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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
CARDIOTOXICIDADE INDUZIDA PELA DOXORRUBICINA:
MECANISMOS DE LESÃO E TERAPIAS ANTIOXIDANTES
(Revisão da Literatura)
Léa Resende Moura
Orientadora: Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura
GOIÂNIA 2011
ii
LÉA RESENDE MOURA
CARDIOTOXICIDADE INDUZIDA PELA DOXORRUBICINA:
MECANISMOS DE LESÃO E TERAPIAS ANTIOXIDANTES
(Revisão da Literatura) Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás. Nível: Doutorado.
Área de concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Linha de Pesquisa:
Patobiologia animal, experimental e comparada
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura - EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Profº. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo - EVZ/UFG
Prof.a Dr.a Rosângela de Oliveira Alves - EVZ/UFG
GOIÂNIA 2011
iii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................1
2. REVISÃO DA LITERATURA................................................................................3
2.1. Noções básicas da histofisiologia cardíaca, cardiomiopatia dilatada, radicais
livres e estresse oxidativo.....................................................................................3
2.2. Doxorrubicina: generalidades, mecanismos de ação e cardiotoxicidade da
doxorrubicina............................................................................................................5
2.3. Lesões cardíacas induzidas pela doxorrubicina.............................................10
2.4. Estresse oxidativo e metaloproteinases de matriz..........................................13
2.5. Antioxidantes...................................................................................................15
2.5.1. Antioxidantes endógenos.............................................................................15
2.5.2. Antioxidantes alimentares............................................................................16
2.5.3. Frutos do cerrado com propriedades antioxidantes.....................................19
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................................21
REFERÊNCIAS......................................................................................................22
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mecanismos da apoptose. 1) Principais indutores da apoptose.
Ligantes de morte específicos (fator de necrose tumoral e Fas ligante),
subtração dos fatores de crescimento ou hormônios e agentes nocivos
(ex., radiação). Alguns estímulos, como células citotóxicas, ativam
diretamente as caspases executoras (à direita). Outros atuam por meio
de proteínas adaptadoras e caspases iniciadoras ou por eventos
mitocondriais que envolvem o citocromo c. 2) A regulação é
influenciada por membros da família do gene Bcl-2, que podem inibir
ou promover a morte celular. 3) As caspases executoras ativam
endonucleases e proteases que degradam proteínas nucleares e do
citoesqueleto. 4) O resultado é a formação de corpúsculos apoptóticos
que expressam novos ligantes a captação por células
fagocíticas...............................................................................................8
Figura 2 A via intrínseca (mitocondrial) da apoptose. Os agonistas da morte
causam alterações na membrana mitocondrial interna resultando na
transição da permeabilidade mitocondrial e liberação de citocromo c e
outras proteínas pró-apoptóticas para o citosol, que ativa as
caspases...........................................................................................9
Figura 3 A) Fotomicrografia de corte transversal de miocárdio de ratos do grupo
controle. Morfologia normal do miocárdio (HE, 400X). B)
Fotomicrografia de corte transversal de miocárdio de ratos tratados
com doxorrubicina. Notar fragmentação (F) e separação das miofibrilas
(HE, 400x).............................................................................................10
Figura 4 Fotomicrografias do miocárdio de ratos tratados com doxorrubicina. A)
Fibras colágenas coradas em azul (setas) substituindo fibras
musculares, indicando fibrose. Tricômico de Masson, 100x. B) Corte
longitudinal das fibras musculares cardíacas, algumas apresentando
v
vacuolização citoplasmática (setas). HE, 200x. C) Necrose miocárdica
(setas). HE, 200x. D) Variação no tamanho nuclear. HE, 200x. ..........11
Figura 5 Microscopia eletrônica de cardiomiócito ventricular de rato três
semanas após a aplicação de 2,2 mg/kg de doxorrubicina. Notar parte
do núcleo com várias mitocôndrias pequenas em seu interior e
miofibrilas supercontraídas adjacentes.................................................13
Figura 6 Fotomicrografias de tecido cardíaco dos grupos controle (A), DOX
(doxorrubicina) (B) e LBP (polissacarídeo de Lycium barbarum) + DOX
(C). Notar que a vacuolização citoplasmática e a desorganização
miofibrilar foi parcialmente atenuada no grupo C e acentuada no grupo
B (LPB + DOX). (HE, 400X)................................................................19
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT alanina aminotransferase
ANT antraciclinas
AST aspartato aminotransferase
Bax proteína x associada ao gene Bcl-2
Bcl-2 família de genes reguladores da apoptose / proteína antiapoptótica
CAT catalase
CK creatinafosfoquinase
CK-MB creatinafosfoquinase MB
CMD cardiomiopatia dilatada
DOX doxorrubicina
DPPH 2,2–difenil–1–picril–hidrazila
ERO espécies reativas de oxigênio
FAS sinal iniciador da apoptose
GPx glutation peroxidase
IAP inibidor de proteínas da apoptose
LDH lactato desidrogenase
MEC matriz extracelular
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
rFasL Fas ligante recombinante
RL radicais livres
RLO radicais livres de oxigênio
SOD superóxido dismutase
TGO transaminase glutâmico-oxalacética
1
1 INTRODUÇÃO
A doxorrubicina (DOX), também denominada adriamicina, é uma droga
do grupo das antraciclinas (ANT) que está entre os quimioterápicos utilizados na
medicina e na medicina veterinária para o tratamento de diferentes neoplasias
malignas, especialmente tumores sólidos, leucemias e linfomas. Entretanto,
possui valor clínico limitado em função de sua cardiotoxicidade (SPEYER et al.,
1988; STEINHERZ et al., 1991; SANTOS et al., 2009).
O efeito cardiotóxico da DOX ao coração está associado a sua
concentração sérica; quando a dosagem excede 250mg/m2, ocorre degeneração
miocárdica progressiva em humanos (BRUNTON et al., 2007). Esta dose
acumulativa é significativamente menor em animais domésticos, por exemplo, em
gatos, recomenda-se não ultrapassar a dose total de 90 mg/m2 (SOUZA, 2004;
SILVA & CAMACHO, 2005; SOUZA & CAMACHO, 2006). Pelos efeitos tóxicos
amplamente conhecidos, a DOX tem sido utilizada como modelo experimental de
cardiomiopatia dilatada em diversas espécies animais (SOUSA, 2007).
De acordo com WOJTACKI et al. (2000), a cardiotoxicidade da DOX é
classificada cronologicamente em aguda, subaguda, crônica e tardia. A forma
aguda ocorre durante ou imediatamente após a administração da droga,
principalmente quando aplicada em velocidade rápida, e envolve vasodilatação,
hipotensão e arritmias. A subaguda é incomum e manifesta-se de um a três dias
após o término da quimioterapia, seguida de pericardite e/ou miocardite. A forma
crônica se desenvolve semanas ou meses após o término do tratamento e
caracteriza-se por cardiomiopatia dilatada com desenvolvimento subsequente de
disfunção contrátil e insuficiência cardíaca congestiva. A forma tardia se
assemelha à fase crônica e pode ocorrer anos após o término do tratamento.
Os efeitos anticancerígenos das ANT ocorrem por meio da inibição da
transcrição, síntese e replicação do ácido desoxirribonucleico (DNA), mas
também geram radicais reativos de oxigênio. A ação destes radicais é definida
como estresse oxidativo e designa uma condição na qual ocorre um desequilíbrio
entre as concentrações de espécies pró e antioxidantes (PEREIRA, 2006a). A
oxidação é parte fundamental da vida aeróbica e os radicais livres (RL) são
2
produzidos naturalmente ou por alguma disfunção biológica. Seu excesso
apresenta efeitos prejudiciais como a peroxidação dos lipídios de membrana e
agressão às proteínas, enzimas, carboidratos e DNA (BARREIRO et al., 2005).
Pesquisas recentes sugerem que a apoptose dos miócitos está diretamente
relacionada ao estresse oxidativo causado pela DOX (EWER & LIPPMAN, 2005;
SMITH et al., 2010).
Estudos comprovam que dietas ricas em antioxidantes naturais
contribuem para a redução significativa de doenças crônicas e degenerativas
(PAULA JÚNIOR et al., 2006). Compostos naturais podem exercer efeitos
benéficos na cardiotoxicidade induzida pela DOX, por meio da neutralização de
RL (XIN et al., 2011).
Diante disso, esta revisão tem como objetivo buscar na literatura os
mecanismos de lesão induzida pela DOX, as terapias antioxidantes usualmente
utilizadas, com ênfase aos antioxidantes naturais.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Noções básicas da histofisiologia cardíaca, cardiomiopatia dilatada,
radicais livres e estresse oxidativo
O coração tem a parede espessa de forma a agir como uma bomba e é
o principal determinador da pressão sanguínea sistêmica. É formado por dois
sincícios de fibras musculares denominados atriais e ventriculares, separados por
tecido conjuntivo fibroso (KIERSZENBAUM, 2008).
As camadas do coração são denominadas epicárdio, miocárdio e
endocárdio. O miocárdio, a porção mais volumosa do coração, é contrátil e
composto por fibras musculares especializadas, que formam uma rede
interconectada e sustentada por tecido fibrocolagenoso frouxo. No ventrículo
esquerdo as fibras são mais espessas e têm núcleos maiores (GARTNER &
HIATT, 2003). As fibras musculares cardíacas podem ser uni ou binucleadas com
núcleos localizados centralmente (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008).
As fibras cardíacas são cadeias ramificadas de células musculares
estriadas, unidas em suas extremidades pelos discos intercalares. O músculo
cardíaco tem contração involuntária realizada pelo deslizamento dos filamentos
de actina sob os de miosina (STEVENS & LOWE, 2001). A atividade contrátil
rítmica é inerente a estas células e a frequência da contração é regulada por
impulsos nervosos (CORMACK, 2003).
De acordo com SOUSA (2007), o termo cardiomiopatia refere-se à
disfunção primária ou secundária do miocárdio na ausência de doença valvar
primária ou doença cardíaca congênita. As cardiomiopatias que merecem
destaque na clínica médica veterinária são a dilatada, a hipertrófica e a restritiva
(CAMACHO, 2001). A cardiomiopatia dilatada (CMD) representa o estágio final de
diversas afecções do miocárdio e caracteriza-se por dilatação, uni ou
biventricular, associada à disfunção contrátil geralmente progressiva (MATTOS,
1999). Pode ter origem idiopática ou conhecida (NELSON & COUTO, 1994; VAN
VLEET & FERRANS, 1986), dentre as quais se encontram as hereditárias,
nutricionais, tóxicas, endócrinas, infecciosas (virais, bacterianas e parasitárias),
4
neoplásicas e associadas à hipertensão sistêmica (VAN VLEET & FERRANS,
2009).
Há relatos de deficiência de carnitina miocárdica em alguns cães que
apresentam CMD, bem como alguns agentes infecciosos podem estar associados
a esta enfermidade cardíaca em decorrência de miocardite, como o vírus da
cinomose e o parvovírus, Trypanosoma cruzi (Doença de Chagas), Borrelia
burgdorferi e Toxoplasma gondii. Outras causas podem incluir isquemia
miocárdica, infarto aterosclerótico das coronárias, toxinas, doenças
imunomediadas, hipotireoidismo, diabetes mellitus, neoplasias, doenças de
estoque do glicogênio, amiloidose e administração de fármacos (CAMACHO,
2001; SOUSA, 2007).
A CMD pode ser decorrente da cardiotoxicidade crônica de DOX e
geralmente ocorre a partir do primeiro mês do encerramento da quimioterapia (YU
et al., 2005). Atualmente, a cardiotoxicidade da DOX é tão bem estabelecida, que
esta droga vem sendo empregada no desenvolvimento de modelos experimentais
animais, especialmente utilizados para fins de pesquisa sobre a CMD em
humanos (SOUSA, 2007; PONTES et al. 2010). PONTES et al. (2010) testaram
um modelo experimental de CMD induzida por DOX em ratos. Para isso,
utilizaram 16 ratos que foram separados em dois grupos (GI placebo e GII 5mg/kg
de DOX). Após seis meses avaliaram os corações macroscopicamente e
microscopicamente e concluíram que a doxorrubicina foi efetiva na indução da
CMD, possivelmente constituindo-se em um modelo experimental para o estudo
desta afecção.
Radicais livres (RL) são moléculas que apresentam um elétron não
pareado no orbital mais externo, o que as tornam muito reativas. Entre estes
radicais encontram-se alguns íons metálicos como o ferro e o cobre, o hidrogênio,
o dióxido de nitrogênio, o óxido nítrico e o oxigênio. Dentre os RL, os mais
frequentes derivam do oxigênio e são denominados radicais livres de oxigênio
(RLO) (FABRIS, 1999). Existem, entretanto, compostos igualmente reativos como
os RLO que não possuem elétron não pareado na última camada e, portanto, não
podem ser chamados de RLO. Essas substâncias são classificadas de maneira
mais ampla como espécies reativas de oxigênio (ERO) (PEREIRA, 2006b).
5
Os RL podem ser produzidos em processos fisiológicos ou patológicos.
Os organismos aeróbios sintetizam o ATP (adenosina trifosfato) por meio da
redução completa de oxigênio (O2) por quatro elétrons, pelo transporte
mitocondrial. Em alguns casos o oxigênio pode receber menos elétrons e, quando
isto acontece, formam-se RLO, que são parte do processo fisiológico. Contudo,
em algumas situações pode ocorrer produção excessiva de RL, o que leva ao
estresse oxidativo (RODRIGUES et al., 2003).
A neutralização de RL é feita por substâncias denominadas
antioxidantes, que são capazes de prevenir os efeitos deletérios da oxidação e
inibir a lipoperoxidação por meio do sequestro dos RL ou do quelamento dos íons
metálicos (THEROND et al., 2000).
2.2Generalidades, mecanismos de ação e cardiotoxicidade da doxorrubicina
A DOX é um antibiótico glicosídico, pertencente ao grupo das
antraciclinas (ANT), isolado de culturas de Streptomyces peucetius, variante
caesius (NASCIMENTO & MARTINS, 2005). Esta droga tem sido utilizada na
prática oncológica desde a década de 1960. A regressão tumoral é expressiva no
uso isolado da DOX e é significativamente maior quando combinada com outros
agentes antitumorais (SIMEONI, 2006). A sua utilidade clínica é limitada pela
dose acumulada, pois doses elevadas podem produzir danos ao miocárdio e até
causar insuficiência cardíaca (BARRET-LEE et al., 2009).
De acordo com SIMUNEK et al. (2009), tem sido sugeridas propostas
para explicar o motivo pelo qual o coração é o principal alvo da toxicidade das
ANT. Uma teoria sugere que a abundância de mitocôndrias neste tecido pode
aumentar significativamente a produção de ERO. Outra, que os níveis das
enzimas catalase e glutation peroxidase são menores neste tecido, reduzindo a
atividade antioxidante endógena. Ainda sugere-se maior retenção das ANT no
tecido cardíaco do que em outros tecidos (SIMUNEK et al., 2009).
Quanto ao mecanismo de ação, as ANT agem alterando o DNA e
produzindo RL, por isso são eficazes contra o câncer. Porém outros mecanismos
têm sido descritos (GRANADOS-PRINCIPAL et al., 2010). As ANT intercalam-se
6
com o DNA, causando ruptura de filamento único e filamentos duplos, bem como
troca de cromátides irmãs (ALMEIDA et al., 2005; NASCIMENTO & MARTINS,
2005). Portanto, as ANT são tanto mutagênicas quanto carcinogênicas.
Similarmente a outros fármacos intercalantes de DNA, a DOX assume importante
ação inibidora da topoisomerase II, uma enzima importante no processo de
replicação do DNA (DIAS et al., 2003). Em função de seu grupo quinona, também
geram RL em tecidos normais e malignos (KARIM et al., 2001).
Quanto à produção de radicais livres, as ANT reagem com a citocromo
P450 redutase na presença de fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo
reduzido (NADPH) para formar intermediários de radicais semiquinonas, os quais,
por sua vez, podem reagir com o oxigênio para produzir radicais de ânion
superóxido. Estes podem gerar peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila
(BRUNTON et al., 2007).
Fontes de ferro são importantes na lesão oxidativa de células, tendo
papel significativo na patogênese de lesões induzidas por RL. O ferro (Fe) é
indispensável para a respiração celular. Este elemento é utilizado nos citocromos
mitocondriais para transporte de elétrons. Entretanto, este metal apresenta papel
crucial na injúria tóxica por oxigênio. A maioria do ferro encontra-se na forma
férrica (Fe+++) no citoplasma e tem que ser reduzida para a forma ferrosa (Fe++)
para ser ativa na reação de Fenton (reação química que descreve a ligação entre
o peróxido de hidrogênio e o ferro para formar radicais hidroxila). Esta redução
pode ser estimulada pelo ânion superóxido, e deste modo o superóxido torna-se
importante porque gera radicais hidroxila (FABRIS, 1999).
Ainda há controvérsias com relação à patogênese molecular da
cardiotoxicidade induzida pela DOX. A hipótese descrita anteriormente, que
relaciona a produção de RL é a mais aceita. Entretanto, evidências sugerem que
outros mecanismos estejam envolvidos neste processo. De acordo com
GRANADOS-PRINCIPAL et al. (2010), tais mecanismos podem estar associados
ao estresse oxidativo e devem ser amplamente estudados a fim de que se
possam desenvolver terapias cardioprotetoras eficientes (SIMUNEK et al., 2009).
Conforme MINOTTI et al. (2004), até poucos anos atrás a apoptose era
descartada como um possível mecanismo de cardiotoxicidade induzida pelas
ANT. Porém, este quadro mudou drasticamente. A apoptose é um fenômeno em
7
que a célula aciona mecanismos que culminam com sua morte. Este processo
pode ser desencadeado por diversos estímulos, sejam eles o estresse oxidativo,
substâncias químicas, irradiações ou até mesmo a hipóxia. A apoptose resulta
sempre em ativação das proteases, que pode ocorrer por diferentes rotas. As
mais comumente utilizadas são a ativação das caspases por via direta, a ativação
das caspases via alteração mitocondrial e por meio da interferência de proteínas
citoplasmáticas reguladoras da apoptose (Figura 1) (PEREIRA, 2006b).
De acordo com MYERS & MCGAVIN (2009), o termo caspase baseia-
se em duas propriedades dessa família de enzimas: o “c” refere-se à cisteína
protease (isto é, uma enzima com cisteína em seu sítio ativo) e “aspase” refere-se
à capacidade singular dessas enzimas em clivar resíduos de ácido aspártico.
Há dois tipos de caspases denominadas iniciadoras e executoras. As
caspases iniciadoras ativam as executoras que, por sua vez, clivam outros
substratos protéicos, como proteínas citoesqueléticas e da matriz nuclear, e
resultam em apoptose (MYERS & MCGAVIN, 2009).
Agentes químicos, RL, radiações ionizantes e luz ultravioleta
desencadeiam a apoptose por diversos mecanismos. Porém, todos estes
estímulos lesivos atingem o genoma da célula podendo ativar a expressão do
gene p53 e seu produto, a proteína p53, induzindo retardo mitótico e apoptose.
Um dos principais alvos da p53 são os genes das proteínas inibidoras da
apoptose (IAP). Sendo assim, as caspases naturalmente inibidas pelas IAP
tornam-se ativadas. Além disso, a p53 ativa os genes das proteínas pró-
apoptóticas Bax (proteína x associada ao Bcl-2), que se dimerizam com as
proteínas antiapoptóticas Bcl-2 (proteínas reguladoras da apoptose inicialmente
identificadas em células B de linfoma), resultando em aumento da permeabilidade
mitocondrial com liberação de fatores pró-apoptóticos (Figura 1) (PEREIRA,
2006b).
8
Ainda de acordo com PEREIRA (2006b), dois outros mecanismos
podem estar envolvidos na indução da apoptose por radiações e RL: a ação direta
sobre as mitocôndrias e a agressão direta na membrana ativando
esfingomielinases, que induzem a liberação de ceramida. A liberação de ceramida
ativa proteínas cinases e fosfatases capazes de inativar os inibidores das
caspases 8 e 9, ativando e induzindo-as à apoptose.
FIGURA 1 –Representação esquemática dos mecanismos da apoptose. 1) Principais indutores da apoptose. Ligantes de morte específicos (fator de necrose tumoral e Fas ligante), subtração dos fatores de crescimento ou hormônios e agentes nocivos (ex., radiação). Alguns estímulos, como células citotóxicas, ativam diretamente as caspases executoras (à direita). Outros atuam por meio de proteínas adaptadoras e caspases iniciadoras ou por eventos mitocondriais que envolvem o citocromo c. 2) A regulação é influenciada por membros da família do gene Bcl-2, que podem inibir ou promover a morte celular. 3) As caspases executoras ativam endonucleases e proteases que degradam proteínas nucleares e do citoesqueleto. 4) O resultado é a formação de corpúsculos apoptóticos que expressam novos ligantes a captação por células fagocíticas.
Fonte: Adaptado de MYERS & MCGAVIN (2009).
9
A DOX foi relacionada a apoptose induzida extrinsicamente pelo
receptor com domínio da morte Fas ligante recombinante (rFasL) em
cardiomiócitos de ratos neonatos (YAMAOKA et al., 2000). Com relação ao
caminho intrínseco mitocondrial, de acodo com MINOTTI et al. (2004), a DOX
induz a apoptose favorecendo a liberação de citocromo c, por meio do aumento
da expressão da Bax, que induz a abertura do poro mitocondrial, ou pela inibição
de Bcl-2, proteína que bloqueia a saída de citocromo c (Figura 2).
A busca por produtos que aumentem a expressão de proteínas
antiapoptóticas é alvo de pesquisas. O objetivo deste aumento é reduzir a
apoptose, um dos mecanismos de cardiotoxicidade, tendo assim um efeito
protetivo (ZHENG et al., 2011;. XIN et al. 2011). XIN et al. (2011) relataram que o
polissacarídeo de Lycium barbarum (LPB), pode aumentar a expressão da
proteína antiapoptótica Bcl-2, funcionando como um cardioprotetor.
FIGURA 2 –Representação esquemática da via intrínseca (mitocondrial) da apoptose. Os agonistas da morte causam alterações na membrana mitocondrial interna resultando na transição da permeabilidade mitocondrial e liberação de citocromo c e outras proteínas pró-apoptóticas para o citosol, que ativa as caspases.
Fonte: Adaptado de MYERS & MCGAVIN (2009).
10
De acordo com ZHENG et al. (2011) & MINOTTI et al. (2004) a falha da
homeostase dos níveis de cálcio é uma importante causa da cardiotoxicidade
mediada pela DOX. A homeostase dos níveis de cálcio é fundamental para os
mecanismos de excitação/contração da fibra muscular e a DOX pode interferir nas
funções destes canais.
2.3 Lesões cardíacas induzidas pela doxorrubicina
Algumas das lesões características da toxicidade miocárdica por DOX
são a perda ou fragmentação de miofibrilas (Figura 3B), edema muscular,
hipertrofia muscular compensatória (YU et al., 2005), fibrose, vacuolização
citoplasmática, necrose e alteração no tamanho nuclear (PONTES et al., 2010).
Assim, quando se suspeita de cardiotoxicidade pela DOX a biopsia miocárdica é o
método diagnóstico definitivo (YU et al., 2005).
FIGURA 3 – A) Fotomicrografia de corte transversal de miocárdio de ratos do grupo controle. Morfologia normal do miocárdio (HE, 400X). B) Fotomicrografia de corte transversal de miocárdio de ratos tratados com DOX. Notar fragmentação (F) e separação das miofibrilas (*) (HE, 400X).
Fonte: Adaptado de SHARKER & SOUROUR (2010).
*
*
11
PONTES et al. (2010) avaliaram lesões macroscópicas e
microscópicas de ratos seis meses após a aplicação de 5mg/kg de DOX. Aferiram
os diâmetros externos e internos e a espessura do ventrículo esquerdo. Os
corações aumentaram 41% em relação ao peso; 33% no diâmetro interno e 14%
no diâmetro externo; e 24% na espessura da parede do VE. Microscopicamente,
fibrose do tecido miocárdico foi observada em 75% dos animais (Figura 4A);
100% dos animais apresentaram vacuolização citoplasmática dos miócitos (Figura
4B); houve necrose miocárdica em 75% dos animais (Figura 4C) e 87%
apresentaram variação no tamanho nuclear (Figura 4D).
FIGURA 4 – Fotomicrografias do miocárdio de ratos tratados com doxorrubicina. A) Fibras colágenas coradas em azul (setas) substituindo fibras musculares, indicando fibrose. Tricômico de Masson (100X). B) Corte longitudinal das fibras musculares cardíacas, algumas apresentando vacuolização citoplasmática (setas). HE (200X). C) Necrose miocárdica (setas). HE (200X). D) Variação no tamanho nuclear (setas). HE (200X).
Fonte: Adaptado de PONTES et al. (2010).
SIMEONI (2006) relata que na cardiomiopatia induzida pela DOX
ocorrem danos funcionais e desvios na função contrátil do músculo cardíaco,
gerando incapacidade do coração em bombear sangue e, consequentemente, O2
B
C D
A
12
na quantidade ideal para o metabolismo celular. Há perda de cardiomiócitos por
necrose e apoptose, bem como alterações estruturais que geram hipertrofia.
Para NASCIMENTO & MARTINS (2005), a aplicação de uma dose
elevada ou a administração de doses múltiplas em espaço de tempo
relativamente curto desenvolverá rapidamente uma extensa lesão cardíaca. Essa
se caracterizará por dilatação do retículo sarcoplasmático, picnose nuclear,
degeneração focal dos miócitos e edema mitocondrial. Mesmo não havendo
alteração no peso cardíaco, os miócitos podem sofrer alterações como
vacuolização citoplasmática, desorganização das miofibrilas e necrose.
A dilatação cardíaca ocorrida durante o uso prolongado da DOX altera
os componentes da matriz extracelular (MEC) (GOTO et al., 2003). As altas
concentrações de DOX alteram a rede de colágeno e também os cardiomiócitos
(DIEZ, 2010). No coração, o colágeno é a principal proteína de sustentação
dessas células. Quando a síntese desta proteína predomina sob a degradação, o
resultado é a fibrose. Ao contrário, quando a degradação predomina, a perda do
colágeno resulta em disfunção contrátil (DIEZ, 2010).
DUDNAKOVA et al. (2003) avaliaram no coração de ratos, por
microscopia de luz, microscopia eletrônica e imunoistoquimica, os colágenos tipo
I, III e IV após uma única aplicação de DOX (2,2 ou 0,44 mg/kg), duas horas e
três semanas após a injeção. De acordo com os autores, após três semanas, na
dose mais elevada (2,2 mg/kg), houve aumento da densidade e extensão do
colágeno, indicando o desenvolvimento de fibrose difusa. Neste mesmo estudo
observaram-se apoptose, perda focal de elementos contráteis, alterações no
citoesqueleto e cardiomiócitos com núcleo penetrado por mitocôndrias, sugerindo
drástica alteração na permeabilidade nuclear (Figura 5) (DUDNAKOVA et al.,
2003).
13
FIGURA 5 - Fotomicrografia eletrônica de cardiomiócito ventricular de rato três semanas após a aplicação de 2,2 mg/kg de doxorrubicina. Parte do núcleo com várias mitocôndrias pequenas em seu interior (setas) e miofibrilas supercontraídas adjacentes (estrelas).
Fonte: DUDNAKOVA et al. (2003).
2.4 Estresse oxidativo e metaloproteinases de matriz
De acordo com POTÁKOVÁ et al. (2007), o estresse oxidativo pode
ativar as metaloproteinases de matriz (MMP), que são enzimas responsáveis pela
degradação de componentes da MEC e atuam no desenvolvimento e
remodelamento normais da MEC ou em processos patológicos (KHASIGOV et al.,
2003). Essas enzimas são classificadas em quatro famílias de diferentes
especificidades ao substrato, denominadas colagenases (MMP1, MMP8 e
MMP13), gelatinases (MMP2 e MMP9), estromalisinas (MMP3, MMP7, MMP10,
MMP11 e MMP26) e metaloproteinases de membrana (MMP14, MMP15, MMP16,
MMP17, MMP24 e MMP25) (HE et al., 1989).
14
Os inibidores de metaloproteinases (TIMP) são proteínas específicas
que regulam a atividade das MMP, auxiliando, desta forma, na manutenção da
integridade da MEC (BREW et al., 2000; VISSE & NAGASE, 2003; PARKS et al.,
2004; PAGE MCCAW et al., 2007). São descritos quatro tipos de TIMP (1, 2, 3 e
4), que diferem em estrutura, propriedades bioquímicas, expressão e funções
biológicas (BREW et al., 2000; HAYAKAWA & YAMASHITA, 2003). O equilíbrio
entre síntese e a ação das MMP e seus inibidores é fundamental para a
manutenção da homeostase das proteínas da MEC. Entretanto, quando esse
equilíbrio é rompido, a integridade da MEC torna-se comprometida (STETLER-
STEVENSON, 1996).
Estudos têm sido realizados para avaliar a ação das MMP e seus
inibidores na cardiotoxicidade induzida pela DOX. Tanto a MMP-2 quanto a MMP-
9 desempenham importante função no desenvolvimento de diversas doenças
cardiovasculares (KIZAKE et al., 2006). Alterações nos níveis de MMP-2 e MMP-9
no miocárdio foram observadas na cardiomiopatia dilatada em humanos (LI et al.,
1998; THOMAS et al., 1998; SPINALE et al., 2000), em doenças hipertensivas
utilizando ratos como modelo experimental (ROBERT et al., 1997), no infarto do
miocárdio (PETERSON et al., 2000), bem como após tratamento agudo (KIZAKE,
2006) e crônico (ADAMCOVÁ et al., 2010) com DOX em ratos.
As MMP podem degradar componentes MEC como as fibras colágenas
tipo I, II e III, gelatina, fibronectina, laminina e vitronectina. A MEC é responsável
pela organização e pela integridade estrutural do miocárdio. No estresse
oxidativo, assim como em outros processos patológicos, pode haver um
desequilíbrio entre as proteases e antiproteases, resultando em alterações
quantitativas e/ou qualitativas na composição da matriz, o que pode resultar em
ruptura do colágeno, com consequente dilatação e remodelamento do miocárdio
(SHAKER & SOUROUR, 2010).
O remodelamento induzido pela DOX pode ser prevenido
terapeuticamente com dexrazoxane, um quelante de ferro, neutralizador de RL
(ADAMCOVÁ et al., 2010). O dexrazoxane é capaz de quelar os íons de ferro
livres, diminuindo assim as reações envolvendo este íon para a produção de RLO,
com consequente redução do estresse oxidativo induzido por esta droga
(GRANADOS-PRINCIPAL et al., 2010).
15
2.5 Antioxidantes
Segundo HALLIWELL (2002), antioxidante é qualquer substância que,
quando presente em baixa concentração, retarda ou previne a oxidação do
substrato.
Existem várias formas de classificação dos antioxidantes. Quanto à
solubilidade, são classificados em hidrossolúveis ou lipossolúveis (SACKHEIM &
LEHMAN, 2001); quanto ao mecanismo de combate aos radicais livres, em
primários ou secundários; quanto à origem, em endógenos (primários,
secundários ou terciários) (LIMA, 2008) ou exógenos, dentre os quais se
encontram os alimentares (BARREIROS & DAVID, 2005). Podem ainda ser
classificados em enzimáticos ou não enzimáticos, sintéticos ou naturais (LIMA,
2008).
A maioria dos antioxidantes solúveis em água reage com oxidantes no
citoplasma celular e no plasma sanguíneo, enquanto os antioxidantes
lipossolúveis protegem as membranas celulares da peroxidação lipídica
(SACKHEIM & LEHMAN, 2001).
Os antioxidantes primários promovem a remoção ou inativação dos RL
formados durante a iniciação ou propagação de uma reação oxidativa. Agem por
meio da doação de átomos de hidrogênio a estas moléculas, interrompendo a
reação em cadeia (LEE & SHIBAMOTO, 2002). Os antioxidantes secundários
bloqueiam a decomposição dos hidroperóxidos e peróxidos pela ação de agentes
redutores, convertendo-os na forma inativa (LIMA, 2008).
2.5.1 Antioxidantes endógenos
Os antioxidantes endógenos compreendem os mecanismos de defesa
celulares (LIMA, 2008). Segundo FREI (1999), os antioxidantes endógenos
primários agem por meio da quelação dos íons metálicos implicados nos
processos oxidativos. Constituem este grupo as proteínas transportadoras de íons
albumina, ceruloplasmina, ferritina, melationeína e transferrina.
16
Os antioxidantes endógenos secundários neutralizam os RL antes que
os mesmos participem de reações em cadeia. Neste grupo encontram-se as
enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase, glutation peroxidase e
glutation redutase) e os compostos de baixo peso molecular (ácido úrico,
bilirrubina, glutation e coenzima-Q) (LIMA, 2008).
Já os antioxidantes endógenos terciários reparam ou eliminam
estruturas celulares lesadas. Neste grupo encontram-se as enzimas de reparo
denominadas DNA glicosidases, endonucleases e ligases (TUDEK, 2003).
2.5.2 Antioxidantes alimentares
Os alimentos além de fornecer nutrientes, podem conter compostos
bioativos promotores da saúde, como a atividade antioxidante das vitaminas A, C
e E, e de compostos fenólicos. De forma geral, o poder antioxidante de frutos e
hortaliças se relaciona aos teores destes compostos, que neutralizam a ação dos
RL (GONÇALVES, 2008).
Devido à grande utilidade das ANT no tratamento do câncer, bem como
ao seu amplo potencial em produzir lesões induzidas por RL, grandes esforços
tem sido feitos em busca de terapias antioxidantes que possam reduzir o estresse
oxidativo destas drogas, sem alterar a eficácia das mesmas. Vários compostos
têm sido testados, especialmente os antioxidantes naturais (GRANADOS-
PRINCIPAL et al., 2010).
Os fenóis, flavonoides, tocoferóis, fosfolipídios, aminoácidos, ácido
fítico, ácido ascórbico, pigmentos e esteróis são substâncias químicas que
possuem atividade antioxidante (ROESLER et al., 2007). Antioxidantes naturais
podem ser extraídos de vegetais e plantas e são excelentes fontes de compostos
fenólicos (ZHENG & WANG, 2001; MANACH et al., 2005). Os compostos
fenólicos apresentam uma grande quantidade de propriedades fisiológicas, dentre
as quais estão as antialergênicas, anti-inflamatórias, antimicrobianas,
antitrombóticas, cardioprotetoras e vasodilatadoras (MIDDLETON et al., 2000;
BALASUNDRAM et al., 2006).
17
O consumo de antioxidantes naturais, como os compostos fenólicos,
presentes na maioria das plantas, inibe a formação de RL e tem sido associado a
uma menor incidência de doenças relacionadas com o estresse oxidativo
(DROGE, 2002). LEE & SHIBAMOTO (2002) evidenciaram que a atividade
antioxidante dos compostos e ácidos fenólicos encontrados em plantas tem seus
efeitos atribuídos a sua propriedade redox e estrutura química. Demonstraram
ainda que os compostos fenólicos possuem um anel benzênico, um grupamento
carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila na molécula, que lhes
conferem propriedades antioxidantes.
O ácido ascórbico (vitamina C), presente em frutas cítricas e algumas
hortaliças, se destaca entre os antioxidantes naturais por ser considerado um dos
mais potentes e menos tóxicos. É hidrossolúvel e encontrado em altas
concentrações em diversos tecidos. É um eficaz neutralizador de RL, já que reage
com as ERO oxidando-se a desidroascórbico, e pela ação da enzima
dehidroascorbatoredutase volta a se converter em ácido ascórbico (LIMA, 2008).
A vitamina C é utilizada para comparar o efeito protetivo de outros compostos
contra os efeitos tóxicos da DOX (GRANADOS-PRINCIPAL et al., 2010).
A vitamina E possui elevada capacidade antioxidante, desempenha
papel biológico fundamental e protege contra os efeitos tóxicos da DOX. Em altas
doses a vitamina E reduz a peroxidação lipídica e aberrações cromossômicas. De
acordo com GRANADOS-PRINCIPAL et al. (2010), este antioxidante reduz a
nefrotoxicidade induzida pela DOX e acelera a regeneração da pele.
PURE et al. (2005) avaliaram o efeito da vitamina E na cardiotoxicidade
induzida pela DOX, utilizando 18 ratos divididos em três grupos (n=6) - grupo A
(controle); grupo B (DOX) e grupo C (pré-tratamento com vitamina E + DOX).
Avaliaram peso, eletrocardiografia, níveis séricos de creatinafosfoquinase MB
(CK-MB), lactato desidrogenase (LDH) e transaminase glutâmico-oxalacética
(TGO), também chamada aspartato aminotransferase (AST). Concluíram que o
pré-tratamento com vitamina E reduziu as alterações eletrocardiogáficas, ajudou a
reduzir os níveis de CK-MB e LDH aumentados com a lesão do miocárdio
causada pela DOX, mostrando evidências de que a vitamina E apresenta efeito
protetor no miocárdio de ratos submetidos à cardiotoxicidade pela DOX.
18
Carotenoides são pigmentos que dão cor a determinados alimentos,
como frutas e verduras, e participam ativamente na fisiologia vegetal,
especialmente da fotossíntese. Alguns carotenoides possuem atividade pró-
vitamina A e antioxidante. Os carotenoides se assemelham à vitamina E por
possuir característica lipofílica, atuando sobre as lipoproteínas. Seu potencial
antioxidante é utilizado quando as lipoproteínas se expõem à oxidação lipídica.
Laranja, manga, mamão, cenoura, batata doce e folhas de espinafre são
exemplos de frutas e verduras que se destacam pela abundância de pigmentos
carotenoides (LIMA, 2008).
Pesquisas foram realizadas em busca de substâncias antioxidantes
para neutralizar os efeitos deletérios do estresse oxidativo e relatam a redução da
cardiotoxicidade da DOX (OZDOGAN et al., 2011 & XIN et al., 2011).
XIN et al. (2011) investigaram o efeito protetivo do Lycium barbarum
(açaí da china) na cardiotoxicidade induzida pela DOX. Para isso, utilizaram 32
ratos divididos em quatro grupos (n=8). Os ratos do G1 receberam água e solução
salina; os do G2 LPB (polissacarídeo de Lycium barbarum) e solução salina; os
do G3 água e DOX (DOX); e os do G4 LPB e DOX. O LPB (200 mg/Kg) e a água
destilada foram administrados por via oral durante 10 dias. A DOX (10 mg/Kg) e a
solução salina (0,9%, 10 ml/kg) foram administrados por via intravenosa no dia
sete após o início do experimento. Três dias após a aplicação da DOX foi
realizado exame eletrocardiográfico, análises bioquímicas e os ratos eutanasiados
para a avaliação morfológica. Os autores concluíram que o LPB propiciou
significativo efeito protetivo na cardiotoxicidade induzida pela DOX pela supressão
do estresse oxidativo. Microscopicamente, o grupo que recebeu somente a DOX
apresentou extensa vacuolização citoplasmática e desorganização miofibrilar
(Figura 6).
19
FIGURA 6- Fotomicrografias de tecido cardíaco de ratos dos grupos controle (A), DOX (B) e LBP + DOX (C). Notar que a vacuolização citoplasmática e a desorganização miofibrilar foi parcialmente atenuada no grupo C e acentuada no grupo B (LPB + DOX). (HE, 400X). Fonte: Adaptado de XIN et al. (2011).
OZDOGAN et al. (2011) avaliaram o efeito antioxidante da carnosina,
um dipeptídeo presente em tecidos de mamíferos, particularmente encontrado
nas fibras musculares esqueléticas, responsável pela neutralização de RL e
produtos da peroxidação lipídica das membranas celulares. Avaliaram-se pressão
arterial, parâmetros hemodinâmicos, eletrocardiográficos, exames bioquímicos
tais como creatinafosfoquinase (CK), lactato desidrogenase (LDH), aspartato
aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), quantificação das
enzimas glutation peroxidase (GSH-Px), superóxido dismutase (SOD) e catalase
(CAT), e mensuração da peroxidação lipídica pelo método de quantificação de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Segundo os autores, o
tratamento com carnosina promoveu significativa redução da disfunção cardíaca
induzida pela DOX, revelada pela normalização da função ventricular,
eletrocardiografia (ECG) e exames bioquímicos.
2.5.3 Frutos do cerrado com propriedades antioxidantes
ROESLER et al. (2007) avaliaram a atividade antioxidante de diferentes
frações de frutos (casca, polpa e semente) do cerrado. Trabalharam com Annona
crassiflora (araticum), Solanum lycocarpum (lobeira), Eugenia dysenterica
(cagaita), Caryocar brasilense (pequi) e Swartzia langsdorfii (banha de galinha).
Os extratos aquosos e etanólicos foram avaliados e devido ao altíssimo teor de
fenóis em alguns extratos, os mesmos foram selecionados para medir o potencial
20
de sequestrar RL pelo modelo 2,2 difenil-1-picril hidrazil (DPPH). Os extratos que
apresentaram os melhores resultados neste estudo foram o aquoso e etanólico da
casca do pequi, o etanólico das sementes de cagaita e o etanólico da casca e
sementes de araticum.
Algumas espécies do gênero Caryocar, da família Caryocaraceae,
denominadas pequi, piqui ou piquiá, são de ocorrência no cerrado brasileiro e os
frutos são apreciados e utilizados na culinária das regiões Centro-Oeste, Norte e
parte do Nordeste. É de uso amplo das populações destas regiões, em grande
parte pelo seu valor alimentício, medicinal, melífero, ornamental, oleaginoso e
tanífero (KERR et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2008). Segundo LIMA et al. (2007),
o fruto do pequi é potencialmente uma fonte de compostos antioxidantes, pois
possuem 209 mg/100g de compostos fenólicos totais avaliados em todo o fruto,
com maior quantidade na casca. Para KUSKOSKI et al. (2005), a capacidade
antioxidante do pequi está diretamente relacionada aos compostos fenólicos.
De acordo com SILVA et al. (2001), os frutos da cagaiteira (Eugenia
dysenterica DC., Myrtaceae) se destacam no bioma cerrado, podem ser
consumidos in natura ou processados na forma de licores, sorvetes, sucos ou
geleias, e seus frutos, folhas e cascas apresentam propriedades medicinais. As
folhas e cascas são utilizadas pela medicina popular no tratamento de diarreias,
diabetes e icterícia. De acordo com GONÇALVES (2008), a cagaita pode ser
considerada uma boa fonte de antioxidantes.
ALVES et al. (2008) avaliaram por voltametria cíclica o potencial
redutor dos extratos etanólicos e hexânicos da cagaita, cajuzinho-do-cerrado e
guariroba, e concluíram que todos estes frutos do cerrado goiano possuem
antioxidantes naturais e oferecem significativa atividade antioxidante.
21
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Tanto o organismo humano quanto o animal estão sujeitos a lesões
induzidas pelo estresse oxidativo, causado pelo próprio organismo ou por fontes
exógenas. A doxorrubicina é uma dentre as várias fontes exógenas de radicais
livres. Devido à relevância clínica e social, antioxidantes naturais derivados da
dieta, como os compostos fenólicos, a vitamina E, vitamina C, os carotenoides,
entre outros, são alvo de investigação científica.
Porém, os mecanismos complexos das atividades pró e antioxidantes
de diversos compostos naturais ainda não estão completamente esclarecidos.
Além disso, constatou-se que os mecanismos moleculares de cardiotoxicidade
pelas antraciclinas também não são bem compreendidos. A profunda
compreensão dos mesmos é fundamental para a obtenção de terapias
cardioprotetoras eficientes.
Os oncologistas necessitam muitas vezes aumentar a dosagem e/ou o
número de aplicações de doxorrubicina em função da resistência de certas
neoplasias. Neste sentido, a busca por substâncias citoprotetoras que visem
reduzir a cardiotoxicidade desta droga sem diminuir seu pontencial quimioterápico
passa a ser alvo de pesquisas.
É importante ressaltar que existem vários frutos do cerrado com grande
capacidade antioxidante e destacar a possibilidade da exploração sustentável dos
recursos naturais deste bioma brasileiro.
22
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