, Brazil.

CEP: 58030-230

Fone.: (83) 9317-1071 (83) 3021-3446


3 Artigo submetido ao periódico Journal of Essential Oil Research.

90

COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume Essential Oil And

Nystatin On Strains Of Candida spp.

ABSTRACT

This study aimed at investigating the antifungal activity of essential oil (EO) of

Cinnamomum zeylanicum Blume alone and combined with Nystatin on strains

of Candida albicans ATCC 40277. For this, it was determined the Minimum

Inhibitory Concentration (MIC) of both the products evaluated, the Fractional

Inhibitory Concentration Index (FIC) and the effect of the essential oil alone and

combined with Nystatin on the growth kinetics of yeasts. When assessed

separately, C. zeylanicum EO and Nystatin showed MICs of 312.5 µg/mL and

64 µg/mL, respectively. After combination, was observed a decrease in MIC

values for both substances, which went down to 39 µg/mL and 32 µg/mL for EO

and Nystatin, respectively. The value of the Fractional Concentration Index

(FIC) was 0.6024. It was observed that in all concentrations evaluated the

products assessed alone and in combination were able to reduce the number of

CFU/mL, when compared with the control group (p <0.0001) from 30 min. The

results indicate an additive effect of the association of C. zeylanicum with

Nystatin to inhibit growth of C. albicans strains.

Key words: Cinnamomum zeylanicum, Nystatin, Natural Product, Candidiasis

INTRODUCTION

C. albicans is an opportunistic pathogen that commensally inhabits the

human body and it’s the major cause of fungal infections in humans. These

infections usually occur as a result of a change in immune response and

virulence of this specie, which presents considerable morphological plasticity

(1). Clinically, the disease may arise as mucosal until systemic manifestations,

characterized by the invasion of various organs. The oral, vaginal and

esophageal mucosas are the most affected sites in cases of candidiasis (2,3).

In immunocompromised individuals, especially those affected by

Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), about 74% present lesions in

the oral mucosa caused by Candida spp infections (4). It is noteworthy that

91

candidiasis can act on these individuals as a marker of disease progression and

prediction for increased immunosuppression.

Late diagnosis and the relative small number of antifungal classes

therapeutically available favors mortality, which is attributed to systemic

infections. Allied to this, fungal resistance to agents available becomes a

problem for some patient groups, including the immunocompromised (5).

Therefore, given the evident growth in the number of pathogens resistant to

antibiotics currently used in the clinic, there is a clear and emerging need to

introduce new antimicrobial agents in the therapeutic arsenal (3,6).

The study and discovery of natural products that have antimicrobial

activity intrinsically or combined with antifungal drugs in common use may

represent itself as a new therapeutic tool against multiresistant microrganisms,

besides preventing contact of these microrganisms with synthetic products,

reducing the risk of selecting new or improved mechanisms of resistance. Thus,

it may guide the pharmaceutical industry in order to promote the production and

use of herbal products as adjuvant treatment on infectious agents (7).

In this perspective and considering the known antimicrobial activity of

essential oil (EO) of Cinnamomum zeylanicum (6,7,8,9,10,11,12), the purpose

of this study was to evaluate the antifungal effect of the combination of this

natural product with Nystatin on Candida spp strains involved in superficial

infections of the oropharyngeal mucosa.

EXPERIMENTAL

Microrganisms


Center for Health Sciences, Federal University of Paraíba, Brazil, which

provided strains of C. albicans ATCC 40277.

Essential Oil

The EO whose antifungal activity is under study was obtained from

Ferquima Ind. and Comp. Ltda (Vargem Grande Paulista, São Paulo, Brazil). Its

92

physical and chemical parameters were described by the supplier, which

produces and markets essential oils on an industrial scale.

Considering the lipid-solubility of the essential oil, an emulsion was

prepared by adding TWEEN 80 and sterile distilled water, and this mixture was

stirred for five minutes in Vortex apparatus. The essential oil concentration used

in the study was determined based on the product’s density (d = 1.040 g / mL).

Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

The MIC determination for the essential oil and for Nystatin was

performed by microdilution technique, using 96-well U-bottom microtiter plates

(ALAMAR®). Initially, 100 µL of Sabouraud Dextrose Broth doubly concentrated

were distributed into the plate’s wells. Then, 100 µL of the emulsion of C.

zeylanicum EO and Nystatin were distributed at an initial concentration of 5,000

µg/mL and 128 µg/mL, respectively. From these concentrations were conducted

serial dilutions by withdrawing an aliquot of 100 µL from the most concentrated

well and inserting it into the following well. Finally, aliquots of 10 µL of inoculum

correspondent to the strains under test were dispensed into the wells of each

column. In parallel, it was made a yeast viability control. Tests were performed

in triplicate, and the plates were incubated at 35°C for 24-48 hours (13).

The reading to determine the essential oil MIC on the yeast strains was

made through the visual method. It was taken into consideration the formation

or non-formation of cellular clusters ("button") at the bottoms of the wells. Thus,

MIC was considered as the lowest concentration of the product under test

capable of producing visible inhibition on the growth of yeast strains used in

microbiological assays (13).

In order to confirm the presence of viable microrganisms at non-inhibitory

concentrations, 10 µL of TTC dye (2, 3, 5 triphenyl tetrazolium chloride) were

inserted into the wells after 24 hours of incubation. The detection of

microrganisms viability reflects the activity of dehydrogenase enzymes, which

are involved in the fungal respiration process. It makes possible to distinguish

the live samples, red-colored, from the dead samples that keep their color (14).

93

Synergism assay – Checkerboard method

Combined effect between Nystatin and C. zeylanicum EO was

determined by the microdilution technique - checkerboard for derivation of the

Fractional Inhibitory Concentration index (FIC index).

The turbidity of the fungal suspension of C. albicans ATCC 40277 was

compared and adjusted to that presented by the barium sulphate suspension

referent to the tube 0.5 of McFarland scale, which corresponds to an inoculum

of approximately 106 Colony Forming Units/mL (CFU/mL). Solutions of the

products tested were used at concentrations determined from their respective

MIC. Initially, 100 µL of Sabouraud Dextrose culture medium were added into

the holes of a 96-well U-bottom microtiter plate (ALAMAR®). Then, 50 µL of

each product tested whose concentrations ranged among MIC÷4, MIC÷2, MIC,

MICx2 and MIC×4 were added in the horizontal (Nystatin) and vertical

(essential oil) directions of the plate. Finally, the culture medium was inoculated

with 10 µL of fungal suspension. Fungal growth was evidenced through the use

of TTC dye. The test was performed in triplicate, and the microplates were

incubated at 37ºC for 48 hours (15).

The FIC index was calculated as FICA + FICB, in which A represents the

EO and B is Nystatin. FICA is calculated through the ratio MICA combined /

MICA alone, while FICB = MICB combined / MICB alone. This index was

interpreted as follows: synergism (<0.5), additivity (0.5-1.0), indifference (> 1

and <4) or antagonism (> 4.0) (15,16).

Study of the effect of the essential oil alone and combined with Nystatin

on the growth kinetics of yeasts

The study of interference of the test product (C. zeylanicum EO) alone or

combined with Nystatin on the viability of fungal strains was performed using

the method of counting viable cells. In this assay, it was observed the behavior

of the yeasts strains compared to EO MIC values as well as to the values

obtained from its association with Nystatin. Initially, 0.5 mL of yeast suspension

was inoculated in 4.5 mL of Sabouraud Broth containing varied concentrations

94

of EO, Nystatin and combination of these products (MIC÷2; MIC, MIC×2, MIC×

4 and MIC×8). In the intervals 0, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min and 24 h

after incubation, an aliquot of 10 µL of inoculum was uniformly inoculated on

Petri plate containing Sabouraud Dextrose Agar. It was also conducted a

control experiment with antifungal-free growth.

The inoculated plates were incubated at 35°C for 48 hours. After

incubation period, it was conducted the counting of the number of viable cells,

which was expressed in CFU/mL and presented in a graphical form of microbial

death curve (17).

Data were statistically analyzed by analysis of variance for parametric

distributions, considering a 5% significance level (p<0.05). For this, statistical

program Graphpad Prism 5.0 was used.

RESULTS AND DISCUSSION

The essential oil of C. zeylanicum and Nystatin when evaluated

separately showed MICs of 312.5 µg/mL and 64 µg/mL, respectively, on C.

albicans strain assessed, as seen in Table 1. These findings confirm the data

presented by other studies (3,18,19,20).

Meades et al. (21) suggest that the antimicrobial activity of the EO

obtained from C. zeylanicum may result from the action of trans-

cinnamaldehyde, a compound found in large quantity in the product. This

antimicrobial activity has also been attributed to eugenol, another component

found in abundance in this oil (3). This information is reinforced by Schmidt et

al. (18), who found that the chemical compounds present in C. zeylanicum EO,

particularly eugenol (the product’s major compound) inhibit growth of Candida

strains.

TABLE 1.

The study of interactive effects between molecules has a long history.

For antimicrobial drugs, the use of double or triple combinations starts with in

vitro studies which indicate that positive interactions can promote the inhibition

of microrganisms growth. There are several experimental models that measure

95

the effects of drug combinations. One of the simplest and well known protocols

is the "checkerboard" test, which provides a two-dimensional array of different

concentrations of the substances evaluated and allows the calculation of

Fractional Inhibitory Concentration index (FIC) (22).

According to Cuenca-Estrella (23), the associated antifungal compounds

can promote greater effectiveness of each drug, thus allowing the use of lower

doses of each drug. For this author, the checkerboard method and the microbial

death curve are often used in the in vitro evaluation of combined antimicrobials

activity.

After association of the products evaluated, it was verified reduction in

MIC values for both substances. The values found were 39 µg/mL and 32

µg/mL for the EO and Nystatin, respectively. These data represent for the EO

and Nystatin a reduction of respectively 87.52% and 50% from the

concentrations initially used. As shown in Table 2, the value of the Fractional

Inhibitory Concentration Index (FIC) was 0.6024, indicating an additive effect of

the association for the growth inhibition of C. albicans strains.

TABLE 2.

It was not found in the literature studies that evaluated the antifungal

effect of the combination of C. zeylanicum EO with Nystatin on Candida

albicans strains. However, the association of other natural products to

conventional antibiotics has been reported by some authors (2,7,24,25,26).

Once verified the additive effect of the combination of C. zeylanicum EO

with Nystatin in the inhibition of cell growth of C. albicans, it was sought to study

the effect of this combination on the growth kinetics of yeasts. It was observed

that all concentrations (MIC÷2, MIC, MICx2, MICx4 and MIC×8) of the products

tested alone or in combination were able to reduce the number of CFU/mL

when compared with the control group (p<0.0001). These data are shown in

Figures 1, 2, 3, 4 and 5, respectively.

FIGURE 1

96

FIGURE 2

FIGURE 3

FIGURE 4

FIGURE 5

The results obtained with the kinetics study indicate that the combination

of products (EO and Nystatin), even in lower concentrations, significantly

reduces the number of viable cells and that the contact time of the substances

with the cells positively favors such reduction.

In order to understand the mechanisms involved in the potentiation of the

effect afforded by this combination, the completion of other studies is required.

Johnson et al. (27) suggest that the synergistic activity of antifungal combination

may occur through inhibition of different stages in the yeast intracellular

biochemical pathways which are essential for cellular survival, for increasing

penetration of the antifungal agent provided by the action of other antifungal in

the fungal cell membrane, and for inhibiting carrier proteins, which would have

the task to promote the extrusion of drugs and inhibition of different cellular

targets simultaneously.

The results of this study suggest the conduction of antimicrobial tests that

reproduce biofilm formation, as they represent clinical situations characterized

by increased resistance to antifungal agents available and also suggest the use

of clinical isolates resistant to conventional antifungal agents. Thus, these

research findings represent the possibility of a new pharmaceutical formulation

for the treatment of superficial fungal infections, particularly those that affect the

oropharyngeal mucosa.

The combination of C. zeylanicum essential oil with Nystatin potentiates

the inhibitory effect on growth of C. albicans strains involved with

mucocutaneous infections of the oropharynx. This association may represent a

new therapeutic option to the treatment of this pathology.

97

Table 1. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C. zeylanicum

essential oil and Nystatin on strains of C. albicans ATCC 40277.

MIC (µg/mL)

Strain C. zeylanicum Nystatin

C. albicans

ATCC 40277

312,5 64

Table 2. Fractional Concentration Index (FIC) and Minimum Inhibitory

Concentration (MIC) (µg/mL) after combination of C. zeylanicum

essential oil with Nystatin on the strain of C. albicans ATCC 40277.

C. zeylanicum EO MIC 39 µg/mL

Nystatin MIC 32 µg/mL

FIC = 0.6024 (Additivity)

98

Figure 1. Growth kinetics of strains of C. albicans ATCC 40277 under activity of

the products assessed at MIC÷2 (*p<0.0001).


the products assessed at MIC (*p<0.0001).

*

*

99


the products assessed at MICx2 (p<0.0001).


the products assessed at MICx4 (*p<0.0001).

*

*

100


the products assessed at MICx8 (*p<0.0001).

REFERENCES

1. R.A. Monge, E. Roma’n, C. Nombela and J. Pla, J. The MAP Kinase signal transduction network in Candida albicans. Microbiology, 152, 905-912 (2006).

2. S. Gamarra, E.M.F. Rocha, Y.Q. Zhang, S. Park, R. Rao, D.S. Perlin. Mechanism of the synergistic effect of amiodarone and fluconazole in Candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother, 54, 1753-1761 (2010).

3. P. Pozzatti, L.A. Scheid, T.B. Spader, M.L. Atayde, J.M. Santurio, S.H. Alves. In vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J Microbiol. 54, 950-960 (2008).

4. V.G.S. Cavassani, J.A. Sobrinho, M.G.N. Homem and A. Rapoport. Candidíase oral como marcador de prognóstico em pacientes portadores do HIV. Revista Brasileira de Otorrinolaringologia, 68, 630-634 (2002).

5. R.D. Cannon, E. Lamping, A.R. Holmes, K. Niimi, P.V. Baret, M.V. Keniya, K. Tanabe, M. Niimi, A. Goffeau and B.C. Monk. Efflux-Mediated Antifungal Drug Resistance. Clinical Microbiology Reviews, 22, 291-321 (2009).

6. R. Khan, B. Islam, M. Akram, S. Shakil, A.A. Ahmad, S.M. Ali, M. Siddiqui and A.U. Khan. Antimicrobial activity of five herbal extracts against multi drug resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin. Molecules, 14, 586-597 (2009).

*

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pozzatti%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Scheid%20LA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spader%20TB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Atayde%20ML%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Santurio%20JM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Alves%20SH%22%5BAuthor%5D

101

7. H.D. Coutinho, J.G. Costa, E.O. Lima, V.S. Falcão-Silva, J.P. Siqueira-Júnior. In vitro interference of Hyptis martiusii Benth and chlorpromazine against an aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian Journal of Medical Research, 129, 566-568 (2009).

8. D. Puangpronpitag and C. Sittiwet. Antimicrobial properties of Cinnamomum verum aqueous extract. Asian Journal of Biological Sciences, 2, 49-53 (2009).

9. M.L Atayde, J.M. Santurio, S.H. Alves, P. Pozzatti, L.A. Scheid and T.B. Spader. In vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Canadian Journal of Microbiology, 54, 950-956 (2008).

10. I.B. Jantan, B.A.K. Moharam, J. Santhanam and J.A. Jamal. Correlation between chemical composition and antifungal activity of the essential oils of eight Cinnamomum species. Pharmaceutical Biology, 46, 405-412 (2008).

11. S. Bansod, M. Rai. Antifungal activity of essential oils from Indian medicinal plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger. World Journal of Medical Sciences, 3, 81-88 (2008).

12. A.C.P. Moreira, E.O. Lima, E.L. Souza, M.A. Van Dingenen and V.N. Trajano. Inhibitory effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential Oil and beta-pinene on the growth of dematiaceous moulds. Brazilian Journal of Microbiology, 38, 33-38 (2007).

13. J.N. Ellof. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Med, 64, 711-713 (1998).

14. D.P. Deswal and U. Chand. Standartization of the tetrazolium test for viability estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Science and Technology, 25, 409-17 (1997).

15. N.K. Dutta, S.G. Dastidar, A. Kumar, K. Mazumdar, R. Ray and A.N. Chakrabarty. Antimycobacterial activity of the antiinflammatory agent diclofenac sodium, and its synergism with streptomycin. Brazilian Journal of Microbiology, 35, 316-323 (2004).

16. C.H. Nightingale, P.G. Ambrose, G.L. Drusano and T. Murakawa. Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory and Cinical Practice. New York Medical (2002).

17. I. Rassoli and S.A. Mirmostafa, S. A. Antibacterial properties of Thimus pubescens and Thymus serpyllum essential oil. Fitoterapia, 73, 244-250 (2002).

18. E. Schmidt, L. Jirovetz, K. Wlcek, G. Buchbauer, V. Gochev, T. Girova, A. Stoyanova and M. Geissler. Antifungal activity of eugenol and various eugenol-containing essential oils against 38 clinical isolates of Candida albicans. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 10, 421-429 (2007).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coutinho%20HD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Costa%20JG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lima%20EO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Falc%C3%A3o-Silva%20VS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Siqueira-J%C3%BAnior%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ingentaconnect.com/content/nrc/cjm;jsessionid=3ecfgb52q2fbg.victoria

102

19. I.O. Lima, R.A.G. Oliveira, E.O. Lima, N.M.P. Farias and E.L. Souza. Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre espécieis de Candida. Revista Brasileira de Farmacognosia. 16, 197-201 (2006).

20. P.C. Gotzsche and H.K. Johansen. Nystatin prophylaxis and treatment in severely immunodepressed patients (Cochrane Review). The Cochrane Library, 1 (2002).

21. G.JR. Meades, R.L. Henken, G.L. Waldrop, M.M. Rahman, S.D. Gilman, G.P. Kamatou, A.M. Viljoen and S. Gibbons. Constituents of Cinnamon Inhibit Bacterial Acetyl CoA Carboxylase. Planta Medica. 76, 1570-1575 (2010).

22. F.C. Odds. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 52, 1 (2003).

23. M. Cuenca-Estrella. Combinations of antifungal agents in therapy–what value are they? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 54, 854-869 (2004).

24. B. Zhai, H. Zhou, L. Yang, J. Zhang, K. Jung, C. Giam, X. Xiang, X. Lin. Polymyxin B in combination with fluconazole, exerts a potent fungicidal effect. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65, 931-938 (2010).

25. H.D. Coutinho, J.G. Costa, E.O. LIma, V.S. Falcão-Silva and J.P. Siqueira-Júnior. Herbal therapy associated with antibiotic therapy: potentiation of the antibiotic activity against methicillin--resistant Staphylococcus aureus by Turnera ulmifolia L. BMC Complementary and Alternative Medicine, 8, 9-13 (2009b).

26. A.M.A. Nascimento, M.G.L. Brandão, G.B. Oliveira, I.C.P. Fortes and E. Chartone-Souza. Synergistic bactericidal activity of Eremanthus erythropappus oil or β-bisabolene with ampicillin against Staphylococcus aureus. Biomedical and Life Sciences, 92, 95-100 (2007).

27. M.D. Johnson, C. Macdougall, L. Ostrosky-Zeichner, J.R. Perfect and J.H. Rex. Combination Antifungal Therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48, 693-715 (2004).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Meades%20G%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Henken%20RL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Waldrop%20GL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rahman%20MM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gilman%20SD%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kamatou%20GP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Viljoen%20AM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gibbons%20S%22%5BAuthor%5D





http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Siqueira%20JP%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.springerlink.com/biomedical-and-life-sciences/

http://www.springerlink.com/content/0003-6072/92/1/

103

5.4 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum zeylanicum Blume EM ASSOCIAÇÃO À NISTATINA SOBRE A MICROMORFOLOGIA DE CEPAS DE Candida albicans.

RESUMO

Este estudo avaliou o efeito combinado do óleo essencial de C. zeylanicum e

nistatina sobre a micromorfologia de cepas de Candida albicans ATCC 40277.

Para tanto, foi utilizada a técnica do microcultivo para leveduras, utilizando o

meio de cultura agar-arroz em câmara úmida. Examinou-se, a partir de

microscópio ótico, a presença de estruturas características como pseudo-hifas,

bastoconídios e clamidoconídios. Foi observado que o óleo essencial de C.

zeylanicum e nistatina, nas menores concentrações avaliadas, que

correspondem a, respectivamente, 312,5 µg/mL e 64 µg/mL, foram capazes de

inibir a formação de hifas, pseudo-hifas e clamidoconídeos. De forma

associada, mesmo em concentrações iniciais de 39 µg/mL e 32 µg/mL do OE

de C. zeylanicum e nistatina, respectivamente, foi possível observar resultado

semelhante, com a inibição do desenvolvimento das células fúngicas. Os

resultados indicam que o óleo essencial de C. zeylanicum isolado e associado

à nistatina é capaz de promover redução na capacidade de desenvolvimento

das células de C. albicans.

Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum, Nistatina, Candida albicans,

sinergismo farmacológico

104

EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) ESSENTIAL OIL

ALONE AND COMBINED WITH NYSTATIN ON MICROMORPHOLOGY OF

Candida albicans STRAINS4

Ricardo Dias de Castro*1, Edeltrudes de Oliveira Lima2

1Doctorate Student: Bioactive Synthetic and Natural Products (Pharmacology),

Federal University of Paraíba. Assistant Professor, Department of Clinics and

Social Dentistry, Federal University of Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brazil.

[email protected]. CEP 58059-900.

2PhD, Associate Professor, Department of Pharmaceutical Sciences, Federal

University of Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brazil. [email protected].

CEP 58059-900.

Correspondence to:


Departament of Clinics and Social Dentistry. Center for Health Sciences.

Federal University of Paraíba, Campus I, Cidade Universitária, João Pessoa,

Paraíba. POSTAL CODE: 58059-900.

Phone: 55 (83) 9317-1071


4 Artigo submetido ao periódico Revista Brasieira de Farmacognosia.




105

EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) ESSENTIAL OIL

ALONE AND COMBINED WITH NYSTATIN ON MICROMORPHOLOGY OF

Candida albicans STRAINS

ABSTRACT

This study evaluated the combined effect between C. zeylanicum essential oil

and nystatin on the micromorphology of Candida albicans strains ATCC 40277.

For this, it was used the microculture technique for yeasts, using agar-rice

culture medium in a moist chamber. Under optical microscopy, it was examined

the presence of characteristic structures as pseudohyphae, blastoconidia and

chlamydoconidia. C. zeylanicum essential oil and nystatin, at the lowest

concentrations tested, 312.5 µg/mL and 64 µg/mL respectively, were able to

inhibit the formation of hyphae, pseudohyphae and chlamydoconidia. In

combination, even at initial concentrations of 39 µg/mL and 32 µg/mL for C.

zeylanicum EO and nystatin, respectively, similar results were observed,

through inhibition of fungal cells development. The results indicate that the

essential oil of C. zeylanicum alone and combined with nystatin is able to

promote reduction in the C. albicans cells development capacity.

Keywords: Cinnamomum zeylanicum, Nystatin, Candida albicans, Drug

synergism

INTRODUCTION

Considering that fungal resistance to therapeutic agents available has

been increasing as a result of a growing population of immunocompromised

individuals and frequent use of prophylaxis and empirical treatment with

106

antifungals (Andes et al., 2006, Rautemaa et al. 2007, Pozzati et al., 2008,

Dunkel et al. 2008, Cannon et al. 2009, Martel et al. 2010), there is a real need

to introduce new antimicrobial agents in the therapeutic arsenal (Khan et al.,

2009).

In the perspective of developing new drugs, natural products are

presented as a therapeutic possibility, since they differ from the synthetics with

regard to molecular diversity. It is known that the molecular diversity of natural

products is much higher than that derived from synthesis processes, which

despite of considerable progress, are still limited. This provides the

development of various new drugs with diverse therapeutic functions (Nisbet &

Moore, 1997).

Among the products derived from plants with recognized antifungal

activity, it’s highlighted the essential oil obtained from C. zeylanicum, which has

been widely studied by many researchers (Lima et al., 1993, Bonjar, Aghighi,

Karimi, 2004, Moreira et al., 2007, Atayde et al. 2008, Bansod & Rai, 2008,

Jantam al. 2008, Kahn et al. 2009, Puangpronpitag & Sittiwet, 2009).

Some authors propose the combination of antifungal compounds

conventionally used in the clinic with natural products, in an attempt to promote

greater effectiveness of each drug, thus allowing the use of lower doses of both

products (Nascimento et al. 2007, Coutinho et al. 2009a, Coutinho et al. 2009b,

Coutinho et al. 2009c, Gamarra et al. 2010, Zhai et al. 2010). This combination

may represent a new way to tackle multi-resistant microrganisms, and prevent

contact of these microrganisms with synthetic agents, thus reducing the risk of

selecting new or improved mechanisms of resistance (Coutinho, 2008).

107

Given the above, this study aimed to evaluate the effect of C. zeylanicum

essential oil alone and combined with nystatin on the micromorphology of

Candida albicans strains involved with mucocutaneous infections.


Microrganisms


Center for Health Sciences, Federal University of Paraiba, which provided

strains of C. albicans ATCC 40277.

Essential Oil

The EO whose antifungal activity has been under study was obtained

from Ferquima Ind. and Comp. Ltd (Vargem Grande Paulista, Sao Paulo,

Brazil). Its physical and chemical parameters were described by the supplier,

which produces and markets essential oils on an industrial scale.




in the study was determined based on the product’s density (d = 1.040 g/mL).

Effect of the essential oil alone and combined with nystatin on the

micromorphology of C. albicans strains

For observation of morphological changes in the C. albicans strains

(ATCC 40277), it was used the technique of microculture for yeasts, using agar-

rice in moist chamber (Gungi, Arima, Beppu, 1983, Kurtzman & Fell, 1998).

108

Taking into consideration previous studies performed by us for

determination of Minimum Inhibitory Concentrations of these products on the

same strain used in this study (MIC of C. zeylanicum EO alone = 312.5 µg/mL;

MIC of C. zeylanicum EO combined = 39 µg/mL; MIC of nystatin alone = 64

µg/mL; MIC of nystatin combined = 32 µg/mL) were added sufficient amounts of

the EO’s emulsion and nystatin, alone and in combination, to the culture

medium agar-rice, in order to obtain various concentrations of the products

(MIC, MICx2, MICx4 and MICx8). Then, into a Petri plate were deposited 3 ml

of agar-rice associated with the products tested, on their respective

concentrations, blown on a sterile glass slide contained in a support (another

slide). After culture medium solidification, the yeasts were seeded by using a

needle in "L" and 02 parallel striations were made. The striations were covered

with sterile coverslips. To avoid desiccation of the medium, it was made a moist

chamber through addition of 2 mL of distilled water on a piece of sterile filter

paper (3x3 cm) on the plate, during the incubation period. The plate was closed

and after 24h, 48h and 72h, the preparation was examined under optical

microscope. In each slide was observed presence of characteristic structures as

pseudohyphae, blastoconidia and chlamydoconidia.


The formation of hyphae and pseudohyphae is related to virulence

factors expressed by C. albicans, as these structures represent a barrier to

phagocytosis and allow the settlement of yeasts on epithelial tissue.

Morphological change is associated with the microrganism’s pathogenicity, and

109

it is believed that environmental factors influence the physiological state of the

commensal yeast (Romani, Bistoni, Puccetti, 2003).

This is the first study demonstrating the activity of the essential oil of C.

zeylanicum and nystatin alone and in combination on fungal micromorphology,

what hampers the comparison with other studies.

The results indicate that, when assessed alone at the lowest

concentrations under test (312.5 µg/mL for EO and 64 µg / mL for nystatin) the

products were able to inhibit the formation of hyphae, pseudohyphae and

chlamydoconidia. These data are consistent with information reported in the

literature about the recognized activity of these products against C. albicans

strains (Quale et al. 1996, Blomgren, Berggren, Jontell et al. 1998, Gotzsche &

Johansen, 2002, Lima et al., 2006, Playford et al. 2006, Moreira et al. 2007,

Pozzatti et al., 2008, Austin, Darlowo, Mcguire, 2009).

In combination, even at initial concentrations of respectively 39 µg/mL

and 32 µg/mL for C. zeylanicum EO and nystatin, similar results were observed,

occurring inhibition of fungal cells development.

On the other hand, as shown in Figure 1A, the cells seeded in culture

medium devoid of antifungal agent were able to develop themselves, and

therefore presented inherent characteristics of the specie, what reflects cells

viability and their normal capability of morphogenesis.

There are few studies designed to evaluate the activity of essential oils

on fungal micromorphology. In the study by Martins (2009) it was found that in

presence of Citrus limon Linn essential oil at 78 µg/mL, clinical isolates of C.

albicans were able to grow in an incipient way, and microscopic analysis

showed blastoconidia and rare rudimentary hyaline pseudohyphae.

110

This study represents a considerable advance in knowledge about the

antifungal activity of C. zeylanicum EO alone and combined with nystatin on C.

albicans strains. However, further researches to assess this activity on resistant

clinical isolates are needed. Furthermore, the use of experimental models that

reproduce the formation of biofilms should be considered, since they represent

a greater possibility to antifungals currently used in therapeutics.

CONCLUSION

The essential oil of C. zeylanicum alone and combined with nystatin is

able to promote reduction in the development of morphological structures of the

C. albicans cells, as pseudohyphae, blastoconidia and chlamydoconidia.

REFERENCES

Andes D, Forrest A, Lepak A, Nett K, Marchillo K, Lincoln I 2006. Impact of

Antimicrobial Dosing Regimen on Evolution of Drug Resistance In Vivo:

Fluconazole and Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother 50: (2374-

2383).

Atayde ML, Santurio JM, Alves SH, Pozzatti P, Scheid IA, Spader TB 2008. In

vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices against

fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J Microbiol

54: (950-956).

Austin N, Darlow BA, Mcguire W 2009. Prophylactic oral/topical non-absorbed

antifungal agents to prevent invasive fungal infection in very low birth weight

infants (Cochrane Review). The Cochrane Library 7: Oxford: Update Software.


111

Bansod S, Rai M 2008. Antifungal activity of essential oils from Indian medicinal

plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger. W Med

Sci 3: (81-88).

Blomgren J, Berggren U, Jontell M 1998. Fluconazole versus nystatin in the

treatment of oral candidosis. Acta Odontol Scand 56: (202-205).

Bonjar GH, Aghighi S, Karimi-Nik A 2004. Antibacterial and antifungal survery in

plants used in indigenous herbal-medicine of south east regions of Iran. J Biol

Sci 4: (405-412).

Cannon RD, Lamping E, Holmes AR, Niimi K, Baret PV, Keniya MV, Tanabe K,

Niimi M, Goffeau A, Monk BC 2009. Efflux-Mediated Antifungal Drug

Resistance. Clin Microbiol Rev 22: (291-321).

Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP 2009a.

In vitro interference of Hyptis martiusii Benth. & chlorpromazine against an

aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian J Med Res129: (566-568).

Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP 2009b.

Potentiating effect of Mentha arvensis and chlorpromazine in the resistance to

aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. In Vivo 23:

(287-289).

Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP 2009c.

Herbal therapy associated with antibiotic therapy: potentiation of the antibiotic

activity against methicillin--resistant Staphylococcus aureus by Turnera ulmifolia

L. BMC Complement Altern Med 8: (9-13).
















112

Coutinho HDM 2008. Avaliação da atividade antibacteriana e

fotossensibilizante de produtos naturais da região do cariri cearense. Tese de

doutorado. Programa de Pós Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos

Bioativos, Universidade Federal da Paraíba. 2008.

Dunkel N, Liu TT, Barker KS, Homayouni R, Morschhäuser J, Rogers D 2008. A

Gain-of-Function Mutation in the Transcription Factor Upc2p Causes

Upregulation of Ergosterol Biosynthesis Genes and Increased Fluconazole

Resistance in a Clinical Candida albicans Isolate. Eukaryotic Cell 7: (1180-

1190).

Gamarra S, Rocha EMF, Zhang YQ, Park S, Rao R, Perlin DS 2010.

Mechanism of the Synergistic Effect of Amiodarone and Fluconazole in Candida

albicans. Antimicrob Agents Chemother 54: (1753-1761)

Gotzsche PC, Johansen HK 2002. Nystatin prophylaxis and treatment in

severely immunodepressed patients (Cochrane Review). The Cochrane Library

4: Oxford: Update Software.

Gungi S, Arima K, Beppu T 1983. Screening of antifungal according to inducing

morfological abnormalities. Agric Biol Chem 47: (2061-1069).

Jantan I, Yeoh EL, Suriani R, Noorsiha A, Abu-Said A 2003. A comparative

study of the constituents of the essential oils of three Cinnamomum species

from Malaysia. J Essent Oil Res 15: (387-391).

Khan R, Islam B, Akram M, Shakil S, Ahmad AA, Ali SM, Siddiqui M, Khan AU

2009. Antimicrobial activity of five herbal extracts against multi drug resistant

(MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin. Molecules 14: (586-597).

113

Kurtzman CP, Fell JW 1998 The yeats, a taxonomie study. Amsterdam:

Elsevier Science B. V.

Lima EO, Gompertz OF, Giesbrecht AM, Paulo MQ 1993. In vitro antifungal

activity of essential oils obtained from officinal plants against dermatophytes.

Mycoses 36: (333-336).

Lima IO, Oliveira RAG, Lima EO, Farias NMP, Souza EL 2006. Antifungal

activity from essential oils on Candida species. Braz J Pharmacogn 16: (197-

201).

Martel CM, Parker JE, Bader O, Weig M, Gross U, Warrilow AGS, Kelly DE,

Kelly SL 2010. A Clinical Isolate of Candida albicans with Mutations in ERG11

(Encoding Sterol 14 -Demethylase) and ERG5 (Encoding C22 Desaturase) Is

Cross Resistant to Azoles and Amphotericin B. Antimicrob Agents Chemother

54: (3578-3583).

Martins IMCLB. Avaliação da ação antifúngica de Citrus limon Linn. frente a

leveduras do gênero Candida. João Pessoa, 76p. Dissertação de Mestrado.

Programa de Pós Graduação em Odontologia, Universidade Federal da

Paraíba.

Moreira ACP, Lima EO, Souza EL, Van Dingenen MA, Trajano VN 2007.

Inhibitory effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential Oil

and beta-pinene on the growth of dematiaceous moulds. Braz J Microbiol 38:

(33-38).

Nascimento AMA, Brandão MGL, Oliveira GB, Fortes ICP, Chartone-Souza E

2007. Synergistic bactericidal activity of Eremanthus erythropappus oil or β-

114

bisabolene with ampicillin against Staphylococcus aureus. Biomedical and Life

Sciences 92: (95-100).

Nisbet IJ, Moore M 1997. Will natural products remain na important source of

drug research for the future? Curr Opin Biotechnol 8: (708-712).

Playford EG, Webster AC, Sorrell TC, Craig JC 2006. Antifungal agents for

preventing fungal infections in non-neutropenic critically ill and surgical patients:

systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials. J Antimicrob

Chemother 57: (628-638).

Pozzatti P, Scheid IA, Spader TB, Atayde ML, Santurio JM, Alves SH 2008. In

vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices against

fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J Microbiol

54: (950-960).

Puangpronpitag D, Sittiwet C 2009. Antimicrobial properties of Cinnamomum

verum aqueous extract. Asian J Biol Sci 2: (949-953).

Quale JM, Landman D, Zaman M, Bumey S, Sathe SS 1996. In Vitro Activity of

Cinnamomum zeylanicum Against Azole Resistant and Sensitive Candida

Species and a Pilot Study of Cinnamon for Oral Candidiasis. The American

Journal of Chinese Medicine 24: (103-109).

Rautemaa R, Richardson M, Pfaller M, Koukila-Käkhölä P, Perheentupa J,

Saxén H 2007. Decreased susceptibility of Candida albicans to azole

antifungals: a complication of long-term treatment in autoimmune










115

polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED) patients. J

Antimicrob Chemother 60: (889-892).

Romani l, Bistoni F, Puccetti P 2003. Adaptation of Candida albicans to the host

environment: the role of morphogenesis in virulence and survival in mammalian

hosts. Curr Opin Microbiol 6: (338-343).

Zhai B, Zhou H, Yang I, Zhang J, Jung K, Giam C, Xiang X, Lin X 2010.

Polymyxin B, in combination with fluconazole, exerts a potent fungicidal effect. J

Antimicrobial Chemother 65: (931-938).

116

Table 1. Micromorphological changes promoted by the products under test on C.

albicans strains (ATCC 40277).

Pseudohyphae Blastoconidia Chlamydoconidia

C.

ze

yla

nic

um

Alo

ne

MIC - + -

MIC x 2 - + -

MIC x 4 - + -

MIC x 8 - + -

Nysta

tin a

lone

MIC - + -

MIC x 2 - + -

MIC x 4 - + -

MIC x 8 - + -

C.

ze

yla

nic

um

+ n

ysta

tin MIC - + -

MIC x 2 - + -

MIC x 4 - + -

MIC x 8 - + -

H2O

-

+

+

+

(+): Presence

(-): Absence

117

Figure 1. Microscopic appearance of C. albicans strain (ATCC 40277): A - growth

control; B - C. activity of C. zeylanicum EO (39 µg/mL) combined with nystatin (32

µg/ml); C - activity of nystatin (64 µg/ml); D - activity of C. zeylanicum EO (312.5

µg/mL).

118

5.5 EFEITO COMBINADO DA AÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE C.

zeylanicum Blume E NISTATINA SOBRE CEPAS DE Candida NÃO-

ALBICANS

RESUMO

O propósito deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial

(OE) de Cinnamomum zeylanicum Blume isolado e associado à nistatina sobre

cepas de Candida não-albicans. Para tanto, foi determinada a concentração

inibitória mínima (CIM), utilizando o método da microdiluição, bem como a

concentração inibitória fracionada (FIC), visando conhecer os possíveis efeitos

sinérgicos da associação. Para realização dos ensaios foram utilizadas cepas

de C. tropicalis ATCC 40042 e C. krusei ATCC 40147. O OE de C. zeylanicum

e nistatina quando avaliados isoladamente apresentaram, respectivamente,

CIM de 312,5 µg/mL e 64 µg/mL sobre ambas as cepas ensaiadas. Quando

associados, foram encontrados CIM de, respectivamente, 39 µg/mL e 32 µg/mL

para o EO e nistatina. O valor do FIC foi de 0,6024 para ambas as cepas

ensaiadas, indicando aditividade do efeito inibitório sobre o crescimento

fúngico. Os resultados indicam que o OE de C. zeylanicum apresenta atividade

antifúngica sobre as cepas de Candida não-albicans avaliadas e que a

associação do mesmo à nistatina promove potencialização desse efeito.

Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum; sinergismo farmacológico;

Candida; Candida tropicalis

119

COMBINED EFFECT OF CInnamomum zeylanicum BLUME ESSENTIAL OIL AND NYSTATIN ON STRAINS OF NON-ALBICANS Candida5

Ricardo Dias Castro, Federal University of Paraiba, Center for Health Sciences,

Department of Clinical and Social Dentistry, João Pessoa, Paraíba, Brazil. E-

mail: [email protected]

Edeltrudes de Oliveira Lima, Federal University of Paraiba, Center for Health



Corresponding to:


Sidney Clemento Dore, 220, Apto 603, Tambaú, João Pessoa, Paraíba, Brazil.

CEP: 58030-230

Fone.: (83) 9317-1071 (83) 3021-3446


5 Artigo submetido ao periódico Journal of Natural Medicines

120

COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume ESSENTIAL OIL

AND NYSTATIN ON STRAINS OF NON-ALBICANS Candida

ABSTRACT

The purpose of this study was to evaluate the antifungal activity of essential oil

(EO) of Cinnamomum zeylanicum Blume alone and combined with Nystatin on

strains of non-albicans Candida. For this, it was determined the Minimum

Inhibitory Concentration (MIC), using the microdilution method, as well as the

Fractional Inhibitory Concentration (FIC) to determine the possible synergistic

effects of the association. Strains of C. tropicalis ATCC 40147 and C. krusei

ATCC 40042 were used in the tests. When assessed separately, C. zeylanicum

EO and Nystatin presented MICs of 312.5 µg/mL and 64 µg/mL, respectively,

on both tested strains. When combined, were found MICs of 39 µg/mL and 32

µg/mL for the EO and for Nystatin, respectively. The FIC value was 0.6024 for

both tested strains, indicating additivity of the inhibitory effect on fungal growth.

The results indicate that C.zeylanicum EO has antifungal activity against the

strains of non-albicans Candida evaluated and that its association with Nystatin

potentiates this effect.

Key-words: Cinnamomum zeylanicum; Drug Synergism; Candida krusei;

Candida tropicalis

INTRODUCTION

Candidiasis is a fungal infection caused by the presence of yeasts of

Candida genus, which is a member of the family Cryptococcaceae. In total,

about 81 species are recognized, especially C. albicans for its virulence and

potential to promote disease. Besides that, other species also contribute to the

development of disease, such as C. tropicalis and C. krusei [1-3].

121

In immunocompromised individuals, especially those affected by HIV /

AISD, about 74% have lesions in the oral mucosa resulting from infections

caused by Candida spp. [4]. It is noteworthy that oral candidiasis in these

subjects can act as a marker of disease progression and as a predictive for

increasing immunosuppression.

Clinically, the disease may arise as mucosal until systemic

manifestations, characterized by the invasion of various organs. The oral,

vaginal and esophageal mucosas are the most affected sites in cases of

candidiasis. Systemic infections, occurring as a result of hematological

dissemination, may cause microabscesses throughout the body. For spreading

C. albicans cells, the vascular endothelium actively participates in the process,

through interaction between receptors present on endothelial cells and adhesins

expressed by yeasts [5,6]

The medication approach to treat candidiasis includes topical and

systemic antifungal agents. The three major classes of antifungal agents

currently used are polyenes (e.g. Nystatin and Amphotericin B), imidazoles

(such as Clotrimazole and Miconazole) and triazoles (e.g. Fluconazole and

Itraconazole) [7].

Whereas oral candidiasis is a superficial infection, usually the initial

treatment is done with a topical agent. Nystatin and Miconazole are the drugs of

initial choice. If topical therapy fails to submit results, systemic treatment is

initiated, and Fluconazole is the most prescribed drug [7].

However, considering the emergence of resistant species of albicans and

non-albicans Candida to agents therapeutically available as a result of the

increased number of immunocompromised population and of the increasingly

frequent use of prophylaxis and empirical treatment with antifungals [8], it’s

verified that there is a clear and emerging need to introduce new antimicrobials

agents in the therapeutic arsenal [9,10].

In this perspective, comes up the possibility to investigate the interactive

effects of conventional antifungal compounds and natural products [11]. This

interaction can promote greater effectiveness of each drug, thus allowing the

use of lower doses of both the substances [12].

122

Thus, considering the known antimicrobial activity of Cinnamomum

zeylanicum Blume essential oil [9, 13-15], the purpose of this study was to

evaluate the antifungal activity of this natural product alone and combined with

Nystatin on strains of C. tropicalis and C. krusei.


Microrganisms



strains of C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC 40147.

Essential Oil

The EO whose antifungal activity is under study was obtained from

Ferquima Ind. and Comp. Ltd (Vargem Grande Paulista, Sao Paulo, Brazil). Its

physical and chemical parameters were described by the supplier, which

produces and markets essential oils on an industrial scale.






The MIC determination for the essential oil and for Nystatin was




zeylanicum EO and Nystatin were distributed at an initial concentration of 5.000

µg/mL and 128 µg/mL, respectively. From these concentrations were conducted

serial dilutions by withdrawing an aliquot of 100 µL from the most concentrated

well and inserting it into the following well. Finally, aliquots of 10 µL of inoculum

correspondent to the strains under test were dispensed into the wells of each

column. In parallel, it was made a yeast viability control. Tests were performed

in triplicate, and the plates were incubated at 35°C for 24-48 hours [16].

123





capable of producing visible inhibition on the growth of yeast strains [16].


concentrations, 10 µL of TTC dye (2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride) were




the live samples, red-colored, from the dead samples that keep their color [17].


Combined effect between Nystatin and C. zeylanicum EO was

determined by the microdilution technique - checkerboard - for derivation of the


The turbidity of the fungal suspensions of C. tropicalis ATCC 40042 and

C. krusei ATCC 40147 was compared and adjusted to that presented by the

barium sulphate suspension referent to the tube 0.5 of McFarland scale, which

corresponds to an inoculum of approximately 106 Colony Forming Units/mL

(CFU/mL). Solutions of the products tested were used at concentrations

determined from their respective MIC. Initially, 100 µL of Sabouraud Dextrose

culture medium were added into the holes of a 96-well U-bottom microtiter plate

(ALAMAR®). Then, 50 µL of each product tested whose concentrations ranged

among MIC÷4, MIC÷2, MIC, MICx2 and MIC×4 were added in the horizontal

(Nystatin) and vertical (essential oil) directions of the plate. Finally, the culture

medium was inoculated with 10 µL of fungal suspension. Fungal growth was

evidenced through the use of TTC dye. The test was performed in triplicate, and

the microplates were incubated at 37ºC for 48 hours [18,19].


EO and B is Nystatin. FICA is calculated through the ratio MICA combined /


124


and <4) or antagonism (> 4.0) [18-20].


The essential oil of C. zeylanicum and Nystatin, when assessed

separately, presented MIC of 312.5 µg/mL and 64 µg/mL, respectively, on both

tested strains, C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC 40147, as seen in

Table 1. These findings confirm the data presented by other studies [11, 21-24].

The antifungal activity of C. zeylanicum EO has been attributed to its

major constituents [21].. As regards the chemical composition, studies indicate

that eugenol is the main component of this essential oil [11]. Meades et al [25]

suggest that this activity may be due to the action of trans-cinnamaldehyde.

Once identified the antifungal activity of C. zeylanicum essential oil on

the species of non-albicans Candida under test, it was sought to evaluate

whether this activity would suffer influence when the EO were combined with

Nystatin, a conventional antifungal used for the treatment of mucocutaneous

candidiasis.


essential oil and Nystatin on strains of C. tropicalis ATCC 40042 and C.

krusei ATCC 40147.

MIC (µg/mL)

Strains C. zeylanicum Nystatin

C. tropicalis

ATCC 40042

312.5

64

C. krusei

ATCC 40147

312.5

64

As seen in Tables 2 and 3, there was a decrease in MIC values for both

substances. The values found were 39 µg/mL and 32 µg/mL for the EO and

Nystatin, respectively, representing a reduction of 87.52% and 50% from the

125

concentrations initially used. After obtaining these findings, FIC was calculated

and its value was 0.6024 for both strains tested, indicating additivity of the

inhibitory effect on fungal growth.

This is the first study evaluating the antifungal effect of the combination

between C. zeylanicum EO and Nystatin against non-albicans Candida species.

However, the association of other natural products to conventional antibiotics

has been reported by some contemporary authors [26-29], what reflects an

increasing interest for this type of theoretical and methodological approach.

There are several experimental models that measure the effects of drug

combinations. One of the simplest and well known protocols is the

"checkerboard" test, which provides a two-dimensional array of different

concentrations of the substances evaluated and allows the calculation of

Fractional Inhibitory Concentration index (FIC) [11,12].

Johnson et al. [30] point out some probable mechanisms responsible for

synergistic activity presented by the combination of antifungal agents, as

follows: a) inhibition of different stages in the yeast intracellular biochemical

pathways, essential for cellular survival; b) increased penetration of the

antifungal agent provided by the action of other antifungal in the fungal cell

membrane. This interaction can be observed, for instance, through the

interaction between Amphotericin B or Fluconazole and Rifamycin; c) inhibition

of carrier proteins. For example, Amphotericin B inhibits the action of plasma

membrane proteins that would promote the extrusion of flucytosine, which

remains inside the cell and exerts its effect; d) inhibition of different cellular

targets simultaneously. This effect can be observed in drugs that exert their

effects on the cell wall and another that acts on the plasma membrane.

Given the above, it is recognized as promising the possibility of using

natural products combined with traditional antimicrobials in order to increase the

antimicrobial potential of drugs [31]. These combinations may represent a new

option for elimination of multiresistant fungi and for reducing the exposure of

conventional antifungal agents to these microrganisms, thus reducing the risk of

selecting new or improved mechanisms of resistance [29].

126

Table 2. Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC) after combination

between C. zeylanicum essential oil and Nystatin on C. tropicalis strain ATCC

40042.



FIC 0,6024 (Additivity)

Table 3. Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC) after combination

between C. zeylanicum essential oil and Nystatin on C. krusei strain ATCC

40147.



FIC 0,6024 (Additivity)

CONCLUSION

The essential oil of C. zeylanicum alone and combined with Nystatin is able to

promote reduction in the non-albicans Candida cells development capacity.

REFERENCES

1 Thein ZM, Samaranayake YH, Samaranayake LP (2006). Effect of oral

bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Arch Oral Biol

51:672-680.

127

2. Henriques M, Azeredo J, Oliveira R (2006). Candida albicans and Candida

dubliniensis: comparison of biofilm formation in terms of biomass and activity.

Br J Biomed Sci 63:5-11.

3. Ramage G, Saville SP, Thomas DP, Lo’pez-Ribot JL (2005). Candida

Biofilms: an Update. Eukaryot Cell 4:633-638.

4. Laskaris G, Hadjivassiliov M, Tratigos J (1992). Oral signs and symptoms in

160 HIV-infected patients. J Oral Path Med 21:120-123.

5. Müller V, Viemann D, Schmidt M, Endres N, Ludwing S, Leverkus M; Roth J,

Goebelers M (2007). Candida albicans Triggers Activation of Distinct Signaling

Pathways to Establish a Proinflammatory Gene Expression Program in Primary

Human Endothelial Cells. J Immun 179:8435-8445.

6. Filler SG, Swerdloff JN, Hobbs C, Luckett PM (1995). Penetration and

Damage of Endothelial Cells by Candida albicans. Infect Immun 63:976–983.

7. Paiva ICA, Ribeiro RA, Pereira JV, Oliveira NMC (2009). Clinical and

laboratorial evaluation of Uncaria tomentosa (Cat’s Claw) gel on oral

candidiasis. Braz J Pharmacogn 19:423-428.

8. Rautemaa R, Richardson M, Pfaller M, Koukila-Käkhölä P, Perheentupa J,

Saxén H (2007). Decreased susceptibility of Candida albicans to azole

antifungals: a complication of long-term treatment in autoimmune

polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED) patients. J

Antimicrob Chemother 60:889-892.

9. Khan R, Islam B, Akram M, Shakil S, Ahmad AA, Ali SM, Siddiqui M, Khan

AU (2009). Antimicrobial activity of five herbal extracts against multi drug

resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin. Molecules

14:586-597.

10. Pozzatti P, Scheid IA, Spader TB, Atayde ML, Santurio JM, Alves SH

(2008). In vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices

against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J

Microbiol 54:950-960.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Filler%20SG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Swerdloff%20JN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hobbs%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Luckett%20PM%22%5BAuthor%5D







128

11. Odds FC (2003). Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts

between them. J Antimicrob Chemother 52:1.

12. Estrella-cuenca M (2004). Combinations of antifungal agents in therapy–

what value are they? J Antimicrob Chemother 54:854-869.

13. Puangpronpitag D, Sittiwet C (2009). Antimicrobial properties of

Cinnamomum verum aqueous extract. Asian J Biological Sci 2:49-53.

14. Atayde ML, Santurio JM, Alves SH, Pozzatti P, Scheid IA, Spader TB

(2008). In vitro activity of essential oils extracted from plants used as spices

against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp. Can J

Microbiol 54:950-956.

15. Bansod S, Rai M (2008). Antifungal activity of essential oils from Indian

medicinal plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger.

W J Med Sci 3:81-88.

16. Ellof JN (1998). A sensitive and quick microplate method to determine the

minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica

64:711-713.

17. Deswal DP, Chand U (1997). Standartization of the tetrazolium test for

viability estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Science and

Technology 25:409-17.

18. Dutta NK, Dastidar SG, Kumar A, Mazumdar K, Ray R, Chakrabarty NA

(2004). Antimycobacterial activity of the antiinflammatory agent diclofenac

sodium, and its synergism with streptomycin. Braz J Microbiol 35:316-323.

19. Eliopoulos GM, Moellering RC (1991). Antimicrobial combinations. In: Lorian

V (ed) Antibiotics in Laboratory Medicine. Baltimore, pp 434-44.

20. Nightingale CH, Ambrose PG, Drusano GI, Murakawa T (2002).

Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory and Cinical Practice. New York

Medical.

21. Schmidt E, Jirovetz l, Wlcek K, Buchbauer G, Gochev V, Girova T,

Stoyanova A, Geissler M (2007). Antifungal activity of eugenol and various




129

eugenol-containing essential oils against 38 clinical isolates of Candida

albicans. J Essent Oil Bearing Plants 10:421-429.

22. Gotzsche PC, Johansen HK (2002). Nystatin prophylaxis and treatment in

severely immunodepressed patients. Cochrane Database Syst Rev 4:

CD002033.

23. Patton IL, Bonito AJ, Shugara DA (2001). A systematic review of the

effectiveness of antifungal drugs for the prevention and treatment of

oropharyngeal candidiasis in HIV-positive patients. Oral Med Oral Pathol Oral

Radiol Endodontol 92:170-179.

24. Quale JM, Landman D, Zaman M, Bumey S, Sathe SS (1996). In Vitro

Activity of Cinnamomum zeylanicum Against Azole Resistant and Sensitive

Candida Species and a Pilot Study of Cinnamon for Oral Candidiasis. Am J

Chin Med 24:103-109.

25. Meades GJR, Henken RL, Waldrop GL, Rahman MM, Gilman SD,

Kamatou GP, Viljoen AM, Gibbons S (2010). Constituents of Cinnamon Inhibit

Bacterial Acetyl CoA Carboxylase. Planta Medica 76:1570-1575.

26. Gamarra S, Rocha EMF, Zhang YQ, Park S, Rao R, Perlin DS (2010).

Mechanism of the Synergistic Effect of Amiodarone and Fluconazole in Candida

albicans. Antimicrob Agents Chemother 54:1753-1761.

27. Zhai B, Zhou H, Yang I, Zhang J, Jung K, Giam C, Xiang X, Lin X (2010).

Polymyxin B, in combination with fluconazole, exerts a potent fungicidal effect. J

Antimicrob Chemother 65:931-938.

28. Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP

(2009a). In vitro interference of Hyptis martiusii Benth. and chlorpromazine

against an aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian J Med Res

129:566-568.

29. Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP

(2009b). Potentiating effect of Mentha arvensis and chlorpromazine in the





















130

resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. In

Vivo 23:287-289.

30. Johnson MD, Macdougall C, Ostrosky-Zeichner I, l.; perfect, j. R.; rex, j. H.

Combination Antifungal Therapy. J Antimicrob Chemother, v. 48, n. 3, p. 693-

715, 2004.

31. Zago JAA, Ushimaru PI, Barbosa IN, Fernandes Júnior A (2009). Synergism

between essential oils antimicrobial drugs against Staphylococcus aureus and

Escherichia coli strains from human infections. Braz J Pharmacogn 19:828-833.

131

5.6 EFEITO COMBINADO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum

zeylanicum Blume E MICONAZOL SOBRE CEPAS DE Candida.

RESUMO

Considerando a necessidade de introduzir novos agentes terapêuticos para

tratamento de candidíase superficial, este estudo objetivou avaliar o efeito

combinado do óleo essencial (OE) de Cinnamomum zeylanicum Blume e

miconazol sobre cepas de Candida. Para tanto, foi determinada a concentração

inibitória mínima (CIM) de ambos os produtos e o índice de concentração

inibitória mínima fracionada (FIC) – checkerboard Test. Quando avaliados

isolados, C. zeylanicum e miconazol apresentaram CIM de, respectivamente,

312,5 µg/mL e 32 µg/mL sobre todas as cepas ensaiaas. Após a associação

dos produtos, foi observado que o OE de C. zeylanicum inibiu o crescimento

das leveduras na concentração de 39 µg/mL. Por outro lado, o miconazol,

quando associado, apresentou CIM de, repectivamente, 128, 32 e 32 µg/mL,

sobre cepas de C. albicans, C. tropicalis e C. krusei. Esses resultados indicam

valores de FIC de, respectivamente, 4,1248 (antagonismo), 1,1248

(indiferença) e 1,1248 (indiferença), para C. albicans, C. tropicalis e C. krusei.

Assim, verifica-se que associação do óleo essencial de C. zeylanicum ao

miconazol não constitui em uma possibilidade vantajosa para inibição de

crescimento de Candida spp.

Palavras-Chave: Cinnamomum zeylanicum, miconazol, sinergismo

farmacológico, Candida spp., Candida albicans

132

5.6 COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume ESSENTIAL

OIL AND MICONAZOLE ON Candida strains

Ricardo Dias de Castro, Doctorate Student: Bioactive Synthetic and Natural

Products (Pharmacology), Federal University of Paraíba. Assistant Professor,

Department of Clinics and Social Dentistry, Federal University of Paraíba, João

Pessoa, Paraíba, Brazil. [email protected].

Edeltrudes de Oliveira Lima, PhD, Associate Professor, Department of

Pharmaceutical Sciences, Federal University of Paraíba, João Pessoa, Paraíba,

Brazil. [email protected].

Correspondence to:


Departament of Clinics and Social Dentistry. Center for Health Sciences.

Federal University of Paraíba, Campus I, Cidade Universitária, João Pessoa,

Paraíba. POSTAL CODE: 58059-900.

Phone: 55 (83) 9317-1071





133

COMBINED EFFECT OF Cinnamomum zeylanicum Blume ESSENTIAL OIL

AND MICONAZOLE ON Candida strains

ABSTRACT

Considering the need to introduce new therapeutic agents for the treatment of

superficial candidiasis, this study aimed to evaluate the combined effect of

essential oil (EO) of Cinnamomum zeylanicum Blume and miconazole on

Candida strains. For this, it was determined the Minimum Inhibitory

Concentration (MIC) of both products and the Fractional Inhibitory

Concentration index (FIC) - Checkerboard Test. When assessed alone, C.

zeylanicum and miconazole showed MIC of 312.5 µg/mL and 32 µg/mL,

respectively, against all strains tested. After combination, it was observed that

the EO inhibited the growth of yeast at a concentration of 39 µg/mL. On the

other hand, when combined, miconazole showed MIC of 128, 32 and 32 µg/mL

against strains of C. albicans, C. tropicalis and C. krusei, respectively. These

results indicate FIC values of 4.1248 (antagonism), 1.1248 (indifference) and

1.1248 (indifference), respectively, for C. albicans, C. tropicalis and C. krusei.

Thus, it’s verified that the combination between the essential oil of C.

zeylanicum and miconazole is not an advantageous possibility for growth

inhibition of Candida spp.

Key-words: Cinnamomum zeylanicum, Miconazole, Drug Synergism, Candida

spp., Candida albicans

INTRODUCTION

C. albicans is an opportunistic pathogen that inhabits the human body as

commensal microrganism and it’s considered the major cause of fungal

infections in humans. Usually, these infections are developed due to C. albicans

virulence, which presents considerable morphological plasticity, and as a result

of changes in immune response (MONGE et al., 2006).

134

The molecular mechanisms involved with such virulence are related to

the activation of MAP (mitogen-activated protein) Kinase signal transduction via,

where cellular responses involved in invasive growth, cell wall formation,

osmotic stress adaptation and reproduction occur through intracellular signaling

pathways as MKc1, Cek1/2 and HOG1 MAP Kinase (MONGE et al., 2006).

The activation of MAPK pathway also provides activation of the

transcription factor Cph1, responsible for the filamentous form, considered

virulence factor for the occurrence of systemic infections, and CLA4,

responsible for the formation of the germ tube and hyphae. The PKA pathway

activation provides the formation of cyclic AMP, which regulates the factor Efg1,

also responsible for the formation of hyphae (LO et al., 1997; PHAN;

BELANGER; FILLER, 2000).

With regard to superficial infections, especially those affecting the

oropharynx, object of interest in this study, it is known that the mucosa of this

region is the most frequent site affected by superficial candidiasis, and

colonization by C. albicans occurs in 10-50% of healthy individuals. The drug

approach to treating this type of candidiasis includes topical and systemic

antifungal agents. Miconazole and nystatin are the drugs of initial choice. If

topical therapy fails to submit results, systemic treatment is initiated, and

fluconazole is the most prescribed drug (PAIVA et al., 2009).

However, currently is considerably increasing the number of occurrences

of Candida species resistance to antifungal agents available (ANDES et al.

2006; BASSO JR et al. 2010; MANOHARLAL et al., 2010, MARTEL et al.,

2010) . Prolonged use of these agents acts as a factor that may contribute to

the development of fungal resistance (FAN-HAVARD et al., 1991). Moreover, it

is evident a growing population of immunocompromised individuals and

increasingly frequent use of prophylaxis and empirical treatment with

antifungals (RAUTEMAA et al., 2007).

Give the above, natural products have been proposed in an attempt to

obtain new drugs, since they differ from synthetic products as regards molecular

diversity, which is much higher in natural products than that derived from

135

synthesis processes, that despite of considerable advances, is still limited. This

provides the development of various new drugs with diverse therapeutic

functions. Within this context, it’s highlighted the recognized antifungal activity

of essential oil of Cinnamomum zeylanicum Blume (LIMA et al. 1993; JANTAM

et al. 2003; BONJAR; AGHIGHI, KARIMI, 2004; MOREIRA, et al., 2007;

ATAYDE et al. 2008; BANSOD, RAI, 2008; KAHN et al. 2008;

PUANGPRONPITAG; SITTIWET, 2009).

As a proposal to introduce new formulations in the therapeutic arsenal

capable of tackling multi-resistant microrganisms and preventing or minimizing

contact of these microrganisms with synthetic products, thus reducing the risk to

select new or improved mechanisms of resistance, some researchers propose

the combination of natural products and conventional antimicrobial agents

(NASCIMENTO et al. 2007; SHAHVERDI et al., 2007; COUTINHO et al. 2009a;

COUTINHO et al. 2009b; COUTINHO et al. 2009c; COUTINHO et al. 2010;

GAMARRA et al., 2010; ZHAI et al., 2010).

In this perspective, this study aimed to evaluate the combined effect

between C. zeylanicum essential oil and miconazole against Candida strains.


Strains



strains of C. albicans ATCC 40277, C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei

ATCC 40147.

Essential Oil

The EO whose antifungal activity has been under study was obtained

from Ferquima Ind. and Comp. Ltd (Vargem Grande Paulista, Sao Paulo,

Brazil). Its physical and chemical parameters were described by the supplier,

which produces and markets essential oils on an industrial scale.



136




The MIC determination for the essential oil and for miconazole was




zeylanicum EO and miconazole were distributed at an initial concentration of

5,000 µg/mL and 128 µg/mL, respectively. From these concentrations were

conducted serial dilutions by withdrawing an aliquot of 100 µL from the most

concentrated well and inserting it into the following well. Finally, aliquots of 10

µL of inoculum correspondent to the strains under test were dispensed into the

wells of each column. In parallel, it was made a yeast viability control. Tests

were performed in triplicate, and the plates were incubated at 35°C for 24-48

hours (ELLOF, 1998).





capable of producing visible inhibition on the growth of yeast strains (ELLOF,

1998).


concentrations, 10 µL of TTC dye (2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride) were




the live samples, red-colored, from the dead samples that keep their color

(GRABE, 1976; DESWAL; CHAND, 1997).


Combined effect between C. zeylanicum EO and miconazole was

determined by the microdilution technique - checkerboard - for derivation of the


137

The turbidity of the fungal suspensions was compared and adjusted to

that presented by the barium sulphate suspension referent to the tube 0.5 of

McFarland scale, which corresponds to an inoculum of approximately 106

Colony Forming Units/mL (CFU/mL). Solutions of the products tested were used

at concentrations determined from their respective MIC. Initially, 100 µL of

Sabouraud Dextrose culture medium were added into the holes of a 96-well U-

bottom microtiter plate (ALAMAR®). Then, 50 µL of each product tested whose

concentrations ranged among MIC÷4, MIC÷2, MIC, MICx2 and MIC×4 were

added in the horizontal (miconazole) and vertical (essential oil) directions of the

plate. Finally, the culture medium was inoculated with 10 µL of fungal

suspension. Fungal growth was evidenced through the use of TTC dye. The

test was performed in triplicate, and the microplates were incubated at 37ºC for

48 hours (ELIOPOULOS; MOELLERING, 1991; DUTTA et al., 2004).


EO and B is miconazole. FICA is calculated through the ratio MICA combined /



and <4) or antagonism (>4.0) (ELIOPOULOS; MOELLERING, 1991;

NIGHTINGALE et al., 2002; DUTTA et al., 2004).


As seen in Table 1, C. zeylanicum EO and miconazole when assessed

alone presented, respectively, MIC of 312.5 µg/mL and 32 µg/mL on strains of

C. albicans, C. tropicalis and C. krusei. These findings confirm the data

presented by other studies (QUALE et al., 1996; CARDOSO et al. 2001; VAN

ROEV et al., 2004; LIMA et al. 2006; SCHMIDT et al., 2007; POZZATTI et al.

2008).

After combination of the products under test, a change in MIC values was

observed for both substances. Were found values of respectively 39 µg/mL and

128 µg/mL for C. zeylanicum EO and miconazole on C. albicans 40277 strains

(Table 2). These data represent a decrease of 87.52% in the essential oil MIC.

138

However, it was necessary to increase the concentration of miconazole in 400%

to promote growth inhibition of the strains assessed. The FIC value was 4.1248,

indicating antagonism of the effect. It is noteworthy that, even considering

reduction of the concentration of the natural product evaluated, the increase in

miconazole concentration may represent a greater possibility of generating

resistance mechanisms by Candida strains.

Nascimento et al. (2000) point out that the combined use of medicinal

plants and/or their products and byproducts with the concomitant use of

conventional drugs can act by inhibiting, enhancing the therapeutic effects of

drugs or otherwise by interfering with the expected response. Oliveira et al.

(2006) emphasize that such combined use on special occasions may put the

patient at risk, since it can trigger acquisition of resistance by microrganisms or

can initiate mechanisms of irritation or other adverse effects.

On the other hand, with respect to strains of C. tropicalis and C. krusei,

there was a decrease in the EO MIC (39 µg/mL) and maintenance of

miconazole MIC (32 µg/mL). Then, it was observed a FIC value of 1.1248 for

both strains, thereby indicating indifference of the effect produced by the

association, when compared with the products tested alone.

In literature, it was found no study evaluating the antifungal effect of the

combination between C. zeylanicum EO and miconazole against Candida spp.

It’s emphasized that the findings of this study do not preclude the

completion of other studies to investigate the association of other natural

products with conventional agents used in the clinic. According to Cuenca-

Estrella (2004), the combined antifungal compounds can promote greater

effectiveness of each drug, thus allowing the use of lower doses of each

product. For this author, the checkerboard method and the microbial death

curve are often used in the in vitro evaluation of combined antimicrobials

activity. This information is reinforced by Odds (2003), which reaffirms the

viability of the checkerboard test in the study of interactive effects between

molecules.

139

CONCLUSION

The results observed in this study indicate that the combination between

C. zeylanicum essential oil and miconazole is not an advantageous possibility

for in vitro growth inhibition of Candida spp., since was verified antagonist or

indifferent effect when compared with the potential of these products alone.


essential oil and miconazole on Candida strains.

MIC (µg/mL)

Strains C. zeylanicum Miconazole

C. albicans ATCC 40277 312.5 32

C. tropicalis ATCC 40042 312.5 32

C. krusei ATCC 40147. 312.5 32

Table 2. Fractional Inhibitory Concentration index (FIC) and MIC (µg/mL) after

combination between C. zeylanicum essential oil and miconazole against strains of C.

albicans ATCC 40277, C. tropicalis ATCC 40042 and C. krusei ATCC 40147.

C. albicans

ATCC 40277

C. tropicalis

ATCC 40042

C. krusei

ATCC 40146

C. zeylanicum EO MIC 39 µg/mL 39 µg/mL 39 µg/mL

Miconazole MIC 128 µg/mL 32 µg/mL 32 µg/mL

FIC 4.1248 1.1248 1.1248

Effect Antagonism Indifference Indifference

140

REFERENCES

ANDES, D.; FORREST, A.; LEPAK, A.; NETT, K.; MARCHILLO, K.; LINCOLN,

L. Impact of Antimicrobial Dosing Regimen on Evolution of Drug Resistance In

Vivo: Fluconazole and Candida albicans. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, v. 50, n. 7, p. 2374-2383, 2006.

ATAYDE, M. L.; SANTURIO, J. M.; ALVES, S. H.; POZZATTI, P.; SCHEID, L.

A.; SPADER, T. B. In vitro activity of essential oils extracted from plants used as

spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp.

Canadian Journal of Microbiology, v. 54, n. 11, p.950-956, 2008.

BANSOD, S.; RAI, M. Antifungal activity of essential oils from Indian medicinal

plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A. niger. World

Journal of Medical Sciences, v. 3, n. 2, p. 81-88, 2008.

BASSO JR, L. R.; GAST, C. E.; MAO, Y.; WONG, B. Fluconazole Transport

into Candida albicans Secretory Vesicles by the Membrane Proteins Cdr1p,

Cdr2p, and Mdr1p. Eukaryotic Cell, v. 9, n. 6, p. 960-970, 2010.

BONJAR, G. H.; AGHIGHI, S.; KARIMI NIK, A. Antibacterial and antifungal

survery in plants used in indigenous herbal-medicine of south east regions of

Iran. Journal of Biological Sciences, v. 4, n. 3, p. 405-412, 2004.

CARDOZO, E. I.; PARDI, G.; PERRONE, M.; SALAZAR, E. Estudio de la

Eficacia del Miconazol Topico (Daktarin® Jalea Oral) en Pacientes con

Estomatitis Sub-Protesica Inducida por Candida. Acta odontolologica

Venezolana, v. 39, n. 3, p. 45-53, 2001.

COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; FALCÃO-SILVA, V. S.; SIQUEIRA-JÚNIOR,

J. P.; LIMA, E. O. In vitro additive effect of Hyptis martiusii in the resistance to

aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.

Pharmaceutical Biology. v. 48, n. 9, p. 1002-1006, 2010.

COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; LIMA, E. O.; FALCÃO-SILVA, V. S.;

SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P. In vitro interference of Hyptis martiusii Benth. &













141

chlorpromazine against an aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian

Journal of Medical Research. v. 129, n. 5, p. 566-568, 2009a.


SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P. Potentiating effect of Mentha arvensis and

chlorpromazine in the resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant

Staphylococcus aureus. In Vivo. v. 23, n. 2,, p. 287-289, 2009 B.


SIQUEIRA, J. P. JR. Herbal therapy associated with antibiotic therapy:

potentiation of the antibiotic activity against methicillin--resistant Staphylococcus

aureus by Turnera ulmifolia L. BMC Complementary and Alternative

Medicine. v. 8, p. 9-13, 2009b.

CUENCA-ESTRELLA, M. Combinations of antifungal agents in therapy–what

value are they? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 54, n.5, p. 854-

869, 2004.

DESWAL, D. P.; CHAND, U. Standartization of the tetrazolium test for viability

estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Science and

Technology, v.25, n.1, p.409-17, 1997.

DUTTA, N. K.; DASTIDAR, S. G.; KUMAR, A.; MAZUMDAR, K.; RAY, R.;

CHAKRABARTY, A. N. Antimycobacterial activity of the antiinflammatory agent

diclofenac sodium, and its synergism with streptomycin. Brazilian Journal of

Microbiology, v. 35, n. 1, p. 316-323, 2004.

ELIOPOULOS, G. M.; MOELLERING, R. C. Antimicrobial combinations. In:

LORIAN, V. (ed): Antibiotics in Laboratory Medicine. Baltimore, MD, p. 434-441,

1991.

ELLOF, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal

inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica, v. 64, n. 8,

p. 711-713, 1998.

FAN-HAVARD, P.; CAPANO, D.; SMITH, S. M.; MANGIA, A.; ENGL, R. H. K.

Development of Resistance in Candida Isolates from Patients Receiving











142

Prolonged Antifungal Therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.

35, n. 11, p. 2302-2305,1991.

GABRE, D. F. Manual do teste de tetrazólio. Brasília: AGIPLAN, 1976. 85P.

GAMARRA, S.; ROCHA, E. M. F.; ZHANG, Y. Q.; PARK, S.; RAO, R.; PERLIN,

D. S. Mechanism of the Synergistic Effect of Amiodarone and Fluconazole in

Candida albicans. Antimicrobiolgy Agents and Chemotherapy, v. 54, n. 5, p.

1753-1761, 2010.

JANTAN, I.; YEOH, E. L.; SURIANI, R.; NOORSIHA, A.; ABU SAID, A. A

comparative study of the constituents of the essential oils of three

Cinnamomum species from Malaysia. Journal of Essential Oil Research, v.

15, p. 387-391, 2003.

KHAN R, ISLAM B, AKRAM M.; SHAKIL, S.; AHMAD, A, A.; ALI, S. M.;

SIDDIQUI, M.; KHAN, A. U. Antimicrobial activity of five herbal extracts against

multi drug resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical origin.

Molecules, v. 14, n. 2, p. 586-597, 2009.

LIMA, E. O.; GOMPERTZ, O. F.; GIESBRECHT, A. M.; PAULO, M. Q. In vitro

antifungal activity of essential oils obtained from officinal plants against

dermatophytes. Mycoses, v. 36, n, 9-10, p. 333-336, 1993.

LIMA, I. O.; OLIVEIRA, R. A. G.; LIMA, E. O.; FARIAS, N. M. P.; SOUZA, E. L.

Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre espécieis de Candida. Revista

Brasileira de Farmacognosia. V. 16, n. 2, p. 197-201, 2006.

MANOHARLAL, R.; GORANTALA, J.; SHARMA, M.; DOMINIQUE, S.;

PRASAD, R. PAP1 [poly(A) polymerase 1] homozygosity and hyperadenylation

are major determinants of increased mRNA stability of CDR1 in azole-resistant

clinical isolates of Candida albicans. Microbiology, v. 156, n. 1, p. 313-326,

2010.

MARTEL, C. M; PARKER, J. E.; BADER, O.; WEIG, M.; GROSS, U.;

WARRILOW, A. G. S.; KELLY, D. E.; KELLY, S. L. A Clinical Isolate of Candida

albicans with Mutations in ERG11 (Encoding Sterol 14 -Demethylase) and

ERG5 (Encoding C22 Desaturase) Is Cross Resistant to Azoles and

143

Amphotericin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 54, n. 9, p.

3578-3583, 2010.

MONGE, R. A.; ROMA’N, E.; NOMBELA, C.; PLA, J. The MAP Kinase signal

transduction network in Candida albicans. Microbiology, v. 152, n. 1, p. 905-

912, 2006.

MOREIRA ACP, LIMA EO, SOUZA EL, VAN DINGENEN, M. A.; TRAJANO, V.

N. Inhibitory effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) essential

Oil and beta-pinene on the growth of dematiaceous moulds. Brazilian Journal

of Microbiology, v. 38, n. 1, p. 33-38, 2007.

NASCIMENTO, A. M. A.; BRANDÃO, M. G. L.; OLIVEIRA, G. B.; FORTES, I. C.

P.; CHARTONE-SOUZA, E. Synergistic bactericidal activity of Eremanthus

erythropappus oil or β-bisabolene with ampicillin against Staphylococcus

aureus. Biomedical and Life Sciences, v. 92, n. 1, p. 95-100, 2007.

NIGHTINGALE, C. H.; AMBROSE, P. G.; DRUSANO, G. L.; MURAKAWA, T.

Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory and Cinical Practice. 2ª ed.

New York Medical, 2002.

ODDS, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between

them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 52, n. 1, p. 1, 2003.

OLIVEIRA, R. A. G.; LIMA, E. O.; VIEIRA, W. L.; FREIRE, K. R. L.; TRAJANO,

V. N.; LIMA, I. O.; SOUZA, E. L.; TOLEDO, M. S.; SILVA-FILHO, R. N. Estudo

da interferência de óleos essenciais sobre a atividade de alguns antibióticos

usados na clínica. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n. 1, p. 77-82,

2006.

PAIVA, L. C. A.; RIBEIRO, R. A.; PEREIRA, J. V.; OLIVEIRA, N. M. C.

Avaliação clínica e laboratorial do gel da Uncaria tomentosa (Unha de Gato)

sobre candidose oral. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 2, p.

423-428, 2009.

PHAN, Q. T.; BELANGER, P. H.; FILLER, S. G. Role of hyphal formation in

interactions of Candida albicans with endothelial cells. Infection and Immunity,

v. 68, n. 6, p. 3485-3490, 2000.



144

POZZATTI, P.; SCHEID, L. A.; SPADER, T. B.; ATAYDE, M. L.; SANTURIO, J.

M.; ALVES, S. H. In vitro activity of essential oils extracted from plants used as

spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible Candida spp.

Can J Microbiol. v. 54, n. 11, p. 950-960, 2008.

PUANGPRONPITAG, D.; SITTIWET, C. Antimicrobial properties of

Cinnamomum verum aqueous extract. Asian Journal of Biological Sciences.

v. 2, n. 2, p. 49-53, 2009.

QUALE, J. M.; LANDMAN, D.; ZAMAN, M.; BUMEY, S.; SATHE, S. S. In Vitro

Activity of Cinnamomum zeylanicum Against Azole Resistant and Sensitive

Candida Species and a Pilot Study of Cinnamon for Oral Candidiasis. The

American Journal of Chinese Medicine, v. 24, n. 2, p. 103-109, 1996.

RAUTEMAA, R.; RICHARDSON, M.; PFALLER, M.; KOUKILA-KÄKHÖLÄ, P.;

PERHEENTUPA, J.; SAXÉN, H. Decreased susceptibility of Candida albicans

to azole antifungals: a complication of long-term treatment in autoimmune

polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED) patients.

Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 60, n., 4, p. 889-892, 2007.

SCHMIDT, E.; JIROVETZ, L.; WLCEK, K.; BUCHBAUER, G.; GOCHEV, V.;

GIROVA, T.; STOYANOVA, A.; GEISSLER, M. Antifungal activity of eugenol

and various eugenol-containing essential oils against 38 clinical isolates of

Candida albicans. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, v. 10, n. 5, p. 421-

429, 2007.

SHAHVERDI A. R.; MONSEF-ESFAHANI, H. R.; TAVASOLI, F.; ZAHERI, A.;

MIRJANI, R. Trans-cinnamaldehyde from Cinnamomum zeylanicum bark

essential oil reduces the clindamycin resistance of Clostridium difficile in vitro.

Journal of Food Science, v. 72, n. 1, p. 55-58, 2007.

VAN ROEY, J.; HAXAIRE, M.; KAMYA, M.; LWANGA, I.; KATABIRA, E.

Comparative efficacy of topical therapy with a slow-release mucoadhesive

buccal tablet containing miconazole nitrate versus systemic therapy with

ketoconazole in HIV-positive patients with oropharyngeal candidiasis. Journal

of Acquired Immune Deficiency Syndromes. v.35, n. 2, p. 144-150, 2004.









http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shahverdi%20AR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Monsef-Esfahani%20HR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tavasoli%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zaheri%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mirjani%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20Roey%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Haxaire%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kamya%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lwanga%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Katabira%20E%22%5BAuthor%5D

145

ZHAI, B.; ZHOU, H.; YANG, L.; ZHANG, J.; JUNG, K.; GIAM, C.; XIANG, X.;

LIN, X. Polymyxin B, in combination with fluconazole, exerts a potent fungicidal

effect. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 65, n. 5, p. 931-938, 2010.

146

CONCLUSÕES

147

6 CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que:

Os produtos naturais avaliados no screening tem um potencial

antifúngico, destacando-se o resultado apresentado pelo óleo essencial

de Cinnamomum zeylanicum Blume;

C. zeylanicum exibiu ação sobre cepas de C. albicans, C. tropicalis e C.

krusei;

A atividade antifúngica apresentada pelo C. zeylanicum ocorre,

provavelmente, por ação no processo de síntese da parede celular

fúngica;

O eugenol representa o componente fitoquímico majoritário do óleo

essencial de C. zeylanicum;

A associação do óleo essencial de C. zeylanicum e nistatina promoveu

potencialização do efeito inibitório sobre o crescimento das cepas de C.

albicans;

O óleo essencial de C. zeylanicum isolado e associado à nistatina é

capaz de promover redução na capacidade de desenvolvimento de

estruturas morfológicas das células de C. albicans;

O óleo essencial de C. zeylanicum apresenta atividade antifúngica sobre

as cepas de Candida não-albicans avaliadas e que a associação do

mesmo à nistatina promove potencialização desse efeito;

A associação do óleo essencial de C. zeylanicum ao miconazol promove

antagonismo (sobre cepas de C. albicans) ou indiferença (sobre cepas

de C. tropicalis e C. krusei) do efeito, quando comparado ao potencial

desses produtos avaliados isoladamente sobre Candida spp.

148

REFERÊNCIAS

149

7 REFERÊNCIAS

ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by gas

chromatography/mass spectroscopy. Carol Stream, Illinois: Allured

Publishing Corporation, 1995.

AIBINU, I.; ADENIPEKUN, T.; ADELOWOTAN, T.; OGUNSANYA, T.;

ODUGBEMI, T. Evaluation of the antimicrobial properties of different parts of

Citrus aurantifolia (lime fruit) as used locally. African Journal of

Traditional, v. 4, n. 2, p. 185-195, 2007.

ALBUQUERQUE, U. P.; HANAZAKI, N. As pesquisas etnodirigidas na

descoberta de novos fármacos de interesse médico e farmacêutico:

fragilidades e perspectivas. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 16,

p. 678-689, 2006.

ALLEGRINI, J; BOUCHBERG, M.S.; MAILOLS, H. Émulsiond d’huilles

essentielles fabricaton et applications en microbiologie. Society Pharmacy

Montpellier. v. 33, n. 1, p. 73-86, 1973.

ALVES, S. H.; CURY, A. E. Candida from câncer patients: susceptibility in

vitro to polyene antifungal agents. Revista do Instituto de Medicina

Tropical de São Paulo, v. 34, n. 3, p.251-254, 1992.

ANDES, D.; FORREST, A.; LEPAK, A.; NETT, K.; MARCHILLO, K.;

LINCOLN, L. Impact of Antimicrobial Dosing Regimen on Evolution of Drug

Resistance In Vivo: Fluconazole and Candida albicans. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, v. 50, n. 7, p. 2374-2383, 2006.

ANDRADE, I. P. B. Efeitos do vinagre sobre Candida albicans aderidas in

vitro em resina acrílica termicamente ativada. Ciência Odontológica

Brasileira, v.11, n.1, p.91-98, 2008.

AQUINO, P.L.P.; LIMA, E.O.; FARIAS, M.P.; FREIRE, K.R.L.; SOUZA, E.L.;

CECHINEL FILHO, V.; CORRÊA, R.; ANDRICOPULO, A. Atividade

150

antifúngica de maleimidas contra dermatófitos isolados de Tinea captis.

Revista Brasileira de Análises Clínicas, v, 35, n. 4, p.191-194, 2003.

ATAYDE, M. L.; SANTURIO, J. M.; ALVES, S. H.; POZZATTI, P.; SCHEID,

L. A.; SPADER, T. B. In vitro activity of essential oils extracted from plants

used as spices against fluconazole-resistant and fluconazole-susceptible

Candida spp. Canadian Journal of Microbiology, v. 54, n. 11, p.950-956,

2008.

AUSTIN, N.; DARLOW, B. A.; MCGUIRE, W. Prophylactic oral/topical non-

absorbed antifungal agents to prevent invasive fungal infection in very low

birth weight infants (Cochrane Review). The Cochrane Library, v. 7, n. 4,

2009.

AZUMA, C. R. S.; CASSANHO, A. C. A.; SILVA, F. C.; ITO, C. Y. K.;

JORGE, A. O. C. Atividade antimicrobiana de soluções de ácido acético de

diferentes tipos e procedências sobre Candida albicans. Revista de Pós-

graduação, v.13, n.2, p.164-167, 2006.

BACHMANN, S. P.; VANDE-WALLE, K.; RAMAGE, G.; PATTERSON, T. F.;

WICKES, B. L.; GRAYBILL, J. R.; LÓPEZ-RIBOT, J. L. In vitro activity of

caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrobial Agents and


BADAUY, C. M.; BARBACHAN, J. J.; RADOS, P. V.; SANT’ANA FILHO, M.;

CHIES, J. A. Relationship between Candida infection and immune cellular

response in inflammatory hyperplasia. Oral Microbiology and

Immunology, v. 20, n.2, p. 89-92, 2005.

BANSOD, S.; RAI, M. Antifungal activity of essential oils from Indian

medicinal plants against human pathogenic Aspergillus fumigates and A.

niger. World Journal of Medical Sciences, v. 3, n. 2, p. 81-88, 2008.

BASSO, L. R. J.; GAST, C. E.; MAO, Y.; WONG, B. Fluconazole Transport

into Candida albicans Secretory Vesicles by the Membrane Proteins Cdr1p,

Cdr2p, and Mdr1p. Eukaryotic Cell, v. 9, n. 6, p. 960-970, 2010.


151

BATISTA, J. M.; BIRMAN, E. G.; CURY, A. E. Susceptibility to antifungal

drugs of Candida albicans strains isolated from patients with denture

stomatitis Revista de Odontologia da Universidade de São Paulo, v. 13,

n. 4, p. 343-348, 1999.

BAUER, A. W. M. M.; KIRBY, J. C.; TURCK, M. Antibiotic susceptibility

testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical

Pathology, v. 45, n. 3, p. 493-496, 1966.

BELÉM, L. F. Estudo epidemiológico da pitiriase versicolor e atividade

antifúngica de produtos naturais e sintéticos contra seu agente

etiológico. 2002. Tese de Doutorado. Universidade Federal da Paraíba,

João Pessoa, Paraíba.

BENSADOUN, R. J.; DAOUD, J.; EL GUEDDARI, B.; BASTIT, L.;

GOURMET, R.; ROSIKON, A.; ALLAVENA, C.; CÉRUSE, P.; CALAIS, G.;

ATTALI, P. Comparison of the efficacy and safety of miconazole 50-mg

mucoadhesive buccal tablets with miconazole 500-mg gel in the treatment of

oropharyngeal candidiasis: a prospective, randomized, single-blind,

multicenter, comparative, phase III trial in patients treated with radiotherapy

for head and neck cancer. Cancer, v. 112, n. 1, p. 204-211, 2008.

BERGENDAL, T.; ISACSSON, G. Effect of nystatin in the treatment of

denture stomatitis. Scandinavian Journal of Dental Research, v. 88, n. 5,

p. 446-454, 1980.

BLOMGREN, J.; BERGGREN, U.; JONTELL, M. Fluconazole versus

nystatin in the treatment of oral candidosis. Acta Odontologica

Scandinavica, v. 56, n. 4, p. 202-205, 1998.

BONJAR, G. H.; AGHIGHI, S.; KARIMI NIK, A. Antibacterial and antifungal

survery in plants used in indigenous herbal-medicine of south east regions

of Iran. Journal of Biological Sciences, v. 4, n. 3, p. 405-412, 2004.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bensadoun%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Daoud%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22El%20Gueddari%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bastit%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gourmet%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rosikon%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Allavena%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22C%C3%A9ruse%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Calais%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Attali%20P%22%5BAuthor%5D

152

BORBA, A. M.; MACEDO, M. Plantas medicinais usadas para a saúde bucal

pela comunidade do bairro Santa Cruz, Chapada dos Guimarães, MT,

Brasil. Acta Botanica Brasilica, v. 20, n. 4, p. 771-782, 2006.

BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE. Programa Nacional de Plantas

Medicinais e Fitoterápicos. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos

Estratégicos. Brasília, 2007.

BRASIL. Decreto nº 5.813 de 22 de junho de 2006. Aprova a Política

Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e dá outras

providências. Diário Oficial da União, Brasília, DF, jun. 2006.

CANNON, R. D.; LAMPING, E.; HOLMES, A. R.; NIIMI, K.; BARET, P. V.;

KENIYA, M. V.; TANABE, K.; NIIMI, M.; GOFFEAU, A.; MONK, B. C. Efflux-

Mediated Antifungal Drug Resistance. Clinical Microbiology Reviews, v.

22, n. 2, p. 291-321, 2009.

CARDOZO, E. I.; PARDI, G.; PERRONE, M.; SALAZAR, E. Estudio de la

Eficacia del Miconazol Topico (Daktarin® Jalea Oral) en Pacientes con

Estomatitis Sub-Protesica Inducida por Candida. Acta odontologica

Venezolana, v. 39, n. 3, p. 45-53, 2001.

CARMO, E. S. Susceptibilidade de fungos do gênero Aspergillus a óleos

essenciais. Dissertação de mestrado 2008. Dissertação de Mestrado.

Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba.

CARVALHO, L. P.; BACELLAR, O.; NEVES, N; A.; CARVALHO, E M.;

JESUS, A. R. Avaliação da resposta imune celular em pacientes com

candidíase recorrente. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina

Tropical, v. 36, n. 5, p. 571-576, 2003.

CASTRO, R. D.; LIMA, E. O. Atividade antifúngica in vitro do óleo essencial

de Eucalyptus globulus L. sobre Candida spp. Revista de Odontologia da

UNESP, v. 39, n. 3, p. 179-184, 2010.

153

CAVASSANI, V. G. S.; SOBRINHO, J. A.; HOMEM, M. G. N.; RAPOPORT,

A. Candidíase oral como marcador de prognóstico em pacientes portadores

do HIV. Revista Brasileira de Otorrinolaringologia, v. 68, n. 5, p. 630-

634, 2002.

CHAMI, N.; CHAMI, F.; BENNIS, S.; TROUILLAS, J.; REMMAL, A.

Antifungal treatment with carvacrol and eugenol of oral candidiasis in

immunosuppressed rats. Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 8, n.

3, p. 217-226, 2004.

CHEN, A.; SOBEL, J. D. Emerging azole antifungal. Expert Opinion on

Emerging Drugs, v. 10, n. 1, p. 21-33, 2005.

COUTINHO, H. D. M. Avaliação da atividade antibacteriana e

fotossensibilizante de produtos naturais da região do cariri cearense.

2008. Tese de Doutorado. Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa,

Paraíba.

COUTINHO, H. D.; COSTA, J. G.; FALCÃO-SILVA, V. S.; SIQUEIRA-

JÚNIOR, J. P.; LIMA, E. O. In vitro additive effect of Hyptis martiusii in the

resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus

aureus. Pharmaceutical Biology, v. 48, n. 9, p. 1002-1006, 2010.


SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P. In vitro interference of Hyptis martiusii Benth. &

chlorpromazine against an aminoglycoside-resistant Escherichia coli. Indian

Journal of Medical Research. v. 129, n. 5, p. 566-568, 2009a.


SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P. Potentiating effect of Mentha arvensis and

chlorpromazine in the resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant

Staphylococcus aureus. In Vivo. v. 23, n. 2,, p. 287-289, 2009b.


SIQUEIRA, J. P. JR. Herbal therapy associated with antibiotic therapy:

potentiation of the antibiotic activity against methicillin--resistant






















154

Staphylococcus aureus by Turnera ulmifolia L. BMC Complementary and

Alternative Medicine, v. 8, p. 9-13, 2009c.

COWAN, M. M. Plant products as antimicrobial agents. Clinical

Microbiology Reviews, v. 12, n. 4, p. 564-582, 1999.

CROY, S. R.; KNOWN, G. S. The effects of pluronic block aggregation state

of nystatin. Journal Controlled Release, v. 95, n. 2, p. 161-171, 2004.

CUENCA-ESTRELLA, M. Combinations of antifungal agents in therapy–

what value are they? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 54, n.5,

p. 854-869, 2004.

DESWAL, D. P.; CHAND, U. Standartization of the tetrazolium test for

viability estimation in ricebean (Vigna umbellate T.) seeds. Seed Science

and Technology, v.25, n.1, p.409-17, 1997.

DONLAN, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerging

Infectious Diseases, v. 7, n. 2, p. 277-281, 2001.

DORMAN, H. J. D.; DEANS, S. G. Antimicrobial agents from plants:

antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology,

v. 88, n. 22, p. 308-316, 2000.

DUARTE, M. C.; FIQUEIRA, G. M.; SARTORATTO, A.; REHDER, V. L.;

DELARMELINA, C. Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants.

Journal of Ethnopharmacology, v. 97, n. 2, p. 305-311, 2005.

DUNKEL, N.; LIU, T. T.; BARKER, K. S.; HOMAYOUNI, R.;

MORSCHHÄUSER, J.; ROGERS, D. A Gain-of-Function Mutation in the

Transcription Factor Upc2p Causes Upregulation of Ergosterol Biosynthesis

Genes and Increased Fluconazole Resistance in a Clinical Candida albicans

Isolate. Eukaryotic Cell, v. 7, n. 7, p. 1180-1190, 2008.

DUTTA, N. K.; DASTIDAR, S. G.; KUMAR, A.; MAZUMDAR, K.; RAY, R.;

CHAKRABARTY, A. N. Antimycobacterial activity of the antiinflammatory

155

agent diclofenac sodium, and its synergism with streptomycin. Brazilian

Journal of Microbiology, v. 35, n. 1, p. 316-323, 2004.

EL-AZIZI, M. A.; STARKS, S. E.; KHARDORI, N. Interactions of Candida

albicans with other Candida spp. and bacteria in the biofilms. Journal of

Applied Microbiology, v. 96, n. 5, p. 1067-1073, 2004.

ELIOPOULOS, G. M.; MOELLERING, R. C. Antimicrobial combinations.

In: LORIAN, V. (ed): Antibiotics in Laboratory Medicine. Baltimore, MD, p.

434-441, 1991.

ELISABETSKY, E.; SOUZA, G. C. Etnofarmacologia como ferramenta na

busca de substâncias ativas. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.;

GOSMAM, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R.

Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6º Ed. Porto Alegre: Editora

da UFRGS; Florianópolis, 2007.

ELLOF, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the

minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta

Medica, v. 64, n. 8, p. 711-713, 1998.

FALEIRO, M. L.; MIGUEL, M. G.; LADEIRO, F.; VENÂNCIO, F.; BRITTO, J.

C.; FIGUEIREDO, A. C.; BARROSO, J. G.; PEDRO, L. G. Antimicrobial

activity of essential oils isolated from Portuguese endemic species of

Thymus. Letters in Applied Microbiology, v. 29, n, 1, p. 130-135, 2003.

FAN-HAVARD, P.; CAPANO, D.; SMITH, S. M.; MANGIA, A.; ENGL, R. H.

K. Development of Resistance in Candida Isolates from Patients Receiving

Prolonged Antifungal Therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

v. 35, n. 11, p. 2302-2305,1991.

FARAH, C. S.; ASHMAN, R. B.; CHALLACOMBE, S. J. Oral candidosis.

Clinics in Dermatology, v. 18, n. 5, p. 553-562, 2000.

156

FILLER, S. G.; SWERDLOFF, J. N.; HOBBS, C.; LUCKETT, P. M.

Penetration and Damage of Endothelial Cells by Candida albicans.

Infection and Immunity, v. 63, n. 3, p. 976–983, 1995.

FROST, D. J.; BRANDT, K. D.; CUGIER, D.; GOLDMAN, R. A whole-cell

Candida albicans assay for the detection of inhibitors towards fungal cell

wall synthesis and assembly. Journal of Antibiotics, v. 28, n. 4, p. 306-

309, 1995.

GABRE, D. F. Manual do teste de tetrazólio. Brasília: AGIPLAN, 1976.

85P.

GAMARRA, S.; ROCHA, E. M. F.; ZHANG, Y. Q.; PARK, S.; RAO, R.;

PERLIN, D. S. Mechanism of the Synergistic Effect of Amiodarone and

Fluconazole in Candida albicans. Antimicrobial Agents and


GAYOSO, C.W.; LIMA, E.O.; OLIVEIRA, V.T.; PEREIRA, F.O.; SOUZA,

E.L.; LIMA, I.O.; NAVARRO, D.F. Sensitivity of fungi isolated from

onychomycosis to Eugenia cariophyllata essential oil and eugenol.

Fitoterapia, v. 76, n, 2, p.247-249, 2005.

GILFILLIAN, D.; SULLIVAN, J.; HAYNES, K.; PARKINSON, T.; COLEMAN,

D. C; GROW, N. A. R. Candida dubliniensis: phylogeny and putative

virulence factors. Microbiology, v. 144, n.4, p. 829-838, 1998.

GILMAN, A. G.; HARDMAN, J. G.; LIMBIRD, L. E. As Bases

Farmacológicas da Terapêutica. 10 º Ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill

Interamericana do Brasil, 2003, p. 413.

GIORDANI, R.; REGLI P.; KALOUSTIAN, J.; MIKAIL, C.; ABOU, L.;

PORTUGAL, H. Antifungal effect of various essential oils against Candida

albicans. Potentiation of antifungal action of amphotericin B by essential oil

from Thymus vulgaris. Phytotherapy Research, v. 18, n. 12, p. 990-995,

2004.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Filler%20SG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Swerdloff%20JN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hobbs%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Luckett%20PM%22%5BAuthor%5D

157

GIORDANI, R.; REGLI, P.; KALOUSTIAN, J.; PORTUGAL, H. Potentiation

of antifungal activity os amphotericin B by essential oil from Cinnamomum

cassia. Phytotherapy Research, v. 20, n. 1, p. 58-61, 2006.

GOTZSCHE, P.C.; JOHANSEN, H. K. Nystatin prophylaxis and treatment in

severely immunodepressed patients (Cochrane Review). The Cochrane

Library, v.1, n. 2, 2002.

GUNGI, S.; ARIMA, K.; BEPPU, T. Screening of antifungal according to

inducing morfological abnormalities. Agricultural and Biological

Chemistry. v. 47, n. 9, p. 2061-1069, 1983.

HARBONE, J. B. Ecological biochemistry. 4º Ed. London: Academic,

1993.

HENRIQUES, H.; AZEREDO, J.; OLIVEIRA, R. Candida albicans and

Candida dubliniensis: comparison of biofilm formation in terms of biomass

and activity. British Journal of Biomedical Science, v. 63, n. 1, p. 5-11,

2006.

HENRIQUES, M.; AZEREDO, J.; OLIVEIRA, R. Adhesion of Candida

albicans and Candida dubliniensis to acrylic and hydroxyapatite.

Biointerfaces, v. 33, n.1, p. 235-241, 2004.

HILI, P.; EVANS, C. S.; VENESS, R. G. Antimicrobial action of essential oils:

the effect of dimethylsulphoxide on the activity of cinnamon oil. Letters in

Applied Microbiology, v. 24, n. 4, p. 269-275, 1997.

HOWELL, S. A.; MALLET, A. I.; NOBLE, W. C. A comparison of the sterol

content of multiple isolates of the Candida albicans Darlington strain with

other clinically azole-sensitive and resistant strains. Journal of Applied

Microbiology, v. 69, v. 5, p. 692-696, 1990.

JANTAN, I. B.; MOHARAM, B. A. K.; SANTHANAM, J.; JAMAL, J. A.

Correlation between chemical composition and antifungal activity of the

158

essential oils of eight Cinnamomum species. Pharmaceutical Biology, v.

46, n. 6, p. 405-412, 2008.

JANTAN, I.; YEOH, E. L.; SURIANI, R.; NOORSIHA, A.; ABU SAID, A. A

comparative study of the constituents of the essential oils of three

Cinnamomum species from Malaysia. Journal of Essential Oil Research,

v. 15, p. 387-391, 2003.

JOHNSON, M. D.; MACDOUGALL, C.; OSTROSKY-ZEICHNER, L.;

PERFECT, J. R.; REX, J. H. Combination Antifungal Therapy. Journal of

Antimicrobial Chemotherapy, v. 48, n. 3, p. 693-715, 2004.

KATZUNG, B.G. Farmacologia Básica e Clínica. 9º Ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2006, 668p.

KHAN R, ISLAM B, AKRAM M.; SHAKIL, S.; AHMAD, A, A.; ALI, S. M.;

SIDDIQUI, M.; KHAN, A. U. Antimicrobial activity of five herbal extracts

against multi drug resistant (MRD) strains of bacteria and fungus of clinical

origin. Molecules, v. 14, n. 2, p. 586-597, 2009.

KONNING, G. H.; AGYARE, C.; ENNISON, B. Antimicrobial activity of some

medicinal plants of Ghana. Fitoterapia, 75, n. 1, p. 65-67, 2004.

KUHN, D. M.; CHANDRA, J.; MUKHERJEE, P. K.; GHANNOUM, M. A.

Antifungal susceptibility of Candida biofilms: unique efficacy of amphotericin

B lipid formulations and echinocandins. Antimicrobial and Agents


KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W. The yeats, a taxonomie study. 4ª ed.

Amsterdam: Elsevier Science B. V., 1998.

LAMBERT, R. J.; SKANDAMIS, P. N.; COOTE, P. J.; NYCHAS, G. J. A

study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano

essential oil, thymol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology, v. 91,

n. 3, p. 453-462, 2001.

159

LASKARIS, G.; HADJIVASSILIOV, M.; STRATIGOS, J. Oral signs and

symptoms in 160 HIV-infected patients. Journal of Oral Pathology and

Medicine, v. 21, n. 3, p. 120-123, 1992.

LESAGE, G.; BUSSEY, H. Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae.

Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 70, n. 2, p.317-343,

2006.

LIMA, E. O.; GOMPERTZ, O. F.; GIESBRECHT, A. M.; PAULO, M. Q. In

vitro antifungal activity of essential oils obtained from officinal plants against

dermatophytes. Mycoses, v. 36, n, 9-10, p. 333-336, 1993.

LIMA, I. O.; OLIVEIRA, R. A. G.; LIMA, E. O.; FARIAS, N. M. P.; SOUZA, E.

L. Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre espécieis de Candida.

Revista Brasileira de Farmacognosia. V. 16, n. 2, p. 197-201, 2006.

LÖFFLER, J.; EINSELE, H.; HEBERT, H. Phospholipid and sterol analysis

of plasma membranes of azole-resistant Candida albicans strains. FEMS

Microbiology Letters, v. 185, n. 1, p. 59-63, 2000.

LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e

exóticas. Plantarum, Nova Odessa: São Paulo, 2003.

LORENZO, J. L. Microbiologia para o estudante de odontologia. São

Paulo: Editora Atheneu, 2004.

MACIEL MAM, PINTO AC, VEIGA JR VF. Medicinal plants: The need for

multidisciplinary scientific studies. Química Nova, v. 25, n. 3, p. 429-438,

2002.

160

MANOHARLAL, R.; GORANTALA, J.; SHARMA, M.; DOMINIQUE, S.;

PRASAD, R. PAP1 [poly(A) polymerase 1] homozygosity and

hyperadenylation are major determinants of increased mRNA stability of

CDR1 in azole-resistant clinical isolates of Candida albicans. Microbiology,

v. 156, n. 1, p. 313-326, 2010.

MARICHAL, P.; KOYMANS, L.; WILLEMSENS, S; BELLENS, D.;

VERHASSELT, P.; LUYTEN, W.; BORGERS, M; RAMAEKERS, F. C. S.;

ODDS, F. C; BOSSCHE, H V. Contribution of mutations in the cytochrome

P450 14α-demethylase (Erg11p, Cyp51p) to azole resistance in Candida

albicans. Microbiology, v. 145, n. 1, p. 2701-2713, 1999.

MARQUES, C. A. Importância econômica da família Lauraceae Lindl.

Floresta e Ambiente, v. 8, n, 1, p. 195-206, 2001.

MARSH, P.; MARTIN, P. Microbiologia oral. São Paulo: Editora Santos, 4º

Edição. 2005.

MARTEL, C. M; PARKER, J. E.; BADER, O.; WEIG, M.; GROSS, U.;

WARRILOW, A. G. S.; KELLY, D. E.; KELLY, S. L. A Clinical Isolate of

Candida albicans with Mutations in ERG11 (Encoding Sterol 14 -

Demethylase) and ERG5 (Encoding C22 Desaturase) Is Cross Resistant to

Azoles and Amphotericin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.

54, n. 9, p. 3578-3583, 2010.

MARTINS, I. M. C. L. B. Avaliação da ação antifúngica de Citrus limon

Linn. frente a leveduras do gênero Candida. 2008. Dissertação de

Mestrado. Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba.

MCLAFFERTY, F. W.; STAUFFER, D. The wiley/NBS registry of mass

spectral data. New York: John Wiley Sons, 1989.

MEADES, G. JR.; HENKEN, R. L.; WALDROP, G. L.; RAHMAN, M. M.;

GILMAN, S. D.; KAMATOU, G. P.; VILJOEN, A. M.; GIBBONS, S.

Constituents of Cinnamon Inhibit Bacterial Acetyl CoA Carboxylase. Planta

Medica, v. 76, n. 14, p.1570-1575, 2010.




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rahman%20MM%22%5BAuthor%5D




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gibbons%20S%22%5BAuthor%5D

161

MENESES, E. A.; CAVALCANTE, M. S.; FARIAS, R. B.; TEIXEIRA, A. B.;

PINHEIRO, F. G.; BEZERRA, B. P.; TORRES, J. C. N.; CUNHA, F. A.

Frequencia e atividade enzimática de Candida albicans isoladas da mucosa

bucal de crianças de uma creche da prefeitura de Fortaleza. Jornal

Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v. 4, n. 1, p. 9-13, 2005.

MESQUITA, R. A.; AGUIAR, M. C. F.; TARQUINO, S. B. C.; GOMEZ, R. S.;

BERTAZZOLI, R. Candidíase oral na infecção HIV. Revista do CROMG, v.

4, n. 1, p. 27-31, 1998.

MISHRA, A. K.; MISHRA, A.; KEHRI, H. K.; SHARMA, B.; PANDEY, A. K.

Inhibitory activity of Indian spice plant Cinnamomum zeylanicum extracts

against Alternaria solani and Curvularia lunata, the pathogenic dematiaceous

moulds. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, v. 8, n. 9, p.

1-7, 2009.

MONGE, R. A.; ROMA’N, E.; NOMBELA, C.; PLA, J. The MAP Kinase signal

transduction network in Candida albicans. Microbiology, v. 152, n. 1, p. 905-

912, 2006.

MOREIRA ACP, LIMA EO, SOUZA EL, VAN DINGENEN, M. A.; TRAJANO,

V. N. Inhibitory effect of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae)

essential Oil and beta-pinene on the growth of dematiaceous moulds.

Brazilian Journal of Microbiology, v. 38, n. 1, p. 33-38, 2007.

MÜLLER, V.; VIEMANN, D.; SCHMIDT, M.; ENDRES, N.; LUDWING, S.;

LEVERKUS, M.; ROTH, J.; GOEBELERS, M. Candida albicans Triggers

Activation of Distinct Signaling Pathways to Establish a Proinflammatory

Gene Expression Program in Primary Human Endothelial Cells. Journal of

Immunology, v. 179, n.1, p. 8435-8445, 2007.

.MUKHERJEE, P. K.; CHANDRA, J. Candida biofilm resistance. Drug

Resistance Update, v. 7, n. 4, p. 301-304, 2004.

NASCIMENTO, G. G. F.; LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C.; SILVA, G. L.

Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-

162

resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, v. 31, n. 1, p. 247-

256, 2000.

NASCIMENTO, A. M. A.; BRANDÃO, M. G. L.; OLIVEIRA, G. B.; FORTES,

I. C. P.; CHARTONE-SOUZA, E. Synergistic bactericidal activity of

Eremanthus erythropappus oil or β-bisabolene with ampicillin against

Staphylococcus aureus. Biomedical and Life Sciences, v. 92, n. 1, p. 95-

100, 2007.

National Committee For Clinical Laboratory Standard. Método de

referência para testes de diluição em caldo para determinação da

sensibilidade de leveduras à terapia antifúngica: norma aprovada –

M27-A2, 2.ed., v. 23, n.15, 2002.

NESS, J.; SHERMAN, F. T.; PAN, C. X. Alternative medicine: What the data

say about common herbal therapies. Geriatrics, v. 54, n. 10, p. 33-38. 1999.

NIGHTINGALE, C. H.; AMBROSE, P. G.; DRUSANO, G. L.; MURAKAWA,

T. Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory and Cinical Practice. 2ª

ed. New York Medical, 2002.

NISBET, L. J.; MOORE, M. Will natural products remain na important source

of drug research for the future? Current Oppinion in Biotechnology, v. 8,

n. 6, p. 708-712, 1997.

NURYASTUTI, T.; MEI, H. C. V.; BUSSCHER, H. J.; IRAVATI, S.; AMAN, A.

T.; KROM, B. P. Effect of Cinnamon Oil on icaA Expression and Biofilm

Formation by Staphylococcus epidermidis. Applied and Environmental

Microbiology, v. 75, n. 21, p. 6850-6855, 2009.

ODDS, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts

between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 52, n. 1, p. 1,

2003.

OLIVEIRA, R. A. G.; LIMA, E. O.; VIEIRA, W. L.; FREIRE, K. R. L.;

TRAJANO, V. N.; LIMA, I. O.; SOUZA, E. L.; TOLEDO, M. S.; SILVA-FILHO,

R. N. Estudo da interferência de óleos essenciais sobre a atividade de



163

alguns antibióticos usados na clínica. Revista Brasileira de

Farmacognosia, v. 18, n. 1, p. 77-82, 2006.

OLIVEIRA, R. A. G.; OLIVEIRA, K. R. A.; DINIZ, M. F. F M. A fitoterapia no

serviço de saúde pública da Paraíba. Revista de Extensão, v. 2, p. 21-31.

1997.

ONYEAGBA, R. A.; UGBOGU, O. C.; OKEKE, C. U. Studies on the

antimicrobial effects of garlic (Allium sativum Linn), ginger (Zingiber

officinale Roscoe) and lime (Citrus auratifolia Linn). African Journal of

Biotechnology, v. 3, n. 10, p. 552-554, 2004.

OROZCO, A.; S.; ZHOU, X.; FILLER, S. G. Mechanisms of the

Proinflammatory Response of Endothelial Cells to Candida albicans

Infection. Infection and Immunity, v. 68, n. 3, p. 1134-1141, 2000.

PAIVA, L. C. A.; RIBEIRO, R. A.; PEREIRA, J. V.; OLIVEIRA, N. M. C.

Avaliação clínica e laboratorial do gel da Uncaria tomentosa (Unha de Gato)

sobre candidose oral. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 2, p.

423-428, 2009.

PALMEIRA-DE-OLIVEIRA, A.; SALGUEIRO, L.; PALMEIRA-DE-OLIVEIRA,

R.; MARTINEZ-DE-OLIVEIRA, J.; PINA-VAZ, C.; QUEIROZ, J. A.;

RODRIGUES, A. G. Anti-Candida activity of essential oils. Mini Reviews in

Medicinal Chemistry, v. 9, n. 11, p. 1292-1305, 2009.

PATTON, L. L.; BONITO, A. J.; SHUGARA, D. A. A systematic review of the

effectiveness of antifungal drugs for the prevention and treatment of

oropharyngeal candidiasis in HIV-positive patients. Oral Medicine, Oral

Pathology, Oral Radiology and Endodontology, v. 92, n. 2, p. 170-179,

2001.

PEREIRA FO. Atividade antifúngica do oleo essencial de Cymbopogon

winterianus Jowitt ex Bor sobre dermatófitos do gênero Trichophyton.

2009. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal da Paraíba, João

Pessoa, Paraíba

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Palmeira-de-Oliveira%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Salgueiro%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Palmeira-de-Oliveira%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Palmeira-de-Oliveira%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Martinez-de-Oliveira%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pina-Vaz%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Queiroz%20JA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rodrigues%20AG%22%5BAuthor%5D

164

PHAN, Q. T.; BELANGER, P. H.; FILLER, S. G. Role of hyphal formation in

interactions of Candida albicans with endothelial cells. Infection and

Immunity, v. 68, n. 6, p. 3485-3490, 2000.

PLAYFORD, E. G.; WEBSTER, A. C.; SORRELL, T. C.; CRAIG, J. C.

Antifungal agents for preventing fungal infections in non-neutropenic

critically ill patients (Cochrane Review). The Cochrane Library, v.25, n. 1,

2006.

POZZATTI P. Susceptibilidade de Candida spp. sensíveis e resistentes

ao fluconazol frente a óleos essenciais extraídos de condimentos.

2007. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Santa Maria,

Santa Maria, Rio Grande do Sul.

POZZATTI, P.; SCHEID, L. A.; SPADER, T. B.; ATAYDE, M. L.;

SANTURIO, J. M.; ALVES, S. H. In vitro activity of essential oils extracted

from plants used as spices against fluconazole-resistant and fluconazole-

susceptible Candida spp. Canadian Journal of Microbiology, v. 54, n. 11,

p. 950-960, 2008.

PRABUSEENIVASAN, S.; JAYAKUMAR, M.; IGNACIMUTHU, S. In vitro

antibacterial activity of some plant essential oils. BMC Complementary and

Alternative Medicine, v. 6, n. 39, p. 1-8, 2006.

PRASAD, R.; WERGIFOSSE, P.; GOFFEAU, A.;BALZI, E. Molecular

cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1,

conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics,

v. 27, n, 4, p. 320-329, 1995.

PUANGPRONPITAG, D.; SITTIWET, C. Antimicrobial properties of

Cinnamomum verum aqueous extract. Asian Journal of Biological

Sciences. v. 2, n. 2, p. 49-53, 2009.

QUALE, J. M.; LANDMAN, D.; ZAMAN, M.; BUMEY, S.; SATHE, S. S. In

Vitro Activity of Cinnamomum zeylanicum Against Azole Resistant and

Sensitive Candida Species and a Pilot Study of Cinnamon for Oral






http://www.springerlink.com/content/100408/?p=1c2f280eb096496a90f88508169343ac&pi=0

165

Candidiasis. The American Journal of Chinese Medicine, v. 24, n. 2, p.

103-109, 1996.

QUAN, H.; CAO, Y.; XU, Z.; ZHAO, J.; GAO, P. QUIN,, X.; JIANG, Y. Potent

In Vitro Synergism of Fluconazole and Berberine Chloride against Clinical

Isolates of Candida albicans Resistant to Fluconazole. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, v. 50, n. 3, p. 1096-1099, 2006.

RAMAGE, G.; SAVILLE, S. P.; THOMAS, D. P.; LO’PEZ-RIBOT, J. L.

Candida Biofilms: an Update. Eukaryotic Cell, v. 4, n. 4, p. 633-638, 2005.

RASSOLI, I.; MIRMOSTAFA, S. A. Antibacterial properties of Thimus

pubescens and Thymus serpyllum essential oil. Fitoterapia, v. 73, n.3, p.

244-250, 2002.

RASTOGI, N.; DOMADIA, P.; SHETTY, S.; DASGUPTA, D. Screening of

natural phenolic compounds for potential inhibit bacterial cell division protein

FtsZ. Indian Journal of Experimental Biology, v. 46, n. 11, p. 783-787,

2008.

RAUTEMAA, R.; RICHARDSON, M.; PFALLER, M.; KOUKILA-KÄKHÖLÄ,

P.; PERHEENTUPA, J.; SAXÉN, H. Decreased susceptibility of Candida

albicans to azole antifungals: a complication of long-term treatment in

autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy

(APECED) patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 60, n., 4,

p. 889-892, 2007.

REYNOLDS, J. E. F. Martindale, The Extra Pharmacopoeia. Thirtieth

Edition. Singapore, Info Access & Distribution.1993.

ROMANI, L.; BISTONI, F.; PUCCETTI, P. Adaptation of Candida albicans to

the host environment: the role of morphogenesis in virulence and survival in

mammalian hosts. Current Opinion in Microbiology, v. 6, n. 4, p. 338-343,

2003.

166

SAMAR, N.; TRIPATHI, A. Effects of Citrus sinensis (L.) Osbeck epicarp


Tieghem. Microbiological Research, v. 163, n. 3, p. 337-344, 2008.

SANGLARD, D.; KUCHLER, K.; ISCHER, F.; PAGANI, J. L.; MONOD,M.;

BILLE, J. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida

albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 39, n. 11, p. 2378-2386,

1995.

SANTOS, E. B.; DANTAS, G. S. ; SANTOS, H. B.; DINIZ, M. F. F. M.;

SAMPAIO, F. C. Estudo etnobotânico de plantas medicinais para problemas

bucais no município de João Pessoa, Brasil. Revista Brasileira de

Farmacognosia, v. 19, n. 18, p. 321-324, 2009.

SARTORATTO, A.; MACHADO, A. L. M.; DELARMELINA, C.; FIGUEIRA,

G. M.; DUARTE, M. C. T.; REDHER, V. L. G. Composition and antimicrobial

activity of essential oils from aromatic plants used in Brazil. Brazilian

Journal of Microbiology, v. 35, n. 4, p. 275-280, 2004.

SAWYER, P. R.; BROGDEN, R. N.; PINDER, R. M. SPEIGHT, T. M.;

AVERY, G. S Miconazole: a review of its antifungal activity and therapeutic

efficacy. Drugs, v. 9, n.6, p. 406-423, 1975.

SCHMIDT, E.; JIROVETZ, L.; WLCEK, K.; BUCHBAUER, G.; GOCHEV, V.;

GIROVA, T.; STOYANOVA, A.; GEISSLER, M. Antifungal activity of eugenol

and various eugenol-containing essential oils against 38 clinical isolates of

Candida albicans. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, v. 10, n. 5, p.

421-429, 2007.

SENANAYAKE, U. M.; LEE, T. H.; WILLS, R. B. H. Volatile constituents of

cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) oils. Journal of Agricultural and

Food Chemistry, v.26, n. 4 , p. 822-824, 1978.

167

SHAHVERDI A. R.; MONSEF-ESFAHANI, H. R.; TAVASOLI, F.; ZAHERI,

A.; MIRJANI, R. Trans-cinnamaldehyde from Cinnamomum zeylanicum bark

essential oil reduces the clindamycin resistance of Clostridium difficile in

vitro. Journal of Food Science, v. 72, n. 1, p. 55-58, 2007.

SHARMAR, N.; TRIPATHI, A. Effects of Citrus sinensis (L.) Osbeck epicarp


Tieghem. Microbiology Research, v. 163, n. 3, p. 337-344, 2006.

SHIN, S.; PYUN, M. Anti-Candida effects of estragole in combination with

ketoconaloze or amphotericin B. Phytotherapy Research, v. 18, n. 1, p.

827-830, 2004.

SHIN, S.; KANG, C. A. Antifungal activity of the essential oil of Agastache

rugosa Kuntze and its synergism with ketoconazole. Letters in Applied

Microbiology. v. 36, n. 2, p. 111-115, 2003.

SHIP. J. A; VISSINK, A.; CHALLACOMBE, S. J. Use of prophylactic

antifungal in the immunocompromised host. Oral Surgery, Oral Medicine,

Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology, v. 103, n. 1, p. 6-14,

2007.

SIDRIM, J. J. C.; MOREIRA, J. L. B. Fundamentos clínicos e

laboratoriais da micologia médica. 1ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 1999.

SILVA, L.; COUTINHO, A.; FEDOROV, A.; PRIETO, M. Conformation and

self-assembly of nystatin nitrobenzoxadiazole derivative in lipid membranes.

Biochimica et Biophysica Acta, v. 1617, n. 1, p. 69-70, 2003.

SILVA, L.; COUTINHO, A.; FEDOROV, A.; PRIETO, M. Nystatin-induced

lipid vesicles permeabilization is strongly dependent of sterol structure.

Biochimica et Biophysica Acta. V. 1758, n. 4, p. 452-459, 2006.

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.;

MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao

mediciamento. 6ª ed. Porto Alegre: Editora da UFRGS. 2007. 1102p.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shahverdi%20AR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Monsef-Esfahani%20HR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tavasoli%20F%22%5BAuthor%5D




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mirjani%20R%22%5BAuthor%5D

168

SMITH, K. J.; WARNOCK, D. W.; KENNEDY, C. T.; JOHNSON, E. M.;

HOPWOOD, V.; VAN CUTSEM, J.; VANDEN BOSSCHE, H. Azole

resistance in Candida albicans. Journal of Medical and Veterinay

Mycology. v. 24, n. 1, p. 133–144. 1986.

SMITH-PALMER, A.; STEWART, J.; FYFE, L. Antimicrobial properties of

plant essential oils and essences against five important food-bome

pathogens. Letters in Applied Microbiology, v. 26, n. 2, p. 118-122, 1998.

SRINIVASAN, D.; SANGEETHA, N.; SURESH, T.; LAKSHMANA

PERUMALSAMY, P. Antimicrobial activity of certain Indian medicinal plants

used in folkloric medicine. Journal of Ethnopharmacology, v. 74, n. 1, p.

217-220, 2001.

SUKATTA, U.; HARATHAITHANASAN, V.; CHANTARAPANONT, W.;

DILOKKUNANANT, U.; SUPPAKUL, P. Antifungal Activity of Clove and

Cinnamon Oil and Their Synergistic Against Postharvest Decay Fungi of

Grape in vitro. Natural Science, v. 42, n. 5, p. 169-174, 2008.

TAVARES, W. Manual de antibióticos e quimioterápicos

antiinfecciosos. 3º Ed., Rio de Janeiro: Atheneu, 2001, p. 749.

THEIN, Z. M.; SAMARANAYAKE, Y. H.; SAMARANAYAKE, L. P. Effect of

oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives

of Oral Biology, v. 51, p. 672-680, 2006.

VAN ROEY, J.; HAXAIRE, M.; KAMYA, M.; LWANGA, I.; KATABIRA, E.

Comparative efficacy of topical therapy with a slow-release mucoadhesive

buccal tablet containing miconazole nitrate versus systemic therapy with

ketoconazole in HIV-positive patients with oropharyngeal candidiasis.

Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, v.35, n. 2, p. 144-

150, 2004.

VIUDA-MARTOS, M., RUIZ-NAVAJAS, Y., FERNÁNDEZ-LOPÉZ, J.;

PÉREZ-ALVAREZ, J. Antifngal activity of lemon (Citrus lemon L.), mandarin

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20Roey%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Haxaire%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kamya%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lwanga%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Katabira%20E%22%5BAuthor%5D

169

(Citrus reticulata L.), grapefruit (Citrus paradisi L.) and orange (Citrus

sinensis L.) essential oils. Food Control, v. 19, .n.1, p. 1130-1138, 2008.

WANNMACHER, L. Antifúngicos. In: WANNMACHER, L.; FERREIRA, M.

B. C. Farmacologia Clínica para Dentistas.3ª Edição. Guanabara Koogan:

Rio de Janeiro, 2007.

WEBB, B. C.; THOMAS, C. J.; WHITTLE, T. A 2-year study of Candida-

associated denture stomatitis treatment in aged care subjects.

Gerodontology. v. 22, n. 3, p. 168-176, 2005.

WHITE, T. C.; MARR, K. A; BOWDEN, R. A. Clinical, cellular, and molecular

factors that contribute to antifungal drug resistance. Clinical Microbiology

Reviews, v. 11, n. 2, p. 382-402, 1998.

WILSON, C. L.; SOLAR, J. M.; GHAOUTH, A. E. Rapid evaluation of plant

extracts and essential oils for antifungal activity against Bortrytis cinerea.

Plant Disease, v. 81, n. 2, p. 204-210, 1997.

WINGETER, M. A.; GUILHERMETTI, E.; SHINOBU, C. S.; TAKAKI, I.;

SVIDZINSKI, T. I. E. Identificação microbiológica e sensibilidade in vitro de

Candida isoladas da cavidade oral. Revista da Sociedade Brasileira de

Medicina Tropical, v. 40, n. 3, p. 272-276, 2007.

ZAGO, J. A. A. ; USHIMARU, P. I.; BARBOSA, L.N.; FERNANDES JÚNIOR,

A. Sinergismo entre óleos essenciais e drogas antimicrobianas sobre

linhagens de Staphylococcus aureus e Escherichia coli isoladas de casos

clínicos humanos. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n.4, p 828-

833, 2009.

ZHAI, B.; ZHOU, H.; YANG, L.; ZHANG, J.; JUNG, K.; GIAM, C.; XIANG, X.;

LIN, X. Polymyxin B, in combination with fluconazole, exerts a potent

fungicidal effect. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 65, n. 5, p.

931-938, 2010.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Webb%20BC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thomas%20CJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Whittle%20T%22%5BAuthor%5D

Documents

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