CONCEITOS DEBIOLOGIA MOLECULAR

Jorge Mondego

Biologia Molecular

The “OME”-Era

Genome Transcriptome

The “OME”-Era

Proteome Metabolome

- Entendimento da fisiologia e reprodução de microorganismos

- Entendimento dos mecanismos de replicação, transcrição e tradução

- Enzimas de restrição

- Plasmídeos

- Purificação de proteínas e Enzimologia

- Polymerase Chain Reaction (PCR)

- Transcriptase reversa e RT-PCR

- Sequenciamento

- Fluoróforos

- Automação

Cromossomo bacteriano Plasmídeos

Plasmídeos

DNA extracromossômico capaz de se replicar independe ntemente da replicação cromossomal

- Resistência a antibióticos- Produção de toxinas- Conjugação (transmissão de material genético entre as bactérias)- Origem de replicação própria

Conjugação

Transmissão de material genéticoentre as bactérias

Transferência horizontal de genes

Transferência de material genético entre reinos

Agrobacterium tumefaciens

Transformação

Competência – Habilidade de uma célula receber DNA extracelular vindo do meio ambiente.

-Natural: Bactérias adquirem DNA do meio para nutrição, reprodução e reparo de seu DNA, através de reparo de seu DNA, através de mecanismo de transporte membranar.

- Artificial: Uso de procedimentos de laboratório que tornam as células passíveis de serem transformadas.

Transdução

Fagos – vírus que infectam bactérias

Daniel Nathans, Werner Arber, Hamilton Smith - 1978

Enzimas de restrição (endonucleases)

Sistema de modificação - restrição

- Enzimas bacterianas que reconhecem e clivam DNA in vasor - Reconhecimento de seqüência palindrômica de DNA exó geno- Seqüências bacterianas equivalentes são metiladas

5'-GTATAC-3'||||||

3'-CATATG-5'Seqüência palindrômica

- Seqüências bacterianas equivalentes são metiladas

Pontas coesivas Pontas “cegas”Pontas coesivasCohesive ends

Pontas “cegas”Blunt ends

Manipulação dos plasmídeos e a tecnologia do DNA recombinante

Sítio de

Resistênciaa antibióticos

Origem de replicação

clonagem

-Plasmídeo é digerido com enzimas

-Gene específico é ligado no plasmídeo,replicado em diversas cópias

“Clonagem” em vetores

Transformação

Choque térmico

Choque osmótico

Shuttle vectors

Plasmídeos que se propagam em duas espécies

-Transformação de plantas, leveduras, fungos filamen tosos e células animais

Bacteriófagos

Fagos como vetor

Vetores Tamanho do inserto

Plasmídeos de alta cópia 0–10 kb

Bacteriófago λ (inserção) 0–10 kb

Bacteriophage λ (substituição) 9–23 kb

Cosmídeos 30–44 kb

Bacteriófago P1 70–100 kb

BAC (cromossomos artificiais de bactérias) até 300 k b

YAC (cromossomos artificiais de leveduras) 0.2–2.0 M b

PCR - A REVOLUÇÃO DA TAQ

Kari Mullis – 1985Premio Nobel de química -1993

PCR 1

95°°°°C

Tm

72°°°°C

PCR 2

n Ciclos de PCR

- Concentração dos reagentesTris-HCl pH 8,8 (20 mM)KCl (10-50 mM)MgCl 2 (1 a 4 mM) – Menos Mg – mais especificidadeGlicerol (menos que 5%)dNTPs (200 a 10 µM – Menos dNTP - mais especificidade)Taq (1 unidade)

PCR – Otimização da reação

Taq (1 unidade)

-Condições dos ciclosEtapa de denaturação inicial (1-3 min a 95°C)Etapa de denaturação (30 seg a 2 min a 95°C)Etapa de anelamento Etapa de extensão (30 seg a 1min e 30 seg a 70-75°C)

- Desenhos dos primers

Características desejáveis em um Primer

● Temperatura de melting (Tm) na faixa de 50 ºC a 65 ºC.

● Tamanho de 15 a 28 pares de bases

● Ausência da capacidade de dimerização.

● Ausência significativa da formação de grampos (>3 bp)

● Inexistência de sítios secundários de anelamento dos primers.

● Temperaturas de anelamento de primers formando um par devem ser próximas

Comprimento

- Quanto maior o comprimento do primer, maior apossibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma quemaiores serão as temperaturas de melting e anelamento.

- De uma forma geral, o comprimento do primer não deve serinferior a 15 bases para assegurar a unicidade. inferior a 15 bases para assegurar a unicidade.

- A existência desta faixa está baseada no fato de se buscarunique primers que apresentem temperatura de anelamentodentro da faixa considerada como a mais adequada.

Temperatura de Melting (TM)

- É a temperatura na qual metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metade naforma de dupla hélice.- Tm é dependente da composição do DNA, de modo queaumento do conteúdo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo maior número de ligações de H.ligações de H.

Temperatura de Anelamento

– É a temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm .

T anneal = Tm_primer – 4°C

Estringência no Anelamento do Primer

- A estringência determina a especificidade no produto deDNA a ser amplificado.

- T anneal é o fator mais significante que afeta a estringência no anelamento do primer.

-T anneal :

Muito baixa = menor estringência = primer pareia em qualquer lugar.

muito alta = maior estringência = primer pode não parear.

Estrutura interna do primer

- Evitar essas estruturas...

..Pode-se utilizar primers com estas estruturas se estas forem formadas

a uma temperatura em torno de 30°C menor que a Tm

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

atgatagaggctctcgaag ctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaa·M··I··E··A··L··E··A··E··V··T··R··R··T··L··E··F··D· ·T··C··K·

gtcgt cgctctcccaatggtataa·V··V··A··L··P··M··V··*·

5´- atgatagaggctctcgaag – 3´ 5´- ttataccattgggagagcg – 3 ´

5´- atgatagaggctctcgaag ctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaagtcgtcgctc tcccaatg3´- tactatctccgagagcttcgactccactggtcctcttgcgagctcaaa ctgtgcacatttcagcagcgagagggttac

gtataa – 3´catatt – 5´

RNA

DNA

TRANSCRIPTASE REVERSA e A QUEBRA DO PARADIGMA

RNA

Proteína

Quebra do paradigma

RT “REVOLUTION”

PRIMERS UTILIZADOS

Oligo(dT)15-25-“Somente mRNA”

Hexâmeros randômicosHexâmeros randômicos- Anelamento em regiões aleatórias

Primer específico do gene- Amplificação somente do gene alvo

Bibliotecas

Expressed Sequence Tags (ESTs)

Extrair RNA de diferentes tecidos/condições

cDNA

Bibliotecas

3’ EST5’ EST

Clonar em vetor

Full-Lenght cDNA

Controle Tratado

Extração de RNA e síntese de cDNA

Northern Eletrônico

sequenciamento sequenciamento

clusterizaçãoSequência consenso

controletratado = 2x

Adaptors

Driver Driver and Tester

Driver Tester

1-cDNA synthesis

2-cDNA digestion with 4 cutter enzyme

3-Adaptor ligation to tester sample

Control Treated

RNA Pools

Biblioteca subtrativa

Driver Driver and Tester

Tester

No amplificatedExponential Amplification

Linear Amplification

EliminatedEliminatedEnriched

Tester

4-Tester/ driver hybridization

5-PCR with primers that anneal specifically to

adaptor previously ligated to tester sample

6-Enrichment of cDNA library in genes

preferentially expressed in tester sample

Fluoróforos e “molecular beacons”

Cianinas

Emissão fluorescente - 570 nm (região do verde do espectro de luz)

Emissão fluorescente - 670 nm Emissão fluorescente - 670 nm (região do verde do espectro de luz)

SYBR GREEN

Emissão fluorescente - 522 nm (região do verde do espectro de luz)

“molecular beacons”

Loop – complementar a seqüência alvo

Análise Qualitativa Visa detectar a presença ou não do gene

Análise QuantitativaVisa detectar a quantidade (expressão) do gene na

amostra

PCR – Quantidade X Qualidade

amostra

Difícil diferenciar 10 cópias de 50 cópias em gel de agarose

Detecção do PCR tradicional

Detecção do Real Time PCR

SYBR green assay

SYBR se liga a DNA dupla fita e fluoresce. Durante o processo

de amplificação, a fluorescência vai aumentando, tornando mais fácil aumentando, tornando mais fácil

a quantificação de DNA

Taq Man®

Sonda anela no gene alvoPolimerase desloca repórter

liberação de fluorescência verde

Polimerase desloca quencher

www.appliedbiosystems.com

TTGTTCGAAGACTGGAAaCAACAGGTCGTCAGGCAGCATAACGAGTACAGGGCCCGTTATGGTGCACCCAACCTGTCCTGGAGCGATGCTCTGTACCCGGATACTGCTCGATATGCCGGACAGTGCAA GTTCcAACACAGGTATGACACGTCGTTGGTTCGTCGACATGTA AGGGTACTGACGACACATTCAAAG

Desenho de primers real time

Junção éxon - íntron

GTTCGTCGACATGTA AGGGTACTGACGACACATTCAAAGCAACAGTGGCGGCAAGTACGGCGAAAACTTGGCTGCTGGTACTGGAAACGCCTATGGTTTCTCGAGCGGCTTGAAGTCGTGGATGGATGAAGCTTGTATGTCTAC

http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/primer_gensc ript.cgi

Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb

(shotgun)

DNA genômico

reads

Clonagem de genomas

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Sequência consenso(DNA original)

Reconstrução do DNA original a partir do fragmentos (clusterização)

A reconstrução é feita a partir de sobreposição dos fragmentos

Quebrar em pedaços Quebrar em pedaços Quebrar em pedaços Quebrar em pedaços aleatoriamente desde aleatoriamente desde aleatoriamente desde aleatoriamente desde

50Kpb até 300Kpb50Kpb até 300Kpb50Kpb até 300Kpb50Kpb até 300Kpb

DNA genômicoDNA genômicoDNA genômicoDNA genômico

Clonar em BAC’s e

Shotgun de pedaços do genoma

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaços de 2000pb

Clonar em BAC’s e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Primer Walking

Clone to sequenceVector

Primer Sequence

New Primer

Sequence

Repeat

Sempre desenhar o primer de forma que a sequência amplificada tenha sobreposição com a anterior (tipicamente 100 pb de sobreposição)

anelamento dos primers

denaturação

TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ...

O programa PHRED lê o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequência :

- A identificação dos picos é feita através de uma transformada de fourier do sinal

- A nota é ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a altura do background

Região de qualidade alta

Analisando o cromatograma

• Picos bem definidos e grandes.

• Linha de base boa.

• Distância entre picos anterior e posterior constante.

Região de qualidade média – poucas ambigüidades

• Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio.

• Linha de base boa a razoável.

• Distância entre picos anterior e posterior razoável.

Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade

• Picos mal definidos e de tamanho pequeno.

• Linha de base confusa.

• Distância entre picos anterior e posterior inconstante.

http://www.454.com/

PirosequenciamentoRoche (454) GS FLX sequencer

Fita simples

Câmera de CCD

Reação de degradação

Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb

(shotgun)

DNA genômico

Shotgun do genoma inteiro

Ligação do adaptador e

separação em fita simples

- O adaptador permite que o DNA se ligue em grânulosminúsculos (diâmetro de 28 mm). Apenas um DNA éligado em cada grânulo

- Os grânulos são envolvidos em gotas de óleo quecontêm todos os reagentes necessários para amplificar oDNA

- Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada para- Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada paraevitar contaminação e consegue produzir 10 milhões decópias numa reação de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reação de pirosequenciamentoproduz 1011 moléculas de ATP gerando mais de 109

fótons, num comprimento de onda de 560 nm, e numperíodo de 3-4 segundos. Facilmente detectado por umacâmera de CCD

O sequenciador 454

Câmera de CCD

Bombeamento de fluídos

Câmara de fluxo contendo as amostras e as fibras ópticas(1,6 milhões/slide)

Computador

Pirograma

Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt

Illumina/Solexa Genome Analyzer Sequenciamento por síntese + clustering PCR

http://www.illumina.com/

- O adaptador permite que o DNA se ligue a uma placa nasuperfície dos canais de fluxo

- PCR em fase sólida permite que as moléculasresultantes de uma PCR fiquem próximas. Ciclo érepetido várias vezes

- Adição de polimerase, primers e de nucleotídeos,- Adição de polimerase, primers e de nucleotídeos,marcados por fluoróforos, com o 3’OH inativado – adiçãode um nucleotídeo por vez. Após incorporação, há adetecção do fluoróforo, reverte-se a inativação do 3’OH ee retira-se o fluoróforo. Ciclo se repete.

Applied Biosystems SOLiD TM

Sequencer

http://www.appliedbiosystems.com.br/site/abhome.jsp

- O adaptador ligado ao DNA e a grânulos magnéticos.Ocorre PCR em emulsão e as fitas de DNA sãodepositadas numa placa

- Ligação de primer universal n ao adaptador e de óligosdegenerados (7 bases) marcados contendo duasprimeiras bases fixas.

- Ocorre detecção do sinal, clivagem das duas últimasbases e adição de novos óligos

- Ao fim de n rounds, a fita resultante é liberada e há aligação de um novo primer universal, (agora n-1). Ciclo serepete mais três vezes (até n-4).

SANGER Novas tecnologias

• Depende de clonagem em bactéria (2 semanas de trabalho)

• Não há clonagem

• Reads de ~700 bp • Reads de 200 a 25 pb

• Clones de fita dupla

Sanger vs Novas tecnologias

• Milhões de bp em menos de 4 horas

• 1 milhão de pb em 24 horas

• Clones de fita dupla permitem seqüenciamento em ambas direções (facilita orientação e montagem)

• Fragmentos fita simples não permitem seqüenciamento em ambas direções. Aplicação da técnica de paired-end

• 6 meses de sequenciamento, 24 horas por dia, para sequenciar o genoma de um fungo

• 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusão : a união faz a força

454 Solexa SoliDSequencing chemistry

PyrosequencingPolymerase-based sequencing-by-synthesis

Ligation-based sequencing

Amplification approach

Emulsion PCR Bridge amplification Emulsion PCR

Paired ends/separation

Yes/3 kb Yes/200 bp Yes/3 kb

Novas Tecnologias

ends/separationYes/3 kb Yes/200 bp Yes/3 kb

Mb/run 100 Mb 1300 Mb 3000 Mb

Time/run (paired ends)

7 h 4 days 5 days

Read length 250 bp 32–40 bp 35 bp

Cost per run (total direct a)

$8439 $8950 $17 447

Cost per Mb $84.39 $5.97 $5.81