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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
REGIONAL JATAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE
MICHELE RESENDE MACHADO
COMPOSIÇÃO DE ARGILAS DE USO COSMÉTICO E
SEUS EFEITOS EM EMBRIÕES E PÓS-LARVAS DE
ZEBRAFISH (Danio rerio)
Jataí-GO
2018
ii
MICHELE RESENDE MACHADO
COMPOSIÇÃO DE ARGILAS DE USO COSMÉTICO E
SEUS EFEITOS EM EMBRIÕES E PÓS-LARVAS DE
ZEBRAFISH (Danio rerio)
Dissertação apresentada a
Universidade Federal de Goiás –
Regional Jataí, como requisito para a
obtenção do título de mestre em
Ciências Aplicadas à Saúde (Área de
concentração: Novos Materiais e
Metodologias Aplicadas à Saúde).
Orientador: Dr. Giovanni Cavichioli
Petrucelli
Co-orietador (a): Dra. Mônica
Rodrigues Ferreira Machado
Jataí - GO 2018
I
II
III
Não fosse eu tão humana,
mudaria o rumo de toda lágrima...
E de cada uma faria chover
pétala de amor do céu.
Sirlei Passolongo
II
À minha família e
amigos, meu amor por vocês é incomensurável.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais e irmãos amados, por serem meus eternos mestres e me ensinarem os melhores valores. Pelo amor, carinho, acolhimento e apoio que sempre me dão. Sou e serei eternamente grata por tudo que vocês dedicaram a mim. Eu tenho muito orgulho de ser filha e irmã de vocês. E muita admiração
pela família que tenho. Obrigado por tudo. Amo muito vocês!
À minhas amigas Agnes e Jenifer, e a minha irmã Mirele que me ofereceram todo o amor, carinho, compreensão e apoio. Além de deixarem meus dias mais
alegres. Eu as amo! Obrigada por tudo!
Aos meus familiares e amigos agradeço a todos pelo carinho, apoio e compreensão. Obrigada por fazerem parte da minha vida.
Aos meu orientador e co-orientadora, Prof. Dr. Giovanni Cavichioli Petrucelli e Prof. Dra. Mônica Rodrigues Ferreira Machado por me receberem abertos a
pesquisa e por ajudar a lapidar a ideia. Por todo o conhecimento compartilhado e pela oportunidade de aprendizado.
À prof. Dra. Taís Malysz pelo conhecimento, ética e preparo para a área da pesquisa.
Aos técnicos do laboratório de química e do laboratório de morfofisiologia por toda ajuda necessária.
Aos professores Dr. Rodrigo Paschoal Prado, Dr. Ricardo Santa Rita e Dr. Matheus Lima pela ajuda com os experimentos e com dados do trabalho.
Aos meus colegas e amigos do Labfish pelos cuidados com os peixes, apoio, trabalho em equipe e compartilhamento de conhecimento. E aos nossos peixes
que contribuíram continuamente para o desenvolvimento do trabalho.
Aos psicólogos Rafael e Aurélia que me acompanharam e deram todo o apoio e acolhimento necessário em momentos difíceis.
Ao programa de Pós-Graduação de Ciências Aplicadas a Saúde, a todos os professores, a todos os meus colegas e a secretaria do programa que contribuíram para o meu desenvolvimento pessoal e profissional, me
proporcionando mais conhecimento e informações.
À FAPEG pelo apoio financeiro por meio da bolsa de formação do mestrado.
À Deus por me proporcionar todos os instrumentos e pessoas para que fosse possível desenvolver o trabalho. Por todas as dificuldades e bênçãos que estão
fazendo parte do meu crescimento tanto pessoal quanto profissional.
IV
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SIMBOLOS .................................................. V
LISTA DE TABELAS E QUADROS .......................................................................... VI
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. VII
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
1.1 Argilas cosméticas ou coloridas ......................................................................... 2
1.2 Zebrafish como modelo experimental .................................................................. 6
1.3 Embriotoxidade ................................................................................................... 8
2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 10
2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 10
2.2 Objetivos específicos .................................................................................... 10
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 11
3.1 Comitê de ética ............................................................................................. 11
3.2 Obtenção e preparo das argilas branca e verde ........................................... 11
3.3 Seleção das amostras para serem analisadas .............................................. 11
3.4 Manutenção dos peixes ................................................................................ 12
3.5 Experimento: concentração letal 50 em mg/ml ................................................ 14
3.6 Avaliação embrionária e pós-larva ................................................................... 15
3.7 Análise estatística ............................................................................................ 16
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................ 18
4.1 Concentração média letal 50 da argila branca e da argila verde sobre embriões
de zebrafish ......................................................................................................... 18
4.2 Movimentos espontâneos (24 hpf) e Batimento cardíacos por minuto (48hpf)
utilizando as argilas cosméticas Branca e Verde ..................................................... 27
4.3 Alterações embrionárias utilizando as argilas cosméticas Branca e Verde ........ 30
4.4 Taxa de eclosão no período de 48, 72 e 96 horas pós fertilização utilizando as
argilas cosméticas Branca e Verde ......................................................................... 34
5 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 37
6 PERSPECTIVAS ..................................................................................................... 38
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 39
Anexo 1 – Projeto aprovado pelo comitê de ética .................................................. 44
V
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SIMBOLOS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ANOVA – Análise de variância
AgNPs – nanopartículas de prata associada com partículas de argilas (Montmorillonite)
bpm - Batimentos por minuto
CL50 - Concentração média letal
cm - Centímetro
DRX – Difração de Raios X
EDXRF – Espectroscopia de Fluorescência de Raios X com Energia Dispersiva
FTIR – Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
g – Gramas
h - Horas
hpf - Horas pós fertilização
ISO - Organização Internacional de Normalização
Kg - Quilograma
L - Litro
mg - Miligrama
mL – Mililitro
μm - Micrômetro
MOF - Estruturas metálicas-orgânicas
nm - Nanômetro
OECD- Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico
ppm - Partes por milhão
s - Segundos
VI
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela 1: Taxa de elementos encontrados nas argilas verde e branca por EDXRF. As
concentrações são em PPM mg Kg-1. ..................................................................................... 6
Tabela 2: Concentração letal 50 da argila branca nos diferentes tempos de avaliação...
..................................................................................................................................................... 21
Tabela 3: Concentração letal 50 da argila verde nos diferentes tempos de avaliação...
..................................................................................................................................................... 24
Tabela 4: movimentação espontânea do embrião com 24 horas pós fertilização,
utilizando a argila branca e argila verde ............................................................................... 28
Tabela 5: batimentos cardíacos por minuto no período de 48 horas pós fertilização,
utilizando a argila branca e argila verde ............................................................................... 29
Quadro 1: Classificação das argilas quanto à cor e sua respectiva composição e
finalidade...................................................................................................................................... 5
Quadro 2: Composição do meio E3. ..................................................................................... 14
Quadro 3: padrão de qualidade embrionária ....................................................................... 15
VII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:Imagem do peixe zebra (Danio rerio). .................................................. 7
Figura 2: Embriões e larvas em A, B, C e D com 24hpf, 48hpf, 72hpf, 144 hpf
respectivamente. (seta verde: somitos, *: saco vitelino, seta azul: olho, seta
vermelha: coração). ............................................................................................ 8
Figura 3: representação do zebrafish.. ............................................................. 12
Figura 4: Aquário de reprodução com caixas para reprodução ........................ 13
Figura 5: placa de 96 poços ilustrando como foram realizados os experimentos
da concentração média letal (CL50). ................................................................ 14
Figura 6: seleção dos embriões para experimentos em bom, intermediário, ruim
e não fertilizado ................................................................................................ 15
Figura 7: Mortalidade acumulativa dos embriões e larvas de zebrafish utilizando
a argila branca. ................................................................................................. 19
Figura 8: Concentração letal 50 da argila branca nos diferentes tempos de
avaliação. ......................................................................................................... 20
Figura 9: Mortalidade acumulativa dos embriões e larvas de zebrafish, utilizando
a argila verde. ................................................................................................... 22
Figura 10: Concentração letal 50 da argila verde nos diferentes tempos de
avaliação .......................................................................................................... 23
Figura 11: Porcentagem de alterações embrionárias e larvais utilizando a argila
branca .............................................................................................................. 31
Figura 12: Porcentagem de alterações embrionárias e larvais utilizando a argila
verde ................................................................................................................ 31
Figura 13: Alterações morfológicas encontradas nos embriões. ...................... 32
Figura 14: Porcentagem de eclosão dos embriões utilizando a argila branca. 35
Figura 15:Porcentagem de eclosão dos embriões utilizando a argila verde. ... 36
VIII
Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos toxicológicos de argilas cosméticas (branca e verde), as quais apresentam em sua composição metais pesados não recomendados pela ANVISA, utilizando embriões de Danio rerio. A argila branca apresenta em sua composição bário (2306 ± 85 ppm), neodímio (230 ± 39 ppm), chumbo (217 ± 9,6 ppm) e zircônio (55 ± 2,2 ppm), já na argila verde foi encontrado o zircônio (277 ± 5,6 ppm). Para os testes, fêmeas e machos de zebrafish foram colocados em reprodução com fotoperíodo e temperatura controlados. Após a reprodução os embriões foram selecionados quanto a qualidade embrionária, em bom, intermediário, ruim e não fertilizado, sendo utilizados apenas os embriões bons para os experimentos. Foram montadas placas com diluições seriadas das argilas, as concentrações variaram entre 50 a 0,025 mg/ml em placas de 96 poços e os embriões foram aleatoriamente colocados individualmente em cada poço. Cada poço continha um volume final de 200 μl. O desenvolvimento embrionário foi realizado a uma temperatura média de 28°C por um período de 144h. Os embriões foram avaliados a cada 24 horas, como mortos, vivos, eclodidos e mau formados, para realização da concentração média letal (CL50). Os resultados mostram a CL50 da argila branca com 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas pós fertilização foram de 26,82; 21,66; 20,92; 14,86; 13,05 e 12,52 mg/mL respectivamente. Já para argila verde a CL50 com 24, 48, 72, 96, 120 e 144 hpf foi de 24,82; 15,75; 14,55; 11,44; 9,17 e 7,58 mg/mL respectivamente. Sugere-se que a argila verde ocasione maior mortalidade dos embriões, pois com doses menores determina uma maior mortalidade destes. Concluiu-se que as argilas branca e verde ocasionam efeitos embriotóxicos, devido a mortalidade, sendo esta concentração-tempo dependentes. Além disso estas substâncias também foram responsáveis por promover teratogênias nos embriões (edema de pericárdio, edema de saco vitelino), porém mais estudos são necessários para isolar o efeito destas sobre o embrião.
Palavras-chaves: metais pesados, teratogênese, toxicidade
IX
ABSTRACT: The objective of this work was to evaluate the toxicological effects of cosmetic clays (white and green), which present heavy metals not recommended by ANVISA, using Danio rerio embryos. The white clay presents in its composition barium (2306 ± 85 ppm), neodymium (230 ± 39 ppm), lead (217 ± 9.6 ppm) and zirconium (55 ± 2.2 ppm). zirconium dichloride (277 ± 5.6 ppm). For the tests, females and males of zebrafish were placed in reproduction with controlled photoperiod and temperature. After breeding the embryos were selected for embryo quality, good, intermediate, bad and unfertilized, using only good embryos for the experiments. Plates were set up with serial dilutions of the clays, concentrations ranged from 50 to 0.025 mg / ml in 96-well plates and the embryos were randomly placed individually in each well. Each well contained a final volume of 200 μl. Embryonic development was performed at a mean temperature of 28 ° C for a period of 144 h. The embryos were evaluated every 24 hours, as dead, alive, hatched and badly formed, to perform the average lethal concentration (LC50). The results show the LC50 of the white clay with 24, 48, 72, 96, 120 and 144 hours post fertilization were 26.82; 21.66; 20.92; 14.86; 13.05 and 12.52 mg / mL respectively. For green clay the LC50 with 24, 48, 72, 96, 120 and 144 hpf was 24.82; 15.75; 14.55; 11.44; 9.17 and 7.58 mg / mL respectively. It is suggested that green clay causes higher mortality of the embryos, because with smaller doses it determines a higher mortality of these. It was concluded that the white and green clays cause embryotoxic effects, due to mortality, being this concentration-time dependent. In addition, these substances were also responsible for promoting teratogenesis in embryos (pericardial edema, yolk sac edema), but further studies are needed to isolate the effect of these on the embryo.
KEYWORS: heavy metals, teratogenesis, toxicity
1
1 INTRODUÇÃO
As argilas coloridas estão sendo bastante empregadas na área cosmética,
devido as suas propriedades, atuando como calmante, cicatrizante, absorvente,
esfoliante suave e adstringente, características que são fornecidas por causa da
sua composição. Estas argilas são utilizadas, principalmente em máscaras
faciais e corporais, na qual possuem a capacidade de absorverem lipídios e
toxinas presentes na pele. Entretanto, antes de serem incorporadas em
formulações cosméticas, estas devem estar dentro dos padrões aceitáveis
especificados pela legislação brasileira (Agência Nacional de Vigilância Sanitária
- ANVISA), preservando a segurança e eficácia do produto ao consumidor.
Em um estudo anterior duas amostras de argilas cosméticas (branca e
verde) foram caracterizadas utilizando as análises de Difração de Raios X (DRX),
Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (IFRT) e
Fluorescência de Raios X com Energia Dispersiva (EDXRF). Nestas avaliações
foram encontrados cinco metais listados pela ANVISA como não recomendados,
sendo eles: bário, cromo, chumbo, neodímio e zircônio. A argila branca
apresenta em sua composição bário (2306 ± 85 ppm), neodímio (230 ± 39 ppm),
chumbo (217 ± 9,6 ppm) e zircônio (55 ± 2,2 ppm), e para a argila verde foi
encontrado o zircônio (277 ± 5,6 ppm) (BALDUINO, PETRUCELLI, 2016). Sabe-
se que estes metais encontrados nas argilas causam danos à saúde, sendo
importante o seu estudo toxicológico.
Os estudos experimentais utilizando o zebrafish (Danio rerio), um
pequeno peixe (3-5 cm quando adultos) apresentam como vantagens a sua fácil
manipulação, capacidade de serem mantidos em elevadas densidades,
possibilidade de absorver substâncias adicionadas diretamente na água,
sensibilidade para drogas, e o rápido metabolismo, além do baixo custo para
criação e manutenção, rápido desenvolvimento e ciclo biológico, genoma
sequenciado e um elevado grau de homologia aos genes do ser humano, cerca
de 70 % (SEIBT, 2009; IGANSI, 2012).
A utilização do zebrafish como modelo experimental para estudo
toxicológico já é bem definida. Neste contexto, o presente trabalho visa avaliar
2
os efeitos das argilas verde e branca em um organismo vivo, fornecendo uma
maior compreensão dos riscos e/ou benefícios destas substâncias.
1.1 Argilas cosméticas ou coloridas
As argilas possuem aplicação em diversas áreas, como na indústria de
cosméticos, farmacêutica, na química, agronomia, entre outros. Desta forma,
elas são usualmente definidas como um material natural, terroso, de granulação
fina, com diâmetro inferior a 2 μm, e quando estas são hidratadas, adquirem
certa plasticidade devido as propriedades hidrofílicas. Sua composição
apresenta diferentes tipos de minerais (argilominerais) que são os silicatos
hidratados de alumínio e ferro denominados de filossilicatos. Nestas ainda
podem ser encontrados certo teor de elementos alcalinos e alcalinos terrosos,
além de matéria orgânica, sais solúveis e partículas de quartzo, pirita, mica,
calcita e outros minerais residuais cristalinos e não cristalinos ou mesmo amorfos
(SANTOS, 1989; BERGAYA; THENG; LAGALY, 2006; MURRAY,2007;
TEIXEIRA-NETO, E; TEIXEIRA-NETO, A, 2009).
Os filossilicatos são um grupo de minerais (argilominerais), no qual phyllon
vem de filo e significa folhas, assim, estes apresentam estruturas cristalinas em
camadas. Estes são formados por compostos lamelares, no qual as camadas
planas e estendidas são ligadas por tetraedros de silício e oxigênio. Eles estão
presentes em vários tipos de solos, onde colaboram com o controle da liberação
de minerais e com a manutenção da umidade, sendo indispensáveis para o
desenvolvimento das plantas. Os filossilicatos também possuem características
interessantes como a baixa densidade específica, hábito planar, dentre outras
(PETRUCELLI, 2008; BADSHAD, 2011). Os cristais estabelecidos pelos
argilominerais apresentam comumente uma dimensão micrométrica abaixo de 2
μm, porém estes ainda podem apresentar uma fração nanométrica, na faixa de
1 a 100 nm (COELHO et al., 2007; SILVA et al., 2011).
As argilas são formadas ainda, por alguns metais, sendo eles o ferro, silício,
zinco, magnésio, cálcio, potássio, titânio, alumínio e manganês. Estes promovem
benefícios estético que são interessantes para utilização na área cosmética. O
ferro funciona como antisséptico e como catalisador nos processos de
3
renovação celular; o magnésio e o zinco atuam como tonificante; O silício fornece
hidratação, renovação celular (cutânea) e tem ação calmante. O cálcio e o
potássio agem na circulação e no revigoramento dos tecidos. O titânio é utilizado
como fotoprotetor, sendo capaz de gerar reflexão da radiação ultravioleta (UV)
(CARRETERO, 2002; CHOY et. al, 2007; SILVA, 2011; SRINIVASAN et al.,
2011).
As argilas possuem uma capacidade adsorvente muito importante que é
fornecida devido às suas características de grande área superficial, estabilidade
química e mecânica, estrutura em camadas e alta capacidade de troca catiônica.
Tanto as argilas naturais, quanto as argilas modificadas tem despertado o
interesse em diferentes áreas, por funcionarem como um excelente adsorvente
de metais pesados como As, Cd, Cr, Co, Cu, Fe, Pb, Mn, Ni e Zn em suas formas
iônicas no meio aquoso (SRINIVASAN, 2011)
Esta capacidade adsortiva seletiva de moléculas, determinam o emprego
das argilas em separações cromatográficas, com o intuito de retirar poluentes
orgânicos do ar e da água, e criar formulações melhoradas para pesticidas, como
sensor químico e peneiras moleculares, entre outros. Além disso, as estruturas
de camadas de organização desse nanocompósito ou microcompósito oferecem
diferentes comportamentos e propriedades a este material, como o
comportamento fotoquímico, área de superfície específica elevada, capacidade
de permuta iônica ou a propriedade de hidratação. Portanto, os minerais de
argila são amplamente utilizados em produtos farmacêuticos e, como
adsorventes, catalisadores ou suporte de catalisadores, permutadores de íons e
agentes descolorantes. Também são usados como uma barreira de gases e anti-
inflamatório. (KHURANA et. al., 2015)
As argilas para fins terapêuticas são usadas desde o começo da civilização
para tratamento de feridas, inibição de hemorragias e picadas de animais e até
em tratamentos estéticos. As máscaras faciais utilizadas são tradicionais devido
as suas propriedades esfoliantes, limpantes e que promovem a renovação
celular e previnem o envelhecimento, além de absorver o excesso de óleos,
sujeira e impurezas da pele. As argilas podem ser usadas em tratamentos
faciais, pós corporais, sabões, loções, cremes, sais de banho, clareadores e
muito mais (PENA-FERREIRA et al., 2011; SILVA, 2011; MATTIOLI et. al, 2016).
4
Cosméticos e medicamentos à base de argilas apresentam capacidade
de carrear moléculas orgânicas ou promover suporte para catalisadores. As
argilas têm sido utilizadas na produção de formulações farmacêuticas sólidas
(comprimidos e pó), líquidas (suspensões e emulsões) e semissólidas (pomadas
e cremes) destinadas tanto para a administração via oral quanto tópica. As
argilas são empregadas como dispersantes ou como estabilizantes do sistema,
pela sua área superficial e suas dimensões coloidais (entre 1 nm e 1 µm), em
produtos semissólidos de cuidados com a saúde (CARRETERO; POZO, 2010;
SILVA, 2011; ZHANG et al, 2011; KHIARI et al., 2014).
Devido à composição química e mineraralógica das argilas, alguns
cuidados devem ser observados antes da sua utilização especialmente em
produtos empregados nas áreas farmacêuticas e de cosméticos (LÓPEZ-
GALINDO et al., 2007). As argilas utilizadas para fins cosméticos e farmacêuticos
devem seguir uma série de requisitos de segurança química (pureza,
estabilidade, inércia química), física (tamanho da partícula, textura) e
toxicológica (controlado teor de metais pesados). Para oferecerem produtos com
alto grau de qualidade e segurança, podendo posteriormente ser utilizados para
diversos fins (BERGAYA, THENG, LAGALY, 2006; MATTIOLI et. al, 2016).
No Brasil a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é o órgão
responsável por determinar as normas e padrões para manutenção da qualidade
das argilas, estabelecendo limites de contaminantes, metais pesados e outros
que envolvam risco á saúde, além de fazer o acompanhamento e execução das
políticas, diretrizes e ações de vigilância. Além das propriedades ideais para
utilização em produtos cosméticos e farmacêuticos, as argilas podem ser
classificadas pela sua cor e aplicabilidade cosmética, dependendo da sua
composição química como demonstrado no Quadro 1.
5
Quadro 1: Classificação das argilas quanto à cor e sua respectiva composição e finalidade.
Cor Alguns elementos presentes nas
argilas Finalidade Cosmética
Amarela SiO2 Rejuvenescimento, purificação e hidratação da pele.
Bege Rica em Si, Al, Ti
E baixo teor de Fe
Adstringente, purificante (absorção de oleosidade),
hidratante e cicatrizante.
Branca Rica em Al e Si (aluminosilicato)
Baixo teor de S, Fe, B, K e Ca
Clareamento da pele, cicatrizante, hidratante e auxilia na
remoção de oleosidade.
Cinza Rica em sílica Antiedematosa (inchaços e edemas), antienvelhecimento
da pele e auxilia na redução de medidas.
Marrom Rica em Si, Al, Ti
E baixo teor de Fe
Reconstituição dos tecidos, purificante, adstringente e
hidratante.
Preta Rica em Al e Si
Baixo teor de Fe, Ti, Mg, Ca e Zn.
Rejuvenescimento da pele, clareamento, cicatrização e
absorção de oleosidade da pele.
Rosa Rica em Fe2O3 e CuO Tratamento de peles sensíveis, desidratadas, cansadas
e sem viço, com ação cicatrizante e suavizante.
Verde Fe2O3 associado ao Ca, Mg, K, Mn,
P, Zn, Cu, Al, Si, Se, Co e Mo.
Ação adstringente, tonificante, estimulante, secativa,
bactericida, analgésica e cicatrizante.
Vermelha Rica em Fe2O3 e CuO Rejuvenescimento da pele e redução de medidas.
Adaptada de Silva, 2011.
As argilas branca e verde do presente estudo foram caracterizadas
anteriormente, apresentando propriedades interessantes para uso cosmético.
Estas foram caracterizadas utilizando as análises Difração de Raios X (DRX),
Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (IFRT) e
Fluorescência de Raios X com Energia Dispersiva (EDXRF). Nestas avaliações
realizadas foram encontrados metais pesados, os quais a ANVISA cita como não
recomendados, sendo eles: bário, cromo, chumbo, neodímio e zircônio. A argila
branca apresentou um maior número de metais não recomendados pela ANVISA
em relação a argila verde. (BALDUINO, PETRUCELLI, 2016). Estas argilas
apresentam em sua composição outros elementos, sendo mostradas na Tabela
1.
6
Tabela 1: Taxa de elementos encontrados nas argilas verde e branca por EDXRF. As concentrações são em PPM mg Kg-1.
Elementos Argila Branca Argila verde
Si 523238 ± 779 431363 ± 808
Al 431792 ± 1053 229731 ± 1159
Ca _ 51516 ± 154
Mg _ 20877 ± 1219
K 16374 ± 97 72023 ± 209
S 15936 ± 103 13240 ± 104
Fe 7372 ± 26 158779 ± 166
Ba 2306 ± 85 _
Ce 1030 ± 46 _
Mn 363 ± 14 3077 ± 32
Ir 316 ± 12 _
Cu 302 ± 6,3 _
Nd 230 ± 39 _
Sr 218 ± 2,8 427 ± 6,4
Pb 217 ± 9,6 _
Zn 107 ± 5,0 334 ± 10
Rb 96 ± 2,8 605 ± 7,5
Zr 55 ± 2,2 277 ± 5,6
Y 49 ± 2,3 82 ± 5,2
Ti _ 14794 ± 93
P _ 2123 ± 143
V _ 752 ± 38
Adaptado de BALDUINO, PETRUCELLI, 2016
1.2 Zebrafish como modelo experimental
7
A Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico
(OECD) preconiza a realização de testes toxicológicos com peixes, sendo o
zebrafish (Danio rerio) um dos modelos experimentais indicados para este tipo
de estudo, (Figura 1). O zebrafish é um peixe teleósteo que funciona como uma
ferramenta poderosa de estudos in vivo, possibilitando a investigação biológica
em alta resolução, aliado à complexidade de organismos multicelulares. Ele
ainda apresenta uma alta homologia genética com o homem, possuindo seu
genoma sequenciado, com cerca de 70% dos genes humanos. (VOGEL, 2000;
SHIN e FISHMAN, 2002; LIESCHKE E CURRIE, 2007)
Fonte: https://images.sciencedaily.com/2012/09/120923141214-large.jpg
Figura 1:Imagem do peixe zebra (Danio rerio).
Casais de zebrafish podem criar entre 100-500 embriões por cópula,
sendo que as fêmeas podem procriar uma vez por semana. Os embriões ainda
são transparentes e toda a formação morfogenética pode ser acompanhada com
o auxílio de um estereomicroscópio (KIMMEL et al., 1995; SEIBT, 2009; IGANSI,
2012). Essas informações justificam a escolha desse modelo experimental para
utilização nesse estudo.
O desenvolvimento do zebrafish acontece depois da fertilização, na qual
de 0 à 24 h é ovo, de 24 a 48 h é embrião, de 72 a 120 h é eleuthero embrião,
nos quais todos os órgãos estão formados, e com 144 hpf transforma-se em
larva, sendo visualizado na Figura 2. A formação de tecido ósseo inicia 144 hpf,
começando então, quando o peixe está na forma de larva. As alterações
morfológicas mais fáceis de serem visualizadas durante o desenvolvimento são
8
no tecido ósseo ou cartilaginoso, tecido cardíaco e neural (BIRD e MABEE, 2003;
STRECKER; WEIGT; BRAUNBECK, 2013).
Figura 2: Embriões e larvas em A, B, C e D com 24hpf, 48hpf, 72hpf, 144 hpf respectivamente. (seta verde: somitos, *: saco vitelino, seta azul: olho, seta vermelha: coração).
Durante a formação do coração os dois tubos cardíacos se fundem,
levando a formação do tubo cardíaco definitivo após 24 horas pós fertilização
(hpf). (STAINIER e FISHMAN, 1992). Com 48 hpf as larvas já apresentam o
coração completamente formado, sendo o metabolismo muito semelhante aos
de humanos adultos (WARREN e FISHMAN, 1998; TON et al., 2002). A partir da
descrição dos estágios de desenvolvimento do zebrafish feita por Kimmel et al.
(1995), desde a formação do zigoto até a eclosão da larva, os estágios larvais e
a formação do indivíduo adulto, é possível identificar as distintas fases de
formação do tecido nervoso. Os diferentes estágios do desenvolvimento
embrionário do zebrafish podem ser observados na Figura 2.
1.3 Embriotoxidade
A utilização de animais em pesquisas vem sendo reconsiderada,
buscando a redução do número de animais empregados, o refinamento de
técnicas ou mesmo a substituição destes, baseado na ética. Para testes de
toxicidade, embriões de peixes são indicados como uma alternativa promissora
para o uso de animais “in vivo”, sendo o zebrafish um ótimo modelo para este
*
* *
*
9
fim, pois este é considerado eleuthero embrião até 120 horas pós fertilização, ou
seja, este ainda não se alimenta, de acordo com a legislação europeia.
(LAMMER et. al., 2009).
Os testes toxicológicos são guiados por teste padrões como os da OECD
e ISO (Organização Internacional de Normalização). Para que os experimentos
possam ser aceitos em comitês de ética de uso animal, a manutenção dos
peixes, larvas e embriões devem ser padronizadas. Parâmetros como tipo de
água (água de consumo ou reconstituída), temperatura da água (25ºC até
28,5ºC), ciclo luz/escuro L/E (8L/16E ou 10L/14E) e limpeza dos aquários devem
ser mantidas de acordo com a necessidade do biotério. Além disso são
necessárias caixas de reprodução para evitar a predação dos ovos pelos adultos.
Após a reprodução é importante determinar o número de embriões assim
como sua viabilidade. A viabilidade embrionária após a fertilização ocorre com 3
horas pós fertilização (hpf), com o embrião com 128 células. Cada grupo
experimental deve conter pelo menos 20 embriões; os ovos são separados de
acordo com a qualidade; nos testes são utilizados pelo menos 5 concentrações;
sendo empregadas placas de 24 poços ou de 96 poços; e as teratogenias são
avaliadas até 144 h. (LAMMER et. al., 2009; SELDERSLAGHS et. al, 2009;
BEEKHUIJZEN et. al, 2015).
As avaliações morfológicas dos embriões e larvas nos testes toxicologicos
são realizadas de acordo com cada fase do desenvolvimento. Podem ser
observados formação de somitos, desprendimento de cauda, desenvolvimento
dos olhos, desenvolvimento do coração, natação, coagulação, mortalidade,
movimentos, circulação, batimentos cardíacos, pigmentação da cabeça, corpo e
cauda (até 48 h), extensão do núcleo ou saco vitelino, barbatana peitoral,
protrusão da boca, eclosão a partir de 48h até 96h. (BEEKHUIJZEN et. al, 2015)
10
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O objetivo foi avaliar a toxicidade das argilas cosméticas branca e verde
em embriões e pós-larvas de zebrafish.
2.2 Objetivos específicos
▪ Determinar a concentração letal 50 das argilas branca e verde para
embriões e larvas de zebrafish
▪ Estudar o efeito das argilas branca e verde na letalidade e teratogênia nos
embriões e larvas de zebrafish, de acordo com as particularidades de
cada argila.
▪ Identificar as alterações morfológicas induzidas por cada argila (branca e
verde)
▪ Comparar a toxicidade das argilas branca e verde
11
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Comitê de ética
Inicialmente o projeto foi submetido à Comissão de Ética no Uso de
Animais da UFG (CEUA/UFG), para ser executado, onde foi aprovado com
o número de protocolo 067/16.
3.2 Obtenção e preparo das argilas branca e verde
Foi empregado no estudo argilas cosméticas comerciais de duas cores
(branca e verde) diferentes, obtidas de uma casa de produtos naturais da cidade
de Jataí-GO, utilizadas para tratamentos faciais. Estas argilas são isentas de
matéria orgânica.
Para o preparo das soluções com as argilas (branca e verde), foram
realizados procedimentos de liberação controlada, através do tratamento com
ácido. Para tanto foi empregada uma solução ácida de HCl 2 mol.L-1 na
proporção de 2,50 g de argila:25 mL de solução, em agitação sob refluxo a 90
°C ± 5°C com tempo de ataque de 12 h, com a finalidade de identificar a liberação
dos metais presentes nas amostras. O sobrenadante desse processo foi
coletado e o seu pH foi neutralizado, sendo que esta solução foi empregada para
realização dos experimentos com embriões. Em um estudo anterior realizado por
Balduino, Petrucelli, 2016 os resultados dos Difratogramas de Raios X mostram
que houve dissolução das folhas tetraédricas e octaédricas dessas argilas,
comprovando a liberação das impurezas presentes nas argilas. Por isso, o
sobrenadante das argilas foi utilizado para os experimentos.
3.3 Seleção das amostras para serem analisadas
Utilizaram-se embriões e larvas de zebrafish para o presente estudo, onde
os peixes foram adquiridos em uma loja de aquarismo e colocados para
reproduzir em condições ideais. Os peixes foram mantidos no Labfish, no prédio
de Ciências da Saúde, da Universidade Federal de Goiás – Regional Jataí.
12
3.4 Manutenção dos peixes
Para os experimentos foram utilizados aproximadamente 50 machos e 25
fêmeas (Figura 3) mantidos separados durante o período experimental em
aquários de acrílico, com tamanho de 11,5 cm x 34,5 cm x 15,5 cm, com
capacidade para 15 peixes. Os aquários foram mantidos em sistema de
recirculação de água, com temperatura de 28,5o C (± 2º C), em ciclo de
luz/escuro 14:10.
https://www.wateronline.com/doc/zebrafish-the-next-great-water-testing-instrument-0001
Figura 3: representação do zebrafish. Sendo 2 machos e 1 fêmea, proporção utilizada na reprodução dos peixes. As fêmeas apresentam ventres abaulados e os machos uma coloração
amarelada forte nas nadadeiras peitorais.
A reprodução era montada com os peixes separados com pelo menos 24
horas de antecedência antes do momento esperado da reprodução, colocando
machos e fêmeas em diagonal, como mostrado na Figura 4. Essa configuração
proporcionou estímulos que aumentaram a taxa de reprodução. Os machos e
fêmeas são reunidos no dia seguinte a montagem da reprodução, anterior ao
acender das luzes. O aumento da luminosidade estimula a desova das fêmeas.
Para que a reprodução aconteça parâmetros de qualidade de água e
alimentação devem ser seguidos de maneira rígida (SCHNEIDER, 2009;
ZORZETTO, 2013)
13
Figura 4: Aquário de reprodução com caixas para reprodução
Os peixes foram alimentados 4 vezes ao dia com ração comercial e alimentos
vivos (Arthemia, microverme, enquitreias). Para a reprodução foram
selecionadas as fêmeas com ventres abaulados e machos com coloração
amarelada forte nas nadadeiras peitorais em uma criadeira, na proporção de 1
fêmea para 2 machos para reprodução natural. Após a reprodução os embriões
foram coletados e transferidos para placas de Petri, em meio E3, apresentado
no Quadro 2. Todos os procedimentos experimentais tanto a reprodução quanto
os testes toxicológicos seguem especificações do guia de toxicidade da OECD
(1992, 2014).
Para fazer 1 L de meio E3, são necessários 10 mL de cada uma das soluções
padrões com os compostos CaCl2, MgSO4, NaHCO3, KCl, obtendo então, 40 mL
de solução, e o volume é completado com 940 mL de água deionizada. Os dados
do Quadro 2 mostram as concentrações das soluções empregadas para fazer a
água reconstituída (MARIANI, 2006).
14
Quadro 2: Composição do meio E3.
Composição do meio E3
Compostos Concentração (mg/L)
CaCl2 58,8 mg/ L
MgSO4 24,6 mg/ L
NaHCO3 12,6 mg/L
KCl 5,5 mg/L
Adaptado de MARIANI, 2006.
3.5 Experimento: concentração letal 50 em mg/ml
Foram empregados para o estudo, embriões de zebrafish, onde foi avaliada
as diferentes fases do seu desenvolvimento. Os peixes foram alocados no
laboratório de fisiologia do Instituto de Ciências da Saúde. Para o procedimento
foram utilizados 84 embriões por placa, por argila testada, branca ou verde.
Foram realizadas 4 repetições, utilizando 5 embriões por concentração. Para
cada argila testada foram utilizadas 12 concentrações diferentes em diluições
seriadas, em placas de 96 poços. As concentrações usadas foram 50 mg/ml, 25
mg/ml, 12,5 mg/ ml, 6,3 mg/ml, 3,2 mg/ml, 1,6 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,4 mg/ ml, 0,2
mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml e 0,025 mg/ml. Para comparação foi realizado um
controle negativo contendo apenas água reconstituída. A Figura 5 demonstra
como a placa era montada durante o experimento para caracterização da CL50.
Figura 5: placa de 96 poços ilustrando como foram realizados os experimentos da concentração média letal (CL50).
15
Após a reprodução dos peixes os embriões foram selecionados em bons,
intermediários, ruins e não fecundados (Figura 6). Para tanto foram observados
sua coloração, disposição das células, proliferação celular, fecundação do ovo e
mau formação (Quadro 3). Para o teste da CL50 foram utilizados somente
embriões classificados como bons.
Figura 6: seleção dos embriões para experimentos em bom, intermediário, ruim e não fertilizado
Os embriões após a seleção foram transferidos aleatoriamente para as
placas de 96 poços, na qual estava presente as diluições citadas. As placas de
96 poços foram mantidas em temperatura ambiente durante todo o
desenvolvimento embrionário e de pós larvas (144 horas), também os
tratamentos foram trocados diariamente durante todo o experimento.
Quadro 3: padrão de qualidade embrionária
Embrião bom Embrião
intermediário
Embrião ruim Embrião não
fertilizado
Coloração clara Célula solta Coloração escura Sem divisão celular
Células organizadas Membrana dobrada
(Corion)
Células soltas Células soltas
Divisão celular Desorganização
celular
Desorganização
celular
Desorganização
celular
Membrana integra
(Corion)
3.6 Avaliação embrionária e pós-larva
16
A concentração letal 50 foi calculada a partir de avaliações diárias com
intervalos de 24 horas, até 144 horas pós fertilização. Nestes momentos os
embriões eram contados em viáveis e não viáveis, para determinação da
capacidade embriotóxica das argilas cosméticas.
Também durante este período diferentes características foram
observadas de acordo com a fase de desenvolvimento dos embriões, entre elas,
formação de somitos, desenvolvimento dos olhos, movimentos espontâneos,
presença de circulação na aorta dorsal, grau de pigmentação da larva, edema
durante a formação do coração, não descolamento de cauda e falta de batimento
cardíaco (NAGEL, 2002). Também durante a formação da larva foram avaliadas
mau formações de cauda, de coração, de saco vitelino, não eclosão após 96
horas (BELYAEVA et al., 2009).
Os embriões de 24 horas de desenvolvimento apresentam movimentos
espontâneos da cauda. A frequência de movimentação do embrião foi contada
diretamente durante 60s. Às 48hpf já é observada frequência cardíaca sendo os
batimentos cardíacos contados durante 15 s e multiplicado por 4 para análise no
período de 1 min. (KIMMEL et al., 1995; FRAYSSE; MONS; GARRIC, 2006)
A taxa de eclosão foi avaliada nos períodos de 48, 72 e 96 hpf, segundo
Kimmel et al.,1995, os embriões começam a eclodir a partir de 48hpf até 96 hpf,
se estes não eclodirem nesse período é considerada mau formação.
3.7 Análise estatística
O cálculo da concentração média letal(CL50) das argilas cosméticas e as
avaliações do desenvolvimento embrionário foram estudadas utilizando o
programa Origin. O nível de significância de adotado para as avaliações foi p =
0,05.
Para a análise da CL50 foi utilizado o Método de Regressão Probit como
objetivo de determinar as probabilidades de duas situações de variáveis binárias,
do tipo morte ou sobrevivência. Este método de análise de dados de
sensibilidade, alcançado em ensaios de concentração-resposta, tem o objetivo
de estimar uma dose que irá fornecer algum efeito em uma população. (DE
SOUZA; CHAVES; MUNIZ, 2011). A curva que expressa a relação entre a
17
concentração e a taxa de mortalidade é denominada de concentração-resposta,
sendo esta linear.
Os dados inicialmente apresentam um padrão de curva de concentração-
resposta sigmoide, a qual está relacionada com o comportamento reativo das
argilas utilizadas, devido a sua forma estrutural. Entretanto, estes dados são
linearizados utilizando o método de regressão do Probit.
Foram utilizados ainda o teste t e teste de ANOVA para compara as
médias dos grupos estudos.
18
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Concentração média letal 50 da argila branca e da argila verde sobre embriões de zebrafish
É possível observar nos gráficos da CL50 da argila branca que conforme
aumentam o tempo de exposição e a concentração, a taxa de mortalidade
também aumenta. Na Figura 7, o gráfico A indica que a CL50-24h para a argila
branca foi de 26,82 mg/mL, apresentando um limite superior de 33,88 mg/mL e
limite inferior de 21,24 mg/mL, com R2 de 0,987. A partir da concentração de 6,3
mg/mL (0,8 Log) a mortalidade dos embriões cresce exponencialmente.
No período 48 horas de exposição com a argila branca, observando a
Figura 7, no gráfico B a CL50 foi de 21,66 mg/mL, com limite superior de 30,08
mg/mL e limite inferior de 15,60 mg/mL. Pode-se observar que a partir da
concentração 6,3 (log 0,8) ocorre um aumento progressivo na taxa de
mortalidade. Comparando os gráficos e CL50 nos tempos de exposição 24 e 48h,
percebe-se que existe uma similaridade das curvas e concentrações. Com 72h,
na Figura 7, em C a CL50 foi de 20,92 mg/mL, com limite superior de 28,88 mg/mL
e limite inferior de 15,16 mg/mL. Na curva de mortalidade pode-se identificar que
a partir da concentração de 12,5 mg/mL (1,1 Log) a taxa de mortalidade é
considerável. Podemos observar que a mortalidade em Probit aumenta em
relação a 24 e 48 horas, ou seja a taxa de mortalidade embrionária aumentou
conforme o tempo de exposição também aumentou, mesmo para as menores
concentrações.
Na Figura 7 em D, E e F são mostradas as curvas de CL50 em Probit com
96, 120 e 144h respectivamente. E possível observar que conforme aumentam
o tempo de exposição a argila e a concentração, a mortalidade também aumenta.
A CL50 para 96 horas de exposição foi de 14,86 mg/mL, com limite superior de
20,84 mg/mL e limite inferior de 10,60 mg/mL. A partir da concentração de 6,3
mg/mL (próximo a 0,8 Log) a taxa de mortalidade dos embriões também é
crescente.
19
Figura 7: Mortalidade acumulativa dos embriões e larvas de zebrafish utilizando a argila branca.
As figuras A, B, C, D, E e F representam a mortalidade cumulativa nos períodos de 24, 48, 72,
96, 120 e 144 h respectivamente. Nas figuras o eixo X a concentração em Logaritmo e no eixo
Y a mortalidade em Probit, a linha vermelha representa a curva da equação e cada ponto
indica a mortalidade dos embriões em determinada concentração.
O gráfico da Figura 7 em E, mostra uma CL50 de 13,05 mg/mL, com limite
superior de 18,77 mg/mL e limite inferior de 9,08 mg/mL no período de 120 hpf.
y = 2,8961x + 0,8629
R² = 0,9825
y = 2,0598x + 2,2488
R² = 0,9277
y = 2,0974x + 2,2301
R² = 0,9389
y = 1,9992x + 2,6569
R² = 0,9931
y = 1,8614x + 2,9232
R² = 0,9978
y = 1,8234x + 2,9989
R² = 0,9866
A B
C D
E F
20
Sendo que ocorre um aumento exponencial da mortalidade a partir da
concentração de 6,3 mg/mL, assim como no período de 96 h. A CL50 com 144h,
na Figura 7 em F foi de 12,52 mg/mL, com limite superior de 18,13 mg/mL e
limite inferior de 8,64 mg/mL. Com 144 horas de exposição podemos observar
que o valor da CL50 diminui. Este comportamento nos mostra que conforme
aumenta o tempo de exposição, concentrações menores se tornam tóxicas,
causando mortalidade aos embriões.
Comparando as concentrações letais de 96, 120 e 144 h podemos
perceber um aumento da toxicidade da argila branca, sendo para estes períodos
de exposição bastante semelhantes. Observando-se os gráficos percebe-se que
existe uma similaridade das curvas, sendo que nas concentrações maiores,
acima de 0,8 log, a taxa de mortalidade aumenta substancialmente.
Quando comparadas as taxas de mortalidade dos grupos experimentais
utilizando a argila branca, em relação a taxa de mortalidade do controle não há
uma diferença significativa com 24 hpf, porém nos períodos de 48, 72, 96, 120,
144 hpf houve diferença significativa (p=0,05) quanto a mortalidade dos
embriões, sendo estas maiores.
A CL50 no tempo de 24 h foi de 26,82 mg/mL, à medida que aumenta o
tempo de exposição dos embriões a argila, o valor da CL50 diminui, sendo que
com 144 h a CL50 foi de 12,52 mg/mL, estes dados são mostrados na Figura 8.
Figura 8: Concentração letal 50 da argila branca nos diferentes tempos de avaliação.
A Tabela 2 apresenta a CL50 para a argila branca durante todo o período
de avaliação dos embriões, sendo observada que a mortalidade é proporcional
ao tempo de exposição. Além disso, podem ser observados os limites superior e
inferior em relação a CL50.
21
Tabela 2: Concentração letal 50 da argila branca nos diferentes tempos de avaliação. Os
valores são dados em mg/mL
Taxa de mortalidade dos embriões submetidos a argila Branca
TEMPO 24 h 48h 72 h 96 h 120 h 144 h
Limite
superior
33,88 30,08 28,88 20,84 18,77 18,13
CL50 26,82 21,66 20,92 14,86 13,05 12,52
Limite inferior 21,24 15,60 15,16 10,60 9,08 8,64
Para a argila verde também foram calculadas as CL50 para os diferentes
tempos de exposição. A Figura 9 em A, B e C, apresentam a CL50 nos tempos
de 24, 48 e 72 h respectivamente. Observou-se que a taxa de mortalidade
aumenta proporcionalmente à medida que a concentração e o tempo de
exposição aumentam. Com 24 horas de exposição a CL50 foi de 24,82 mg/mL,
com limite superior de 38,08 mg/mL e limite inferior de 16,18 mg/mL. Observando
o gráfico 9 em A e possível perceber que a mortalidade embrionária para este
tempo de exposição é crescente.
No período de 48 horas, na Figura 9 em B, a CL50 foi de 15,75 mg/mL,
com limite superior de 23,99 mg/mL e limite inferior de 10,34 mg/mL. Pode-se
notar de acordo com a curva de mortalidade que ocorre um aumento exponencial
da letalidade dos embriões com início na concentração de 3,2 mg/mL (Log 0,5).
No período de 72h a CL50 reduziu para 14,55 mg/mL, com limite superior de
21,93 mg/mL e limite inferior de 9,65 mg/mL. Percebe-se que a partir da
concentração de 3,2 mg/mL a taxa da mortalidade dos embriões aumenta
rapidamente. Nos tempos de exposição 48 e 72 h a taxa de mortalidade é
semelhante.
22
Figura 9: Mortalidade acumulativa dos embriões e larvas de zebrafish, utilizando a argila verde.
As figuras A, B, C, D, E e F representam a mortalidade cumulativa nos períodos de 24, 48, 72,
96, 120 e 144 h respectivamente. Nas figuras o eixo X a concentração em Logaritmo e no eixo
Y a mortalidade em Probit, a linha vermelha representa a curva da equação e cada ponto
indica a mortalidade dos embriões em determinada concentração.
No gráfico 9 em D, E e F são apresentadas a mortalidade x concentração
da argila verde com 96, 120 e 144 h respectivamente. Com 96h a CL50 foi de
y = 1,5801x + 2,796
R² = 0,815
y = 1,4366x + 3,28
R² = 0,8215
y = 1,474x + 3,2859
R² = 0,8774
y = 1,3746x + 3,545
R² = 0,8786
y = 1,1295x + 3,9131
R² = 0,8077
y = 1,1304x + 4,0055
R² = 0,9071
A B
C D
E F
23
11,44 mg/mL, com limite superior de 17,76 mg/mL e limite inferior de 7,37 mg/mL.
A medida que aumenta a concentração da argila, a letalidade também é maior,
sendo que acontece um aumento mais expressivo da mortalidade dos embriões
com início na concentração de 3,2 mg/mL(Log 0,5).
A argila verde apresenta uma CL50-120h de 9,17 mg/mL, com limite superior
de 15,66 mg/mL e limite inferior de 5,37 mg/mL. A taxa de mortalidade dos
embriões aumenta visivelmente a partir da concentração de 3,2 mg/mL (log 0,5).
A CL50-144h foi de 7,58 mg/mL, com limite superior de 12,95 mg/mL e limite inferior
de 4,44 mg/mL. Nesse período a letalidade dos embriões aumenta
proporcionalmente ao aumento da concentração. Observando os resultados da
argila verde, podemos ver que conforme ocorre o aumento do tempo de
exposição o valor da CL50 vai ficando cada vez mais baixo.
A taxa de mortalidade da argila verde quando comparado com o grupo
controle, foi significativamente maior após 24 horas de exposição. A CL50 da
argila verde no período de 24 horas foi de 24,82 mg/mL, e à medida que aumenta
o tempo de exposição, diminui a CL50. Com 144 horas de exposição, a CL50 foi
de 7,58 mg/ml. Isso pode ser observado na Figura 10.
Figura 10: Concentração letal 50 da argila verde nos diferentes tempos de avaliação
A Tabela 3 apresenta a CL50 para a argila branca durante todo o período
de avaliação dos embriões, sendo observada que a mortalidade é proporcional
ao tempo de exposição. Além disso, podem ser observados os limites superior e
inferior em relação a CL50.
24
Tabela 3: Concentração letal 50 da argila verde nos diferentes tempos de avaliação. Os valores são dados em mg/mL
Taxa de mortalidade dos embriões submetidos a argila Verde
TEMPO 24 h 48h 72 h 96 h 120 h 144 h
Limite
superior
38,08 23,99 21,93 17,76 15,66 12,95
CL50 24,82 15,75 14,55 11,44 9,17 7,58
Limite inferior 16,18 10,34 9,65 7,37 5,37 4,44
Foi observado que uma menor concentração da argila verde causa uma
maior mortalidade dos embriões, comparada com a argila branca, porém não
houve diferença estatística, utilizando teste de ANOVA com um p= 0,05.
No presente estudo, tanto a argila branca quanto a argila verde apresentam
o zircônio em sua composição, porem a argila verde apresenta maior
concentração deste metal. ALMJASHEVA (2017) avaliou a toxicidade de
nanopartículas de dióxido de zircônio em monocamadas de células L-41 e não
observou efeitos biológicos significantes. Já EPSTEIN (1960) utilizando lactato
de zircônio, via intradérmica em pacientes humanos, observou a presença de
granuloma no local de aplicação, o que indicou toxicidade. A argila verde
promoveu maior taxa de mortalidade que a argila branca. É provável que este
aumento da taxa de mortalidade possa estar relacionado com os maiores níveis
de zircônio, corroborando os dados de EPSTEIN (1960).
O dióxido de zircônio é um composto que não se dissolve facilmente,
podendo justificar a baixa toxicidade das nanopartículas de dióxido de zircônio.
Entretanto o lactato de zircônio é solúvel, por isso provavelmente é mais toxico.
Os níveis de zircônio da argila branca são menores que da argila verde. A
argila branca apresentou um valor da CL50 maior que a argila verde, o que
significa que ela tem menor toxicidade. Porem esta argila apresenta chumbo em
sua composição. SCHROEDER; MITCHENER; NASON (1970) demonstrou que
25 ppm de chumbo ministrado via oral a ratos machos determinam perda de
peso e pele escassa, mas não mortalidade. Esta concentração de chumbo e 10
vezes menor que a dose presente na argila branca. BABAYIGIT (2016) mostrou
0,54 mM de Pbl2 determina letalidade de 100% de embriões de zebrafish 2 -3
25
dias pós fertilização. Esta concentração e 10 vezes menor que a utilizada em
nossos experimentos. Porem a argila branca apresenta outros metais que
podem influenciar na toxicidade do chumbo.
Na composição da argila branca estudada, ainda foi encontrado o metal
pesado Bário, porém a argila verde não o possui em sua composição. Segundo
WANG; WANG (2008) em seu estudo foram aplicadas altas concentrações (75
μM e 200 μM) de bário em Caenorhabditis elegans, as quais causaram múltiplos
defeitos biológicos devido a toxicidade do Bário, entretanto não levaram a morte.
A CL50 da argila branca foi maior do que a argila verde, ou seja, os embriões
precisam de concentrações mais altas para encontrar a CL50 da argila branca,
sugerindo que a argila branca cause menor mortalidade dos embriões,
colaborando os dados de WANG; WANG (2008). O estudo de KWON et. Al.
(2016) também encontrou sinais de toxicidade utilizando BaCl2. Para tanto, foi
utilizado peixes adultos de zebrafish, que foram expostos a concentrações sub-
letais de BaCl2, durante 21 dias. Os resultados destes indicam que o BaCl2 pode
influenciar na reprodução, pois a produção de ovos reduziu significativamente.
Dessa forma, pode-se sugerir que a presença desse metal pode retardar o
desenvolvimento do zebrafish provocando algumas alterações e
consequentemente sua morte.
A argila branca contém em sua composição o metal Neodimio, e os
resultados do presente estudo mostram que ela é citotoxica devido a mortalidade
dos embriões de zebrafish. XING; ZHANG; WANG (2014) também encontraram
resultados parecidos quando testaram a toxicidade do neodímio (Nd) em
Dugesia japonica planariana. No qual o aumento da suplementação dietética de
Nd, gera a mortalidade do planario, sendo diretamente proporcional à
concentração. Os seus resultados mostram que esse animal aquático é sensível
à contaminação por Nd e pode ser um organismo indicador para a poluição por
Nd. Diante disso, pode-se considerar que o zebrafish também seja um bom
indicador dos efeitos de metais pesados no organismo. HUANG et.al. (2017)
também encontraram citotoxicidade na sua pesquisa sobre o tratamento com
Nd2O3 em macrófagos alveolares NR8383 de ratos. Estes encontraram que a
viabilidade celular é dose-dependente, mas não dependente do tempo.
Provavelmente a concentração de neodimio na argila branca possa ter
influenciado na mortalidade dos embriões.
26
No presente estudo foram aplicadas duas argilas (verde e branca) em
embriões de zebrafish durante o período de 24 até 144 hpf, onde estas
ocasionaram a mortalidade desses animais. De acordo com GUPTA; DHAWAN;
SHANKER (2016) em seu estudo, foram utilizadas nanopartículas de prata
(AgNPs) associada com partículas de argilas (Montmorillonite) em pH ácido e
neutro. Para os testes toxicológicos foi empregando embriões de zebrafish com
72 hpf. Constatou-se que a taxa de mortalidade foi maior em caso de exposição
a complexos AgNP-argila (pH 4,0 e 7,0) em comparação apenas com as
nanopartículas. Os autores concluíram que os colóides inorgânicos, em
ambiente aquático podem alterar o potencial de toxicidade das nanopartículas.
Estes resultados colaboram com os resultados do presente estudo, pois indicam
que o meio utilizado e o modelo experimental apresentam boa sensibilidade as
argilas cosméticas, fornecendo mais informações sobre seus efeitos no
organismo.
Estudos in vitro sugerem que as argilas comumente induzem citotoxicidade
(dependendo do tipo de argila, concentração, sistema experimental, etc.) com
diferentes mecanismos subjacentes, como necrose/apoptose, estresse oxidativo
ou genotoxicidade. Entrentato, a maioria dos experimentos in vivo realizados em
roedores não apresentaram evidências claras de toxicidade sistêmica mesmo
em concentraçãos altas. (MAISANABA, et. Al., 2015). Conforme ALI; VAN MIL;
RICHARDSON, 2011 em sua pesquisa, estes avaliaram 60 compostos solúveis
em água que apresentam uma variedade de classes químicas e mecanismos
toxicológicos empregando embriões de zebrafish, para encontrar a CL50. Os
seus resultados foram comparados com a pesquisas da literatura realizadas com
ratos, no qual cada uma das substancias tem uma melhor resposta com um
determinado modelo experimental. Assim, acredita-se que o zebrafish seja um
bom modelo para previsão de toxicidade das argilas cosmesticas, pois os
resultados deste estudo mostraram que os embriões são sensiveis ao
tratamento.
As argilas branca e verde pesquisadas no presente estudo mostram
comportamentos diferentes para a mortalidade dos embriões, sendo que a argila
verde em menores concentrações causa uma maior mortalidade destes.
MAISANABA, et. Al., 2015 explicam que em relação ao meio ambiente, os
minerais que compõem as argilas têm diferentes aplicações, portanto, com um
27
controle rigoroso das concentrações utilizadas, estas podem ser benéficas. Eles
concluiram que é necessária uma avaliação toxicológica individual, pois as
argilas têm seus próprios perfis toxicológicos.
Tanto a argila verde quanto a argila branca possuem metais pesados em sua
composição, e ambas ocasionaram mortalidade dos embriões de zebrafish. De
acordo com MASCOLO; SUMMA; TATEO (1999) as argilas apresentam
composições mineralógicas distintas, sendo assim, estas podem oferecer uma
digestibilidade diferente, de acordo com sua estabilidade termodinâmica, pois
esta pode mudar dependendo do ambiente, meio ácido ou alcalino. Então,
quando a concentração de metal no sangue estiver abaixo do limiar tóxico, a
ingestão de argila pode ser considerada segura, mesmo contendo metal. No
entanto, se os níveis de metais no sangue for excessivamente alto, a ingestão
de argila deve ser considerada um uso perigoso. Acredita-se que os metais
presentes nas argilas branca e verde estavam em um limiar toxico devido a
mortalidade encontrada. Porém é necessario mais estudos para esclarecer a real
toxicidade das argilas.
Em estudo anterior realizado por BALDUINO, PETRUCELLI, 2016 foi
encontrada na composição da argila branca caulinita, ilita, barita, diquita e
haloisita, esses minerais possuem uma área de superfície menor, implicando em
uma reatividade menor. No entanto, a argila verde possui em sua composição
mica, caulinita, haloisita, montmorilonita e quartzo, estes minerais tem uma
grande área de superfície, deixando essa argila mais reativa. Além disso, a forma
estrutural da argila verde é mais complexa, essas características podem estar
relacionadas com a maior mortalidade dos embriões de zebrafish.
4.2 Movimentos espontâneos (24 hpf) e Batimento cardíacos por minuto (48hpf) utilizando as argilas cosméticas Branca e Verde
Para a argila branca foi observada uma média de 5,08
movimentos/minuto, sendo que a maior movimentação foi de 10 movimentos e
a menor de 1 movimento. Esses movimentos involuntários indicam
desenvolvimento normal da musculatura e sinapses. Não houve diferença
significativa (p=0,05) quando comparados os movimentos nas diferentes
concentrações de argila (Tabela 4). No entanto, as concentrações de 1,6 e 0,8
28
mg/mL, quando comparado com o controle de 0 mg/mL apresentam valores
maiores (p=0,095). É possível que a argila branca possa apresentar um efeito
positivo no desenvolvimento embrionário, melhorando a qualidade do dos
embriões o que influenciaria positivamente no aumento de movimentos/minuto,
uma vez que a movimentação espontânea dos embriões é maior que do controle.
Tabela 4: movimentação espontânea do embrião com 24 horas pós fertilização, utilizando a argila branca e argila verde
Concentração
mg/mL
Média (argila
branca)
Teste t
(argila
branca)
Média
(argila
verde)
Teste t
(argila
verde)
25 5,57±2,23 0,43 3,9±2,6 0,37
12,5 5,75±2,38 0,24 4,6±2,1 0,79
6,3 4,47±2,42 0,61 3,6±1,3 0,03
3,2 4,5±1,61 0,54 4,3±1,7 0,34
1,6 5,4±1,88 0,095 4,2±1,9 0,31
0,8 5,92±198 0,095 5,3±2,6 0,57
0,4 5,08±2,68 0,76 4,8±2,1 0,98
0,2 4,33±2,29 0,47 4,2±2,3 0,39
0,1 5,38±1,56 0,30 4,9±2,4 0,90
0,05 4,43±2,14 0,55 4,5±1,9 0,57
0,025 5,31±1,55 0,37 4,2±1,8 0,32
0 (controle) 4,82±1,78 4,8±2,1
Para a argila branca a média de batimentos cardíacos por minuto foi de
128 bpm, sendo que o maior batimento por minuto encontrado foi de 148 e o
menor foi de 104 bpm. Os embriões possuem o seu tubo cardíaco formado com
48 hpf (WARREN e FISHMAN, 1998; TON et al., 2002), então neste estudo, os
batimentos cardíacos foram avaliados durante 1 minuto, nesse período do
desenvolvimento. Na Tabela 5 podem ser observadas as médias de batimentos
cardíacos por minuto dos embriões em cada concentração. Pode-se observar
que a concentração de 12, 5 mg/ml apresenta uma frequência cardíaca menor
que o controle (p=0,06). Esta concentração para 48 horas é o dobro da CL50
29
encontrada e provavelmente a diminuição da frequência cardíaca está
relacionada as baixas taxas de sobrevivência para concentrações acima da CL50.
Tabela 5: batimentos cardíacos por minuto no período de 48 horas pós fertilização, utilizando a argila branca e argila verde
Concentração
mg/mL
Média
(argila branca)
Teste t
(p<0,05)
Argila branca
Média
(argila
verde)
Teste t
(p<0,05)
Argila
verde
25 126±6,9 0,12 123±9,5 0,30
12,5 124±10,0 0,06 123±13,2 0,38
6,3 128±8,7 0,27 126±9,0 0,84
3,2 126±13,0 0,19 127±9,9 0,98
1,6 127±10,3 0,23 126±12,6 0,83
0,8 125±12,2 0,13 131±10,3 0,25
0,4 132±13,4 0,75 129±9,0 0,61
0,2 129±12,1 0,66 132±6,8 0,11
0,1 132±9,9 0,82 127±10,0 0,95
0,05 131±11,4 0,89 131±9,3 0,25
0,025 130±12,8 0,75 124±10,9 0,52
0 (controle) 131±10,2 127±12,7
Para a argila verde são apresentadas as médias de movimentos
involuntários na Tabela 4. Podemos observar que a concentração de 6,3 mg/mL
(p=0,03), apresentou diferença significativa no número de movimentos quando
comparado com o controle de 0 mg/mL, apresentado um número menor de
movimentos. A média de movimentação espontânea com 24 hpf para a argila
verde foi 4,4 movimentações por minuto, sendo que a maior movimentação foi
de 10 movimentos e a menor de 1 movimento.
A argila verde exibe uma média de batimentos cardíacos por minuto de
127 bpm, sendo que o maior batimento por minuto encontrado foi de 144 e o
menor foi de 88 bpm. Na Tabela 5 podem ser observadas as médias de
batimentos cardíacos por minuto dos embriões em cada concentração, não
30
apresentando diferença significativa nas concentrações dos grupos
experimentais, quando comparado com o controle de 0 mg/mL.
Quando comparamos as medias de movimentação das duas argilas
(branca, 5,08 movimentos/minuto e verde, 4,4 movimentos/minuto) podemos
perceber que os embriões expostos a argila branca apresentam maior
movimentação que os expostos a argila verde (p=0,05). Para a frequência
cardíaca não houve diferença estatística entre as argilas.
A argila branca do presente estudo apresenta em sua composição o bário
e outros metais pesados, sendo que estes não influenciam na movimentação
espontânea do zebrafish. Diferentemente WANG; WANG (2008) em seu estudo
utilizando como organismo modelo o Caenorhabditis elegans, empregando altas
concentrações (75 μM e 200 μM) de bário, observou que este causou graves
defeitos de vida útil, como alterações no desenvolvimento, reprodução e
locomoção em nematodes.
Um estudo de toxicidade realizado por FRAYSSE; MONS; GARRIC, 2006
testando o metal cadmio (108 mM ou 32 mg/L), avaliou o desenvolvimento
embrionário durante 4 dias, no qual encontraram em sua avaliação com 24 hpf,
uma variação de movimentação espontânea entre 0 a 6 movimentações, sendo
que a maior parte dos embriões movimentaram entre 1 a 2 vezes, no período de
20 segundos. Os batimentos cardíacos foram avaliados em 10 segundos, onde
a média foi entre 29 a 32 batimentos por minuto, com o menor valor de 25 bpm
e o maior valor de 35 bpm. Os resultados desse estudo são semelhantes aos
nossos quanto a movimentação espontânea, porem em relação aos batimentos
cardíacos, parecem ter uma proporção maior.
4.3 Alterações embrionárias utilizando as argilas cosméticas Branca e Verde
Tanto a argila branca quanto a argila verde promoveram alterações
teratogênicas nos embriões. As mais encontradas foram: edema de pericárdio,
edema de saco vitelino e alterações de coluna vertebral. Os gráficos 11 e 12
demonstram estas alterações encontradas, independente do tempo de
exposição às argilas.
31
Figura 11: Porcentagem de alterações embrionárias e larvais utilizando a argila branca
O eixo Y mostra as alterações do desenvolvimento em porcentagem e o
eixo X apresenta as concentrações testadas. Para a argila branca foi observado
um aumento do edema de pericárdio nos embriões expostos as diferentes
concentrações de argila em relação ao controle (p=0,05) (gráfico 11). Para a
argila verde os resultados são semelhantes aos encontrados para os embriões
expostos a argila branca (gráfico 12)
Figura 12: Porcentagem de alterações embrionárias e larvais utilizando a argila verde
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,025 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2 6,3 12,5 25 50
Po
rcen
tage
m d
e al
tera
ções
(ar
gila
b
ran
ca)
Concentração (mg/mL)
edema de pericardio edema de saco vitelino Alteração de coluna vertebral
**
**
**
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,025 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2 6,3 12,5 25 50
Po
rcen
tage
m d
e al
tera
ções
(ar
gila
ve
rde)
Concentração (mg/mL)
edema de pericardio edema de saco vitelino Alteração de coluna vertebral
**
*
**
* *
32
A argila branca apresenta a maior porcentagem de edema de pericárdio com
a concentração de 12,5mg/mL, nesta concentração os embriões do grupo
experimental também apresentam uma frequência cardíaca menor do que a
frequência cardíaca do controle. Isso provavelmente acontece, devido à
sobrecarga causada ao organismo, pois a CL50 inicial, no tempo de 24 horas é
de 9,38 mg/mL, logo, concentrações maiores são mais toxicas.
Figura 13: Alterações morfológicas encontradas nos embriões. Em A alteração da coluna vertebral (hiperlordose); B edema de saco vitelino e pericárdio; C não eclosão após 96h; D
degeneração.
Para as argilas branca e verde do presente estudo foram encontradas
alterações de coluna vertebral, edema de saco vitelino e de pericárdio. As
alterações mais encontradas foram edema de pericárdio e edema de saco
vitelino em ambas as argilas. Essas alterações podem ser visualizadas na figura
13. Foi realizado teste de ANOVA para comparar se alguma das argilas
apresentam mais alterações embrionários, entretanto não houve um resultado
significativo. De acordo com JEZIERSKA; LUGOWSKA; WITESKA (2009) em
sua revisão sobre os efeitos dos metais pesados no desenvolvimento
embrionário de peixes, estes causam a intoxicação dos embriões provocando
distúrbios nos processos de desenvolvimento, ocasionando em malformação e
mortalidade embrionárias e larvas. Sendo que o período inicial de
desenvolvimento embrionário, logo após a fertilização, e provavelmente o
33
período de eclosão são os mais sensíveis à intoxicação por metal. Assim sugere-
se que além de mortalidade as argilas também podem promover malformação
embrionária.
As alterações mais embrionarias mais encontradas no presente estudo
foram edema de pericardio e edema de saco vitelino, tanto para argila branca
quanto para a argila verde. Segundo RUYRA et. Al. (2015) em seu estudo foram
avaliadas estruturas metálicas-orgânicas (MOF), quanto à citotoxicidade para
toxicidade para embriões de zebrafish. As alterações morfológicas identificadas
nos embriões foram avaliação dos olhos anormalmente desenvolvidos, falta de
formação de somitos, atraso no desenvolvimento, edema pericárdico, edema de
saco vitelino, pigmentação irregular, malformação da cauda e/ou uma coluna
torcida. As malformações mais comumente encontradas foram edema
pericárdico, edema de saco vitelino e coluna torcida que colaboram com o nosso
estudo.
A argila branca estudada no presente estudo contem chumbo em sua
composição, esta gera algumas alterações nos embriões de zebrafish como
edema de pericárdio, edema de saco vitelino e alterações na coluna vertebral.
Segundo BABAYIGIT et.al (2016) em seu estudo usando o Pb e Sn, aplicados
em embriões de zebrafish, também foram encontradas alterações como não
eclosão, edema cardíaco, defeito hemovascular cerebral, tronco anormal
(inclinado para cima ou inclinado para baixo) e alteração na cauda. Estes
pesquisadores, sugeriram que a malformação dependente da dose. Isso indica
que as concentrações dos metais presentes nas argilas podem influenciar
nessas alterações embrionárias.
No presente estudo, tanto a argila verde quanto a argila branca induziram
teratogênias nos embriões de zebrafish como edema de pericárdio, edema de
saco vitelino e ainda mortalidade. De acordo com GUPTA; DHAWAN; SHANKER
(2016) eles também encontraram alterações no desenvolvimento embrionário
como alterações na cauda, edema de saco vitelino e pericárdio, utilizando
nanopartículas de prata (AgNPs) associada a partículas de argila
(Montmorillonite). Em seus estudos, os embriões de zebrafish exibiram níveis
mais altos de alterações morfológicas quando as nanopartículas estavam
associadas com a argila, do que em grupos contendo apenas a nanopartículas.
Estes concluíram que os colóides inorgânicos em ambientes aquáticos podem
34
alterar o potencial de toxicidade das nanopartículas. Devido a essa sensibilidade
ao ambiente, as argilas empregadas no presente estudo, podem ter ocasionado
alterações no desenvolvimento embrionário do zebrafish. Sugerindo ser um bom
modelo para tais testes.
A argila branca apresenta em sua composição o bário, nesta foram
encontradas alterações embrionárias que indicam toxicidade. no estudo de
MOHAMMED; ISMAIL (2017), estes investigaram sais de bário (BaCl2, 179
mg/kg e BaCO3, 418 mg/kg), que foram ministrados por via oral durante 30 dias
em ratos machos adultos. Os resultados destes também apontam que BaCl2 e
BaCO3 são intensamente tóxicos para vários tecidos do corpo, provocando
distúrbios como anemia, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade e cardiomiopatia. O
edema de pericárdio foi uma das alterações mais encontradas utilizando tanto a
argila verde quanto a argila branca, podendo acontecer devido à sobrecarga e
os efeitos que esses metais causam no organismo.
4.4 Taxa de eclosão no período de 48, 72 e 96 horas pós fertilização utilizando as argilas cosméticas Branca e Verde
A taxa de eclosão dos embriões expostos a argila branca é demonstrada
na Figura 14, no período de 48, 72 e 96 horas pós fertilização, respectivamente.
Kimmel et al. (1995) considera um embrião não eclodido após 72 hpf como
teratogênia. Porém em nosso trabalho não observamos embriões vivos não
eclodidos. Ou seja, todos os embriões não eclodidos estavam mortos. Assim
quanto maior a concentração menor a taxa de eclosão isto porque a mortalidade
aumenta.
Para a argila branca foi observado que a concentração de 1,6 mg/ml
apresentou com 48 horas de exposição maior taxa de eclosão que o controle
negativo. Com 72 hpf as concentrações 1,6 mg/ml e 0,2 mg/ml apresentaram
maior taxa de eclosão que o controle. Este mesmo resultado foi observado para
96 hpf. Na concentração de 1,6 mg/mL o número de movimentos espontâneos é
maior (p=0,095) do que o controle, influenciando na taxa de eclosão. Além disso,
não foram encontradas alterações embrionárias nessa concentração. Sugerindo
que essa possa ser uma concentração que não causem alterações ao
organismo.
35
Figura 14: Porcentagem de eclosão dos embriões utilizando a argila branca. Em A, B e C são representadas as taxas de eclosão nos períodos de 48 hpf, 72 hpf e 96 hpf, respectivamente
48 hpf argila branca Média= 36,36; SD= 8,2619; p = 0,0366
72 hpf argila branca Média= 70,18; SD= 17,7564; p= 0,0174
96 hpf argila branca. Média= 71,92; SD= 7,9799; p= 0,0001
A argila branca em concentrações abaixo de 12,5 mg/ml, nos tempos de
48, 72 e 96 horas determina uma taxa de eclosão semelhante ao controle. A
partir da concentração de 6,3 mg/ml a taxa de eclosão diminui significativamente.
Isto porque com 48 horas de exposição, a CL50 e de 6,3, ou seja, neste momento
ocorre mortalidade de 50% dos embriões, o que determina uma diminuição da
taxa de eclosão.
Para a argila verde a Figura 15 mostra a taxa de eclosão dos embriões
nos tempos de 48, 72 e 96 horas respectivamente. A argila verde promoveu uma
taxa de eclosão semelhante ao controle quando os embriões foram expostos a
0,1 mg/ml durante 48 horas. Com 72 horas e 96 horas de exposição os embriões
expostos a 0,2 mg/ml também apresentaram uma taxa de eclosão semelhante
ao controle negativo. Quando observamos as CL50 para estes tempos de
exposição percebemos que estas concentrações são muito menores, e que as
taxas de mortalidade promovidas pela argila verde nesta concentração e tempo
de exposição são semelhantes ao controle.
A argila verde demonstra o mesmo comportamento da argila branca,
sendo que a medida que aumenta a concentração, diminui a taxa de eclosão,
pois a CL50 inicial é de 2,48 mg/mL, logo, concentrações maiores que esta causa
a letalidade dos embriões. Nos gráficos da taxa de eclosão da argila verde,
observou-se que a partir de 3,2 mg/mL esta começa a diminuir.
A B C
36
Figura 15:Porcentagem de eclosão dos embriões utilizando a argila verde. Em A, B e C são representadas as taxas de eclosão nos períodos de 48 hpf, 72 hpf e 96 hpf, respectivamente
48 hpf argila verde Média= 34,27; SD= 16,9033; p= 0,0765
72 hpf argila verde Média= 70,18; SD= 17,7564; p= 0,0174
96 hpf argila verde Média 65,98; SD= 7,1767; p= 0,0001
B C A
37
5 CONCLUSÃO
Nos testes de toxicidade com embriões foi observado que a argila verde
ocasiona maior mortalidade dos mesmos, pois necessitam de concentrações
menores para chegar a uma taxa de mortalidade de 50 porcento dos embriões.
E ainda, as movimentações espontâneas no período de 24 horas pós fertilização
são menores com a argila verde quando comparada com a argila branca,
demonstrado um resultado significativo. Ambas as argilas ocasionam alterações
embrionárias no zebrafish, sendo que as mais frequentes são edema de
pericárdio e edema de saco vitelino, mas não há diferença significativa quando
comparadas a argila branca com a argila verde.
Conclui-se que é imprescindível um maior rigor na fiscalização das argilas
cosméticas, alertando a população a respeito dos riscos que podem causar a
saúde e ao meio ambiente. São necessários mais estudos para elucidar os
efeitos tóxicos das argilas, pois estas são utilizadas diretamente na pele. É
provável que as substancias (argilas cosméticas) utilizadas no estudo também
causem alterações embrionárias, porém mais pesquisas são necessárias para
isolar o efeito destas sobre o embrião.
38
6 PERSPECTIVAS
• Avaliar genotoxicidade das argilas nos embriões
• Metais pesados causam alteração de DNA
• Avaliar medidas morfométricas dos embriões para curva de crescimento
• Observar a diferença quanto a toxicidade das frações em micrometros e
nanômetros das argilas cosméticas.
39
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ANEXO 1 – PROJETO APROVADO PELO COMITÊ DE ÉTICA
