Chá branco ( Camellia sinensis ) diminui estresse ...sumÁrio lista de quadros x lista de tabelas xi lista de figuras xii lista de siglas e abreviaturas xvi resumo xix abstract xxi

Lílian Gonçalves Teixeira

Chá branco (Camellia sinensis) diminui

estresse oxidativo e trigliceridemia em

camundongos com obesidade induzida por

dieta hiperlipídica

Instituto de Ciências Biológicas da UFMG

Belo Horizonte, MG

2010

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Lílian Gonçalves Teixeira

Chá branco (Camellia sinensis) diminui

estresse oxidativo e trigliceridemia em

camundongos com obesidade induzida por

dieta hiperlipídica

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológica da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Bioquímica e Imunologia

Orientadora: Dra. Jacqueline I. Alvarez-Leite

Instituto de Ciências Biológicas da UFMG

Belo Horizonte, MG

2010

ATA DA DEFESA

AGRADECIMENTOS

A professora Jacqueline I. Alvarez Leite, que aceitou ser minha

orientadora, me direcionou e me proporcionou grande conhecimento durante

esses dois anos.

Aos professores do departamento de bioquímica e imunologia, pelos

ensinamentos compartilhados. E aos funcionários, pelo serviço prestado.

A Maria Helena, essencial no nosso trabalho.

À turma de bases moleculares, pelos momentos de estudos e também

os de diversão.

A Priscilla, que, como aluna de iniciação científica foi muito eficiente e

me ajudou muito nos experimentos e como amiga, presente em todos os

momentos. Agradeço a Nathalia, que começou a me ajudar em um momento

de extrema necessidade. E agradeço também o Rafael, que mesmo não sendo

meu aluno, me ajudou muito nos momentos críticos.

Aos colaboradores do projeto, Solange, Fabíola, Edenil e Tatianna, por

toda a ajuda e companheirismo.

A Analina, o Luciano, a Juliana, a Ana Cecília, a Luciana, a Adaliene e a

Zélia pelos ensinamentos nas técnicas.

Aos amigos do LABiN, que foram como uma segunda família, ajudando

em momentos de trabalho e discussões científicas, em momentos de estresse

e nervosismo e em momentos de alegria e diversão.

Aos outros laboratórios do departamento e de outros departamentos,

pelo socorro em momentos inesperados.

Às instituições financiadoras, CAPES, FAPEMIG e CNPq, pelo incentivo

financeiro.

À Farmácia Galgani, pelo oferecimento do chá branco.

A todos os meus amigos, que, longe ou perto, são essenciais. Muito

obrigada pela amizade e apoio.

A minha família e ao Guilherme, pelo constante incentivo e paciência

nos momentos mais instáveis.

A Nossa Senhora, por sua eterna proteção.

E a Deus, por todas as vitórias conseguidas.

"Para realizar grandes conquistas, devemos não apenas agir, mas também

sonhar; não apenas planejar, mas também acreditar." (Anatole France)

SUMÁRIO

LISTA DE QUADROS X

LISTA DE TABELAS XI

LISTA DE FIGURAS XII

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS XVI

RESUMO XIX

ABSTRACT XXI

1. INTRODUÇÂO 22

2. OBJETIVOS 25

2.1. Objetivo geral 26

2.2. Objetivos específicos 26

3. REVISÃO DE LITERATURA 27

3.1. Obesidade 28

Tecido adiposo e adipócito 29

3.2. Estresse Oxidativo 33

Espécies Reativas de Oxigênio 35

Danos das ROS ao organismo 37

Sistema antioxidante 37

3.3. Obesidade e estresse oxidativo 39

3.4. Complicações da Obesidade 41

Desregulação do metabolismo de lipídeos e doenças

cardiovasculares

42

Resistência insulínica e diabetes mellitus tipo 2 45

3.5. Chá branco e outros chás derivados da planta Camellia

sinensis

47

O chá branco 48

Ação das catequinas 56

Chá de Camellia sinensis e obesidade 58

3.6. Modelo experimental de obesidade induzida por dieta 60

Sumário (continuação)

4. MATERIAIS E MÉTODOS 61

4.1. Animais experimentais 62

4.2. Delineamento experimental 62

Modelo de obesidade 62

Suplementação dietética com chá branco (Camellia sinensis) 64

4.3. Controle do peso corporal, consumo líquido e alimentar 65

4.4. Eficiência alimentar 65

4.5. Amostras de sangue 65

4.6. Amostras de tecidos 66

4.7. Avaliação do perfil lipídico 66

Determinação das concentrações de colesterol total 66

Determinação das concentrações de HDL colesterol 67

Determinação das frações aterogênicas e do índice aterogênico 67

Determinação das concentrações de triglicerídeos séricos 67

Extração de lipídeos por solvente orgânico 68

4.8. Avaliação da Glicemia 68

Determinação da glicemia de jejum 68

Teste de tolerância oral à glicose 69

Teste de sensibilidade à insulina 69

4.9. Avaliação do estresse oxidativo 70

Monitoramento da capacidade antioxidante do soro - Dosagem de

dieno conjugado

70

Avaliação da peroxidação lipídica- TBARS (substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico)

71

Dosagem da concentração de hidroperóxidos 72

Dosagem da atividade da enzima antioxidante catalase 73

Dosagem da atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase 73

ELISA para anticorpo de LDL oxidada 74


4.10. Determinação da Hepatotoxicidade 76

Dosagem de ɣGT 76

4.11. Determinação do infiltrado de macrófagos 76

Dosagem indireta de macrófagos pela determinação da atividade da

N-acetilglicosaminidase (NAG) em tecido adiposo

76

4.12. Avaliação histológica do tecido adiposo 77

4.13. Análise Estatística 77

5. RESULTADOS 79

5.1. O Modelo de Obesidade 80

Ingestão calórica 80

Peso corporal final 80

Adiposidade 81

Parâmetros bioquímicos do soro 83

Estresse oxidativo no fígado 84

Estresse oxidativo no tecido adiposo 85

Infiltrado de macrófagos 86

5.2. O chá branco na obesidade induzida por dieta

hiperlipídica

88

Hepatotoxicidade 88

Ingestão alimentar 89

A. Avaliação do efeito do chá branco na redução do peso

corporal e suas consequências

90

Peso corporal 90

Eficiência alimentar 91

Adiposidade 92

Infiltração de macrófagos no tecido adiposo 95

B. Avaliação do chá branco como agente hipolipidêmico 97

Perfil de lipoproteínas e colesterol total 97


Trigliceridemia e lipídeos cecais e hepáticos 97

C. Avaliação da ação do chá branco como agente

hipoglicemiante

100

Glicemia de jejum 100

Teste de tolerância oral à glicose 101

Teste de sensibilidade à insulina 102

D. Avaliação do chá branco como antioxidante 102

Tecido adiposo 102

Fígado 104

Soro sanguíneo 106

6. DISCUSSÃO 108

6.1. Do modelo de obesidade 108

6.2. Do efeito do chá branco em relação às suas alegações

populares

114

7. CONCLUSÂO 121

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 123

9. ANEXO 140

9.1. Protocolo de aceitação do CETEA 141

9.2. Composição da dieta comercial Labina® 142

X

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Estudos com o chá branco 50

XI

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Ingredientes da dieta hiperlipídica 63

Tabela 2: Composição Centesimal das Dietas 63

Tabela 3: Composição do chá branco 64

Tabela 4: Parâmetros bioquímicos no soro 83

Tabela 5: Perfil colesterolêmico 97

XII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Excesso de ingestão energética contribui para inflamação no

tecido adiposo e contribui para desenvolvimento da síndrome energética

29

Figura 2: Infiltração de macrófagos no tecido adiposo, na obesidade 33

Figura 3: Ânion superóxido e seus derivados 34

Figura 4: Relações entre espécies reativas de oxigênio, defesa

antioxidante e estresse oxidativo.

35

Figura 5: Aumento da geração de ROS e consequente estresse oxidativo

na obesidade.

40

Figura 6: Aumento de ROS na obesidade pode contribuir para síndrome

metabólica

41

Figura 7: Representação esquemática do metabolismo de lipídeos 43

Figura 8: Mudanças na secreção de adipocinas decorrentes da

obesidade e desenvolvimento da resistência insulínica.

46

Figura 9: Planta Camellia sinensis 47

Figura 10: Estruturas de catequinas 56

Figura 11: Cinética da formação de dienos conjugados 70

Figuras do modelo de obesidade

Figura 12: Ingestão calórica 80

Figura 13: Peso corporal final 81

Figura 14: Percentual de adiposidade epididimal final 81

Figura 15: Análise histológica do tecido adiposo epididimal 82

Figura 16: Área dos adipócitos 83

Figura 17: Avaliação do estresse oxidativo em fígado 84

Figura 18: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em fígado 85

Figura 19: Avaliação do estresse oxidativo em tecido adiposo 85

Figura 20: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em tecido

adiposo

86

Figura 21: Dosagem indireta da infiltração de macrófagos 87

Figura 22: Aspecto histológico das estruturas tipo coroa 87

Figura 23: Análise quantitativa das estruturas tipo coroa encontradas em

tecido adiposo epididimal

88

XIII

Lista de figuras (continuação)

Figuras do efeito do chá branco em suas alegações populares

Figura 24: Dosagem de ɣGT 89

Figura 25: Consumo calórico e líquido 90

Figura 26: Evolução ponderal 91

Figura 27: Eficiência alimentar 91

Figura 28: Adiposidade epididimal final 92

Figura 29: Análise histológica do tecido adiposo epididimal 93

Figura 30: Área dos adipócitos 94

Figura 31: Lipídeos extraídos do tecido adiposo epididimal 94

Figura 32: Dosagem indireta da infiltração de macrófagos 95

Figura 33: Aspecto histológico das estruturas tipo coroa ao redor dos

adipócitos

96

Figura 34: Análise quantitativa das estruturas tipo coroa encontradas em

tecido adiposo epididimal

96

Figura 35: Dosagem de triglicerídeos séricos 98

Figura 36: Lipídeos extraídos do conteúdo cecal 99

Figura 37: Lipídeos extraídos do tecido hepático 100

Figura 38: Dosagem de glicemia 101

Figura 39: Teste de tolerância oral à glicose 101

Figura 40: Teste de sensibilidade à insulina 102

Figura 41: Dosagem de estresse oxidativo em homogenato de tecido

adiposo

103

Figura 42: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em

homogenato de tecido adiposo

104

Figura 43: Dosagem de estresse oxidativo em homogenato de tecido

hepático

105

Figura 44: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em

homogenato de tecido hepático

106

Figura 45: Fase de latência da formação de dienos conjugados 106

Figura 46: Dosagem de Anticorpo anti-LDL oxidada 107

XIV

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ɣGPNA

Glutamil da gama glutamil p – nitroanilida

ɣGT Gama glutamil transpeptidase

µg Micrograma

µL Microlitro

µm Micrômetro

µg/mL Micrograma por mililitro

µmol/g Micromol por grama

µmol/L Micromol por litro

µM Micromolar

ºC Grau centígrado

∆ Variação

∆E/min/mg Variação de energia por minuto por miligrama de proteína

Abs Absorbância

Abs/min Absorbância por minuto

AG Ácidos graxos

AGE Produtos avançados de glicação

AGL Ácidos graxos livres

AMP Adenosina monofosfato

AO Defesa antioxidante

Apo Apoproteína

BHT Hidroxitolueno butilado

BSA Soro de albumina bovina

CETP Enzima proteína de transferência de ésteres de colesterol

Co-A Coenzima A

CO Grupo experimental que recebeu dieta comercial

Col. Colaboradores

CRP Proteína C reativa

Cu2+ Íon cuproso

CuCl2 Cloreto de cobre

db/db Camundongo deficiente para o gene do receptor de leptina

DIF Fator de diferenciação monócito-macrófago

XV

Lista de siglas e abreviaturas (continuação)

DMSO Dimetilsulfóxido

DPPH Capacidade de sequestro de radicais livres

EA Eficiência alimentar

EDTA Ácido etileno diamino tetra-acético

EGCG Epigalocatequina galato

ELISA “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”

eNOS Óxido nítrico sintase endotelial

Fase lag Fase de latência

Fe2+ Íon ferroso

Fe3+ Íon férrico

FOX Solução de xilenol orange e sulfato ferroso

FRAP Poder antioxidante da redução férrica

g Gramas

g/mL Gramas por mililitro

GLUT4 Transportador de glicose tipo 4

GG Glicilglicina

GPX Glutationa peroxidase

H2O2 Peróxido de hidrogênio

H2SO4 Ácido sulfúrico

HL Grupo experimental que recebeu dieta hiperlipídica

HCl Ácido clorídrico

HDL Lipoproteína de alta densidade

HDLc Colesterol em HDL

HOCl Hiperclorito

HPLC Cromatografia líquida de alta performance

HSL Hormônio lípase sensível

IDL Lipoproteína de densidade intermediária

IFNɣ Interferon gama

IL-1β Interleucina 1 beta

IL-4 Interleucina 4

IL-6 Interleucina 6

XVI


IL-10 Interleucina 10

IMC Índice de massa corporal

iNOS Óxido nítrico sintase induzível

IRS Substrato do receptor de insulina

JNK Jun quinase

KBr Brometo de potássio

Kcal Quilocalorias

Kcal/g Quilocalorias por grama

Kg Quilogramas

kg/m2 Quilogramas por metro ao quadrado

LDL Lipoproteína de densidade baixa

LDLc Colesterol em LDL

LPL Lipase lipoproteica

m Metro

M Molar (mol por litro)

mg Miligrama

mg/dL Miligrama por decilitro

mg/kg Miligramas por quilograma de peso

mL Mililitros

mmol/L Milimol por litro

Mm Mili molar

MAPK Proteínas quinases ativadas por mitógenos

MCP-1 Proteína quimiotática de monócitos 1

MDA Malondialdeído

MIF Fator inibitório de macrófagos

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

MTT Brometo de dimetiltiazol-difeniltetrazolium

NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

NAG N-acetilglicosaminidase

NEFA Ácidos graxos não esterificados

NFκB Fator nuclear kapa B

XVII


Nm Nanômetro

NOS Óxido nítrico sintase

nNOS Óxido nítrico sintase neuronal

NOx Oxidases dependentes de NADPH

O2- Ânion superóxido

OH- Radical hidroxila

ONOO- Peroxinitrito

Ob Grupo experimental com obesidade induzida por dieta

Ob + chá Grupo experimental com obesidade induzida por dieta

acrescida de 0,5% de extrato de chá branco

ob/ob Camundongo deficiente para o gene da leptina

OMS Organização Mundial de Saúde

OPAS Organização Panamericana de Saúde

OPD ortofenileno-diamino

ORAC Capacidade de absorbância dos radicais de oxigênio totais

p/v Peso por volume

PAI-1 Inibidor do ativador do plasminogênio 1

PBS Salina tamponada com fosfato

PKC Proteína quinase C

PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonil

PNA p-nitroalanina

PTN Proteína

RBP4 Proteína ligadora de retinol 4

RNA Ácido ribonucléico

ROS Espécies reativas de oxigênio

RPM Rotações por minuto

SAA3 Soro amilóide A3

SOD Superóxido dismutase

SREBP-1 Proteína ligadora do elemento de regulação do esterol

TA Tecido adiposo

TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

XVIII


TBA Ácido tiobarbitúrico

TEAC Trolox equivalente oxidante

TG Triglicerídeos

TGF-β Fator de transformação e crescimento beta

TNFα Fator de necrose tumoral alfa

TPP Trifenilfostina

U.A. Unidades arbitrárias

U*g Unidades multiplicado por gramas de tecido adiposo

U/L Unidades por litro

U/mg Unidades por miligrama

VCAM-1 Molécula de adesão vascular 1

VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular

VLDL Lipoproteína de densidade muito baixa

v/v Volume por volume

XIX

RESUMO

Alguns estudos sugerem que o chá verde tenha efeitos benéficos na perda de

peso e complicações da obesidade como aterosclerose e diabetes mellitus tipo

2, provavelmente por sua atividade antioxidante. O chá branco, derivado da

mesma planta (Camellia sinensis), possui maior teor de catequinas que o chá

verde e, por isso, tem sido usado popularmente para perda de peso. Porém,

não há relatos consistentes na literatura científica que este efeito realmente

ocorra. Assim, nosso objetivo foi avaliar o efeito da ingestão do chá branco na

evolução da obesidade e suas complicações em camundongos com obesidade

induzida por dieta. Para tanto, criamos um modelo de obesidade associado ao

estresse oxidativo, onde animais C57BL/6 apresentavam aumento do peso, do

percentual de gordura visceral e infiltração de macrófagos neste tecido,

aumento do estresse oxidativo e piora do perfil de lipoproteínas no sangue.

Este modelo foi utilizado, então, para a avaliação dos efeitos da ingestão de

chá branco no ganho ponderal e obesidade. Os animais foram divididos em

grupo obesos (com dieta indutora de obesidade sem suplementação de chá

branco) e grupo chá branco (suplementados com dieta acrescida de 0,5% de

extrato de chá branco) e mantidos nas respectivas dietas por 8 semanas. No

sacrifício, sangue, tecido adiposo, fígado foram coletados. Foram medidos

percentual de tecido adiposo, perfil lipídico e glicêmico, e estresse oxidativo

hepático e de tecido adiposo e infiltração de macrófagos foram calculados.

Nossos resultados não mostraram nenhum efeito do chá branco em reduzir a

ingestão alimentar ou o peso dos animais. Isso foi confirmado pela similaridade

do percentual de adiposidade epididimal (visceral) e do tamanho dos adipócitos

entre os dois grupos. Da mesma forma, não foram vistas alterações no perfil de

lipoproteínas ou homeostase da glicose nos animais recebendo o chá. Por

outro lado, foi observada diminuição dos triglicerídeos séricos, com maior

excreção de lipídeos pelos animais que ingeriram o chá. Animais recebendo o

chá apresentaram também, redução do estresse oxidativo no fígado e tecido

adiposo, independente do aumento da atividade de enzimas antioxidantes. Em

conclusão, a suplementação de chá branco (0,5% na dieta) não foi capaz de

reduzir o peso corporal ou outros parâmetros ligados à obesidade, embora

XX

tenha reduzido o estresse oxidativo e os triglicerídeos séricos. Assim, os

possíveis benefícios do uso do chá podem estar restritos às complicações da

obesidade relacionadas ao estado oxidativo ou alterações dos triglicerídeos

séricos.

Palavras chave: obesidade, estresse oxidativo e chá branco, Camellia

sinensis.

XXI

ABSTRACT

Several studies suggest that green tea has beneficial effects on obesity and its

related complications, mainly due to its antioxidant effects. White tea derivated

of same plant (Camellia sinensis), has higher levels of catechins than green tea

and has been popularly used for weight loss. However, there are no scientific

studies supporting this effect. Our goal was to evaluate the effect of white tea

intake on the obesity development and its complications in obese mice. For

that, we developed a model of diet induced obesity associated to increased

oxidative stress. After 8 weeks receiving such diet, C57BL/6 mice increased

body weight, expansion of visceral fat associated to macrophages infiltration,

increased oxidative stress and worse atherogenic lipoprotein profile when

compared to mice fed chow diet. This model of diet induced obesity was used to

evaluate the effects dietary supplementation of white tea extract in the obesity

development during 8 experimental weeks. After that, mice receiving white tea

free diet or diet plus 0.5% of white tea extract were sacrificed and blood,

perigonadal fat and liver were collected. The percentage of visceral fat,

adipocyte area, macrophage infiltration on perigonadal fat as well as serum lipid

profile and glucose and oxidative stress parameters were studied. The results

did not reinforce beneficial effects of white tea in reducing food intake or body

weight. Moreover, there were no differences on the percentage of visceral fat

and on the adipocyte area between groups. Similarly, no changes were seen in

glucose homeostasis and lipoprotein profile in animals receiving white tea. On

the other hand, a decrease in serum triglycerides associated to increased

excretion of lipids was seen after white tea suplemmentation. Nonetheless,

white tea intake reduced oxidative stress in liver and adipose tissue but not in

the serum. We concluded that dietary white tea extract supplementation (0.5%)

does not influence body weight or other parameters related to obesity. The

possible beneficial effects of this tea are the reduction of oxidative stress and

serum triglycerides in obese mice. Thus, the possible benefits of using tea can

be restricted to the oxidative stress associate complications of obesity or

hytriglyceridemia.

Keywords: obesity, oxidative stress, white tea and Camellia sinensis

Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos

em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica

22

1. INTRODUÇÃO

Introdução

23

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS, 2009), sobrepeso e

obesidade são definidos como acúmulo excessivo ou anormal de gordura que

apresenta um risco para a saúde. É diagnosticada através do Índice de Massa

Corporal (IMC), que é o peso (em quilogramas) do indivíduo dividido pelo

quadrado da sua altura (em metros). Uma pessoa com um IMC de 25kg/m2 ou

mais é geralmente considerada com sobrepeso enquanto uma pessoa com um

IMC igual ou superior a 30kg/m2 é considerada obesa.

A obesidade é fator de risco para diversas doenças como diabetes

mellitus tipo 2 , hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, acidentes

vasculares cerebrais e alguns tipos de câncer (Organização Panamericana de

Saúde – OPAS- 2003).

Segundo a OPAS (2003) existem no mundo mais de um bilhão de

pessoas com excesso de peso sendo que, pelo menos 300 milhões desses são

obesos. A obesidade afeta também as crianças, sendo que existem mais de

dezessete milhões de crianças menores de cinco anos obesas.

Segundo o Ministério da Saúde, em 2008, 43,3% da população brasileira

apresentava sobrepeso e 13,0% era obesa. Em Belo Horizonte – Minas Gerais,

44% da população apresentava sobrepeso e 12,1% apresentava obesidade.

A busca por modificações dos fatores de risco predisponentes para a

obesidade é crescente, tanto pelo uso de drogas quanto por mudanças

comportamentais, estando inseridas nesse último item, as alternativas

dietéticas. Sendo assim, fatores dietéticos com alegações de influência no

curso da obesidade, como por exemplo, atuando na perda de peso ou na

diminuição do ganho de peso, atuando como antioxidantes desfavorecendo a

ação de radicais livres ou atuando no metabolismo de lipídeos e glicose para

evitar as complicações da obesidade, sem, contudo, apresentar efeitos

colaterais ao organismo são de grande importância e interesse.

O chá é uma das bebidas mais consumidas atualmente no mundo

(ALCÁZAR et al., 2007; RYU et al., 2006; CHATTOPADHYAY. P. et al., 2004;

WEISBURGER, 1997). Na China, os chás têm sido considerados medicinais

por mais de quatro mil anos (CHENG, 1998).

Introdução

24

A planta Camellia sinensis (C. sinensis) é usada como chá de diversas

maneiras, de acordo com os níveis de fermentação: branco e verde (não

fermentado), oolong (parcialmente fermentado) e preto (fermentado). O poder

antioxidante do chá é maior quanto menos fermentado ele for (CHENG, 2000).

Os chás preto, oolong e verde são feitos a partir das folhas da C.

sinensis. Já o chá branco é um chá não fermentado feito a partir de brotos

jovens da planta. O broto é protegido da luz solar durante seu crescimento para

reduzir a formação de clorofila, dando às plantas jovens uma aparência branca

(ALCÁZAR et al., 2007).

O chá branco, assim como o chá verde, é constituído por polifenóis que

englobam uma gama de substâncias com uma ou mais hidroxilas (RAHMAN,

2006). Os principais polifenóis do chá branco são as catequinas, monômeros

de flavonóides e compostos análogos como epigalocatequina galato,

epigalocatequina, epicatequina galato e epicatequina (RAHMAN, 2006;

VARILEK et al., 2001). Sato e Miyata (2000), estudando os efeitos de chás da

C. sinensis (principalmente chá verde) demonstraram sua capacidade

antioxidante, antimicrobiana, anticarcinogênica, anti-inflamatória e

imunoestimulatória.

Pouco se sabe sobre os efeitos do chá branco, uma vez que os estudos

são derivados do chá verde. Porém, por ter maior concentração de polifenóis

que o chá verde, pode-se prever que, no que diz respeito ao poder

antioxidante, o chá branco terá efeitos mais relevantes que os do chá verde.

Embora o chá branco esteja sendo utilizado popularmente como adjuvante na

perda de peso, a literatura científica é bastante escassa. Assim, neste trabalho,

nosso objetivo é avaliar as possíveis alterações da ingestão do chá branco na

obesidade e no estresse oxidativo induzido pela dieta.



25

2. OBJETIVOS

Objetivos

26

2.1. Objetivo Geral

Avaliar o efeito do chá branco (Camellia sinensis) na evolução ponderal,

síndrome metabólica e status antioxidante em camundongos C57BL/6 com

obesidade induzida por dieta hiperlipídica.

2.2. Objetivos Específicos

� Criar e validar um modelo experimental de obesidade induzida por dieta

hiperlipídica.

� Verificar se a dose oferecida do chá branco causa hepatotoxicidade aos

camundongos obesos.

� Avaliar o efeito do chá branco em camundongos obesos em relação ao

seu peso, adiposidade e eficiência alimentar.

� Verificar o efeito do chá branco no perfil lipídico (triglicerídeos, colesterol

total e em HDL e fração aterogênica) em camundongos obesos.

� Avaliar o efeito do chá branco na glicemia, através da avaliação dos

níveis de glicose de jejum, e dos testes de sensibilidade à insulina e

tolerância oral à glicose, em animais obesos.

� Verificar o efeito do chá branco no estresse oxidativo em tecido adiposo

e hepático em camundongos obesos.

� Avaliar a inflamação do tecido adiposo, através da infiltração de

macrófagos.



27

3. REVISÃO DE LITERATURA

Revisão de Literatura

28

3.1. OBESIDADE

A obesidade e o sobrepeso são definidos como acúmulo excessivo ou

anormal de gordura que apresenta um risco para a saúde. É diagnosticada

através do Índice de Massa Corporal (IMC), que é o peso (em quilogramas) do

indivíduo dividido pelo quadrado da sua altura (em metros). Uma pessoa com

um IMC de 25kg/m2 ou mais é geralmente considerada com sobrepeso. Uma

pessoa com um IMC igual ou superior a 30kg/m2 é considerada obesa (OMS,

2009).

A obesidade é uma doença multifatorial que envolve fatores genéticos,

endócrinos e comportamentais. Dentre os comportamentais destacam-se a

ingestão excessiva de dietas ricas em gorduras e açúcares e o baixo nível de

atividade física (OPAS, 2003). O aumento da ingestão energética pode ser

decorrente tanto da elevação quantitativa do consumo de alimentos como de

mudanças na dieta que se caracterizam pela ingestão de alimentos com maior

densidade energética, ou pela combinação dos dois. O processo de

industrialização dos alimentos tem sido apontado como um dos principais

responsáveis pelo crescimento energético da dieta da maioria das populações

do ocidente (MENDONÇA e ANJOS, 2004).

O consumo excessivo de ácidos graxos saturados provenientes

principalmente de carnes vermelhas e produtos derivados do leite é altamente

associado com a síndrome metabólica, (KENNEDY et al., 2009) que é um

conjunto de risco para doenças cardiovasculares, resistência insulínica (que

culmina no diabetes mellitus tipo 2), relacionado à obesidade, dislipidemias,

hipertensão (LIEN e GUYNTON, 2008). Além disso, obesidade abdominal,

acúmulo ectópico de gordura, esteatose hepática e apneia do sono são

incluídas nas complicações metabólicas da obesidade (RASSOULI e KERN,

2008).

O consumo energético excessivo leva a um aumento da síntese de

triglicerídeos (TGs) nos adipócitos e com isso ocorre uma expansão do tecido

adiposo em tamanho (hipertrofia) e, em algumas situações, em número

(hiperplasia) dos adipócitos, gerando uma disfunção nestes. Os adipócitos


29

hipertrofiados secretam agentes pró-inflamatórios que promovem uma

inflamação sistêmica. Além disso, pode ocorrer apoptose de adipócitos,

recrutando macrófagos e neutrófilos. (Figura 1) (KENNEDY et al., 2009).

Figura 1: Excesso de ingestão energética contribui pra inflamação no tecido adiposo e contribui para desenvolvimento da síndrome energética. Com o aumento de peso, ocorre hipertrofia e hiperplasia dos adipócitos. Os adipócitos hipertrofiados secretam diversas citocinas e quimiocinas (IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8) e proteínas de fase aguda como PAI-1 e CRP. Essas atuam levando ao aumento da inflamação podendo levar às complicações da obesidade como aterosclerose e resistência insulínica. A desregulação da secreção das adipocinas, característica da obesidade, também contribui para a evolução dessas complicações. Além disso, ocorre secreção de MIF e MCP-1, que atraem macrófagos e neutrófilos para o tecido adiposo, aumentando ainda mais a inflamação. PAI-1: inibidor do ativador de plasminogênio, CRP: Proteína C reativa, TNFα: fator de necrose tumoral alfa, IL: interleucina, MIF: Fator inibitório de macrófagos, MCP-1: proteína quimiotática de monócitos 1, AGL: ácidos graxos livres, RBP4: Proteína ligadora de retinol 4 (adaptado de KENNEDY et al., 2009)

Tecido adiposo e adipócito

O tecido adiposo não é composto somente por adipócitos, mas também

por uma fração estromovascular de células. Essa fração consiste de diversa

população de linfócitos, fibroblastos, células endoteliais e estromais e pré-

adipócitos que juntamente com os adipócitos servem como uma grande fonte

de citocinas e adipocinas (O’ROURKE, 2009). O tecido adiposo deve, então,

ser considerado não apenas como órgão de armazenamento de lipídeos, mas


30

também um órgão imune endócrino, enviando e respondendo sinais que

modulam o apetite, a sensibilidade à insulina, o sistema endócrino e

reprodutivo, o metabolismo ósseo, a inflamação e a imunidade (O’ROURKE,

2009; RAMALHO e GUIMARÃES, 2008).

Na fração estromovascular são produzidos fatores que contribuem para

a adesão celular e para a remodelação da matriz extracelular

(metaloproteinases e VCAM-1) e algumas citocinas (O’ROURKE, 2009).

Os adipócitos possuem propriedades inflamatórias significativas, sendo

sensíveis a sinais inflamatórios mediados por citocinas. Expressam receptores

que lhes permitem detectar a presença de patógenos e de mediadores

inflamatórios. De fato, os adipócitos reagem a diversos mediadores

inflamatórios – IL-1β, IL-4, IL-6, IL-11, IFNɣ e componentes da parede celular

de fungos. Quando ocorre a estimulação desses receptores, são ativados

inúmeros sinais de transdução da cascata inflamatória que induzem a

expressão e secreção de diversas proteínas de fase aguda e mediadores da

inflamação, incluindo TNFα (fator de necrose tumoral alfa), PAI-1 (inibidor do

ativador de plasminogênio 1), IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-15, hepatopoetina

(fator de crescimento dos hepatócitos), SAA3 (proteína soro amilóide A3), MIF

(fator inibitório de macrófagos), haptoglobina, fatores B e C3 do complemento,

prostaglandina E2, TGFβ (fator de transformação e crescimento), MCP-1

(proteína quimotática para monócitos 1), VEGF (fator de crescimento do

endotélio vascular), adipsina, apelina e visfatina, iNOS2 (óxido nítrico sintase

indutível), DIF (fator de diferenciação monócito-macrófago) e possíveis

moduladores inflamatórios como a leptina, a adiponectina e a resistina

(RAMALHO e GUIMARÃES, 2008). As citocinas, quando secretadas pelo

tecido adiposo, são conhecidas como adipocinas e estão envolvidas em

processos fisiológicos como o metabolismo lipídico, a regulação da pressão

sanguínea e a angiogênese (TRAYHURN e WOOD, 2005).

Sendo assim, o aumento do tecido adiposo na obesidade contribui

diretamente para um aumento da inflamação sistêmica (BERG e SCHERER,

2005). Vários estudos estabeleceram uma relação entre o ganho de peso e o

nível de determinadas proteínas inflamatórias (BERG e SCHERER, 2005). A

expressão, produção e liberação de citocinas – principalmente, TNFα, IL-1, IL-


31

6, PAI-1, haptoglobina e leptina, encontram-se aumentadas em indivíduos

obesos (TRAYHURN e WOOD, 2005). Algumas exceções são a adiponectina e

a IL-10 cuja produção e níveis circulantes se encontram diminuídos em

indivíduos obesos. A IL-10 aumenta a sua expressão após perda de peso e

inibe a formação de citocinas pró-inflamatórias – IL-1, IL-6 e TNFα, por parte

dos macrófagos. Contudo, a inflamação sistêmica observada na obesidade não

se deve unicamente ao tecido adiposo, mas também a outros tecidos

inflamatórios importantes como o fígado, que libera proteínas de fase aguda

como a proteína C reactiva (PCR), que é secretada em resposta à liberação de

IL-6 pelo tecido adiposo. (RAMALHO e GUIMARÃES, 2008).

O tecido adiposo produz a adiponectina, que, ao contrário da maioria

das citocinas relacionadas ao tecido adiposo, está diminuída em indivíduos

obesos. Ela é capaz de interagir com células imunes, como macrófagos, onde

suprime a produção e secreção de TNFα e IL-6 e com monócitos, aumentado

sua produção de citocinas anti-inflamatórias (GARAULET et al., 2007). Os

níveis de adiponectina relacionam-se inversamente com a diabetes mellitus tipo

2. Ela melhora a sensibilidade à insulina, oxidação da gordura muscular e

dissipação energética. (ROCHA e LIBBY, 2008; JUGE-AUBRY et al., 2005). A

ação sobre a sensibilidade à insulina da adiponectina pode envolver a ativação

da proteína quinase dependente de AMP, conhecida por regular a

concentração celular de malonil-CoA e também por regular a produção de

glicose no fígado, pela diminuição da expressão de enzimas da neoglicogênese

(BASTARD et al., 2006).

A leptina é um fator circulante produzido pelo tecido adiposo que age

central e perifericamente para regular o metabolismo geral e funções

relacionadas à inflamação. É o produto do gene ob e produzida

proporcionalmente à massa de gordura corporal e controla o apetite e gasto

energético através de vias hipotalâmicas. A leptina também modula diversas

respostas imunes e inflamatórias (JUGE-AUBRY et al., 2005); parece ser hábil

para controlar a produção de TNFα e sua ativação por macrófagos, mas os

mecanismos ainda não estão esclarecidos (BASTARD et al., 2006). O

camundongo deficiente para o gene da leptina (ob/ob) e o camundongo


32

deficiente para o receptor de leptina (db/db) desenvolvem obesidade grave

(ROCHA e LIBBY, 2008).

A resistina é produzida pelo tecido adiposo e está aumentada na

obesidade. Em camundongos, a neutralização da resistina resulta na

diminuição da glicose sanguínea, enquanto sua administração produz

resistência insulínica em condições normoglicêmicas e hiperglicêmicas

(ROCHA e LIBBY, 2008; BASTARD et al., 2006; JUGE-AUBRY et al., 2005).

A proteína ligadora de retinoide 4 (RBP4) é outro produto dos adipócitos

e o maior transportador de retinol pelo sangue. Pode contribuir para resistência

insulínica sistêmica (ROCHA e LIBBY, 2008).

O fator de necrose tumoral alfa (TNFα) está envolvido em processos

inflamatórios, doenças autoimunes, desenvolvimento de tumores e metástases,

replicação viral, choque séptico e febre. TNFα é produzido por diversos tipos de

células do sistema imune como monócitos, linfócitos T e B, células

polimorfonucleares, células tumorais, fibroblastos e células musculares lisas.

Seu envolvimento com o metabolismo do adipócito foi mostrado através da

supressão de diversos genes específicos do tecido adiposo, como a lipase

lipoproteíca, e por estimular a lipólise levando ao decréscimo de triglicerídeos

acumulados no adipócito. Seu papel no desenvolvimento da resistência

insulínica foi descoberto pela sua capacidade em regular negativamente o

transportador de glicose tipo 4 (GLUT4) no tecido adiposo (BASTARD et al.,

2006; JUGE-AUBRY et al., 2005). É um potente regulador local do tecido

adiposo, agindo tanto de forma autócrina como parácrina. Dentro do tecido

adiposo branco, tem papel pivô na produção de citocinas e adipocinas como IL-

6 e proteínas de fase aguda (TRAYHURN e WOOD, 2004).

A proteína quimiotática para monócitos (MCP-1) é usualmente

fracamente expressa, mas pode ser induzida por diversos estímulos como

TNFα. É mediadora da captação de monócitos e tem papel principal na

aterosclerose, onde atrai monócitos para as placas ateroscleróticas. Sua

expressão é aumentada em indivíduos obesos, em relação a indivíduos

normais e possui ação parácrina e autócrina nos adipócitos (JUGE-AUBRY et

al., 2005).


33

A desregulação da expressão e secreção dessas adipocinas na

obesidade contribui para a infiltração de macrófagos no tecido adiposo

(SCHENK et al., 2008; WELLEN E HOTAMISLIGIL, 2003). O aumento na

secreção de TNFα pode estimular os pré-adipócitos a produzirem MCP-1 e

então, atrair macrófagos para o tecido (WELLEN E HOTAMISLIGIL, 2003). O

aumento da infiltração de macrófagos ativa citocinas pró-inflamatórias como

TNFα e IL-6, que trabalham de forma parácrina para ativar vias inflamatórias

intracelulares nas células vizinhas e de forma endócrina para gerar uma

inflamação de baixo grau generalizada. Essa situação pode culminar na morte

dos adipócitos e em torno desses acumulam-se macrófagos, formando

estruturas tipo coroa. Além disso, ocorre alteração do perfil de adipocinas

produzidas pelo tecido adiposo, com diminuição de adiponectina e aumento de

resistina, que, juntamente com os ácidos graxos livres decorrentes do excesso

de tecido adiposo podem levar à resistência insulínica nos órgãos periféricos e

no tecido muscular (Figura 2) (SCHENK et al., 2008).

Figura 2: Infiltração de macrófagos no tecido adiposo, na obesidade. Com a expansão do tecido adiposo ocorre aumento da infiltração de macrófagos e da secreção de adipocinas inflamatórias, que, juntamente com o excesso de ácidos graxos livres podem culminar em resistência insulínica nos órgãos periféricos (Adaptado de SCHENK et al., 2008).

3.2. ESTRESSE OXIDATIVO

O termo estresse oxidativo foi primeiramente definido em 1985 e resulta

de um desequilíbrio entre produção excessiva de compostos oxidantes e


34

produção insuficiente de mecanismos de defesa antioxidante. O estresse

oxidativo pode causar dano aos tecidos e órgãos e está envolvido em grande

número de doenças humanas (BUONOCORE e GROENENDAAL, 2007;

GOETZ e LUCH, 2008).

Um aspecto particularmente destrutivo do estresse oxidativo é a

produção de espécies reativas de oxigênio (ROS - reactive oxygen species),

que incluem radicais livres e peróxidos. ROS são espécies de oxigênio que

estão em um estado mais reativo que o oxigênio molecular, ou seja, o oxigênio

pode ser reduzido em diferentes graus. A ROS primária é o superóxido (Figura

3), que é formado na primeira redução do oxigênio molecular catalisada pela

NADPH oxidase (GENESTRA, 2007).

Figura 3: Ânion superóxido e seus derivados. O ânion superóxido é formado a partir do oxigênio, pela ação da NADPH oxidase. A partir dele, outras ROS são formadas e podem atuar de diversas formas, danificando o organismo (adaptado de AFONSO et al., 2007). Para proteção contra a ação das ROS e do estresse oxidativo, um

sistema antioxidante bem organizado trabalha de forma coordenada para

resistir aos distúrbios redox. O termo antioxidante é amplamente definido como

qualquer substância que retarda ou evita a oxidação de um substrato. Quando

este é suficiente para evitar ou balancear o ataque das ROS, o organismo evita

o estresse oxidativo (Figura 4) (MONAGHAN et al., 2009; POWERS e

JACKSON, 2008).


35

Figura 4: Relações entre espécies reativas de oxigênio (ROS), defesa antioxidante (AO) (incluindo reparação) e estresse oxidativo. (a) Na condição basal homeostática, os níveis de ROS e antioxidantes (AO) são baixos, com defesas suficientes para equilibrar a produção de ROS para que não haja estresse oxidativo. (b) Um aumento na produção ROS pode inicialmente exceder a capacidade do sistema antioxidante, levando a um período de estresse oxidativo. (c) Se o aumento de ROS é pequeno, pode ser compensado pelo aumento da utilização de antioxidantes, impedindo ainda mais o estresse oxidativo. Se a elevação de ROS é apenas temporária, haverá, então, um retorno à posição homeostática. (d) A exposição mais prolongada elevação de ROS pode induzir o organismo permanentemente para aumentar seus níveis basais antioxidante, tornando-a mais apta a lidar com eventos futuros oxidativo. (Adaptado de MONAGHAN et al., 2009). Espécies Reativas de Oxigênio

O radical ânion superóxido (O2-) é produzido em sistemas biológicos

através de uma redução de oxigênio catalisada enzimaticamente. Essa reação

ocorre geralmente nas membranas mitocondriais. É formado principalmente

como um intermediário nas reações bioquímicas. Uma vez gerado, o O2- pode

agir com um radical livre fraco, como elétron redutor ou como elétron oxidante.

Possui uma longa meia-vida que permite a difusão dentro da célula e,

consequentemente, o aumento do número dos alvos potenciais. Como espécie

redox ativo, superóxido pode reduzir alguns materiais biológicos, por exemplo,


36

citocromo c, e oxidar outros, tais como ascorbato (GOETZ e LUCH, 2008;

POWERS e JACKSON, 2008).

O peróxido de hidrogênio (H2O2) é um composto reativo que pode

facilmente gerar radicais livres como o radical hidroxil (OH-) em circunstâncias

específicas. Pode ser gerado a partir da ação de uma enzima antioxidante, a

superóxido dismutase (SOD). O peróxido de hidrogênio é estável, permeável

às membranas, e tem uma meia-vida relativamente longa no interior da célula.

É citotóxico, mas é considerado um agente oxidante relativamente fraco

(GOETZ e LUCH, 2008; POWERS e JACKSON, 2008). Já os radicais hidroxil

(OH-) são altamente reativos com forte poder oxidante. Resultam da

transferência de elétrons entre peróxido de hidrogênio e metais de transição.

São as ROS mais prejudiciais, visto que interagem com biomoléculas

imediatamente após sua geração. Pressupõe-se que o radical OH- contribua

para várias doenças e fenômenos biológicos como câncer, envelhecimento,

diabetes mellitus tipo 2 , fagocitose e síndrome de isquemia e reperfusão

(GOETZ e LUCH, 2008; POWERS e JACKSON, 2008).

O oxigênio singlet é outra forma reativa de oxigênio que pode ser gerado

em alguns materiais biológicos. Tem meia vida muito curta, mas é capaz de

difusão e é permeável às membranas. É produzido durante a contração

esquelética muscular, durante o exercício (POWERS e JACKSON, 2008).

O óxido nítrico (NO-) é sintetizado a partir de aminoácidos, como a

arginina, por muitos tipos celulares. A síntese ocorre através da óxido nítrico

sintase (NOS), a qual ocorre em três tipos principais: NOS endotelial (eNOS),

NOS neuronal (nNOS) e NOS induzível (iNOS). É um agente redutor fraco,

reage com o oxigênio e com o superóxido, produzindo peroxinitrito (ONOO-)

(GOETZ e LUCH, 2008; POWERS e JACKSON, 2008). Esse ou sua forma

protonada (ONOOH) é um forte oxidante e pode levar ao esgotamento de

grupos tiol, danos ao DNA e nitração de proteínas. É classificado como

espécies reativas ao nitrogênio, que inclui também o óxido nítrico (GOETZ e

LUCH, 2008; POWERS e JACKSON, 2008).

O hiperclorito (HOCl) é formado pela ação da mieloperoxidase utilizando

o peróxido de nitrogênio. É predominantemente formado por neutrófilos e pode,


37

na sua forma ácida (ácido hipocloroso), atravessar membranas celulares e

causar fragmentação e agregação de proteínas (POWERS e JACKSON, 2008).

Danos das ROS ao organismo

As ROS podem causar danos a biomoléculas e ter efeitos sobre a

sinalização celular (GOETZ e LUCH, 2008). Podem causar oxidação de

proteínas e aminoácidos, por inibição de enzimas. Podem induzir mudanças

conformacionais que levam ao aumento da hidrofobicidade e subsequente

desnaturação, agregação e precipitação. Eventualmente, este processo

contribui para a inflamação tecidual e morte celular (GOETZ e LUCH, 2008)

As espécies reativas de oxigênio também podem causar peroxidação

lipídica. A natureza da lesão celular depende do sítio de ação das ROS. Danos

da membrana desencadeiam início da morte celular. Esses danos podem ser

diretos, através da oxidação de ácidos graxos poli-insaturados presentes em

lipídeos, ou indiretamente através da inibição da síntese de lipídeos ou

ativação de lipases (GOETZ e LUCH, 2008).

Danos ao DNA também ocorrem por ação das espécies reativas de

oxigênio. Em condições fisiológicas regulares, o balanço global da quantidade

de dano oxidativo ao DNA foi estimado em 1 por 130.000 modificações de

nucleotídios no DNA. Os danos ao DNA são causados principalmente por

radicais hidroxilas. Ao longo dos últimos anos tornou-se claro que fatores

exógenos como radiação, produtos químicos, dieta com alta ingestão calórica,

altas taxas metabólicas e doenças inflamatórias afetam os níveis de danos

oxidativos ao DNA (GOETZ e LUCH, 2008).

Sistema antioxidante

O organismo contém antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos que

atuam como uma unidade complexa de regulação de ROS (POWERS e

JACKSON, 2008).


38

A superóxido dismutase (SOD) foi descoberta em 1969 e constitui a

primeira linha de defesa contra os radicais superóxido, transformando-os em

peróxido de hidrogênio e oxigênio (POWERS e JACKSON, 2008).

2O2- + 2H+ ------→ H2O2 + O2

SOD

Existem três isoformas nos mamíferos e todas exigem um metal de

transição (cobre, zinco ou manganês) no sítio ativo para realizar sua ação. A

SOD1 requer cobre e é localizada no citosol e no espaço transmembrana

mitocondrial (POWERS e JACKSON, 2008). Em camundongos, a expressão

aumentada da SOD1 é associada à proteção contra danos cerebrais

decorrentes de isquemia ou doença de Parkinson e sua mutação é associada

com o aumento da apoptose e do dano oxidativo protéico. A SOD1 apresenta

papel central na sobrevivência e crescimento celular (AFONSO et al., 2007). A

SOD2 requer o manganês como cofator e é localizada na matriz da mitocôndria

(POWERS e JACKSON, 2008). Animais nocaute para a SOD2 apresentam

cardiomiopatia letal e neurodegenaração (AFONSO et al., 2007). Já a SOD3

requer cobre e zinco como cofatores e está localizada no espaço extracelular

(POWERS e JACKSON, 2008). Mutações no gene da SOD3 levam a aumento

do risco de doenças cardiovasculares (AFONSO et al., 2007).

A catalase atua em várias funções bioquímicas, mas seu principal

objetivo é catalisar a reação de transformação do peróxido de hidrogênio em

água e oxigênio (POWERS e JACKSON, 2008).

2H2O2 ---------------→ 2H2O + O2

Catalase

Precisa que o ferro aja como cofator em seu sítio ativo (POWERS e

JACKSON, 2008). É encontrada nos peroxissomos celulares e no citosol. Essa

enzima também apresenta atividade de peroxidase e reage com peróxidos

orgânicos. A catalase é muito eficaz em altos níveis de estresse oxidativo e

protege a célula do peróxido de hidrogênio intracelular. É especialmente

importante em casos de conteúdo limitado de glutationa ou atividade de


39

glutationa peroxidase reduzida e tem um papel significativo no desenvolvimento

da tolerância ao estresse oxidativo na resposta adaptativa das células

(WASSMANN et al., 2004).

A glutationa peroxidase (GPX) catalisa a redução de peróxidos de

hidrogênio ou hidroperóxidos orgânicos para água e álcool. Existem 5

isoformas nos mamíferos e é um importante oxidante intracelular para proteger

danos à membrana de lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos (POWERS e

JACKSON, 2008).

Além dessas enzimas, existem numerosos antioxidantes não

enzimáticos nas células como o ácido úrico, bilirrubina, vitamina C e vitamina E

(POWERS e JACKSON, 2008).

3.3. OBESIDADE E ESTRESSE OXIDATIVO

Com o aumento da obesidade ocorre aumento do estresse oxidativo

(YAMATO et al., 2007; FURUKAWA et al., 2004). Tem sido proposto que a

hiperglicemia, a disfunção mitocondrial e a desregulação de enzimas do

sistema redox estão envolvidas na produção celular de ROS na obesidade

(PARK et al., 2007). A hiperglicemia promove geração de ânion superóxido

através da via do poliol, da via da hexosamina, da via da proteína kinase C

(PKC) e da geração de produtos avançados de glicação (AGE - advanced

glycation end-product), resultando em estresse oxidativo (GRATTAGLIANO et

al., 2008; BROWNLEE, 2001).

A disfunção mitocondrial está relacionada a desordens relacionadas a

estresse oxidativo como complicações vasculares, diabetes mellitus tipo 2 ,

doenças neurodegenerativas e senescência celular (HUANG e MANTON,

2004). As enzimas óxido nítrico sintase e NADPH oxidase, que estão

envolvidas na produção de espécies reativas de oxigênio, estão

significativamente aumentadas em indivíduos obesos, o que também poderia

explicar o estresse oxidativo aumentado na obesidade (PARK et al., 2007).

O acúmulo de gordura visceral, devido à alta ingestão de açúcares e

gorduras, causa desregulação das funções do adipócito, incluindo secreção de

adipocinas e citocinas inflamatórias (Figura 5). A secreção desregulada de


40

adipocinas leva ao aumento da transcrição de genes inflamatórios, ativa as

oxidases dependentes de NADPH (Nox), e potencializa a resistência insulínica.

A resistência insulínica, juntamente com o acúmulo de gordura no fígado

(esteatose hepática), causa um desarranjo das funções das organelas sub-

celulares, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio e

nitrogênio que leva, então, a alterações metabólicas como peroxidação lipídica,

LDL oxidada, diminuição de óxido nítrico, e pode culminar em doenças

cardiovasculares, como a aterosclerose, além de diabetes mellitus tipo 2 e

síndrome metabólica (GRATTAGLIANO et al., 2008).

Figura 5: Aumento da geração de ROS e consequente estresse oxidativo na obesidade. O acúmulo de gordura visceral, devido à alta ingestão de açúcares e gorduras, causa desregulação das funções do adipócito. A secreção desregulada de adipocinas ativa as oxidases dependentes de NADPH (Nox), e potencializa a resistência insulínica. A resistência insulínica, juntamente com a esteatose hepática, causa um desarranjo das funções das organelas subcelulares, aumentando a produção de ROS que leva, então, a alterações metabólicas como peroxidação lipídica, LDL oxidada, diminuição de óxido nítrico (adaptado de GRATTAGLIANO et al., 2008).

Intervenções que diminuam o estresse oxidativo e a obesidade têm de

ser levadas em conta para diminuição das complicações relacionadas às

mesmas. Entre essas intervenções incluem-se dieta, exercícios físicos,


41

suplementação nutrição nutricional, agentes farmacológicos e cirurgia bariátrica

(VICENT et al., 2007). A suplementação nutricional é bem vinda por não ter

efeitos colaterais ao paciente.

3.4. COMPLICAÇÕES DA OBESIDADE

Como descrito acima, a obesidade é acompanhada de um estado

inflamatório de baixo grau e de um aumento o estresse oxidativo. O aumento

do estresse oxidativo, juntamente com a inflamação, aumenta o risco para

complicações na obesidade, como as doenças cardiovasculares, a resistência

insulínica e o diabetes mellitus tipo 2 (FURUKAWA et al., 2004) (Figura 6).

Figura 6: Aumento de ROS na obesidade pode contribuir para síndrome metabólica. Durante a obesidade ocorre aumento da enzima oxidante NADPH oxidase e diminuição do sistema antioxidante, levando ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O aumento das ROS gera estresse oxidativo no tecido adiposo e nos tecidos periféricos. No tecido adiposo, ocorre desregulação das adipocinas. Essas alterações aumentam o risco para resistência insulínica, diabetes e aterosclerose, culminando na síndrome metabólica. PAI-1: inibidor do ativador do plasminogênio 1; TNFα: fator de necrose tumoral alfa; MCP-1: fator quimiotático para monócitos (adaptado de FURUKAWA et al., 2004).


42

Desregulação do metabolismo de lipídeos e doenças cardiovasculares

Colesterol e triglicerídeos (TG) são ambos essenciais para a integridade

e estrutura da membrana, mas também podem servir como uma fonte de

energia, ou como moléculas sinalizadoras. Devido à sua insolubilidade em

água, o colesterol e os TGs precisam de partículas solúveis em água para fazer

o seu transporte, tal como as lipoproteínas (FRANSSEN et al., 2008).

As lipoproteínas diferem em tamanho e composição. Os quilomícrons

são as lipoproteínas de menor densidade e maior tamanho. As lipoproteínas de

densidade muito baixa (VLDL), intermediária (IDL), e a lipoproteínas de

densidade baixa (LDL) são sucessivamente mais densas, com maiores

proporções de proteínas do que lipídeos. As lipoproteínas de densidade alta

(HDL) são as partículas mais densas e estão envolvidas no transporte reverso

do colesterol (CHAMPE et al., 2007). As lipoproteínas são compostas de

diferentes tipos de lipídeos e de apoproteínas (apo), que são um grupo de

proteínas que possuem diversas funções tais como proporcionar locais para o

reconhecimento de receptores da superfície celular, e servindo como

ativadores ou coenzimas para as enzimas envolvidas no metabolismo das

lipoproteínas. Algumas das apolipoproteínas são exigidas como componentes

estruturais essenciais das partículas e não podem ser removidas enquanto

outras são transferidas livremente entre lipoproteínas. Apolipoproteínas estão

divididas por função e estrutura em cinco grandes categorias, de A a E

(CHAMPE et al., 2007).

Lipoproteínas ricas em TGs são secretadas na circulação pelo sistema

digestivo, como quilomícrons, ou pelo fígado, como VLDL (Figura 7)

(FRANSSEN et al., 2008). Após uma refeição, TGs dietéticos digeridos e

absorvidos pelo intestino são transportados para a circulação como

quilomícrons. Estas partículas transportam os TGs para os tecidos-alvo, tecido

adiposo e muscular, onde podem ser hidrolisados pela enzima lipase

lipoprotéica (LPL) localizada na superfície endotelial. Depois da hidrólise dos

TGs, ácidos graxos livres (AGL) são formados e podem ser levados para o

tecido adiposo para armazenamento energético ou para músculo esquelético

para utilização como fonte de energia. (FRANSSEN et al., 2008; MERKEL et


43

al., 2006). O fígado também é capaz de produzir TGs a partir de ácidos graxos

e glicerol, sob a influência da insulina. Estes TGs são, então, secretados no

sangue como VLDL. Os ácidos graxos utilizados pelo fígado para formação de

TG são derivados do plasma ou recém-formado no fígado, onde a glicose pode

servir como substrato para a sua síntese. A captação de ácidos graxos

plasmáticos pelo fígado a partir do plasma é impulsionada pelos níveis

plasmáticos de ácidos graxos livres (AGL). Se o fígado estiver captando mais

ácidos graxos do que pode utilizar na formação de VLDL, esses ácidos graxos

excedentes são armazenados no fígado sob forma de gotículas gordurosas. A

insulina também atua no fígado sobre a SREBP-1, uma proteína localizada na

membrana celular de hepatócitos e ativa transcricionalmente genes envolvidos

na lipogênese de novo (FRANSSEN et al., 2008; HORTON et al., 2002).

Figura 7: Representação esquemática do metabolismo de lipídeos. Após uma refeição, TGs dietéticos são transportados para a circulação como quilomícrons. Estas partículas transportam os TGs para os tecidos-alvo onde podem ser hidrolisados pela enzima lipase lipoprotéica (LPL). Depois da hidrólise dos TGs, ácidos graxos livres (AGL) são formados, e podem ser levados para o tecido adiposo para armazenamento energético ou para músculo esquelético para utilização como fonte de energia. O fígado também é capaz de produzir TGs a partir de ácidos graxos e glicerol, que são, então, secretados no sangue como VLDL. Os ácidos graxos utilizados pelo fígado para formação de TG são derivados do plasma ou recém-formado no fígado por um processo chamado lipogênese de novo. Na lipogênese de novo, a glicose serve como um substrato para síntese de ácidos graxos. A insulina também atua no fígado sobre a SREBP-1, que ativa transcricionalmente genes envolvidos na lipogênese de novo AG: ácidos graxos; LPL: lipoproteína lípase; NEFA: ácidos graxos não esterificados; SREBP-1: proteína ligadora do elemento de regulação do esterol (adaptado de FRANSSEN et al., 2008)


44

A dislipidemia associada à obesidade aumenta o risco para doenças

cardiovasculares e é caracterizada por hipertrigliceridemia, diminuição de

colesterol em HDL (HDLc) e transformação da LDL em um composto mais

aterogênico, a LDL pequena e densa, amplamente envolvida na aterosclerose

(FRANSSEN et al., 2008). Tanto a hipertrigliceridemia como baixo HDL

colesterol são critérios de diagnóstico para a síndrome metabólica (GRUNDY et

al., 2005). O efeito ateroprotetor da HDL é relacionado com o transporte

reverso de colesterol, resultando no transporte de colesterol dos tecidos

periféricos para o fígado (FRANSSEN et al., 2008). O aumento da secreção e

diminuição do clearence de VLDL levando à hipertrigliceridemia contribui para a

diminuição dos níveis de HDL em indivíduos obesos. Além disso, o aumento da

atividade da proteína de transferência de ésteres de colesterol (CETP),

aumentada em indivíduos obesos, também contribui para diminuição da HDLc

por facilitar a transferência de ésteres de colesterol da HDL para lipoproteínas

ricas em TGs e por criar HDL ricas em TGs que são substratos melhores para

o clearence no fígado (FRANSSEN et al., 2008).

Essa desregulação do metabolismo lipídico em indivíduos obesos,

juntamente com o aumento do estresse oxidativo e da inflamação, leva ao

desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como a aterosclerose

(FURUKAWA et al., 2004; STEFFENS e MACH, 2004). Na aterosclerose, altas

concentrações plasmáticas de LDL podem levar à ativação das células

endoteliais. As LDL são também minimamente oxidadas em seus fosfolípides

devido à ação de ROS e do aumento do estresse oxidativo (STEFFENS e

MACH, 2004). A LDL oxidada (LDLox) induz à expressão da proteína

quimiotática para monócitos (MCP-1) pelas células endoteliais e macrófagos, e

do fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF) pelas células

endoteliais; além de aumentar a expressão de moléculas de adesão as células

endoteliais. Os monócitos são recrutados para a lesão, onde se diferenciam em

macrófagos, dando origem às células espumosas e levando à formação das

placas ateroscleróticas (VORA et al., 1997, WANG et al., 1997). O aumento do

estresse oxidativo decorrente da obesidade induz a formação de LDLox

(VOGIATZI et al., 2009; PAOLETTI et al., 2006). O aumento da expressão e

secreção de adipocinas pró-inflamatórias, como TNFα e MCP-1, também


45

contribuem para o desenvolvimento das placas ateroscleróticas. A

desregulação do metabolismo lipídico em obesos é semelhante ao encontrado

em indivíduos com resistência insulínica ou diabetes mellitus tipo 2. De fato, a

resistência insulínica geralmente precede o quadro de dislipidemia em

indivíduos obesos (FRANSSEN et al., 2008).

Resistência insulínica e diabetes mellitus tipo 2

A obesidade é fator de risco para o desenvolvimento de resistência

insulínica e diabetes mellitus tipo 2 (FURUKAWA et al., 2004). A resistência

insulínica é caracterizada por um dano na habilidade da insulina em inibir a

produção de glicose pelo fígado e promover sua captação pelo tecido adiposo

e muscular. Por isso, a resistência insulínica é fator chave para o

desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (QATANANI e LAZAR, 2007). O

aumento da glicose sanguínea também é critério de diagnóstico para a

síndrome metabólica (GRUNDY et al., 2005).

O aumento do infiltrado de macrófagos, juntamente com a expansão do

tecido adiposo ocasiona secreção desregulada das citocinas e adipocinas,

favorecendo o quadro inflamatório. (GALIC et al., 2009). A diminuição da

adiponectina decorrente da obesidade leva à diminuição da sensibilidade à

insulina, aumento do influxo de ácidos graxos, diminuição da oxidação de

ácidos graxos, e redução da captação de glicose hepática, enquanto o

aumento da resistina leva a resistência insulínica por diminuir a expressão de

enzimas gliconeogênicas no fígado. O aumento de citocinas inflamatórias,

como a IL-6 também é associado com resistência insulínica e intolerância à

glicose. O TNFα ativa serina quinases como JNK (jun quinase) e MAPK

(Proteínas quinases ativadas por mitógenos), aumenta a fosforilação dos

receptores de substrato da insulina (IRS1 e 2), tornando-os substratos pobres

para a ativação do receptor de insulina-quinases e aumentando a sua

degradação. A JNK, juntamente com a proteína quinase C (PKC), também

pode ser ativadas pelos ácidos graxos livres e seus metabólitos, como acil-CoA

e diacilglicerol, que servem como moléculas sinalizadoras para essa ativação e

estão aumentadas na obesidade. O aumento dos ácidos graxos livres também


46

está relacionado com o aumento da produção de ROS devido ao aumento da

βoxidação. O aumento do estresse oxidativo pode levar ao aumento da

resistência insulínica também por ativação da JNK ou de forma indireta através

de uma série de eventos transcricionais mediados por NFκB (QATANANI e

LAZAR, 2007).

Além disso, a obesidade leva ao acúmulo ectópico de gordura em

músculos e órgãos e isso está relacionado à resistência insulínica

possivelmente devido ao turnover de triglicerídeos e à produção de moléculas

sinalizadoras derivadas de ácidos graxos ou a ativação de vias intracelulares

deletérias, como as espécies reativas de oxigênio, estresse mitocondrial ou

disfunção do retículo endoplasmático (QATANANI e LAZAR, 2007).

Figura 8: Mudanças na secreção de adipocinas decorrentes da obesidade e desenvolvimento da resistência insulínica. A expansão do tecido adiposo na obesidade gera aumento na infiltração de macrófagos e na inflamação com aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias como TNFα e IL-6. Isso é acompanhado do aumento da liberação de ácidos graxos livres e da desregulação da secreção de leptina, adiponectina, resistina e proteína ligadora de retinol 4. Juntas, essas substâncias derivadas de macrófagos e adipócitos podem atuar de forma parácrina e autócrina de forma a exacebar a inflamação no tecido adiposo. Em nível sistêmico, a alteração da secreção de adipocinas pode levar ao aumento da ingestão alimentar e redução do gasto energético através de ações hipotalâmicas e diminuir a sensibilidade à insulina no músculo e no fígado através do acúmulo ectópico de lipídeos e inflamação. TNFα: Fator de necrose tumoral alfa; IL-6: Interleucina 6 (adaptado de GALIC et al., 2009).


47

Dessa forma, estando o aumento do estresse oxidativo relacionado à

obesidade e às suas complicações, a busca por intervenções nutricionais com

ação antioxidante se torna de grande interesse.

3.5. CHÁ BRANCO E OUTROS CHÁS DERIVADOS DA PLANTA Camellia

sinensis

O chá é uma das bebidas mais consumidas atualmente no mundo

(ALCÁZAR et al., 2007; RYU et al., 2006; CHATTOPADHYAY, et al., 2004;

WEISBURGER, 1997). No Brasil, o consumo de chá é de, aproximadamente,

0,48kg por indivíduo por ano, o que é equivalente a 1,33g por indivíduo por dia

(IBGE, 2004). Na China, os chás têm sido considerados medicinais por mais de

quatro mil anos (CHENG, 1998). Acredita-se que os polifenóis presentes nos

chás sejam os responsáveis por seus efeitos benéficos (RAHMAN et al., 2006;

HIGDON e FREI, 2003). A planta Camellia sinensis (Figura 9) é consumida na

forma de chá e é rica em catequinas (WALTNER-LAW et al., 2002).

Figura 9: Planta Camellia sinensis Fonte: www.henriettesherbal.com

O diferente processamento da C. sinensis leva aos diversos tipos de

chás produzidos a partir da planta e aos diferentes constituintes flavonóides

dos mesmos. Enzimas polifenoloxidases e catequinas existem em diferentes


48

camadas na folha da C. sinensis. O processo de fermentação rompe as

camadas permitindo que ocorra oxidação enzimática das catequinas. (HIGDON

e FREI, 2003). As folhas da C. sinensis podem dar origem aos chás preto,

oolong e verde, enquanto seus brotos podem dar origem ao chá branco

(ALCÁZAR et al., 2007; HIGDON e FREI, 2003). Para fabricação do chá preto,

as folhas são enroladas e totalmente oxidadas, levando a formação de

teaflavinas e tearubinas. Para o chá oolong, o tempo de oxidação é menor,

sendo o chá parcialmente fermentado, e mantendo maior quantidade de

catequinas que o chá preto. O chá verde é produzido a partir da folha de C.

sinensis não fermentada, sendo que elas são estufadas para inativar a

polifenoloxidase e preservar suas catequinas (HIGDON e FREI, 2003; CHENG,

2000). Já o chá branco é também um chá não fermentado, feito a partir de

brotos jovens da C. sinensis. O broto pode ser protegido da luz solar durante

seu crescimento para reduzir a formação de clorofila, dando às plantas jovens

uma aparência branca e conservando ainda mais as catequinas (ALCÁZAR et

al., 2007). O poder antioxidante do chá é maior quanto menos fermentado ele

for, visto que terá maior teor de catequinas (CHENG, 2000).

Têm sido demonstrados diversos efeitos benéficos do chá verde para a

saúde como fornecedor da proteção antitumorigênica (MUKHTAR AND

AHMAD, 2000; YANG et al., 2002), antioxidante (KHAN et al., 2007),

hipocolesterolêmico (YANG e KOO, 2000), prevenção de desenvolvimento de

placas ateroscleróticas (CHYU et al., 2004). Demonstrou-se que o chá verde

também tem efeitos antidiabéticos em modelos animais de resistência

insulínica (WU et al., 2004) e promotor do aumento do gasto energético

(DULLOO et al., 1999) e perda de peso (NAGAO et al., 2007). Ainda apresenta

efeitos antibacteriano (STAPLETON et al., 2004), anti-HIV (NANCE e

SHEARER, 2003), antienvelhecimento (ESPOSITO et al., 2002) e anti-

inflamatório (DONA et al., 2003).

O chá branco

O chá branco tem sido utilizado popularmente para diminuição do LDLc,

levando a diminuição do risco de doenças cardiovasculares, para diminuição


49

dos sintomas do diabetes mellitus tipo 2 , para retardar o envelhecimento, pela

sua ação antioxidante e principalmente, para perda de peso. Porém, os

estudos com essa substância ainda são recentes e não há muitos trabalhos

publicados indicados no PUBMED (Quadro 1). A maioria dos estudos feitos

com chá branco pesquisaram sua composição (MALINOWSKA et al., 2008;

ALCÁZAR et al., 2007; FERRARA et al., 2001), sua ação antitumorigênica

(WANG et al., 2008; ANGER et al., 2005; ORNER et al., 2003; ORNER et al.,

2002; DASHWOOD et al., 2002; SANTANA-RIOS et al., 2001) ou sua ação

antioxidante (SEERAM et al., 2008; KOUTELIDAKIS et al., 2008; CALZUOLA

et al., 2006).

Em relação a sua composição, foi observado que os chás possuem

diferentes composições de minerais de acordo com seu processamento

(FERRARA et al., 2001). MALINOWSKA e col. (2008) em seu estudo

verificaram que a quantidade de fluoreto é menor no chá branco quando

comparado com o chá preto, devido à sua fermentação. ALCÁZAR e col.

(2007) viram que os aminoácidos que mais se diferenciaram entre os chás

eram glutamato, asparagina, serina, alanina, leucina e isoleucina, sendo que o

chá branco apresentou maior quantidade de asparagina e tanino.

Nos trabalhos sobre a ação antitumorigênica do chá branco, SANTANA-

RIOS e col. (2001) observaram que o chá branco apresentou ação

antimutagênica significativamente maior que o chá verde, sendo que os dois

inibem a atividade do receptor βcatenina/TCF4 em células HEK293 devido à

diminuição da expressão da βcatenina (DASHWOOD et al., 2002). O chá

branco diminuiu a formação de tumores intestinais também pela regulação

negativa da βcatenina (ORNER et al., 2003; ORNER et al., 2002). O chá

branco também foi capaz de inibir a via receptor hidrocarbono aril-citocromo

P450, sendo esse outro mecanismo de ação antitumorigênica do chá branco

(ANGER et al., 2005). Wang e col. (2008) demonstraram que o chá branco foi

capaz de diminuir a incidência de câncer de cólon.

A ação antioxidante do chá branco foi demonstrada em um estudo in

vitro onde o chá apresentou uma forte atividade de neutralização do radical

superóxido e alto poder redutor (CALZUOLA et al., 2006). Em um estudo in

vivo, o chá branco aumentou a capacidade antioxidante do soro e do coração


50

de camundongos (KOUTELIDAKIS et al., 2008). Em outro estudo onde foi

comparado o poder antioxidante de diversas bebidas consumidas nos Estados

Unidos, o chá branco apresentou importantes efeitos antioxidantes, com

valores maiores que de sucos de laranja e maçã e chás preto e verde

(SEERAM et al., 2008).

Apenas um estudo recente foi endereçado à ação do chá branco em

aspectos relacionados aos adipócitos (SÖHLE et al., 2009). Nesse estudo

SÖHLE e col. (2009) utilizaram culturas de adipócitos e pré-adipócitos

humanos e verificaram que o chá branco foi capaz de diminuir a incorporação

de triglicerídeos durante a adipogênese de forma dose dependente, sem afetar

a viabilidade da célula. Além disso, o chá branco diminuiu a expressão mRNA

de fatores também relacionados à adipogênese (PPARγ, ADD1/SREBP-1c,

C/EBPαand C/EBPδ) e aumentou a atividade lipolítica dos adipócitos.

Porém, ao nosso conhecimento, não há estudos in vivo relacionando o

chá branco com a obesidade e suas complicações.

Quadro 1: Estudos com o chá branco

Assunto Desenho experimental

Resultados e Conclusões

Referência

Distribuição de minerais e flavonóides

Verificação da distribuição de

minerais e flavonóides nos chás verde,

branco e preto, por HPLC.

Os chás possuem diferentes

composições de minerais e

flavonóides de acordo com seu processamento.

FERRARA et al., 2001

Atividade antimutagênica

A atividade antimutagênica dos chás verde e branco foram testados em

Salmonella typhimurium estirpe

TA98

Chá branco mostrou uma

atividade antimutagênica

significativamente mais potente que o

chá verde.

SANTANA-RIOS et al.,

2001


51

Quadro 1: Estudos com o chá branco (continuação)



Referência

Ação antitumorigênica

Células embrionárias de rins humanos

(HEK293) transfectadas com o

receptor βcatenina/TCF4 (a

inibição de tumores no intestino é relacionada

com a regulação negativa da expressão

de βcatenina) foram testadas sob a ação

dos chás verde e branco.

Os chás branco e verde inibem a

atividade do receptor

βcatenina/TCF4 em células HEK293

devido à diminuição da expressão da βcatenina.

DASHWOOD et al.,

2002

Ação antitumorigêrica

Verificação da ação do chá branco combinado com “sulindac” (agente anti-inflamatório) em

modelos animais com tumorigênese

intestinais.

O chá branco diminuiu a

formação de tumores intestinais

e a ação foi potencializada pelo

“sulindac”.

ORNER et al., 2002


Verificação da eficiência

antitumorigênica dos chás verde e branco (combinado ou não com “sulindac”, um

agente anti-inflamatório) em camundongos

C57BL/6J-ApcMin/+, que produzem

tumorigênese intestinal

Os chás branco e verde diminuíram a

formação de tumores intestinais

e a ação foi potencializada pelo

“sulindac”, pela regulação negativa

da βcatenina.

ORNER et al., 2003


52




Referência


Quantificação da atividade da via

hidrocarbono aril - citocromo P450 (via hábil a transformar

substâncias inócuas em sua forma mutagênica e

tumorigênica) em microssomos do fígado de ratos adicionados

de chá branco, verde e preto.

Os chás branco, preto e verde

foram capazes de inibir a via receptor hidrocarbono aril - citocromo P450, sendo esse um

possível mecanismo de

ação antitumorigênica.

ANGER et al., 2005

Atividade antioxidante

Chá branco e outras substâncias foram testados quanto ao

seu poder antioxidante através de análises de cinética da atividade

de varredura do radical superóxido, poder

redutor total.

O chá branco mostrou uma forte

atividade de limpeza do radical superóxido e alto

poder redutor, mostrando sua

possível atividade antioxidante.

CALZUOLA et al., 2006

Conteúdo de aminoácido

Diferenciação dos chás branco, verde,

oolong, preto e pu-erh quanto ao conteúdo de

aminoácidos por cromatografia líquida.

Os aminoácidos que mais se

diferenciaram entre os chás foram

glutamato, asparagina, serina, alanina, leucina e isoleucina. O chá

branco apresentou maior quantidade

de tanina e asparagina.

ALCÁZAR et al., 2007


53




Referência


Um teste de carcinogenicidade

conduzido durante 1 ano em ratos,

induzidos por 2-amino-1-metil-6-

fenilmidazol[4,5-b]piridina (PhIP)/dieta hiperlípidica, ofertando

chá branco (2%p/v) como única fonte de

líquido.

O chá branco não foi capaz de reduzir os tumores na pele, intestino, glândulas

salivares e pâncreas, porém

diminuiu a incidência de

câncer de cólon.

WANG et al., 2008

Capacidade antioxidante

Cinco camundongos receberam chá branco, por gavagem (0,1mL a 8g/mL) durante cinco

dias. Foi medida a capacidade

antioxidante do soro e de homogenatos de

órgãos.

O chá branco aumentou a capacidade

antioxidante do soro e do coração, mas não teve efeito

nos rins, pulmão, fígado, cérebro e

baço.

KOUTELIDAKIS et al.,

2008


Diversas bebidas comuns nos EUA,

inclusive o chá branco gelado (preparação comercial pronta), foram comparadas

quanto ao seu poder antioxidante (Trolox

equivalente antioxidante (TEAC),

capacidade de absorbância dos

radicais de oxigênio totais (ORAC), capacidade de

sequestro de radicais livres (DPPH) e poder

antioxidante da redução férrica (FRAP)

e funcionalidade antioxidante (inibição da oxidação de LDL).

O chá branco gelado comercial apresentou boa

capacidade antioxidante,

apesar de apresentar valores

menores que vinhos tintos, sucos

de uva, mirtilo, cereja e açaí.

Porém apresentou melhores valores

em relação à sucos de laranja e maçã e

a outros chás gelados, como o

chá verde e preto. Os resultados para

inibição da oxidação da LDL

foram semelhantes.

SEERAM et al., 2008


54




Referência

Dosagem de fluoreto

Fluoreto foi dosado nos chás branco,

verde, oolong, preto e pu-erh.

O chá branco apresentou menor

dosagem de fluoreto e o chá preto a maior,

sendo o chá branco o mais indicado

visto que o excesso de fluoreto pode causar fluorose

esquelética.

MALINOWSKA et al.,

2008

Proteção contra luz ultravioleta.

Pele de voluntários irradiada com luz

ultravioleta foi tratada com chás verde ou

branco.

A aplicação tópica de chá verde ou branco ofereceu proteção contra

efeitos prejudiciais da luz ultravioleta. Assim, tanto o chá verde como o chá branco podem ser

usados em conjugados com

métodos de proteção solar.

CAMOUSE et al., 2009


55




Referência

Atividade lipolítica e indução de

adipogênese

Utilizando cultura de adipócitos e pré-

adipócitos humanos foi investigado a ação do

chá branco sobre a inibição da

incorporação de triglicerídeos durante a

adipogênese, a atividade lipolítica, e sobre a expressão gênica de fatores

relacionados à adipogênese.

O chá branco foi capaz de diminuir a

incorporação de triglicerídeos

durante a adipogênese de

forma dose dependente, sem

afetar a viabilidade da célula e diminuiu a expressão mRNA de fatores também

relacionados à adipogênese

(PPARγ, ADD1/SREBP-1c,

C/EBPαand C/EBPδ). O chá

branco também foi capaz de aumentar a atividade lipolítica

nos adipócitos.

SÖHLE et al., 2009


Testes antioxidantes, antielastases e

anticolagenases em extratos de 21 plantas.

Chá branco apresentou atividade

antielastase e anticolagenase.

Apresentou também, maior quantidade de

compostos fenólicos em

relação às outras plantas, e atividade antioxidante pelo

teste de Trolox e da superóxido dismutase

THRING et al., 2009


56

Ação das catequinas

Como dito anteriormente, muitos dos efeitos dos chás de C. sinensis são

decorrentes de seu teor de catequinas. Estas são monômeros de flavonóides,

componentes do grupo flavonas, e abrangem vários compostos similares,

epicatequinas, epicatequinas galato, epigalocatequinas e epigalocatequinas

galato (Figura 10) (RAHMAN et al., 2006; HIGDON e FREI, 2003). As

epicatequinas possuem um grupo orto-dihidroxil no anel B nos carbonos 3’ e 4’

e um grupo hidroxil no carbono 3 do anel aromático C. A epicatequina galato

difere da epicatequina por ter um grupo trihidroxil nos carbonos 3’, 4’ e 5’ do

anel B. A epicatequina galato tem um grupo galato esterificado no carbono 3

do anel C, enquanto a epigalocatequina galato possui ambos os grupos

trihidroxil no anel B, como o grupamento galato esterificado no carbono 3 do

anel C (HIGDON e FREI, 2003).

Figura 10: Estruturas de catequinas (adaptado de WALTNER-LAW et al.,2002).

Embora o conhecimento sobre a absorção, biodisponibilidade,

biodistribuição e metabolismo de polifenóis não seja totalmente esclarecido,

parece que alguns polifenóis são bioativos e são absorvidos pelo intestino

(embora em quantidades baixas) em sua forma nativa ou modificados. As

formas absorvidas são metabolizadas e podem ser detectadas no plasma em

faixas nanomolares. Os polifenóis plasmáticos mantêm, em parte, sua


57

capacidade antioxidante antes de serem excretados. Em geral, a

biodisponibilidade dos flavonóides é baixa devido à sua baixa absorção e

excreção rápida. Todavia, flavonóides glicosilados são absorvidos no intestino

delgado, mas são rapidamente transformados em derivados metilados e

sulfonados. (RAHMAN et al., 2006). No cólon, os flavonóides podem ser

metabolizados por enzimas bacterianas e transformados em metabólitos mais

simples (HIGDON e FREI, 2003).

A biodisponibilidade difere acentuadamente entre os diferentes tipos de

catequinas. A epigalocatequina galato (EGCG) é o único polifenol conhecido

encontrado no plasma, em sua forma livre, em grandes proporções (77-90% da

catequina ingerida). As outras catequinas são altamente conjugadas com

grupos sulfato (RAHMAN et al., 2006).

As catequinas possuem atividade antioxidante que é atribuída aos

grupamentos di e tri-hidroxil nos anéis aromáticos. Essa estrutura aumenta a

capacidade antioxidante dos compostos. A EGCG é a catequina mais eficaz na

remoção de espécies reativas de oxigênio. Além disso, as catequinas têm

capacidade de quelar íons metálicos, impedindo a formação de radicais livres

(RAHMAN, et al., 2006). As catequinas também atuam inibindo a oxidação de

lipoproteínas em macrófagos, catalisada por Cu2+ (YOSHIDA et al., 1999). Em

um estudo feito com mulheres eutróficas, entre 20 e 39 anos, no qual elas

recebiam durante quarenta e dois dias 2 xícaras de chá verde (contendo

250mg de catequinas cada), houve um aumento significativo da capacidade

antioxidante plasmática total e diminuição dos níveis de peróxidos plasmáticos

(ERBA et al., 2005). Em outro estudo feito com ratos, no qual eles receberam

extrato de chá verde a 3% em água, por 25 dias, houve diminuição da

formação de malondialdeído, um marcador de peroxidação lipídica, no fígado e

nos rins, e diminuição da atividade de superóxido dismutase no intestino e no

fígado (KHAN et al., 2007). Coimbra e col. (2006) verificaram diminuição da

formação de malondialdeído em homens e mulheres saudáveis que ingeriram 1

litro de chá verde por dia, durante 4 meses.


58

Chás da planta Camellia sinensis e obesidade

A obesidade está relacionada com o metabolismo de lipídeos e

carboidratos e estudos têm sido feitos mostrando a relação do chá verde com o

metabolismo de carboidratos (WU et al., 2004a; WU et al., 2004b; SABU et al.,

2002) e de lipídeos (NEGISHI et al., 2004; RAEDERSTORFF et al., 2003;

MURASE et al., 2002; MIURA et al., 2001).

Em relação ao metabolismo de lipídeos, em um estudo realizado em

ratos, a EGCG, oferecida como 1% de dieta hipercolesterolêmica, foi capaz de

reduzir o colesterol plasmático e hepático totais, aumentar a excreção de

lipídeos e diminuir a absorção de triglicerídeos e colesterol (RAEDERSTORFF

et al., 2003). Murase e col. (2002) observaram resultados semelhantes quando

estudaram camundongos C57BL/6 que recebiam dieta com 30% de lipídeos,

acrescida de 0,5% de extrato de chá verde. Eles observaram que

camundongos que receberam o chá verde apresentaram menor ingestão

energética, diminuição dos triglicerídeos hepático e do colesterol e glicose

plasmáticos e diminuição de enzimas relacionadas ao metabolismo de lipídeos.

Fujita e Yamagami (2008) viram que a suplementação com tabletes de extrato

de chá pretos, por 3 meses, reduziu o colesterol total e LDL colesterol, além de

reduzir o peso, de humanos.

Em relação ao metabolismo de glicose, Sabu e col. (2002) observaram

que o chá verde foi capaz de reduzir a glicose plasmática de ratos tratados com

aloxano. Em outro experimento realizado em ratos normais, o chá verde foi

capaz de reduzir a insulina plasmática e os triglicerídeos plasmáticos no teste

de tolerância oral à glicose (WU et al., 2004a).

Estudos sobre o efeito dos chás das plantas C. sinensis na perda de

peso também já foram realizados. Murase e col. (2002) realizaram um estudo

com camundongos C57BL/6, no qual ofereceram dieta hiperlipídica acrescida

ou não com 0,5% de chá verde, por onze meses, e observaram que o

acréscimo de chá verde foi capaz de diminuir o ganho de peso e a acumulação

de gordura visceral. Em outro estudo, realizado com ratos Wistar, no qual o chá

verde foi oferecido por 6 meses, foi observado menor ganho de peso e menor

tamanho de adipócitos para os animais que receberam o chá verde, em relação


59

ao controle (MONTEIRO et al., 2008). Em relação a estudos clínicos, um

estudo realizado com mulheres e homens adultos, com Índice de Massa

Corporal (IMC) entre 24 e 30kg/m2 e/ou circunferência da cintura entre 80 e

94cm, mostrou que o consumo de 340mL de chá verde, contendo 583mg de

catequinas, por 12 semanas, levou à diminuição do peso corporal, IMC, massa

de gordura corporal, área de gordura visceral e subcutânea, além da

diminuição da pressão arterial sistólica e LDL colesterol (NAGAO et al., 2007).

Entretanto, as ações emagrecedoras do chá verde e das catequinas

ainda são controversas na literatura. Não foi observada diminuição do peso

corporal e do percentual de tecido adiposo em um estudo realizado em ratos

Sprague-Dawle com dieta com 35% de lipídeos acrescida de 0,5% de chá

verde por oito semanas (NOMURA et al., 2008). Richard e col. (2009) também

não observaram alterações de peso quando ofertados 2% de chá verde para

camundongos C57BL/6. Em estudos clínicos também é observada a ausência

de ação do chá verde e das catequinas. Em um estudo realizado com mulheres

obesas (IMC maior que 27kg/m2), com idade entre 16 e 60 anos, a ingestão de

1200mg por dia de extrato de chá verde em cápsulas, por 12 semanas, não

proporcionou diferença no peso corporal, IMC e circunferência da cintura, bem

como não houve diminuição de colesterol total e triglicerídeos (HSU et al.,

2008). Maki e col. (2009) em seu estudo clínico com indivíduos sobrepeso e

obesos, praticando 3 horas de exercício por dia e ingerindo 625mg de

catequina por dia (500mL de chá verde diários), não observaram diferença na

perda de peso e no percentual de gordura corporal em comparação com os

indivíduos que não ingeriram o chá verde. Em indivíduos eutróficos que

ingeriram chá verde também não foi observada variação no peso (BELZA et al.,

2009).

Em relação ao chá branco, na literatura indicada pelo PUBMED ainda

não existem trabalhos relacionando o chá branco com a obesidade induzida

por dieta em estudos experimentais.


60

3.6. O MODELO EXPERIMENTAL DE OBESIDADE INDUZIDA POR DIETA

Diversos são os modelos com modificação genética para a indução de

distúrbios relacionados à obesidade. Os camundongos com mutação no gene

para leptina, ob/ob (ZHANG et al., 1994), e no gene para o receptor de leptina,

db/db (TARTAGLIA et al., 1995), apresentam obesidade precoce, com gasto

energético e crescimento linear diminuído, além de apresentar infertilidade. Os

camundongos da espécie Tubby (KLEYN et al., 1996) se caracterizam pela

resistência insulínica e obesidade enquanto os Agouti (BULTMAN et al., 1992)

apresentam excesso de peso, diabetes tipo 2 e hiperleptinemia. Em relação

aos ratos, a espécie Zucker (fa/fa) (NAGGERT et al., 1995), apresenta

hiperfagia, hiperinsulinemia e hiperlipidemia. Porém, embora mutações

genéticas acarretem desenvolvimento de obesidade em animais, elas são raras

em humanos (RANKINEN et al., 2006; FAROOQI E O’RAHILLY, 2005).

A dieta hiperlipídica pode induzir obesidade e distúrbios metabólicos em

roedores que lembram a síndrome metabólica humana. Entretanto, essa

intervenção dietética não está padronizada e o fenótipo induzido pela dieta

hiperlipídica varia entre os estudos (BUETTNER et al., 2007). Ainda assim, o

modelo de obesidade induzida por dieta é preferível em detrimento dos

modelos com alterações genéticas visto que é necessário que o modelo animal

apresente, não apenas o fenótipo, como também a patogênese semelhante à

doença humana (BUETTNER et al., 2007). Buettner e col. (2007) mostram em

uma revisão sobre modelos animais de obesidade induzida por dieta

hiperlipídica que camundongos C57BL/6 são susceptíveis a esse tipo de

indução e que a banha pode ser utilizada como fonte de lipídeos de forma

eficiente.



61

4. MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais e Métodos

62

4.1. Animais experimentais

Foram utilizados camundongos C57BL/6, machos, de 4 a 6 semanas de

idade, obtidos no Biotério Central do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Minas Gerais e mantidos no Biotério Ênio Cardillo

Vieira da mesma instituição.

Os animais de todos os grupos tiveram livre acesso à dieta e água e

foram mantidos em gaiolas coletivas (5 animais por gaiola), em ambiente com

ciclos de luminosidade de 12 horas (7:00 às 19:00) e temperatura controlada

(20 a 24o C). Os animais foram mantidos em gaiolas de dimensões de

30x20x13cm para até 6 animais.

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal

da UFMG (CETEA/UFMG): nº do protocolo 116/2009 (Anexo 9.1).

4.2. Delineamento experimental

Modelo de obesidade

Inicialmente, nosso objetivo foi criar um modelo rápido para estudo de

obesidade e estresse oxidativo. Para isso, os animais foram divididos em dois

grupos homogêneos quanto ao peso, triglicerídeos e colesterol inicial, da

seguinte forma: grupo controle, com dieta comercial (CO; n = 10), e grupo

experimental para indução da obesidade, com dieta hiperlipídica (HL; n = 20).

Para tal, o grupo CO recebeu dieta comercial para roedores Labina® e ao

grupo HL foi oferecida dieta hiperlipídica, com 61% do fornecimento calórico

em forma de gordura (adaptada de AKAGIRI et al., 2008).

A dieta comercial para roedores Labina®, segundo o fornecedor, é

composta de: milho integral moído, cloreto de sódio, aditivo antifúngico

fungistático, cloreto de colina, premix vitamínico mineral, feno de alfafa, fosfato

bicálcico, soja integral moída, calcário calcítico, farelo de soja, farelo de peixe,

farelo de trigo, remoído de trigo e pode apresentar eventuais substitutivos

(Anexo 9.2). A composição da dieta experimental e sua comparação com a

dieta comercial estão descritas nas tabelas 1 e 2.


63

Tabela 1: Ingredientes da dieta hiperlipídicaa (em g/kg)

Amido de milho b 59,19

Caseína 190,93

Óleo de soja b 19,09

Celulose 47,73

Mistura de minerais 33,41

Mistura de vitaminas 9,55

Cistina (metionina) 2,86

Bitartarato de colina 2,39

BHT 0,01

Banha de porco b 338,90

Groselha Celli® c 295,94

TOTAL (g) 1000,00

a Adaptado de AKAGIRI et al., 2008. b Composição segundo PHILIPPI, 2002. c Composição fornecida pelo fabricante.

Tabela 2: Composição Centesimal das Dietas

Comercial a Hiperlipídica

Carboidrato 50,3% 24,5%

Proteína 41,9% 14,5%

Gordura total 7,8% 61,0%

Calorias / g dieta 2,18kcal/g 5,21 kcal/g

a Composição fornecida pelo fabricante da ração comercial Labina®


64

O experimento com tratamento dietético decorreu por oito semanas e

ao final desse período, após anestesia e jejum de 12 horas, os animais foram

sacrificados por exaguinação da artéria femoral seguido por deslocamento

cervical.

Suplementação dietética com chá branco (Camellia sinensis)

Para o estudo dos efeitos do chá branco na evolução da obesidade e

suas complicações, os animais foram divididos em dois grupos homogêneos

quanto ao peso, triglicerídeos e colesterol inicial, da seguinte forma: grupo

obeso controle (Ob; n = 25) e grupo obeso com chá branco (Ob + chá; n = 25).

A dieta oferecida foi a hiperlipídica, com 61% do fornecimento calórico em

forma de gordura (adaptada de AKAGIRI et al., 2008), já citada acima. Aos

grupos que receberam chá branco, esse foi acrescido na proporção de 0,5% do

total de dieta.

A composição do chá foi determinada pelo fornecedor chinês e encontra-

se no quadro abaixo:

Tabela 3: Composição do chá branco

Componente Porcentagem

Polifenóis totais 91,3%

EGCG 33,9%

Cafeína 7,3%

L-tanino 1,3%

As dietas foram oferecidas durante as oito semanas experimentais e ao

final desse período, após anestesia e jejum de 12 horas, os animais foram

sacrificados, por exaguinação da artéria femoral.


65

4.3. Controle do peso corporal, do consumo líquido e alimentar

Semanalmente, os camundongos foram pesados para observar o

crescimento ponderal. Foi quantificado o consumo semanal de água,

verificando a quantidade oferecida aos animais e a quantidade restante.

Foi feita, semanalmente, a quantificação do consumo alimentar. Para

isso, as dietas ofertadas aos animais foram pesadas. Foi quantificado o

restante de dieta ofertada e seus restos no fundo da gaiola através da

peneiração da maravalha. A diferença entre dieta ofertada e o restante não

consumido de dieta e de restos no fundo da gaiola forneceu o consumo de

dieta semanal. Para o cálculo do consumo calórico, o consumo por animal por

dia foi multiplicado pela densidade calórica da dieta.

4.4. Eficiência alimentar

Com a finalidade de analisar a capacidade do animal converter em peso

corporal a energia alimentar consumida, foi realizado o cálculo da eficiência

alimentar (EA). Este cálculo foi obtido dividindo-se a soma do ganho do peso

semanal (g), dos animais de cada gaiola pelo total de energia ingerida (kcal),

por gaiola, multiplicado por 100 (NASCIMENTO, 2006). A energia ingerida foi

calculada multiplicando-se a quantidade ingerida de alimento pela densidade

calórica da dieta.

4.5. Amostras de sangue

As amostras de sangue foram retiradas após jejum de 8 a 12 horas. No

início do experimento, o sangue foi retirado pela veia caudal através de

capilares com anticoagulante contendo antiglicolítico (Glistab, Labtest,

composto de EDTA 6g/L e fluoreto de potássio 12g/L) para análise da glicemia,

e sem anticoagulante para análises de colesterol e triglicerídeos. Ao término do

experimento, os animais foram anestesiados intraperitonealmente com uma

solução de ketamina (70 mg/kg) e Xilazina (11,5 mg/kg) (preconizado pelo

CETEA da Universidade Federal de Minas Gerais) e foram sacrificados por


66

exanguinação pela artéria femoral. Posteriormente, o sangue foi centrifugado a

6.000rpm durante 5 minutos em centrífuga de mesa Fanem Centrimicro 243

para separação do plasma ou do soro. As amostras de soro ou plasma foram

armazenadas à –75ºC para posteriores análises.

4.6. Amostras de tecidos

Ao final do tratamento, o fígado e o tecido adiposo epididimal dos

animais foram retirados, perfundidos com salina tamponada com fosfato (PBS)

e acondicionados a -75ºC para as análises posteriores. Antes de ser

armazenado, o tecido adiposo foi pesado para cálculo da porcentagem de

adiposidade epididimal. O ceco também foi retirado para uso do conteúdo

cecal. Esse foi seco em estufa a 60oC e armazenado a -75ºC para as análises

posteriores.

4.7. Avaliação do perfil lipídico

Determinação das concentrações de colesterol total

As concentrações de colesterol foram medidas de acordo com o método

da colesterol oxidase (ALLAIN et al., 1974) utilizando kit comercial Labtest,

Brasil. O método consiste na hidrólise de ésteres de colesterol pela colesterol

esterase produzindo colesterol livre. Este, em presença da colesterol oxidase e

de oxigênio, produz peróxido de hidrogênio que, pela ação da peroxidase em

presença de fenol e 4-aminoantipirina, produz um composto róseo-

avermelhado com absorção máxima de 500nm.

As concentrações de colesterol no soro ou plasma dos animais foram

determinadas por um ensaio em microplaca de 96 poços, de acordo com Fazio

e col. (1997). 5µL das amostras de soro foram diluídas em água deionizada

(1:200), afim de que as leituras de absorbância fossem adequadas à variação

linear do teste. 100µL de reagente de colesterol total foram adicionados a

100µL do soro diluído. Após um período de incubação de 15 minutos a 37º C a


67

absorbância foi lida a 492nm em um leitor de microplaca (Modelar Devices,

modelo Spectra Max Plus).

Determinação das concentrações de HDL colesterol

As concentrações de HDL-colesterol no soro foram obtidas por meio do

kit enzimático Labtest, Brasil, cujo princípio se baseia na precipitação seletiva e

quantitativa das lipoproteínas LDL e VLDL pelo ácido fosfotúgstico e cloreto de

magnésio. Após centrifugação (12.000rpm por 4 minutos), o colesterol ligado

às lipoproteínas de alta densidade (HDL) é determinado no sobrenadante.

O sobrenadante foi plaqueado (10µL) em duplicata em uma microplaca

de 96 poços, em seguida, adicionados a 200µL do reagente de cor Colesterol

Liquiform - Labtest (Brasil). Após incubação de 15 minutos a 37º C, a

absorbância foi lida a 492nm.

Para a determinação do padrão foram substituídos 10µL de

sobrenadante de amostra por 10µL de padrão de HDLc. Para o cálculo das

concentrações de HDLc foi feita a determinação do fator de Calibração através

da seguinte equação: F (Fator de calibração) = 40/média da Absorbância do

Padrão; HDLc (mg/dL) = Absorbância da amostra x Fator de calibração.

Determinação das frações aterogênicas e do índice aterogênico

O colesterol das frações aterogênicas (LDLc, VLDLc e IDLc) foi

calculado pela diferença entre o colesterol total e a HDLc. O índice aterogênico

foi calculado pela razão entre a fração não aterogênica e o HDLc.

Determinação das concentrações de triglicerídeos séricos

As concentrações de triglicerídeos séricos foram medidas de acordo

com o método enzimático colorimétrico (FOSSATI e PRENCIPE, 1982),

utilizando kit comercial Doles, Brasil. O método consiste na hidrólise dos


68

triglicerídeos do soro pela lipase lipoprotéica produzindo glicerol livre. Esse é

fosforilado pela glicerol quinase, cujo produto sofre a ação da glicerol fosfato, o

qual, em presença de oxigênio, produz peróxido de hidrogênio. Este, sob ação

da peroxidase em presença de um reagente fenólico (4-clorofenol) e 4-

aminoantipirina, produz um composto róseo avermelhado, com máximo de

absorção a 510nm. As dosagens e a curva padrão foram feitas em

microplacas. A diluição utilizada foi de 5µL de soro em 245µL de água

deionizada.

Extração de lipídeos por solvente orgânico

A extração de lipídeos por solvente orgânico (FOLCH et al., 1956), foi

feita, resumidamente da seguinte forma: 100mg de tecido foram

homogeneizados, em tubo de vidro, com 1900µL solução clorofórmio:metanol

(2:1). Foram acrescentados 400µL de metanol, jato forte, e centrifugados a

3000rpm, por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para tubo previamente

pesado e acrescidos de 800µL de clorofórmio e 640µL de NaCl 0,73%, jato

forte. Após homogeneização lenta, os homogenatos foram centrifugados

durante 5 minutos, a 3000rpm. A fase superior foi desprezada e a parede do

tubo foi lavada 3 vezes com 600µL solução de Folch (3% de clorofórmio, 48%

de metanol, 47% de água destilada e 2% de NaCl 0,2%) e colocados para

secar em estufa, a 60º. A quantidade de lipídeos extraída foi calculada por

diferença de peso.

4.8. Avaliação da Glicemia

Determinação da glicemia de jejum

As concentrações de glicose no plasma foram dosadas por meio do kit

enzimático Labtest, Brasil. O princípio se baseia na oxidação da glicose a ácido

glucônico, pela ação da glicose oxidase, com liberação de peróxido de

hidrogênio. Este, pela ação da peroxidase em presença de fenol e 4-


69

aminoantipirina, produz um composto róseo-avermelhado com absorção

máxima de 520nm.

O sangue foi separado utilizando anticoagulante contendo antiglicolítico

(Glistab, Labtest, composto de EDTA 6g/L e fluoreto de potássio 12g/L), sendo

2µL de plasma transferidos para uma microplaca de 96 poços e adicionados a

200µL do reagente de cor, em duplicata. Após incubação de 15 minutos a 37º

C, a absorbância foi lida a 492nm em leitor de microplaca (Thermo Plate).

Para a determinação do padrão foram substituídos 2µL amostra por 2µL

de padrão. Para o cálculo das concentrações de glicose em mg/dL foi utilizada

a fórmula, indicada pelo Kit Labtest: Média da absorbância da amostra / média

da absorbância do padrão x 100.

Teste de tolerância oral à glicose

O teste de tolerância oral à glicose, juntamente com o teste de

sensibilidade à insulina, é usado para estimar a resistência insulínica, e foi

realizado conforme descrito anteriormente por Santos e col. (2008). Os

animais foram deixados em jejum, por 6 horas. Em seguida, os animais

receberam solução de D-glicose, 2g/kg de peso corporal, por gavagem. Foi

feita a leitura da glicemia, com auxílio de um glicosímetro Advantage, nos

tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos após a gavagem. Para tal, foi retirada uma

gota de sangue caudal. A glicemia foi dada em mg/mL.

Teste de sensibilidade à insulina

O teste de sensibilidade à insulina, juntamente com o teste de tolerância

oral à glicose, é usado para estimar a resistência insulínica, e foi realizado

conforme descrito anteriormente por Santos e col. (2008). Com os animais em

estado alimentado, foi injetado intraperitonealmente 0,75 unidades de insulina

por kg de peso do animal. Foi feita a leitura da glicemia, com auxílio de um

glicosímetro Advantage, nos tempos 0, 15, 30 e 60 minutos após a injeção.


70

Para tal, foi retirada uma gota de sangue caudal. A glicemia foi dada em

mg/mL.

4.9. Avaliação do estresse oxidativo

Monitoramento da capacidade antioxidante do soro - Dosagem de dieno conjugado

A oxidação de componentes do soro é um processo mediado por

radicais livres, no qual, ácidos graxos poli-insaturados são degradados em um

processo de peroxidação lipídica, dando origem a uma variedade de produtos

altamente reativos, tais quais hidroperóxidos lipídicos, aldeídos e dienos

conjugados, entre outros (ESTERBAUER et al., 1992).

O perfil cinético da peroxidação lipídica pode ser dividido em três fases:

a fase de latência (fase lag), a fase de propagação e a fase de decomposição.

Na primeira fase, os antioxidantes são consumidos, sem ocorrer uma oxidação

significativa de ácidos graxos. Logo após a depleção de antioxidantes há a fase

de propagação e então os ácidos graxos são rapidamente oxidados formando

dienos conjugados. Na fase de decomposição os níveis de dienos caem

lentamente. O tempo de latência tem sido utilizado como critério para avaliação

da resistência à oxidação lipídica e para a avaliação da suscetibilidade dos

lipídeos séricos à oxidação (SCHNITZER et al.,1998). Um exemplo do gráfico

de cinética é mostrado na Figura abaixo:

Figura 11: Cinética da formação de dienos conjugados, gráfico plotado em absorbância (nanômetro) por tempo (minutos)


71

Amostras séricas foram diluídas em salina tamponada com fosfato

(PBS), pH 7,4, na proporção de 1:100, sendo adicionada uma solução de CuCl2

a 1 mmol/L até a concentração final de 30 µmol/L. Em seguida, as amostras

foram incubadas a 37º C e monitoradas espectrofotometricamente a 245 nm

durante uma hora (SCHNITZER et al.,1998).

Avaliação da peroxidação lipídica- TBARS (substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico)

A geração de radicais livres e a peroxidação lipídica são reações

extremamente rápidas, que são, geralmente, mensuradas pelos seus produtos,

principalmente as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), entre

as quais o malonaldeído é o principal. A formação do malonaldeído, pela

quebra de ácidos graxos poli-insaturados, é um método conveniente para se

determinar o grau de peroxidação lipídica.

A mensuração dos metabólitos, reativos ao ácido tiobarbitúrico, foi

realizada em microplacas pelo método descrito por Wallin e col. (1993). Os

tecidos (100mg de tecido acrescido de 1,0mL de PBS) foram triturados com um

homogeneizador (Euro Turraz T20b, IKA labortechnik) e mantidos em gelo. O

volume de 500µL do homogenato de cada amostra foi colocado em tubos de

ensaio e adicionado 1mL de solução contendo ácido tricloroacético (TCA 15%),

ácido tiobarbitúrico (TBA 0,0375%) e ácido clorídrico (HCL 0,25 N). As

amostras foram mantidas em banho-maria fervente por 15 minutos e então

colocadas sob água corrente até esfriarem. Foi adicionado aos tubos 1,5mL de

álcool butílico, e os tubos foram vigorosamente agitados. Após centrifugação a

3000rpm, por 10 minutos, o sobrenadante foi recolhido e plaqueado em

duplicata e a leitura realizada a 535nm. O resultado foi normalizado por

dosagem de proteínas pela técnica de Lowry (1951), segundo o qual a

concentração de proteínas nas amostras é calculada através de uma curva

padrão, feita com albumina.


72

Dosagem da concentração de hidroperóxidos

O ensaio da oxidação ferrosa do xilenol orange consiste basicamente na

oxidação de íons ferrosos (Fe2+) a férricos (Fe3+) sob condições ácidas pelos

hidroperóxidos (NOUROOZ-ZADEH et al., 1994; BANERJEE et al., 2002). O

indicador utilizado é o Xilenol Orange, que se liga ao íon férrico produzindo um

cromóforo azul-arroxeado. Os homogenatos preparados para a técnica de

TBARS foram centrifugados a 12000rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi

utilizado para análise de hidroperóxido. A mensuração foi realizada em

microplaca. No momento da realização do ensaio, uma parte da solução FOX

(preparado pela dissolução do xilenol orange e do sulfato ferroso amoniacal em

250mM de H2SO4 para uma concentração final de 1 e 2,5mM, respectivamente)

foi diluída em nove partes da solução de metanol grau-HPLC contendo 4,4mM

de BHT, obtendo-se o reagente FOX-2.

Para as dosagens foram retirados 20µL do sobrenadante do

homogenato preparado para a análise de TBARS e, acrescidos a este 180µL

do reagente para FOX-2, diretamente na microplaca, em duplicata. Para fazer o

branco foram utilizado 20µL de água deionizada no lugar do homogenato. Em

seguida, as placas foram mantidas em temperatura ambiente por 30 minutos.

Posteriormente a absorbância foi lida a 560nm em um leitor de microplaca

(Modelar Devices, modelo Spectra Max Plus).

Adicionalmente, foi realizada a redução dos hidroperóxidos com

Trifenilfostina (TPP). A TPP é utilizada como eficiente ferramenta para distinção

entre peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos (não-H2O2), já que a presença

ou a ausência de TPP indica o teor de H2O2 da amostra (NOUROOZ-ZADEH et

al., 1994; BANERJEE et al., 2002).

Em 15µL do sobrenadante do homogenato preparado para a análise de

TBARS foram adicionados 5µL de TPP a 10mM (a TPP foi diluída em metanol),

diretamente na microplaca, em duplicata e mantida em temperatura ambiente

por 30 minutos. Logo após, foram acrescidos 180µL do reagente para FOX-2

em cada poço. Para fazer o branco foram utilizados 15µL de água deionizada

no lugar do homogenato. Em seguida, estas misturas foram mantidas em


73

temperatura ambiente por 30 minutos. Posteriormente, a absorbância foi lida a

560nm em um leitor de microplaca (Modelar Devices, modelo Spectra Max

Plus).

O Xilenol Orange ao se ligar aos íons férricos, produz um cromóforo

azul-arroxeado com coeficiente de extinção de 1,5 x 10-4M-1 a 560nm. A

concentração de hidroperóxidos pode ser estimada uma vez que o coeficiente

de extinção dos hidroperóxidos é de 4,3 x 10-4M-1 a 560nm. Concentrações

inferiores a 1µM podem ser detectadas.

Para quantificar os hidroperóxidos da amostra foram subtraídas as

dosagens com TPP daquelas sem TPP (sem TPP - com TPP = quantidade de

hidroperóxidos da amostra) que pode ser expressa em absorbância ou em

µmolar. O resultado foi normalizado por dosagem de proteínas pela técnica de

Lowry e colaboradores (1951).

Dosagem da atividade da enzima antioxidante catalase

A dosagem da atividade de catalase se baseia no decaimento da

absorbância do peróxido de hidrogênio (H2O2) – (Abs240) pela metabolização

deste pela catalase (2H2O2 � 2H2O + O2) (NELSON e KIESOW, 1972).

Resumindo, 25µL de homogenato de fígado em tampão fosfato (50mM) diluído

(1:25) foi acrescentado a 1mL de tampão fosfato 50mM em uma cubeta de

quartzo. Para o tecido adiposo, o homogenato não foi diluído. Foram

acrescidos 25µL de solução de H2O2 a 0,3M e lida a absorbância (Abs240)

durante 1 minuto. Os cálculos foram feitos pela diferença de leitura no tempo

final pelo tempo inicial, dividido pelo volume (mL) da amostra. O resultado é

expresso por concentração de proteína (mg/mL), dosada pelo método de Lowry

(1951).

Dosagem da atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase

A dosagem da atividade da superóxido dismutase (SOD) é baseada na

sua habilidade de limpar o radical O2-, diminuindo a razão de auto-oxidação do


74

pirogallol (adaptado de DIETERICH et al., 2000). Resumindo, 30µL de

homogenato de tecido em tampão fosfato (50mM) foram plaqueados em placa

de 96 poços e acrescidos de 99µL de tampão fosfato, 6µL de MTT (brometo de

dimetiltiazol-difeniltetrazolium) e 15µL de pirogallol. Para o branco, o pirogallol

foi substituído por tampão fosfato e para o padrão, a amostra foi substituída por

tampão fosfato. Após 5 minutos de incubação a 37ºC, a reação foi parada com

150µL de DMSO (dimetil sulfóxido) e a absorbância foi lida a 570nm. Para o

cálculo do resultado foi considerado que 1 unidade (U) de SOD era capaz de

evitar a auto-oxidação de 50% de pirogallol do padrão. O resultado foi expresso

em Unidades por mg de proteína.

ELISA para anticorpo de LDL oxidada

1. Separação da LDL

Após a coleta de 10mL de sangue de indivíduo saudável (voluntário) não

fumante, em tubo vacutainer com EDTA 10%, procedeu-se a centrifugação a

3000rpm por dez minutos, em centrífuga de mesa (Fanem Excelsa Baby, mod.

205N). O soro foi coletado e adicionado os conservantes: aprotinina,

benzamidina, azida sódica 5% com EDTA 5% e clorafenicol 0,1%, PMSF

0,5mM em DMSO. O soro teve sua densidade elevada para 1,21 com solução

de Brometo de potássio (KBr). Três mililitros deste soro foram colocados em

tubos de polipropileno, com volume total de 10mL, próprios para ultracentrífuga

Sorvall Ultra pro-80/Du Pont, utilizando o rotor 875T. Após o soro, foi

adicionada a solução de KBr de densidade 1,006 até completar o volume total

do tubo, formando assim o gradiente descontínuo de densidade de duas

camadas. Os tubos devidamente equilibrados foram colocados para

centrifugação por duas horas e meia a 50.000rpm e 40C, para separação das

lipoproteínas. Terminada a rodada, foi retirada a camada composta pela LDL e

a amostra foi submetida à diálise em solução de tampão fosfato (PBS), por um

período de vinte e quatro horas a 40C, com três trocas do tampão. Em seguida,

o material foi filtrado e guardado estéril em atmosfera de nitrogênio a 40C, em

recipiente protegido da luz (CHUNG et al., 1986).


75

2. Oxidação da LDL

Para a oxidação da LDL foi acrescido CuCl2 a 1mM, para concentração

final de 5µM. Após 3 horas e 30 minutos de oxidação, a 37ºC, sob agitação

constante, e envolto em papel alumínio, a reação foi finalizada com EDTA 0,5M

(proporção de 2 EDTA: 1 CuCl2).

3. Quantificação das Imunoglobulinas Anti - LDL Oxidada

As Imunoglobulinas foram dosadas pelo ensaio ELISA (LEE et al., 1999),

descritos resumidamente: Microplacas de poliestireno (Nunc, Maxisorp, Denmark)

foram incubadas 24 horas, em temperatura ambiente, com 100µL por poço de

solução do antígeno (LDL oxidada e nativa, com 50µg/mL de proteína) diluído em

salina fisiológica. Após o período de sensibilização, as placas foram incubadas por

uma hora, com 200µL de uma solução BSA 1% em PBS, por poço, para bloqueio,

à 37°. A solução de bloqueio foi desprezada, as placas foram lavadas 5 vezes

com salina fisiológica contendo 0,05% de Tween 20 (SIGMA Chemical Co., St

Louis, MO, USA) e incubadas a temperatura ambiente, overnight, com o 100µL

por poço do soro diluído 1:10. As placas foram lavadas cinco vezes com salina-

Tween 0,05% e incubadas, por duas hora a 37o C, com 100µL de uma solução de

IgG peroxidase, na diluição 1:5000. As placas, após serem lavadas dez vezes

com salina-Tween, foram incubadas no escuro, com 100µL de uma solução

reveladora - 10mL de tampão citrato (pH=5,0) contendo 40µl de H2O2 e 10mg de

ortofenileno-diamino (OPD) - para o desenvolvimento de cor, por reação

enzimaticamente catalisada. Após trinta minutos de incubação, a reação foi

interrompida pela adição de 30µL por poço de H2SO4 1:20. A absorbância do

comprimento de onda a 492nm foi feita por leitor automático (Model 450

microplate Reader, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Os resultados foram obtidos pelo cálculo da média das repetições da LDL

nativa subtraídas da LDL oxidada em cada grupo experimental.


76

4.10. Determinação da Hepatotoxicidade

Dosagem de ɣGT

A dosagem de ɣGT foi feita usando kit comercial Labtest, Brasil. A

técnica se baseia na determinação cinética da ɣGT, na qual há produção de p-

nitroalanina (PNA). A elevada absorção da p-nitroanilina (PNA) formada na

reação de transferência do grupamento glutamil da ɣglutamil p – nitroanilida

(ɣGPNA) para glicilglicina (GG) é proporcional à atividade da ɣGT na amostra

biológica.

Para a dosagem, 10µL de amostra foram transferidos direto para a

microplaca, em duplicata, e acrescidos de 200µL do reagente de trabalho em

todos os poços. Após incubação por 5 minutos na estufa a 37ºC, foi feita a

leitura no leitor de microplaca a 405nm. A leitura foi repetida 1, 2 e 3 minutos. O

cálculo foi feito através da diferença por minuto (∆ Abs/min), entre as medias

das absorbâncias. O valor encontrado foi multiplicado por 2121 pra encontrar-

se a dosagem de ɣGT expressa em U/L.

4.11. Avaliação do infiltrado de macrófagos

Dosagem indireta de macrófagos pela determinação da atividade da N-

acetil-glicosaminidase (NAG) em tecido adiposo

Para a quantificação indireta da enzima N-acetil-glicosaminidase

presente em macrógafos (BAILEY, 1988), cerca de 100mg do tecido adiposo

foram congeladas em freezer -80°C. Posteriormente, as amostras foram

descongeladas, pesadas e acondicionadas em tubos Eppendorf de 2,0mL.

Logo após, 100mg destas amostras foram homogeneizadas e maceradas em

2,0mL de salina 0,9%/Tritonx-100 0,1% v/v, e em seguida, centrifugadas a

3000rpm durante 10 minutos a 4°C. O infranadante foi utilizado no ensaio.

Para o ensaio enzimático, foram adicionados 100µL das amostras,

diluídas (1:4) em tampão fosfato, a uma placa de 96 poços. Às amostras, foram


77

adicionados 100µL do substrato p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glicosaminida (Sigma)

diluído em tampão fosfato. A placa foi incubada a 37°C por 10 minutos.

Para interromper a reação foi adicionado de 100µL de tampão glicina

0,2M, pH 10,6. A absorbância foi medida por espectrofotometria em

comprimento de onda de 400nm. O resultado foi multiplicado pela quantidade,

em gramas, de tecido adiposo do sítio em que foi feito a análise, para que o

resultado fosse expresso em atividade de NAG absoluta em tecido adiposo

específico e também foi expresso por proteína, dosada pelo método de Lowry

(1951).

4.12. Avaliação histológica do tecido adiposo

O tecido adiposo epididimal foi retirado, lavado em solução salina e

fixado em solução de Bouin (água destilada saturada de ácido pícrico acrescido

de 25 % de formol 10% e 5% de ácido acético glacial). Após 24 horas, o tecido

foi transferido para uma solução de etanol 70% e, posteriormente, foi feita a

inclusão em parafina. Cortes de 7µm de espessura foram obtidos em

micrótomo e corados com hematoxilina-eosina. As fotos foram obtidas em

microscópio acoplado a uma câmera digital, com aumento final de 100X. As

imagens foram analisados com auxílio do software ImageProPlus (Image-Pro

Plus Sftware, Bethesda Maryland - USA), e a média da área de 100 adipócitos

por amostra foram determinadas. Para contagem das coroas de macrófagos,

10 campos de cada amostra foram analisados em microscópio, com aumento

final de 400x, e as estruturas tipo coroa foram contadas em cada campo. O

resultado foi expresso em número de estruturas tipos coroa por campo.

4.13. Análise Estatística

Os dados foram expressos em média + erro padrão ou mediana;

mínimo-máximo, e analisados no software Prisma (GraphPad Software, San

Diego California – USA), versão 5.0. Foi utilizado o teste de Grubbs para

detecção de outliers. Para verificar a normalidade da amostra foram utilizados


78

os testes D’agostino and Pearson e Kolmogorov-Smirnov. Para comparação

entre os grupos experimentais foi utilizado o teste t de Student para valores que

seguiam a normalidade e teste Mann Whitney pra os que não seguiam. Foi

considerado um nível de significância de 5% (p < 0,05).



79

5. RESULTADOS

Resultados

80

5.1. MODELO DE OBESIDADE

Para estabelecimento do modelo de obesidade, foram observados os

seguintes parâmetros: ingestão calórica, peso e adiposidade.

A ingestão calórica dos animais foi estatisticamente diferente entre os

grupos analisados. O grupo HL apresentou maior ingestão calórica por animal

por dia, ao longo das semanas (16,34kcal ± 0,66) em relação ao grupo CO

(9,20kcal ± 0,14) (Figura 12).

Figura 12: Ingestão calórica dos camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL), por 8 semanas. Os resultados foram expressos em média + erro padrão, ao longo das semanas experimentais, sendo n = 8. Teste t de Student. * = p<0,05.

O peso final dos animais do grupo HL (30,54g ± 0,63) foi

significativamente maior em relação aos animais do grupo CO (19,87g ± 0,58),

como visto na Figura 13.

Resultados

81

Figura 13: Peso corporal final, em gramas, dos camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas. Sendo CO: n = 10 e HL: n = 20. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t Student, * = p<0,05. Em relação à adiposidade visceral, avaliada através da porcentagem de

gordura visceral do sítio epididimal, a dieta hiperlipídica (1,67%; 0,84 – 7,38) foi

capaz de aumentá-la significativamente em relação ao grupo CO (0,87%; 0,49

– 1,34), conforme mostra a Figura 14:

Figura 14: Percentual de adiposidade epididimal final, dos camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas, calculada pela divisão do peso total do tecido adiposo epididimal pelo peso corporal final do animal, multiplicado por 100. Sendo CO: n = 10 e HL: n = 15. Os resultados foram expressos em mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney. * = p<0,05.

Resultados

82

Quando analisada a área do adipócito (Figura 15), também foi

observada diferença entre os grupos (CO = 2664µm2 ± 698,6 e HL = 9791µm2 ±

1257), como observado na Figura 16:

Figura 15: Análise histológica do tecido adiposo epididimal nos animais que receberam dieta controle (A) ou dieta hiperlipídica (B) por 8 semanas.Tecido corado com hematoxilina-eosina. Aumento de 100x.

Resultados

83

Figura 16: Área dos adipócitos dos camundongos C57BL/6, em µm2, que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas, calculada pela média da área de 100 adipócitos por animal. Sendo n = 5 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais, ao final do experimento. Teste t Student, * = p<0,05.

Além dos parâmetros citados, a dieta hiperlipídica foi capaz de alterar o

perfil lipídico dos animais, mas não afetou a glicemia e os triglicerídeos,

conforme mostrado na tabela 4:

Tabela 4: Parâmetros sanguíneos observados em camundongos C57BL/6 que receberam dieta indutora de obesidade (hiperlipídica) ou dieta comercial por 8 semanas. Sendo CO: n = 10 e HL: n = 20 para glicose e triglicerídeos e n = 10 por grupo experimental, para o perfil do colesterol. aTeste t de Student, com resultados expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento e bTeste Mann Whitney, com resultados expressos em mediana (mínimo – máximo). * = p<0,05. Glicose: p = 0,11; Triglicerídeos: p = 0,13.

Parâmetro Comercial Hiperlipídica

Colesterol (mg/dL)a 100,6 ± 9,2 130,0 ± 7,6 *

HDL colesterol (mg/dL)b 64,7 (39,0 – 72,9) 36,1 (28,4 – 90,0) *

Fração aterogênica

(mg/dL)b

39,4 (5,1 – 87,7) 82,7 (20,4 – 151,1) *

Índice aterogênicob 0,63 (0,07 – 1,99) 2,51 (0,35 – 7,79) *

Glicose (mg/dL)a 138,7 ± 11,2 118,4 ± 6,8

Triglicerídeos (mg/dL)b 75,2 (40,8 – 152,3) 59,3 (27,3 – 136,8)

Resultados

84

A atividade antioxidante foi medida no fígado e tecido adiposo. Quando o

fígado foi analisado, não houve diferenças entre os grupos pela técnica de

TBARS (CO = 0,036µmol/g ± 0,004 e HL = 0,04µmol/g ± 0,004). Porém a

formação de hidroperóxidos foi maior no fígado dos animais HL, comparados

aos CO (CO = 4,16µmol/g; 1,09 – 28,18 e HL = 20,02µmol/g; 5,00 – 74,90),

sugerindo o aumento do estresse oxidativo (Figura 17).

Figura 17: Avaliação do estresse oxidativo em fígado de camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas. (A) Dosagem do estresse oxidativo pela técnica de TBARS, sendo n = 10, por grupo experimental, com resultados expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student. p = 0,38. (B) Dosagem do estresse oxidativo pela avaliação da concentração de hidroperóxidos, sendo CO: n = 8 e HL: n = 7, com resultados expressos em mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney, * = p<0,05.

Em relação às enzimas antioxidantes, avaliamos superóxido dismutase

(SOD) e catalase. O grupo HL apresentou aumento significativo da atividade da

SOD no fígado em relação ao grupo CO (0,52U/mg ± 0,05 e 0,37U/mg ± 0,02,

respectivamente). Porém, a atividade da catalase permaneceu inalterada (CO=

5,16∆E/min/mg; 1,12–15,92, HL= 5,78∆E/min/mg; 1,28–15,75) (Figura 18).

Resultados

85

Figura 18: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em fígado de camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas. (A) Dosagem da atividade da Superóxido Dismutase (SOD), sendo n = 10 por grupo experimental, com resultados expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student; * = p<0,05. (B) Dosagem da atividade da catalase, sendo n = 10 por grupo experimental com resultados expressos em mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney. p = 0,80. Quando o estresse oxidativo no tecido adiposo foi analisado, a dieta

hiperlipídica aumentou o estresse oxidativo, tanto pela técnica de TBARS (CO

= 0,64µmol/g ± 0,22 e HL = 1,50µmol/g ± 0,31) quanto pela técnica de

hidroperóxidos (CO = 1,18µmol/g; 0,58 – 1,42 e HL = 130,02µmol/g; 1,30 –

27,59), como mostra a Figura 19:

Figura 19: Avaliação do estresse oxidativo em tecido adiposo de camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas. (A) Dosagem do estresse oxidativo pela técnica de TBARS, sendo n = 6 por grupo experimental com resultados expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student; * = p<0,05. (B) Dosagem do estresse oxidativo pela avaliação da concentração de hidroperóxidos, sendo CO: n = 5 e HL: n = 9 com resultados expressos em mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney; * = p<0,05.

Resultados

86

Em relação às enzimas antioxidantes, o grupo HL (6,8U/mg ± 1,42)

aumentou significativamente a atividade da superóxido dismutase (SOD) em

relação ao grupo CO (1,76U/mg ± 0,51), porém sem alterar a atividade da

catalase (CO = 0,50∆E/min/mg ± 0,21 e HL = 0,91∆E/min/mg ± 0,23) (Figura

20).

Figura 20: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em tecido adiposo de camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento, sendo CO: n = 5 e HL: n = 7. Teste t de Student; * = p<0,05. (A) Dosagem da atividade da Superóxido Dismutase (SOD) e (B) Dosagem da atividade da catalase; p = 0,24.

A avaliação da infiltração de macrófagos através da atividade da enzima

N-acetil-glicosaminidase, mostrou que, quando analisado em relação à proteína

do tecido, não houve diferenças entre os grupos (CO = 0,92U/mg ± 0,10 e HL =

1,17U/mg ± 0,12). Porém, como é importante considerar o tamanho da massa

adiposa, ao analisarmos o número de macrófagos presentes em todo o tecido

adiposo epididimal do animal, nota-se um aumento significativo nos animais HL

em relação aos controles (HL= 0,52 U*g ± 0,16 e CO=0,14U*g ± 0,02) (Figura

21):

Resultados

87

Figura 21: Medida indireta da infiltração de macrófagos, pela dosagem da enzima N-acetilglicosaminidase em homogenatos de tecido adiposo de camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas. Resultado calculado por unidades divididas por mg de proteína do homogenato; p = 0,16 (A) e multiplicado por gramas de tecido adiposo epididimal (B). Resultados expressos em média ± erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento no tecido adiposo epididimal, sendo CO: n = 8 e HL n = 9. Teste t de Student, * = p<0,05.

O aumento do infiltrado de macrófagos foi confirmado através da

quantificação das estruturas tipo coroa (Figura 22), onde foi observada maior

quantidade de coroa de macrófagos nos animais que ingeriram dieta

hiperlipídica (0,44 coroas + 0,05) em relação aos animais que receberam dieta

controle. Esses últimos não apresentam coroas de macrófagos (Figura 23).

Figura 22: Aspecto histológico das estruturas tipo coroa ao redor dos adipócitos de tecido adiposo epididimal corado com hematoxilina-eosina. Aumento de 100x.

Resultados

88

Figura 23: Análise quantitativa das estruturas tipo coroa encontradas em tecido adiposo epididimal de camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas, calculada pela contagem de coroas de macrófagos em 10 campos, expresso em coroas por campo. Resultados expressos em média ± erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento no tecido adiposo epididimal, sendo n = 5 por grupo experimental. Teste t de Student; * = p<0,05.

5.2. O CHÁ BRANCO NA OBESIDADE INDUZIDA POR DIETA

HIPERLIPÍDICA

Após a confirmação do modelo de obesidade induzida pela dieta,

analisamos os efeitos da dieta rica em chá branco em animais obesos

comparado com animais obesos sem o chá. Assim, a comparação foi feita

entre o grupo tratado com o chá e o seu controle, ou seja, entre o grupo obeso

com chá (Ob + chá) e o grupo obeso (Ob).

Hepatotoxicidade

Antes de analisarmos os efeitos do chá, verificamos se a sua

suplementação, nos níveis vistos neste estudo, não seria deletéria. Assim,

analisamos seu efeito no fígado através da medida sérica de γGT, uma enzima

bastante sensível a pequenas alterações na função hepática. Os resultados

estavam dentro dos limites da normalidade e foram similares entre os grupos

Resultados

89

(Ob = 8,66U/L ± 1,47 e Ob + chá = 6,51U/L ± 1,04), sugerindo ausência de

hepatotoxicidade com a dose escolhida (Figura 24).

Figura 24: Dosagem de ɣGT no soro sanguíneo de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, em U/L. Sendo n = 10 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student. p = 0,25.

Ingestão calórica

A ingestão calórica e líquida não variou entre os grupos durante as 8

semanas experimentais (Figura 25), sugerindo ser o chá bem tolerado.

Resultados

90

Figura 25: Consumo calórico, p = 0,17 (A) e líquido, p = 0,06 (B), dos camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas. Os resultados foram expressos em média + erro padrão da ingestão por gaiola, ao longo das 8 semanas de experimento. n = 8. Teste t de Student.

A. Avaliação do efeito do chá branco na redução do peso corporal e suas

consequências:

Peso corporal

Não houve diferenças no peso corporal dos animais ao longo das 8

semanas, sendo o peso corporal final semelhante entre os grupos obeso e

obeso com chá (Ob = 30,54g ± 063 e Ob + chá = 31,58g ± 0,82), como

observado na Figura 26. Estes dados não sustentam um efeito do chá no

ganho de peso ao longo de 8 semanas.

Resultados

91

Figura 26: Evolução ponderal, em gramas, dos camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, Sendo Ob: n = 19 e Ob + chá: n = 20. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao longo das semanas experimentais. Teste t de Student, p > 0,05 em todos os pontos.

Eficiência alimentar

A eficiência alimentar foi calculada pela razão entre a soma de ganho de

peso por gaiola e o consumo alimentar, ao longo das semanas, e foi observado

que não houve diferença entre os grupos (Figura 27).

Figura 27: Eficiência alimentar, em gramas por kcal, de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco ao longo de 8 semanas, calculado pela divisão da soma do ganho do peso semanal (g) dos animais de cada gaiola pelo total de energia ingerida (kcal), multiplicado por 100. Sendo n = 4 por grupo experimental, por semana. Resultado expresso em média + erro padrão das gaiolas, ao longo do experimento. Teste t de Student, p > 0,05 em todos os pontos.

Resultados

92

Adiposidade Visceral:

Os dados de peso são corroborados pela medida da adiposidade

visceral (medida no sítio epididimal) que também foi semelhante entre os

grupos (Ob = 1,51; 0,84 – 4,12 e Ob + chá = 2,18; 1,05 – 4,11) (Figura 28).

Figura 28: Adiposidade epididimal, em porcentagem relativa ao peso corporal total, de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas. Sendo n = 14 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney, p = 0,67.

O resultado de adiposidade visceral foi também confirmado pela área do

adipócito epididimal (Figura 29), que apresentou áreas semelhantes entre os

grupos, independentemente da ingestão do chá (Ob = 9791µm2 ± 1257 e Ob +

chá = 10043µm2 ± 1009) (Figura 30).

Resultados

93

Figura 29: Análise histológica do tecido adiposo epididimal nos animais que receberam dieta hiperlipídica (A) ou dieta hiperlipídica acrescida de chá branco (B). Tecido corado com hematoxilina-eosina. Aumento de 100x.

Resultados

94

Figura 30: Área dos adipócitos dos camundongos C57BL/6, em µm2, que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, calculada pela média da área de 100 adipócitos por animal. Sendo n = 5 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t Student, p = 0,88.

Avaliamos também o teor de lipídeos totais no tecido adiposo epididimal

(Ob = 651,4mg/g ± 108,6 e Ob + chá = 723,5mg/g ± 56,55) que não apresentou

alterações devidas ao consumo de chá (Figura 31), confirmando os dados de

adiposidade visceral e área dos adipócitos.

Figura 31: Lipídeos extraídos do tecido adiposo epididimal de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, em mg de lipídeos por grama de tecido. Sendo n = 10 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student, p = 0,53.

Resultados

95

Infiltração de macrófagos no tecido adiposo visceral

A infiltração de macrófago é um indicativo do processo inflamatório

característico da obesidade e fortemente associado à síndrome metabólica,

pelo potencial de secreção de adipocinas destas células.

A dosagem indireta da infiltração de macrófagos, pela técnica da

dosagem da enzima N-acetilglicosaminidase (NAG), mostrou que o chá branco

não alterou a infiltração de macrófagos no tecido adiposo epididimal, quando o

resultado foi expresso por proteína (Ob + chá = 1,13U/mg ± 0,12) em relação

ao grupo que não recebeu o chá (Ob = 1,17U/mg ± 0,12), bem quando

multiplicado o resultado pela quantidade total, em gramas (Ob = 0,28 U*g; 0,16

– 0,35 e Ob + chá = 0,31U*g; 0,19 – 0,41) (Figura 32).

Figura 32: Dosagem indireta da infiltração de macrófagos em camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, pela dosagem da enzima N-acetilglicosaminidase em homogenatos de tecido adiposo epididimal calculado por proteína do homogenato, p = 0,81 (A) ou multiplicado por gramas de tecido adiposo, p = 0,26 (B). Sendo n = 7 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão ou mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student e Mann Whitney, respectivamente.

O mesmo resultado foi observado quando a infiltração de macrófagos foi

avaliada pela contagem das estruturas tipo coroa (Figura 33), no tecido adiposo

epididimal (Ob = 0,44 coroas por campo ± 0,05 e Ob + chá = 0,32 coroas por

campo ± 0,06) (Figura 34).

Resultados

96

Figura 33: Aspecto histológico das estruturas tipo coroa ao redor dos adipócitos de tecido adiposo epididimal corado com hematoxilina-eosina. Aumento de 100x.

Figura 34: Análise quantitativa das estruturas tipo coroa encontradas em tecido adiposo epididimal de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, calculada pela contagem de coroas em macrófagos em 10 campos, expresso em coroas por campo. Resultados expressos em média ± erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento no tecido adiposo epididimal, sendo n = 5 por grupo experimental. Teste t de Student, p = 0,16.

Resultados

97

B. Avaliação do chá branco como agente hipolipidêmico

Perfil de lipoproteínas e colesterol total

Em relação ao perfil colesterolêmico, não foi observado nenhum efeito

da ingestão do chá, em nenhum parâmetro observado, como demonstrado na

tabela 5:

Tabela 5: Perfil colesterolêmico Parâmetros observados no perfil colesterolêmico em camundongos C57BL/6 obesos, tratados (Obeso com chá) ou não (Obeso) com 0,5% de extrato de chá branco por oito semanas. Sendo n = 20 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média + erro padrão (aTeste t de Student) ou mediana (bMann Whitney) dos animais por grupo, ao final do experimento.

Parâmetro Obeso Obeso com chá p

Colesterol (mg/dL)a 110,8 ± 3,77 118,2 ± 4,81 0,23

HDL colesterol (mg/dL)b 78,2 (28,4 – 99,7) 53,2 (14,9 – 117,1) 0,72

Fração aterogênica

(mg/dL)b

30,0 (6,2 – 159,1) 30,6 (5,8 – 114,8) 0,99

Índice aterogênicob 0,36 (0,08 – 4,80) 0,93 (0,06 – 3,45) 0,81

Trigliceridemia e lipídeos cecais e hepáticos

Em relação aos triglicerídeos séricos, animais que receberam chá

branco (42,96mg/dL; 25,53 – 88,25) apresentaram menor concentração de

triglicerídeos séricos em relação aos animais controle (59,55mg/dL; 27,30 –

136,8), como demonstrado na Figura 35:

Resultados

98

Figura 35: Dosagem de triglicerídeos séricos em soro sanguíneo de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, em mg/dL. Sendo n = 24 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney, * = p<0,05.

Para avaliarmos se a redução dos triglicerídeos séricos era relacionada

a alterações na absorção destes, analisamos o teor de lipídeos totais no

conteúdo cecal e no fígado. Os resultados mostram que animais que ingeriram

o chá branco (118,5mg/g ± 8,09) excretaram mais triglicerídeos em relação aos

animais sem chá (88,33mg/g ± 10,48), sugerindo que a menor trigliceridemia

possa ser devido à menor absorção dietética (Figura 36).

Resultados

99

Figura 36: Lipídeos extraídos do conteúdo cecal de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato chá branco por 8 semanas, em mg de lipídeos por grama de tecido. Sendo n = 10 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student, * = p<0,05.

Em relação ao fígado, não observamos alteração na quantidade de

lipídeos pela adição de chá branco (Ob = 85,13mg/g ± 11,99 e Ob + chá =

71,02mg/g ± 11,72), como observado na Figura 37.

Esses resultados sugerem que o chá branco apresentou efeito na

absorção de lipídeos, mas sem interferir na concentração hepática desses.

Resultados

100

Figura 37: Lipídeos extraídos do tecido hepático de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato chá branco por 8 semanas, em mg de lipídeos por grama de tecido. Sendo n = 10 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student, p = 0,41.

C. Avaliação da ação do chá branco como agente hipoglicemiante

Glicemia de jejum

Em relação à dosagem de glicose, não foi observada diferença entre os

grupos experimentais (Ob = 109,2mg/dL ± 7,0 e Ob + chá = 130,2mg/dL ± 9,3),

conforme visto na Figura 38.

Resultados

101

Figura 38: Dosagem de glicemia em plasma de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, em mg/dL. Sendo n = 24 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student, p = 0,08.

Teste de Tolerância Oral à Glicose

No teste de tolerância oral à glicose não foi houve diferença entre os

animais que ingeriram ou não chá branco, ao longo do tempo, bem como na

área sob a curva (Ob = 18106U.A. + 1843 e Ob + chá = 15060U. A. + 1830),

como observado na Figura 39.

Figura 39: Teste de tolerância oral à glicose, em camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, mostrado em percentual de variação da glicemia ao longo do tempo, p > 0,05 em todos os pontos (A) e área sob a curva, p = 0,27 (B). Os resultados foram expressos em média + erro padrão, ao final do experimento. Teste t de Student.

Resultados

102

Teste de sensibilidade à insulina:

O teste de sensibilidade à insulina também não evidenciou diferenças

entre os grupos, quando o tempo após administração de insulina ou a área total

sob a curva foram observados (Ob = 1999U. A. + 172,6 e Ob + chá = 2553U. A.

+ 346,3) (Figura 40).

Figura 40: Teste de sensibilidade à insulina, em camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, mostrado em percentual de variação da glicemia ao longo do tempo, p > 0,05 em todos os pontos (A) e área sob a curva, p = 0,19 (B). Os resultados foram expressos em média + erro padrão, ao final do experimento. Teste t de Student.

Os resultados de glicemia de jejum, tolerância à glicose e sensibilidade à

insulina em conjunto não sustentam qualquer efeito da ingestão de chá branco

na homeostase de glicose como sugerido popularmente.

D. Avaliação do chá branco como antioxidante

Tecido adiposo

O estado oxidativo foi estudado através de 2 técnicas: Substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS (ou concentração de MDA) e

concentração de hidroperóxidos. No tecido adiposo, o chá branco foi capaz de

reduzir a concentração de malondialdeído (produto da peroxidação) obtido pela

técnica de TBARS (Ob = 0,23µmol/g ± 0,03 e Ob + chá = 0,14µmol/g ± 0,04).

Porém, nenhuma diferença foi observada quando o estado oxidativo foi

Resultados

103

avaliado pela técnica de concentração de hidroperóxidos (Ob = 10,02µmol/g;

1,28 – 27,59 e Ob + chá = 5,94µmol/g; 0,69 – 32,72) (Figura 41).

Figura 41: Dosagem de estresse oxidativo em homogenato de tecido adiposo de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, (A) pela técnica de TBARS (Teste t de Student, resultados expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento) e (B) pela dosagem da concentração de hidroperóxidos (Mann Whitney, resultados expressos em mediana dos animais por grupo, ao final do experimento, p = 0,54), sendo Ob: n = 9 e Ob + chá: n = 8. * = p<0,05

Em relação à atividade de enzimas antioxidantes no tecido adiposo, o

chá branco não alterou a atividade, tanto da SOD (Ob = 6,84U/mg de ptn ±

1,42 e Ob + chá = 5,85U/mg de ptn ± 1,12), como da catalase (Ob =

0,88∆E/min/mg de ptn ± 0,21 e Ob + chá = 1,67∆E/min/mg de ptn ± 0,37)

(Figura 42).

Resultados

104

Figura 42: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em homogenato de tecido adiposo de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas. (A) Atividade da SOD, p = 0,60 e (B) atividade da catalase, p = 0,09, sendo Ob: n = 8 e Ob + chá: n = 9. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student.

Estes dados sugerem haver um efeito antioxidante que não depende da

ação celular exercida pelas enzimas SOD e catalase.

Fígado

O estresse oxidativo foi também avaliado em outro sítio. No fígado, o

efeito do chá branco foi mais proeminente, com diminuição significativa do

estresse oxidativo, tanto pela dosagem de MDA (Ob = 0,039µmol/g ± 0,004 e

Ob + chá = 0,025µmol/g ± 0,003), quanto pela concentração de hidroperóxidos

(Ob = 18,19µmol/g ± 45,35 e Ob + chá = 4,97µmol/g ± 1,52) (Figura 43).

Resultados

105

Figura 43: Dosagem de estresse oxidativo em homogenato de tecido hepático de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, (A) pela técnica de TBARS (n = 10 por grupo experimental) e (B) pela dosagem da concentração de hidroperóxidos (n = 7 por grupo experimental). Os resultados foram expressos em média ± erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student; * = p<0,05 Tendo sido o chá branco capaz de diminuir o estresse oxidativo

hepático, foi dosada a atividade das enzimas antioxidantes superóxido

dismutase (SOD) e catalase no fígado. Mais uma vez, não houve alteração da

atividade das enzimas hepáticas SOD (Ob = 0,517U de SOD/mg de ptn ± 0,04

e Ob + chá = 0,531U de SOD/mg de ptn ± 0,04), ou da catalase (Ob =

0,161∆E/min/mg de ptn ± 0,036 Ob + chá = 0,140∆E/min/mg de ptn ± 0,025)

após a ingestão do chá (Figura 44).

Resultados

106

Figura 44: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em homogenato de tecido hepático de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas. (A) Atividade da SOD (n = 10 por grupo experimental, p = 0,82) e (B) atividade da catalase (n = 9 por grupo experimental, p = 0,56). Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student.

Soro

Para avaliar o estado oxidativo no soro, utilizamos a técnica da detecção

de dieno conjugado ao longo do tempo. Neste sítio, não foi visto efeito do chá

em camundongos obesos (Ob = 12,0 minutos ± 1,9 e Ob + chá = 11,2 minutos

± 1,2) (Figura 45).

Figura 45: Fase de latência da formação de dienos conjugados, dosada em soro de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, expressa em minutos. Sendo n = 5 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student, p = 0,73.

Resultados

107

Na avaliação do estresse oxidativo no soro, além do dieno conjugado,

pode-se avaliar a concentração indireta de LDL oxidada. Esta análise é uma

medida especialmente importante, pois mostra não só a presença do estresse

oxidativo, mas também de um importante fator de risco para doença

aterosclerótica. A LDL oxidada, foi medida no soro indiretamente, através da

dosagem do anticorpo anti-LDL oxidada. Os resultados não mostraram

diferenças em sua quantificação (Ob = 27,0U.A.; 9,0 – 49,0 e Ob + chá =

20,0U.A.; 3,5 – 47,5), como demonstrado na Figura 46.

Figura 46: Dosagem indireta de LDL oxidada pela técnica de ELISA para anticorpos anti-LDL oxidada, em soro de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, expressa em Unidades Arbitrárias. Sendo Ob: n = 9 e Ob + chá: n = 10. Os resultados foram expressos em mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Mann Whitney, p = 0,33.



108

6. DISCUSSÃO

Discussão

109

6.1. Do modelo de obesidade

O modelo de obesidade induzida por dieta pode ser vantajoso em

relação aos modelos de obesidade genética, visto que, indivíduos obesos, em

sua grande maioria, apresentam peso elevado devido ao desequilíbrio entre

ingestão e gasto energéticos (MENDONÇA e ANJOS, 2004, BUETTNER et al.,

2007). Além disso, levantamentos genéticos populacionais, mostram que as

deficiências genéticas relacionadas aos modelos de obesidade em roedores,

têm prevalência baixa em indivíduos com obesidade por causas genéticas

(RANKINEN et al., 2006; FAROOQI E O’RAHILLY, 2005).

Em nosso estudo, utilizamos uma dieta hiperlipídica com 61% de energia

sob a forma de gordura, oferecida a camundongos C57BL/6, durante 8

semanas, com intenção de induzir obesidade. Embora diversos trabalhos

tenham utilizado dietas hiperlipídicas para indução da obesidade em ratos (LI et

al., 2008; MILAGRO et al., 2006) ou camundongos (SOHET et al., 2009; YAN

et al., 2009; HAGIWARA et al., 2009; BALWIERZ et al., 2009; HOFFLER et al.,

2009; DEFURIA et al., 2009; VIEIRA et al., 2009; NAGATA et al., 2008;

YAMATO et al., 2007), não há um padrão para sua composição. Assim, há

variação da quantidade de calorias oferecidas, principalmente na forma de

gordura, entre 40% (NAGATA et al., 2008) e 72% de lipídeos (SOHET et al.,

2009). O consumo diário de uma dieta com 60% de energia sob a forma de

gordura leva à alteração no peso e composição corporais, componentes do

sangue, alteração da expressão gênica e alterações na função hepática e renal

(HOFFLER et al., 2008). Apesar dessa variabilidade, todos os estudos citados

mostraram aumento do peso final e da adiposidade epididimal dos animais que

se alimentaram da dieta hiperlipídica.

Optamos for fazer uma dieta com cerca de 60% das calorias como

lipídeos por saber que nesta, a presença de estresse oxidativo secundário ao

excesso de lipídeos é uma importante alteração, o que seria adequado para o

estudo de suplementação do chá branco, pelas suas propriedades

antioxidantes. Embora o teor de proteínas a dieta indutora de obesidade seja

menor do que a ração comercial utilizada, não foram observados sinais de

Discussão

110

desnutrição nos animais, tal como redução da ingestão alimentar e do peso

corporal, tendo sido observado exatamente o oposto, conforme já discutido.

Sendo, a substituição parcial de proteínas por lipídeos em dietas indutoras de

obesidade não representa um fator prejudicial no desenvolvimento dos animais.

Nossos resultados também mostraram maior peso e adiposidade

corporais (Figuras 13 e 14), bem como aumento no tamanho do adipócito

(Figuras 15 e 16) em relação aos animais controle. Vieira e col. (2009) também

relatam aumento do percentual de tecido adiposo epididimal em camundongos

C57BL/6. O maior ganho de peso dos animais que receberam dieta

hiperlipídica é condizente com a maior ingestão calórica (Figura 12), visto que a

densidade calórica dessa dieta é 5,21kcal/g, mais que o dobro da dieta controle

(2,18kcal/g). No estudo de DeFuria e col. (2009), no qual foi oferecida dieta

hiperlipídica (60% de energia como gordura) ou dieta controle a camundongos

C57BL/6 por 8 semanas, foi também observada maior ingestão calórica com

consequente maior ganho de peso e adiposidade.

Em humanos, a ingestão da dieta rica em lipídeos de origem animal leva

ao aumento das lipoproteínas ricas em colesterol e triglicerídeos circulantes no

sangue (ALVAREZ-LEITE, 1995). Em nosso estudo, não observamos aumento

de triglicerídeos com a ingestão da dieta (Tabela 4). Camundongos C57BL/6 já

são descritos como resistentes ao desenvolvimento de hipertrigliceridemia

(NAGATA et al., 2008; MEIR e LEITERSDORF, 2004; SCHREYER et al.,

2002), o que justifica nossos resultados. Porém, encontramos alteração

significativa do perfil colesterolêmico (Tabela 4) do animal que consumiu dieta

hiperlipídica, mostrando que a dieta, além de induzir obesidade, aumenta o

risco de aterosclerose por aumentar o colesterol total e reduzir o colesterol em

HDL, aumentando assim a fração aterogênica no sangue. Yamato e col. (2007)

também observaram que uma dieta hiperlipídica oferecida por tempo

prolongado foi capaz de levar ao aumento de colesterol total, LDL colesterol e

diminuição de HDL colesterol no sangue de camundongos C57BL/6.

A glicemia também é afetada pela obesidade, uma vez que a resistência

à insulina é um dos seus quadros mais comuns. Em nosso estudo, porém, não

foram observadas alterações na glicemia de jejum nos camundongos que

receberam a dieta hiperlipídica (Tabela 4). Este resultado está de acordo com

Discussão

111

os achados de Hoffler e col. (2009), que não observaram aumento da glicose

em animais que receberam dieta hiperlipídica (60% de energia sob a forma de

gordura) durante oito semanas. Acredita-se que não houve alteração da

glicemia de jejum nos camundongos que receberam dieta hiperlipídica devido a

uma hiperinsulinemia compensatória. Aumento na glicemia de animais que

ingeriram dieta hiperlipídica em relação aos que ingeriram dieta controle é

observado em estudos experimentais nos quais a dieta hiperlipídica possui

maior teor de lipídeos (SOHET et al., 2009), maior duração do experimento

(YAN et al., 2009; NAGATA et al., 2008 e YAMATO et al., 2007) ou diferentes

linhagens de animais, por exemplo, o camundongo neozelandês (BALWIERZ et

al., 2009). Dessa forma, é possível que os resultados controversos da literatura

em relação à hiperglicemia em animais que recebem dieta hiperlipídica sejam

decorrentes de diferente composição de dieta, maior de tempo de experimento

ou diferente linhagens do animal.

O estresse oxidativo aumentado na obesidade está relacionado com o

desenvolvimento e evolução das complicações como a resistência insulínica e

o diabetes mellitus tipo 2. Este fato foi visto por nós pelo resultado de TBARS e

atividade de SOD hepáticos (Figuras 17 e 18) e por diversos outros estudos

(HAGIWARA et al., 2009; NAGATA et al., 2008; QATANANI E LAZAR, 2007;

FRIDLYAND e PHILIPSON, 2006; HOUSTIS et al., 2006; FURUKAWA et al.,

2004). O aumento da atividade da SOD pode ser visto como uma tentativa de

eliminar íons superóxido que ocorrem em situações de estresse oxidativo

(MIAO e ST. CLAIR, 2009). Nagata e col. (2008), utilizando camundongos

C57BL/6 tratado com dieta hiperlipídica (40% de energia como gordura) por 24

semanas, observaram aumento do estresse oxidativo no fígado, sem o

aumento da expressão do mRNA das enzimas antioxidantes SOD e glutationa

peroxidase. Porém deve-se ressaltar que é possível que ocorra aumento da

atividade da enzima, independentemente do aumento de sua expressão. Nesse

mesmo estudo, o estresse oxidativo e expressão da SOD não foram alterados

no tecido adiposo. Porém níveis elevados de glutationa peroxidase foram

observados, indicando que essa enzima estava atuando no balanço oxidativo.

Nossos resultados mostraram aumento do estresse oxidativo no tecido adiposo

e da atividade da SOD nesse tecido (Figuras 19 e 20). Não houve alteração da

Discussão

112

atividade da catalase, tanto no fígado (Figura 18), como no tecido adiposo

(Figura 20). A principal ação da catalase é a transformação do peróxido de

hidrogênio em água e oxigênio (POWERS e JACKSON, 2008). A enzima

glutationa peroxidase, não investigada em nosso estudo, também atua na

degradação do peróxido de hidrogênio e poderia estar realizando essa função.

Dessa forma, é possível que SOD tenha sua atividade aumentada no tecido

adiposo e no fígado em uma tentativa que controlar o estresse oxidativo.

No presente estudo encontramos aumento significativo na ativação de

macrófagos no tecido adiposo epididimal, como sugerido indiretamente pela

atividade da enzima N-acetil-glicosaminidase (NAG) (Figura 21) e diretamente

pela contagem das estruturas tipo coroa (Figura 23). Esse resultado está de

acordo com o resultado encontrado por diversos autores, que observaram

aumento da infiltração de macrófagos através de imuno-histoquímica

(NISHIMURA et al., 2009; MAMANE et al., 2009; YAN et al., 2009; VIEIRA et

al., 2009).

É importante ressaltar que o aumento da atividade de NAG relativo à

proteína do tecido não foi diferente. Assumindo que a quantidade de proteína

representa uma normalização do número de células no tecido, independente do

seu conteúdo lipídico, pode-se concluir que os macrófagos presentes no tecido

epididimal estão igualmente ativados. Porém, ao se considerar o tecido adiposo

epididimal como um todo (seu volume total), a atividade é significativamente

maior nos animais submetidos à dieta hiperlipídica. Estes dados levam à

sugestão de que ocorre uma maior infiltração de macrófagos com a dieta pelo

aumento do tecido adiposo, e não uma maior ativação do macrófago

individualmente. Este resultado é confirmado do número de macrófagos

agrupados nas estruturas tipo coroa que foi maior no tecido adiposo visceral de

animais alimentados com dieta hiperlipídica. DeFuria e col. (2009) observaram

o aumento da expressão de marcadores para macrófagos em tecido adiposo

de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica com 60% de

energia sob forma de gordura por oito semanas em relação aos controles.

Também foi observado aumento na expressão de TNFα e MCP-1, além do

aumento das estruturas coroa de macrófagos e do tamanho do adipócito, o que

está de acordo com nossos resultados.

Discussão

113

O acúmulo de macrófagos no tecido adiposo é o principal responsável

pelo aumento de citocinas inflamatórias como TNFα e IL-6 levando à condição

de inflamação de baixo grau associada ao excesso de gordura corporal

(BOULOUMIE et al., 2005). Propostas têm sido feitas para explicar esse

aumento da infiltração de macrófagos no tecido adiposo de obesos

(HEILBRONN e CAMPBELL, 2008). Com o aumento da quantidade e do

tamanho do tecido adiposo, ocorre maior liberação de fatores inflamatórios ou

quimiotáticos para macrófagos, como leptina, TNFα, IL-6, MCP-1 (PEAKE et

al., 2006). Outra proposta seria a ingestão nutricional exagerada

(“overnutrition”) caracterizada por uma ingestão energética excessiva

prolongada ou ingestão aumentada de ácidos graxos. Essa nutrição excessiva

pode levar ao maior acúmulo de macrófagos via ativação de receptor tipo toll 4.

Os ácidos graxos saturados podem ativar a via toll4-NFκB nos adipócitos

aumentando a infiltração de macrófagos nos mesmos (TSUKUMO et al., 2007).

Outra hipótese é a hipóxia, já que, com o aumento de tecido adiposo, ocorre

aumento do fator indutor de hipóxia alfa (YE et al., 2007). Essas áreas de

hipóxia levam à morte de adipócitos, induzindo à formação das estruturas tipo

coroa de macrófagos em torno do adipócito morto, co-localizando áreas de

hipóxia e macrófagos (HEILBRONN e CAMPBELL, 2008; STRISSEL et al.,

2007). Além disso, Charriere e col. (2003) demostraram, estudando pré-

adipócitos implantados na cavidade peritoneal, que estes podem ser

transformados em macrófagos, levantando a hipótese de que pré-adipócitos

podem ser convertidos não só em adipócitos, mas também em macrófagos no

tecido adiposo.

Em resumo, considerando os dados mostrados acima, conseguimos

desenvolver em 8 semanas, um modelo de obesidade induzida por dieta, com

aumento de estresse oxidativo no fígado e no tecido adiposo, piora do perfil

colesterolêmico e com inflamação moderada do tecido adiposo, típicos da

obesidade e síndrome metabólica vistas em humanos.

Esse modelo é adequado para o estudo da obesidade e tem a vantagem

de estabelecer o quadro de obesidade e suas complicações mais rapidamente

que a maioria daqueles já descritos na literatura (YAN et al., 2009; HAGIWARA

et al., 2009; HOFFLER et al., 2009; LI et al., 2008; NAGATA et al., 2008;

Discussão

114

YAMATO et al., 2007). Especificamente, conseguimos em 8 semanas de dieta,

obter um peso corporal final cerca de 50% maior que os animais em dieta

controle. Além disso, desenvolvemos um bom modelo para estudo de

obesidade visceral, visto que a adiposidade epididimal foi aumentada não só

em termos absolutos, mas também como percentual do peso corporal total (já

aumentado nos animais com dieta hiperlipídica). Além disso, o modelo

preenche alguns critérios para o diagnóstico de síndrome metabólica, como

aumento da adiposidade visceral, diminuição do HDL colesterol e sinais de

inflamação do tecido adiposo.

6.2. Do efeito do chá branco em relação às suas alegações

populares (redução da obesidade, hipoglicemiante,

hipocolesterolêmico e antioxidante)

Após a constatação de que obtivemos um modelo adequado de

obesidade, nosso próximo objetivo foi investigar em estudo controlado, o efeito

do chá banco na obesidade e em algumas de suas principais consequências

como diabetes mellitus tipo 2, dislipidemias e aumento do estresse oxidativo.

A opção de investigar este chá na obesidade é sustentada pelo fato de

que em indivíduos obesos ocorre um aumento do estresse oxidativo. O chá

branco, já foi previamente descrito como antioxidante (THRING et al., 2009;

SEERAM et al., 2008; KOUTELIDAKIS et al., 2008; CALZUOLA et al., 2006) e

também como anticarcinogênico (WANG et al., 2008; ANGER et al., 2005;

ORNER et al., 2003; ORNER et al., 2002; DASHWOOD et al., 2002;

SANTANA-RIOS et al., 2001). Por isso, um de nossos objetivos foi observar se

os efeitos antioxidantes eram mantidos mesmo na presença de um estímulo

pró-oxidante como é o caso da obesidade induzida pela dieta. Além disso,

como citado anteriormente, embora o chá branco seja popularmente usado

para emagrecimento, ainda não existem estudos científicos sobre seu efeito na

obesidade.

Em nosso estudo, optamos por oferecer o extrato de chá branco em pó

suplementado na dieta, em uma proporção de 0,5% do peso final da dieta.

Discussão

115

Essa dose correspondeu a uma ingestão de, em média, 400mg de extrato de

chá branco por kg de peso do animal por dia. Segundo cálculos de Bruno e col.

(2008) baseados na ingestão energética, essa quantidade é equivalente a três

xícaras (140mL cada) de chá branco por dia, para humanos. Esta ingestão é

viável e corresponde ao volume ingerido por muitos que querem perder peso

com o chá. A opção pela administração do extrato de chá branco na dieta e

não na água visou a melhor aceitação do suplemento pelos animais e a

garantia da ingestão (uma vez que associado a outros nutrientes, a ingestão

passa a ser compulsória). Essa dose estava dentro dos parâmetros de

normalidade para todos os animais e não se mostrou tóxica, como confirmado

pela evolução ponderal (Figura 26), eficiência alimentar (Figura 27) e pela

dosagem de ɣGT hepática (Figura 24). A ɣGT é uma enzima liberada no

sangue logo após algum dano tóxico ao fígado (ROE, 1993). A preocupação

com a hepatotoxicidade vem da correlação com os resultados de Lambert e

col. (2009) relativos ao chá verde. Os autores observaram que, em

camundongos, uma dose de chá verde de 1500mg/kg de peso gera dano

hepático, com aumento de alanina aminotransferase plasmática (ALT), IL-6 e

MCP-1 plasmáticos, além de necrose hepática moderada. Takami e col. (2008)

estimaram que a dose máxima de chá verde que não causa efeitos adversos

para ratos é 764mg/kg peso/dia para machos e 820mg/kg peso/dia para

fêmeas. Com concordância com nossos resultados com o chá branco, esses

autores também não encontraram alteração na ɣGT plasmática, quando doses

de 0,3 a 5% de extrato de chá verde foram ofertadas a ratos, em comparação

aos controles.

Levando-se em conta a atribuição popular do chá branco para perda de

peso, não foi observado efeito do chá branco em nenhum dos parâmetros

ligados ao peso ou adiposidade dos animais. Como observado, a evolução

ponderal foi similar entre os grupos ao longo das 8 semanas, resultando em um

peso final semelhante entre eles (Figura 26). Embora a perda de peso seja a

alegação mais forte que leva ao uso dos chás desta planta, ainda faltam dados

suficientes para sustentá-la, mesmo se considerarmos o chá verde, já bastante

estudado. Em estudos com chá verde, alguns autores não encontraram perda

de peso ou mesmo menor ganho de peso (MAKI et al., 2009; KIM et al., 2009;

Discussão

116

BELZA et al., 2009; HSU et al., 2008; BRUNO et al., 2008). Já em outros, os

autores encontraram efeitos do chá verde ou da epigalocatequina galato

(EGCG) na redução ou menor ganho de peso corporal (RICHARD et al., 2009;

SOGAWA et al., 2009; AUVICHAYAPAT et al., 2008; NOMURA et al., 2008;

NAGAO et al., 2007; KHAN et al., 2007; ZHENG et al., 2004; HASEGAWA et

al., 2003; MURASE et al., 2002, MIURA et al., 2001). Essas diferenças nos

resultados são decorrentes de vários fatores, como diferenças nos tempos

experimentais, na dieta utilizada, na ingestão calórica ou na espécie do animal

utilizada. Assim, em relação ao chá branco, ou mesmo ao chá verde, não há

evidências suficientes na literatura para sustentar o uso destes chás para o

controle do peso corporal.

A falta de propriedades emagrecedoras do chá branco é confirmada pela

ausência de diferença em um parâmetro definitivo e mais acurado na definição

da obesidade, a adiposidade. Assim, na maioria dos parâmetros referentes à

expansão do tecido adiposo como adiposidade visceral (Figura 28), área dos

adipócitos (Figuras 29 e 30) e quantidade de lipídeos no tecido adiposo (Figura

31) a ingestão do chá branco foi incapaz de mostrar efeitos benéficos. Esses

resultados também poderiam ser previstos pelos resultados de ganho de peso.

Nossos resultados de adiposidade estão de acordo com os de diversos outros

já publicados utilizando chá verde (RICHARD et al., 2009; KIM et al., 2009;

NOMURA et al., 2008; ZHENG et al., 2004), mas em desacordo com outros

que mostraram redução da adiposidade pelo uso do chá verde ou da ECGC

(MAKI et al., 2009; SOGAWA et al., 2009; BOSE et al., 2008; BRUNO et al.,

2008.; NAGAO et al., 2007; HASEGAWA et al., 2003; MURASE et al., 2002).

Estas essas diferenças, assim como a do peso, podem ser decorrentes das

variações entre os experimentos, como tipo do animal, idade e dieta oferecida.

Em um estudo in vitro (SÖHLE et al., 2009), realizado em pré-adipócitos e

adipócitos humanos, foi observado que o chá branco diminuiu a incorporação

de triglicerídeos durante a adipogênese de forma dose dependente, e diminuiu

a expressão mRNA de fatores também relacionados à adipogênese (PPARγ,

ADD1/SREBP-1c, C/EBPαand C/EBPδ). O chá branco também foi capaz de

aumentar a atividade lipolítica nos adipócitos. Estes resultados in vitro

Discussão

117

divergem dos nossos, pois o aumento da atividade lipolítica acarretaria

hipertrigliceridemia, o que não foi constatado em nossos experimentos.

A infiltração e atividade de macrófagos no tecido adiposo também não

são afetadas pela ingestão do chá branco (Figuras 32 e 34). Em relação a este

parâmetro, não existem estudos indicados no PUBMED que avaliem o efeito do

chá branco ou mesmo do verde na infiltração de macrófagos no tecido adiposo.

Existe apenas uma referência indireta feita por Bose e col. (2008) onde a

ingestão de chá verde foi capaz de diminuir a concentração de MCP-1

circulante, um dos principais fatores quimiotáticos para macrófagos. Este

resultado, porém, não pode ser relacionado à migração adipocitária de

macrófagos, pois MCP-1 apenas indica a migração para um sítio inflamado,

que pode ser em diversos órgãos, como coração.

Em nosso estudo, o chá branco também foi capaz de diminuir os

triglicerídeos séricos (Figura 35). Esse dado está de acordo com os resultados

de Richard e col. (2009), em camundongos nocaute para o gene ob; de Bose e

col. (2008) em camundongos C57BL/6 recebendo epigalocatequina galato

(EGCG) e Fallon e col. (2008), onde foi oferecida uma mistura de chá verde e

preto a ratos Sprague-Dawle. Os últimos também observaram maior excreção

de lipídeos após a ingestão da mistura de chás. Este dado está em

concordância com nosso trabalho, onde observamos uma maior concentração

de lipídeos no conteúdo cecal de animais que ingeriram o chá branco (Figura

36) e nenhuma alteração nos lipídeos hepáticos (Figura 37), sugerindo que a

diminuição dos triglicerídeos séricos pode ser devida a uma menor absorção e

maior excreção destes. Também observamos que não há diferença no

conteúdo de lipídeos no tecido adiposo epididimal (Figura 30), sugerindo que o

chá não aumentou o armazenamento de lipídeos no tecido adiposo. Como foi

observada diminuição na trigliceridemia e aumento da excreção de lipídeos, era

esperado que ocorresse emagrecimento dos animais. Porém explica-se que a

excreção aumentada de lipídeos, bem como a diminuição dos triglicerídeos

séricos não foram suficientes para acarretar perda de peso, visto que, os

animais obesos controles excretaram 0,8kcal por grama de conteúdo cecal,

enquanto os animais obesos que receberam o extrato de chá branco

excretaram 1,1kcal por grama de conteúdo cecal. Essa diferença de calorias

Discussão

118

excretadas pelos diferentes grupos não foi suficiente para interferir no peso

final dos animais. A literatura disponível utilizando o chá verde e suas

catequinas mostra que estes podem melhorar o perfil lipídico por diminuir a

hidrólise luminal dos lipídeos e, consequentemente, reduzir sua absorção

intestinal (BABU et al., 2008; KOO e NOH, 2007). Além disso, já foi descrito

que as catequinas regulariam a expressão dos receptores hepáticos de LDL,

modulando a biossíntese, excreção e processamento intracelular dos lipídeos

(BABU et al., 2008; KOO e NOH, 2007; VITA, 2003). Como a concentração

circulante de LDL em camundongos é insignificante, estes receptores seriam

importantes na retirada de VLDL, carreadora de triglicerídeos e a principal

lipoproteína aumentada em dietas hiperlipídicas, o que condiz com nossos

resultados.

Em relação ao perfil colesterolêmico, não foi observado nenhum efeito

do chá branco (Tabela 5). Não há trabalhos na literatura sobre os efeitos do

chá branco na colesterolemia. Os estudos com chá verde também são

controversos a este respeito. Alguns autores encontraram redução da

colesterolemia em camundongos (RICHARD et al., 2009; KIM et al., 2009) e

outros não observaram diferenças (FARDET et al., 2008; ZHENG et al., 2004).

A controvérsia também existe em estudos clínicos, onde o chá verde ou suas

catequinas reduziram a colesterolemia em alguns estudos (HSU et al., 2008;

NAGAO et al., 2007) e não em outros (MAKI et al., 2009). Nossos resultados

parecem pertinentes, já que, como regra, agentes antioxidantes (como os chás

verde e branco) não alteram quantitativamente as lipoproteínas e colesterol

circulantes. Em vez disso, sua ação é mais qualitativa, reduzindo o estresse

oxidativo que levaria à formação de LDL anormais (oxidadas) e ativaria

macrófagos, ambos, fatores cruciais para a formação da placa aterosclerótica.

Embora a obesidade seja fator de risco para a resistência insulínica

(QATANANI e LAZAR, 2007), não observamos alteração nesse parâmetro. Em

relação ao perfil glicêmico, não foram observadas alterações na glicemia de

jejum, assim como nos testes de sensibilidade à insulina e tolerância oral à

glicose (Figuras 38 a 40), usados para detectar resistência insulínica. Esse

resultado está de acordo com a maioria dos trabalhos utilizando chá verde

(NOMURA et al., 2009; VENABLES et al., 2008). Nos trabalhos onde ocorre

Discussão

119

melhora deste parâmetro, a dose oferecida de chá verde foi de 3%, dose esta 6

vezes maior do que a oferecida em nosso trabalho (KHAN et al., 2007) ou o

tempo experimental foi de 16 semanas, o dobro da duração do presente estudo

(BOSE et al., 2008). Em adição, estudos clínicos com obesos ativos ou

inativos, também não sustentam a ação do chá verde na melhora da glicemia

(MAKI et al., 2009; HSU et al., 2008).

Como muitas das complicações da obesidade estão associadas ao

estresse oxidativo, a redução deste pode levar à menor incidência de

complicações como resistência insulínica, diabetes mellitus tipo 2 e doenças

cardiovasculares (FURUKAWA et al., 2004). Diversos estudos mostraram o

efeito antioxidante do chá branco (THRING et al., 2009; SEERAM et al., 2008;

KOUTELIDAKIS et al., 2008; CALZUOLA et al., 2006) e do chá verde (PANZA

et al., 2008; KHAN et al., 2007; HSU et al., 2007; SABU et al., 2002;

SKRZYDLEWSKA et al., 2002; YOKOZAWA et al., 2002). Nossos resultados

confirmam a ação antioxidante atribuída a este chá em tecidos, mas não no

sangue (Figuras 45 e 46). Isto é devido, provavelmente, ao fato de que os

antioxidantes predominantes no sangue (bilirrubinas, ácido úrico, glutationa,

ubiquinona, etc.) foram suficientes para prevenir o aumento no estresse

oxidativo ocasionado pela dieta. Porém, o chá branco foi capaz de diminuir o

estresse oxidativo no fígado e tecido adiposo (figuras 43 e 41). Como

esperado, esse efeito não foi devido à alteração da atividade das enzimas

antioxidantes SOD e catalase (Figuras 42 e 44), que se mantiveram inalteradas

após o uso do chá. Já é descrito na literatura que os polifenóis, um dos

principais componentes do chá branco, podem atuar como antioxidantes

diretos ou indiretos. De forma direta, os polifenóis removem espécies reativas

de oxigênio e nitrogênio e quelam íons metálicos de transição redox-ativos. De

forma indireta, eles poderiam inibir fatores de transcrição redox-sensíveis,

como o NFκB e o ativador de proteína 1 (AP-1), inibir enzimas pró-oxidantes,

como iNOS, lipoxigenases, cicloxigenases e xantina oxidase ou ativar enzimas

antioxidantes, como a glutationa peroxidase e superóxido dismutase (FREI e

HIGDON, 2003). Como a atividade da SOD e catalase não foram afetadas pela

ingestão de chá branco em nossos experimentos, é possível que este esteja

atuando principalmente de forma direta, como quelante de metais de transição,

Discussão

120

já que o chá é composto de catequinas com seus grupamentos redutores como

hidroxila (OH), grupamento galato (3,4,5 trihidroxil) e o grupamento catecol

(orto 3-4 dihidroxil) nas suas extremidades. O chá branco poderia ainda inibir

fatores de transcrição redox-sensiveis como o NFκB e AP-1.

A diminuição do estresse oxidativo e dos triglicerídeos circulantes pode

ser protetor no desenvolvimento das complicações da obesidade. Naderali e

col. (2001) viram em seu estudo que a hipertrigliceridemia induziu disfunção

endotelial, contribuindo para o potencial aterogênico. O aumento do estresse

oxidativo, por si só, também é risco para desenvolvimento de doenças

cardiovasculares (VOGIATZI et al., 2009). Estes podem ser mecanismos para o

efeito protetor do chá branco no desenvolvimento da aterosclerose. Estes

dados também sugerem um efeito benéfico da suplementação do chá branco

nos casos de hipertrigliceridemia, visto que sua ingestão reduz tanto a

absorção intestinal como a concentração de triglicerídeos no sangue.

Em resumo, de todas as alegações populares do chá branco, nossos

resultados suportam apenas seu papel como antioxidante direto em órgãos

como fígado e tecido adiposo e sugerem um efeito benéfico trigliceridemia pela

menor absorção de gordura.



121

7. CONCLUSÃO

Conclusão

122

Em nosso trabalho, foi possível desenvolver um modelo experimental

rápido de obesidade induzida por dieta com características semelhantes às

vistas clinicamente como aumento do peso corporal e adiposidade visceral

assim como piora do perfil colesterolêmico com aumento do estresse oxidativo

e moderado grau de inflamação.

Em relação ao efeito do chá branco na obesidade e suas complicações,

concluímos que a maioria dos efeitos alegados do chá não puderam ser

suportados experimentalmente. Apesar disso, o chá ainda foi capaz de atuar

como antioxidante, diminuindo o estresse oxidativo em órgãos alvo, além de

reduzir a absorção lipídica, acarretando redução dos triglicerídeos no sangue.

Estes últimos resultados apontam para um efeito benéfico do consumo do chá

para as complicações da obesidade ligadas a estes fatores como,

aterosclerose, hipertrigliceridemia, doenças ligadas ao aumento de radicais

livres e o diabetes mellitus tipo 2.



123

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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140

9. ANEXO

Anexo

141

9.1. Protocolo de Aceitação do CETEA - no. 116/09

Anexo

142

9.2. Composição da dieta comercial Labina®, segundo o fornecedor

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