Cinética Enzimatica atual

CinéticaEnzimática

Enzimas são proteínas que agem comocatalisadores biológicos:

enzima

CompostoComposto A A ((substratosubstrato))

CompostoComposto BB ((produtoproduto))

Centro ativoou

sítio catalíticode uma enzima é a porçãoda molécula onde ocorre a

atividade catalítica

Observe que não há consumoou modificação permanente da

enzima

Reação catalisada pela enzima

TeoriaTeoria dada catcatááliselise

No equilíbrio da reação, as velocidades das reações se igualam: v1 = v-1

- concentrações de todos os reagentes não se alteram mais- pode se dizer que a reação terminou

Catalisador acelera as velocidades de ambos os lados da reação

- o ponto do equilíbrio é atingido mais rápido

- o ponto do equilíbrio não se altera, ou seja [reagentes] e de [produtos] no “final” da reação” são as mesmas dareação não catalisada

- termodinâmica da reação não se altera

Catalisador não é consumido na reação pode atuar em [ ] baixas

A + B CA + B Cv1

v-1

Considere as reações:

Um Catalisador diminui a barreira energética criando percursos alternativosda reação para formação do estado de transição.

Energia de ativação ou barreiraenergética:

quantidade de energiaque é preciso fornecer aosreagentes para a reação ocorrer

Estado de transição oucomplexo ativado:

forma molecular inter-mediária entre o reagente e o produto, existe somenteno alto da barreiraenergética.

É altamente instável.Progresso da reação

Ene

rgia

Estado de transição

Reação não catalisada

Reação catalisada

Energia de

ativação

Substrato (S)

Produto (P)

TeoriaTeoria dada catcatááliseliseO gráfico mostra a variação de energia ao longo de uma reação.

Enzimaholozima

Apoenzimaparte proteica

Grupo prostético

metal

coenzima

cofator

Coenzima Reação com Vitamina

Biocitina CO2 Biotina

Coenzima A Grupos acil Ác. Pantotênico

Coenzima B12 H e grupos alquil Vitamina B12

FAD, FMN óxido-redução Riboflavina

NAD, NADP óxido-redução Niacina

Fosfato de piridoxal Grupos aminos Piridoxina

Pirofosfato Tiamina Grupos aldeídos Tiamina

Tetrahidrofolato unidades C Ácido fólico

Algumas proteínas, enzimas em especial, contêm em sua molécula uma porção não proteica, que é essencial para atividade biológica.

Distinção entre cofator e coenzima depende da força de ligação com a apoproteína. Ex: o NAD+

pode ser cofator de uma enzima (ligação fraca) e ser coenzima de outra (ligação forte). O mesmo ocorre com os metais.

ativa

inativaGrupo Prostético

Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas

recebendo ou fornecendo grupos químicos para a reação

Algumas enzimas formam intermediários covalentescom seus substratos

QuimotripsinaElastase

EsterasesTrombina

Tripsina

PapaínaGliceraldeído-3-PO4

desidrogenase

Fosfatase alcalinaFosfoglicomutase

Fosfoglicerato mutaseSuccinil-CoA sintase

AldolaseDescarboxilases

Enzimas dependentesde piridoxal fosfato

Grupo reativono sítio ativo

Intermediáriocovalente

Enzimas

Enzimas com o mesmo tipo de mecanismo catalítico, ou seja,

possuem o mesmo grupo de aminoácidos no sítio

ativo, formam intermediários covalentes

similares

Formas rígidas

E e S se deformam, paraotimizar o encaixe

Emil Fisher (1950)Modelo chave-fechadura• o reconhecimento (especificidade) do substrato pela enzima. • o sítio ativo da enzima é pre-formado e tem a forma complementar à molécula do Substrato, de modo que outras moléculas não teriam acesso a ela.

No entanto, o modelo chave-fechadura não explica a interação das enzimas com inibidores e análogos dos substratos.

Daniel Kosland (1970) Modelo de encaixe induzido• o contacto com a molécula do substrato induz mudanças conformacioais na enzima, que otimizam as interações com os resíduos do sítio ativo.

Enzimas são específicas para o reconhecimento de seus substratos.

Modelo Chave-Fechadura

Modelo Chave-Fechadura

Carboxipeptidase A é uma enzima digestiva da classe dasmetaloproteinases.

Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profundamudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.

Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, à direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de ZnZn2+2+,, que está

acima do Glu270.

A B

Mecanismo de ação da quimotripsinaquimotripsina, um exemplo típico de uma serino protease

O H+ é transferido da His-57 para o substrato. A ligação susceptível éclivada, e parte do substrato fica ligadocovalentemente à enzima

Ligação a ser hidrolisada

Enzima interagecom substratos

aromátcos

Tríade catalíticaSer – His - Asp

A Ser-195 transfere H+

para His-57 formando um estado de transiçãotetraédrico com o substrato. O Asp-102 estabiliza o próton na His-57 fazendo uma ligaçãoiônica

A H2O entra no sítioativo e forma umaponte de H+ com a His-57

A H2O transfere H+ para a His-57 e –OH para o substrato, formando um segundoestado de transiçãotetraédrico

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Victor Henri (1903): E E ++ S S ⇔⇔ EESSAfirmou que um complexo enzima-substrato é um passo essencial na

catálise enzímática

��1913 1913

Leonor Michaelis Leonor Michaelis --EnzimologistaEnzimologista

MaudMaud MentenMenten -- PediatraPediatra

E + SK1

K-1

ESKp

E + P

Etapa rápida Etapa lenta

A velocidade da reação apresenta três regiões de comportamentodiferente, a medida que se aumenta a concentração do substrato:

-parte a: v aumenta proporcionalmentecom aumentos de S.

-parte b: v aumenta não proporcional-mente com aumentos de S.

-parte c: v não aumenta mais, tendendoa um valor máximo (Vmax), sendo independente da [S]

O gráfico mostra um conjunto de reaçõesque estão acontecendo simultâneamente, conforme as equações abaixo:

EE ++ SS EE SS P P + + EEK1

K2

K3

e - x s - x xv

Enzimas – Componentes da Reação

K1 = Cte de velocidade de formação do complexo

K2 = Cte de velocidade de dissociação do complexo

K3 = Cte de velocidade de cecomposição do complexo formando o produto

v = Velocidade de formação do produto

s = Molaridade inicial do substrato

e = Molaridade inicial da enzima

x = Molaridade do complexo no instante t

ENZIMAS CINÉTICA ENZIMÁTICA

Cinética Enzimática

�Determinar as constantes de afinidade do S e

dos inibidores;

�Conhecer as condições ótimas da catálise;

�Ajuda a elucidar os mecanismos de reação;

�Determinar a função de uma determinada

enzima em uma rota metabólica.

Enzimas Cinética enzimática

E + SK1

K2ES

K3

K4E +P

Km = K2+ K3K1

Estabilidade do complexo ES pode ser expressa pela relação entre as velocidades de dissociação e de formação do complexo

Específico para cada

enzima


Com o aumento na concentração do substrato,observa-se uma mudança na Atividade Enzimática

Concentração SubstratoCapítulos Prova

Nota

Atividade

Enzim

ática

Estudante A

Estudante B

Estudante C

0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

☺

☺

��

Juang RH (2004) BCbasics

Aum

entona

Concentração

do Substrato

21 3 4 5 6 7 80

0 2 4 6 8

Substrato (µmole)

Produto

80

60

40

20

0

S+E↓P

(emu m

períodofixo

de tempo)


E S+ P+

TeoriaTeoria do Regime do Regime EstacionEstacionááriorio

No estado estacionário, a produção e o consumo do estado de transição dá-se na mesma taxa. Destaforma, a [ ] no estado de transição mantêm-se cte.

SE E

Juang RH (2004) BCbasics

Concentração do complexo ES em regime estacionário

SP

E

ES

Tempo de Reação

Concentração

Cinética enzimática

Michaelis e Menten expressaram matematicamente a velocidade da reação pela fórmula:

V=Vm . [S]

Km +[S]

Onde Vm évelocidade máxima da

reação

E + S

K1

K2ES

K3E +P

Cinética enzimática

Km= [S]

Numericamente, Km pode ser expresso como o [substrato] necessária para que a velocidade da

reação seja metade da velocidade máxima

V máx

[S]

V

Vmax2

A A constanteconstante de de MichaelisMichaelis--MentenMenten (K(KMM) ) éé um um parâmetroparâmetro cincinééticotico queque traztrazinformainformaççõesões sobresobre a a afinidadeafinidade queque a a enzimaenzima tem tem pelopelo substratosubstrato. .

k1

KM = k-1+ k2

Quando Vf é mais alta do que Vd

k-1+ k2 = pequenok1 = grande

Km baixo

E tem alta afinidade por S

Quando Vd é mais alta do que Vf

k-1+ k2 = grandek1 = pequeno

Km alto

E tem baixa afinidade por S

Considerando a afinidade da E pelo seu S, temos 2 casos:

1. 2.

O KM é numéricamente igual à [substrato] queproduz metade da Vmax .

Substituindo na equação v por Vmax/2, vemos:

Vmax.Km + Vmax.[S] = 2Vmax.[S]

Vmax.Km = Vmax.[S] Km = [S]

Vo=Vmax Vmax = Vmax.[S]2 2 Km + [S]

y = a . x + b equaçãode reta

Aplicando-se o inverso a ambos

os lados daequação de

Michaelis-Mentem, obtem-se a equação de

Lineweaver-Burk, que é uma funçãolinear (uma reta):

Uma outra forma de se obter os valores de KM e de Vmax é através do gráfico dos duplos recíprocos (1/V x 1/S), e da equação de Lineweaver-Burk.

Tang α

A interseção da reta com o eixo x é igual a -1/KM

substituindo y = 0 na equação, temos:

0 = Km . 1 + 1 -1 = Km . 1 Vmax [S] Vmax Vmax Vmax [S]

-1 = Km - 1 = 1[S] Km [S]

=KM/Vmax

a = coef. angular = Km/Vmax(tangente ângulo alfa)

b = coef. linear = 1/Vmax(interseção com o eixo y)

Onde:

A velocidade da reaçãosomente é proporcional à

[E]quando a enzima está

saturada, ou seja, reação éde ordem zero (independe)

em relação a [S]

Eficiência catalítica

Kcat/Km

Parâmetro mais adequadopara comparações

cinéticas

- k2 ou kcat (constante catalítica) mede o “podercatalítico” da enzima

v = k2 Etotal + [P] k2 = Vmax (s-1)

[ES] [Etotal]

Para calcular kcat considera-se que toda a E existe como ES, e que v=Vmax

Exemplo de Cinética Enzimática (Invertase)

Vmax

Km S

vo

1/S

1v

o

Dobro recíproco Plotagem

1)1) Usar uma qtidade pré-defininada de Enzima→ E

2)2) Adicionar o Substrato em várias concentrações.→ S (x )

3)3) Medir o produto em um Tempo fixo (P/t)→ vo

(y )

4)4) (x, y) Plote (curva hiperbólica), estimar → Vmax

5)5) Quando y = 1/2 Vmax obtêm x ([S]) → Km

1Vmax

- 1 Km

1/2

Exemplo real de cinética EnzimáticaD

ata

no

1234

0.250.501.02.0

0.420.720.800.92

Absorbância v (µmole/min)[S]

0.210.360.400.46

(1) O produto foi medido por espectroscopia a 600 nm

(2) (2) Tempo de reação 10 min

VelocidadeSubstrato Produto Dobro recíproco

1/S 1/v421

0.5

2.081.561.351.16

→→→→

1.0

0.5

0

v

Plo

tage

mD

ireta

Dob

rore

cípr

oco 2.0

1.0

0

1/v

-4 -2 0 2 41/[S]

0 1 2[S]

1.0

-3.8

Lineweaver-Burk


vo=

Vmax [S]

Km

+ [S]

Km

Vmax &

E1E2E3

1st order

zero order

Competitivo

Não-competitivo

Imcompetição

Plotagem Direta

Duplo recíprocoAfinidade comSubstrato

VelocidadeMáxima Inibição

Atividade

Observe de vo

sobVários [S], resultouna plotagem do rendimentoVmax and K

m

k3

[Et]

kcat

No

Turn over

kcat

/Km

Unid. de Atividade

1 µmolemin

Ativ. Especifica

unitmg

Significância

NÚMERO DE RENOVAÇÃO(TURNOVER NUMBER)

nº de mols de substrato convertido em produto por mol

de enzima em unidade de tempo

Conclusões sobre Km

Km

Afinidade da enzima pelo substrato

Pequena [substrato] énecessária para a reação

atingir metade da Vmáxima

KmGrande [substrato] é

necessária para a reação atingir metade da Vmáxima

Afinidade da enzima pelo substrato

Conclusões sobre KmKm Afinidade da enzima pelo substrato

Km Afinidade da enzima pelo substratov

V

V/2 1/V

Km Km s -1/Km -1/Km1/s

Vmáx

V

V/2

Km Km

ENZIMAS

[s]

Conclusões sobre Km

� Característico de cada enzima� Reflete a afinidade da enzima pelo seu

substrato� É numericamente IGUAL a [substrato] na

qual a velocidade da reação é metade da Vmáxima

Ordem de Reação

Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática

•Mantidas fixas as condições de- temperatura ótima- pH ótimo- [enzima]

Vel

oci d

ade

da r

eaçã

o

[S]

Cinética de1a ordem

Cinética deordem zero


E E

E E

S+ E E

E E

S E E

E EP

P+

Baixa concentração de substrato

Formação do produto é PROPORCIONAL àconcentração de substrato


3/4 de saturação do centro ativo da enzima

S

S

S

+E E

E E

E E

E E

S S

S

E E

E E+

PP

P

PP

P

Formação do produto é PROPORCIONAL àconcentração de substrato

100 % de saturação do centro ativo da enzima

SS

SS

+E E

E E

E E

E E

S S

S S

E E

E E+ P

P

P

P

P

PP

P


[Substrato] em excesso

SS

S

S

S

S

S

S

+E E

E E

E E

E E

S S

S S

E E

E E + P

P

P

P

P

PP

P

SS

S

SS

SS

S

Velocidade da reação independe da [S]


Quando aformaformaçção de P for ão de P for proporcionalproporcional àà [S][S]

a reação é de1a ORDEM

Quando a velocidade velocidade da reada reaçção independe ão independe da [S]da [S] a reação é de

ORDEM ZERO

Vel

ocid

ade

da r

eaçã

o

[S]

v = K[S]

v = Vmax

Cinética EnzimáticaV

eloc

idad

eda

rea

ção

[S]

Devido à ascensão gradual da curva

hiperbólica édifícil determinar

quando foi atingida a Vmáx

Não se pode calcular com

exatidão os valores de Km e Vmáx

Considerações Finais

� Apresentam alto grau de especificidade;

� São produtos naturais biológicos;

� Reações baratas e seguras;

� São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida);

� São econômicas, reduzindo a energia de ativação;

� Não são tóxicas;

� Apresenta um mercado em crescente expansão

Perguntas ?

Para mais informações, visite as páginas abaixo:

http://www.brenda.uni-koeln.de/

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA/

http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi?id=index;action=clanid

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