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Clusterização de sequências biológicas : PHRAP e CAP3
Marcelo Falsarella Carazzolle
Laboratório de Genômica e Proteômica
Unicamp
Resumo- Introdução
- Processamento de reads (revisão)
- DNA
- ESTs
- Pipeline de montagem
- Computando os overlaps
- Formando os contigs e singlets
- Gerando sequência consensu
- Analisando a montagem
- PHRAP x CAP3
Introdução- Ordenação dos trechos de DNA sequenciados para a obtenção da sequência original
- Melhoria da qualidade de sequências de interesse
- Expressão gênica em biblioteca de cDNA
Processamento de reads (revisão)- O pipeline de um projeto genoma
- Após base calling temos :
>Unknown sequences #1
5 6 5 7 10 9 10 12 15 16 17 20 20 23 25 30 30 30 40 40 45 50 50 50 ...
Identificar regiões de baixa qualidade
Identificar regiões de vetores
Eliminar sequências formadas apenas por vetores
Cortar regiões de baixa qualidade e vetor
Bioinformatics 17 (2001), n. 122001, 1093-1104
- Possíveis combinações de regiões com qualidade ruim e vetores
- Para cDNA :
GMB 24 (2001), 17-23
Ribossomais podem atrapalhar a montagem
Corte de poly-A
Mascarando o vetor
Corte em qualidade
Remoção de sequências curtas
Pipeline de montagem
Clustering AssemblySeededClustering
Input
AssembledClusters
ConsensusSequences
- Algoritmo
1. Encontra sobreposições dos reads
3. Encontra a sequência consensu ..ACGATTACAATAGGTT..
2. Alinha os pares de reads formando os contigs
• Sort all k-mers in reads (k ~ 10)
TAGATTACACAGATTAC
TAGATTACACAGATTAC|||||||||||||||||
• Find pairs of reads sharing a k-mer
• Extend to full alignment
T GA
TAGA| ||
TACA
TAGT||
Encontrando os overlaps
-Para uma montagem um alinhamento é considerado válido se tiver :
- Overlap >= 40 pb
- 90% de identidade Bioinformatics 20 (2004), 2973
TAGATTACACAGATTACTGATAGATTACACAGATTACTGATAG TTACACAGATTATTGATAGATTACACAGATTACTGATAGATTACACAGATTACTGATAGATTACACAGATTACTGATAG TTACACAGATTATTGATAGATTACACAGATTACTGA
Formando os contigs e singlets- Cria um alinhamento múltiplo local para alinhar todos os reads
contig
TAGATTACACAGATTACTGA TTGATGGCGTAA CTATAGATTACACAGATTACTGACTTGATGGCGTAAACTATAG TTACACAGATTATTGACTTCATGGCGTAA CTATAGATTACACAGATTACTGACTTGATGGCGTAA CTATAGATTACACAGATTACTGACTTGATGGGGTAA CTA
TAGATTACACAGATTACTGACTTGATGGCGTAA CTA
Encontra a sequência consensu
-No caso de discrepâncias a escolha da base pode depender :
- Da nota phred das sequências discrepantes
- Da quantidade de relativa de bases discrepantes
Visualizando a montagem
Erros de montagem devido as regiões repetitivas
reads
Sequência consensu(DNA original)
Marca de um possível erro de sequenciamento causado por regiões repetitivas
Repeat Repeat
Repeat
1. Assembly WITHforward-reverse constraints
2.Assembly WITHOUTforward-reverse constraints
Misassembled fragment… …leaves asingleton
Montagem com vínculos de forward e reverse
PHRAP x CAP3
Genome Research 9 (1999), 868
- Pipeline CAP3
- PHRAP produz contigs maiores
- CAP3 produz menos erros internos (regiões com sobreposição)
- CAP3 produz mais erros externos (nas pontas do consensu)
- Performance do CAP3 e PHRAP na montagem de DNA genômico (BACs)
- Performance do CAP3 e PHRAP na montagem de ESTs
- Para ESTs o CAP3 é melhor que o PHRAPNucleic Acid Research 28 (2000), 3657
END
Outline of phrap assembly:
0) Read in sequence & quality data, trim off any near-homopolymer runs at ends of reads, construct read complements.
1) Find pairs of reads with matching words. Eliminate exact duplicate reads. Do swat comparisons of pairs of reads which have matching words, compute (complexity-adjusted) swat score.
2) Find probable vector matches and mark so they aren't used in assembly.
3) Find near duplicate reads.
4) Find reads with self-matches.
5) Find matching read pairs that are "node-rejected" i.e. do not have "solid" matching segments.
6) Use pairwise matches to identify confirmed parts of reads; use these to compute revised quality values.
7) Compute LLR scores for each match (based on qualities of discrepant and matching bases). (Iterate above two steps).
8) Find best alignment for each matching pair of reads that have more than one significant alignment in a given region (highest LLR-scores among several overlapping).
9) Identify probable chimeric and deletion reads (the latter are withheld from assembly).
10) Construct contig layouts, using consistent pairwise matches in decreasing score order (greedy algorithm). Consistency of layout is checked at pairwise comparison level.
11) Construct contig sequence as a mosaic of the highest quality parts of the reads.
12) Align reads to contig; tabulate inconsistencies (read / contig discrepancies) & possible sites of misassembly. Adjust LLR-scores of contig sequence.
