Cinética Enzimática Prof. Dr. Henning Ulrich

Cinética EnzimáticaCinética Enzimática

Prof. Dr. Henning Ulrich

Influência do SubstratoInfluência do Substrato

Concentração de substrato [S]: afeta a Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação;velocidade da reação;

Efeito de [S]: varia durante o curso de uma Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação reação SS PP;;

Velocidade inicial (Velocidade inicial (VV00): [S] >> [E] ): [S] >> [E] tempo tempo

muito curto muito curto [S] = constante. [S] = constante.


[E] = cte

[S] = V0 linear

[S] = V0

V0 = Vmáx


Alguns casos a Alguns casos a VV00 não pode ser medida não pode ser medida• Não existe técnica experimental;Não existe técnica experimental;• Equação química não representa a Equação química não representa a

transformação;transformação;

Velocidade da reação:Velocidade da reação:• Velocidade média de consumo ou Velocidade média de consumo ou

produção;produção;• Variação de uma propriedade no sistema.Variação de uma propriedade no sistema.


Vitor Henri (1903): Vitor Henri (1903): EE liga-se ao liga-se ao SS para formar para formar ES ES passo obrigatório; passo obrigatório;

Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)• EE combina-se reversivelmente com combina-se reversivelmente com SS ESES

kk11

E + S ES E + S ES kk-1-1

• ES se rompe ES se rompe E E ee P P kk22

ES E + PES E + P


Qualquer instante da reação: Qualquer instante da reação: E E e e ESES;;

[S] [S] = velocidade da reação = velocidade da reação [S]; [S];

VVmáxmáx = todas as moléculas de = todas as moléculas de EE estiverem estiverem na forma na forma ESES enzima “saturada”; enzima “saturada”;

[S]: estado pré-estacionário [S]: estado pré-estacionário ESES;;• Estado estacionário Estado estacionário [ES] = cte; [ES] = cte;• VV00 estado estacionário. estado estacionário.

Equação Michaelis-Equação Michaelis-MentenMenten

Curva: possui a Curva: possui a mesma forma para a mesma forma para a maioria das enzimas;maioria das enzimas;

Expressa pela Expressa pela Equação de Equação de Michaelis e Menten;Michaelis e Menten;

Hipótese: limitante quebra de ES E + P.

Equação Michaelis-Equação Michaelis-MentenMenten Equação da velocidade para uma reação Equação da velocidade para uma reação

catalisada enzimaticamente e com um único catalisada enzimaticamente e com um único substrato;substrato;

Relação quantitativa entre a Relação quantitativa entre a VV00, a , a VVmáxmáx e a e a

[S] inicial relacionadas através de [S] inicial relacionadas através de KKmm..

SK

SVV

m

máx

0

Equação Michaelis-Equação Michaelis-MentenMenten

Relação numérica: Relação numérica: VV00 é metade de é metade de VVmáxmáx;;

kkmm = “afinidade” pelo = “afinidade” pelo substrato;substrato;

KKmm afinidade afinidade

máxVV 2

10

Vmáx é proporcional à [E].

Significado de KSignificado de Km m e Ve Vmáxmáx

Equação Michaelis e Menten = Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica;dependência hiperbólica;

Mecanismos de reação diferentes Mecanismos de reação diferentes catalisam reações com 6 ou 8 passos;catalisam reações com 6 ou 8 passos;

Significado e magnitude de Significado e magnitude de VVmáxmáx e e KKmm varia;varia;

KKmm: depende de aspectos específicos do : depende de aspectos específicos do mecanismo de reação.mecanismo de reação.


KK22 << << KK-1-1 afinidade da enzima; afinidade da enzima;

KK22 >> >> KK-1-1;;

KK22 e e KK-1-1 são comparáveis a são comparáveis a KKmm função função

complexa;complexa; VVmáxmáx: número de passos da reação e : número de passos da reação e

identidade dos passos limitantes.identidade dos passos limitantes.

1

12

k

kkKm


Enzima na saturação: Enzima na saturação: EPEP e V e Vmáxmáx = = kk33.[Et];.[Et];

KKcatcat = velocidade limitante de qualquer = velocidade limitante de qualquer reação reação enzimas saturadas; enzimas saturadas;

KKcatcat e e KKmm = ambiente celular, concentração = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação.do substrato e química da reação.

E + S ES EP E + PK1 K2 K3

K-1 K-2

Complexo enzima-substrato: ESv (formação) = k1 [S] [E] { v (“degradação”) = k-1[ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES]

Estado estacionário (“steady state”): [ES] = constante

v de formação = v de “degradação” ou: k1 [S] [E] = (k-1 + k2) [ES]

[S] [E] / [ES] = (k-1 + k2) / k1 { (k-1 + k2) / k1 = Km

Constante de Michaelis

[ES] = [S] [E] / Km { [E] = [ET] – [ES] { [ES] = ([ET] – [ES]) [S] / Km

[ES] = [ET] [S] / Km – [ES] [S] / Km {[ES] + [ES] [S] / Km = [ET] [S] / Km

([ES] Km + [ES] [S]) / Km = [ET] [S] / Km { [ES] (Km + [S]) / Km = [ET] [S] / Km

[ES] = [ET] [S] / Km + [S]

[ES] = [ET] ( [S] / Km + [S] )

[ES] = v / k2 [ET] = Vmax / k2

v / k2 = Vmax / k2 ( [S] / Km + [S] )

Variável dependente:velocidade de reação, função de [S].

Constante*:velocidade máxima

Variável independente:concentração do substrato.

Constante de Michaelis:KD aparente de ES.

* “Constante”: Vmax é função de [E]total

Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos

Exemplo:Exemplo:

[S] (g/L) [S] (g/L) VVoo (g/L.h)(g/L.h)

0,25 0,780,25 0,78

0,51 1,250,51 1,25

1,03 1,661,03 1,66

2,52 2,192,52 2,19

4,33 2,354,33 2,35

7,25 2,577,25 2,57

0,0

1,0

2,0

3,0

0 2 4 6 8

[S] (g/L)

Vo

(g/L

.h)

Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos

Exemplo: Lineweaver-Burk

y = 0,228x + 0,3668

R2 = 0,9991

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 1 2 3 4 5

1/[S] (L/g)

1/V

o (

L.h

/g)

L

gK

V

K

hL

gV

V

SV

VSV

K

V

mmáx

m

máxmáx

máxmáx

m

622,0228,0

73,23668,01

Portanto,

3668,01

228,01

111

0

0

Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos Forma estrutural = substrato Forma estrutural = substrato

competição;competição;

Porcentual de inibição Porcentual de inibição concentrações concentrações e afinidade pela enzima.e afinidade pela enzima.

Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos

[S] [S] VVmáx máx ==

KKmm Experimento Experimento • 1º 1º [E], [S] = cte [E], [S] = cte• 2º 2º [E], [I] = cte [E], [I] = cte

1/V0 x 1/[S]


Equação de Equação de Michaelis e MentenMichaelis e Menten

Lineweaver-BurkLineweaver-Burk

SKIK

SVV

Im

máx

1

SV

KIK

VV máx

Im

máx

11

11


ISKK

K

V

V

mI

m

I

10

Relação entre as velocidades com e Relação entre as velocidades com e sem inibidorsem inibidor

[S] [S] = influência = influência do [I] desprezível.do [I] desprezível.

Inibidores Não-Inibidores Não-CompetitivosCompetitivos

Ocupa outro sítio Ocupa outro sítio ESES, , EI EI ee EIS EIS;;

[S] [S] = não leva = não leva todas as todas as EE produtiva;produtiva;

VVmáxmáx e e KKmm normal.normal.

Inibidores Não-Inibidores Não-CompetitivosCompetitivos

Equação da Equação da velocidade:velocidade:

Lineweaver-BurkLineweaver-Burk

IIm

máx

K

IS

K

IK

SVV

11

ImáxImáx

m

K

I

VSK

I

V

K

V1

111

1

Inibidores IncompetitivosInibidores Incompetitivos

Bloqueio de ES;Bloqueio de ES;

2 sítios ativos 2 sítios ativos II se fixa no complexo se fixa no complexo ESES;;

ESIESI = não forma = não forma PP;;

VVmáxmáx e e KKmm


Equação da velocidade:Equação da velocidade:

Lineweaver-Burke:Lineweaver-Burke:

SK

IK

S

KIV

V

I

m

I

máx

1

1

Imáxmáx

m

K

I

VSV

K

V1

111


Inibidores IrreversíveisInibidores Irreversíveis

Combinam-se com um grupo funcional Combinam-se com um grupo funcional destruição;destruição;

União covalente União covalente inibidor e enzima. inibidor e enzima.

VVmáxmáx e e KKmm ==


Equação de Equação de Michaelis e Menten:Michaelis e Menten:

SK

SEIkVV

mmáxI

][3


Lineweaver-Burk:Lineweaver-Burk: SEIKV

K

EIKVV máx

m

máxI

111

33

Influência do pHInfluência do pH

Valor de pH ótimo = atividade máxima;Valor de pH ótimo = atividade máxima;

Velocidade da reação: Velocidade da reação: pH afasta do ótimo; pH afasta do ótimo;

Influência do pH: análise dos grupos Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis;dissociáveis;

Ácidos (Brönsted): compostos capazes de Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando Hdissociar-se, liberando H++..

bHNHCHCHCHCHNHCHCHCHCH

aHCOOCHCOOHCH

2222232222

22


HA HA A + H A + H++

pH pH HA HA A A

Aminoácidos:Aminoácidos:

pH pH -COO -COO-- captam prótons = -COOH; captam prótons = -COOH; pH pH -NH -NH33

++ são dissociados = NH são dissociados = NH22;;

Ligação eletrostática = -COOLigação eletrostática = -COO-- -- NH -- NH33++..


pH ótimo depende do número e tipo de grupos pH ótimo depende do número e tipo de grupos ionizáveis ionizáveis estrutura primária; estrutura primária;

Variações do pH Variações do pH afeta substrato com grupos afeta substrato com grupos ionizáveis;ionizáveis;

Estabilidade da enzima: temperatura, força Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre da enzima e concentração da enzima, entre outros.outros.


pH 5 e 8 = não afeta a atividade;

Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada;

5 > pH > 8 = inativação irreversível.

Influência da Influência da TemperaturaTemperatura TT velocidade de reação = velocidade de reação = energia energia

cinética;cinética;

T T muito elevadas = desnaturação da enzimamuito elevadas = desnaturação da enzima• Rompidas as pontes de hidrogênio Rompidas as pontes de hidrogênio

alterações estruturas = nova conformação;alterações estruturas = nova conformação;• TT desnaturação desnaturação pouco acima da pouco acima da T T ótima. ótima.

Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura

Enzimas PM 1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor;

Efeito da T = pH, força iônica e a presença ou ausência de ligantes;

Substratos protegem a enzima da desnaturação.


K é função da T Lei de Arrhenius

RTekk

0


Enzimas são termolábeis reação enzimática = inativação términa

Efeito da T na velocidade das reações coeficiente de temperatura

• Velocidade quando a T 10ºC.

10

log3,2 1012 QTTREa

RTekk

'0

'

Regulação da AtividadeRegulação da Atividade

Sistema enzimático: produto da reação da 1ª enzima substrato da enzima subseqüente;

Enzimas reguladoras determina a velocidade da seqüência;

• Atividade catalítica ou sinais;

Moléculas sinalizadoras pequenos metabólitos ou cofatores.

Enzimas AlostéricasEnzimas Alostéricas

Ligação não-covalente e reversível modulador;

Inibição por retroalimentação• Enzima reguladora inibida pelo P final da

via reequilibra as necessidades celulares;

Moduladores: inibidores ou estimuladores.


Modulador = substrato homotrópicas; Modulador substrato heterotrópicas;

Sítio alostérico específico para o modulador;

Curva de saturação sigmóide subunidades múltiplas.


curvas de variação de atividade moduladores inibidores, ativadores ou os dois tipos.

Modificação CovalenteModificação Covalente

Ligação covalente de um grupo químico à Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura;sua estrutura;

Metabolismo alterado Metabolismo alterado aciona vias aciona vias inativas e inibem vias ativas.inativas e inibem vias ativas.

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