COMUNICAÇÃO TÉCNICA ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Nº 175799

Anticorpos monoclonais: uso terapêutico e diagnóstico Patricia Léo

Palestra apresentada WORKSHOP DE BIOTECNOLOGIA, WORKBIOTECH, 4., 2018, Botucatu

A série “Comunicação Técnica” compreende trabalhos elaborados por técnicos do IPT, apresentados em eventos, publicados em revistas especializadas ou quando seu conteúdo apresentar relevância pública. ___________________________________________________________________________________________________

Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S/A - IPT

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www.ipt.br

ANTICORPOS MONOCLONAISUSO TERAPÊUTICO E DIAGNÓSTICO

PATRICIA LÉOLABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA

NÚCLEO DE BIONANOMANUFATURA

INSTITUTO DE PESQUISAS TECNOLÓGICAS - IPT

Nanotecnologia

NÚCLEO DE BIONANOMANUFATURA

BiotecnologiaProcessos químicos

Micro manufatura

LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

ANTICORPOS MONOCLONAIS

2015: 27% FDA – produtos biológicos – maioria anticorpos monoclonais2015: 61 anticorpos aprovadosAté 2017: EMA – aprovados 21 biossimilares: primeiro AcMo : infliximab (Doença de Crohn e artrite reumatóide)

Anticorpos Monoclonais

Classe de biofármacos mais estudada e com maior crescimento

Aplicações:• Diagnóstico in vitro e in vivo;• Tratamento :

1. Tumores - câncer;2. Doenças cardiovasculares;3. Asma;4. Doenças infecciosas;5. Doença de Crohn6. Psoaríse7. Rejeição de transplantes8. Doenças auto-imunes (Artrite

reumatóide, Esclerose múltipla, Lúpus eritematoso sistêmico;

Tratamento de tumores:

- Reconhecimento específico e ligação a receptores de superfície de células tumorais

-Monoclonais conjugados a drogas – direcionados a célula alvo

- 2004: aprovação *Avastin (Bevacizumab) para tratamento de câncer coloretal metastásico – inibidor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)

* Genentech/Roche

- 1997: Anticorpos anti-fibrina - no inicio do processo de Coagulação (Abciximabe- ReoPro)* inbição da agregação plaquetária)* Centocor- Evita a formação de coágulos no sistema vascular

- Evita a interrupção do fluxo sanguíneo e embolia

Doenças cardiovasculares:

- Anticorpos contra antígenos de superfície de vírus- Exemplos: vírus Hepatite B e o HIV

- Anticorpos contra sub-unidades peptidícas de Streptococcus mutansCárie dentária

Doenças infecciosas virais:

Doenças infecciosas bacterianas:

ANTICORPOS MONOCLONAIS APLICADOS NAS PRÁTICAS MÉDICAS

O que são anticorpos?

Moléculas produzidas pelos linfócitos B após a exposição a um antígeno

Köhler Milstein Jerne

Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1984

Por explicar a formação e diversidade de anticorpos

http://www.whatisbiotechnology.org/exhibitions/milstein/antibodies

https://www.nature.com/milestones/mileantibodies/full/mileantibodies09.html

Células de mieloma (não secretora de anticorpos)

Células baço animais

imunizadosLinfócitos B

Polietileno Glicol

Meio seletivo HATHipoxantina

AminopterinaTimina

Anticorpos MonoclonaisO que são hibridomas?

Kohler & Milstein,

1975 Feeder-layerCamada de macrófagos

Como ocorre a seleção ?

RNA

DNA

Via Principal

ViaAlternativa

HPGRT -

TimidinaQuinase -

Hipoxantina

Timidina

MEIO HAT

Fusão celular

X

1,5 x 106 células/mL

Ascite 1-40mg/mL

Camundongos mesma espécie dos animais imunizados

Como ocorre a expansão ?

Diluição limitante

20-100 µg/mL 1 g/L batelada1–10 g/L batelada alimentada

Biorreator

1975: Köhler &Milstein – Nature – A tecnologia de hibridomasContinuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificityG. KÖHLER & C. MILSTEINNature volume 256, pages495–497 (07 August 1975)

• Tecnologia livre de direitos de propriedade intelectual

• Cada anticorpo = produto único = patenteado = exclusividade de mercado

MOTIVAÇÃO a OBTENÇÃO DOS MONOCLONAIS

1986: aprovado primeiro AcMo terapêutico - Orthoclone OKT3, (prevenção a rejeição de transplantes)HAMA: anticorpos humanos anti-camundongos

1990s aprovação do primeiro anticorpo quimêrico

2013 venda global de ACMo ~ $75 bilhões

2020: »70 AcMo - $125 bilhões

2024: $138,6 bilhões

EVOLUÇÃO DO MERCADO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS

Murino

QuimêricosFC - humano

HumanizadosAC humano com domínios

hipervariáveis murino

Monoclonais recombinantesPlataformas de células animais e

humanas

Nú

mer

o d

e P

rod

uto

s

Mabs e correlatos Produtos aprovados mas removidos do mercado

Número de produtos (Mabs e correlatos) aprovados por ano

2014 = 62015 = 92016 = 62017 = 10

HAMAQuimêricos

CHO

insulina

Mercado de proteínas recombinantes

2013 venda global de ACMo ~ $75

2020: »70 AcMo - $125 bilhões

2024: $138,6 bilhões

MABS2018, VOL. 10, NO. 2, 183–203https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1415671

PERSPECTIVE Antibodies to watch in 2018

Helene Kaplona and Janice M. ReichertbaLaboratory UMRS 1138 “Cancer, Immune Control and Escape”, Cordeliers Research Centre, Paris, France; bThe Antibody Society, Framingham, MA, USA

MABS2018, VOL. 10, NO. 2, 183–203https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1415671

PERSPECTIVE Antibodies to watch in 2018

Helene Kaplona and Janice M. ReichertbaLaboratory UMRS 1138 “Cancer, Immune Control and Escape”, Cordeliers Research Centre, Paris, France; bThe Antibody Society, Framingham, MA, USA

MABS2018, VOL. 10, NO. 2, 183–203https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1415671

PERSPECTIVE Antibodies to watch in 2018

Produção de Anticorpos MonoclonaisTecnologias de Células Animais

Bioterapêuticos – cultura de células Uso Comercial e Estudos Clínicos

Otimização de inúmeras variáveis•Linhagem celular capaz de produzir a molécula requerida com altaprodutividade e baixo custo de operação;

•Meios de cultura e biorreatores que permitam produtividade e qualidade do produto;

•Sensores on-line e off-line informações para melhorar o controle de processo

•Bom entendimento do bioprocesso para um escalonamento adequado

Tecnologias de Células Animais

• Confiável •Robusta •Madura

Obtenção de Anticorpos Monoclonais

Desenvolvimento e engenharia de linhagens

celulares

Meios de culturas e estratégias de processo

Otimização em biorreatores e ampliação

de escala

Caracterização e validação do processo

Transferência de tecnologia

Fabricação em GMP

Testes pré-clínicos

Busca de novos alvos

Obtenção das sequênciasgênicas de interesse

Sistema de expressão em mamíferos

Seleção de clones

produtores

1 2

3

CONSTRUÇÃO DE LINHAGEM CELULAR RECOMBINANTE

Gene de Interesse

Vetor de Expresssão

Linhagem Hospedeira

Linhagem Celular Recombinante

Seleção do vetor de expressãoEstratégias de clonagem

Método de entrega do DNA

Seleção, clonagem e screening

Condições de cultivo, meio utilizadoEngenharia metabólica

Otimização do crescimento, metabolismo e produtividade

Historicamente•Baixo rendimento•Complexidade do meio de cultura•Necessidade de soro fetal bovino•Sensíveis a agitação - cisalhamento

Tecnologias de Células Animais

LINHAGENS CELULARES MAIS UTILIZADAS NA INDÚSTRIA BIOFARMACÊUTICA

LINHAGEM CELULAR ESPÉCIE APLICAÇÕES

CHO.k1/CHO dhfr Hamster Expressão transiente e estável

BHK-21 Hamster Expressão transiente e estável, produção de

vacinas

HEK-293 Human Expressão transiente e estável, produção de

vírus

Perc.C6 Human Expressão estável, produção de vacinas e

vírus

Vero Monkey Produção de vacinas

COS Monkey Expressão transiente, produção de vírus

LINHAGENS CELULARES MAIS UTILIZADAS NA INDÚSTRIA BIOFARMACÊUTICA

LINHAGEM CELULAR ESPÉCIE APLICAÇÕES

Hibridoma, NSO, SP2/O Mouse Expressão estável, produção de anticorpo

monoclonal

MDCK Dog Expressão estável, produção de vacinas

Sf-9/Sf-21 Insect Produção de proteína recombinante e de

baculovírus

Tn-368/High-FiveTM BTI-TN-5B1-4

Insect Produção de proteínas

Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-016-7388-9

Advances in recombinant antibody manufacturingRenate Kunert & David Reinhart

LINHAGENS CELULARES

1 g/L batelada1–10 g/L batelada alimentada

Publicações PubMed linhagens celulares utilizadas para produção de proteínas

Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-016-7388-9

Advances in recombinant antibody manufacturingRenate Kunert & David Reinhart

CHO: célula hospedeira predominante para produção de proteínas terapêuticas (70%). DUXB1, DG44 e CHOK1 (DHFR +)

Tecnologias de Células Animais

1. Desenvolvimento da Linhagem Celular

• Construção do vetor de expressão e transfecção

Plasmídeo contendo genes da cadeia leve e pesada, genes marcador de seleção* num mesmo casseteCassete para replicação do plasmídeo em bactériaPromotores fortes: CMV (citomegalovírus)Sequência sinal de poliadenilação SV40

* Marcador de Seleção:

Marcadores de seleção metabólicosAntibióticos

Marcador de Seleção Reagente seletivo

Metabólico

Dihidrofolato redutase(DHFR)

Metionina sulfóximine (MSX)

Glutamina sintetase (GS) Metrotrexato (MTX)

Antibiótico

Puromicina acetiltransferase Puromicina

Blasticidina diaminase Blasticidina

Histidinol dehidrogenase Histidinol

Higromicinaq fosfotransferase Higromicina

Gene de resistência a zeomicina

Zeocina

Gene de resistência a bleomicina

Bleomicina

Amiloglicosidefosfotransferase

Neomicina (G418)

CHO

MARCADORES DE SELEÇÃO RECESSIVOS

• DIHIDROFOLATO REDUTASE (DHFR)

CHO deficiente em DHFR (Urlaub & Chasin, 1980): DUKX-B11 E DG44Requer glicina, hipoxantina e timidina para o crescimentoCHO-DHFR deficiente são transfectadas com um gene heterólogode DHFRMeio seletivo com ausência de nucleósídeos: Ham’s F12 sem T e Halfa- meio sem nucleosídeos

AMPLIFICAÇÃO GÊNICA

MTX MTX

Folato Dihidrofolato (FH2)

DHFR DHFRTetrahidrofolato (FH4)

•Amplificação é obtida depois da seleção por aumento da resistência• O DNA amplificado apresenta estabilidade variável• O tamanho e estrutura da unidade amplificada são variáveis e pode mudar com o tempo

• MTX (metotrexato): análogo ao folato, o qual liga ao sítio catalítico de DHFR

AMPLIFICAÇÃO GÊNICA: DHFR/MTX

• Células altamente resistentes a MTX:

Cópias de gene DHFR + cópias do gene heterólogo

Monocamada de células DHFR positiva

Monocamada de células resistentes a 50 nm MTX

Monocamada de células resistentes a 150 nm MTX

Seleção Seleção Seleção

50 nm MTX 150 nm MTX 450 nm MTX

Análise dalinhagemcelular clonal

•Processo no qual o genede interesse é introduzidodentro das célulaseucarióticas por métodosbioquímicos ou físicos;

•Método rápido, simples,requer poucos reagentes,eficiência variada emdiferentes linhagenscelulares;

•Método mais utilizadopara a entrega do DNA.

ENTREGA DE DNA NAS CÉLULAS DE MAMÍFEROS

TRANSFECÇÃO

•Processo mediado por vírus noqual as células alvos sãoinfectadas com vírus carregandoa sequência de interesse clonadaem seu genoma;

•Método mais complicado, requermais etapas e mais tempo;

•Alta eficiência em linhagenspermissíveis, mas baixa emcélulas deficientes em receptorespara o vírus.

INFECÇÃO

Transfecção

Co-precipitação com fosfato de cálcio

Lipofecção com lipídeo catiônico*

Métodos baseados em polimêros PEI/DEAE-Dextran ou dendrímeros

Eletroporação

Microinjeção

Microprojétil mediando a transferência do gene

COPRECIPITAÇÃO COM FOSFATO DE CÁLCIO

DNA + tampão fosfato + CaCl2 precipitado fino

• Baixo custo

•Amplo espectro de células

•Toxicidade variada

•Reprodutibilidade pode ser problemática

•Requer cuidadosa preparação de reagentes (sensível ao pH)

LIPÍDEOS CATIÔNICOS

•Rápido e fácil de executar, resultados reprodutíveis

•Amplo espectro de linhagens celulares

•Alta eficiência e performance de expressão

•Necessidade de otimização para cada linhagem celular

ELETROPORAÇÃO

•Pulsos elétricos curtos de alta voltagem alterando a permeabilidade celular•Possível controlar o número de cópias

• Necessidade de eletroporador

•Pulso e campo elétrico podem ser otimizados

•Alta mortalidade celular

Transfecção

Expressão Transiente

Expressão Transiente

Meio Seletivo

Expressão Estável

Episomal

Dias: 0 1 – 3 3 -14 7 - 14

Seleção Clones Estáveis

EXPRESSÃO DO GENE

PARÂMETROS A CONSIDERAR ANTES DA TRANSFECÇÃO

•Linhagem hospedeira (características de crescimento, transfectabilidade, viabilidade)

•Tipo de expressão: transiente ou estável

•Eficiência do método de transfecção utilizado

•Presença de soro ou antibióticos

•Tamanho da unidade de expressão e qualidade do DNA

•Presença de elementos de controle apropriados no vetor de expressão

•Método de detecção utilizado para medir a expressão do gene

Gene de Interesse

Vetor de Expresssão

Linhagem Hospedeira

Linhagem Celular Recombinante

Otimização do crescimento, metabolismo e produtividade

Seleção do vetor de expressãoEstratégias de clonagem

Método de entrega do DNA

Seleção, clonagem e screening

Condições de cultivo, meio utilizadoEngenharia metabólica

CONSTRUÇÃO DE LINHAGEM CELULAR RECOMBINANTE

Colônias resistentes a drogas

Tripsinização

Placa Mestre

Célula Progenitora

Linhagem celular (um clone)

MÉTODOS DE CLONAGEM

800

600

400

200

0

con

cen

tra

ção

(n

g/m

L)

VARIAÇÃO CLONAL DEVIDO A INTEGRAÇÃO ALEATÓRIA

• Variação no nível de expressão das células transfectadas

•Algumas células não expressam ou expressam proteína recombinante abaixo do nível de detecção

• Poucas células expressam a proteína recombinante acima do nível médio

MÉTODOS DE SCREENING

Permitir a detecção e/ou quantificação de proteína recombinante

Simples, rápido, sensível e confiável

Exemplos:

Western blotELISARIAAtividade biológicaImunoensaioFACS

Screening e seleção de clones com alta produtividade

ELISA: elimina clones com baixa ou nenhuma produção

12-24 clones com alta produção: ampliados

Crescimento celularProdutividade específica por célulaProdutividade volumêtrica (título)

4-6 clones: avaliação em biorreator

Sítio de recombinação FRT ou loxP

Transfecção na linhagem celular produtora

Integração randômica no genoma(recombinação não homóloga ou ilegítima

Screening e seleção de clones exibindo:alta expressão gênica de uma única cópia integrada

Loci com alta atividade transcripcional

Marcador

Marcador

GERAÇÃO DE CLONES COM EXPRESSÃO ISOGÊNICA

1. Geração de linhagens celulares estáveis altamente produtoras

GFPX

Recombinação dirigida

pRec+

pX-RS

Clones Isogênicos

700

600

400

200

0X c

on

c. (

ng

/mL

)

RMCE (Recombinase mediando a troca de cassete)

Parâmetros afetando a qualidade do bioprocesso e do produto

Bioprocesso

Fig. 2 Typical cell and product concentrations achieved due to process improvements in the past three decades

MELHORAMENTO DE PROCESSO

BIORREATORES – CISALHAMENTO

BIORREATORES – VALIDAÇÃOSINGLE USE BIOREACTOR - SUB

LIBBS

2012: 5% prescrições Sistema Único de Saúde (SUS) 43% dos custos de medicamentos (Guia 2013).

anticorpos utilizados para o tratamento de artrite reumatoidecusto :US$ 10.000 e US$ 30.000 por ano

NO BRASIL

Biossimilares – Uma alternativa viável

PATENTES EXPIRANDO

• 2008 o governo formulou uma política industrial denominada Política para o Desenvolvimento Produtivo (PDP),

• Parcerias para o Desenvolvimento Produtivo – que são Parcerias Público Privadas (PPP) (Sundfeld & Souza 2013).

• PDP criar a indústria de biotecnologia médica no Brasil por meio dos biossimilares

Parcerias Público Privadas _ Política Desenvolvimento Produtivo

MOTIVAÇÃO

As Parcerias para o Desenvolvimento Produtivo envolvem basicamente três atores:

a) laboratório público;b) laboratório farmacêutico privado (nacional ou

estrangeiro instalado no país) ec) produtor de insumos biotecnológico ou de rota

química nacional (transferência de tecnologia de uma empresa estrangeira)

PDPs

ABBVIE INC.ALEXION PHARMACEUTICALS INC

AMGEN INC.ASTRAZENECA PLC.BIOGEN INC.BRISTOL-MYERS SQUIBB COELI LILLY AND CO.FRESENIUS KABI USAGENMAB A/SGILEAD INC.GLAXOSMITHKLINEF. HOFFMANN-LA ROCHE LTD.JOHNSON & JOHNSON INC.MERCK & CO. INC.MERCK KGAANOVARTIS AGPFIZER INC.SANOFI INC.SEATTLE GENETICS INC.SPECTRUM PHARMACEUTICALS INC.TAKEDA PHARMACEUTICAL U.S.A., INC.UCB

Indústrias Internacionais de Biotecnologia e Farmacêuticaem P&D anticorpos monoclonais

•2009 – 2013 = 104 termos de compromisso, dos quais 28 em biossimilares.

• Bionovis tem como sócios: Aché, EMS, Hypermarcas e União Química.

• Orygen: Eurofarma, Cristália, Libbs e Biolab.

•Cristália e a Libbs, que continuaram a desenvolver projetos próprios de biossimilares, porém ainda vinculadas às PDPs

PDPs

PDPs - Biossimilares

Portfólio de biossimilares da Libbs farmacêutica:

– trastuzumabe: tratamento de câncer de mama metastático, câncer de mama inicial e câncer gástrico avançado.

– rituximabe: indicado no tratamento de linfoma não Hodgkin, Linfoma Folicular, artrite reumatoide, leucemia linfoide crônica e outras doenças autoimunes.

– bevacizumabe: tratamento de câncer colorretal metastático, câncer de pulmão de células não pequenas localmente avançado, metastático ou recorrente, câncer de mama metastático ou localmente recorrente, câncer de células renais metastático e/ou avançado.

– etanercepte: indicado para tratar artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, espondilite anquilosante, artrite psoriática e psoríase crônica.

– adalimumabe: tratamento de artrite reumatoides, artrite psoriática, espondiliteanquilosante, doença de Crohn, psoríase em placas e artrite psioriática juvenil poliarticular.

APLICAÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS

MICROFLUÍDICA

DIAGNÓSTICO PRECOCES

BIÓPSIA LÍQUIDA

Cell Physiol Biochem 2017;41:755-768

TENDÊNCIA

SUSBSTITUIÇÃO TESTES EM ANIMAIS

Human-on-a-chip

OBRIGADA

PATRICIA LÉOpatrileo@ipt.br