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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA E ECOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
EMANUELLE PEREIRA DO NASCIMENTO
CEPAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASE: ANÁLISE DA EFICÁCIA DE
NOVO TESTE RÁPIDO PARA SUA IDENTIFICAÇÃO.
CUIABÁ
2016
EMANUELLE PEREIRA DO NASCIMENTO
CEPAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASE: ANÁLISE DA EFICÁCIA DE
NOVO TESTE RÁPIDO PARA SUA IDENTIFICAÇÃO.
Projeto de pesquisa apresentado ao Departamento de Botânica e Ecologia do Instituto de Biociências da Universidade Federal de Mato Grosso, como requisito parcial para obtenção do Grau de Especialista em Microbiologia.
Orientadora: Prof.ª Dra. Inês Stranieri Coorientadora: Prof.ª Dra. Aline Gehlen Dall Bello
CUIABÁ
2016
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho a Deus que
sempre me abençoou e me deu força e
aos meus pais que são as pessoas mais
importantes da minha vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela sabedoria, saúde e força para superar as adversidades.
A Universidade Federal de Mato Grosso, o qual possibilitou, junto ao corpo docente,
um extenso conhecimento para trabalhar com qualidade, confiança e ética.
A empresa PROBAC, pela disponibilização dos testes para a pesquisa, o qual foi
essencial para o seu desenvolvimento.
Ao Hospital Santa Rosa representado pelo Dr. Cervantes, Santa Rosa Lab
representado pela Diretora Mara Nasrala e em especial a Gerente Técnica Gabrieli
Carlotto Moura, pela disponibilização dos dados para realização da pesquisa, além
da dedicação, incentivo e amizade que proporcionou durante esse período, o qual foi
de extrema importância para realização da pesquisa.
A orientadora Prof.ª Dra. Inês Stranieri, por todo ensinamento dedicado nesses
últimos anos e pelo incentivo à pesquisa.
A Co-orientadora Prof.ª Dra. Aline Gehlen Dall Bello, que me mostrou que além do
conhecimento e a dedicação, a integridade e a generosidade nos leva ao sucesso.
A Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH), representada pela Dra.
Zamara Brandão, Auriane Rodrigues Técnica de Enfermagem da CCIH e a toda
equipe do Setor de Microbiologia do Santa Rosa Lab pela parceria.
Aos familiares e amigos pelo o amor e apoio incondicional.
E a todos que fizeram parte direta e indiretamente dessa conquista.
EPÍGRAFE
“A razão é o passo, o aumento da
ciência o caminho e o benefício da
humanidade o fim.”
Thomas Hobbes
RESUMO
INTRODUÇÃO: Segundo a organização Mundial de Saúde (OMS), infecções
associadas aos cuidados de saúde com microrganismos resistentes são uma das
principais causas de morte, dentre as doenças infecciosas. O número de infeções de
Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase (KPC) no Brasil, está
aumentando, além do impacto clínico, podem causar um fardo econômico enorme
em países em desenvolvimento. O padrão-ouro para a detecção de carbapenemase
é a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), porém essas técnicas moleculares são
geralmente caras, trabalhosas, demoradas e não são facilmente disponíveis em
laboratórios clínicos, dessa forma, métodos alternativos que possam trazer bons
resultados podem ser importantes aliados para um laboratório de microbiologia
clínica que não dispõe desta tecnologia. OBJETIVO: Analisar a eficácia do teste
rápido Carbapenembac®, para identificação de cepas produtoras de carbapenemase
isoladas de espécimes clínicos no laboratório microbiológico de rotina.
METODOLOGIA: Foram incluídos nesse estudo um total de 50 amostras clínicas
não duplicados, com isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes aos
carbapenêmicos, os quais foram coletados no período de Novembro de 2015 à
Junho de 2016 do Laboratório Santa Rosa, localizado no Hospital Santa Rosa,
Cuiabá – MT. A susceptibilidade antimicrobiana foi realizada automaticamente
através do Sistema PhoenixTM 100 da Becton Dickinson utilizando como
interpretação o CLSI. A detecção pelo teste rápido carbapenembac foi realizada de
acordo com as instruções do fabricante. A Detecção do gene blaKPC por métodos
moleculares (qPCR) foi realizado pela Universidade Federal de Ciências da Saúde
de Porto Alegre – UFCSPA, a fim de comparar o teste com um padrão ouro.
RESULTADOS E DISCUSSÕES: A detecção de KPC pelo teste rápido foi positiva
em 47/50 isolados. Os resultados do qPCR foram positivos em todas as amostras.
O valor preditivo positivo foi de 94%, o valor preditivo negativo de 62,5%, a
sensibilidade de 94% e a especificidade de 100%. CONCLUSÃO: 3/50 isolados
testados apresentaram resultados negativos para produção de carbapenemase no
teste rápido, sendo positivos no padrão ouro. Poucas amostras negativas para KPC
foram testadas, por isso a especificidade pode ter sido superestimada (100 %).
Comparando os resultados obtidos pelo teste rápido e o padrão ouro, os testes
apresentaram alta sensibilidade (94%) sendo um ótimo teste de triagem em rotina
laboratorial.
PALAVRAS-CHAVE: Carbapenembac. KPC. qPCR. Teste rápido.
ABSTRACT
INTRODUCTION: according to the World Health Organization (WHO), healthcare-
associated infections with resistant organisms are one of the leading causes of death
among infectious diseases. The number of infections of Klebsiella pneumoniae
carbapenemase (KPC) in Brazil, it is increasing, in addition to the clinical impact, can
cause a huge economic burden on developing countries. The gold standard for
detection of carbapenemase is the polymerase chain reaction (PCR), however these
molecular techniques are generally expensive, laborious, time consuming and are
not easily available in clinical laboratories, in this way, alternative approaches that
can bring good results can be important allies for a clinical microbiology laboratory
that has not this technology. OBJECTIVE: Analyze the effectiveness of the
Carbapenembac® rapid test for identification of carbapenemase producing strains
isolated from clinical specimens in the microbiological laboratory routine. METHODS:
were included in this study a total of 50 samples non-duplicated, with clinical isolates
of Klebsiella pneumoniae resistant to carbapenêmicos, which were collected in the
period from November to June 2015 to 2016 the laboratory Santa Rosa in Santa
Rosa Hospital, Cuiabá-MT. Antimicrobial susceptibility was performed automatically
through the system 100 PhoenixTM of Becton Dickinson using interpretation the
CLSI. The detection by the carbapenembac rapid test was performed according to
the manufacturer's instructions. Detection of the gene blaKPC by molecular methods
(qPCR) was conducted Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre-
UFCSPA in order to compare the test with the gold standard. RESULTS AND
DISCUSSIONS: the KPC detection for quick test was positive for 47/50. The results
of the qPCR were positive in all samples. The positive predictive value was 94%, the
negative predictive value of 62.5%, 94% sensitivity and 100% specificity.
CONCLUSION: 3/50 tested isolates showed negative results for carbapenemase
production in the rapid test, being positive in the gold standard. Few negative
samples for KPC were tested, so the specificity may have been overestimated
(100%). Comparing the results obtained by the rapid test and the gold standard, the
tests showed high sensitivity (94%) being a good screening test in laboratory routine.
Keywords: Carbapenembac. KPC. qPCR. Quick test.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Dados clínicos e laboratoriais dos isolados.
Tabela 2. Resultados dos isolados testados.
Tabela 3. Resultado comparativo entre qPCR blaKPC e o teste rápido
Carbapenembac.
LISTA DE SIGLAS
ESBLs: β-lactamases de espectro estendido
IMP: Imipenemase
VIM: Verona Imipenemase
NDM: New Delhi metallo-beta-lactamase
KPC: Klebsiella pneumoniae carbapenemase
OMS: Organização Mundial de Saúde.
CCIH: Comissão de Controle de Infecção Hospitalar.
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
qPCR: reação em cadeia da polimerase em tempo real.
DNA: Ácido desoxirribonucleico
RNA: Ácido ribonucleico
AN: Amicacina
AMC: Amoxacilina/clavulanato
FEP: Cefepime
CAZ: Ceftazidima
CRO: Ceftriaxona
CXM: Cefotaxima
CIP: Ciprofloxacina
CL: Colistina
ETP: Ertapenem
GM: Gentamicina
IPM: Imipenem
LVX: Levofloxacina
MEM: Meropenem
TZP: Piperacilina/ tazobactam
SXT: Trimetropim/ sulfametoxazol
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 11
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 12
3. OBJETIVO .......................................................................................................... 13
3.1. OBJETIVO GERAL ...................................................................................... 13
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 13
4. HIPÓTESE .......................................................................................................... 13
5. METODOLOGIA ................................................................................................. 14
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES ....................................................................... 16
7. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 19
8. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 20
11
1. INTRODUÇÃO
A resistência microbiana traz consigo várias adversidades relacionadas à
falha terapêutica, levando ao aumento da morbidade e mortalidade de pacientes,
além do custo do tratamento por conta da prorrogação do tempo de internação e
gastos com outros antimicrobianos (HAWKEY,2009).
Com o surgimento das β-lactamases de espectro estendido (ESBLs), mais
frequentes em enterobactérias, especialmente Klebsiella pneumoniae e Escherichia
coli, que causam resistência às penicilinas, cefalosporinas de amplo espectro e
monobactâmicos (ANVISA,2016), aumentou-se a frequência de utilização de
carbapenêmicos para tratamento de infecções por bactérias da família
Enterobactereaceae. Além da pressão seletiva criada pelo uso dos carbapenêmicos,
têm sido observados índices crescentes de resistência a estas drogas (TAVARES,
2014), as enterobactérias resistentes a carbapenens tem sido reportada
mundialmente como consequência da facilidade de adquirir os genes
carbapenemases (NORDMANN, 2011). É provável que a circulação de gene
carbapenemase procede de duas direções: fontes ambientais fornecendo material
genético como fonte destas enzimas, por exemplo, a carbapenemase SFC-1 de
classe A foi descrita em um isolado ambiental de Serratia fonticola. Cepas clínicas
podem dispersar estes genes tanto dentro do ambiente hospitalar como no ambiente
circulante (QUEENAN, 2007).
Essa resistência é observada a partir da produção de carbapenemase, sendo
o principal mecanismo que confere resistência a essa classe de antibióticos em
bactérias da família Enterobacteriaceae.
Carbapenemases são membros da classe molecular A, B, D e β-lactamase.
Na classe B estão as metalobetalactamases, sendo os tipos IMP, VIM e NDM as
mais frequentemente detectadas em enterobactérias; na classe D as OXA-
carbapenemases, sendo a mais frequente em enterobactérias a OXA-48; e as
carbapenemases de classe A que inclui membros das famílias das PME, IMI, NMC,
GES, e KPC (ANVISA, 2013; QUEENAN; BUSH, 2007). Dentro da classe A, as
carbapenemases KPC são as mais prevalentes, encontradas principalmente em
plasmídeos em Klebsiella pneumoniae (QUEENAN; BUSH, 2007) e de acordo com
TAVARES (2014), é uma das mais importantes do ponto de vista epidemiológico,
12
pois apresentou rápida disseminação mundial, após seu primeiro relato, em 1996,
que ocorreu na Carolina do Norte (EUA), durante a execução de um projeto de
vigilância epidemiológica (YIGIT et al., 2001).
No Brasil, a enzima KPC foi relatada inicialmente em K. pneumoniae no
estado do Recife, em 2006, mas atualmente já se encontra disseminada pelo país,
onde sua incidência tem aumentado significativamente (TAVARES, 2014).
Segundo a organização Mundial de Saúde (OMS), em todos os países, as
infecções associadas aos cuidados de saúde com microrganismos resistentes são
uma das principais causas de morte, dentre as doenças infecciosas (WHO, 2016).
Portanto, há necessidade de uma identificação correta dessas cepas resistentes,
para proporcionar um tratamento adequado ao paciente.
2. JUSTIFICATIVA
Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase (KPC) podem causar
infecções graves, principalmente em pacientes hospitalizados, devido a poucas
opções terapêuticas, corroborando para o aumento da mortalidade. Causando um
fardo econômico enorme à saúde pública. Além disso, KPC pode ser um desafio de
detectar em laboratórios clínicos (ZÚÑIGA, et. al, 2015). O padrão-ouro para a
detecção de carbapenemase é a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), porque
os métodos fenotípicos têm baixa especificidade. Além disso, técnicas moleculares
são geralmente caras, trabalhosas, demoradas e não são facilmente disponíveis em
laboratórios clínicos (MARTINO, 2015).
Dessa forma, métodos alternativos que possam trazer bons resultados, se
tratando de precisão, rapidez e custo acessível, podem ser importantes aliados para
um laboratório de microbiologia clínica que não tem a possibilidade de investir em
uma detecção através do PCR e assim ajudar a Comissão de Controle de Infecção
Hospitalar (CCIH) a desenvolver um bom trabalho na unidade de saúde.
O novo teste rápido Carbapenembac®, propõe a identificação rápida de
bactérias produtoras de carbapenemases. Suas fitas possuem em sua composição
carbapenêmicos numa concentração ideal para que as enzimas produzidas pelas
13
KPCs provoquem a hidrólise destes compostos. A leitura é feita a partir do produto
dessa hidrólise.
3. OBJETIVO
3.1. OBJETIVO GERAL
Analisar a eficácia do teste rápido Carbapenembac®, para identificação de
cepas produtoras de carbapenemase.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
● Analisar sua acurácia;
● Identificar se o teste rápido é viável para exames microbiológicos de rotina.
4. HIPÓTESE
Apresenta alta sensibilidade e especificidade para detecção de cepas
produtoras de carbapenemases com bom custo-benefício para implantação na rotina
de laboratórios clínicos.
14
5. METODOLOGIA
Isolados clínicos
Foram incluídos nesse estudo um total de 50 isolados não duplicados de
Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos (Imipenem, Meropenem e
Ertapenem). Os isolados foram coletados no período de Novembro de 2015 à Junho
de 2016, hospitalizados no Hospital Santa Rosa, em Home Care e em unidades de
atendimento do Laboratório Santa Rosa, localizado no Hospital Santa Rosa, Cuiabá
– MT.
Os dados clínicos foram fornecidos pela Comissão de Controle de Infecção
Hospitalar (CCIH) do Hospital Santa Rosa. Os dados das outras unidades de saúde
e de pacientes de Home Care, não foram fornecidos.
Os microrganismos foram isolados de múltiplas infecções, incluído urina (n=
24), swab retal (n=8), sangue (n=5), aspirado traqueal (n= 7), ponta de cateter (n=2),
líquido biliar (n=1), líquido peritoneal (n=1), secreção de ferida operatória (n=1) e
secreção de gastrostomia (n=1).
Como controle negativo foram incluídos 5 teste com cepa de Escherichia coli
ATCC 25922.
Determinação da suscetibilidade antimicrobiana
A susceptibilidade antimicrobiana foi realizada automaticamente e
interpretada de acordo com as recomendações do CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute). Todas as cepas foram identificadas como possíveis produtoras
de carbapenemases através do Sistema PhoenixTM 100 da Becton Dickinson -
Estados Unidos, utilizando o PHOENIX PAINEL BD NMIC/ID 94.
Detecção de KPC através do teste rápido carbapenembac
A detecção da carbapenemase KPC foi realizada a partir de repiques no meio
de cultivo ágar sangue com culturas incubadas por 24 horas. A preparação do
inóculo foi feita a partir de uma suspensão equivalente a turvação de 10 na escala
de McFarland num tubo com solução seletiva que compõe o Kit Carbapenembac®.
Inoculou-se 150 µL da suspensão na fita, a qual foi encubada entre 35º e 37º C por 1
hora dentro de uma placa de petri tampada.
15
Retirou-se a placa com as fitas da estufa e após a adição de 200µL da
Solução de Iodo Especial que confere uma cor roxa à fita, a placa foi tampada e
armazenada em temperatura ambiente.
O diagnóstico de cepa carbapenemase positiva pode ser feito de 15 a 20
minutos, onde nas bordas das fitas aparecerá inicialmente uma cor amarela
esbranquiçada, o que indica hidrólise dos carbapenêmicos presentes na fita. A
hidrólise será evidenciada até sumir quase totalmente a cor roxa, ficando apenas a
amarela. Esse tempo pode variar de 15 a 60 minutos após a adição da solução de
Iodo Especial.
As fitas embebidas com cepas negativas permanecem de cor roxa podendo
apresentar leve cor branca nas bordas, dessa forma, a cada 10 testes com as cepas
selecionadas, realizamos 1 controle negativo com cepa Escherichia coli ATCC
25922.
Detecção do gene blaKPC por métodos moleculares
A fim de comparar os resultados obtidos pelo teste rápido Carbapenembac®
com um teste molecular padrão ouro, todos os 50 isolados, foram enviados para
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre – UFCSPA, onde
investigou-se os genes responsáveis pela produção de carbapenemase através da
reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR).
A extração do DNA das amostras e controle positivo (suspensão em água
livre de DNA e RNA) foi realizada com o kit comercial Pathogen RNA/DNA MagMax®
no equipamento MagMaxTM Express, conforme a seguinte padronização: (1) preparo
da placa com a solução "Bead mix", amostra, isopropanol, soluções de lavagem e
tampão eluente, (2) adicionado 50µl da suspensão contendo a amostra, equivalente
a turvação de 10 na escala de McFarland, (3) inserção da placa no equipamento e
posterior programação do mesmo (protocolo 4462359). Após esse processo, os
ácidos nucleicos foram quantificados no equipamento Nanodrop®, diluídos a uma
concentração de 10ng/µl e armazenados a -20°C.
A qPCR foi realizada no equipamento Applied Biosystems® 7500 Real Time
PCR Systems. Utilizou-se os primers com as sequencias forward (5’-
TTGTTGATTGGCTAAAGGG-3’) e reverse (5’- CCATACACTCCGCAGGTT-3’)
padronizado por Wang et. al. O amplicon foi de 106 pares de base. O volume total
da reação foi de 25 μl, contendo 15 μl de SYBR® Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems), 0.2 μM de cada primer, 7,6 μl de água estéril livre de RNA e DNA e 2 μl
16
DNA template (amostra extraída). A amplificação por RT-PCR realizada utilizando:
ciclo inicial de 5 minutos a 95°C, seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 95°C, 15
segundos a 55°C e 30 segundos a 72°C. As amostras positivas apresentaram a
curva de melting igual ao controle positivo utilizado (ATCC BAA1705).
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os isolados clínicos testados procederam de pacientes hospitalizados no
Hospital Santa Rosa (38/50), internos de outras unidades (5/50) e de Home Care
(7/50). A faixa de idade foi de 1 mês à 90 anos, 31/50 do gênero masculino e 19/50
do gênero feminino.
Dentre as doenças de base e condições associadas (Tabela 1), destaca-se
Diabetes Mellitus 13,3% (6/45), Neoplasias 11,1% (5/45), Vírus da imunodeficiência
Humana – HIV 2,2 % (1/45), Insuficiência renal 11,1% (5/45), Traumatismo 8,8%
(4/45) e Acidente Vascular cerebral 8,8% (4/45).
Para os pacientes hospitalizados o tratamento variou entre os casos. Em 81,6
% (31/38) foi utilizado associação de antibióticos, destacando-se o uso de
Carbapenêmicos e Polimixina B. Já no uso de terapia isolada 18,4 % (7/38), utilizou-
se Meropenem, Amicacina, Ertapenem e Ciprofloxacina. Evoluindo para alta
hospitalar 52,6% (20/38), óbito 44,7% (17/38).
Tabela 1. Dados clínicos e laboratoriais dos isolados. Amostras KPC (50)
Genero M/F 31/19
Idade Média 64,3
Colonização 16% (8/50)
Condições associadas
Imunocomprometido
HIV 2,2 % (1/45)
Neoplasia 11,1% (5/45)
Diabete mellitus 13,3% (6/45)
Imunocompetente
Insuficiencia renal 11,1% (5/45)
Insuficiencia hepática 2,2 % (1/45)
Insuficiencia respiratória 4,4% (2/45)
17
Peritonite 4,4% (2/45)
Traumatismo 8,8% (4/45)
Acidente vascular cerebral 8,8% (4/45)
Trombose 2,2 % (1/45)
Hiperplasia de próstata 2,2 % (1/45)
Tratamento*
Polimixina B + Carbapenêmicos 16,1 % (5/31)
Polimixina B + Carbapenêmicos + Amicacina 3,2% (1/31)
Carbapênemicos + Amicacina 3,2% (1/31)
Polimixina B + Amicacina 6,4% (2/31)
Linezolida + Meropenem 6,4% (2/31)
Amicacina 6,4% (2/31)
Carbapenêmico 3,2% (1/31)
Meropenem + Teicoplanina + Amicacina 9,6% (3/31)
Ciprofloxacina 3,2% (1/31)
Daptomicina + Polimixina B 3,2% (1/31)
Piperacilina/Tazobactam + Amicacina 3,2% (1/31)
Teicoplanina + Amicacina + Polimixina B 3,2% (1/31)
Meropenem + Tigeciclina + Amicacina + Polimixina B 3,2% (1/31)
Meropenem + Gentamicina 3,2% (1/31)
Moxifloxacino 3,2% (1/31)
Teicoplanina + Polimixina B 3,2% (1/31)
Cefepime + Teicoplanina + Fluconazol 3,2% (1/31)
Piperacilina/Tazobactam + Teicoplanina + Meropenem
3,2% (1/31)
Ceftriaxona + Clindamicina 3,2% (1/31)
Ceftriaxona + Ciprofloxacina 3,2% (1/31)
Claritromicina + Amicacina + Polimixina B 3,2% (1/31)
Evolução
Alta hospitalar 40% (20/38)
Óbito 34% (17/38)
Não informado 2%(1/38)
Amostras: Não foram fornecido dados clínicos dos pacientes de outras unidades de saúde (5/50) e Tratamento/ Evolução dos pacientes de Home Care (7/50). * Amostras provenientes de colonização não foram contabilizadas no tratamento.
A maioria das estirpes de Klebsiella pneumoniae apresentaram o mesmo
padrão de susceptibilidade (Figura 1), sendo 100% resistentes a
AMOXACILINA/CLAVULANATO, CEFEPIME, CEFTAZIDIMA, CEFTRIAXONA,
CEFOTAXIMA, ERTAPENEM, IMIPENEM e PIPERACILINA/TAZOBACTAM.
Intermediários a AMICACINA 16% (8/50) e CIPROFLOXACINA 2% (1/50) e
Sensíveis a AMICACINA 70% (35/50), CIPROFLOXACINA 2% (1/50), COLISTINA
64% (32/50), GENTAMICINA 30% (15/50), LEVOFLOXACINA 2% (1/50),
MEROPENEM 2% (1/50) e TRIMETROPIM/SULFAMETOXAZOL 16% (8/50).
18
Figura 1. Padrão de susceptibilidade antimicrobiana das estirpes de Klebsiella pneumoniae.
AN = amicacina; AMC= amoxacilina/clavulanato; FEP= cefepime; CAZ= ceftazidima; CRO= ceftriaxona; CXM= cefotaxima; CIP= ciprofloxacina; CL= colistina; ETP= ertapenem; GM= gentamicina; IPM= imipenem; LVX= levofloxacina; MEM= meropenem; TZP= piperacilina/ tazobactam; SXT = trimetropim/ sulfametoxazol; R=resistente; S= sensível; I= intermediário.
Todas os isolados foram testados por três metodologias, os resultados estão
sintetizados na tabela 2. A detecção de carbapenemase KPC pelo teste rápido, foi
positiva para 47/50 isolados, sua positividade (presença de bordas amarelas
esbranquiçadas) foi evidenciada entre 15 e 20 minutos. Após 60 minutos os testes
positivos já estavam totalmente brancos (Figura 2).
Tabela 2. Resultados dos isolados testados. Isolados Clínicos Phoenix 100 Carbapenembac PCR real time
Klebsiella pneumoniae (50) 50/50 positivo 47/50 positivo 50/50 positivo
Escherichia coli ATCC 25922 (10) 5/5 negativo 5/5 negativo 5/5 negativo
As fitas embebidas com cepas negativas de Escherichia coli ATCC 25922,
permaneceram inalteradas, apresentando bordas esbranquiçadas após 60 minutos
de teste. Da mesma forma se comportou os testes com as cepas 34, 35 e 48, sendo
consideradas negativas.
19
Figura 2. Representação do teste rápido carbapenembac com isolados de Klebsiella pneumoniae positivos para carbapenemase KPC.
C= controle negativo (Escherichia coli ATCC 25922); 40 = cepa positiva para KPC.
A acurácia do teste rápido de KPC comparado ao padrão ouro foi calculada
baseada na tabela 3. Os resultados do qPCR foram positivos em todas as amostras,
conforme a tabela abaixo. O valor preditivo positivo foi de 94%, o valor preditivo
negativo de 62,5%, a sensibilidade de 94% e a especificidade de 100%.
Tabela 3. Resultado comparativo entre qPCR blaKPC e o teste rápido Carbapenembac®.
Padrão-ouro PCRq
Positivo Negativo
Teste rápido Carbapenembac
®
Positivo 47 0
Negativo 3 5
Sensibilidade de 94%; Especificidade de 100%.
7. CONCLUSÃO
Dos isolados testados 3/50 apresentaram resultados negativos para produção
de carbapenemase, mas foram positivas no qPCR. Como poucas amostras
negativas ou sem suspeita de KPC foram testadas, a especificidade do teste foi alta
(100 %), podendo ter gerado uma especificidade aumentada em relação a realidade,
dessa forma, sugere-se a realização de testes de qPCR e Cabapenembac com
amostras sensíveis a carbapenens para cálculo de especificidade.
20
Comparando os resultados obtidos pelo teste rápido Carbapenembac com um
teste molecular padrão ouro, os testes apresentaram alta sensibilidade (94%) sendo
um ótimo teste de triagem em rotina laboratorial e apresentando um bom custo-
benefício. Recomenda-se sempre utilizar um controle negativo juntamente com o
teste a ser realizado, lembrando que um resultado negativo deve ser confirmado
utilizando o padrão ouro.
8. REFERÊNCIAS
ANVISA – Agência Nacional de vigilância Sanitária. Resistencia microbiana:
mecanismos e impacto clínico. Disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/opas_w
eb/modulo3/mec_permeabilidade.htm. Acesso em 24 de Abril de 2016.
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Nota técnica nº 01/2013 -
Medidas de prevenção e controle de infecções por enterobactérias multiresistentes.
Brasília, 2013.
HAWKEY, P. M.; JONES, A. M. The changingepidemiologyofresistance. J
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MARTINO, M. D. V.; KOGA, P. C. M.; PASTERNAK, J.; DOI, A. M.; CIOLA, C. S.;
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carbapenemresistenteEnterobacteriaceae. Journal of Microbiological Methods, 2015.
QUEENAN A. M.; BUSH, K. Carbapenemases: the versatile beta-lactamases.
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TAVARES, C. P. Caracterização molecular de Enterobacteriaceaenão-
Klebsiellapneumoniaeprodutoras de KPC isoladas em diferentes estados
21
brasileiros(Dissertação de Mestsrado) Instituto Oswaldo Cruz – Pós-Graduação em
Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro, 2014.
WANG, L; GU, H; LU, X. A rapid low-cost real-time PCR for the detection of klebsiella
pneumoniae carbapenemase genes. Annals of Clinical Microbiology and
Antimicrobials. Department of Laboratory Medicine, Beijing Tongren Hospital, Capital
Medical University, No1. Dongjiaominxiang Road, Dongcheng District, Beijing
100730, China, 2012.
WHO – World Health Organization.Public Health Importance of Antimicrobial
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