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Instituto de Ensino e Pesquisa do
Hospital Santa Casa de Belo Horizonte
Comparação dos níveis circulantes de
marcadores de estresse oxidativo e óxido nítrico
entre gestantes sadias e com doenças
hipertensivas da gravidez
HÉLVIO FAGUNDES GOMES
Belo Horizonte
2011
2
Hélvio Fagundes Gomes
Comparação dos níveis circulantes de
marcadores de estresse oxidativo e óxido nítrico
entre gestantes sadias e com doenças
hipertensivas da gravidez
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pesquisa e Pós-
Graduação do Hospital Santa Casa de Belo Horizonte, como
requisito parcial para a obtenção do título de mestre em
Ciências da Saúde.
Orientadora: Profª Drª Valéria Cristina Sandrim
3
Belo Horizonte
Hospital Santa Casa de Misericórdia
2011
FOLHA DE APROVAÇÃO
4
AGRADECIMENTOS
“VINCIT QUI SE VINCIT”
Agradeço, primeiramente a Deus, presença em cada momento; provedor de grande força para vencer
este desafio.
À minha querida orientadora, Dra Valeria Cristina Sandrim, pela força, confiança, pelas palavras de
sabedoria e estímulo nos momentos difíceis. Dedico a você este trabalho, Obrigado!
À minha família querida: meus pais, Edilson e Rosinha e irmãos, Lívia e Cássio, exemplos de vida que
me ajudam a manter meus pés no chão e me estimulam a melhorar a cada dia.
À Juliana Hollerbach, minha namorada e companheira, exemplo de otimismo e amor, TE AMO!
À minha querida primeira orientadora, Dra Cristiane Fernanda Fuzer Grael, quem me fez despertar para
a vida acadêmica e busca do conhecimento.
Aos meus amigos, primos e “primanos”, pelo apoio nos momentos alegres e difíceis.
Ao núcleo de pós-graduação e pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte, pela competência e
responsabilidade. Aos professores e colegas por compartilharem conhecimento tão precioso e às
secretárias, Shirley e Zélia, pelos serviços prestados.
Ao Laboratório multiusuário da Faculdade de Medicina da USP-Ribeirão Preto, Lílian e Ana Carol por me
receberem com atenção e prestatividade.
À Farmácia, curso que escolhi e que me permite dar minha parcela de colaboração à sociedade.
5
Compartilho com todos vocês esta conquista!
SUMÁRIO
Introdução
Alterações fisiológicas da gestação saudável
Revelvância das doenças hipertensivas gestacionais
Fisiopatologia da Pré-eclâmpsia
Estresse oxidativo e pré-eclâmpsia
Avaliando o grau de estresse oxidativo
Óxido nítrico e pré-eclâmpsia
Avaliando a biodisponibilidade sistêmica de NO
Objetivos
Objetivos específicos
Pacientes, Materiais e Métodos
Critérios de diagnóstico
Coleta e processamento das amostras
Soluções e Reagentes
Equipamentos e Softoware utilizados nos protocolos experimentais
Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (teste MDA-
TBARS)
Determinação da atividade antioxidante total do plasma (teste FRAP)
Determinação do potencial anti-oxidante do plasma, método MTT
Determinação dos níveis de nitrito plasmático
Análise dos resultados
ResultadosDiscussão
6
Características clínicas
Marcadores de estresse oxidativo e de óxido nítrico
Conclusões
Referências
LISTA DE ABREVIATURAS
ADMA-----------------------------------------------------------------------------------------------------dimetilarginina assimétrica
ANOVA----------------------------------------------------------------------------------------------------------análise de variância
AOPP-----------------------------------------------------------------------------------------Produtos avançados de oxidação protéica
BH4---------------------------------------------------------------------------------------------------------------tetrahidrobiopterina
CAT-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------catalase
DC ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------débito cardíaco
eNOS------------------------------------------------------------------------------------------------------sintase endotelial do óxido nítrico
FRAP-----------------------------------------------------------------------------------sigla em inglês para habilidade redutora do ferro
GS--------------------------------------------------------------------------------------------------------------Gestantes Saudávéis
GSH--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Glutationa
GSHPx--------------------------------------------------------------------------------------------------------glutationa peroxidase
HAG-------------------------------------------------------------------------------------------------------Hipertensão Arterial Gestacional
HAS--------------------------------------------------------------------------------------------------------Hipertensão Arterial Sistêmica
hCG--------------------------------------------------------------------------------------------------------gonadotrofina coriônica
HCMFRP-USP--------------------------------Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP campus Ribeirão Preto
HELLP----------------------------------- sigla em inglês para associação entre Hemólise, Plaquetopenia e Disfunção Hepática
HPLC------------------------------------------------------------------------------------------------cromatografia líquida de alta performance
IMC---------------------------------------------------------------------------------------------------------índice de massa corpórea
LDL---------------------------------------------------------------------------------------------------------lipídeos de baixa densidade
MDA-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------malondialdeído
MTT--------------------------------------------------------------------------- (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)
NO-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------óxido nítrico
PAD---------------------------------------------------------------------------------------------------------Pressão Arterial Diastólica
PA----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Pressão Arterial
PAS---------------------------------------------------------------------------------------------------------Pressão Arterial Sistólica
PBS-------------------------------------------------------------------------------------Phosphate Buffered Saline (Tampão fosfato salino)
PE------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Pré-eclâmpsia
ROS---------------------------------------------------------------------------------------------------------espécies reativas de oxigênio
7
RVP--------------------------------------------------------------------------------------------------------- resistência vascular periférica
SOD-----------------------------------------------------------------------------------------------------------superóxido dismutase
TBA----------------------------------------------------------------------------------------------------------------ácido tiobarbitúrico
TBARS--------------------------------------------------sigla em inglês para Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação esquemática da fisiopatologia da pré-eclâmpsia......6
Figura 2 - Concentração plasmática de MDA/TBARS para os grupos GS (grávida
sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia)..............31
Figura 3 - Potencial antioxidante total do plasma (FRAP) para os grupos GS (grávida
sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia)...............32
Figura 4: Valores de MTT para os grupos GS (grávida sadia), HAG (hipertensa
gestacional) e PE (pré-eclâmpsia)...................................................................33
Figura 5: Valores obtidos de Nitrito plasmático em nM para os grupos GS, HAG e
PE................................................................................................................34
8
LISTA DE TABELAS e ESQUEMAS
Tabela 1 - Estudos envolvendo análises de marcadores de estresse oxidativo em pré-
eclâmpsia..............................................................................................10
Esquema 1- Produtos e vias relacionados à peroxidação lipídica....................15
Tabela 2- Concentrações usadas para a curva de calibração, teste MDA.....23 Tabela
3- Escala de diluições usadas para definir a curva padrão do teste
FRAP................................................................................................................24
Tabela 4- Características clínicas e laboratoriais das participantes..................30
9
RESUMO
As doenças hipertensivas gestacionais afetam entre 12-22% das gestações em
todo o mundo e são responsáveis por 17,6% das mortes maternas. Dentre elas
destaca-se a pré-eclampsia, caracterizada por hipertensão associada à proteinúria que
inclui em seu processo fisiopatológico estresse oxidativo e disfunção endotelial. O
presente estudo avalia a relação entre os níveis dos marcadores de estresse oxidativo
MDA-TBARS, FRAP e MTT e de nitrito plasmático, que revela o status de
biodisponibilidade do vasodilatador NO (óxido nítrico) em grupos formados por
gestantes saudáveis (GS) (n=38), com hipertensão gestacional (HAG) (N=33) e
portadoras de pré-eclâmpsia (PE) (n=28). As características clínicas e bioquímicas
foram comparadas utilizando-se o teste de análise de variância (ANOVA) de uma via,
corrigida por Bonferroni e valores de p<0,05 foram considerados significantes. Ao
avaliarmos os marcadores de estresse oxidativo não foram encontradas diferenças
entre os grupos para o MDA-TBARS, entretanto, os níveis de FRAP e MTT
demonstraram-se elevados nas gestantes dos grupos HAG e PE comparados a GS. Os
níveis de nitrito plasmático nos grupos HAG e PE apresentaram-se reduzidos em
comparação ao grupo GS. Estes resultados demonstram que mulheres com doenças
hipertensivas gestacionais não demonstram alterações no marcador de peroxidação
10
lipídica MDA-TBARS, contudo, marcadores plasmáticos de atividade antioxidante
encontram-se aumentados, sugerindo um mecanismo de defesa frente ao aumento de
radicais livres produzidos. Além disso, os níveis reduzidos de nitrito plasmático e
conseqüentemente de NO, sugerem que fatores adicionais devem contribuir para a
disfunção endotelial observada nessas gestantes.
Palavras-chave: Doenças hipertensivas gestacionais, estresse oxidativo, nitrito
plasmático.
11
ABSTRACT
Hypertensives disorders of pregnancy affect 12-22% of all pregnant worldwide and are
responsible to 17.6% of maternal death. Preeclampsia is characterized by hypertension
associated with proteinuria, and the pathophysiology involves oxidative stress and
endothelial dysfunction. The current study evaluated the relation among oxidative stress
markers (MDA-TBARS, FRAP and MTT) and plasma nitrite, the marker that indicates
the bioavailability of the vasodilator nitrite oxide (NO) in healthy pregnant (HP, n=38),
gestational hypertensives (GH, n=33) and preeclampsia (PE, n=28) pregnant. We found
no difference of MDA-TBARS levels among groups, in addition higher levels of FRAP
and MTT were found in GH and PE compared to HP. Conversely, nitrite levels were
lower in GH and PE compared to HP. Our results suggest that pregnant with
hypertensives disorders present a defensive mechanism regarding free radicals
production. In addition, the lower levels of NO suggest that others factor besides
oxidative stress contribute to endothelial dysfunction observed in GH and PE.
Key-words: Hypertensives disorders of pregnant, oxidative stress and nitrite
12
Introdução
Alterações fisiológicas da gestação saudável
Ao processo gestacional estão associadas adaptações fisiológicas, metabólicas
e anatômicas que culminam em acentuadas mudanças no organismo materno,
incluindo a composição dos elementos figurados e humorais do sangue circulante.
Adaptações cardiovasculares na gestante permitem o suprimento constante de
nutrientes e metabólitos ao feto, sem comprometer as necessidades maternas. Tais
alterações resultam de interações complexas entre hormônios, substâncias vasoativas
e vários outros fatores (Gilbert JS 2007; Pridjian and Pruschet 2002; Longo Dola et al.
2003).
Durante a gravidez ocorre elevação de cerca de 40 a 50% do volume sanguíneo
total em decorrência do aumento, tanto do volume plasmático quanto da massa total de
eritrócitos na circulação. O débito cardíaco (DC) eleva-se (30 a 50%) acompanhado por
aumento, também, na freqüência cardíaca, hipertrofia ventricular esquerda e
resistência moderada à insulina (Rovinsky and Jaffin 1965; Hytten 1985; Gilbert JS
2007).
Considerando todas estas alterações hemodinâmicas, poderíamos esperar
aumento na pressão sanguínea durante a gravidez. Entretanto, o contrário é
observado. Na gravidez saudável são observadas diminuições na pressão arterial (PA)
sistólica e diastólica até a 16ª-20ª semana gestacional (MacGillivray et al. 1969;
13
Maynard, Epstein et al. 2008; Gilbert 2007). Tais mudanças são conseqüência da
diminuição da resistência vascular periférica (RVP) que ocorre, predominantemente,
em resposta à vasodilatação e à diminuição da responsividade aos vasoconstritrores e
à angiogênese (Roberts and Gammill 2005; Maynard, Epstein et al. 2008).
A gravidez de algumas mulheres não é acompanhada por estas alterações
hemodinâmicas que permitem a acomodação do volume corpóreo e conseqüente
diminuição da pressão sanguínea, conduzindo a quadros de doenças hipertensivas
(Rovinsky and Jaffin 1965).
Relevância das doenças hipertensivas gestacionais
As doenças hipertensivas gestacionais afetam entre 12-22% das gestações em
todo o mundo e são responsáveis por 17,6% das mortes maternas (MacKay 1988, Berg
et al. 2001).
De modo similar, no Brasil, dados do Ministério da Saúde apontam a hipertensão
como a maior causa de morte materna, sendo responsável por cerca de 35% da taxa
de 140-160 mortes maternas/100.000 nascidos vivos. Em relação à mortalidade
perinatal, a taxa nacional é de 150/1000 partos, assinalando a hipertensão também
como a maior causa de óbitos fetais ou de recém-natos (Vasconcelos 2002).
A gravidez pode ser complicada por quatro formas distintas de hipertensão:
hipertensão crônica de qualquer etiologia, pré-eclâmpsia sobreposta à hipertensão
crônica, hipertensão gestacional e pré-eclâmpsia/eclampsia (Paschoal 2002,
Vasconcelos 2002).
14
Segundo as diretrizes da Associação Médica Brasileira e do Conselho Federal
de Medicina, as manifestações clínicas que caracterizam as diversas classificações
para a formas de hipertensão na gravidez são determinadas por:
Hipertensão crônica - ocorre em cerca de 3 a 5% das gestações. Caracterizada
pela presença da hipertensão arterial sistêmica antes da gravidez, diagnosticada pela
primeira vez antes da 20ª semana gestacional ou persistente após 12 semanas pós-
parto (Vasconcelos 2002; Longo, Dola et al. 2003).
Hipertensão arterial gestacional - caracterizada por aumento de pelo menos
30mmHg na pressão arterial sistólica (PAS) e/ou 15mmHg na pressão arterial diastólica
(PAD), em relação à média dos valores obtidos antes da 20ª semana. Quando a
pressão arterial (PA) prévia for desconhecida, valores >140/90mmHg em duas
aferições, com intervalo mínimo de 4h, em repouso, são considerados anormais .
Hipertensão Arterial Crônica Superposta por Pré-eclâmpsia caracteriza-se por
proteinúria aguda intensa (>300mg/urina 24h), aumento repentino da pressão arterial,
trombocitopenia ou níveis elevados das enzimas hepáticas iniciados após a 20ª
semana gestacional em gestante com hipertensão arterial preexistente. Ocorre em
aproximadamente 20 a 25% das mulheres com HAS crônica (Vasconcelos MJA 2002;
Longo, Dola et al. 2003).
Pré-eclâmpsia (PE) - síndrome específica da gravidez que ocorre a partir de sua
segunda metade. É caracterizada por aumento da pressão arterial (PAS > 140mmHg
ou PAD > 90mmHg) e proteinúria (excreção de proteína urinaria ≥ 300mg/24h), com
início após a 20ª semana gestacional em gestante previamente normotensa. Para a
mãe, as complicações da PE incluem falência renal e hepática, acidentes vasculares e
15
morte. Para o feto, pode resultar em redução do tempo gestacional, prematuridade,
danos neurológicos ou morte. A patologia afeta entre 3-5% das mulheres grávidas e é
das principais causas de morte entre mães e filhos. Estima-se que aproximadamente
500.000 mulheres morrem no parto a cada ano no mundo e 10- 15% dessas mortes
são em decorrência de eclâmpsia. (Maarten T. M et al. 2004; Baumwell and
Karumanchi 2007; Pridjian and Puschett 2002, Vasconcelos 2002).
A eclâmpsia é o aparecimento de convulsões em paciente com pré-eclâmpsia ou
hipertensão gestacional, na ausência de epilepsia e outras doenças convulsivas
prévias (Longo, Dola et al. 2003). Pode ocorrer durante a gestação, na evolução do
trabalho de parto e no puerpério imediato (Vasconcelos 2002).
A PE é mais comum nas primigrávidas do que naquelas que estão a partir da
segunda gravidez. Entretanto, com a mudança de parceiro, o risco da mulher
desenvolver PE aumenta. É possível de que o pai desempenhe papel importante no
processo, podendo aumentar o risco de que a mulher desenvolva uma gravidez pré-
eclâmptica. Histórico de obesidade, múltiplas gravidezes, doenças crônicas como
hipertensão, diabetes e trombofilia (uma tendência herdada de coagulação hiperativa)
também devem ser levadas em consideração (Walker 2000, Redman 2005; Maynard et
al. 2008).
A pré-eclâmpsia não pode ser prevenida; a doença é controlada através do
monitoramento dos sintomas com a finalidade de minimizar seu agravamento (Maarten
et al. 2004).
A síndrome HELLP: associação entre hemólise, plaquetopenia e disfunção
hepática é uma complicação da PE grave/Eclâmpsia e proteinúria que pode ou não
estar presente nessa síndrome (Vasconcelos 2002).
16
Fisiopatologia da pré-eclampsia
Enquanto os eventos iniciais desencadeadores da patogênese da pré-eclâmpsia
permanecem desconhecidos, vários trabalhos começam a elucidar os mecanismos
moleculares por trás da patologia.
Em 1939 E.W. Page propôs que a placenta desempenhasse papel central no
processo. Exames histológicos em placentas obtidas de pré-eclâmpsia severa
demonstravam lesões clássicas de aterose aguda, artérias e arteríolas escleróticas e
estreitadas com múltiplos infartos, deposição de fibrina e tromobose. Portanto, uma
placenta com desenvolvimento anormal, disfunção endotelial e hipóxia associada é
necessária para o início do desenvolvimento da PE (Baumwell and Karumanchi 2007,
Maynard et al 2008).
Indiscutivelmente, o evento mais importante no início da placentação normal é o
estabelecimento da circulação materna efetiva, processo que está ligado à conversão
fisiológica das estreitas e tortuosas artérias espiraladas maternas em um flácido ducto
sinoidal com baixa resistência que permite o suprimento sanguíneo necessário ao
desenvolvimento da placenta (Gotti et al.2002).
Em contrapartida, ocorre o processo de invasão trofoblástica de origem fetal que
contribui para transformação da circulação útero-placentária em um sistema de alta
capacidade, baixa resistência que exibe resistência relativa aos agentes vasopressores
(Figura 1).
17
Figura 1. Representação esquemática da fisiopatologia da pré-eclâmpsia. Adaptado de
Redman, et al., 2005. Durante a gravidez saudável, os citotrofoblastos, de origem fetal,
invadem as arteríolas espiraladas. Seu fenótipo diferencia-se de epitelial para
endotelial, permitindo que estes vasos aumentem seu calibre, aumentando, também, a
perfusão placentária. Na pré-eclâmpsia, em contrapartida, esta diferenciação não
ocorre de maneira adequada. Há conseqüente redução da perfusão placentária e
hipóxia associada, gerando um quadro de estresse oxidativo.
Este processo ocorre em dois estágios. Inicialmente, os segmentos deciduais
das artérias espiraladas são afetados pela primeira onda de invasão trofoblástica
18
seguida por uma segunda onda, a partir do segundo trimestre, na qual a invasão
extende-se até o primeiro terço do miométrio (Gotti et al 2002).
Na gravidez pré-eclâmptica é percebida uma falha na segunda onda de invasão
trofoblástica, resultando em um quadro de vasoconstrição arteriolar, aumentada
responsividade aos peptídeos e aminas vasopressoras e reduzido fluxo sanguíneo na
unidade uteroplacentária. O remodelamento das artérias espirais fica limitado, e a
vasodilatação fica prejudicada (Gotti et al. 2002; Maynard et al 2008).
A isquemia placentária progride continuamente durante a gravidez e os vasos
estreitados não fornecem a demanda da unidade fetoplacentária em desenvolvimento,
um quadro de hipóxia insurge, gerando estresse oxidativo e forte resposta inflamatória
de origem materna. Ocorre produção aumentada de fatores antiangiogênicos
placentários, especificamente formas solúveis da tirosina quinase 1 (sFLT-1) e a
endoglina solúvel. Estes fatores afetam o endotélio causando disfunção endotelial e
resultam em hipertensão, proteinúria e outras manifestações da PE. Outros fatores
como alterações no eixo renina-angiotensina-aldosterona, mal adaptação imunológica,
perda excessiva de fragmentos de trofoblastos e fatores genéticos parecem contribuir
para a patogênese da placentação anormal (Maynard S et al.2008; Walker JJ 2000).
Na PE o estresse oxidativo resulta em disfunção endotelial, por ação direta na
vasculatura ou através da redução na biodisponibilidade de mediadores vasoativos
como o óxido nítrico (NO). O estresse oxidativo contribui para a disfunção endotelial e
para a fisiopatologia da doença baseando-se na atividade pró-oxidante, podendo
resultar, também, de interações entre o componente materno, que inclui condições pré-
existentes como obesidade, diabetes e hiperlipidemia e/ou do componente placentário
que, por sua vez, inclui secreção de peroxidolipídeos (Gilbert et al. 2007).
19
Estresse oxidativo e pré-eclâmpsia
O estado de estresse oxidativo é definido pelo desequilíbrio entre as
concentrações de espécies reativas de oxigênio (ROS) e os mecanismos antioxidantes
de defesa do organismo. Neste processo, a geração de ROS está aumentada ao ponto
de superar os mecanismos de defesa antioxidantes. Em outras palavras, ocorre
desequilíbrio entre as espécies pró e antioxidantes, sendo que as espécies
antioxidantes encontram-se em desvantagem (Dotan et al., 2004; Gilbert et al.2007;
Gupta et al.2009).
Podem ser considerados ROS os radicais livres e as demais espécies reativas
do oxigênio. Radicais livres são moléculas com um ou mais elétrons despareados na
órbita mais externa do oxigênio da estrutura, entre eles estão incluídos o radical
hidroxila, os radicais do ânion superóxido e do óxido nítrico. As ROS como peróxido de
hidrogênio e peroxinitrito não têm elétrons dispareados em sua camada mais externa
(Grupta et al. 2005; Dotan et al.2004).
As ROS, no entanto, exercem papel duplo. São segundos mensageiros chave
para a manutenção das funções fisiológicas, inclusive no trato reprodutivo feminino.
Contudo, a sua produção excessiva pode causar diversos danos celulares, ao DNA e
às proteínas circulantes (Grupta et al 2009; Grupta et al. 2005; Dotan et al. 2004).
Frente a tais fenômenos, nosso organismo dispõe de diversos sistemas antioxidantes
para limitar ou inativar a produção das ROS, reparar o dano celular ou até mesmo
adaptar o organismo à condição do estresse oxidativo (Grupta et al.2005; Dotan et al.
2004).
A gravidez é caracterizada por aumento na geração das ROS, principalmente do
radical superóxido que ocorre em função da demanda metabólica aumentada, maior
20
atividade mitocondrial e grande necessidade de oxigenação dos tecidos, principalmente
na unidade útero-placentária em desenvolvimento. A origem de sua produção está
associada a níveis diminuídos da produção da superóxido dismutase (SOD) e
glutationa peroxidase (GSHPx), enzimas antioxidantes presentes nos trofoblastos
placentários (Gitto et al.2002; Grupta et al 2005).
Em contrapartida, o organismo materno parece reagir tentando equilibrar tal
situação, com aumento de agentes antioxidantes como vitamina E, ceruloplasmina e os
tióis de eritrócitos, lançados na circulação (Gitto et al. 2002).
Na pré-eclampsia, a geração das ROS está ainda mais ativa, visto que a
placentação anormal leva à isquemia com hipóxia associada e dano endotelial pelo
estresse oxidativo placentário. Além disso, níveis de importantes antioxidantes como
vitaminas A, E e C, betacaroteno e glutationa, assim como a capacidade ligante do
ferro, encontram-se alterados. Alguns estudos sugerem que ocorra diminuição de sua
concentração (Mutlu-Torkogiu et al 1998; Yaninik 1999 et al Panburana 2000 El
alMadazli 2001 et al), muito embora, outros sugerem elevação de seus níveis durante a
PE (Noyan et al. 2006; Uotila et al.1993; Schiff et al. 1996; Zhang et al. 2001). Na
Tabela 1 estão apresentados alguns trabalhos avaliando marcadores de estresse
oxidativo em PE.
21
Tabela 1: Estudos envolvendo análises de marcadores de estresse oxidativo em pré-
eclâmpsia
Estudo Características do estudo
Características dos pacientes
Parâmetros avaliados
Conclusões
Takacs et al(2001). Estudo caso-controle Mulheres com PE severa.( N = 12) ou plasma proveniente de gestantes saudáveis (N = 12)
MDA plasmático Elevação significativa nos níveis de peroxilipídeos em mulheres com pré-eclâmpsia.
Yanik et al(1999) Estudo transversal de casos de PE e controle de gestantes normotensas
Oitenta pacientes com PE e 25 controles normotensos foram recrutados para o estudo
MDA, Vitamina E Os valores de MDA apresentaram-se significativamente mais elevados nos casos em que os valores de Vitamina E apresentaram-se significativamente mais baixos.
Madazili et al(2002)
Estudo transversal de casos de PE e controle de gestantes normotensas
Vinte e duas pacientes com PE foram comparadas com controle de 21 gestantes normotensas e saudáveis
Vitaminas E, C e MDA no plasma
MDA estava significativamente mais alto no grupo PE enquanto níveis de vitaminas E e C estavam significativamente mais altos no grupo controle.
Mutlu-Torkogiu et al(1998)
Estudo transversal de casos de PE e controle de gestantes normotensas
Setenta gestantes com diagnóstico de PE foram comparadas a 10 controles normotensos
TBARS, glutationa, GSH-Px, SOD, Vitamina C
Níveis de TBARS estavam significativamente mais altos nos casos de PE em comparação aos controles, enquanto os níveis de antioxidantes estavam significativamente mais baixos.
Panburana El al (2000)
Estudo transversal de casos de PE e controles normotensos
O grupo controle era composto por 60 gestantes normotensas. Trinta casos de PE moderada também fora recrutados
Vitaminas A,C , E e MDA
As mulheres portadoras de PE apresentaram níveis significativamente menores de vitamina C em comparação aos controles. Entretanto, não houve diferença significativa entres os níveis de vitamina A e E depois de ajuste de colesterol.
Uoitila et al. (1993) Estudo transversal comparando pacientes com PE a gestantes saudáveis como controle
Foram avaliadas 20 gestantes saudáveis, 23 com PE grave, 23 com PE moderada e 13 com hipertensão gestacional.
Foram avaliados níveis plasmáticos de MDA, TBARS, cromolipídios fluorescentes, GSHPx selênio, acido úrico e vitamina E
O aumento nas concentrações de antioxidantes pode ocorrer em resposta à peroxidação lipídica em PE
Noyan et al. (2006) Estudo caso-controle 21 gestantes com PE, 11 gestantes com eclampsia e 19 gestantes saudáveis
Níveis séricos de MDA, AOPP (produtos avançados de oxidação protéica), vitamina C e Catalase
Níveis significativamente elevados de MDA, Catalase e vitamina C em PE em comparação aos do grupo controle.
22
A placenta é a maior fonte de estresse oxidativo durante a gravidez; é rica em
ácidos graxos polinsaturados, que são fonte abundante de peroxilipídios, os quais são
secretados na circulação materna. As principais enzimas antioxidantes como SOD,
catalase (CAT), GSHPx, gluitationa redutase, glutationa S-transferase e glicose-6-
fosfato-desidrogenase, que estão presentes na placenta, parecem ter sua atividade
diminuída na gravidez pré-eclâmptica (Gitto et al.2002).
A peroxidação lipídica desempenha papel importante na fisiopatologia da PE. Os
peroxilipídeos seqüestram os antioxidantes não enzimáticos circulantes (vitaminas A, C
e E e glutationa) e afetam a funcionalidade dos antioxidantes de origem enzimática
(GSHPx e SOD), além de causar dano oxidativo (Gupta et al. 2005). Os peroxilipídeos
são então transportados aos mais distantes locais do organismo, resultando em
exarcebação da resposta inflamatória e disfunção endotelial sistêmica, contribuindo,
assim, para as complicações da pré-eclampsia (Grupta et al 2005, Redman Sacks et al.
2009).
O estresse oxidativo com produção de peroxilipídeos e a resposta inflamatória
podem ser considerados como processos complementares, visto que a primeira é
capaz de desencadear a segunda situação clínica (Redman, Sacks et al. 1999).
O dano inerente ao estresse oxidativo pode ser avaliado com a mensuração de
seus mais diversos marcadores. Com o resultado dessas mensurações podemos
acompanhar a evolução fisiopatológica das doenças nas quais o estresse oxidativo
está incluído, bem como saber quais potenciais danos estarão associados aos
processos patológicos em estudo.
23
Avaliando o grau de estresse oxidativo
Basicamente, existem duas maneiras de mensurar o grau de estresse oxidativo.
Através da avaliação das concentrações de subprodutos ou dos promotores do dano
oxidativo e através do status ou capacidade antioxidante do meio em questão. A
primeira forma avaliativa fornece, de certa maneira, as dimensões do dano oxidativo,
enquanto a segunda demonstra a capacidade antioxidante do meio, que pode ocorrer
em resposta ao estresse oxidativo ou como forma de adaptação do organismo àquela
situação desfavorável (Dotan et al 2004; Nikki 2010).
No caso da pré-eclampsia, os principais subprodutos do estresse oxidativo são
as formas provenientes da peroxidação lipídica, representadas pelos peroxilipídeos
(Dotan et al. 2004). `
Dentre os marcadores mais utilizados para avaliar o dano lipídico por oxidação
está o teste MDA (principal metabólito da quebra do peroxilipídeo), que utiliza o ensaio
TBARS (Dotan et al 2004). Este teste identifica produtos de oxidação lipídica,
pigmentos de bile, aminoácidos e açúcares que podem gerar cromógenos interferentes.
Diante disso, é mais apropriado usar o termo substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS). No entanto, o MDA é mais reativo ao TBA. Além disso, o fato
de o TBA ser calibrado com MDA, leva os autores a, na maioria das vezes, expressar
seus resultados com o termo “quantidade de MDA” (Costa et al. 2006).
Outra maneira útil de avaliar o estresse oxidativo é mensurar o “status oxidativo”.
Representados pelos chamados “testes de potência” que avaliam a capacidade
redutora dos fluidos corpóreos, isto é, a capacidade destes fluidos reduzirem a
oxidação, testes como o FRAP (habilidade redutora do ferro pelo plasma ou poder
antioxidante redutor do ferro) e MTT ( reação de um sal tipo tetrazolium que sofre
24
redução ao reagir com fatores anti-oxidantes do plasma) podem ser utilizados para
avaliar a capacidade/poder antioxidante (Dotan et al. 2004; Abreu et al. 2007).
Os teste FRAP baseia-se na redução do complexo 2,4,6-tripiridil-s-triazina férrico
([Fe(III)-(TPTZ)2]3+ no complexo ferroso de cor azul intensa [Fe(II)-(TPTZ)2]
2 por ação
de compostos antioxidantes no plasma sanguíneo, entre eles, principalmente o ácido
úrico e as vitaminas C e E (Benzie et al 1996).
O teste MTT baseia-se na capacidade dos fatores antioxidantes do plasma como
ascorbato, urato, vitamina E, albumina e o grupo das sulfidril proteínas terem de reduzir
o composto [-(3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)] a um
composto colorimétrico formado pelos os cristais de formazana. (Abreu et al. 2007)
25
No esquema 1 estão apresentados os principais vias e produtos relacionados a
peroxidação lipídica.
Esquema 1 – Produtos e vias relacionados à peroxidação lipídica. Esse esquema
descreve vários produtos, entre eles: Radical peroxil (1), isoprotanos (4) e MDA (5).
Extraído de Dotan 2004.
26
Óxido Nítrico e Pré-Eclâmpsia
Dentre todos os mediadores vasoativos, o NO exerce papel dos mais
importantes na regulação da resistência vascular.
Sintetizado no endotélio pela sintase endotelial do óxido nítrico (eNOS) através
da conversão do aminoácido L-arginina e oxigênio em L-citrulina e NO, o NO contribui
para a manutenção da homeostase vascular, promovendo além da vasodilatação, a
inibição da agregação e adesão plaquetárias, modificações oxidativas do colesterol
LDL, limitando a proliferação das células do músculo liso por ações específicas na
célula e diminuindo a expressão de genes pró-inflamatórios que promovem o
desenvolvimento da ateroesclerose (Forsterman 2008; Moncada e Higgs 1993).
De uma maneira geral, durante a gestação normal, é observado um aumento
dos níveis de NO pela atividade da eNOS (Anumba et al. 1999). A causa específica
deste aumento é desconhecida, mas sugere-se que o aumento do shear stress- força
de fricção na superfície endotelial que resulta em fluxo intraluminal, importante estímulo
fisioológico para a vasodilatação mediada por NO - (Sladek et al. 1997; Ranjan et al.
1995) e de certos hormônios, tais como, o 17--estradiol (Wieczorel et al 1995; Hayashi
et al. 1997) e hCG (Hishirawa et al. 1995; Voorhis et al. 1995; Jablonka-Shariff e Olson
1997) durante a gravidez estimulem a atividade desta enzima.
Para a placenta, especificamente, a atividade da eNOS é importante porque o
NO produzido mantém a baixa resistência vascular, além de atenuar a ação dos
vasoconstritores (Baylis et al. 1998). Tem sido hipotetizado que a diminuição na
produção de NO na placenta poderia acarretar perfusão anormal da placenta, o que é
evidenciado nos estados de pré-eclâmpsia. Com relação a produção sistêmica de NO,
27
sugere-se que a vasodilatação dependente do fluxo de NO esteja comprometida em
gestantes com pré-eclâmpsia comparadas às grávidas normais (Cockell e Poston
1997).
Na presença de estresse oxidativo e do dano endotelial é percebida uma
redução da bioatividade do NO. Um dos mecanismos que explicam esta redução
ocorre pelo seqüestro e inativação pelo ânion superóxido. Além disso, evidências
indicam que o estresse oxidativo persistente causa disfunção da eNOS, que
desacoplada, cessa a produção do NO e passa a produzir ROS como o ânion
superóxido (Forsterman 2008).
Além destas evidências, alguns trabalhos demonstram alterações nos
mecanismos regulatórios da atividade da eNOS em mulheres com pré-eclampsia. Por
exemplo, os níveis do inibidor endógeno da eNOS (ADMA) e do co-fator BH4,
necessário à atividade desta enzima é maior e menor, respectivamente,em gestantes
com alta resistência da circulação placentária e, portanto, com risco aumentado para o
desenvolvimento de pré-eclâmpsia, comparadas às gestantes saudáveis (Savvidou et
al. 2003).
Todas estas evidências apontam para uma importância significativa do NO
durante a gestação normal, além disso, este sistema parece estar alterado em
mulheres com pré-eclâmpsia. De uma maneira geral, acredita-se que combinações
diferentes de fatores de predisposição podem levar a mecanismos de disfunção
semelhantes que dificultam a investigação desta condição patológica.
Avaliando a biodisponibilidade sistêmica do NO
Uma maneira de se avaliar a atividade da eNOS se dá pela análise dos produtos
de espécies relacionadas ao NO, uma vez que sua curta meia-vida e as suas pequenas
28
concentrações dificultam a avaliação quantitativa da produção in vivo nos tecidos. Entre
as espécies citadas, as concentrações plasmáticas dos principais produtos da oxidação
do NO (nitritos e nitratos) são mais comumente utilizadas (Ohtoshi etal. 2002; Yoon et
al 2000; Tsukada et al. 1998; Nagassaki et al 2005). Os nitritos derivam da reação do
NO com oxigênio em solução e são biologicamente ativos. Os nitratos, que são
biologicamente inativos, são produzidos através da oxidação dos nitritos pela
oxihemoglobina nas hemácias. Entretanto, muitos fatores incluindo etnia, sexo,
poluentes ambientais (Noris et al. 2004; Davis et al. 2001; Castillo et. al 1996) e
medicamentos podem afetar os níveis plasmáticos de nitrato, limitando, assim, sua
utilização clínica para avaliação da produção endógena de NO. Recentemente, a
quantificação do nitrito tem se mostrado interessante, uma vez que os níveis
plasmáticos deste produto sofrem pouca influência de fatores exógenos. Estima-se que
70% dos níveis encontrados sistemicamente sejam derivados da atividade da eNOS,
além de que é sugerido que este composto seja um reservatório de NO na circulação,
no qual sua conversão para NO se dá devido pH baixo ou pressões de oxigênio baixas
(Noris et al. 2004). Alguns trabalhos vêm demonstrando redução das concentrações
plasmáticas de nitrito em condições patológicas, como hipertensão e em indivíduos que
apresentam algum fator de risco para doenças cardiovasculares como os tabagistas
(Kleinborngard et al. 2006); porém, até o momento pouco se conhece a respeito da
relação entre este composto e a pré-eclâmpsia ou HAG. Desta maneira, a
quantificação dos nitritos plasmáticos seria mais indicada para análise da atividade da
eNOS e portanto da produção endógena de NO.
Diante desses aspectos e dos anteriores, é de grande interesse científico a
quantificação, tanto dos parâmetros que revelam os índices de marcadores de estresse
oxidativo e status anti-oxidante, quanto do nitrito plasmático, que revela a
29
biodisponibilidade de NO, que por sua vez, representa papel importante no tônus
vascular e vasodilatação. Bem como a possível relação destes na fisiopatologia da Pré-
eclâmpsia.
30
Objetivos
Objetivo Geral
Comparar níveis de marcadores de estresse oxidativo e de nitrito plasmático em
gestantes com doenças hipertensivas da gravidez.
Objetivos específicos
1- Determinar os níveis plasmáticos dos seguintes marcadores de estresse
oxidativo: MDA, FRAP E MTT. Em gestantes saudáveis (GS), com Hipertensão
Arterial (HAG) e Pré-eclâmpticas (PE).
2- Determinar níveis de nitrito plasmático em gestantes dos grupos PE, HAG e GS.
3- Estabelecer relação fisiológica e bioquímica entre os níveis dos marcadores
anteriormente citados.
31
Pacientes, Materiais e Métodos
Seleção das participantes e determinação dos grupos de estudo
Para o presente trabalho foram selecionadas: 33 gestantes com HAG e 28
gestantes pré-eclâmpticas (PE), acompanhadas pelo atendimento especializado no
Ambulatório de Gestação de Alto Risco do HCFMRP-USP. Paralelamente, 38
gestantes saudáveis foram selecionadas no ambulatório de pré-natal normal da
MATER em Ribeirão Preto.
Gestantes portadoras de co-morbidades como diabetes gestacional, diabetes
crônica, doenças inflamatórias e que fossem fumantes foram excluídas dos grupos de
estudo. Os grupos foram equilibrados por idade, IMC e semana gestacional. Todas as
gestantes selecionadas para este estudo são de raça branca.
O estudo em questão é um subprojeto do projeto intitulado “Farmacogenética do
tratamento anti-hipertensivo de pacientes com pré-eclâmpsia: relevância do haplótipo
da eNOS”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto-USP, de acordo com o processo HCRP n° 4682/2006.
Critérios de Diagnóstico
O diagnóstico de HAG e PE pré-eclâmpsia foi feito com base nas orientações da
Federação Brasileira das Sociedades de Ginecologia e Obstetrícia.
Foram diagnosticas como portadoras de HAG, gestantes que apresentaram
hipertensão após 20º semana de gestação, caracterizada por pressão arterial sistólica
em níveis > 140mmHg e a diastólica >90mmHg, em duas aferições de pressão, com
32
intervalo de 4h, em repouso; Foram consideradas gestantes com pré-eclâmpsia PE
aquelas que apresentaram quadro de hipertensão após a 20º semana de gestação e
proteinúria (> 0,3 g/L em urina 24 horas).
Coleta e processamento das amostras
Daquelas voluntárias que aceitaram participar deste estudo, após
esclarecimento detalhado sobre o projeto e assinatura do “termo de consentimento
informado” (anexo I), foram coletados, seguindo as técnicas de coleta adequadas, 30
ml de sangue venoso, em tubos contendo EDTA ou heparina, e centrifugado a 3000g
por 5 minutos, para a obtenção das frações plasma/soro e posteriormente, mantido sob
refrigeração em freezer a -70º C até a realização das análises bioquímicas.
As amostras de sangue foram coletadas durante o atendimento clínico e
utilizadas para os estudos bioquímicos de doseamento de Nitrito plasmático, MDA,
MTT e FRAP.
33
Soluções e Tampões
Etanol absoluto refrigerado (4ºC)
Nitrato de Sódio a 10 mM
Água miliQ
Solução redutora composta de 3 mL de Vanádio(III) a 0,1M e 3 mL de HCl a 1M
Reagente de cor TBA-TCA-HCl (TBA: 0,375%,TCA:15%, HCL: 0,25N). TBA
(ácido tiobarbitúrico) TCA (ácido tricloracético) HCl: (ácido clorídrico
concentrado)
Solução TMP (Tetrametoxipropano, Sigma, no cat 1083833-100ML;
PM=164,2g/mol)
Tampão Acetato 0,3 M, pH 3,6;
Solução de HCl 40 mM (0,04 M);
TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine, Sigma, nº cat T1253-5G, PM= 312,34 g/mol) a
10 mM;
Cloreto Férrico 20 mM (0,02 M)
Sulfato ferroso em tampão acetato (0,0695 g sulfato ferroso (FeSO4.7H2O) .
Isopropanol ácido (0,3 mL de HCl 0,04 M em 90 mL de Álcool isopropílico)
34
Equipamentos e Software utilizados nos protocolos experimentais
Centrífuga: fabricante, Hettich Zentrifugen; mod: universal 320R; 220volts
Analisador de NO (Sievers Model 280 NO analyser – Boulder, CO, EUA)
Vórtex: fabricante, Marconi; mod.: MA162; 110 volts
Banho-maria: fabricante, Marconi; mod.: MA156; 220 volts
Spectrofotômetro: Marca Spectramax M5; leitor 96 poços; 220 volts
Software para análise estatística: GraphPad Prism v. 3
pHmetro de bancada
Espectrofotômetro
35
Determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (teste MDA-TBARS)
(COSTA et al 2006)
Este teste consiste na medida de um cromógeno róseo formado pela reação do
MDA com duas moléculas de ácido tiobarbitúrico, em meio ácido, em alta temperatura.
Essa reação, chamada de “teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS)”.
Em tubos de ensaio marcados, foram pipetados 100µL plasma
(homogeneizado em vórtex), branco e padrão. A cada tubo de ensaio foi adicionado
1mL de reagente de cor TBA-TCA-HCl (TBA: 0,375%,TCA:15%, HCL: 0,25N).
As amostras foram submetidas a aquecimento em banho-maria, sob
temperatura controlada (100º C), durante 30 minutos e, em seguida, submetidas ao
resfriamento, em banho de gelo, por 5 minutos e, finalmente, centrifugadas por 10
minutos a 3000rpm (1358,57g). Foram pipetados 200 µL do sobrenadante.
A análise foi feita em placa de 96 poços,com leitura em espectrofotômetro a
535nm.
Para a curva de calibração, foram pipetados em duplicata 200 µL dos padrões
de solução TMP (Tetrametoxipropano), de acordo com a tabela 2 e do branco.
Tabela 2: Concentrações usadas para a curva de calibração, teste MDA
Ponto da curva Concentração (µM)
P1 250,00
P2 125,00
P3 62,50
P4 31,25
36
P5 15,62
P6 7,82
Os resultados foram dispostos em planilha Excel com TMP (µM) no eixo X e as
respectivas medidas das absorbâncias no eixo Y. A equação da reta da curva padrão
foi calculada e a partir dela, foram calculados os valores de MDA de cada amostra,
expressos em µM (ou µmol/L).
Determinação da Atividade Antioxidante Total do Plasma (teste FRAP) (BENZIE et
al 1996)
O ensaio FRAP avalia a capacidade dos antioxidantes da amostra em reduzir o
complexo 2,4,6-tripyridyl-s-triazine férrico ([Fe(III)-(TPTZ)2]3+ no complexo ferroso de
cor azul intensa [Fe(II)-(TPTZ)2]2+, em meio ácido.
Previamente, foram preparadas as soluções: A - Tampão Acetato 0,3 M, pH 3,6;
B - Solução de HCl 40 mM (0,04 M); C – de TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine, Sigma, nº
cat T1253-5G, PM= 312,34 g/mol) a 10 mM; D de Cloreto Férrico 20 mM (0,02 M) e a
solução FRAP, que consiste na mistura das soluções A, C, D na razão 10:1:1, feita,
obrigatoriamente, no dia da análise.
Para a curva padrão foi feita solução de Sulfato ferroso em tampão acetato
(0,0695 g sulfato ferroso (FeSO4.7H2O) em 5 mL de tampão acetato 0,3M). Os pontos
da curva padrão seguiram as diluições demonstradas na tabela 3.
37
Tabela 3: Escala de diluições usadas para definir a curva padrão do teste FRAP
Ponto da Curva Concentração final ( uM)
P1 1000
P2 500
P3 250
P4 125
P5 62,5
Foram pipetados na placa de 96 poços 10 uL de água miliq e 300 µL de solução
FRAP para fazer o branco, 10 µL de cada ponto da curva padrão adicionados de 300
µL de solução FRAP, em duplicata e 10 µL de plasma adicionados 300 µL de solução
FRAP. A placa foi incubada no espectrofotômetro a 37ºC por 4 minutos e a leitura feita
a 593nm.
Para o cálculo dos resultados foram dispostas em planilha Excel as
concentrações da curva padrão realizada com sulfato ferroso (µM) no eixo X e as
respectivas médias da duplicata das absorbâncias no eixo Y para que a equação da
reta fosse calculada. A partir da equação da reta da curva padrão, foram calculados os
valores de FRAP da amostra expressos em µM.
38
Determinação do potencial anti-oxidante do plasma pelo Método de MTT (Medina
et.al 1996)
O MTT [-(3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)] é um tipo de
sal tetrazolium que sofre redução metabólica a um produto final colorimétrico, os
cristais de formazana. O plasma contém muitos fatores antioxidantes como: ascorbato,
urato, α-tocoferol, albumina e o grupo das sulfidril proteínas que são capazes de
reduzir o MTT (Medina et al., 2007) e assim transformá-lo em seu produto final no qual
sua concentração será detectada pela absorção de luz (espectrofotômetro ou leitor de
ELISA).
Para esta análise, foram pipetados em tubos de ensaio identificados, 100 µL da
amostra em EDTA. Foram adicionados ao conteúdo dos tubos 50 µL de PBS (Tampão
fosfato salino) e 12,5 µL de MTT. Feito isto, os tubos foram fechados com papel
alumínio e incubados em banho-maria a 37º C por 60min. A cada tubo, foram
adicionados 750 µL da solução de isopropanol ácido e feita homogeinizaçao em vortéx
por aproximadamente 30 segundos para que fossem submetidos a centrifugação por
10min a 3000rpm Finalmente, foi feita leitura em espectrofotômetro a 570nm. Para o
controle negativo foram utilizados 150 µL de PBS e 12,5µL de MTT. Para o Branco
PBS. Ambos reagentes seguiram o mesmo processo submetido às amostras.
Os valores encontrados foram plotados em planilha do Excel e os dados
analisados em pacote estatístico (GraphPad Prism v. 3).
Determinação dos níveis de Nitrito plasmático (GLADWIN et al, 2000).
Imediatamente após a coleta de 30 ml de sangue das voluntárias, o plasma foi
separado da fração celular do sangue por centrifugação a 3000rpm por 5 minutos. O
39
plasma separado foi mantido sob refrigeração em gelo seco até ser armazenado a
-70ºC.
Para evitar interferências e formação de bolhas que prejudicassem a leitura da
concentração de nitritos nessas amostras de plasma, foi realizado um processo de
desproteinização do plasma pela técnica da precipitação das proteínas por etanol
absoluto gelado. Nesta técnica, 300 L de plasma foram adicionados a 600 L de
etanol absoluto refrigerado (4ºC). A mistura foi vigorosamente agitada para que o
etanol gelado precipitasse as proteínas presentes no plasma. Após a agitação, o
plasma com etanol foi mantido sob refrigeração a 0ºC por 30 minutos e então, as
amostras foram centrifugadas a 10000 rpm durante 5 minutos. Com esse
procedimento, as proteínas precipitaaram-se e depositaram-se no fundo do tubo. O
sobrenadante foi então retirado e armazenado a –70ºC até o momento da quantificação
de nitrito plasmático.
Para a montagem da curva de calibração para dosagem de nitritos, preparou-se
uma solução estoque de Nitrato de Sódio na concentração de 10 mM. A partir dessa,
foram feitas diluições sucessivas para obtenção de padrões de nitrito nas seguintes
concentrações: 100, 50, 20, 10, 5, 1 e 0,5 M.
Com uso do Analisador de NO as leituras de cada um dos padrões foram feitas
em triplicata. Também foi feita a dosagem do branco (água miliQ) para verificar se a
água utilizada no preparo das soluções continha nitritos, devendo o pico referente ao
branco ser o mais próximo possível do ruído.
A quantificação de nitrito foi realizada no plasma, sempre em triplicata, pelo
método da quimioluminiscência, que é um dos métodos mais simples, sensíveis e
40
precisos. Utilizou-se um analisador de NO (Sievers Model 280 NO analyser – Boulder,
CO, EUA), o qual permite medir NO em quantidades tão pequenas quanto 1 pmol
(GLADWIN et al, 2000).
Amostras previamente desproteinizadas (15 L) foram injetadas num frasco
contendo uma solução redutora (solução redutora é aquecida a 90ºC e composta de 3
mL de Vanádio(III) a 0,1M e 3 mL de HCl a 1M). Essa solução reduz os nitritos
presentes na amostra a gás NO. O frasco é conectado a um fluxo contínuo do gás
inerte (Nitrogênio) que passa através da solução, carreando o NO liberado em direção
ao analisador de NO. As quantidades de NO produzidas são medidas após reação do
NO com ozônio numa câmara do analisador de NO. Nesta câmara, a reação do NO
com ozônio cria moléculas de NO2 (nitrito) que, no seu estado excitado, emitem luz
proporcionalmente às quantidades de NO liberadas pela amostra. O analisador contém
um detector de luz que transforma o sinal luminoso em sinal elétrico, que é finalmente
convertido em sinal analógico e registrado.
Análise dos Resultados
As características clínicas e bioquímicas foram comparadas entre os grupos
estudados com auxílio do Software estatístico GraphPad Prism v. 3. Após realizado
teste de distribuição Gaussiana para grupo de características clínicas e bioquímicas,
foram aplicados testes paramétricos aos grupos que se enquadravam nas
características da distribuição Gaussiana e testes não-paramétricos àqueles grupos
que não a apresentaram. Foram utilizadas as ferramentas estatísticas t de Student não-
pareado e ANOVA de uma via. Valores de p<0.05 foram considerados estatisticamente
significantes.
41
Resultados
Na primeira etapa deste trabalho comparamos níveis de marcadores bioquímicos de
estresse oxidativo (MDA, FRAP, MTT) e o estado clínico das gestantes dos grupos
estudados.
Na tabela 4 estão sumarizadas as características das gestantes selecionadas para
este estudo. Os grupos das gestantes saudáveis (GS), com hipertensão gestacional
(HAG) e com Pré-eclâmpsia (PE) foram similares quanto à idade, índice de massa
corpórea e idade gestacional da amostragem. Entretanto, houve diferenças
significativas quanto à porcentagem de primigestas, pressão sanguínea sistólica e
diastólica e proteinúria. Estes parâmetros foram superiores em mulheres com pré-
eclâmpsia comparados aos das gestantes saudáveis.
A semana gestacional do parto e o peso do recém-nascido, por sua vez,
apresentaram valores inferiores no grupo PE, comparando com os grupos GS e HAG.
42
Tabela 4 – Características clínicas e laboratoriais das participantes
GS HAG PE
N 38 33 28
Idade (anos) 25.3 ±6.1 26.3 ± 6.7 26.6 ± 6.0
Primigrávida (%) 25 43* 41*
IMC (kg/m2) 24.5 ± 4.3 26.4 ± 5.1 26.4 ± 5.0
PASis (mmHg) 113.2 ± 8.8 134.0 ± 14.3* 140.8 ± 13.8*
PADias (mmHg) 75.0 ± 7.4 84.1 ± 9.7 89.1 ± 9.4*
Pr 24h (mg/24h) ND 139.6 ± 75.1 1819 ± 639.3
SG (semanas) 36.2 ± 3.2 35.9 ± 4.5 34.8 ± 3.4
SG parto
(semanas)
39.7 ± 1.2 38.8 ± 1.4 36.3 ± 2.5*#
Peso RN (g) 3448 ± 456.8 3183 ± 424.1 2807 ± 887.4*
Abreviações: GS, grávidas saudáveis; HAG, hipertensão gestacional; PE, pré-eclâmpticas;
IMC, índice de massa corpórea; PA SIS, Pressão Arterial sistólica; PA DIAS, pressão arterial
diastólica; Pr 24h, proteinúria em urina 24 horas ; SG amostragem, semana gestacional da
amostragem; SG PARTO, semana gestacional do parto; PESO RN, Peso do recém-nascido;
ND, não determinado. Os valores representam as médias ± S.D. * P<0,05 vs. grupo GS e #
P<0,05 vs. HAG.
43
A segunda etapa do trabalho foi constituída pela análise das características
bioquímicas indicadoras de estresse oxidativo (testes MDA, FRAP e MTT) e dos níveis
de nitrito plasmático nas amostras coletadas.
Como demonstrado pela Figura 2, não houve diferença estatística entre os grupos
estudados para os valores de MDA-TBARS, marcador de estresse oxidativo, indicador
de peroxidação lipídica.
GS HAG PE0.0
2.5
5.0
7.5
MD
A (
nM
)
44
Figura 2: Concentração plasmática de MDA/TBARS para os grupos GS (grávida
sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia).
Na figura 3, estão demonstrados os resultados do teste de atividade anti-
oxidante total do plasma, método FRAP. Neste teste, o grupo PE demonstrou valores
superiores aos demais grupos, GS (p<0,05) e HAG, revelando maior concentração de
agentes anti-oxidantes no plasma das amostras do grupo PE.
GS HAG PE0
500
1000
*
FR
AP
(
M)
Figura 3: Potencial antioxidante total do plasma (FRAP) para os grupos GS
(grávida sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia).
45
Na figura 4 estão expressos os valores de MTT para os grupos estudados. O
ensaio MTT é um teste não específico que expressa o status anti-oxidante do
plasma, e portanto, o teor de agentes anti-oxidantes circulantes. Os grupos HAG
(p<0,01) e PE (p<0,001) apresentaram valores superiores no teste MTT
comparados aos do grupo GS.
Figura 4: Valores de MTT para os grupos GS (grávida sadia), HAG (hipertensa
gestacional) e PE (pré-eclâmpsia).
46
A figura 5 expressa as concentrações de nitrito plasmático obtidas nas amostras
dos três grupos estudados. Os valores de nitrito plasmático do grupo GS
apresentaram valores superiores aos dos demais grupos estudados HAG (P<0,01)
e PE (P<0,05).
GS HAG PE0
100
200
300
**
Nit
rito
pla
sm
áti
co
(n
M)
Figura 5: Valores obtidos de Nitrito plasmático em nM para os grupos GS, HAG e
PE.
47
Discussão
Características clínicas
É sabido que fatores étnicos/genéticos (Tanaka et al. 2007, Sandrim 2008),
tabagismo (Pryor 1993), obesidade e diabetes (Sibai et al. 2000; Rosenberg et al.
2005), doenças inflamatórias (Greer, Lyall et al. 1994) e até mesmo a idade (Horta
2007) são considerados interferentes nos processos patológicos em estudo (estresse
oxidativo e disfunção endotelial). Todos estes potenciais interferentes foram
considerados para definirmos os critérios de inclusão/exclusão das pacientes.
Nenhuma das características clínicas observadas para os grupos (tabela1)
diverge das que já estão estabelecidas para as doenças hipertensivas gestacionais
(Vasconcelos 2002).
Marcadores de estresse oxidativo
Várias evidências apontam o estresse oxidativo como fator presente nos eventos
fisiopatológicos da pré-eclâmpsia (Raijmarkers 2004; Redman 2005; Baumwell and
Karumanchi 2007). Neste contexto, inúmeros estudos avaliam os marcadores que
refletem, com suas devidas limitações, estes processos, dentre os quais está o teste
MDA-TBARS, cuja simplicidade de execução, reduzido custo e confiabilidade
contribuem para a difusão e freqüência de sua utilização (Grupta et al 2004, 2005).
48
Os resultados obtidos no nosso trabalho demonstraram não haver diferenças
entre os grupos para o teste MDA-TBARS, assim como demonstrado anteriormente por
Llurba 2004, Morris 1998, Diedrich et al. 2001 e Raijmaker et a 2001, Yaninik et AL
1999). Em contra-partida outros trabalhos encontraram diferenças significativas entre
os grupos: Orhan et al 2001 e Uoitila et al. 1993 encontraram, respectivamente,
valores de MDA 34% e 70% superiores em PE em relação ao grupo controle de
gestantes normotensas, enquanto Mistry et al 2008 encontrou valores 2,6 vezes
maiores comparando grupos similares.
Entretanto, a metodologia utilizada na avaliação do MDA pode sofrer variações.
O teste MDA-TBARS, por exemplo, pode ser executado com a utilização de métodos
espectrofotométricos ou por HPLC, este último, por ser mais preciso, minimiza a o
impacto dos interferentes (Costa et al 2006). O MDA também pode ser avaliado
independentemente do teste TBARS e geralmente, sua mensuração também é feita
mediante uso da técnica HPLC.
Ao revisarmos a literatura percebemos que a maioria dos resultados nos quais
os valores de MDA não diferiam entre os grupos foi feita através da técnica MDA-
TBARS.
O teste MDA-TBARS, entretanto, é de certo modo inespecífico, uma vez que o
ácido tiobarbitúrico, seu principal reagente, reage não somente com o MDA, mas
também com pigmentos da bile, aminoácidos e açúcares e outros fatores interferentes
(Costa et al 2006). Possivelmente, o efeito destes interferentes pode ter levado aos
resultados inconclusivos.
Outro fator sempre levado em consideração é a possibilidade de diferença entre
os resultados de cada laboratório, a acurácia técnica da equipes laboratoriais e as
diferenças entre materiais e equipamentos utilizados na execução das mesmas.
49
O tempo de armazenamento das amostras e o cuidado ao manuseá-las também
são fatores importantes para a confiabilidade do teste em questão. Minimizam,
inclusive, que ocorra a auto-oxidação do plasma. Morris et al, utilizou por exemplo
plasma citrado tratado com hidroxitolueno para evitar que a auto oxidação ocorresse.
Em nosso estudo, as amostras, após coletadas, foram cuidadosamente armazenadas
de modo que fosse minimizada ao máximo sua degradação.
Ao considerarmos a heterogeneidade dos sujeitos e desenho dos estudos,
podemos perceber que cada um avalia populações distintas. Grupos formados por sul-
africanas (Raijmaker et al 2004), espanholas (Llurba 2004) e holandesas(Diedrich et al
2001) e inglesas (Morris et al 1998) não demonstraram diferenças nos valores de MDA,
enquanto outros grupos formados por mulheres turcas, por exemplo, apresentarem
(Yanik et al, 1999; Noyan et al 2006). Devemos, portanto, considerar diversos fatores
potenciais interferentes como alimentação, genéticos, de idade e até mesmo
metodológicos. Outro marcador de dano lipídico, os isoprostanos (8,12-iso-iPF(2alpha)-
VI), considerado mais preciso por ser produzido mais prontamente durante a
peroxidação lipídica e mais estável (ver esquema 1) também apresenta contradições
com relação a dosagens em doenças hipertensivas da gravidez, sendo que Regan
2001 e Morris 1998 não observam diferenças entre os grupos, enquanto recentemente
Bazavilvaso-Rodríguez (2011) demonstra aumento deste biomarcador em PE. Este
cenário contribui para indefinições com relação ao aumento ou não de síntese de
componente oxidantes na PE.
Entretanto, outro marcador formado em etapa anterior da quebra lipídica (ver
esquema 1) os hidroperóxidos de lipídeos, apresenta-se concentrações elevadas na
maioria dos estudos que avaliam dano lipídico em PE. Foi sugerido por Llurba 2004,
inclusive, que ao serem formados, os hidroperóxidos de lipídios podem atuar como
50
gatilho para o estímulo da atividade de agentes antioxidantes de origem enzimática ou
não na circulação sanguínea resultando numa reação do organismo materno frente ao
dano oxidativo. Nosso trabalho demonstra haver aumento significativo dos dois
marcadores de atividade antioxidante do plasma MTT e FRAP no grupo PE em relação
ao grupo GS sugerindo haver forte resposta antioxidante do plasma materno, além de
indicar provável produção excessiva de radicais livres.
Com relação às enzimas antioxidantes do plasma, a maioria dos estudos
avaliam enzimas (SOD, glutationa, etc) ou antioxidantes (vit C, vit E, etc) de maneira
isolada (Mutlu-Torkogiu et al 1998; Yaninik et al 1999, Panburana El alMadazli et al
2001 ) e poucos trabalhos avaliaram a atividade antioxidante total do plasma (Harma
2005, Harsem et al 2006), sendo apenas um utilizando a técnica de FRAP (Harsem et
al 2006) e nenhum trabalho na literatura apresenta dados utilizando MTT. Com relação
ao FRAP, os dados corroboram com os nossos achados, demonstrando aumento da
atividade em PE comparada a GS. Nenhum trabalho investigou esses biomarcadores
em HAG. De maneira interessante os dois marcadores de atividade antioxidante
apresentaram resultados semelhantes, dando suporte a sugestão do aumento dessa
atividade em PE e HAG.
Apesar do aumento da atividade antioxidante do plasma e balanceamento da
produção de marcadores de estresse oxidativo, os níveis de nitrito plasmático nessas
gestantes apresentam valores significativamente mais baixos comparados às gestantes
saudáveis, demonstrando a disfunção endotelial característica dessas doenças o que
contribui para o aumento da pressão sanguínea observada nesses grupos, uma vez
que o NO é o principal fator responsável pela manutenção do sistema vascular
(Forsterman 2008; Moncada e Higgs 1993). Os níveis reduzidos de nitrito, apesar de
um possível equilíbrio da produção e captura de radicais livres, indica que outros
51
fatores, além do estresse oxidativo poderiam estar contribuindo para reduções da
biodisponibilidade de NO. Entre estes fatores podemos citar a presença de altos níveis
circulantes de hemoglobina plasmática que capturam o NO, como já demonstrado por
nosso grupo (Sandrim et al 2010a) e a presença de altos níveis de ADMA plasmático
em PE que podem competir com seu inibidor endógeno (L-arginina) reduzindo o
acoplamento da eNOS e conseqüentemente sua atividade produzindo menos NO
(Sandrim et al 2010b e Savvidou et al 2003).
Resumo dos Resultados
Com os dados apresentados nesse trabalho podemos fazer as seguintes
conclusões e implicações:
- Gestantes com doenças hipertensivas da gravidez não apresentam aumentos
significativos de MDA-TBARS, um marcador de peroxidação lipídica;
- Gestantes com doenças hipertensivas da gravidez apresentam aumentos
significativos da atividade antioxidante do plasma, sugerindo um mecanismo de defesa
em contrapartida a aumentos de radicais livres produzidos;
- Gestantes com doenças hipertensivas da gravidez apresentam níveis
reduzidos de nitrito, um marcador clinicamente relevante para avaliar a
biodisponibilidade de NO, um potente vasodilatador. Esses dados sugerem que outros
mecanismos devem contribuir para disfunção endotelial e redução de NO observada
nessas gestantes.
52
CONCLUSÕES
Neste trabalho não encontramos indícios de alterações para o marcador de dano
lipídico MDA-TBARS. No entanto, marcadores de resposta anti-oxidante do plasma
MTT e FRAP demonstram haver forte resposta fisiológica antioxidante frente ao dano
oxidativo iminente para os grupos representantes das doenças hipertensivas da
gravidez. Além disto, o marcador de biodisponibinidade de NO, nitrito plasmático,
encontra-se reduzido nos grupos citados. Isto demontra que, apesar de o NO poder ser
sequestrado pelo estresse oxidante, outros mecanismos estão envolvidos em sua
depleção.
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ANEXO 1
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO - ESTUDO
Projeto: “Farmacogenética do tratamento anti-hipertensivo de pacientes com pré-
eclâmpsia: relevância do haplótipo da eNOS
59
Responsáveis:
- Prof. Dr. José Eduardo Tanus dos Santos (FMRP-USP) – CREMESP 84.966 - Prof. Dr. Ricardo de Carvalho Cavalli – CREMESP 91.680
- Dra. Valéria Cristina Sandrim
Você está sendo convidada a participar de um estudo cujos detalhes são:
1) Este projeto pretende estudar se a Sra/Srta apresenta algumas diferenças em alguns dos
seus genes (que são responsáveis pela transmissão de suas características hereditárias, que
passam de pais para filhos) que poderiam contribuir para o desenvolvimento da pré-eclâmpsia
(pressão alta na gravidez) e na resposta aos medicamentos utilizados no tratamento desta
doença. Além disso, pretendemos estudar como estas diferenças nos genes podem modificar
as concentrações de substâncias importantes no controle da sua pressão sanguínea. Estes
dados poderão nos auxiliar no entendimento das alterações cardiovasculares que acontecem
durante a gravidez e na obtenção de marcadores genéticos de desenvolvimento da pré-
eclâmpsia.
2) Sua participação neste estudo será:
Serão retirados, no máximo, 30 mL do seu sangue, coletados por punção venosa
utilizando técnica adequada. Este volume de sangue é cerca de 20 (vinte) vezes menor do que
o volume de sangue habitualmente doado quando um indivíduo doa sangue para bancos de
sangue. Este sangue será utilizado para realizar todas os estudos bioquímicos e genéticos
mencionados acima. Uma segunda coleta de sangue (10 mL de sangue venoso) será realizada
caso o seu médico prescreva para o tratamento da pressão alta o medicamento -metildopa.
Além disso, caso permita tal procedimento, coletaremos da Sr(a) uma amostra de saliva com o
objetivo de avaliaremos a atividade de enzimas importantes na gestação.
Com isto, encerra-se a sua participação neste estudo.
3) Você terá direito a ressarcimento financeiro caso haja gastos gerados exclusivamente pela sua participação como voluntário desta pesquisa.
4) Caso haja dano comprovadamente decorrente da pesquisa você terá direito à indenização.
5) NÓS NÃO PODEMOS E NÃO GARANTIREMOS QUE VOCÊ RECEBERÁ QUALQUER BENEFÍCIO DIRETO DESTE ESTUDO.
6) Indiretamente, acreditamos que este estudo trará como benefício um entendimento da fisiopatologia da pré-eclâmpsia, bem como na obtenção de marcadores genéticos
de susceptibilidade a pré-eclâmpsia e de resposta à -metildopa.
7) Qualquer dado que possa ser publicado posteriormente em revistas científicas, não revelará
a sua identidade. Entretanto, órgãos governamentais ligados à saúde podem solicitar
informações a respeito da pesquisa e identidade dos voluntários nela envolvidos.
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8) Você pode retirar o seu consentimento para participar deste estudo a qualquer momento,
inclusive sem justificativas e sem qualquer prejuízo para você.
9) Você terá a garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de
qualquer dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de outras situações
relacionadas com a pesquisa e o tratamento a que será submetida. Qualquer questão a
respeito do estudo ou de sua saúde deve ser dirigida ao Prof. Dr. José Eduardo Tanus dos
Santos (telefone 0xx16 3602-3163), do Departamento de Farmacologia da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), ao Dr. Ricardo de Carvalho Cavalli (telefone 0xx16
36022588), do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto (FMRP) ou à Doutora Valéria Cristina Sandrim (telefone 0xx16 36262851, 0xx16
36023329) do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
(FMRP). O telefone do Comitê de Ética em Pesquisa da FMRP é 016-3602-2228.
Eu, _____________________________________________________________, abaixo assinado, declaro que em ____/____/____ fui devidamente informada em detalhes pelo pesquisador responsável no que diz respeito ao objetivo da pesquisa, aos procedimentos que serei submetido, aos riscos e benefícios, à forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, bem como à indenização quanto por danos decorrentes da pesquisa. Declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que me foram asseguradas e acima relacionadas.
Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que me foram
apresentadas e que, livremente, manifesto a minha vontade de participar do referido projeto.
Ribeirão Preto, __________ de ______________ de ______.
_____________________________ ____________________________
Assinatura do voluntário Assinatura do investigador/testemunha
