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THAÍS MEDEIROS DA SILVA


COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DA ALEXIDINA COMO IRRIGANTE ÚNICO, OU COMO

IRRIGANTE FINAL, COM O HIPOCLORITO DE SÓDIO E COM A CLOREXIDINA

2015

Programa de Pós-Graduação em Odontologia Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580, cobertura

22790-710 – Rio de Janeiro, RJ Tel. (0XX21) 2497-8988

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COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DA ALEXIDINA COMO IRRIGANTE ÚNICO, OU COMO IRRIGANTE FINAL, COM O HIPOCLORITO

DE SÓDIO E COM A CLOREXIDINA

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Estácio de Sá, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Odontologia (Endodontia).

Orientador:

Prof. Dr. Flávio Rodrigues Ferreira Alves

Co-orientadora:

Dra. Márcia Teresa Soares Lutterbach

UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ RIO DE JANEIRO

2015 FICHA CATALOGRÁFICA

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iv

“Não é na ciência que está a felicidade, mas na aquisição da ciência”.

Edgar Allan Poe

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era

antes”.

Marthin Luther King

“Só há felicidade se não exigirmos nada do amanhã e aceitarmos do hoje, com gratidão, o que nos trouxer. A hora mágica chega sempre”.

Hermann Hesse

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DEDICATÓRIA

Aos meus queridos pais, Marilda e Sérgio, que se sacrificaram, se dedicaram, abdicaram de tempo e de muitos projetos pessoais para que eu tivesse a

oportunidade de estudar e de ter uma boa formação profissional e pessoal.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida, família e amigos. Deus, na grandeza de tua presença em

minha vida, sigo minha estrada dando valor às conquistas e lhe agradecendo por fazer parte de todas elas! Aos meus orientadores: Professor Doutor Flávio Rodrigues Ferreira Alves, pela sua disponibilidade

irrestrita, pelos ensinamentos, lições, orientações, críticas construtivas e, principalmente, pelo exemplo de como ser um verdadeiro Professor. Professora Doutora Márcia Teresa Soares Lutterbach, pela competência e

capacidade de compartilhar e transmitir seus conhecimentos, pela paciência, pelo auxílio criterioso, generosidade e gentileza durante o desenvolvimento deste trabalho. Aos Professores do PPGO, pelos ensinamentos compartilhados, pela dedicação e atenção durante a realização das disciplinas ministradas durante o curso. A todos os alunos das turmas de doutorado, mestrado e especialização do PPGO, pela simpatia e trocas de conhecimento durante a realização deste curso. À Angélica, por todo seu carinho e cuidado durante meus 9 anos de PPGO. ÍNDICE

vii

1. INTRODUÇÃO

2. REVISÃO DE LITERATURA

3. JUSTIFICATIVA

4. HIPÓTESE

5. PROPOSIÇÃO

6. MATERIAIS E MÉTODOS

7. CRONOGRAMA

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

9. ANEXOS

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xx

xx

xx

xx

xx

xx

xx

viii

RESUMO

Objetivo: Este estudo in vitro teve como objetivo comparar a eficácia da

alexidina (ALX), um irrigante promissor, sozinha ou como irrigante final, em

combinação com hipoclorito de sódio (NaOCl).

Materiais e métodos: Noventa e quatro fragmentos de dentina humana foram

contaminados com E. faecalis durante 24 horas e distribuídos aleatoriamente em

4 grupos experimentais de 20 fragmentos cada. Os grupos NaOCl, CHX e ALX

foram imersos em 1 ml de de NaOCl 2,5%, CHX 2% e ALX 1% durante 10

minutos, respectivamente. As amostras do grupo de NaOCl + ALX foram imersas

em 1 ml de NaOCl a 2,5% durante 10 minutos, seguida pela imersão em 1ml de

ALX 1%, durante 10 minutos. O grupo de controlo (n = 12) foi imerso em solução

salina estéril. Amostras bacteriológicas foram colhidas, cultivadas e as unidades

formadoras de colônias foram contadas.

Resultados: A análise intergrupo revelou não haver diferença significante entre

os grupos (p > 0,05), com exceção da comparação entre os grupos CHX x ALX

e NaOCl+ALX x ALX (p= 0,004). Nos grupos CHX e NaOCl+ALX houve a

eliminação das células bacterianas em todas as amostras. Todos os grupos

experimentais foram mais efetivos no controle bacteriano do que o grupo

controle (p < 0,05).

Conclusão: A ALX sozinha não deve ser o indicada como um irrigante

intracanal, pois seu efeito antibacteriano contra E. faecalis foi inferior a CHX 2%

e NaOCl 2,5%. No entanto, a combinação de NaOCl com ALX, como irrigante

final, tem potencial para ser utilizada para eliminar biofilmes.

ix

Palavras-chave: Antibacteriano; hipoclorito de sódio; clorexidina; biofilme;

Enterococcus faecalis.

x

ABSTRACT Aim: This in vitro study aimed to compare the efficacy of alexidine (ALX), a

promising root canal irrigant, alone or as a final irrigant in combination with

sodium hypochlorite (NaOCl), with the most common canal irrigants, NaOCl and

chlorhexidine (CHX).

Methods: Ninety-four root fragments from extracted human teeth were

contaminated with Enterococcus faecalis for 24 hours and then randomly

distributed into 4 experimental groups of 20 fragments each. The NaOCl, CHX

and ALX groups were immersed in 1 ml of 2.5% NaOCl, 2% CHX and 1% ALX

for 10 minutes, respectively. The samples of the NaOCl+ALX group were

immersed in 1 ml of 2.5% NaOCl for 10 minutes followed by 1% ALX for 10

minutes. The control group (n=12) was immersed in saline solution.

Bacteriological samples were taken, cultured, and the colony-forming units were

counted.

Results: Intergroup analysis revealed no significant difference among the

experimental groups (p > 0.05) except for the comparisons CHX versus ALX and

NaOCl + ALX versus ALX (p = 0.004). ALX alone was the worst irrigant. CHX and

NaOCl + ALX eradicated all bacterial cells in all samples. All experimental groups

were significantly more effective than the control group (p < 0.05).

Conclusions: ALX alone should not be indicated as an intracanal irrigant since

its antibacterial effect against E. faecalis was inferior to 2% CHX and 2.5%

NaOCl. However, the combination of NaOCl with ALX as a final irrigant has

potential to be used in endodontic treatment to eliminate biofilms.

Keywords: antibacterial; biofilm; Enterococcus faecalis; root canal irrigant.

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Imagem obtida em microscópio eletrônico de varredura mostrando

um ápice dentário com presença de lesão perirradicular.

Figura 2 Processo de formação de biofilme.

Figura 3 Estrutura química dos antimicrobianos clorexidina e alexidina.

Figura 4 Desenho técnico do TBF.

Figura 5 TBF: Esquema dinâmico.

Figura 6 Contaminação das amostras.

Figura 7 Exposição das amostras aos antimicrobianos e contagem das

UFC.

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Contagem de UFC por grupo.

Tabela 2 Valores da média, mediana e intervalo das UFC contadas.

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

MPE Matriz polimérica extracelular

LTA Ácido lipoteicóico

NaOCl Hipoclorito de sódio

CHX Clorexidina

ALX Alexidina

EDTA Ácido etilenodiamino tetracético

TBF TeethBioForm

UFC Unidades formadoras de colônias

1

1. INTRODUÇÃO

As patologias pulpares e perirradiculares são usualmente de natureza

inflamatória e de etiologia microbiana (MÖLLER et al., 1981). Embora fatores

físicos e químicos possam também estar envolvidos, uma série de evidências

científicas confirmam que a infecção endodôntica é fundamental para a

progressão e perpetuação das diferentes formas de periodontite apical.

As bactérias são os principais micro-organismos associados a tais

infecções, porém podemos encontrar também, colonizando o sistema de canais

radiculares, fungos, vírus e arqueias (VIANNA et al., 2004; SIQUEIRA & RÔÇAS,

2009). Mais de 460 espécies e filotipos bacterianos já foram detectados em

diferentes tipos de infecções endodônticas (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009). De

acordo com RICUCCI & SIQUEIRA (2010), nas infecções em estágios mais

avançados é maior a probabilidade de encontrarmos, aderidas às paredes do

sistema de canais radiculares, bactérias organizadas em biofilmes.

Os biofilmes, presentes no sistema de canais radiculares, são

potencialmente perigosos, pois podem estimular uma inflamação persistente

associada a um dano tecidual na região periapical. A inflamação e o dano são

proporcionais à quantidades de células (densidade), à composição de espécies

bacterianas do biofime e ao grau de organização da comunidade microbiana que

habita o sitema de canais radiculares (SIQUEIRA et al., 2002; SIQUEIRA &

RÔÇAS, 2011). Biofilmes bacterianos estão mais associados a processos

patológicos duradouros, com presença de lesões perirradiculares extensas e

cistos perirradiculares (RICUCCI & SIQUEIRA, 2010).

1.1. Biofilmes bacterianos

2

As bactérias possuem uma capacidade extraordinária de crescerem

rapidamente em condições ambientais e nutricionais apropriadas. Porém, muitos

destes micro-organismos desenvolveram mecanismos altamente sofisticados

para manterem a viabilidade celular durante períodos de escassez de nutrientes.

De acordo com SIEGELE & KOLTER (1992), em resposta à falta de nutrientes,

algumas espécies formam, por exemplo, esporos , enquanto outras formam

corpos de frutificação e agregados celulares.

As bactérias, nos mais diversos ambientes, podem ser encontradas

livremente em suspensão, forma de existência planctônica, ou aderidas a um

substrato inerte ou superfície viva, forma de existência séssil. Segundo GEESEY

(1996), as condições ambientais ditam, em grande parte, se as bactérias irão

existir em um estado planctônico ou séssil.

Podemos dizer que as bactérias constituem a forma de vida de maior

sucesso na Terra, em termos de biomassa total e em relação à variedade e

extensão dos hábitats colonizados, em função principalmente da plasticidade

fenotípica, ou seja, habilidade do genótipo bacteriano responder a estímulos

ambientais. Uma importante estratégia fenotípica que vem sendo estudada

durante anos é a organização das bactérias sob a forma de biofilmes (BROWN

& WILLIAMS, 1985).

Os biofilmes bacterianos podem atingir dimensões compatíveis para

observação a olho nu e, provavelmente foi o que ocorreu em 1684, quando

Antonie van Leeuwenhoek observou, com auxílio de um microscópio primitivo,

um conjunto de micro-organismos (“animáculos”) que habitava a placa

bacteriana que ele havia removido de um de seus dentes.

3

Os biofilmes bacterianos podem ser definidos como estruturas

constituídas por comunidades de bactérias aderentes entre si e/ou à superfícies

inertes ou vivas, envolvidas por uma matriz polimérica extracelular (MPE)

altamente hidratada (COSTERTON, 2008). A superfície do biofilme é bastante

adsortiva devido à sua natureza polieletrolítica, sendo capaz de reter

quantidades significantes de compostos orgânicos e inorgânicos do meio

(CHARACKLIS, 1981) (Fig. 1).

Fig. 1- Imagem obtida em microscópio eletrônico de varredura mostrando um ápice dentário com presença de lesão perirradicular

Aproximadamente 80% a 90% da massa total dos biofilmes é

composta por água. As células bacterianas representam cerca de 70% do peso

seco, enquanto o restante é atribuído à MPE. Também participam da sua

4

composição partículas de proteínas, lipídeos, fosfolipídeos, carboidratos, sais

minerais e vitaminas (FLEMMING, 1993).

Em 1982, GESSEY definiu MPE como polímeros orgânicos de origem

microbiana que, em biofilmes, são responsáveis por unir células a outros

materiais particulados (coesão) e ao substrato (adesão). A produção de MPE é

uma propriedade geral de micro-organismos em ambientes naturais e ocorre em

procarióticos e eucarióticos, é responsável pela integridade estrutural e funcional

e pelas propriedades biológicas e físico-químicas dos biofilmes. A MPE forma

uma estrutura gelatinosa tridimensional, altamente hidratada na matriz do

biofilme, na qual os micro-organismos estão envolvidos e parcialmente

imobilizados. Em geral, a proporção de MPE em um biofilme pode variar de 59%

a 90% do total da matéria orgânica.

A MPE pode conferir aos biofilmes maior resistência à ação de

agentes químicos e físicos. Segundo FLEMMING (1993), um dos fatores que

favorece essa resistência é o caráter aniônico da maioria dos polissacarídeos

presentes na MPE, pois propicia o aprisionamento de cátions presentes em

alguns compostos químicos, diminuindo sua concentração, e

consequentemente, sua ação nociva aos micro-organismos.

A colonização bacteriana de superfícies biológicas tem sido descrita

como estratégia básica de sobrevivência dos micro-organismos (DUNNE Jr.,

2002). As interfaces sólido-líquido, água-óleo, água-ar e sólido-ar, propiciam um

ambiente para a adesão e o crescimento dos micro-organismos. Estudos vêm

demonstrando que a adesão bacteriana obedece a princípios de especificidade

e sinalização celular. Muitas bactérias, Gram-positivas e Gram-negativas, se

comunicam através da liberação de sinais químicos específicos (ferormônios)

5

que aumentam com o aumento da densidade populacional, fenômeno conhecido

como quorum sensing. Atualmente sabemos que o sistema quorum sensing

regula a virulência, a liberação de produtos secundários do metabolismo celular

e a formação de biofilmes (DAVIES et al., 1998).

Em relação ao mecanismo de formação dos biofilmes, várias teorias

foram formuladas. A primeira foi proposta por MARSHALL et al., em 1971, na

qual os autores propuseram que a adesão ocorre em duas etapas: na primeira,

o processo de adesão dos micro-organismos na superfície se dá por meio de

forças de Van der Walls, sendo portanto, considerada reversível. Já na segunda,

as fímbrias poliméricas ligam a célula bacteriana ao substrato, tornando difícil a

remoção do biofilme. Na primeira etapa, a rinsagem poderia remover o biofilme,

já na segunda, precisariam ser utilizados métodos mecânicos, como lavagem ou

raspagem.

Em 1976, FLETCHER formulou uma teoria focada na metodologia da

acumulação dos micro-organismos no substrato, em três etapas: adsorção ou

acumulação dos micro-organismos na superfície, consolidação dos micro-

organismos ao substrato e crescimento microbiano.

CHARACKLIS, em 1984, formulou uma teoria na qual a formação do

biofilme foi dividida em cinco etapas: condicionamento da superfície pela

adsorção de material orgânico, transporte de células e nutrientes para o sítio de

aderência, início da adesão bacteriana ainda reversível, crescimento celular,

colonização e adesão irreversível.

De acordo com NOTERMANS et al. (1991), a formação do biofilme

ocorre em três etapas: fixação inicial, consolidação da bactéria na superfície e

crescimento da bactéria.

6

Entre as diversas teorias formuladas, a mais aceita foi a proposta por

BOTT, em 1993, que considera a formação do biofilme como resultado da

agregação de substâncias orgânicas, micro-organismos e produtos derivados do

seu metabolismo. O desenvolvimento do biofilme é separado em cinco fases:

formação de um filme condicionante, através da adsorção de substâncias

orgânicas dissolvidas no meio aquoso; transporte de micro-organismos e outras

partículas do meio aquoso para a superfície sólida acondicionada; adesão firme

dos micro-organismos à superfície; transporte de nutrientes da fase líquida para

a interface líquido-biofilme, bem como para o interior do filme microbiano e

produção do biofilme devido ao consumo de nutrientes, crescimento, reprodução

dos micro-organismos aderidos e síntese de polímeros extracelulares. Nessa

última fase, também ocorre o transporte de subprodutos do biofilme para o

exterior e o desprendimento de porções do biofilme, devido a fenômenos de

erosão superficial ou deslocamento súbito. O desprendimento das porções mais

externas está relacionado ao aumento da espessura do biofilme, estabelecendo

assim, um processo dinâmico e contínuo de renovação do biofilme (fig. 2).

Fig. 2 – Processo de formação de biofilme

7

Durante o processo de formação do biofilme, as características do

substrato, como rugosidade, presença de filme condicionante e hidrofobicidade,

as propriedades da fase líquida, como velocidade do fluxo e presença de

agentes antimicrobianos e as propriedades dos micro-organismos, como

presença de fímbrias, flagelos e a MPE produzida, afetam diretamente a adesão.

Geralmente, a adesão ocorrerá mais facilmente em substratos mais

rugosos, mais hidrofóbicos e recobertos com um filme condicionante (DONLAN,

2002). A hidrofobicidade da superfície celular, a presença de fímbrias e flagelos

e a produção de MPE podem influenciar a razão e a extensão da adesão das

células microbianas. O aumento na velocidade do fluxo é considerado um fator

fundamental para a formação, estruturação e estabilidade do biofilme. De acordo

com CHARACKLIS (1984), a velocidade do fluxo interfere na taxa de

transferência de massa do líquido para o biofilme e no desprendimento dos

micro-organismos. Se a velocidade do fluxo for baixa, o processo de

transferência de massa do líquido para o biofilme não será suficiente para que

ocorra a formação de um biofilme com estrutura coesa. Porém, se a velocidade

do fluxo for alta, teremos a formação de um biofilme com estrutura coesa, mesmo

com uma alta taxa de desprendimento de micro-organismos.

1.2. Tipos de infecções endodônticas

As infecções endodônticas são classificadas de acordo com a

localização anatômica (intrarradicular e extrarradicular) e com o momento que

os micro-organismos têm aceeso ao sistema de canais radiculares (primária,

secundária e persistente) (SIQUEIRA, 2008). A infecção intrarradicular primária

8

é causada por micro-organismos que invadiram e colonizaram o tecido pulpar

necrosado, podendo causar a lesão perirradicular. De acordo com RÔÇAS &

SIQUEIRA (2008), bactérias anaeróbias estritas predominam na microbiota

destes casos. A infecção intrarradicular secundária é representada por micro-

organismos que não estavam presentes na infecção primária e que penetraram

no canal radicular após a intervenção inicial, ou seja, durante o tratamento

endodôntico, entre as consultas ou mesmo após a conclusão do tratamento. Por

sua vez, a infecção intrarradicular persistente ocorre quando os micro-

organismos presentes nas infecções primária e/ou secundária resistiram aos

procedimentos de desinfecção, suportando períodos de escassez de nutrientes

(SIQUEIRA, 2011). Nos casos de fracasso, a microbiota é diferente da infecção

primária, e de acordo com SIQUEIRA & RÔÇAS (2004) a espécie Enterococcus

faecalis é uma das mais prevalentes. A infecção extrarradicular, causada pela

invasão de micro-organismos aos tecidos perirradiculares inflamados, pode ser

dependente ou não de uma infecção intrarradicular (SIQUEIRA & LOPES, 2011).

1.3. Enterococcus faecalis

Nos casos de fracasso da terapia endodôntica, o E. faecalis assume um

lugar de destaque, dada a alta prevalência com que é identificado ( SIQUEIRA

& RÔÇAS, 2004; SCHIRRMEISTER et al., 2007; GOMES et al., 2008). De

acordo com SHERMAN et al. (1937), os Enterococcus podem crescer entre 10º

C e 45º C, em pH 9,6, em caldo de NaCl a 6,5% e sobrevivem a 60º C durante

um período de 30 minutos. O E. faecalis pode se adaptar à condições subletais

de estresse, tornando-se menos suscetível aos níveis normalmente letais de por

exemplo, dodecil sulfato de sódio, sais biliares, condições de hiperosmolaridade,

9

calor, etanol, peróxido de hidrogênio, acidez e alcalinidade. Além disso, células

de E. faecalis submetidas à escassez de nutrientes podem se tornar resistentes

à radiação ultravioleta, calor, hipoclorito de sódio, peróxido de hidrogênio e

etanol (GIARD et al., 1996; HARTKE et al., 1998).

O micro-organismo em questão também possui a capacidade de penetrar

em túbulos dentinários, resistir aos efeitos antimicrobianos do hidróxido de cálcio

e produzir vários fatores de virulência, entre eles, substâncias de agregação,

adesinas de superfície, ácido lipoteicóico (LTA), superóxido extracelular,

gelatinase, hialuronidase, citolisina e bacteriocinas. Todos esses fatores de

virulência possibilitam a adesão e colonização do hospedeiro, a resistência aos

mecanismos de defesa, inibição do crescimento de outras bactérias, dano

tecidual e indução de resposta inflamatória. Após a contaminação dos canais

radiculares, o E. faecalis pode aderir à parte mineral da dentina através de

adesinas de superfície, colonizar o canal principal e penetrar nos túbulos

dentinários, permanecendo em um local protegido da ação dos instrumentos

endodônticos e dos medicamentos. Considerando que canais radiculares

tratados endodonticamente são escassos em nutrientes e foram obturados

adequadamente, o E. faecalis ainda assim pode obter energia através da

degradação da dentina pela enzima hialuronidase ou através do fluido dentinário.

Além disso, em canais com vedamento apical deficiente, a produção de

superóxidos, gelatinases, citolisinas e hialuronidases pelo micro-organismo pode

causar danos diretos aos tecidos perirradiculares.

1.4. Preparo químico e mecânico dos canais radiculares

10

Diferentemente de infecções localizadas em outras partes do corpo

humano, a infecção endodôntica não sofre remissão espontânea pelos

mecanismos de defesa do hospedeiro e tampouco por antibioticoterapia

sistêmica. O que explica tal fato é a ausência de corrente sanguínea no canal

radicular contendo polpa necrosada ou previamente tratado, impossibilitando o

acesso de células e moléculas de defesa, assim como antibióticos. Portanto, o

tratamento de canais infectados depende da intervenção direta do profissional,

que por sua vez, se utiliza de estratégias químicas e mecânicas na eliminação

dos micro-organismos.

Conforme exposto anteriormente, a colonização do sistema de canais

radiculares por micro-organismos é o principal fator etiológico das patologias

perirradiculares. Os protocolos de desinfecção do sistema de canais radiculares

são compostos, em geral, por várias etapas, entre elas, a instrumentação

mecânica, a irrigação com soluções antimicrobianas, a remoção da smear layer,

a utilização de medicação intracanal, a obturação do sistema dos canais e a

restauração coronária.

O objetivo primordial do preparo químico e mecânico é promover a

limpeza, a desinfecção e a modelagem do canal radicular. Enquanto os

instrumentos endodônticos promovem a remoção mecânica de micro-

organismos, de seus produtos e de tecidos degenerados, a substância química

maximiza a remoção de detritos, através da ação física do fluxo e refluxo e

também pela ação química, desde que possua atividade antimicrobiana e

solvente de matéria orgânica (LOPES et al., 2010a). Esta etapa do tratamento é

de extrema importância na desinfecção dos canais radiculares, uma vez que os

instrumentos endodônticos e as soluções irrigadoras auxiliares atuam

11

principalmente no canal principal, no qual se concentra a maior quantidade de

células bacterianas.

A ação física da solução irrigadora (fluxo e refluxo) é capaz de reduzir

significativamente a população microbiana (BYSTRÖM & SUNDQVIST, 1981;

SIQUEIRA et al., 1999). Apesar de alguns estudos (DALTON et al.,1998;

SIQUEIRA et al., 1999) constatarem uma redução considerável na população

microbiana após o preparo químico e mecânico com soluções sem atividade

antimicrobiana, a eliminação total não foi demonstrada. Soluções irrigadoras

com propriedades antimicrobianas devem ser empregadas buscando a máxima

eliminação de micro-organismos durante o preparo químico e mecânico

(SIQUEIRA et al., 2010b).

De acordo com o estudo realizado por CIUCCHI et al. (1989), a

eficácia do protocolo de irrigação é dependente da natureza química do agente

irrigante, do tempo de ação do mesmo e da capacidade do irrigante de entrar em

contato com todo o sistema de canais radiculares..

A permanência de micro-organismos em canais acessórios, laterais,

ramificações apicais, reentrâncias do canal principal, anastomoses e no interior

de túbulos dentinários, principalmente na região apical, mesmo após o preparo

químico e mecânico, pode causar o fracasso da terapia endodôntica. Devido a

estas complexidades anatômicas, 30% a 50% da área dos canais radiculares

permanece intocada após o preparo químico e mecânico (KISHEN, 2012).

Atualmente, temos disponível uma grande variedade de instrumentos

endodônticos para realizarmos o preparo mecânico dos canais radiculares. A

ação dos instrumentos, no entanto, ocorre apenas na luz do canal principal.

Sendo assim, a utilização de uma substância antimicrobiana auxiliar à

12

instrumentação mecânica visa, não somente, facilitar a ação dos instrumentos

endodônticos no canal principal, como também, atuar física e quimicamente na

desinfecção do sistema de canais radiculares.

A necessidade do emprego de soluções irrigantes durante o preparo

dos canais radiculares é incontestável. A ação física da irrigação, juntamente

com a aspiração mecânica, promove uma circulação hidráulica pelo interior do

canal radicular, arrastando matéria orgânica, micro-organismos e raspas de

dentina. Já a ação química, tem como principais objetivos promover a dissolução

de tecido orgânico, inorgânico e a desinfecção.

Há décadas, os pesquisadores vêm buscando uma solução irrigadora

ideal. O hipoclorito de sódio (NaOCl) tem sido utilizado por mais de quatro

décadas. Dentre suas propriedades químicas, podemos destacar a excelente

ação antimicrobiana e solvente de matéria orgânica, porém em altas

concentrações é uma substância tóxica aos tecidos perirradiculares

(KURUVILLA & KAMATH, 1998).

A clorexidina (CHX) surgiu como uma alternativa ao NaOCl,

principalmente em casos de pacientes com hipersensibilidade ao cloro e ápices

incompletamente formados. Sua grande vantagem está em sua atividade

antimicrobiana prolongada (PARSONS et al., 1980), porém demonstrou não ser

capaz de dissolver matéria orgânica (MOHAMMADI & ABBOT, 2009).

Mais recentemente, a alexidina (ALX), uma substância muito utilizada

em soluções desinfetantes de lentes de contato, tem sido pesquisada como um

possível irrigante endodôntico. Trata-se de uma bisbiguanida com efeito

antimicrobiano, que possui maior afinidade, em comparação com a CHX, pela

maioria dos fatores de virulência bacterianos, como lipopolissacarídeos e o LTA.

13

Comparando a estrutura química da ALX com a da CHX, observamos que na

ALX, o grupo p-clorofenil terminal é substituído pelo etilhexil (fig. 3). Estudos

recentes mostraram que a ALX apresenta um tempo de atividade residual maior

do que a CHX e uma ação bactericida mais veloz, pois altera mais rapidamente

a permeabilidade da membrana bacteriana (ZORKO & JERALA, 2008).

Fig. 3 – Estrutura química dos antimicrobianos clorexidina e alexidina

14

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Antimicrobianos em Endodontia

O NaOCl foi utilizado pela primeira vez na Endodontia em 1972,

com o nome de Água de Javele, uma mistura de NaOCl e potássio. Labarraque,

em 1820, utilizava o NaOCl 2,5% para desinfetar feridas. Porém, Dakin, em

1915, durante a Primeira Guerra Mundial, observou que utilizando a solução de

Labarraque, as feridas cicatrizavam lentamente, atribuindo tal fato ao alto teor

de hidróxido de sódio presente na solução. O estudioso, então, propôs a

utilização de uma solução de NaOCl 0,5%, tamponada com ácido bórico 0,4%,

objetivando reduzir o pH da solução de 11 para 9, tornado-a mais neutra. Essa

nova formulação ficou conhecida como Líquido de Dakin (ESTRELA et al., 1999;

ZEHNDER et al., 2002).

De acordo com ESTRELA (2004), foi Barret, no ano de 1917, quem

difundiu o uso do Líquido de Dakin como irrigante durante o tratamento de canais

radiculares, apontando sua eficiência como antisséptico. Desde então, o NaOCl

vem sendo utilizado amplamente em Endodontia, pois além das propriedades de

ação clareadora, desodorizante, lubrificante, detergente e solvente de tecido

orgânico, o NaOCl tem se mostrado um excelente agente desinfetante

(SIQUEIRA et al., 1997).

Em 1936, WALKER preconizou a utilização do NaOCl 5% (soda

clorada) para irrigar dentes com polpas necrosadas.

GROSSMAN, em 1943, apresentou um método de irrigação que

associava o NaOCl 5% com o peróxido de hidrogênio 3%. Essa associação

15

produzia efervescência, favorecendo a eliminação de restos orgânicos e micro-

organismos.

Em 1988, PAIVA & ANTONIAZZI preconizaram o emprego de uma

combinação de peróxido de uréia e detergente, veiculados numa base de

Carbowax, originando a fórmula comercial Endo-PTC® (peróxido de carbamida

10%, Tween80 15% veiculados em uma base de CarboWax 75%). O Endo-

PTC® utilizado em associação com o NaOCl 0,5% também produz

efervescência, auxiliando na eliminação de micro-organismos.

O NaOCl tem ação antimicrobiana de amplo espectro. Esta

substância pode eliminar rapidamente bactérias na forma vegetativa, fungos,

protozoários e vírus (incluindo HIV, rotavírus, vírus herpes simples 1 e 2 e vírus

da hepatite A e B). Para eliminar bacilos ácido-resistentes e esporos bacterianos

são necessárias concentrações mais altas (BYSTRÖM & SUNDQVIST,1983;

SIQUEIRA et al., 1997). Embora os efeitos antibacterianos do NaOCl sejam

reconhecidos, o exato mecanismo de ação não está devidamente elucidado.

Supõe-se que quando o NaOCl se associa à água, forma o ácido hipocloroso,

que contém cloro ativo, um forte agente oxidante. O cloro exerce sua ação

antibacteriana através de uma oxidação irreversível de grupamentos sulfidrila de

enzimas essenciais aos micro-organismos, desativando funções metabólicas da

célula bacteriana (RUTALA & WEBER,1997; SIQUEIRA, 2001). O NaOCl

também pode ter um efeito deletério ao DNA bacteriano, formando derivados

clorados das bases de nucleotídeos. O NaOCl também pode induzir o

rompimento da membrana bacteriana. Além disso, de acordo com MC DONNEL

& RUSSEL (1999), a reação do NaOCl com ácidos graxos e lipídios provoca a

dissolução de tecidos orgânicos, transformando-os em sabão e álcool. O ácido

16

hipocloroso e os íons hipoclorito levam à hidrólise e degradação dos

aminoácidos.

Ainda não existe consenso na literatura sobre a concentração ideal

do NaOCl a ser utilizada. Sabe-se que quanto maior a concentração da

substância, maior será sua efetividade antimicrobiana, desde que outros fatores,

como pH, temperatura e conteúdo orgânico, se mantenham constantes. Porém,

a toxicidade em relação aos tecidos periapicais também aumenta, e isso deve

ser levado em consideração no momento da escolha da solução irrigadora,

devendo o endodontista optar por substâncias cujas concentrações permitam

maior biocompatibilidade, sem interferir significamente na atividade

antimicrobiana. O efeito da concentração pode e deve ser compensado através

de uma irrigação copiosa e frequente (SIQUEIRA, 2001).

HARRISON et al. (1990), avaliaram as propriedades antimicrobianas

do NaOCl 2,62% e 5,25% contra os micro-organismos Enterococcus faecalis e

Candida albicans. Os autores contaminaram cones de papel absorvente estéreis

com os micro-organismos citados e em seguida, os expuseram às diferentes

concentrações do biocida. Após 45 segundos de exposição ao NaOCl 2,62% e

após 60 segundos de exposição à concentração 5,25%, não houve crescimento

de Enterococcus faecalis. A eliminação da Candida albicans ocorreu após 15

segundos de exposição, em ambas as concentrações.

O NaOCl é o padrão ouro das soluções irrigadoras de canais

radiculares no que se refere à desinfecção, mas substâncias alternativas vêm

sendo estudadas, dentre as quais destacamos a CHX e a ALX.

A CHX é uma biguanida catiônica que atua por adsorção na parede

celular do micro-organismo, causando derrame de componentes intracelulares.

17

Em altas concentrações (2%) apresenta efeito bactericida, pois age rompendo a

parede celular, já em baixas concentrações (0,2%), a CHX tem efeito

bacteriostático, inibindo funções da membrana, sendo seu efeito mantido por

várias horas, graças a sua excelente substantividade. A CHX possui leve caráter

ácido, com pH variando de 5,5 a 6,0, apresentando habilidade de doar prótons

(ZEHNDER, 2006).

Estruturamente, a CHX é composta por dois anéis clorofenólicos nas

extremidades, ligados por um grupamento de biguanida de cada lado,

conectados por uma cadeia central de hexametileno. Trata-se de uma base forte,

praticamente insolúvel em água, por isso preparada na forma de sal, o que

aumenta a solubilidade da substância, sendo o sal digluconato de clorexidina em

solução aquosa, a apresentação mais utilizada em Odontolgia (DENLEY et al.,

1982).

A CHX possui amplo espectro de ação, atuando contra um grande

número de micro-organismos Gram-positivos e negativos, leveduras, aeróbios e

anaeróbios facultativos (DENLEY et al., 1982; OZTAN, 2002; OKINO, 2004).

A CHX foi utilizada pela primeira vez na Grã Bretanha em 1954, como

antisséptico para ferimentos da pele, e em 1959 seu uso foi iniciado em

Odontologia, através de bochechos. A substância tem sido proposta como um

possível substituto ao NaOCl, por apresentar menor toxicidade, ação

antimicrobiana contra espécies resistentes ao NaOCl, menor tensão superficial

e capacidade residual.

O estudo de PARSONS et al. (1980), foi um dos primeiros a sugerir o

uso da CHX no tratamento endodôntico. Os autores analisaram a adsorção,

liberação e atividade antibacteriana da CHX contra Streptococcus faecalis, em

18

polpas bovinas e amostras de dentina. As amostras tratadas com CHX não

evidenciaram contaminação após 48 e 72 horas de exposição ao micro-

organismo. Com os resultados, os autores confirmaram a atividade

antibacteriana e o efeito residual da substância.

RINGEL et al., em 1982, compararam in vitro o efeito da CHX 0,2% e

do NaOCl 2,5% como irrigantes endodônticos. Os autores concluíram que o

NaOCl foi mais eficaz do que a CHX, quando utilizados durante o tratamento

endodôntico de dentes com necrose pulpar.

Em 1994, JEANSONNE & WHITE mostraram o efeito antimicrobiano

da CHX 2% e o NaOCl 5,25%, como irrigantes endodônticos. Foram utilizadas

amostras microbiológicas coletadas após a instrumentação de dentes humanos

com necrose pulpar. A irrigação com os biocidas reduziu significativamente o

número de colônias, em relação à irrigação com solução salina, mas os autores

não encontraram diferença estatisticamente significante entre as substâncias.

Outra observação importante foi que após 24 horas, a CHX mostrou atividade

antimicrobiana em 83% das amostras e o NaOCl em apenas 50%.

KURUVILLA & KAMATH (1998) avaliaram a capacidade

antimicrobiana de: NaOCl 2,5%, CHX 0,2%, NaOCl 2,5% e CHX 0,2%

misturados na proporção 1:1 e como controle, solução fisiológica. A redução no

número de micro-organismos ocorreu em 59,4% das amostras do NaOCl, 70%

das amostras da CHX e em 84,6% das amostras da associação das substâncias.

Os autores observaram a formação de uma substância acastanhada após a

associação do NaOCl e da CHX, que permaneceu na parte interna das raízes,

porém não foi observada na parte externa das mesmas.

19

LEONARDO et al., em 1999, avaliaram in vivo a atividade

antimicrobiana da CHX 2% como irrigante endodôntico, utilizando uma amostra

de 22 canais radiculares com polpas necrosadas, composta por incisivos e

molares de 12 pacientes. As coletas foram feitas através de cones de papel

esterilizados em 3 momentos: antes do preparo químico e mecânico,

imediatamente após a irrigação final e após 48 da irrigação final, permanecendo

o conduto radicular vazio. Os testes utilizados foram métodos de cultura

microbiológica e difusão em ágar com Micrococcus luteus (ATCC 9341). As

análises mostraram uma redução de micro-organismos anaeróbios em 77.78%

das amostras utilizando a CHX 2% como irrigante, além de apresentar um efeito

residual por até 48 horas.

Em 1999, SEN et al. realizaram um estudo ex vivo com o objetivo de

avaliar a atividade antifúngica da CHX 0.12% e do NaOCl a 1% e 5%. Para tal,

utilizaram 266 fragmentos radiculares, dos quais em 133 houve remoção da

smear layer, enquanto na metade restante não houve remoção da lama

dentinária. Todas as amostras foram contaminadas com Candida albicans e, em

seguida, expostas aos antimicrobianos durante 1, 5, 30 e 60 minutos. No grupo

com smear layer, os biocidas mostraram atividade antifúngica após 1 hora de

exposição, enquanto no grupo sem smear layer, o NaOCl 5% mostrou atividade

antifúngica após 30 minutos.

GOMES et al. (2001) avaliaram in vivo a capacidade antimicrobiana

de diferentes concentrações de NaOCl (0,5%, 1%, 2,5%, 4% e 5%) e da CHX

em gel e em solução, também em diferentes concentrações (0,2%, 1% e 2%)

contra o Enterococcus faecalis. A conclusão dos autores foi de que a eliminação

do micro-organismo depende do tempo de exposição e da concentração do

20

biocida. Os melhores resultados foram obtidos com a solução de CHX 2%

associada ao NaOCl 5,25%.

Ainda em 2001, FERRAZ et al. compararam a capacidade de

desinfecção do gel de CHX 2%, com a do NaOCl 5.25% e do natrosol gel em

canais contaminados com Enterococcus faecalis. Os autores coletaram

amostras de 95 dentes humanos unirradiculares extraídos, utilizando cones de

papel esterilizados e analisaram a turbidade do meio de cultura. Também

analisaram, através de microscopia eletrônica de varredura, a limpeza das

paredes radiculares, concluindo que o gel de CHX 2% obteve resultados

semelhantes aos das outras substâncias, podendo ser utilizado como irrigante

endodôntico.

SPRATT et al. (2001) analisaram o efeito biocida das soluções de 5

ppm de prata coloidal, NaOCl 2.25%, CHX 0.2% e iodopovidona 10%. Os

biofilmes foram cultivados sobre filtros de discos de membrana e expostos às

substâncias biocidas por um período de 15 minutos a 1 hora. Para a contagem

de unidades formadoras de colônias (UFC), as bactérias foram removidas dos

discos e incubadas em anaerobiose. Os autores concluíram que a prata coloidal

foi inefetiva contra todas as cepas testadas, enquanto o NaOCl foi a solução

mais eficiente entre as testadas.

LEONARDO et al., em 2001, compararam ex vivo a atividade

antimicrobiana das soluções irrigantes Endoquil (detergente de óleo de rícino),

CHX 2% e NaOCl 0.5% e 2% contra cepas de cocci Gram-positivos (Micrococcus

luteus, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus

epidermidis, Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus), rods Gram-

negativos (Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa) e o fungo Candida

21

albicans. A técnica utilizada foi a de difusão em ágar, mantendo as placas 2

horas para a pré-difusão das soluções e incubação por 24 horas em jarro de

anaerobiose. Após as medições dos halos de inibição, os autores concluíram

que a CHX 2% inibiu todas as cepas, o Endoquil foi efetivo contra os micro-

organismos Gram-positivos e o NaOCl 0.5% foi efetivo contra o Staphylococcus

aureus.

TANOMARU FILHO et al. (2002) avaliaram a resposta inflamatória de

alguns irrigantes endodônticos injetados no interior da cavidade peritonial de

ratos. Os resultados mostraram que o NaOCl 0,5% causou intensa irritação

tecidual, enquanto a CHX 2% mostrou ser biocompatível.

ESTRELA et al. (2003) realizaram o teste de difusão em ágar e

exposição direta para analisarem o efeito antimicrobiano do NaOCl 2% e da CHX

2% contra cinco cepas de micro-organismos e a mistura delas (Staphylococcus

aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e

Candida albicans). O melhor resultado foi encontrado no grupo do NaOCl,

seguido pelo grupo da CHX.

Em 2003, SASSONE et al. analisaram ex vivo a atividade

antimicrobiana do NaOCl em diferentes concentrações (1% e 5%) e a CHX

(0.12%, 0.5% e 1%) através de teste de contato direto utilizando cepas de

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Porphyromonas

gingivalis e Fusobacterium nucleatum. As cepas foram expostas aos

antimicrobianos durante 5, 10 e 30 minutos, com uma repetição de 10 vezes. A

CHX 0.12% não foi capaz de eliminar o Enterococcus faecalis, independente do

tempo de exposição. A CHX 0.5% e 1% e o NaOCl 1% e 5% foram capazes de

eliminar o Enterococcus faecalis.

22

YAMASHITA et al. (2003) analisaram através de microscopia

eletrônica de varredura a capacidade da CHX em limpar os canais rediculares,

comparando-a com o NaOCl 2.5% isoladamente e com o NaOCl 2.5% associado

ao EDTA durante 3 minutos. O grupo da CHX foi o que apresentou os piores

resultados.

Um estudo in vivo realizado por ZAMANY et al., em 2003, objetivou

avaliar se a irrigação final com CHX 2% aumentaria a desinfecção do sistema de

canais radiculares. Foram selecionados 24 pacientes com dentes unirradiculares

com polpas necrosadas e lesão periapical evidente radiograficamente. Desse

grupo, metade recebeu irrigação final com a CHX 2%. As amostras foram

coletadas antes do preparo químico e mecânico, após o preparo e após a

irrigação final com o antimicrobiano analisado e incubadas em meio de cultura

durante 4 semanas. A metade que recebeu irrigação final com a CHX 2%

apresentou crescimento microbiano em apenas uma amostra, enquanto o outro

grupo apresentou crescimento em sete amostras.

VIANNA et al. (2004) analisaram ex vivo a atividade antimicrobiana

da CHX em gel e líquida nas concentrações de 0.2%, 1% e 2% e do NaOCl nas

concentrações de 0.5%, 1%, 2.5%, 4% e 5.25% contra patógenos comuns nas

infecções endodônticas. Os autores diluíram os micro-organismos em caldo e

marcaram o tempo que o biocida levou para eliminá-los. A CHX 2% em gel e na

forma líquida eliminou o Staphylococcus aureus e a Candida albicans em 15

segundos, enquanto a forma gel eliminou o Enterococcus faecalis em 1 minuto.

Em média, o tempo necessário para a CHX 1% e 2% líquida e o NaOCl 5.25%

eliminarem todos os micro-organismos foi semelhante.

23

DAMETTO et al., em 2005, compararam ex vivo a atividade

antimicrobiana da CHX a 2% em gel com as soluções de CHX 2% e NaOCl

5.25%. A amostra foi composta por 80 raízes de pré-molares inferiores humanos

contaminados com Enterococcus faecalis por 7 dias. As coletas foram realizadas

antes e após a instrumentação e após os dentes serem preenchidos com caldo

BHI e selados durante 7 dias. A análise foi feita através de plaqueamento e

contagem de UFC. A CHX 2% em gel e em solução foi capaz de reduzir a carga

bacteriana após a instrumentação e após 7 dias, enquanto o NaOCl 5.25%

reduziu a carga bacteriana apenas após a instrumentação.

PORTENIER et al. (2005) compararam a susceptibilidade das células

de Enterococcus faecalis (cepas VP3-80 e A197A), durante as fases de

crescimento, estacionária e declínio, a solução saturada de hidróxido de cálcio,

CHX 0.05% e NaOCl 0.00001%. .Os autores utilizaram a microscopia eletrônica

de varredura e concluíram que as células na fase de crescimento são mais

suscetíveis, sendo eliminadas entre 3 segundos e 10 minutos. Na fase

estacionária, elas se mostraram mais resistentes do que na fase anterior,

apresentando viabilidade mesmo após 10 minutos, porém a maior resistência foi

encontrada na fase de declínio, não havendo a eliminação total após 10 minutos

de exposição, além do aumento do número de células sobreviventes em culturas

bacterianas.

Em 2005, VIVACQUA-GOMES et al. analisaram a permanência do

Enterococcus faecalis após o tratamento endodôntico realizado em sessão única

e em múltiplas sessões. Os autores utilizaram 45 pré-molares humanos

extraídos e infectados com o micro-organismo por 60 dias. Eles foram divididos

em cinco grupos: o grupo 1 recebeu irrigação com CHX 2% e obturação em

24

sessão única, o grupo 2 foi irrigado com CHX 2%, medicado com hidróxido de

cálcio durante 14 dias e obturado, o grupo 3 foi irrigado com CHX 2% e obturado

após 7 dias, o grupo 4 foi irrigado com soro fisiológico e obturado após 7 dias e

o grupo 5 foi irrigado com soro fisiológico e obturado imediatamente, sem

cimento endodôntico. Após o tratamento, os dentes foram incubados durante 60

dias a 370 C, em seguida, tiveram 5 mm apicais seccionados para contagem de

UFC. A sobrevivência do micro-organismo foi de 20% no grupo 1, 25% no grupo

2, 40% no grupo 3, 60% no grupo 4 e 100% no grupo 5.

CLEGG et al., em 2006, compararam a atividade biocida do NaOCl

15%, 6% e 3%, da CHX 2% e do BioPure MTAD (Dentsply, Tulsa, EUA). Os

autores coletaram material do interior do canal radicular de 10 pacientes com

periodontite apical crônica e os micro-organismos obtidos foram cultivados em

hemi-secções de ápices radiculares humanos, sendo, separadamente imersos

nos biocidas analisados. A observação feita com auxílio da microscopia

eletrônica de varredura mostrou que o NaOCl 3% e 6% foi capaz de eliminar o

biofilme, o MTAD foi capaz de desorganizar, mas não eliminou o biofilme

formado, enquanto a CHX 2% não foi capaz de desorganizar o biofilme.

RUFF et al., em 2006 compararam ex vivo a eficácia antifúngica do

NaOCl 6%, da CHX 2%, do EDTA 17% e do BioPure MTAD utilizados como

irrigantes finais. 48 dentes humanos foram inoculados com Candida albicans

(ATCC 60193) e incubados por 72 horas. Após a irrigação, alíquotas das

amostras foram plaqueadas para contagem de UFC. Os resultados mostraram

que o NaOCl 6% e a CHX 2% foram efetivos e significativamente superiores ao

BioPure MTAD e EDTA 17% na atividade antifúngica.

25

BASRANI et al., em 2007, analisaram qualitativa e quantitativamente

o produto formado após a mistura do NaOCl e a CHX. Os resultados mostraram

que existe uma reação entre as duas substâncias, mesmo em baixas

concentrações. Os autores também observaram a presença de uma substância

denominada paracloroanilina, em concentração proporcional à concentração do

NaOCl.

ESTRELA et al. (2007) verificaram a eficácia antimicrobiana de

soluções irrigantes a base de água ozonizada, ozônio gasoso, NaOCl 2.5% e

CHX 2% em dentes ântero-superiores de humanos, extraídos e infectados com

Enterococcus faecalis durante 60 dias. As amostras foram colocadas num

dispositivo que permitia a circulação do meio de cultura, com o auxílio de uma

bomba peristáltica (50 ml/min, durante 20 minutos por dia). Após exposição aos

biocidas testados, os autores concluíram que nenhuma solução demonstrou

efetividade antibacteriana contra o Enterococcus faecalis, mesmo após 10

minutos.

Em 2007, OLIVEIRA et al. estudaram ex vivo a ação antimicrobiana

do gel de CHX 2%, comparado ao NaOCl 1,5% e 5,25% contra Enterococcus

faecalis. A amostra foi composta por 80 molares humanos inoculados por 7 dias

e a coleta aconteceu em 3 momentos: antes do preparo químico e mecânico,

imediatamente após o preparo e 7 dias após o preparo. Alíquotas de cada

amostra foram coletadas e plaqueadas para a contagem de UFC. Os autores

concluíram que o gel de CHX 2% e o NaOCl 5,25% possuem atividades

semelhantes contra o micro-organismo, mesmo 7 dias após o preparo químico e

mecânico.

26

SIQUEIRA et al., em 2007, avaliaram in vivo a redução bacteriana

após o preparo químico e mecânico utilizando a CHX 0.12% como irrigante e

uma medicação intracanal associando hidróxido de cálcio e CHX 0.12% em gel.

A amostra foi composta por 13 dentes com infecção primária e periodontite apical

crônica, dos quais houve coleta antes do preparo, imediatamente após o preparo

e sete dias após o uso da medicação intracanal. O material coletado foi cultivado

e analisado através da contagem e identificação pela análise sequencial do RNA

do gene ribossômico 16S. Na primeira coleta, todos os canais apresentavam

bactérias, com uma média de 3 espécies por canal, na segunda coleta, 53.8%

dos canais apresentaram bactérias, com uma média de 1.7 espécies por canal.

Já na terceira coleta, apenas 7.7% dos canais apresentaram bactérias. Os

autores concluíram que a irrigação com CHX a 0.12% foi eficaz em reduzir a

carga bacteriana em mais da metade das amostras.

Em 2008, KISHEN et al. estudaram qual substância irrigante poderia

reduzir a adesão das bactérias ao substrato de dentina. Os autores concluíram

que a irrigação com NaOCl, seguida de EDTA e CHX tem a maior capacidade

de diminuir a adesão de bactérias à dentina. Os autores ressaltam o cuidado de

intercalar o EDTA entre o NaOCl e a CHX, evitando assim a formação da

paracloroanilina.

SASSONE et al., em 2008, avaliaram ex vivo a capacidade

antimicrobiana do NaOCl 1% e 5% e da CHX 0.12%, 0.5% e 1%, com ou sem

adição de material orgânico bovino (BSA), contra cepas bacterianas de

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Porphyromonas

gingivalis e Fusobacterium nucleatum. Os autores utilizaram dois tipos de testes

de atividade, contato direto e difusão em ágar. No teste de contato direto, a CHX

27

0.12% não eliminou o Enterococcus faecalis nos tempos experimentais,

enquanto todas as outras amostras foram eliminadas pelos outros biocidas. O

BSA não interferiu na atividade antimicrobiana das soluções irrigantes. No teste

de difusão em ágar, todos os biocidas exibiram zonas de atividade

antimicrobiana, entretanto o BSA interferiu na precisão do teste. O trabalho

concluiu que a CHX 0.12% não foi capaz de eliminar o Enterococcus faecalis,

enquanto a CHX 0.5% e 1% e o NaOCl 1% e 5% foram efetivos contra todas as

cepas.

A ALX difere quimicamente da CHX pela presença de grupos etilhexilo

nas extremidades da molécula, no lugar do grupo clorofenil. Essa substância

possui atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-

negativas e atua contra células tumorais com características específicas. A ALX

é comumente utilizada em enxaguatórios bucais e em soluções para limpeza de

lentes de contato.

As pesquisas sobre a ação da ALX no controle da formação da placa

dental datam da década de 70 do século XX. Quatro estudos duplo cego

indicaram que um enxaguatório bucal contendo ALX foi efetivo no controle da

placa dental (CARLSON et al., 1977; LOBENE & SOPARKAR, 1973). Em todos

os estudos houve uma redução significante nos índices de gengivite.

Em 1981, ADDY & ROBERTS compararam ex vivo as propriedades

antibacterianas de antissépticos bucais contendo CHX, ALX, cloreto de

cetilpiridínio e hexetidine. Os resultados mostraram que a ALX foi capaz de

manter a redução dos níveis bacterianos na saliva durante 3 horas e a CHX

durante 5 horas.

28

De acordo com ZORKO & JERALA (2008), comparativamente com a

CHX, a ALX possui uma maior afinidade pela maioria dos fatores de virulência

bacterianos, como lipopolissacarídeos e o ácido lipoteicóico (LTA).

Em 2012, KIM et al. avaliaram a interação química entre a ALX e o

NaOCl, misturando diferentes concentrações de ALX (0.125%, 0.25%, 0.5% e

1%) com NaOCl 4%. Os autores pesquisaram especificamente se a mistura

dessas substâncias gerava paracloroanilina (PCA), um precipitado marrom,

assim como ocorre na mistura entre a CHX e o NaOCl. A análise feita através

de espectometria de cromatografia de massa revelou que a mistura da ALX com

o NaOCl não gera qualquer precipitado, e quanto menor a concentração da ALX,

mais transparente é a solução gerada.

Em 2013, KIM et al. compararam ex vivo, pela primeira vez na

literatura, a atividade antimicrobiana da ALX 1% e a CHX 2% contra

Enterococcus faecalis. Os autores contaminaram 60 blocos de dentina bovina,

utilizando um aparato sugerido por LUPPENS et al., em 2002. A formação do

biofilme foi induzida durante 24 horas e em seguida, os blocos de dentina foram

imersos nos biocidas durante 5 e 10 minutos. O efeito antimicrobiano foi avaliado

através da contagem do número de bactérias aderidas às paredes dentinárias e

observação de modificação no formato da célula bacteriana ou ruptura de sua

membrana através do uso de um microscópio eletrônico de varredura. Uma

redução significativa no número de bactérias aderidas às paredes dentinárias foi

observado nos grupos que entraram em contato com as substâncias, se

comparados com o grupo controle (p< 0.05). Porém, não houve diferença

significante no número de bactérias aderidas às paredes dentinárias entre os

grupos da CHX e da ALX (p> 0.05). A ruptura da membrana bacteriana foi mais

29

observada nos grupos imersos nos biocidas durante 10 minutos, em comparação

com os grupos nos quais o contato com os biocidas durou apenas 5 minutos. Os

autores concluíram que o uso dos biocidas ALX 1% e CHX 2%, durante 10

minutos, pode ser efetivo contra o micro-organismo Enterococcus faecalis.

BARRIOS et al., em 2013, utilizaram blocos de dentina humana para

avaliarem, ex vivo, a substantividade das soluções de CHX 0.5%, CHX 2%, ALX

1% e ALX 2%. Os blocos de dentina foram contaminados com Enterococcus

faecalis, expostos aos antimicrobianos durante 1 minuto e o crescimento

bacteriano foi acompanhado durante 80 dias. Os grupos expostos a ALX

obtiveram resultados significativamente melhores de que os grupos expostos a

CHX. Todas as amostras dos grupos expostos a CHX apresentaram

contaminação ao final do estudo, apresentando uma relação direta entre a

concentração utilizada e o tempo de sobrevivência do micro-organismo. Não

houve diferença significante entre a ALX 1% e 2%. Os autores concluíram que o

uso do biocida ALX 1% ou 2%, durante 1 minuto, promove uma longa atividade

antimicrobiana (substantividade) contra o Enterococcus faecalis,

comparativamente ao uso da CHX 0.5% e 2%.

Em 2014, RUIZ-LINARES et al. avaliaram a atividade antimicrobiana

da ALX 0,2%, 0,5%, 1% e 2% , da CHX 0,2% e 2% e do cetrimide 0,2% contra o

Streptococcus mutans em superfícies de dentina humana desmineralizada. Os

autores concluíram que os antimicrobianos ALX 1% e 2% e centrimide 0,2%,

utilizados durante 1 minuto, foram capazes de erradicar o biofilme de

Streptococcus mutans, nas condições do estudo.

30

3. JUSTIFICATIVA

Tendo em vista os casos que o insucesso do tratamento endodôntico

está fortemente associado à permanência de micro-organismos organizados em

biofilmes, no interior do sistema de canais radiculares, e que os irrigantes

comumente utilizados para a desinfecção do sistema não são ideais, justifica-se

investigar a atividade antimicrobiana de um irrigante promissor, a ALX e

compara-la a das substâncias mais utilizadas atualmente, NaOCl e CHX.

31

4. HIPÓTESE

A solução de ALX 1% possui capacidade antimicrobiana maior que a

da CHX 2% e similar ao NaOCl 2,5%.

32

5. OBJETIVOS

As propostas deste estudo foram: 1- comparar a atividade

antimicrobiana da ALX 1% com a do NaOCl 2,5% e da CHX 2%. 2- avaliar o

potencial antimicrobiano da ALX 1% como irrigante final, combinada ao NaOCl

2%, compatando-o com aquelas soluções testadas individualmente no objetivo

1.

33

6. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1. Obtenção e preparação das amostras

Após a revisão e aprovação do presente estudo pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Universidade Estácio de Sá (CEP/UNESA), em 14 de setembro de

2014, CAAE nº 3455.1212.2.0000.5284 (Anexo I), foram obtidos do banco de

dentes da UNESA, 64 caninos superiores humanos, sem tratamento

endodôntico e com raízes hígidas, mantidos em soro fisiológico até a realização

do experimento.

Dando início às etapas de preparação das amostras, a coroa e o terço

apical dos dentes foram separados por secção transversal e descartados. Os

fragmentos do terço médio, foram então seccionados longitudinalmente gerando

dois fragmentos, que foram ambos separados para o estudo. No total, 104

fragmentos foram preparados para o experimento. Cada fragmento selecionado

foi cortado nas laterais, para que cada um apresentasse uma área de 25 mm2.

Um disco diamantado (Coraldent, São Paulo, Brasil) e um paquímetro digital

(Mitutoyo, São Paulo, Brasil) foram utilizados para a realização desta etapa.

Logo após, com o objetivo de remover a smear layer, gerada pelo corte,

os fragmentos de raiz foram submersos em EDTA 17% e agitados em cubra

ultrassônica (Cristófoli, Rio Grande do Sul, Brasil), durante 30 segundos, na

potência de 40 Hz. Em seguida, os fragmentos foram: mergulhados em solução

de NaOCl 2,5% (Super Globo Química Ltda., Minas Gerais, Brasil), mantidos

submersos por 1 minuto, lavados com água destilada e autoclavados.

6.2. Formação de biofilmes de E. faecalis sobre os fragmentos radiculares

34

Os fragmentos radiculares foram infectados com E. faecalis, com o auxílio

de um dispositivo denominado TeethBioForm (TBF). Este produto foi adaptado

a partir do aparato desenvolvido por LUPPENS (2002), para ser utilizado no

presente estudo. Cumpre destacar que a partir desta inovação foi submetido um

pedido de patente junto ao Instituto Nacional de Propriedade Industrial,

registrado com o número (INCLUIR) (ANEXO – anexar o documento: parte dele

que contém o número).

O TBF é composto por duas bases em acrílico transparente que medem

cada uma, 7 cm de largura, 8 cm de altura e 1,5 cm de espessura. A base da

direita, na qual ocorre a entrada do fluido, possui 4 parafusos sextavados de aço

inoxidável (304) com 4 mm de diâmetro cada um, posicionados a 1.5 cm das

laterais da base e uma abertura em círculo, com 3,5 cm de diâmetro, dando

acesso a um tubo também em acrílico transparente, distando 1,3 cm das bordas

inferiores das bases e com 25,4 cm de comprimento. O tubo conecta a base da

direita com a base da esquerda e abriga uma bandeja removível de acrílico

transparente medindo 26 cm de comprimento, 3,3 cm de largura e 5 mm de

espessura. A bandeja possui 12 slots projetados para acomodar amostras

dentárias medindo, cada um, 1 cm de comprimento, 3,3 cm de largura e 1 mm

de profundidade. Porém, podemos utilizar mais amostras, dependendo do

tamanho. A distancia entre cada siot é de 1 cm. O TBF é hermeticamente

fechado através de um quadrado de acrílico que mede 6 cm de altura, 6 cm de

largura e 1,4 cm de espessura e possui quatro aberturas em circulo com 6 mm

cada urna, permitindo o encaixe dos parafusos que estão presos á base da

direita. Após o encaixe do quadrado nos parafusos da base, os mesmos são

apertados com 4 arruelas niqueladas com 1,2 cm de diâmetro e lúmen de 5 mm,

35

cada uma e 4 borboletas niqueladas. O quadrado que permite o fechamento do

dispositivo possui ainda um oring com 4,3 cm de diâmetro posicionado a 9 mm

da borda inferior da base direita, circundando toda a abertura em círculo da base

direita, auxiliando no vedamento do TBF. Para permitir a entrada do fluido, o

quadrado para fechamento do dispositivo possui rosqueado a ele, um bico em

PVC com uma abertura de 4 mm, na qual uma mangueira será acoplada. A

distância entre o bico e a borda inferior da base é de 1,7 cm. A base esquerda

também possui um bico idêntico, porém posicionado a uma distância de 3,6 cm

da borda inferior da base, no qual também será acoplada uma mangueira para

permitir a saída do fluido (fig. 4).

Fig. 4 – Desenho técnico do TBF: (A) visão lateral do TBF, (B) visão laterla da bandeja, (C) visão da parte superior da bandeja, (D) visão inferior da parte inferior da bandeja, (E) oring,

(F) bicos plásticos, (G) borboletas de metal, (H) arruelas de metal (I e J), parafusos (K e L), visão da base lateral direita (M) Visão da base lateral esquerda

36

O TBF foi conectado a uma bomba peristáltica (Exatta, Santa Catarina,

Brasil) e a dois recipientes de vidro, com capacidade para 9 litros (Vidroquímica,

Rio de Janeiro, Brasil), um que recebeu o meio de cultura e outro para o descarte

do meio após a passagem pelo TBF (fig. 5). As conexões foram feitas através

de mangueiras de silicone com diâmetro de 9 mm (Mantova, Rio Grande do Sul,

Brasil). . Os recipientes de vidro e as mangueiras acopladas ao TBF, foram

esterilizados em autoclave. O TBF e a mangueira localizada no interior da bomba

peristáltica, foram descontaminados com NaOCl 2,5% durante 30 minutos e, em

seguida, lavados com água destilada estéril.

Fig. 5 – TBF: Esquema dinâmico

O meio de cultura escolhido foi o caldo triptona de soja – TSB (BD

Diagnostic Systems, Heidelberg, Alemanha) com glicose a 1%. Após o preparo,

o meio de cultura foi esterilizado em autoclave. No interior de uma câmara de

37

fluxo laminar (Nuaire, Plymouth, MN, EUA), o caldo TSB transferido para um dos

recipientes de vidro e as mangueiras foram conectadas ao TBF, à bomba

peristáltica e aos recipiente de vidro.

Com o auxílio da cola em gel Super Bonder (Henkel, Düsseldorf,

Alemanha), os 104 fragementos de raiz foram fixados na bandeja do TBF e, em

seguida, o caldo TSB foi bombeado para o interior do TBF durante 30 minutos.

Após os 30 minutos iniciais, o caldo TSB que estava no interior do TBF foi

substituído por 200 ml de um caldo TSB inoculado com uma cultura de 24 horas

do E. faecalis (ATCC 29212), que permaneceu em repouso durante 30 minutos.

Em seguida, todo o conjunto formado pelo TBF, os recipientes de vidro,

as mangueiras e a bomba peristáltica foram levados para estufa a 37º C e a

bomba religada, permanecendo em funcionamento durante mais 24 h, com uma

vasão de 6,25 ml/min. Após esse período, as mangueiras foram cortadas e o

TBF foi levado novamente para o interior da câmara de fluxo laminar. Os

fragmentos de raiz foram então removidos da bandeja e transferidos para placas

de cultura celular com 24 poços (Prolab, São Paulo, Brasil), sendo um fragmento

de raiz depositado em cada poço da placa. Dois fragmentos de raiz foram

separados neste momento para serem analisados através de microscopia

eletrônica de varredura (MEV), a fim de confirmar a formação do biofilme.

38

Fig. 6. Contaminação das amostras

6.3. Ensaio da desinfecção da dentina

Os fragmentos radiculares foram divididos aleatoriamente em quatro

grupos de 20 fragmentos cada, de acordo com o biocida a que foram expostos

(NaOCl, CHX, ALX, NaOCl+ALX). Doze fragmentos foram separados para o

grupo controle.

Com o auxílio de uma pipeta acoplada à ponteiras estéreis (Biosystems,

Curitiba, Paraná, Brasil), os fragmentos de raiz dos grupos NaOCl, CHX e ALX

foram imersos, respectivamente em 1 ml de NaOCl 2,5% (Super Globo Química

Ltda., Minas Gerais, Brasil), CHX 2% (FGM Produtos Odontológicos, Santa

Catarina, Brasil) e ALX 1% durante 10 minutos. A ALX 1% foi preparada diluindo-

se 1g do pó (Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA) em 100 ml de água

destilada estéril. Após o período inicial de 10 minutos, o biocida foi removido, e

as amostras imersas em 1ml de neutralizante universal, durante 15 minutos. O

neutralizante utilizado teve a seguinte composição: Tween 80 a 3%, Lecitina a

0,3%, Histidina a 0,1% e Tiossulfato de sódio a 0,5%.

39

Diferentemente do descrito acima, as amostras do grupo NaOCl + ALX

foram imersas, primeiramente, em NaOCl 2,5% durante 10 minutos, o biocida foi

removido, e em seguida, foram imersas em 1ml de ALX 1%, durante 10 minutos.

Após a retirada da ALX 1%, a neutralização foi realizada com 1 ml do

neutralizante, durante 15 minutos. Os fragmentos de raiz do grupo controle foram

expostos duas vezes seguidas à solução salina estéril, sendo que cada

exposição teve duração de 10 minutos.

Nesta etapa, as placas para cultura celular contendo as amostras de todos

os grupos foram submetidas a um banho de ultrassom (Cristófoli, Rio Grande do

Sul, Brasil), durante 3 minutos, sendo que após cada minuto, houve um período

de descanso de 30 segundos.

Na etapa seguinte, novamente no interior da câmara de fluxo laminar, 20 µl

do sobrenadante de cada amostra foi coletado, com o auxílio de uma

pipeta (Biosystems, Paraná, Brasil) acoplada à ponteira estéril (Biosystems,

Paraná, Brasil), e transferido para um poço de uma placa para cultura

celular contendo 96 poços (Nest Biotechnology, Wuxi, China). Cada poço

continha previamente180 µl de solução salina estéril a 0,9%. Após a

primeira diluição, foram feitas mais 3 diluições seriadas, diluindo-se 20 µl

do sobrenadante do poço anterior em 180 µl de solução salina estéril do

poço seguinte.

Logo após, as quatro diluições 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 foram plaqueadas

em meio de cultura sólido de Agar Mitis salivarius (BD Diagnostic System,

40

Heidelberg, Alemanha) e incubadas em estufa a 370 C, durante 24 horas.

Todos os procedimentos anteriores foram repetidos para todas as

amostras.

Após as 24 horas em estufa, foi realizada a contagem do número de

células viáveis, expresso em unidades formadoras de colônias (UFC). O

fator de diluição e o volume do inóculo foram considerados para o cálculo

do resultado final.

Fig. 7 – Exposição das amostras aos antimicrobianos e contagem das UFC

41

6.5. Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa

SPSS versão 17 (IBM, New York, USA). Os dados de cada parâmetro avaliado

foram submetidos aos testes estatísticos Kruskal-Wallis e Mann Whitney. O nível

de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05).

6.6. Microscopia eletrônica de varredura

Para fixação do material biológico, as amostras separadas para análise

no microscópio eletrônico de varredura foram fixadas, durante 4 dias, em solução

de glutaraldeído 2,5% em tampão de cacodolato de sódio 0,1M (pH 7,4),

preparado com água Mili-Q. Após os 4 dias, a amostra foi retirada dessa solução

e lavada duas vezes em solução tampão de cacodilato de sódio 0,1M, sendo

cada tempo de lavagem de 10 minutos. Em seguida, o material biológico foi

desidratado em álcool 30%, 50%, 70% e 100%, em banhos sequenciais de 5

minutos cada. Por fim, efetuou-se o ponto crítico de secagem do material no

equipamento Leica EM CPD030 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha).

Findo o tempo de secagem, as amostras foram metalizadas com uma camada

de ouro com 15 nm de espessura, utilizando o equipamento Emitech modelo

K550X (Emitech, Ashford, Inglaterra). As amostras foram então analisadas em

microscópio eletrônico de varredura (Inspect F-50, FEI, Hillsboro, Oregon, EUA).

42

7. RESULTADOS

Analisando os dados da tabela 1, verificamos que nos grupos CHX e

NaOCl+ALX houve a eliminação total das células bacterianas em todas as

amostras. O grupo NaOCl apresentou crescimento bacteriano em 1 das 20

amostras analisadas, enquanto o grupo ALX apresentou crescimento em 7 das

20 amostras. Como já era esperado, o grupo controle, imerso em solução salina

estéril, apresentou crescimento bacteriano em todas as 12 amostras Para

comparação estatística dos grupos, o número de UFC contadas não foi levado

em consideração, mas apenas se houve (presente) ou não houve (ausente)

crescimento bacteriano.

Tabela 1 – Contagem de UFC por grupo

Na tabela 2 estão expostos os valores da média, mediana e do intervalo

das UFC multiplicadas pelo fator de diluição. A análise intergrupo (testes de

Kruskal Wallis e Mann Whitney) revelou não haver diferença estatisticamente

significante entre eles (p > 0,05), com exceção da comparação entre os grupos

CHX e ALX (p= 0,004) e entre os grupos NaOCl+ALX e ALX (p= 0,004).

43

44

45

8. DISCUSSÃO

Biofilmes bacterianos são frequentemente encontrados no sistema de

canais radiculares de dentes que apresentam periodontite apical. Na

Endodontia, a lógica é a mesma. A instrumentação dos canais radiculares é

considerada uma etapa importante no tratamento endodôntico, pois tem o

objetivo de promover a limpeza e modelagem do sistema de canais radiculares

por meio da ação mecânica dos instrumentos endodônticos cortantes (LOPES

et al., 2010a). Essa etapa tem um papel fundamental no controle microbiano dos

canais radiculares infectados, já que seu principal objetivo é a máxima redução

do número de micro-organismos localizados na luz do canal principal. Porém,

biofilmes bacterianos podem permanecer em áreas do canal principal não

tocadas pelos instrumentos, ou em áreas distantes do mesmo, como no interior

de túbulos dentinários, istmos e ramificações laterais ou apicais (RICUCCI &

SIQUEIRA, 2008). A permanência destes biofilmes após o tratamento

endodôntico pode causar a persistência da periodontite apical (SIQUEIRA &

RÔÇAS, 2008). Por estas razões, susbstâncias irrigadoras auxiliares são

essenciais durante a etapa da instrumentação, um vez que coadjuvam a

eliminação dos micro-organismos, com potencial de eliminar a infecção nas

áreas intocadas pela instrumentação.

No presente estudo, para comparar a atividade antimicrobiana da ALX,

um promissor irrigante do canal, sozinha ou em combinação com o NaOCl, com

os irrigantes mais comumente utilizados na Endodontia, o NaOCl e a CHX,

fragmentos de raiz foram infectados com E. faecalis, com o auxílio do TBF.. O

principal diferencial do uso do TBF está na sujeição das amostras a um regime

46

de escoamento turbulento do meio de cultura, interferindo nos processos de

adesão bacteriana, transporte de nutrientes e desprendimento do biofilme,

influenciando o desenvolvimento do mesmo, uma vez que ocorre um aumento

na velocidade de escoamento do meio de cultura em contato com as superfícies

dentárias.

De acordo com CHARACKLIS (1990), a velocidade de escoamento do

fluido tem influência direta sobre a taxa de transferência de massa (nutrientes)

do seio do líquido para o biofilme. Quando a velocidade do fluido é baixa, a

resistência à transferência de massa do meio líquido para os micro-organismos

embebidos no biofilme é mais elevada, retardando seu crescimento. Em

contrapartida, quando a velocidade do fluido é alta, sendo traduzida em uma

elevada turbulência do líquido, ocorre um aumento na taxa de transferência de

massa do seio do líquido para o biofilme e , consequentemente um aumento na

sua taxa de desenvolvimento. O resultado é a obtenção de um biofilme

firmemente aderido ao substrato, simulando o que acontece em canais

radiculares infectados (KIM et al, 2013).

Além do regime de escoamento, o uso do TBF permitiu que todas as

amostras fossem contaminadas com um fluxo idêntico e contínuo de meio de

cultura durante 24 horas, sem qualquer interferência dos pesquisadores,

possibilitando a estandardização do estágio de desenvolvimento do biofilme para

todas as amostras, fator importante na avaliação do efeito antimicrobiano das

substâncias analisadas (SHEN et al., 2011). Segundo estudos, 24 h é um

período suficiente para a obtenção de um biofilme com densidade adequada

(LIMA et al., 2001; PERSOON et al., 2012)

47

A ALX vem sendo utilizada como antisséptico em bochechos (ELEY,

1999) e em soluções para desinfecção de lentes de contato (YANAI et al., 2011),

embora seu uso esteja associado a um surto de infecção ocular, ocorrido em

2006, causado por Fusarium (CHANG et al., 2006; PATEL & HAMMERSMITH,

2008). Neste estudo, a ALX foi utilizada na concentração 1%, uma vez que um

estudo anterior relatou que concentrações maiores causaram moderada

citotoxicidade em fibroblastos humanos (KIM et al., 2013).

A ausência, na literatura científica, de um neutralizante específico para a

ALX fez com que optássemos por utilizar a fórmula descrita anteriormente, uma

vez que a combinação do Tween 80, lecitina e histidina neutraliza aldeídos e

compostos fenólicos, a combinação de lecitina e Tween 80 neutraliza compostos

de amônio quaternário, o Tween 80 neutraliza derivados de hexaclorofeno, o

tiossulfato de sódio neutraliza compostos halogenados, a lecitina neutraliza a

CHX e a histidina neutraliza formaldeído (ROMÃO, 1985).

Analisando os resultados, verificamos que a ALX 1% mostrou a pior

atividade antimicrobiana em comparação com o NaOCl 2,5% e a CHX 2%.

Porém, utilizada em combinação com o NaOCl 2,5%, a ALX 1% obteve

resultados semelhantes a CHX 2%.

Dois estudos realizados anteriormente compararam a atividade

antimicrobiana da ALX e CHX, em concentrações idênticas das utilizadas neste

estudo, porém eles não encontraram diferenças estatisticamente significantes

entre as substâncias. Igualmente ao atual estudo, o realizado por KIM et al.,

(2013) contaminou as amostras com o micro-organismo E. faecalis, porém os

fragmentos utilizados foram de dentina bovina e os autores não avaliaram a

viabilidade das células bacterianas, apenas observaram, por meio de MEV, o

48

número de células remanescentes e a degradação da membrana bacteriana. No

nosso estudo, as imagens de MEV também revelaram que a ALX e a CHX

reduzem o número de células bacterianas aderidas à parede dentinária porém,

ao avaliarmos a viabilidade celular, encontramos células bacteriana viáveis em

amostras imersas em ALX, o que não aconteceu nas amostras imersas em CHX.

Já o estudo dos autores RUIZ-LINARES et al., (2014) avaliou a atividade

antimicrobiana da ALX em fragmentos de dentina humana contaminados com o

micro-organismo Streptococcus mutans. Diferenças na metodologia, nos

substratos e nos micro-organismos utilizados em cada estudo pode ter

influenciado nos resultados finais.

Uma das possíveis explicações para a baixa atividade antimicrobiana da

ALX, encontrada no estudo em questão, pode estar associada ao fato de que a

atividade de um agente antimicrobiano contra um biofilme intacto está

diretamente relacionada à combinação da susceptibilidade da espécie

microbiana e à capacidade que esse agente possui de penetrar no biofilme

formado, composto pelas células do micro-organismo e sua coesiva MPE

(TANZER et al., 1977).

BARRIOS et al., (2013) encontraram melhores resultados antibacterianos

com a utilização da ALX 1%, comparados com os da CHX 2%. É importante

enfatizar que o estudo em questão analisou a atividade antibacteriana das

substâncias durante um período de 80 dias, e que os fragmentos de raiz foram

imersos primeiramente na substância biocida, e em seguida, expostos à

suspensão bacteriana, sequencia oposta a utilizada nos outros estudos. Tanto

no presente estudo, como nos anteriores, a atividade antibacteriana foi avaliada

em um momento único, imediatamente após o contato da dentina infectada com

49

a substância antimicrobiana. Os resultados do uso da ALX 1% isoladamente ou

em combinação com o NaOCl 2,5% não poderão ser mais discutidos, uma vez

que não existem mais estudos comparando estas substâncias.

Os melhores resultados antimicrobianos foram obtidos com o uso da CHX

2% isoladamente e com o uso combinado do NaOCl 2,5% e da ALX 1%, não

confirmando nossa hipótese inicial. O principal problema do uso da CHX como

substância irrigadora é o fato de que a mesma não possui capacidade de

dissolver matéria orgânica. Nesse contexto, existe um potencial para o uso da

combinação NaOCl 2,5% e ALX 1% para eliminação de biofilmes durante os

tratamentos endodônticos. Nossos resultados demonstraram que esta

combinação erradicou as células de E. Faecalis, em todas as amostra, contudo,

é importante analisar com cautela este resultado uma vez que neste grupo o

tempo total de ação da combinação foi o dobro comparado aos demais grupos.

Logicamente, quando se adiciona um irrigante final ao protocolo de irrigação, o

tempo total do protocolo é aumentado. Neste contexto, futuros estudos

comparando protocolos com irrigação final com ALX com protocolos com outras

substâncias são necessários para a correta indicação da ALX como irrigante

final. A capacidade solvente de matéria orgânica do NaOCl, a alta

biocompatibilidade e substantividade da ALX, juntamente com a vantagem de

que essa mistura não gera qualquer precipitado (KIM et al., 2012) e agora, com

a confirmação da adequada atividade antimicrobiana deste protocolo, justificam

estudos futuros em outros modelos metodológicos.

O presente estudo concluiu que a ALX 1%, em comparação com o NaOCl

2,5% e a CHX 2% possui a pior atividade antimicrobiana, e o uso combinado do

NaOCl 2,5% com a ALX 1%, como irrigante final, apresenta um potencial para

50

utilização nos tratamentos endodônticos, pois essa combinação possui a

capacidade de eliminar biofilmes bacterianos, sem a formação de qualquer

precipitado.

51

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8. ANEXOS

8.1 . ANEXO I – PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP

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Documents

COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DA ALEXIDINA … · 2019. 6. 29. · foram imersos em 1 ml de de NaOCl 2,5%, CHX 2% e ALX 1% durante 10 minutos, respectivamente. As amostras