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CONSTITUIÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E
APLICAÇÃO DE PADRÕES SOROLÓGICOS INTERNACIONAIS PARA
AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DE IMUNOENSAIOS USADOS NA
VIGILÂNCIA ATIVA DA FEBRE AFTOSA
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Renata de Mendonça Campos
CONSTITUIÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE PADRÕES SOROLÓGICOS INTERNACIONAIS PARA AVALIAÇÃO DO
DESEMPENHO DE IMUNOENSAIOS USADOS NA VIGILÂNCIA ATIVA DA FEBRE AFTOSA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Microbiologia)
Orientadores: Ingrid Evelyn Bergmann Moacyr Alcoforado Rebello
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO DEZEMBRO DE 2008
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
Campos, Renata de Mendonça Constituição, caracterização e aplicação de padrões sorológicos internacionais para avaliação do desempenho de imunoensaios usados na vigilância ativa da febre aftosa / Renata de Mendonça Campos – Rio de Janeiro, 2008 XIX, 100 Tese [Doutorado em Ciências (Microbiologia)] Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, 2008. Orientadores: Ingrid Evelyn Bergmann e Moacyr Alcoforado Rebello Referências bibliográficas:f 95 1. Padrões de soros internacionais 2. Vírus da Febre Aftosa 3. Testes para proteínas não-capsídais 4. Validação 5. Controle de Qualidade 6. Imunoensaios I. Bergmann, Ingrid Evelyn. II. Rebello, Moacyr Alcoforado. III. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Doutorado em Ciências (Microbiologia). IV. Constituição, caracterização e aplicação de padrões sorológicos internacionais para avaliação de desempenho de imunoensaios usados na vigilância ativa da febre aftosa
iii
Renata de Mendonça Campos
CONSTITUIÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE PADRÕES SOROLÓGICOS INTERNACIONAIS PARA AVALIAÇÃO DO
DESEMPENHO DE IMUNOENSAIOS USADOS NA VIGILÂNCIA ATIVA DA FEBRE AFTOSA
Rio de Janeiro,16 de Dezembro de 2008 Moacyr Alcoforado Rebello, Doutor, UFRJ Ingrid Evelyn Bergmann, Doutora, Centro Pan-Americano de Febre Aftosa Davis Fernandes Ferreira, Doutor, UFRJ Edson Elias da Silva, Doutor, FIOCRUZ Viviana Malirat, Doutora, Centro Pan-Americano de Febre Aftosa Walter Martin Roland Oelemann, Doutor, UFRJ
iv
O presente trabalho foi realizado no Laboratório do Centro Pan-americano de Febre Aftosa, OPAS/OMS, em colaboração com o Departamento de Virologia, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação dos Profs Ingrid Evelyn Bergmann e Moacyr Alcoforado Rebello
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Agradecimentos
Aos meus orientadores Dra Ingrid Evelyn Bergmann pela oportunidade concedida, a confiança depositada, o incentivo para o ingresso no Doutorado, o apoio na concretização desse trabalho, os inestimáveis ensinamentos e pela amizade; ao Dr Moacyr Alcoforado Rebello pelos ensinamentos e pelo apoio recebido durante toda a minha trajetória acadêmica. Ao Diretor, Dr. Eduardo Corrêa Melo “in memória”, atualmente, ao Dr. Albino Belotto e ao Administrador, Dr João Luiz de Oliveira Gondomar, do Centro Pan-americano de Febre Aftosa, por autorizarem e apoiarem o desenvolvimento desse trabalho. À Coordenação do curso de Pós-graduação em Microbiologia e Imunologia do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG), na pessoa da Dra Thaís Christina B.S. Souto-Padrón e a sua equipe. Ao Dr Abraham Falczuk do Serviço Nacional de Saúde e Qualidade Agroalimentária da Argentina, ao Dr Camilo Sanchéz do Instituto Colombiano Agropecuário e ao Dr Salomón Ortiz do Serviço Nacional de Saúde Agrária do Peru e as suas equipes, pela extensa colaboração nesse estudo, que permitiram a obtenção, a caracterização do material utilizado e possibilitaram, através da vasta experiência e conhecimento, o aprimoramento das discussões e uma melhor compreensão da problemática da doença a campo. À Dra Emiliana Brocchi e a sua equipe pelos estudos de caracterização realizados no Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna (IZSLER), Brescia, Itália. À Doutora Erika Neitzert pela oportunidade de aprendizado, pois, sem os ensinamentos e as discussões científicas, este trabalho não poderia ter sido realizado.
vi
Ao Dr. Walter Oelemann por ter aceito, prontamente, o convite para ser revisor desse trabalho. A toda equipe de profissionais, consultores, funcionários e estagiários do laboratório do PANAFTOSA, sem os quais esse trabalho também não poderia ter sido realizado e, em especial, aos funcionários que compõem a equipe de soroepidemiologia e ativamente participaram na realização do mesmo. Meu muito obrigado ao Carlos Chagas, Carlos Senna, Luis Cláudio, Paulo Dias, Ivan Teixeira, Marcos Ramos, Rosane Nunes, e particularmente ao amigo e companheiro de trabalho Alberto Tadeu por todo apoio e dedicação. Ao companheiro e amigo Maurício Martins, responsável pelos processos de inativação e liofilização dos soros no laboratório do PANAFTOSA e ao amigo José Junior por todo apoio nos momentos difíceis. Ao Engenheiro Aristelmo por toda dedicação para compreensão e solução dos nossos problemas. A todos os meus amigos que, de longe ou perto, me incentivaram a continuar, mas principalmente, aos amigos eternos Marcelo, Leandro e Daniel, por todos os momentos solidários e felizes que partilhamos e a minha amiga Eliane Veiga por todo apoio profissional e moral. Ao Rodrigo pelo incentivo e carinho que me ajudaram a continuar nos momentos difíceis. À minha amiga e companheira de trabalho Viviana Malirat, cujo apoio diário foi inestimável, para a realização desse trabalho e para a minha formação profissional. Á Deus pela abençoada oportunidade de conhecer, conviver e aprender com todas essas pessoas.
vii
Dedico este trabalho com muito amor aos meus pais Renato e Célia e aos meus irmãos Márcia Helena e Thiago
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RESUMO
Renata de Mendonça Campos
Constituição, caracterização e aplicação de padrões sorológicos
internacionais para avaliação do desempenho de imunoensaios
usados na vigilância ativa da febre aftosa
Orientadores: Ingrid Evelyn Bergmann e Moacyr Alcoforado Rebello
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
A Febre Aftosa (FA), enfermidade de origem viral muito
contagiosa que atinge animais bingulados, produz grandes perdas
econômicas no mercado internacional de animais e produtos
derivados.
O avanço do Plano Hemisférico de Erradicação da FA na
América do Sul, sustentado no uso de vacinas inativadas,
evidenciou a necessidade de contar com metodologias laboratoriais
para avaliar de forma confiável a ausência de circulação viral
silenciosa em animais vacinados. Principalmente devido a habilidade
do vírus da FA (VFA) de estabelecer infecção subclínica e inclusive
persistente (assintomática) em alguns animais independentemente
da condição de vacinação. Nesse sentido, foi desenvolvido no
Centro Pan-Americano de Febre Aftosa (PANAFTOSA), um sistema
diagnóstico baseado na detecção de anticorpos contra as proteínas
não capsidais (PNCs) do VFA, os quais podem ser associados à
circulação viral independentemente da vacinação. O mesmo é
composto por um ELISA indireto, utilizando a poliproteína
ix
recombinante 3ABC como método de triagem seguido por um
western blot utilizando 5 antígenos não capsidais recombinantes
(3A, 3B, 2C, 3D e 3ABC), como método confirmatório para as
amostras suspeitas ou positivas pelo ELISA. O sistema foi validado,
reconhecido pela Organização Mundial para a Saúde Animal (OIE)
como teste de referência (índice ou padrão ouro) e estabelecido
como kit completo.
A ampla e exitosa utilização do mesmo gerou respaldo junto à
OIE para a aceitação da categoria de áreas/países livres da doença
com vacinação. Igualmente, promoveu internacionalmente o uso da
vacinação em contraposição ao sacrifício abrindo a possibilidade de
utilização de testes PNCs em outras regiões, o que incentivou o
desenvolvimento de novos ensaios com PNCs.
De acordo com as diretrizes de validação de ensaios da OIE,
para a avaliação do desempenho de outros kits e/ou metodologias
em desenvolvimento em comparação ao teste índice é necessário o
preparo de padrões internacionais de calibração e avaliação. Este
trabalho apresenta a seleção, caracterização e aplicação de três
soros (negativo, fraco positivo e forte positivo) denominados
Padrões Internacionais bovinos (PIBs) e de um Painel Internacional
de Avaliação (PIA), composto de 34 soros de bovinos com
comprovado estado de exposição/infecção, obtidos por condições
experimentais ou a campo. Valores de referência no sistema índice,
dados de reprodutibilidade e dados de estabilidade estão aqui
descritos.
De acordo com o bom resultado obtido os padrões foram
utilizados para avaliar o desempenho comparativo de kits
comerciais e testes “in house”, para avaliar a viabilidade de um
teste em desenvolvimento e em exercícios de proficiência na
utilização do sistema PNC do PANAFTOSA nos laboratórios nacionais
de referência da América do Sul, harmonizando o diagnóstico da
região.
x
As características dos padrões (PIBs e PIA) que incluem um
amplo espectro de reatividade, estabilidade satisfatória, o preparo
das amostras seguindo os padrões internacionais, e a capacidade de
apontar diferenças na sensibilidade relativa, tornam essas
ferramentas apropriadas, como padrões de referência
internacionais, para controlar se métodos equivalentes ao teste
índice são utilizados na vigilância epidemiológica e pelos parceiros
comerciais. Os padrões descritos nesse trabalho foram adotados
pela OIE como padrões de referência internacional para os testes
PNCs.
Palavras-chave: 1. Padrões de soros internacionais 2. Vírus da
Febre Aftosa 3.Testes para proteínas não-capsídais 4.Validação
5.Controle de Qualidade 6.Imunoensaios
Rio de Janeiro
Dezembro de 2008
xi
ABSTRACT
Renata de Mendonça Campos
Assembly, characterization and application of international serum
standards to evaluate the performance of immunoassays used in
active surveillance of Foot-and-Mouth disease
Orientadores: Ingrid Evelyn Bergmann e Moacyr Alcoforado Rebello
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Foot-and-Mouth disease (FMD) is a highly contagious disease
of cloven-hoofed animals that causes severe economic losses in
international trade of animals and their derived products.
The progress of the Hemispheric Plan for the FMD Eradication
in South America, based on the use of inactivated vaccines,
revealed the necessity for laboratory methodologies that
unequivocally detect the absence of viral circulation in
asymptomatic vaccinated populations. This need was reinforced by
the fact that FMD virus (FMDV) can establish subclinical as well as
persistent asymptomatic infections in some animals, irrespective of
their vaccination status. In this regard the Pan American Foot-and-
Mouth Disease Center (PANAFTOSA) developed a diagnostic system
based on the detection of antibodies against FMDV non-capsid
proteins (NCP), which are biological markers of virus circulation
irrespective of the animal vaccination status. The system consists of
an indirect ELISA as a screening test, that uses 3ABC recombinant
polyprotein, followed by a western blot assay as a confirmatory test
xii
for positive or suspect samples, using 5 non-capsid recombinant
proteins (3ABC, 3D, 2C, 3B and 3A). The NCP-PANAFTOSA system
was validated, recognized as the World Organization for Animal
Health (OIE) index test for NCP test, and produced as complete kits.
The extensive and successful application of the NCP
PANAFTOSA system supported the incorporation of the “FMD-free
country/zone where vaccination is practiced” concept into OIE code.
Likewise, it globally promoted the vaccination policy over the
stamping out policy, opening the way to the application of NCP tests
in other regions, and encouraging the development of new NCP
assays.
According to the OIE guidelines for assay validation,
international standards for calibration and evaluation were needed
to evaluate the comparative performance of in use kits and of
upcoming tests against the OIE index assay. To this end, this work
describes the selection, characterization and application of three
sera (negative, weak positive and strong positive) named Bovine
International Standard (BIS) and one International Evaluation Panel
(IEP) composed of 34 cattle sera from animals with unambiguous
exposed/infected status, obtained either under experimental
conditions or from the field. Reference values in the Index test and
their reproducibility in other laboratories, as well as data on stability
are reported here.
The standards were applied for the evaluation of comparative
performance of commercial kits and in-house tests, and to evaluate
the feasibility of tests under development. Moreover, they were
used in proficiency tests, which evaluate the NCP PANAFTOSA
system application in South American National Reference
laboratories, harmonizing regional diagnostic procedures.
The characteristics of the standards (BIS and IEP) comprising
a broad range of antibody reactivity, proper stability, an adequate
preparation following international guidelines, and the ability to
xiii
assess differences on relative sensitivity, make these tools suitable
as reference standard to evaluate if tests equivalent to the OIE
Index method are used in support of FMD control programs and by
trading partners, and also whether laboratories maintain their
standards of diagnostic performance. The Standards described here
were recognized as International reference standard to NCP tests by
the OIE.
Keywords: 1.International Serum standards 2.Foot-and-mouth
disease virus 3. Non-capsid protein tests 4.Validation 5.Quality
Control 6. Immunoassays
Rio de Janeiro
December 2008
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
Abs – Absorbância
AL – Área livre
ALV – Área livre com vacinação
BHK-21 – Células de rim de hamster recém nascido – “baby
hamster kidney” -clone 21
BSA – Albumina sérica bovina – “bovine serum albumin”
BEI – Etilenoamina binária
CA – Controle de Anticorpo
Cap – 7-metil guanosina trifosfato
CF – Controle de Fluorescência
CI – Controle do Instrumento
CN – Controle Negativo
CP1 – Controle Padrão 1
CP2 – Controle Padrão 2
CV – Coeficiente de Variação
DI50% - Dose infectante a 50%
DO – Densidade óptica
dpd – Dias após descarga
dpe – Dias após exposição
dpfoco – Dias após foco
dpi – Dias após infecção
E – Endêmico
E. coli – Escherichia coli
EITB – Ensaio de imunotransferência associado à enzima –
“Enzyme linked immunoelectrotransfer assay”
ELISA – Ensaio de imunoadsorção associado à enzima - “Enzyme
linked immunosorbent assay”
Exp Inf – Experimentalmente infectado
xv
Exp Vac – Experimentalmente vacinado
Exp Vac Des – Experimentalmente Vacinado e desafiado
F - Foco
FA – Febre aftosa
FN – Falso negativo
FP – Falso positivo
IDGA – Imunodifusão em gel de agarose
I-ELISA – ELISA indireto
IgG – Imunoglobulina G
IMF – Intensidade Média de Fluorescência
IBRS-2 - Células de rins de suíno
IRES – Sítio interno de entrada do ribossomo
LEF – Líquido Esofágico-faríngeo
LN – Laboratórios Nacionais
M – molar
mM - milimolar
MEM – Meio Eagle mínimo essencial – “Minimum Essential Médium
Eagle”
mg - Miligrama
ml - Mililitro
OIE - Organização Mundial de Saúde Animal – “World Organization
for Animal Health”
PA – Painel de Avaliação
PAL – Painel de área livre
PANAFTOSA – Centro Pan-Americano de Febre Aftosa
PEG – Polietileno Glicol
PHEFA – Plano Hemisférico para a Erradicação da Febre Aftosa
PIA – Painel Internacional de Avaliação
PIBs – Padrões internacionais Bovinos
PI – Porcentagem de inibição
PNCs – Proteínas não-capsidais
PP – Porcentagem de positividade
xvi
RNA – Ácido ribonucléico
RNAm – RNA mensageiro
RNase – Ribonuclease
Sn-A – Sensibilidade Analítica
Sn-D – Sensibilidade Diagnóstica
SP – Soro forte positivo
Sp-A – Especificidade Analítica
Sp-D – Especificidade Diagnóstica
T/C – Densidade óptica do soro teste / valor do ponto de corte
TPB – Caldo Triptose fosfato – “Tryptose phosphate broth”
U - Unidade
VC – Condições de vacinação a campo
VFA – Vírus da febre aftosa
VIAA – Antígeno associado à infecção viral – “Viral Infection
Associated Antigen”
VN – Verdadeiro negativo
VP – Verdadeiro positivo
VPg – Polipeptídeo genômico
ZC – Zona cinza
xvii
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 1 1.1. A Febre Aftosa ............................................................................................................. 1 1.2. O Vírus da Febre Aftosa............................................................................................... 2 1.2.1. Classificação e Estrutura.......................................................................................... 2 1.2.2. Organização do Genoma.......................................................................................... 3 1.2.3. Ciclo de Replicação ................................................................................................. 5 1.2.4. Variação Antigênica................................................................................................. 8 1.2.5. Infecção Persistente.................................................................................................. 9 1.3. Diagnóstico................................................................................................................. 10 1.4. Febre Aftosa nos países da América do Sul - Plano Hemisférico de Erradicação ..... 11 1.5. Vigilância Ativa - Soroepidemiologia........................................................................ 12 1.5.1. Desenvolvimento dos testes para a detecção de anticorpos contra PNCs.............. 12 1.5.2. Aplicação do sistema PNC do PANAFTOSA ....................................................... 15 1.6. Validação de provas de diagnóstico ........................................................................... 17 1.6.1. Validação de Testes Imunoenzimáticos ................................................................. 17 1.6.2. Validação do teste Índice da OIE........................................................................... 21 1.6.3. Preparo de padrões sorológicos.............................................................................. 22 2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 24 3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 25 3.1. Amostras de soros bovinos candidatos a padrões de referência ................................. 25 3.1.1. Soros Padrões Internacionais Bovinos (PIBs)........................................................ 25 3.1.2. Painel Internacional de Avaliação - Bovino (PIA) ................................................ 27 3.2. Soros bovinos adicionais ............................................................................................ 30 3.3. Inativação dos Soros Bovinos .................................................................................... 31 3.4. Testes imunoenzimáticos ........................................................................................... 32 3.4.1. Sistema PANAFTOSA .......................................................................................... 32 3.4.1.1. NCPanaftosa Teste de Triagem – Bovino (I-ELISA 3ABC)............................. 32 3.4.1.2. NCPanaftosa Prova Confirmatória – Bovino (EITB) ........................................ 32 3.4.2. Ceditest® FMDV-NS, Cedi Diagnosis B.V., Lelystad, Holanda............................ 34 3.4.3. CHEKIT*FMD-3ABC bo-ov, Dr Bommeli AG a subsidiaria do laboratório IDEXX, Inc. Liebefeld-Bern, Suíça ........................................................................................ 34 3.4.4. SVANOVIRTM FMDV 3ABC-Ab ELISA, Svanova, Upsala, Suécia.................... 35 3.4.5. UBI® FMDV NS ELISA, United Biomedical Inc., New York, USA.................... 36 3.4.6. ELISA de captura In House 3ABC do Instituto Zooprofilattico Sperimentalle della Lombardia e dell’Emilia Romagna (IZSLER), Brescia, Itália ................................................ 36 3.4.7. “Luminex Liquid array–Multiplex” ....................................................................... 37 3.5. Desenho das provas laboratoriais utilizadas............................................................... 38 3.5.1. Caracterização dos soros........................................................................................ 38 3.5.1.1. Determinação de valores de referência dos soros PIBs e PIA ........................... 38 3.5.1.2. Determinação da estabilidade dos soros PIBs e PIA ......................................... 39 3.5.1.3. Determinação dos valores dos soros PIBs e PIA em outros laboratórios .......... 39 3.5.2. Aplicação dos Padrões Internacionais PIBs e PIA................................................. 40 3.5.2.1. Avaliação comparativa de imunoensaios........................................................... 40 3.5.2.1.1. Testes em uso..................................................................................................... 40 3.5.2.1.2. Teste em desenvolvimento ................................................................................ 41 3.5.2.2. Aplicação em teste de proficiência .................................................................... 41 3.6. Estudos adicionais de comparação de provas ELISA ................................................ 43 4. RESULTADOS ............................................................................................................. 44 4.1. Inativação dos soros ................................................................................................... 44 4.2. Resultados de referência – Sistema PNC do Panaftosa (índice) ................................ 46
xviii
4.2.1. Soros Padrões Internacionais – PIBs: Características e valores de referência ....... 46 4.2.2. Painel Internacional de Avaliação – PIA: Características e valores de referência. 50 4.2.3. Avaliação de estabilidade dos soros PIBs e PIA.................................................... 54 4.2.4. Reprodutibilidade dos valores de referência em outros laboratórios (PIBs e PIA) 56 4.3. Aplicações dos Padrões Internacionais (PIBs e PIA)................................................. 58 4.3.1. Desempenho comparativo de imunoensaios .......................................................... 58 4.3.1.1. Testes em uso (ELISAs comerciais e “in house”) ............................................. 59 4.3.1.1.1. Sensibilidade analítica ....................................................................................... 59 4.3.1.1.2. Sensibilidade diagnóstica relativa...................................................................... 66 4.3.1.2. Teste em desenvolvimento (Luminex) .............................................................. 70 4.3.1.2.1. Luminex – “Liquid array” – desenvolvido como Multiplex.............................. 70 4.3.2. Teste de proficiência .............................................................................................. 73 4.4. Estudos Adicionais para a comparação de kits........................................................... 82 4.4.1. Resultados de provas comparativas com painéis adicionais .................................. 82 5. DISCUSSÃO ................................................................................................................. 87 6. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................... 95 7. ANEXO ........................................................................................................................ 100
xix
1. INTRODUÇÃO
1.1. A Febre Aftosa
A Febre Aftosa (FA) é uma enfermidade de origem viral, muito contagiosa, que
atinge animais bingulados domésticos e selvagens, dentre as espécies afetadas
destacam-se bovinos, ovinos, suínos, caprinos, lhamas, búfalos e veados (Pereira,
1981). A doença se caracteriza por um período febril inicial e o aparecimento de
lesões vesiculares nas mucosas oral e nasal, espaços interdigitais e epitélio dos
mamilos. Foi primeiramente relatada no século XVI por Fracastorius no Norte da
Itália (Bullock, 1927 citado por Pereira, 1981).
Embora a doença não apresente uma alta mortalidade em animais adultos, os
efeitos debilitantes que incluem a claudicação do animal, diminuição da alimentação
com a concomitante perda de peso e a redução da produção de leite resultam em uma
diminuição crescente de produtividade. A mortalidade pode ser alta em animais
jovens, quando o vírus pode apresentar tropismo para o coração. Dessa forma, a
doença se destaca pelas implicações sócio-econômicas originadas no mercado
internacional de animais e seus derivados. Conseqüentemente, é a doença animal com
maior quantidade de recursos, alocados em todo o mundo, para combate e prevenção.
Com referência à ocorrência da doença, historicamente, ela se apresentava de
forma global com surtos registrados em todas as regiões que apresentavam rebanhos,
com exceção da Nova Zelândia. Na América do Norte a doença ingressou no fim do
século XIX e foi controlada em 1929 nos EUA, e na década de 50 no Canadá e
México através do sacrifício de animais infectados e seus contatos imediatos
susceptíveis (“stamping out”). Nessa mesma década a primeira vacina contra FA foi
disponibilizada e para a erradicação da doença na América do Sul a vacinação em
massa dos rebanhos tem sido a ferramenta de escolha.
A Organização Mundial para Saúde Animal (OIE) tem a responsabilidade de
produzir uma lista dos países membros ou regiões que se encontram livres de certas
doenças. Devido a grande importância econômica, a FA foi a primeira a ter uma lista
contendo os status dos países e/ou regiões. As regiões eram tradicionalmente
divididas em livres da doença sem vacinação e regiões infectadas. Nos últimos anos,
devido ao grande avanço obtido com a vacinação e o desenvolvimento de ferramentas
de diagnóstico capazes de identificar circulação viral em rebanhos vacinados,
1
realizado na América do Sul, foi aceita pela OIE uma nova categoria, áreas livres da
doença com vacinação.
Dessa forma, os países previamente afetados, que logrem controlar a doença por
meio de vacinação e demonstrar ausência de circulação viral nos rebanhos, podem
solicitar a alteração de seus status, facilitando assim sua participação no mercado
internacional. Na Figura 1 estão relacionadas os surtos ou focos (ocorrência de um ou
mais casos da doença ou infecção em um rebanho) de FA notificados a OIE em 2008.
Resolvido Contínuo
Figura 1: Distribuição geográfica dos surtos de FA notificados a OIE em 2008. WAHID Interface em http://www.oie.int acessado em 01/10/2008.
1.2. O Vírus da Febre Aftosa
1.2.1. Classificação e Estrutura
O vírus da FA (VFA) pertence ao gênero Aphthovirus, dentro da família
Picornaviridae. A classificação taxonômica desta família inclui oito gêneros:
Aphthovirus (VFA e da renite eqüina), Cardiovirus (vírus da encefelomiocardite,
Mengovirus, vírus de Theiler, vírus de Maus Elberfeld, vírus Columbia, etc.);
Hepatovirus (vírus da hepatite A); Enterovirus, que agrupa os vírus da poliomielite,
vírus de Coxsackie A e B, Ecovirus e os Rhinovirus; Parechovirus; Erbovirus;
Kobuvirus e o Teschovirus.
2
A partícula viral é constituída por uma molécula de RNA fita simples (não
segmentada) de polaridade positiva envolta por um capsídeo protéico de simetria
icosaédrica medindo aproximadamente 22 nm de diâmetro (Vazquez et al., 1978). O
vírus não apresenta envoltório lipoprotéico. O capsídeo protéico é constituído por 60
cópias de cada uma das quatro proteínas: VP4, VP2, VP3 e VP1 (Rueckert &
Wimmer, 1984). Estas 60 cópias estão organizadas em 12 subunidades pentaméricas,
cujo coeficiente de sedimentação é 12 S, contendo cinco cópias de cada uma das
proteínas VP1, VP2 e VP3 (Figura 2) que se encontram parcialmente expostas no
capsídeo e mais cinco cópias de VP4 localizadas mais internamente em associação
com o genoma. Newman & Brown em 1997 relataram que, além da cópia da proteína
3B (VPg) covalentemente ligada ao RNA, traços de outras proteínas também podem
ser encontradas em partículas virais purificadas.
Figura 2: Diagrama do capsídeo icosaédrico dos picornavírus, onde a área contornada representa o pentâmero 12 S (adaptado de Luo, Rossman & Palmember, 1988).
1.2.2. Organização do Genoma
O material genômico do VFA é composto de um RNA fita simples com
polaridade positiva apresentando aproximadamente 8200 nucleotídeos. Esse RNA é
traduzido em uma única poliproteína, a qual sofre clivagens pós traducionais e gera os
precursores, as proteínas do capsídeo e as proteínas não capsidais (PNCs) maduras
(Grubman et al.,1984; Robertson et al.,1985; Rueckert & Wimmer 1984) (Figura 3).
3
Clivagem
als odutos
Figura 3: Representação do RNA viral e da poliproteína por ele codificada. Na região 5`não codificante “untranslated region”(5`UTR) encontram-se representadas as seguintes estruturas: VPg (3B) – proteína viral associada ao genoma; S – fragmento S; PKs – Falsa junção “pseudoknots”; cre – elemento replicativo agindo em cis “cis-acting replicative element” e IRES – sítio interno de entrada ao ribossomo “internal ribosome entry site”. Na região aberta de leitura encontram-se representadas as proteínas virais (VP) nomeadas de acordo a nomenclatura de Rueckert & Wimmer, 1984: Lpro – protease L; proteínas do capsídeo codificadas pela região P1 (VP4; VP2; VP3 e VP1); proteínas não capsidais codificadas pela região P2 (2A, 2B e 2C) e proteínas não capsidais codificadas pela região P3 (3B; 3Cpro – protease 3C; 3Dpol – polimerase 3D). Na região 3` não codificante (3`UTR) encontra-se a região poli-A (poly-A). AUG – códon de iniciação. As figuras geométricas indicam os sítios de clivagem das proteases: ▲ 3Cpro; □ 2A; ■ desconhecida e Lpro (adaptado de Grubman & Baxt , 2004).
Dentro da região codificante do RNA genômico, na porção 5’, se localiza a
região L, que codifica o componente N-terminal da poliproteína, e apresenta dois
códons iniciadores AUG que resultam na tradução de proteínas L (L e L’). Seguida à
região L está a região P1 que codifica as quatro proteínas do capsídeo do vírus (VP4,
VP2, VP3 e VP1). Após a região P1 está a região P2, que codifica três PNCs (2A, 2B,
e 2C), e a região P3, que codifica a proteína 3A, três cópias da VPg (3B), 3Cpro
(protease) e 3Dpol (RNA polimerase RNA dependente).
Além das regiões descritas, o RNA apresenta duas regiões não codificantes
situadas em ambas extremidades (3´e 5`) que flanqueam a região codificante. A
Pacidopr
Proteínas Capsidais Proteínas não capsidais
Clivagem
als odutos
Pacidopr
Proteínas Capsidais Proteínas não capsidais
4
região 5’ não codificante contém 1300 bases e pode ser dividida em 5 elementos
funcionais que atuam na tradução e replicação do RNA viral. Na extremidade 3` do
RNA se encontra uma região poli-A com tamanho variável entre 40 e 100
nucleotídeos (Fellner, 1979). Essa seqüência poli-A é sintetizada a partir do próprio
genoma viral e não adicionada a extremidade 3` como ocorre com os RNAm
transcritos por vírus RNA de polaridade negativa. Essas seqüências não codificantes
estão relacionadas com a regulação da iniciação da tradução e da replicação viral,
respectivamente, apresentando estruturas primárias e secundárias altamente
conservadas, como, por exemplo, o sítio interno de entrada do ribossomo (IRES)
(Rueckert, 1996). Esta região, contendo aproximadamente 450 nucleotídeos está
presente na extremidade não codificante 5` e associada ao início da síntese de
proteínas (Belsham & Sonenberg, 1996; Poyry, Hentze & Jackson, 2001).
1.2.3. Ciclo de Replicação
O VFA, como os demais picornavirus, apresenta um ciclo replicativo de curta
duração e citoplasmático. Em cultura de células pode ser observado efeito citopático
nas células infectadas. Alterações bioquímicas incluindo a inibição da tradução e
transcrição do hospedeiro também são observadas (Rueckert, 1996).
A primeira etapa do ciclo replicativo é o processo de adsorção. A adsorção é
mediada pela proteína VP1, sendo o tripeptídeo composto pelos resíduos de Arg-Gly-
Asp, nas posições 145, 146 e 147, responsável pela ligação vírus-célula. Esse
tripeptídeo em forma de alça é altamente conservado nos 7 sorotipos virais (Baxt &
Becker, 1990). Também há evidencias da participação dos aminoácidos situados nas
posições 203-213 no processo de interação da VP1 com os receptores celulares.
Os receptores celulares descritos para o VFA são duas famílias de integrinas,
αvβ3 (Beristein et al., 1995) e a αvβ6 (Jackson et al., 2000), e proteoglicanas de
sulfato de heparana (Rueckert, 1996).
Uma vez a partícula viral adsorvida a membrana da célula, ocorrem os
processos de penetração e desnudamento. A partícula viral é internalizada por
processo endocítico, há formação de endossomas, o viron (140S) é desagregado em
subunidades pentaméricas (12S) e o RNA viral é liberado. (Baxt, 1987).
5
Quando o RNA é liberado no citoplasma da célula, a ligação fosfodiéster entre o
fosfato 5`-terminal do RNA viral e o resíduo de tirosina na VPg é clivada por uma
enzima celular, o que torna o RNA apto para a tradução (Ambros, Peterson &
Baltimore, 1978).
Diferentemente da maioria dos RNAs mensageiros do hospedeiro o RNAm viral
não contém Cap e a síntese de proteína se inicia internamente na IRES pelo
mecanismo cap-independente.
O polipepitídeo de 250 KDa traduzido necessita de processamento pós-
traducional para a geração das proteínas funcionais. Durante a síntese desse
polipepitídeo ocorrem às primeiras clivagens, originando as quatro proteínas
precursoras L, P1, P2 e P3. Posteriormente, as proteínas precursoras sofrem a ação de
proteases virais e dão origem às proteínas do capsídeo e às não capsidais.
O precursor L apresenta dois produtos finais denominados (L / L´) (Cao et al.,
1995). As formas da proteína L do VFA são proteases com múltiplas atividades: uma
autolítica, responsável pela maturação das proteínas capisidais adjacentes; e a outra
que parece ajudar na inibição da tradução celular dependente de Cap, sem, entretanto,
afetar a tradução do RNAm viral “não capeado” (Medina et al., 1993).
As quatro proteínas do capsídeo são originadas após o processamento do
polipepitídeo P1 (1ABCD-2A). A ordem de tradução dessas proteínas NH2-VP4-
VP2-VP3-VP1-COOH (Sangar et al., 1980) propicia a associação das mesmas
favorecendo, posteriormente, a formação das unidades similares que fazem parte do
capsídeo viral (Grubman et al., 1984).Também encontra-se nesse precursor um
pequeno polipeptídeo chamado de proteína 2A, constituído de apenas 16 aminoácidos
que, nos enterovírus e rinovírus, atua como uma protease semelhante à tripsina, cuja
clivagem é pré-requisito para o processamento proteolítico da região precursora do
capsídeo.
No precursor P2 se incluem as proteínas funcionais 2B e 2C. A função das
proteínas codificadas pelas regiões 2B e 2C é pouco conhecida. A proteína e seu
precursor 2BC estão ambos contidos exclusivamente no complexo de replicação
dentro das vesículas induzidas pelo vírus (Bienz et al., 1990), contudo, sabe-se que
mutações dessas regiões levam a uma forte queda na síntese de RNA viral (revisado
por Porter, 1993).
Em relação ao precursor P3 (3ABCD) observa-se a presença da enzima 3D na
extremidade carboxi-terminal que é uma RNA polimerase dependente de RNA
6
(Newman & Brown, 1997). Essa proteína também possui as atividades de RNA
helicase e de nuclease (Newman et al., 1994). A proteína 3B, também conhecida
como VPg, está presente em três cópias nos Aftovírus e tem um importante papel na
iniciação da síntese do RNA viral de sentido positivo, funcionando como um “primer”
(iniciador) para que a polimerase inicie a replicação (Agol, Paul & Wimmer, 1999). O
precursor 3AB da proteína 3A, por ser muito hidrofóbico, parece estar ancorado às
membranas vesiculares dos complexos replicativos, servindo como doador de 3B
(VPg) (Porter, 1993). A proteína 3C é a protease responsável pela maioria das
clivagens necessárias à maturação da proteína precursora. A proteólise mediada pela
3C ocorre em uma complexa cascata de clivagens cis e trans em sítios específicos. No
VFA essa proteína parece induzir a clivagem das proteínas básicas histonas H3, o que
contribui com a severa inibição da transcrição de RNA celular e fatores celulares de
iniciação da tradução (eF4A e eIF4F (p220). Desta forma, as células infectadas
apresentam uma grande inibição na síntese de suas próprias proteínas (Belsham,
Mcnermey & Ross-Smith, 2000).
A replicação do genoma viral ocorre através de um intermediário replicativo,
um RNA de polaridade (-). Essa molécula é utilizada como molde para a síntese de
novas fitas de RNA de polaridade (+). As novas fitas positivas poderão ser traduzidas,
encapsidadas (formando uma nova partícula viral) ou servirão de molde para novas
fitas de polaridade (-) (Baltimore & Girard, 1966).
A montagem das partículas virais ocorre quando a proteína precursora do
capsídeo (P1) é clivada formando os protômeros imaturos compostos por três
proteínas agregadas de forma compacta (VP0, VP1, VP3). Esse processo é regulado
no inicío da infecção pela baixa concentração do precursor (P1) e da enzima
responsável pela clivagem (3C ou 3CD). Na etapa tardia do ciclo replicativo, ocorre
um aumento na concentração do precursor e da enzima, disponibilizando as proteínas
para montagem dos pentâmeros, os quais empacotam as fitas positivas de RNA
associadas a VPg para formar os provírus (revisado por Olascoaga et al.,1999).
O empacotamento do RNA viral é um processo específico, pois, apenas as fitas
de polaridade positiva associadas a VPg são empacotadas. São excluídas as fitas que
servem como mensageiro, fitas negativas e qualquer outro RNA celular. Existem
estudos que atribuem esse processo de sinalização à polimerase viral, ela
permaneceria ligada às fitas positivas nascentes marcando-as para o processo de
empacotamento (Newman et al., 1994).
7
Finalmente ocorre a clivagem das cadeias de VP0, formando as quatro
subunidades maduras características dos picornavírus (VP4, VP2, VP3 e VP1). Com
as clivagens o provirus imaturo se torna infeccioso. As partículas virais maduras
formam cristais nas células infectadas e posteriormente são liberadas por
desintegração das mesmas, uma vez que a síntese de macromoléculas das células
hospedeiras foi inibida.
1.2.4. Variação Antigênica
O VFA apresenta 7 sorotipos com propriedades antigênicas e imunologicas
diferentes e, dentro deles múltiplos subtipos. Os sorotipos não estão uniformemente
distribuídos no mundo. A África apresenta ocorrência de 6 dos 7 sorotipos (O, A, C,
SAT-1, SAT-2 e SAT-3), enquanto a Ásia apresenta 4 (O, A, C, Ásia-1) e a América
do Sul 3 (O, A e C).
Esta variação antigênica pode ser facilmente explicada considerando que o
genoma do VFA é molécula RNA, que como tal apresenta uma alta taxa de mutação
durante o processo de replicação. Esta heterogeneidade está associada à ausência de
um sistema de correção da RNA polimerase que gera, um extenso, polimorfismo
genético da população de vírus na natureza (Meyer et al., 1994, Domingo et al.,
1985).
A variabilidade na população do VFA é manifestada quando mutações levam a
alterações de códons resultando na mudança de fenótipos. A maioria dessas mutações
ocorre na região que codifica para as proteínas do capsídeo, levando a uma variação
antigênica. Tem sido observado que a infecção prévia ou a vacinação com um dado
sorotipo não confere proteção contra outros sorotipos e pode até falhar na proteção
total de outros subtipos do mesmo sorotipo (Bergmann, Malirat & Falczuk, 2005). As
mutações também ocorrem nas regiões que codificam para as PNCs, entretanto essas
são menos toleradas já que essas proteínas estão envolvidas no processo de replicação
(Grubman & Baxt, 2004).
8
1.2.5. Infecção Persistente
Após a fase aguda da infecção pelo VFA em ruminantes, alguns animais
podem apresentar uma longa infecção persistente assintomática. O tempo de duração
da infecção persistente depende da espécie hospedeira e do indivíduo. O búfalo
Africano (Syncerus caffer) pode apresentar infecção persistente por mais de 5 anos,
bovinos por mais de 3 anos, ovinos por mais de 9 meses e caprinos e ruminantes
selvagens por curto período de tempo. Além das características do hospedeiro,
também devem ser considerados a cepa e o sorotipo do vírus (Sutmöller & Olascoaga,
2002).
Desta forma, um animal é considerado persistentemente infectado ou portador
quando é possível recolher vírus infeccioso após 28 dias da infecção (Sutmöller,
McVicar & Cottral, 1968, Salt, 1993). O número de animais portadores na população
depende de vários fatores tais como: a espécie, a incidência de infecção e o estado
imune do rebanho (vacinado ou não vacinado).
A identificação de um hospedeiro assintomático pode ser feita pelo isolamento
de vírus, em cultura de células e/ou mediante detecção de RNA viral. O isolamento do
vírus é feito a partir do material de células superficiais e/ou muco da faringe, obtidos
através de raspagem. (Sutmöller et al., 2003; Moonen & Schrijver, 2000). A
quantidade de vírus presente no tecido da faringe de um animal persistentemente
infectado pode variar e o isolamento das partículas virais depende de vários fatores,
como a sensibilidade do sistema de cultura de células utilizado, o estado de imunidade
do animal, o cuidado com a amostra. A recuperação do vírus a partir do líquido
esofágico-faríngeo (LEF) não é contínua durante todo o estado de persistência no
animal (Bergmann et al., 1993).
O papel dos portadores na disseminação da doença a campo ainda é
controverso. Apesar das evidências circunstanciais de transmissão de vírus de búfalos
Africanos para bovinos domésticos, não há evidências que comprovem a campo ou
experimentalmente, em espécies da América do Sul, a capacidade de transmissão dos
portadores bovinos ou ovinos a animais susceptíveis. Igualmente, para avaliação do
risco de transmissão também deve ser considerada a disseminação na excreção de
vírus em animais vacinados. (Bergmann, Malirat & Falczuk, 2005). Mesmo com o
acima exposto, a idéia de que os animais portadores representam um risco de
9
transmissão da doença parece persistir, em alguns grupos, e permanece como base
para a regulamentação do comércio de animais e seus derivados (Alexandersen,
Zhang & Donaldson, 2002; Bergmann, Malirat & Falczuk, 2005).
1.3. Diagnóstico
O diagnóstico da FA se baseia em observações clínicas, epidemiológicas e
laboratoriais. As mesmas devem ser rápidas e confiáveis, possibilitando a
implementação de medidas para o controle da disseminação da doença.
O diagnóstico clínico da enfermidade deve ser confirmado pelo diagnóstico
laboratorial, pois a sintomatologia pode ser confundida com outras enfermidades
vesiculares tais como Doença Vesicular dos Suínos, a Estomatite Vesicular e o
Exantema Vesicular dos Suínos, entre outras. Estas doenças têm em comum a
propriedade de provocar a formação de vesículas típicas com coloração
esbranquiçada, contendo um líquido incolor ou ligeiramente sanguinolento. Desta
forma, o diagnóstico clínico necessita de provas diferenciais (OIE 2008a).
O diagnóstico laboratorial é feito, preferencialmente, pela detecção do vírus ou
de seus antígenos em tecidos ou fluidos. Também é possível realizar o diagnóstico
através da detecção de anticorpos específicos contra o vírus sempre que relacionado
com um episódio vesicular. (OIE 2008a)
A amostra clínica empregada para isolamento do vírus é preferencialmente
obtida a partir das lesões vesiculares. Quando as lesões já estão cicatrizadas, o vírus
pode ser recuperado do LEF. São utilizados para o isolamento cultivo celular de rim
de filhote de hamster (BHK-21) e rim de porco (IBRS-2). A tipificação do sorotipo
envolvido é realizada pelo teste de ELISA Sanduíche Indireto (SI) (Alonso et al.,
1992) e, alternativamente, pela fixação de complemento a 50 % (Alonso, 1986). De
forma semelhante, o RNA viral pode ser extraído diretamente do tecido infectado ou
após as passagens celulares e a caracterização do vírus realizada por seqüenciamento
do genoma. A comparação do genoma do vírus envolvido com os bancos genéticos
permite inferir uma hipótese de origem.
10
1.4. Febre Aftosa nos países da América do Sul - Plano Hemisférico de Erradicação
O primeiro registro de FA na América do Sul ocorreu em Buenos Aires,
Argentina, por volta de 1870 como resultado da importação de animais vivos da
Europa. Posteriormente, a doença foi registrada na Região Central do Chile, no
Uruguai e nos estados da Região Sul do Brasil. Em seguida, a FA se espalhou para os
estados do Centro Oeste do Brasil, e durante a primeira metade do século 20 foi
registrada no Peru, Bolívia e Paraguai, atingindo a Venezuela e Colômbia em 1950 e
o Equador em 1961. (Rweyemamu, 2008).
Em 1988 os países da América do Sul assinaram o Plano Hemisférico de
Erradicação da Febre Aftosa (PHEFA). Esse plano tem como objetivo:
a) Erradicar a Febre Aftosa,
b) Prevenir sua introdução nas áreas livres.
A estratégia do PHEFA consiste, dentre outras medidas, na resposta imediata a
surtos, no controle da movimentação dos animais de áreas afetadas para áreas livres e
na vacinação em massa de animais susceptíveis. Atualmente, a maioria das vacinas é
formulada com antígenos produzidos em culturas de células em suspensão. Os
antígenos são quimicamente inativados com inativantes de primeira ordem
(Bahnemann, 1975), tais como, etilenoamina binária (BEI), concentrados com
polietilenoglicol (PEG) e parcialmente purificados. Desta forma, são utilizadas
principalmente proteínas do capsídeo do vírus na vacina.
Desde 1995 as campanhas de vacinação atingem uma alta cobertura do rebanho
do continente. Essas campanhas, aliadas às demais medidas de controle, têm sido
responsáveis pela diminuição do número de surtos relatados por ano em toda a
América do Sul. Em 1990 foram relatados 950 episódios e esse número foi reduzido
para 130 em 1999. (Melo & Lopez, 2002). Os grandes avanços, principalmente no
Cone Sul, levaram no final da década de 90 a suspensão da utilização da vacina na
Argentina, Uruguai e região sul do Brasil. Contudo, a re-introdução da doença nessa
região em 2001 gerou uma enorme perda econômica e levou aos líderes dos
programas regionais a uma re-avaliação das estratégias empregadas. A região sul do
continente voltou a controlar a doença e a vacinação continua sendo utilizada. Desde
então, episódios isolados foram relatados e rapidamente controlados.
11
A região andina também tem apresentado avanços no controle da doença,
principalmente na Colômbia e no Peru. Atualmente, as áreas de risco se encontram na
Bolívia, no Equador e na Venezuela, sendo os dois últimos países de maior risco, pois
ainda apresentam deficiências nos serviços veterinários.
A situação epidemiológica da América do Sul está representada na Figura 04.
s
on
e
Source: OI
EpidemioloPANAFTOS
Livre sem vacinação
Livre com vacinação
Não livreZona de alta vigilância
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Source: OI
EpidemioloPANAFTOS
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Não livreZona de alta vigilância
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Focos relatados por ano
País 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Argentina 1 0 0 0 1 0 0
Figura 04 – A tabela indica o número de focos relatados por ano por país a OIE. O mapa indica a situação epidemiológica da América do Sul considerada pela OIE em maio de 2008 (Fonte:OIE).
Na etapa final do PHEFA, os esforços estão direcionados para o controle da
doença no Equador e na Venezuela e um programa de trabalho conjunto nas fronteiras
entre Argentina/Bolívia/Brasil/Paraguai (zona de alta vigilância), para evitar a
recorrência da doença no Cone Sul.
1.5. Vigilância Ativa - Soroepidemiologia
1.5.1. Desenvolvimento dos testes para a detecção de anticorpos contra PNCs
Na década de 60, Cowan e Graves (1966) descreveram um complexo empírico
de proteínas obtido de células infectadas com VFA o qual foi denominado VIAA
Bolívia
Equador
Venezuela
9 5 0 0 0 15 0 Brasil 0 0 5 34 0 0 0 Chile LIVRE
Colômbia 8 2 2 1 0 0 7 108 42 42 22 15 7 7
Guiana LIVRE
Peru 0 20 20 0 0 0 0 Paraguai 1 1 0 0 0 0 0 Uruguai 0 0 0 0 0 0 0
9 34 34 13 36 43 29
s
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Livre sem vacinação
Livre com vacinação
Não livreZona de alta vigilância
Livre sem vacinação
Livre com vacinação
Não livreZona de alta vigilância
Livre sem vacinação
Livre com vacinação
Não livreZona de alta vigilância
Focos relatados por ano
País 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Argentina 1 0 0 0 1 0 0 9 5 0 0 0 15 0
Brasil 0 0 5 34 0 0 0 Chile LIVRE
Colômbia 8 2 2 1 0 0 7 108 42 42 22 15 7 7
Guiana LIVRE
Peru 0 20 20 0 0 0 0 Paraguai 1 1 0 0 0 0 0 Uruguai 0 0 0 0 0 0 0
9 34 34 13 36 43 29
Bolívia
Equador
Venezuela
12
(antígeno associado à infecção viral, do inglês “Viral Infection Associated Antigen”).
Em 1970 foi descrita pela primeira vez por McVicar e Stumöller (1970) a técnica de
imunodifusão em gel de agar (IDGA) para a detecção de anticorpos contra o VIAA.
Essa técnica foi inicialmente utilizada para verificar se um rebanho havia entrado em
contato com o vírus. Com o aumento da aplicação dessa metodologia em estudos de
vigilância ficou evidente a limitação causada pela baixa sensibilidade da mesma.
Logo, com o objetivo de aumentar a sensibilidade, Alonso e colaboradores, em 1990
desenvolveram um ELISA em fase líquida, utilizando o VIAA como antígeno.
Contudo, apesar do aumento de sensibilidade, também foi verificado nos animais não
infectados vacinados e revacinados com vacinas contendo antígenos parcialmente
purificados, um aumento no número de positivos. Além do já exposto, tanto a técnica
de ELISA quanto o IDGA utilizando o VIAA apresentaram uma reprodutibilidade
limitada. A falta de reprodutibilidade parece estar associada tanto às características
intrínsecas da metodologia de IDGA quanto à natureza semi-purificada da preparação
do VIAA pois, o mesmo é parcialmente purificado de suspensões virais replicadas em
células BHK, e pode variar muito entre lotes. Para diminuir uma das limitações acima
mencionadas foi proposto a substituição na metodologia de IDGA com antígeno
VIAA pela proteína 3D recombinante descrita por Neitzert e colaboradores (1991), os
quais descreveram essa proteína como principal composto do complexo VIAA. Os
resultados com o antígeno 3D recombinante demonstraram maior consistência, uma
vez que os lotes são mais homogêneos, além da mesma especificidade e da mesma
sensibilidade que o antígeno VIAA. Contudo, a sensibilidade alcançada com a
metodologia de IDGA não foi suficiente para atender as necessidades de uma
vigilância ativa. (Bergmann, et al 1998).
Com a implementação do PHEFA e o progresso conseguido com relação à
diminuição dos casos clínicos da doença, e considerando a característica do VFA de
estabelecer infecções persistentes, ficou ainda mais evidente a necessidade de contar
com um teste sorológico de fácil aplicação, altamente sensível e específico que
permitisse avaliar a ausência de circulação viral. Desta forma, PANAFTOSA
desenvolveu o ensaio imunoenzimático de eletrotransferência (EITB) ou “Western
blot” para a detecção de anticorpos contra as PNCs. Este ensaio utiliza como antígeno
de captura 5 antígenos do VFA, 3A, 3B, 2C e 3ABC, obtidos por técnicas de DNA
recombinante e altamente purificados.
13
A técnica de EITB demonstrou uma maior sensibilidade quando comparado
com a técnica de IDGA, permitindo detectar como positivos soros coletados durante
estágios mais avançados da infecção. Além da alta sensibilidade também foi
observada alta especificidade, pois, o ensaio de EITB foi capaz de eliminar um grande
número de soros com reatividade positiva induzida pela vacina, na técnica de IDGA.
Essa reatividade positiva é ocasionada por soros de bovinos vacinados com vacinas
não corretamente purificadas (Bergmann, et al., 1993).
O avanço das áreas livres no continente gerou um aumento expressivo das
amostragens em apoio à demonstração da ausência de atividade viral com
conseqüente aumento no número de soros a serem testados. Isso incentivou a busca de
uma metodologia que compatibilizasse custo e possibilitasse a análise de um elevado
número de amostras, sem perder a sensibilidade e especificidade alcançadas com o
teste de EITB. Nesse sentido, os antígenos não capsidais recombinantes (3A, 3B, 2C,
3D e 3ABC), foram avaliados em um ensaio imunoenzimático em fase sólida no
formato indireto (I-ELISA). Dos 5 ELISAs testados, os que utilizaram os antígenos
3A, 3B ou 3ABC apresentaram melhor desempenho para a detecção de anticorpos em
animais nas etapas tardias de uma infecção persistente. Com base nesses resultados e
na experiência com EITB foi selecionada a poliproteína 3ABC para a padronização de
um ELISA indireto como prova de triagem (Bergmann, et al., 2000).
Para a avaliação de circulação viral em áreas com vacinação sistemática foi
proposto como uma abordagem adequada, rápida e precisa para levantamento
soroepidemiológico o uso de um sistema ou algoritmo de provas baseado na detecção
de anticorpos PNC denominado Sistema PNC PANAFTOSA que consiste no I-
ELISA 3ABC, atualmente denominado NCPanaftosa Teste de Triagem, como uma
prova de triagem, seguido da confirmação das amostras suspeitas ou reativas pelo
método de EITB, atualmente denominada, NCPanaftosa Teste Confirmatório.
As características de desempenho do I-ELISA 3ABC aliadas a facilidade,
simplicidade, rapidez de execução e baixo custo permitem a análise de um grande
número de amostras tornando-o um perfeito método de triagem. Além dessa
vantagem, o teste de ELISA permite a análise da população através de perfis,
possibilitando o acompanhamento de reatividade no espaço e no tempo. E o teste de
EITB se tornou a prova confirmatória. Essa estratégia permite trabalhar em condições
de alta sensibilidade sem perda de especificidade (Malirat et al., 1998; Bergmann et
al., 2000).
14
Igualmente, o sistema PNC pode ser utilizado para a confirmação da doença em
áreas livres sem vacinação. Por ser uma prova sorotipo independente, é mais fácil de
ser utilizada que as provas baseadas na detecção de anticorpos contra as proteínas
capsidais, quando a origem do vírus é desconhecida.
O sistema PNC do PANAFTOSA foi validado e serviu como base para a
implementação da guia da OIE de validação de ensaios indiretos. Todos os
parâmetros solicitados para validação estão descritos no ponto 1.6.1 dessa seção.
1.5.2. Aplicação do sistema PNC do PANAFTOSA
Na década de 90, a OIE solicitava para a aprovação de áreas livres de FA ode se
aplica a vacinação um dossiê incluindo os testes sorológicos efetuados em apoio à
demonstração de ausência de infecção viral, para o qual o sistema PNC do
PANAFTOSA foi amplamente utilizado. È relevante mencionar que a identificação
com precisão de animais infectados que eventualmente possam permanecer em um
rebanho, provavelmente em baixo número, em regiões com programas avançados de
erradicação, onde se espera uma baixa prevalência, apresenta limitações, sendo
necessário a existência de testes imunoenzimáticos perfeitos. Uma das limitações que
podemos mencionar é a possibilidade de encontrar anticorpos contra as PNCs em
animais até 12 meses após o último isolamento do vírus a partir do LEF, o que não
permite distinguir infecção passada de infecção recente. Por outro lado, resultados
negativos podem ser obtidos em animais em fase de soroconversão, a qual pode ser
retardada em animais vacinados e expostos. Para a avaliação confiável da atividade
viral remanescente são necessários desenhos estatísticos apropriados e grandes
amostragens.
Dessa forma, a realização de estudos populacionais à procura de animais
infectados (portadores) não ignorar a possibilidade de obter resultados positivos e
negativos relacionados aos pontos acima descritos; e, em alguns casos, a busca por
esses animais pode precisar da amostragem de um número considerado, podendo até
necessitar a análise de todos os animais, dependendo do tamanho do rebanho.
De qualquer forma e caso haja risco epidemiológico em termos de transmissão
oriundo de possíveis animais portadores, a circulação viral no rebanho pode ser
detectada pela análise populacional. Essa análise deve apresentar um desenho
15
apropriado, contemplando a investigação de soroconversão em animais jovens, os
quais são mais susceptíveis (Bergmann, Malirat & Neitzert, 2005).
Nesse contexto, a complexidade de identificar e comprovar os animais
verdadeiramente infectados, associado ao fato desses animais portadores só
apresentarem importância epidemiológica se forem capazes de transmitir a doença,
promoveu uma mudança de conceitos, dentro das guias da OIE voltada à busca de
circulação viral ao invés de infecção.
O uso em grande escala com a análise de mais de 1 milhão de soros, pelo
sistema PNC do PANAFTOSA, durante pelo menos 4 anos, nos permitiu comprovar
que a ausência de soroconversão em animais jovens reflete a ausência de circulação
viral. (Bergmann et al., 1996; Bergmann et al., 1998).
A experiência obtida com o uso do sistema I-ELISA 3ABC / EITB na América
do Sul permitiu não só a identificação das áreas de risco como também um melhor
entendimento sobre o papel dos portadores na população sistematicamente vacinada.
Os dados obtidos apóiam a eficácia da vacinação sistemática para conter a circulação
viral após um episódio. Quando milhões de bovinos foram sistematicamente
vacinados em várias regiões da América do Sul, a FA foi controlada nessas áreas sem
a necessidade do sacrifício de animais. Um baixo número de animais portadores pode
persistir, mas, esses não são capazes de interromper o processo de erradicação da
doença. Os resultados da sorovigilância reforçaram a manutenção do status de áreas
livres com vacinação e proveram alternativas para evitar o sacrifício sanitário frente à
emergência “stamping out policy”.
Considerando todas as questões anteriormente mencionadas, a OIE na Sessão
Geral de Maio de 2004, alterou o requerimento para solicitação de reconhecimento de
áreas/países livres da doença com vacinação. Ao invés de solicitar às autoridades a
demonstração de ausência de infecção, passou a solicitar a demonstração de ausência
de circulação viral.
O cenário apresentado incentivou o desenvolvimento de novos testes tanto “in
house” (De Diego et al., 1997) quanto comerciais (Shen et al., 1999; Sorensen et al.,
1998), para a avaliação de atividade viral residual, o que desencadeou a aplicação
mundial dos mesmos para a detecção de anticorpos contra as PNCs. A experiência da
América do Sul aliada à disponibilidade de novos testes apoiou a elaboração de
normas a favor da vacinação para a vida “vaccination to live” em oposição à política
de sacrifício (OIE 2007).
16
O avanço na utilização dos testes PNCs, principalmente no formato de kits
completos e o impacto dos mesmos na liberação de áreas, gerou a necessidade
internacional de avaliação da equivalência do desempenho dos kits comercialmente
disponíveis, e principalmente, a equivalência de desempenho dos mesmos frente ao
teste índice. Para a avaliação dessa problemática extensos exercícios internacionais,
com um número elevado de amostras foram realizados. Nesse contexto, o teste índice
apresenta a função de construir e caracterizar padrões sorológicos capazes de avaliar a
equivalência de desempenho de provas, gerando indicadores para respaldar as etapas
de avaliação e manutenção dos critérios de desempenho no processo de validação.
1.6. Validação de provas de diagnóstico
As discussões sobre a relevância da aplicação dos conceitos de qualidade têm
avançado em todo o mundo e ocupado cada vez mais espaço nos fóruns
internacionais.
Especificamente na área de saúde animal a OIE publicou em 2008 uma guia de
gerenciamento de qualidade para orientar aos laboratórios veterinários que realizam
diagnóstico de enfermidades infecciosas (OIE 2008b).
Dentro das diretrizes recomendadas está a utilização de provas validadas.
1.6.1. Validação de Testes Imunoenzimáticos
O processo de validação avalia os ensaios determinando se os mesmos estão
apropriados para um uso em particular, além de conferir confiabilidade. A validação
de um ensaio é um processo contínuo e leva em consideração o propósito de uso do
mesmo. Nesse contexto, antes do desenvolvimento de qualquer novo ensaio estudos
de viabilidade devem ser realizados e deve ser também avaliada a capacidade do novo
ensaio de atender aos seus propósitos.
Todas as etapas do processo de validação recomendados pela OIE estão
descritas a seguir (OIE 2008c).
17
Etapa 1 – Viabilidade, calibração, estimativas de repetibilidade e sensibilidade
analítica
Esse estágio tem por objetivo padronizar os protocolos, os parâmetros físico-
químicos para a realização do ensaio e realizar os estudos de titulação e calibração.
Também visa identificar os pontos críticos e descrever os critérios de
aceitação/rejeição dos ensaios, a normalização, expressão e interpretação dos
resultados.
Nessa etapa os valores de sensibilidade analítica (Sn-A) e especificidade
analítica (Sp-A) são determinados. A Sn-A representa a menor parte do analito ou a
menor reação que pode ser detectada. Para a determinação desse parâmetro é
recomendado a utilização do analito purificado. Nos sistemas biológicos complexos
como nas interações antígeno-anticorpo, isso não é possível. Nesses casos, a
determinação indireta da sensibilidade analítica pode ser obtida através da diluição de
padrões de referência. Para a determinação desses parâmetros é recomendada a
utilização de soros padrões forte e fraco positivos. No caso de testes em uso, com
pontos de cortes definidos, esse parâmetro pode ser expresso como a última diluição
detectada como positiva, quando um soro de referência diluído em base 2 é avaliado.
A Sp-A é determinada através da análise de amostras obtidas de animais que
foram infectados com agentes patogênicos relacionados. Dependendo da aplicação
diagnóstica do ensaio em desenvolvimento, a sensibilidade analítica pode ser testada
frente a espécies, grupos ou sub-grupos. Quanto menor o nível de reação cruzada
melhor o nível de especificidade analítica da prova.
Etapa 2 - Estimativa da sensibilidade e especificidade diagnóstica
As características de sensibilidade e especificidade diagnóstica só podem ser
estimadas a partir da definição do ponto de corte da prova (“cut-off”) e conseqüente
separação das categorias positiva e negativa.
Idealmente, a estimativa desses parâmetros deve ser baseada na análise de
animais de referência com histórico e status de infecção conhecidos. Contudo, a
constituição de painéis com essas amostras é extremamente difícil. Em alguns casos
se faz necessário a imunização ou a infecção experimental de grupo de animais, e o
acompanhamento da imunização ou infecção com a coleta de material. A constituição
18
de painéis de amostras de animais livres, em alguns casos, pode ser difícil. Para
contornar essa adversidade, faz-se necessário o teste de grupo de animais não
infectados distantes da população alvo.
A sensibilidade diagnóstica (Sn-D) é definida pela proporção de animais de
referência, conhecidamente infectados, que são identificados como positivos pelo
teste e, a especificidade diagnóstica (Sp-D) é determinada pela proporção de animais
de referência não infectados, que são identificados como negativo pelo teste. O
número de amostras de referência necessárias para a determinação desses parâmetros
deve ser calculado. Para isso, devem ser computados os valores esperados de
sensibilidade e especificidade, e deve ser adotado um intervalo de confiança de 95%.
Entretanto, as fórmulas não podem computar todas as variações que podem afetar o
desempenho de um ensaio. Dessa forma, a OIE recomenda como regra geral a
avaliação de não menos que 300 animais infectados e 1000 não infectados. Nesta
etapa também devem ser realizadas comparações com outras provas, previamente
estudadas. As fórmulas abaixo são utilizadas para o cálculo de sensibilidade e
especificidade.
Sensibilidade Diagnóstica = VP/(VP+FN)
Especificidade Diagnóstica = VN/(VN+FP)
Onde VP = verdadeiro positivo; VN = verdadeiro negativo; FP = falso positivo e FN=
falso negativo.
Segundo a guia de validação da OIE para a determinação dos parâmetros de Sn-
D e Sp-D de novos testes, esses podem ser comparados com o teste índice. Os testes
índices são os ensaios que apresentam melhor sensibilidade e especificidade de todos
os testes em uso corrente. Contudo, os resultados obtidos nessa forma refletem os
dados de sensibilidade e especificidade relativa. Nesse caso assume-se que os
resultados do teste padrão refletem precisamente o estado de infecção do animal.
Quando essas comparações são realizadas sem o histórico e/ou acompanhamento do
animal as divergências não podem ser explicadas. Para reduzir as possíveis
divergências geradas por falsos positivos e negativos podem ser utilizados uma
bateria de testes para caracterizar a amostra.
19
Etapa 3 – Estimativa de reprodutibilidade e repetibilidade
Os parâmetros de precisão, repetibilidade, reprodutibilidade e exatidão também
devem ser determinados.
A precisão pode ser definida como a medida de dispersão do resultado de uma
amostra repetidamente testada.
A exatidão é definida como a medida de concordância entre o valor obtido e o
valor esperado para um padrão de referência de título ou concentração conhecida.
A repetibilidade apresenta duas abordagens: a variação entre as réplicas
(geralmente duplicatas ou triplicatas) de cada soro controle em uma mesma placa ou
membrana e, a variação entre provas dos valores de cada soro controle. Os limites de
variação devem ser estipulados para cada soro controle e os parâmetros para
aprovação ou rejeição estipulados. Também devem ser avaliadas a repetibilidade das
amostras testes. Uma variação muito grande, principalmente próximo ao ponto de
corte da prova, pode causar dificuldade para tomada de decisão com relação ao status
de infecção do animal. Para o teste de ELISA indireto os resultados compreendidos
em até 2 desvios padrões são satisfatórios.
A reprodutibilidade é determinada quando um painel de amostras de reatividade
definida é testado por vários laboratórios utilizando protocolos e reativos idênticos.
Em alguns casos, não é apropriado predeterminar o valor esperado, mas sim
estabelecer estatisticamente os limites superior e inferior de reatividade com base nos
resultados concordantes dos laboratórios participantes. Esse conceito é extremamente
importante para o desenvolvimento de padrões.
Etapa 4 – Implementação, manutenção e aprimoramento dos critérios de
validação
A última comprovação do sucesso de um ensaio é a sua aplicação a campo. E
isso deve incluir aspectos internacionais, regionais e/ou nacionais. Um novo ensaio
para substituir um ensaio padrão deve provar que atende melhor ao propósito desejado
e isso deve ser demonstrado pelos registros da sua ampla utilização. Quando
reconhecido como teste índice, o ensaio deve ser utilizado para produção de reagentes
de referência para o controle de qualidade, testes de proficiência e para harmonização.
20
Um teste validado deve estar sob constante monitoramento para a verificação da
manutenção do seu desempenho.
Modificações nos protocolos de produção requerem uma nova avaliação, para
confirmar a permanência de desempenho do teste. Modificações menores que não
implicam em alterações no desempenho analítico do ensaio, não necessitam de uma
reavaliação dos parâmetros de sensibilidade e especificidade diagnóstica.
Finalmente, mudanças da doença a campo, tais como, diminuição de
prevalência, alterações sazonais, surgimento de microorganismos relacionados ou
mudança nas práticas de vacinação podem gerar a necessidade de re-validação do
teste segundo o seu propósito de uso.
1.6.2. Validação do teste Índice da OIE
Os dois testes que constituem o sistema PNC do PANAFTOSA foram validados
com um extenso número de soros de animais em distintas condições epidemiológicas.
O elevado desempenho alcançado pelo sistema levou ao reconhecimento do mesmo
como teste índice ou teste de referência para a OIE (OIE 2008a). Os resultados
obtidos durante o exercícios realizados na América do Sul e na Europa foram
apresentados para registro seguindo o formato da guia da OIE.
O sistema do PANAFTOSA pode ser utilizado para atender aos seguintes
propósitos:
1) Demonstração do estado de livre de infecção em uma população definida
(país/região/compartimento/rebanho) (prevalência aproximadamente zero)
a) Livre com ou sem vacinação
b) Histórico do estado de livre de infecção
c) Restituição do estado de livre de infecção após surto
2) Certificação de livre de infecção ou agente em animais individuais ou produtos
para comércio ou movimentação.
3) Diagnóstico confirmatório de suspeitas ou casos clínicos (incluindo a confirmação
de amostras positivas nos testes de triagem)
5) Estimativa da prevalência de infecção ou exposição para facilitar a análise de risco
(vigilância, estado de saúde do rebanho, medidas de controle da doença)
6) Comparação de novos testes PNCs
7) Controle da indução de anticorpos contras as PNCs produzidos pelas vacinas
21
1.6.3. Preparo de padrões sorológicos
Para concretizar todas as exigências de validação de um teste índice é
importante que o mesmo conte com ferramentas que possibilitem a avaliação do
desempenho acima descrito, fixando as bases para a comparação de testes futuros. É
preconizado o preparo de “Padrões de Referência Internacional”, este termo é
entendido como padrão de referência primário e representa os padrões que devem ser
utilizados para comparação e calibração de todos os demais.
Os padrões são necessários para assegurar que uma determinada prova mede a
presença e/ou atividade dos anticorpos com nível de desempenho esperado. Nesse
contexto, os padrões são utilizados não só para avaliação contínua do teste índice,
apontando possíveis distorções nos parâmetros de repetibilidade, reprodutibilidade,
sensibilidade analítica, sensibilidade diagnóstica e especificidade, mais também para a
avaliação individual ou comparativa de metodologias novas ou já comercialmente
disponíveis.
Transpondo a avaliação das metodologias os padrões também se mostram
ferramentas úteis para a avaliação de laboratórios em testes de proficiência.
Para ser selecionado como padrão de referência internacional, um soro tem que
apresentar: um histórico detalhado da origem do animal, o qual deve apresentar um
histórico clínico representativo para a aplicação da metodologia em questão; deve ser
obtido em grande volume; deve ser submetido a um procedimento de inativação
internacionalmente reconhecido; e deve, finalmente, apresentar inocuidade e
estabilidade comprovadas. No caso dos padrões positivos, sempre que possível,
devem ser selecionados soros que representem uma resposta humoral típica, desta
forma, os animais hiperimunes devem ser evitados.
Para a avaliação de sensibilidade analítica, calibração de controles de provas e
análises iniciais de repetibilidade, três soros padrões de referência internacional
devem ser constituídos: um forte positivo, um fraco positivo e um negativo.
Para a avaliação do desempenho devem ser preparados painéis de soros, que
representem todo o espectro de reatividade encontrado na população-alvo. Estes
podem ser utilizados para a avaliação de desempenho entre lotes do próprio teste
índice, para confirmação das características de desempenho declaradas pelos
fabricantes de kits nos dossiês de validação, para a avaliação de metodologias em
22
desenvolvimento e para a determinação de desempenho comparativo dos kits
comerciais disponíveis.
Dessa forma, este trabalho descreve o preparo, a caracterização e a avaliação de
três soros padrões internacionais bovinos (PIBs) (forte positivo, fraco positivo e
negativo), os quais foram reconhecidos como Padrões de Referência Internacional da
OIE durante a Sessão Geral número 73. Em seguimento, para a avaliação de
desempenho, este trabalho descreve a seleção, o preparo, a caracterização e a
utilização/aplicação de um Painel Internacional de Avaliação (PIA) constituído de 34
soros bovinos (Campos et al., 2008).
A aplicação dos padrões internacionais de referência contribui para a utilização
de testes de diagnóstico com desempenho equivalente pelos programas de controle e
pelos parceiros comerciais.
23
2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi a obtenção de padrões sorológicos
internacionais de referencia para a avaliação do desempenho dos kits usados na
vigilância ativa da FA capazes de:
a) verificar a manutenção dos parâmetros de desempenho definidos pelo teste índice
b) estabelecer a equivalência com outros testes em uso
c) promover a confiabilidade dos resultados obtidos nos laboratórios nacionais de
referência
Para alcançar os objetivos gerais propostos foi necessário concretizar os
objetivos específicos listados a seguir:
• Selecionar, preparar, caracterizar e validar três soros padrões de referência
internacionais (negativo, fraco positivo e forte positivo) de origem bovina
(PIBs) para serem utilizados principalmente nas etapas de calibração e
estabelecimento de sensibilidade analítica de imunoensaios baseados na
detecção de anticorpos contra as PNCs do VFA.
• Constituir, caracterizar e validar um painel de Soros de Avaliação
Internacional PIA (34 soros) de origem bovina para serem aplicados na
avaliação do desempenho, principalmente da sensibilidade analítica e
diagnóstica, de imunoensaios baseados na detecção de anticorpos contra as
PNCs do VFA.
• Avaliar com os padrões desenvolvidos (PIBs e PIA) o desempenho
comparativo de testes imunoenzimáticos PNCs comercialmente disponíveis,
“in house” e analisar a viabilidade de testes em estágios iniciais de
desenvolvimento.
• Estender os estudos de desempenho comparativo de testes imunoenzimáticos
PNCs incluindo um maior número de soros representativos da situação
epidemiológica da América do Sul comparando os resultados com as
tendências obtidas com os padrões PIBs e PIA, assim como com os dados
disponíveis na literatura com soros de outras regiões.
• Avaliar com os padrões desenvolvidos o desempenho dos Laboratórios
Nacionais de Referência da América do Sul na utilização do testes PNCs
através da realização de testes de proficiência.
24
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Amostras de soros bovinos candidatos a padrões de referência
3.1.1. Soros Padrões Internacionais Bovinos (PIBs)
Para soros padrões internacionais foram selecionados e preparados dois soros
positivos (A e B) e um soro negativo.
O soro negativo foi preparado a partir de uma mistura de soros de animais não
vacinados de áreas livres.
O soro positivo A foi obtido de um bovino, de raça Crioula, de 2 anos de
idade, com histórico de vacinação com uma vacina trivalente (O,A,C), naturalmente
infectado com o vírus sorotipo A e cujo sangue foi coletado entre 13 e 15 dias após o
desenvolvimento de sinais clínicos.
O soro positivo B foi obtido de um bovino, raça Hereford, proveniente de uma
área livre sem vacinação, inoculado com 10.000 doses infectantes a 50% (DI50%) do
vírus tipo A24 Cruzeiro e coletado 12 dias após infecção (dpi). Os três soros foram
inativados conforme descrito no item 3.2 e testados nas provas de referência do
PANAFTOSA (NCPanaftosa Teste de Triagem - Bovino/NCPanaftosa Teste
Confirmatório - Bovino).
Para a avaliação do desempenho dos soros positivos A e B, os mesmos foram
diluídos de forma seriada em base dois utilizando como matriz negativa o soro bovino
negativo, cada diluição foi testada em triplicata no teste de Triagem do
PANAFTOSA, seguindo as instruções de uso para o processamento de soros
problema.
Como padrões forte e fraco positivo, foram preparados 300 ml de cada uma das
diluições escolhidas. Parte desse volume foi liofilizado no aparelho LabConco em
alíquotas de 500µl, totalizando 400 frascos por soro. O restante do material foi
estocado a -700C.
Para a análise da homogeneidade do processo de liofilização, 4 frascos dos
soros A, B diluídos, agora denominados forte e fraco positivo, e negativo,
aleatoriamente escolhidos foram reconstituídos e testados em quadruplicata,
25
totalizando 16 determinações de cada soro. Na mesma placa o material
correspondente às diluições não liofilizadas foram testados 16 vezes, o soro negativo
não liofilizado 8 vezes. Essa prova foi realizada com dois lotes de kit NCPanaftosa
Teste de Triagem (Figura 05). Na análise dos resultados foram incluídos os dados
obtidos em ambos os lotes de kit. Foi calculado o coeficiente de variação (CV), o
desvio padrão (desvpad) e a média aritmética dos resultados obtidos para os soros
forte e fraco positivos liofilizados e para as réplicas das amostras não liofilizadas.
Os valores de referência dos soros fraco e forte positivo foram calculados com
a média aritmética do material liofilizado.
Placa lote 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A CN A ( F1) A (F3) A ñ liof A ñ liof Neg (F1) Neg (F3) Neg ñ liof B ( F1) B (F3) B ñ liof B ñ liofB CN A ( F1) A (F3) A ñ liof A ñ liof Neg (F1) Neg (F3) Neg ñ liof B ( F1) B (F3) B ñ liof B ñ liofC CP 1 A ( F1) A (F3) A ñ liof A ñ liof Neg (F1) Neg (F3) Neg ñ liof B ( F1) B (F3) B ñ liof B ñ liofD CP 1 A ( F1) A (F3) A ñ liof A ñ liof Neg (F1) Neg (F3) Neg ñ liof B ( F1) B (F3) B ñ liof B ñ liofE CP 2 A ( F2) A (F4) A ñ liof A ñ liof Neg (F2) Neg (F4) Neg ñ liof B ( F2) B (F4) B ñ liof B ñ liofF CP 2 A ( F2) A (F4) A ñ liof A ñ liof Neg (F2) Neg (F4) Neg ñ liof B ( F2) B (F4) B ñ liof B ñ liofG SP A ( F2) A (F4) A ñ liof A ñ liof Neg (F2) Neg (F4) Neg ñ liof B ( F2) B (F4) B ñ liof B ñ liofH SP A ( F2) A (F4) A ñ liof A ñ liof Neg (F2) Neg (F4) Neg ñ liof B ( F2) B (F4) B ñ liof B ñ liof
Placa lote 21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CN A ( F1) A (F3) A ñ liof A ñ liof Neg (F1) Neg (F3) Neg ñ liof B ( F1) B (F3) B ñ liof B ñ liofB CN A ( F1) A (F3) A ñ liof A ñ liof Neg (F1) Neg (F3) Neg ñ liof B ( F1) B (F3) B ñ liof B ñ liofC CP 1 A ( F1) A (F3) A ñ liof A ñ liof Neg (F1) Neg (F3) Neg ñ liof B ( F1) B (F3) B ñ liof B ñ liofD CP 1 A ( F1) A (F3) A ñ liof A ñ liof Neg (F1) Neg (F3) Neg ñ liof B ( F1) B (F3) B ñ liof B ñ liofE CP 2 A ( F2) A (F4) A ñ liof A ñ liof Neg (F2) Neg (F4) Neg ñ liof B ( F2) B (F4) B ñ liof B ñ liofF CP 2 A ( F2) A (F4) A ñ liof A ñ liof Neg (F2) Neg (F4) Neg ñ liof B ( F2) B (F4) B ñ liof B ñ liofG SP A ( F2) A (F4) A ñ liof A ñ liof Neg (F2) Neg (F4) Neg ñ liof B ( F2) B (F4) B ñ liof B ñ liofH SP A ( F2) A (F4) A ñ liof A ñ liof Neg (F2) Neg (F4) Neg ñ liof B ( F2) B (F4) B ñ liof B ñ liof
CV CV CV CVMédia Média Média Média
Desvpad Desvpad
Calculado: Calculado: Calculado: Calculado:
Figura 05 – Desenho das placas do teste NCPanaftosa Teste de Triagem utilizadas para avaliação do processo de liofilização. A figura apresenta a posição e a quantidade de repetições de cada soro estudado. Os retângulos em vermelho apontam os resultados que foram utilizados para os cálculos da média aritmética e do coeficiente de variação (CV) e os retângulos em azul apontam os resultados que foram utilizados para os cálculos da média aritmética, do coeficiente de variação (CV) e do desvio padrão (desvpad). Coluna 1 – Controles da prova. Colunas 2 e 3 – Soro A diluído 1:4, denominado forte positivo, (F1-F4) frascos de 1 a 4. Colunas 4 e 5 – Soro A diluído 1:4 não liofilizado. Colunas 6 e 7 – Soro negativo frascos de 1 a 4. Coluna 8 – Soro negativo não liofilizado. Colunas 9 e 10 – Soro B diluído 1:16 denominado fraco positivo, (F1-F4) frascos de 1 a 4. Colunas 11 e 12 – Soro B diluído 1:16 não liofilizado.
26
3.1.2. Painel Internacional de Avaliação - Bovino (PIA)
Foram coletadas amostras de soro, em grande volume (100 a 300ml), de 34
animais de regiões apresentando distintas situações epidemiológicas. As informações
sobre cada soro estão resumidas na Tabela 01. Estão descritos abaixo os detalhes de
cada grupo de amostra coletado.
a) Quatro amostras de soros de animais de áreas livres de FA sem
vacinação da América do Sul (AL).
b) Seis amostras de soro de animais de áreas com mais de cinco anos
sem registro de enfermidade clínica e em intenso programa de
vacinação (ALV), incluindo dois animais plurivacinados e três
animais apresentando menos de seis meses que nunca foram
vacinados.
c) Um soro de um animal imunizado com uma vacina experimental
com processo de purificação limitado (Exp Vac).
d) Dez amostras de soro de animais envolvidos em focos (F), em três
países da América do Sul, coletados entre 10 – 26 dias após
identificação da doença. Sete desses animais apresentaram
sintomatologia clínica compatível com FA.
e) Cinco amostras de soros de animais de áreas endêmicas (E) da
América do Sul, coletados durante investigações de rotina entre 30 –
240 dias após a identificação da doença.
f) Oito amostras de soros de animais infectados conforme indicado
abaixo. a) um animal imunizado com vacina monovalente contra C3
Indaial e desafiado após 93 dias de imunização com injeção
intradermolingual de 10.000 ID50 de vírus homólogo. O soro foi
coletado 11 dias após o desafio (Exp Vac Des). b) sete animais não
vacinados foram infectados com injeção intradermolingual contendo
10 000 ID50 de vírus C3 Indaial, A24 Cruzeiro ou O1 Campos. Os
soros foram coletados entre 12 – 37 dpi (Exp Inf).
27
As provas utilizadas para a determinação dos valores de referência, para
verificação da estabilidade e para avaliação da aplicabilidade do painel estão descritas
no item 3.4 dessa seção.
28
Tabela 1 – Informação dos soros do painel de referência
Via Dias pós- Vírus Sinais DosesExposição exposição tipo clínicos vacinas
PIA-1 AL Crioula < 2 anos - - - - -PIA-2 AL Crioula < 2 anos - - - - -PIA-3 AL Crioula < 2 anos - - - - -PIA-4 AL Crioula > 2 anos - - - - -PIA-5 ALV Crioula 5 - 6 meses - - - - 1PIA-6 ALV Crioula 3 - 4 anos - - - - ≥ 6PIA-7 ALV Crioula < 6 meses - - - - 0PIA-8 ALV Crioula < 6 meses - - - - 0PIA-9 ALV Crioula < 6 meses - - - - 0PIA-10 ALV Crioula > 2 anos - - - - ≥ 4PIA-15 Exp Vac Crioula 2 anos - - - - 1PIA-12 F Crioula > 2 anos contato 10 dpe b O ? VC cPIA-14 F Crioula > 2 anos contato 15-20 dpe O ? VCPIA-16 F Crioula > 2 anos contato 15-20 dpe O ? VCPIA-17 F Crioula 1 - 2 anos contato 26 dpe A sim VCPIA-22 F Crioula > 2 anos contato 15-20 dpe O sim VCPIA-30 F Crioula 14 meses contato 15 dpe A sim VCPIA-31 F Crioula 6 meses contato 26 dpe A sim VCPIA-32 F Crioula > 2 anos contato 15-20 dpe O sim VCPIA-33 F Crioula 1 - 2 anos contato 26 dpe A sim VCPIA-34 F Crioula > 2 anos contato 15-20 dpe O sim VCPIA-19 E Crioula > 2 anos contato 150 dpe A ? VCPIA-21 E Crioula > 2 anos contato 140 dpe A ? VCPIA-23 E Crioula > 2 anos contato 240 dpe A ? VCPIA-24 E Crioula 1 - 2 anos contato 30 dpe A sim VCPIA-27 E Crioula 1 - 2 anos contato 60 dpe A sim VCPIA-13 Exp Vac Des Hereford 18 - 24 meses Inoculação 11 dpd d C3 Indaial não 1PIA-18 Exp Inf Hereford 1 - 2 anos Inoculação 12 dpi e A24 sim 0PIA-20 Exp Inf Crioula 18 meses Inoculação 25 dpi O1Campos sim 0PIA-25 Exp Inf Crioula 18 meses Inoculação 30 dpi A 24 sim 0PIA-26 Exp Inf Crioula 18 meses Inoculação 25 dpi A 24 sim 0PIA-28 Exp Inf Hereford 18 - 24 meses Inoculação 15 dpi C3 Indaial sim 0PIA-29 Exp Inf Hereford 18 - 24 meses Inoculação 15 dpi C3 Indaial sim 0PIA-35 Exp Inf Crioula 18 meses Inoculação 37 dpi A 24 sim 0
Soro Origem a Raça Ano
a Origem do soro: animais virgens (não expostos e sem vacinção) (área livre – sem vacinação) (AL); animais em áreas livres sob programa de vacinação (ALV); animal vacinado com uma vacina experimental com limitada purificação (Exp Vac); animais envolvidos em surtos (amostras coletadas entre 10 e 26 dpe) (F); animais em regiões endêmicas (E); animal experimentalmente vacinado e desafiado (Exp Vac Des); animais experimentalmente infectados (Exp inf). b dpe = dias após exposição c VC = condição de vacinação a campo: animais em regiões sob intenso programa de vacinação (pelo menos 2 vacinações/ano em animais menores de 2 anos e uma vez ao ano para animais mais velhos) com vacinas sob controle de lote estrito, seguindo as normas da OIE. d dpd = dias após desafio e dpi = dias após infecção
29
3.2. Soros bovinos adicionais
Soros bovinos, com volume limitado, de animais infectados experimentalmente
e a campo, foram utilizados particularmente para estudos comparativos do
desempenho de kits PNCs. Esses soros positivos foram selecionados de animais
representando infecção inicial e tardia, além de animais envolvidos em foco. A Tabela
02 resume o número de animais e o estado clínico. Nesse estudo, foram avaliados os
kits de ELISA do PANAFTOSA, CEDI, Bommeli (atualmente IDEXX) e UBI, os
únicos disponíveis no mercado na data do exercício. Os soros foram estudados, em
determinações únicas, simultaneamente em todos os kits.
Tabela 02- Resumo das condições epidemiológicas dos animais utilizados para a
avaliação de sensibilidade diagnóstica.
No. de
animaissoroconversão 8;9;10;11 2 B1 e B2
Infecção temprana 11;13;25;30;37;34 6 Sd.1 a Sd. 6cepa atenuda 49;56;63;77;70 5 Sd.7 a Sd.11
Infecção tardia (LEF+) 532; 602; 615 3 Sd.12 a Sd.14Animais de foco 115Animais de foco com vacinação LEF+ 90 2 Sd.15 a Sd.16
Origem dpi / dpfoco Soro
Experimentalmente infectado
LEF+ - Isolamento de vírus a partir do líquido esofágico-faríngeo dpi – dias após infecção dpfoco – dias após foco
Para a avaliação do desempenho da metodologia em desenvolvimento que
utiliza microesferas associadas a corantes fluorescentes (Luminex) foi utilizado, além
do PIA dois painéis adicionais denominados PAL 1 e PIC 3, que constituído
respectivamente por 294 soros de animais de áreas livres sem vacinação da América
do Sul e 121 soros de animais infectados da América do Sul. Para cada soro foi feita
uma única determinação.
30
3.3. Inativação dos Soros Bovinos
Todos os soros utilizados foram inativados com 2-Bromoetilenoamina
hidrobromado “2-Bromoethylamine hydrobromide” (BrCH2CH2NH2 · HBr) (BEI) a
0,1M segundo a metodologia descrita por Bahnemann, 1976.
Antes do processo de inativação uma alíquota de cada soro foi retirada para
avaliação comparativa.
O BEI é preparado por ciclização de 2 bromoetilamina hidrobromado (Fluka
06670) em 0,2 N de hidróxido de sódio (NaOH). Foi preparado 1 litro da solução de
BEI a 0,1M, para isso, foi adicionado 20,5g de 2-bromoetilamina hidrobromado em
um litro de NaOH 0,2N. Foi mantida so agitação suave por uma hora a 370C. Em
seguida, a solução foi filtrada com filtro Millipore 0,22µm.
Ao volume total de cada soro foi adicionado a solução de BEI 0,1M na
proporção de 1:100, de forma que, a concentração final do BEI no soro foi de
0,001M. Os soros foram incubados por 5 horas a 370C. Após o processo de inativação
o resíduo de BEI foi neutralizado com tiosulfato de sódio a 1M. Para isso, foi
preparada uma solução de tiosulfato de sódio 1M esterilizada por filtração através de
filtro Millipore 0,22µm. Esta solução foi adicionada a cada soro até uma concentração
final de 1%.
Após a inativação foi realizado o teste de inocuidade. Este teste foi feito em
cultura de células linhagem BHK-21, cultivada em monocamadas em frascos de
plástico tipo Falcon. Foi utilizado o meio mínimo essencial (MEM) de Eagle
(Glasgow) suplementado com TPB (Tryptose Phosphate Broth, Difco) a 2,95 g/L;
NaHCO3 a 2,5 g/L; penicilina a 100 U/mL; estreptomicina a 0,1 mg/mL; fungizona a
2,5 mg /mL e soro fetal bovino a 2 % e soro bovino a 8 %. De cada soro foi retirado
0,5ml e misturado com 1,5ml de meio MEM sem soro e inoculado nas monocamadas
de células BHK-21. A ausência de efeito citopático, após três passagens sucessivas de
48h, foi considerada como isolamento viral negativo.
Os soros foram fracionados e estocados congelados a – 700C, alíquotas para
futuras análises de estabilidade foram estocadas a -200C.
Para análise da estabilidade do soro ao processo de inativação alíquotas antes e
depois do processo de inativação foram testadas nas provas de triagem e confirmatória
do PANAFTOSA.
31
3.4. Testes imunoenzimáticos
3.4.1. Sistema PANAFTOSA
3.4.1.1. NCPanaftosa Teste de Triagem – Bovino (I-ELISA 3ABC)
O NCPanaftosa Teste de Triagem é um ELISA indireto que usa a poliproteína
recombinante 3ABC como sonda sorológica. As placas são cobertas diretamente com
a poliproteína 3ABC purificada. A diluição teste dos soros é 1:20. Um anticorpo
contra IgG bovino conjugado à peroxidase é utilizado como sistema revelador. Como
controles de prova são utilizados: um soro negativo (CN), um soro forte positivo (SP),
um intermediário (CP2) e um soro fraco positivo (CP1). Os resultados são expressos
em porcentagem de positividade (PP) em relação ao controle positivo, sendo
considerado positivo soros com PP ≥ 10.
Os resultados são expressos na forma de PP.
PP = (DO Amostra – Média DO CN) / (Média DO SP - Média DO CN) x
100
Soros positivos na prova de triagem devem ser confirmados pela prova
confirmatória.
Para o NCPanaftosa Teste de Triagem a sensibilidade de diferentes grupos de
animais, com comprovado estado de infecção, experimental ou a campo atinge
valores próximos a 100%. A especificidade em animais de áreas virgens excede a
98%. O ensaio pode apresentar um maior número de animais reativos em áreas com
intenso programa de vacinação, dependendo da qualidade das vacinas utilizadas e do
número de revacinações. Essas informações e as referências bibliográficas estão
descritas no instrutivo de uso do kit.
3.4.1.2. NCPanaftosa Prova Confirmatória – Bovino (EITB)
A prova de EITB é um Western Blot que usa cinco proteínas recombinantes
purificadas como sondas sorológicas (3ABC, 3D, 2C, 3B e 3A). As sondas são
fixadas à membrana de nitrocelulose por eletrotransferência. Os soros são testados em
32
diluição final de 1:200. Um anticorpo anti-IgG Bovino conjugado a fosfatase alcalina
é utilizado como sistema revelador.
O resultado desta prova será obtido através de comparação entre as reatividades
apresentadas pelos soros estudados e os soros controles. A prova apresenta três soros
controles; um soro negativo (CN), um positivo (CP2) e outro fraco positivo (CP1) ou
limite, que é utilizado como limite de positividade da prova.
Os soros controles devem apresentar o seguinte padrão de reatividade:
• Controle Negativo (CN) – não deve apresentar bandas de reação para
nenhum dos cinco antígenos ou estas devem ser apenas apreciáveis, com
intensidade inferior a intensidade observada para a banda correspondente
no soro limite (CP1)..
• Controle Padrão 1 (CP1) – deve apresentar bandas apenas apreciáveis e de
intensidade homogênea para cada um dos cinco antígenos.
• Controle Padrão 2 (CP2) – deve apresentar bandas bem visíveis para cada
um dos cinco antígenos com intensidades superiores as do CP1.
A reatividade de cada soro é analisada por comparação com a reatividade do
soro controle CP1 processado no mesmo gel e na mesma prova.
O soro deverá ser considerado não reativo quando se observa alguma destas
condições:
• Ausência total de reação para os cinco antígenos ou,
• Reatividade com intensidade menor a da banda correspondente no CP1
para cada um dos cinco antígenos, individualmente ou em conjunto ou,
• Reatividade igual ou maior a da banda correspondente no CP1 para no
máximo dois antígenos simultaneamente.
O soro é considerado reativo quando se observa:
• Reatividade para 3ABC, 3D, 3B e 3A (± 2C) com intensidade igual ou
superior a banda correspondente no soro controle CP1.
O resultado é considerado indeterminado:
Quando o padrão de bandas obtido não se ajusta aos parâmetros definidos para
os soros reativos ou não reativos.
33
Para o NCPanaftosa Teste Confirmatório a sensibilidade em populações da
América do Sul e Europa não vacinadas e experimentalmente infectadas ou de campo,
com comprovado estado de infecção persistente, atinge 100%. A especificidade em
animais virgens, da América do Sul e Europa excedeu 99%. Nos animais vacinados,
em áreas de vacinação sistemática, a especificidade também excedeu a 99%, para
animais menores de 2 anos. Essas informações e as referências bibliográficas estão
descritas no instrutivo de uso do kit.
3.4.2. Ceditest® FMDV-NS, Cedi Diagnosis B.V., Lelystad, Holanda.
O ELISA Ceditest® FMDV-NS (Cedi) é um ELISA de bloqueio que usa um
anticorpo monoclonal aderido à placa para fixar a proteína 3ABC recombinante
produzida no sistema de expressão de baculovirus. A diluição teste para os soros é de
1:5. Um anticorpo monoclonal contra 3B conjugado à peroxidase é utilizado como
sistema detector. O kit contém três controles, uma amostra positiva forte, uma
amostra positiva fraca e o controle negativo que determina a máxima DO do teste. Os
resultados são expressos em porcentagem de Inibição (PI) relativo a DO450 média do
soro controle negativo. Soros com PI ≥ 50 são considerados positivos.
PI = (DO Soro Problema / DO máxima ) x 100
No instrutivo de uso do kit não há informações sobre os valores de sensibilidade
e especificidade do teste.
3.4.3. CHEKIT*FMD-3ABC bo-ov, Dr Bommeli AG a subsidiaria do laboratório IDEXX, Inc. Liebefeld-Bern, Suíça
O CHEKIT*FMD-3ABC bo-ov (IDEXX) é um ELISA indireto que usa a
poliproteína 3ABC recombinante como antígeno. As placas são cobertas diretamente
com o antígeno purificado. A diluição teste para o soro é de 1:100. Um anticorpo
monoclonal anti IgG de ruminate conjugado a peroxidase é utilizado com sistema
detector. O kit apresenta um soro controle positivo (CP) e um soro controle negativo
(CN). Os resultados são expressos como porcentagem de positividade (PP)
34
comparado ao controle positivo, sendo negativo quando PP < 20, suspeito quando 20
≤ PP < 30 e positivo quando PP ≥ 30.
PP = (DO Amostra – Média DO CN) / (Média DO CP - Média DO CN) x
100
Foram utilizadas duas versões desse kit o produzido pela IDEXX como
mencionado acima e a original produzida pela Bommeli Diagnostica – Intervet
(Bommeli). As duas versões apresentam o mesmo desenho de prova e análise de
resultados. Diferenciando apenas na diluição do conjugado. A versão produzida pela
Bommeli fornecia o conjugado concentrado para diluição antes do uso. Já a versão
atual da IDEXX fornece o reativo já diluído.
No instrutivo de uso do kit não há informações sobre os valores de sensibilidade
e especificidade do teste
3.4.4. SVANOVIRTM FMDV 3ABC-Ab ELISA, Svanova, Upsala, Suécia.
O kit FMDV 3 ABC-Ab SVANOVIRTM (Svanova) é um ELISA indireto que usa
a proteína recombinante 3ABC produzida em E. coli como antígeno. As placas são
diretamente sensibilizadas com o antígeno purificado. A diluição teste dos soros é
1:40. Anticorpo anti-IgG bovino conjugado a perixadase é utilizado como sistema
detector. O kit apresenta dois soros controles um positivo e um negativo. As amostras
devem ser corridas em duplicata. Com cada amostra dever ser feita uma correção da
DO. Para isso, deve ser subtraído do valor da DO obtida para a amostra no poço que
contém 3ABC o valor da DO da respectiva amostra no poço controle. Os resultados
são expressos em procentagem de positividade (PP) comparado ao controle positivo.
O ponto de corte recomendado para os soros positivos é PP ≥ 48.
PP = (DOcorr Amostra / (DOcorr CP) x 100
No instrutivo de uso do kit não há informações sobre os valores de sensibilidade
e especificidade do teste
35
3.4.5. UBI® FMDV NS ELISA, United Biomedical Inc., New York, USA.
O ELISA UBI® FMDV Nonstructural protein (UBI) é um ELISA indireto que
usa o peptídeo sintético 3B como antígeno. As placas são cobertas diretamente com o
peptídeo sintético. A diluição utilizada para teste dos soros é 1:21. A proteína
recombinate A/G conjugada a peroxidase é utilizada como sistema revelador. O kit
apresenta dois controles um negativo e um positivo. O controle positivo corresponde
ao soro de uma cabra não infectada hiperimunizada com o peptídeo sintético. Esse
soro determina o ponto de corte da prova, que é determinado multiplicando a DO do
soro controle positivo pelo fator 0,23 (segundo as instruções do fabricante) ; amostras
com valores de DO maior ou igual ao valor do ponte de corte são consideradas
positivas. Nesse trabalho, para simplificar a comparação dos valores obtidos em
diferentes placas, os resultados foram normalizados como DO soro teste / Valor do
ponto de corte (T/C). Valores de T/C ≥ 1 foram considerados positivos.
A sensibilidade de 94% é descrita, no instrutivo de uso do kit, para bovinos
experimentalmente infectados e sangrados entre 10-14 dpi. Também está descrito
ausência de reação cruzada em amostras de animais vacinados, com 4 semanas de
antecedência, com vacina para o sorotipo O fabricada pela empresa Intervet, Holanda.
Mas, o valor de especificidade esperado em porcentagem não está descrito.
Os kits foram utilizados segundo as instruções fornecidas por cada empresa.
3.4.6. ELISA de captura In House 3ABC do Instituto Zooprofilattico Sperimentalle della Lombardia e dell’Emilia Romagna (IZSLER), Brescia, Itália
O ensaio é um ELISA indireto que usa um antígeno 3ABC recombinante
expresso em E. coli como sonda sorológica, capturado na placa de ELISA por um
anticorpo monoclonal anti 3A. Os soros são testados na diluição 1:100. O conjugado é
uma mistura de dois anticorpos monoclonais um reagindo contra a IgG1 de ruminantes
e o outro contra a IgG2 de bovino. Os resultados são expressos como porcentagem de
positividade (PP) comparado ao soro controle positivo. Valores de PP ≥ 10 são
considerados positivos.
36
3.4.7. “Luminex Liquid array–Multiplex”
A tecnologia de “Luminex liquid array” é um sistema de detecção de analitos
composto de microesferas de poliestireno no qual moléculas de captura tais como
pequenas moléculas antigênicas, anticorpos ou oligonucleotídeos podem ser
covalentemente conjugadas. Esse tipo de suporte permite a detecção de diferentes
analitos em um único ensaio.
Resumidamente, o princípio de ensaio consiste em embeber as microesferas
utilizadas em dois corantes fluorescentes vermelho e infravermelho, que ao serem
excitados emitirão fluorescência em diferentes comprimentos de onda formando para
cada analito pesquisado um único endereço espectral. O analito capturado em cada
microesfera corada é detectado utilizando um reagente secundário indiretamente
marcado com um indicador fluorescente. Cada microesfera é então avaliada por um
citômetro de fluxo. No teste utilizado, o laser a 635nm (classificador) excita as
moléculas de corante no interior das microesferas e classifica as esferas de acordo
com o seu grupo. O laser a 532 nm (indicador) excita as moléculas fluorescentes
ligadas à superfície das microesferas quantificando-as. O citômetro de fluxo é capaz
de ler 1000 microesferas por segundo (Figura 06).
No ensaio de Luminex desenvolvido na forma de “Multiplex” foram utilizados
como moléculas de captura os peptídeos sintéticos 3A, 3B e 3D e a proteína
recombinante 3ABC, conjugados as microesferas. Como sistema revelador foi
utilizado uma mistura de um antibovino de cabra conjugado com biotina.
A leitura das microesferas foi realizada no aparelho Bio-Plex da Bio Rad.
Como controle negativo (CN) o ensaio apresenta uma microsesfera recoberta
de albumina sérica bovina (BSA), pois o analito não apresenta afinidade por BSA, e
consequentemente, a Intensidade Média de Fluorescência (IMF) deve sempre ser
baixa. Altas IMF nas esferas de CN obtidas na presença de amostras provavelmente
indicam reação não específica.
37
Microesferas codificadas pela cor
Portão
Figura 06 – Representação esquemática do processo de leitura das microesferas realizado pelo Luminex. Interface em http://www.innogenetics.com acessado em 20/10/2008.
Para a análise dos resultados as amostras tiveram os valores de IFM subtraídos
dos valores de IFM do CN utilizado.
Para cada antígeno foi construído um gráfico de distribuição da população,
isto é, a IFM foi separada em intervalos e a porcentagem dos animais positivos e
negativos compreendidos em cada intervalo foi calculada.
3.5. Desenho das provas laboratoriais utilizadas
3.5.1. Caracterização dos soros
3.5.1.1. Determinação de valores de referência dos soros PIBs e PIA
Os valores de referência para os soros PIBs e os soros do PIA foram obtidos nos
testes NCPanaftosa Teste de Triagem e NCPanaftosa Prova Confirmatória. Estas
provas foram realizadas segundo instrutivo de uso de cada kit.
38
A determinação dos valores de referência para os soros PIBs (negativo, forte
positivo e fraco positivo) está descrita na prova de avaliação do processo de
liofilização (item 3.1.1 figura 05).
Para os soros do PIA os resultados de referência foram baseados em seis
determinações (realizadas em duplicata em três dias diferentes) para o teste
NCPanaftosa Teste de Triagem e em três provas, com uma única aplicação de cada
soro, processadas em ocasiões diferentes para o teste NCPanaftosa Prova
Confirmatória.
3.5.1.2. Determinação da estabilidade dos soros PIBs e PIA
A verificação da estabilidade ao armazenamento dos soros foi realizada com os
testes de referência do PANAFTOSA. Para esse estudo, uma alíquota de cada soro foi
armazenada a -200C e em intervalos bimestrais testada em duplicata no teste de
Triagem, e em uma única determinação no teste confirmatório. Para o resultado final,
no teste de triagem, foi calculada a média aritmética das duplicatas de cada prova. O
resultado de cada bimestre foi comparado com o resultado de referência. Variações
compreendidas entre ± 20% do valor de referência foram aceitas. Além da variação
padrão adotada foi verificado se algum soro apresentou redução de reatividade
constante e progressiva durante as provas de estabilidade.
Cabe ressaltar que os soros PIBs liofilizados foram reconstituídos e mantidos a
-200C e utilizados na prova de estabilidade.
3.5.1.3. Determinação dos valores dos soros PIBs e PIA em outros laboratórios
Os soros PIBs e o PIA foram analisados em três laboratórios da América do Sul,
que rotineiramente usam o sistema NCPanaftosa Testes de Triagem e Confirmatório.
Os soros foram fornecidos aos laboratórios codificados. Para o NCPanaftosa Teste de
Triagem foram solicitadas seis determinações realizadas em duplicata em três
ocasiões diferentes. Os resultados foram informados ao PANAFTOSA como valores
de absorbância e analisados (valores de PP). Para a prova confirmatória foi solicitado
uma única determinação em duas ocasiões.
39
Para a análise dos resultados da prova de triagem foi calculado o CV de cada
laboratório e a média aritmética dos valores de PP. Em seguida, foi realizada a média
aritmética das determinações dos três laboratórios e o CV entre eles. Para avaliar a
variação frente aos dados de referência de PANFTOSA foi realizado o cálculo do CV
dos resultados dos laboratórios incluindo os valores de referência de PANFTOSA.
3.5.2. Aplicação dos Padrões Internacionais PIBs e PIA
3.5.2.1. Avaliação comparativa de imunoensaios
3.5.2.1.1. Testes em uso
Os padrões de referência internacional (PIBs e PIA) foram utilizados para
apontar variações no desempenho comparativo dos testes ELISA, 4 ELISAs
comerciais e um ELISA “in house” foram comparados quanto a sensibilidade analítica
e a sensibilidade diagnóstica.
A sensibilidade analítica, ou limite de detecção, de cada prova foi avaliada
utilizando os soros PIBs e o PIA. Para isso, os soros positivos foram diluídos em base
2 até 1:128, utilizando o soro negativo como matriz. Cada diluição foi processada
como um soro problema em duplicata nos testes NCPanaftosa Teste de Triagem,
CEDI, IDEXX, Svanova e UBI segundo as instruções do fabricante. A análise dos
resultados obtidos com os soros PIBs foi feita através da construção de curvas de
titulação, expressando as médias obtidas nas duplicatas. Para a análise do resultado
obtido com as diluições dos soros positivos do PIA, além das curvas de tiltulação, foi
conformada uma tabela indicando, para cada kit avaliado, a diluição máxima que
apresentou resultado positivo.
O PIA completo foi utilizado para avaliação da sensibilidade diagnóstica
comparativa dos testes. Os testes comerciais (CEDI, IDEXX, Svanova e UBI) foram
utilizados no PANAFTOSA, cada soro foi testado em duplicata em três ocasiões
diferentes. O estudo do painel com o teste IZSLER “in house” foi realizado no
próprio instituto em Brescia, Itália. Nesse teste uma determinação de cada soro foi
realizada em três dias diferentes, e os resultados encaminhados ao PANAFTOSA para
a análise comparativa. Para cada réplica foi calculado o CV e a média aritmética.
40
3.5.2.1.2. Teste em desenvolvimento
O padrão de referência internacional PIA e painel de soros de área livre PAL 1
foram utilizados para apontar o desempenho do teste imunoenzimático em
desenvolvimento luminex montado como Multiplex, como descrito no item 3.3.7.
Esses soros descritos no itens 3.1 e 3.2 foram testados no PANAFTOSA. Cada soro foi
processado uma única vez. A capacidade do teste em discriminar populações
verdadeiramente positivas e negativas foi verificada com a construção de gráficos de
distribuição, para isso foram utilizados diretamente os dados de intensidade de
fluorescência média (IFM) obtidos sem normalização.
3.5.2.2. Aplicação em teste de proficiência
O PIA foi utilizado para avaliar o desempenho dos laboratórios oficiais de
referência para FA da América do Sul no processamento dos kits NCPanaftosa Teste
de Triagem e Confirmatório. Os soros foram codificados e fornecidos aos
laboratórios, os mesmos foram instruídos a processar os soros individualmente em
cada prova, não utilizando a forma de sistema.
Na prova de triagem foram solicitadas três provas distintas, com os soros
processados em duplicata e uma única prova confirmatória. Tanto os resultados de
absorbância quanto os resultados analisados foram encaminhados ao PANAFTOSA
para análise.
Para a avaliação do desempenho dos laboratórios três pontos foram
considerados. O primeiro foi a correta classificação (categoria) dos soros (reativo, não
reativo e indeterminado/inconclusivo) e, em seguida, a repetibilidade intra-placa e
inter-placa. Para a análise da prova de triagem foram aceitas mudanças de categoria
para os soros próximos ao ponto de corte da prova (PP = 10 ± 20%) (PIA-12; PIA-13;
PIA-14), desde que o valor indicado pelo laboratório estivesse dentro da variação de
20%. Desta forma, os 34 soros do painel foram incluídos na análise de categoria. Para
análise de repetibilidade os soros negativos foram excluídos, restando 24 soros para a
análise desse parâmetro. Para cada soro foi solicitada uma análise em duplicata, em
três provas diferentes, logo foram gerados 3 CVs intraplaca por soro e 72 CVs para
todos os soros. Também foram calculados CV inter-placa com as seis determinações
41
de cada soro, totalizando 24 CV. A Figura 07 exemplifica a planilha utilizada para a
análise dos resultados de NCPanaftosa teste de triagem de cada laboratório.
Média CV CategoriaPP1 PP2 Média CV * PP1 PP2 Média CV * PP1 PP2 Média CV * Final interplaca
Soro 1 83 86 85 3 78 81 80 3 84 88 86 3 83 4 ReativoNA NA NA NA Não reativoSoro 2 5 4 5 4 5 5 3 3 3 4
Soro 3Soro 4Soro 5Soro 6Soro 7
Soro 35
...
NCPanaftosa Teste de Triagem Prova 3Prova 1 Prova 2
Figura 07 – Representação da planilha utilizada para a análise dos resultados do teste NCPanaftosa Teste de Triagem recebidos no exercício de proficiência. PP – porcentagem de positividade; CV * – coeficiente de variação intraplaca e NA - não aplica
Para cada laboratório foi calculado a porcentagem de soros informados
corretamente e a porcentagem de soros com CV dentro das variações aceitáveis, intra-
placa 10% e inter-placa 20%.
Para avaliação da reprodutibilidade obtida pelos laboratórios frente ao valor de
referência do PANAFTOSA. Gráficos foram construídos, para cada soro, expressando
o valor de referência ± 20%, a média final obtida por cada laboratório e o desvio
padrão obtido.
Para o NCPanaftosa Teste Confirmatório da mesma forma, foram aceitas
diferenças na classificação dos soros que apresentavam bandas com intensidades
próximas as bandas do soro limite (CP1) e que poderiam gerar mudanças de
categorias (PIA-12; PIA-13 e PIA-15). O soro PIA-12 apresenta a proteína 3B
próxima ao soro limite CP1 e as demais bandas com intensidade superior ao CP2.
Para este soro foi aceita a classificação de indeterminado ou reativo. O soro PIA-13
detecta as proteínas 3ABC e 3A com intensidade semelhante ao soro CP1, as demais
proteínas com intensidade entre CP1 e CP2. Desta forma, esse soro deve ser
considerado entre indeterminado ou reativo. O soro PIA-15, apresenta as 5 bandas
com intensidades homogêneas próximas ao soro limite (CP1), e deve ser considerado
reativo ou indeterminado.
42
3.6. Estudos adicionais de comparação de provas ELISA
Foi realizado no PANAFTOSA um exercício de provas comparativas. Nesse
estudo foram utilizadas 139 amostras provenientes de 133 animais, verdadeiramente
positivos. As características desses animais estão descritas no item 3.2
Foram utilizados os testes de ELISA da CEDI, UBI, Bommeli (atual IDEXX) e
NCPanaftosa Teste de Triagem. Cada soro foi analisado em determinação única em
cada um dos testes.
As tendências obtidas no estudo comparativo de PANFTOSA, no estudo
comparativo realizado no laboratório do Instituto Zooprofilattico Sperimentalle della
Lombardia e dell`Emilia Romagna, Brescia em 2004 e as tendências obtidas com os
soros PIBs e o PIA foram resumidas para comparação.
43
4. RESULTADOS
4.1. Inativação dos soros
Como os padrões de referência internacional destinam-se a utilização em
laboratórios de referência de diversos países e considerando que por ser um material
biológico pode conter diferentes patógenos, os mesmos foram inativados e, para
garantir a segurança, selecionados de animais provenientes de áreas livres de
Encefalopatia Espongiforme bovina (BSE).
Como metodologias de inativação reconhecidas internacionalmente e adotadas
pela OIE estão o processo de irradiação e a initivação química com etilenoamina
binária (BEI). Esse último foi o processo escolhido neste trabalho pois, é seguro,
apresenta baixo custo e, é inócuo, em princípio não interferindo na reatividade dos
soros.
Todos os soros destinados aos padrões internacionais descritos nesse trabalho
foram inativados com BEI segundo a metodologia detalhada no item 3.3 e para a
avaliação da manutenção da reatividade alíquotas antes e após o tratamento foram
testadas nas provas de triagem e confirmatória do PANAFTOSA. A Tabela 03
apresenta os valores obtidos e o CV entre as alíquotas comparadas.
Na prova de triagem do PANAFTOSA os valores de reatividade variaram
dentro do esperado (CV< 10%) e na prova confirmatória não foram observadas
alterações de reatividade dos soros (dado não mostrado), indicando que os mesmos se
mostraram estáveis após o tratamento e que, o inativante não interferiu na reatividade
dos soros estudados.
Após o tratamento os soros foram inoculados em cultura de células BHK. Não
foi evidenciado efeito citopático em nenhuma das três passagens sucessivas
realizadas.
44
Tabela 03 – Resultados dos soros do PIBs e PIA obtidos no NCPanaftosa Teste de
Triagem antes e após o processo de inativação
Soros PP(antes) PP(após) CVNeg (PIB) -1 1 -A (PIB) 125 120 3B (PIB) 70 72 2PIA-1 -2 -1 -PIA-2 -1 -1 -PIA-3 -2 -2 -PIA-4 4 4 -PIA-5 -3 -2 -PIA-6 4 5 -PIA-7 -1 -1 -PIA-8 -2 -2 -PIA-9 -2 -2 -PIA-10 2 6 -PIA-15 19 21 8PIA-12 12 11 7PIA-14 10 9 7PIA-16 30 28 5PIA-17 34 30 9PIA-22 71 72 1PIA-30 93 88 4PIA-31 85 90 4PIA-32 104 107 2PIA-33 120 131 6PIA-34 120 125 3PIA-19 62 59 4PIA-21 59 56 4PIA-23 73 71 3PIA-24 65 63 2PIA-27 82 83 1PIA-13 14 14 2PIA-18 37 35 4PIA-20 40 45 8PIA-25 83 73 9PIA-26 60 65 6PIA-28 82 79 3PIA-29 93 93 0PIA-35 149 132 8
NCPanaftosa Teste de Triagem
PP(antes) - Valores em porcentagem de positividade (PP) das médias de duplicatas obtidas para as alíquotas retiradas antes da inativação. PP(após) - Valores em porcentagem de positividade (PP) das médias de duplicatas obtidas para as alíquotas retiradas após a inativação CV – Coeficiente de variação entre as quatro determinações Neg – Soro Negativo
45
4.2. Resultados de referência – Sistema PNC do Panaftosa (índice)
4.2.1. Soros Padrões Internacionais – PIBs: Características e valores de referência
Os soros Padrões Internacionais são padrões primários utilizados principalmente
para a calibração dos testes de diagnóstico e avaliação da sensibilidade analítica.
Esses soros são utilizados nas etapas iniciais de calibração de um teste e sua curva
infere os limites de detecção obtidos pelo teste índice.
A seleção desses soros levou em consideração as características dos animais,
descritas no item 3.1.1., o volume, a reprodutibilidade, a estabilidade e,
principalmente, a curva de diluição obtida quando os soros diluídos em base dois são
processados no teste de triagem do PANAFTOSA, apresentada na Figura 08. As setas
indicam as diluições escolhidas para o preparo dos padrões de referência. Para o
preparo do soro de referência forte positivo foi escolhida a diluição 1:4 do soro A, que
se encontra entre o platô superior da curva e o ponto central da região linear. Para o
preparo do soro fraco positivo foi escolhida a diluição entre o ponto central da curva e
o platô inferior que corresponde a diluição 1:16 do soro B. Ambas as diluições estão
situadas nas porções lineares das curvas de diluição evitando os extremos não lineares
(Wright, 1998).
As diluições escolhidas foram preparadas e liofilizadas conforme descrito no
item 3.1.1. Após a liofilização 4 frascos de cada soro aleatoriamente escolhidos foram
reconstituídos e testados na prova de triagem do PANAFTOSA em comparação com
uma alíquota do material não liofilizado. O desenho da prova utilizada para a
verificação da homogeneidade está detalhado na Figura 05.
O soro forte positivo não liofilizado foi avaliado em 32 réplicas, sendo 16
determinações em cada placa. O CV de todas as 32 réplicas foi igual a 8%, logo todas
foram utilizadas para o cálculo da média da porcentagem de positividade (média =
119 PP), essa média foi usada como referência para o soro não liofilizado, assim
mesmo foi calculado o desvio padrão. O soro liofilizado da mesma forma foi avaliado
com 32 réplicas. Para comparação entre o soro liofilizado e não liofilizado foi
construído um gráfico de dispersão de resultados (Figura 09A). No gráfico A estão
indicados a média obtida para o soro não liofilizado, ± 1, 2 e 3 desvios padrões. Os
46
resultados obtidos para as quatro alíquotas do soro liofilizado estão mostrados em
forma de gráfico de dispersão para comparação. Como pode ser observado, o processo
de liofilização não produziu alteração na reatividade apresentada pelo soro forte
positivo, pois os resultados obtidos encontraram-se dispersos entre dois desvios
padrões. O CV obtido entre as 32 réplicas do soro forte positivo liofilizado foi igual a
9%, dessa forma, para a determinação do valor de referência, foi calculada a média
das 32 réplicas correspondentes ao soro liofilizado (média = 118 PP).
Para o soro fraco positivo o mesmo desenho de prova foi adotado. As 32
determinações do soro fraco positivo não liofilizado apresentaram média de PP igual a
32 e CV 16%. Para avaliação da dispersão dos resultados, também foi calculado o
desvio padrão. Igualmente ao observado para o soro forte positivo o processo de
liofilização não produziu alteração no título de anticorpos. Os valores de porcentagem
de positividade obtidos para o soro fraco positivo liofilizado também não superaram
dois desvios padrões. Dos 32 valores de PP obtidos para o soro fraco positivo
liofilizado, um ponto foi descartado, a determinação 4 da placa 1. Como pode ser
observado no gráfico da Figura 09B, o valor descartado é superior a 3 desvios padrões
e, é possível que tenha sido ocasionado por um erro de manipulação. O valor de
referência (PP=32) foi obtido pela média de 31 repetições do material liofilizado, as
quais apresentaram CV igual a 9%.
Em geral, para os ensaios de ELISA indireto valores podem variar até dois
desvios padrões (Crowther, 2001).
A incorporação de um soro negativo como padrão internacional é essencial,
uma vez que se recomenda que a matriz de diluição para os soros padrões positivos
seja semelhante a matriz dos soros em questão. Por exemplo, para a diluição de um
soro bovino de animal adulto não é recomendada a utilização de soro fetal bovino
como base negativa. O soro negativo também foi testado após a liofilização. Quatro
frascos foram selecionados de forma aleatória, reconstituídos e testados em quatro
repetições, totalizando 24 determinações por placa. Foram utilizadas duas placas.
47
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
1/25
6
1/51
2
1/10
24
1/20
48
Diluições
PP
A B Neg
Forte Positivo
Fraco Positivo
Negativo
Figura 08 – Curva de diluição dos soros Padrões Internacionais Bovinos (PIBs) na prova NCPanaftosa Teste de Triagem. O gráfico apresenta a curva de diluição dos soros A e B, os quais foram utilizados como base para a preparação dos PIBs. A – Soro A coletado de um bovino naturalmente infectado, características descritas no item 3.1, e diluído em base 2 em soro bovino negativo. B - Soro B coletado de um bovino experimentalmente infectado, características descritas em M & M item 3.1, e diluído em base 2 em soro bovino negativo. PP - Porcentagem de positividade frente ao controle positivo. As setas indicam as diluições selecionadas para o preparo dos soros de referência internacional.
48
A
020406080
100120140160
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Determinações
PP
Placa 1 Placa 2
B
0
10
20
30
40
50
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Determinações
PP
Placa 1 Placa 2
Figura 09 – Determinação dos valores de reatividade dos soros PIBs. Comparação entre o material liofilizado e não liofilizado. O gráfico A apresenta os valores obtidos para o soro forte positivo liofilizado, comparando com os valores obtidos para o mesmo soro antes da liofilização. Gráfico B apresenta os valores obtidos para o soro fraco positivo liofilizado, comparado com os valores obtidos para o mesmo soro antes do processo de liofilização. Média dos valores obtidos nas placas 1 e 2 com soros não liofilizados. ±1 desvio padrão, calculado para os valores obtidos nas placas 1 e 2 com soros não liofilizados. ±2 desvios padrões , calculado para os valores obtidos nas placas 1 e 2 com soros não liofilizados. ±3 desvios padrões, calculado para os valores obtidos nas placas 1 e 2 com soros não liofilizados. ♦ Valores obtidos para o soro liofilizado na placa 1 ♦ Valores obtidos para o soro liofilizado na placa 2
49
4.2.2. Painel Internacional de Avaliação – PIA: Características e valores de referência
Além dos soros PIBs, descritos até o momento nesse trabalho, a construção e
caracterização de indicadores capazes de avaliar a sensibilidade diagnóstica dos testes
imunoenzimáticos e comparar o desempenho dos mesmos com o desempenho
apresentado pelo teste índice é de extrema relevância. Para uma correta avaliação da
sensibilidade diagnóstica são necessários soros abrangendo um amplo espectro de
reatividade e que reflitam, da melhor maneira possível, a complexidade da interação
antígeno anticorpo que pode ser encontrada a campo. Dessa maneira, foram
selecionados e caracterizados soros de animais da América do Sul em regiões com
distintas situações epidemiológicas, assim como soros de animais de modelos
experimentais e infectados e vacinados, para a constituição de um Painel Internacional
de Avaliação (PIA).
Os resultados de referência obtidos para os soros do PIA no sistema PNC do
PANAFTOSA estão descritos na Tabela 04 e Figura 10. Os valores de referência
obtidos para o teste de triagem do PANAFTOSA foram baseados em duplicatas
obtidas em três provas, totalizando seis determinações. Para prova confirmatória os
resultados de referência se basearam em três determinações processadas em provas
diferentes.
Os quatro soros provenientes de animais virgens (não expostos e não vacinados)
(PIA-1; PIA-2; PIA-3 e PIA-4) apresentaram resultados negativos na Prova de
Triagem e na prova confirmatória do PANAFTOSA. Os seis soros de animais de
áreas livres com vacinação (ALV) (PIA-5; PIA-7; PIA-8; PIA-9), incluindo animais
com múltiplas vacinações (PIA-6 e PIA-10) utilizando vacinas convencionais também
apresentaram resultados negativos em ambos os testes.
O Soro PIA-15, coletado de um animal imunizado com uma vacina
experimental com purificação limitada (Exp Vac) apresentou PP = 18 no teste de
triagem e confirmou positivo no teste confirmatório.
No grupo de animais infectados/expostos todos os 10 soros coletados logo após
o foco (O) (PIA-12; PIA-14; PIA-16; PIA-17; PIA-22; PIA-30; PIA-31; PIA-32; PIA-
33 e PIA-34) e os cinco soros de animais em regiões endêmicas (E) (PIA-19; PIA-21;
PIA-23; PIA-24 e PIA-27) apresentaram resultado positivo no teste de triagem. Todos
esses soros confirmaram positivos no teste confirmatório do PANAFTOSA.
50
O grupo constituído do soro de sete animais não vacinados e inoculados com
uma das três cepas protótipos dos sorotipos O, A e C (O1 Campos; A24 Cruzeiro ou
C3 Indaial), sangrados entre 12-37 dpi (Exp inf) (PIA-18; PIA-20; PIA-25; PIA-26;
PIA-28; PIA-29 e PIA-35) apresentaram resultados positivos em ambos os testes. O
soro coletado de um animal vacinado e desafiado (PIA-13) também apresentou
resultado positivo na prova de triagem e confirmou positivo no teste confirmatório.
O painel apresentou para os soros positivos um amplo espectro de reatividade que
variou de PP 11 a 139. Essa variação também foi observada na intensidade das bandas
do teste confirmatório (Figura 10). Os soros de PIA -1 a PIA-10 não apresentaram
mais de duas bandas com intensidade superior as bandas do soro controle CP1, ponto
de corte da prova, sendo classificados como não reativos. Os soros PIA-12 a PIA-35
apresentaram perfis de reatividade compatível com a classificação de soro reativo
para a prova: reatividade para as bandas (3ABC, 3D, 3B, 3A ± 2C) com intensidade
igual ou superior às bandas do soro controle CP1 correspondentes.
51
Tabela 04 – Valores de referência para o PIA: NCPanaftosa Teste de Triagem e
NCPanaftosa Teste Confirmatório
PP1 PP2 Cve PP1 PP2 Cve PP1 PP2 Cve
PIA-1 AL 0 1 - 0 -1 - 0 0 - 0 - NegPIA-2 AL 0 0 - -1 -1 - -1 0 - -1 - NegPIA-3 AL 0 0 - -1 -1 - 0 0 - 0 - NegPIA-4 AL 3 3 - 3 4 - 3 3 - 3 - NegPIA-5 ALV 0 0 - -1 -1 - 0 0 - 0 - NegPIA-6 ALV 1 2 - 3 2 - 4 6 - 3 - NegPIA-7 ALV 0 0 - -1 0 - -1 0 - 0 - NegPIA-8 ALV -1 -1 - -1 -1 - -1 -1 - -1 - NegPIA-9 ALV 0 5 - -1 -1 - -1 1 - 1 - NegPIA-10 ALV 5 6 - 3 3 - 5 5 - 5 - NegPIA-15 Exp Vac 17 19 8 19 17 8 19 19 0 18 6 PosPIA-12 F 12 12 0 10 12 13 14 17 14 13 19 PosPIA-14 F 9 10 7 11 10 7 12 12 0 11 11 PosPIA-16 F 22 23 3 21 23 6 24 26 6 23 7 PosPIA-17 F 31 31 0 27 27 0 31 30 2 30 7 PosPIA-22 F 53 53 0 67 66 1 61 62 1 60 10 PosPIA-30 F 72 77 5 77 79 2 81 84 3 78 5 PosPIA-31 F 70 73 3 73 72 1 80 82 2 75 6 PosPIA-32 F 97 95 1 99 98 1 97 95 1 97 2 PosPIA-33 F 121 118 2 130 121 5 132 132 0 126 5 PosPIA-34 F 103 102 1 113 110 2 116 115 1 110 6 PosPIA-19 E 47 48 1 58 60 2 51 54 4 53 10 PosPIA-21 E 57 57 0 51 50 1 58 57 1 55 6 PosPIA-23 E 69 74 5 54 53 1 70 68 2 65 14 PosPIA-24 E 56 56 0 44 45 2 64 65 1 55 16 PosPIA-27 E 69 70 1 63 63 0 73 75 2 69 7 PosPIA-13 Exp Vac Des 11 11 0 11 12 6 11 12 6 11 5 PosPIA-18 Exp Inf 31 30 2 29 31 5 31 35 9 31 7 PosPIA-20 Exp Inf 35 36 2 39 37 4 43 45 3 39 10 PosPIA-25 Exp Inf 69 69 0 77 77 0 71 72 1 73 5 PosPIA-26 Exp Inf 64 57 8 64 61 3 64 66 2 63 5 PosPIA-28 Exp Inf 66 69 3 68 71 3 70 75 5 70 4 PosPIA-29 Exp Inf 79 77 2 77 82 4 78 84 5 80 4 PosPIA-35 Exp Inf 132 126 3 150 137 6 144 142 1 139 6 Pos
Placa 3Soro Origema NCPanaftosa
Teste ConfirmatóriaMean PPc CVd
NCPanaftosa Teste de Triagemb
Placa 1 Placa 2
a ver Tabela 1 para detalhe b PP = Porcentagem de positividade. Ponto de corte: Pos ≥ 10 PP c Média de seis determinações d CV = Coeficiente de variação interplaca e CV = Coeficiente de variação intraplaca
52
PIA
CN P1 P2 1 10
CN P1 P2PIA
12 35
3ABC3D2C
3B3A
3ABC3D2C
3B3A
PIACN P1 P2 1 10
CN P1 P2PIA
12 35
3ABC3D2C
3B3A
3ABC3D2C
3B3A
Figura 10 – Resultado dos soros do Painel de Avaliação Internacional (PIA) na prova NCPanaftosa Teste Confirmatório (“Western blot”). Perfil de reatividade dos anticorpos dos 34 soros do PIA para os cinco antígenos recombinantes utilizados no teste confirmatório do PANAFTOSA. CN – Soro controle negativo. P1- Soro controle positivo 1, limite de positividade. P2- Soro controle positivo 2. Os soros PIA -1 a PIA-10 não apresentaram mais de duas bandas com intensidade superior as bandas do soro controle 1, sendo classificados como não reativos. Os soros PIA -12 a PIA-35 apresentaram perfis de reatividade compatível com a classificação de soro reativo para a prova: reatividade para as bandas (3ABC, 3D, 3B, 3A ± 2C) com intensidade igual ou superior as bandas do soro controle 1 correspondentes. Destacamos que, a perda de definição na digitalização da imagem inviabiliza a visualização de algumas bandas mais tênues.
53
4.2.3. Avaliação de estabilidade dos soros PIBs e PIA
Apenas soros com comprovada estabilidade podem ser aceitos como padrões de
referência internacional. Para garantir a estabilidade dos soros por um longo período
os soros PIBs foram liofilizados e os soros PIA serão liofilizados a continuação desse
trabalho. Segundo a experiência do PANAFTOSA, que mais uma vez foi corroborada
nesse trabalho, o processo de liofilização nas condições padronizadas não induzem
alterações de reatividade nos soros.
Por outro lado, é importante obter informações sobre as condições de
armazenamento do material reconstituído, bem como o tempo em que o mesmo pode
ser utilizado com confiança foram realizados. Esse estudo de estabilidade visa
observar se há perda de reatividade durante o armazenamento a -200C e seis ciclos de
congelamento e descongelamento, em um período de um ano. Dessa forma apenas os
soros positivos PIBs e os soros positivos do painel foram estudados no sistema do
PANAFTOSA.
A Tabela 05 apresenta os resultados de seis determinações obtidas em intervalos
bimestrais (média de duplicatas) para cada soro no teste de triagem do PANAFTOSA.
Como pode ser visto na tabela os valores flutuam dentro da variação esperada, com
nenhuma redução contínua de reatividade. Os mesmos resultados foram observados
na prova confirmatória (dado não mostrado), demonstrando uma estabilidade
satisfatória durante o período experimental e após seis ciclos subseqüentes de
congelamento e descongelamento.
.
54
Tabela 05 – Resultado de Estabilidade dos soros PIBs e PIA
ValorReferênciaa 4 6 8 10 12
Forte Pos (PIB) 118 123 119 124 117 120Fraco Pos (PIB) 32 28 33 34 27 30
PIA-15 18 21 17 14 20 24PIA-12 13 15 13 11 15 17PIA-14 11 14 13 14 13 13PIA-16 23 21 25 27 29 28PIA-17 30 38 28 31 26 36PIA-22 60 80 69 67 65 64PIA-30 78 104 91 90 86 87PIA-31 75 77 63 71 82 77PIA-32 97 123 112 98 97 95PIA-33 126 132 100 100 122 128PIA-34 110 91 103 97 100 93PIA-19 53 58 49 45 66 51PIA-21 55 56 47 43 65 42PIA-23 65 74 68 67 72 76PIA-24 55 50 70 59 48 58PIA-27 69 60 52 54 77 75PIA-13 11 11 14 10 14 10PIA-18 31 31 36 28 34 26PIA-20 39 50 30 52 44 34PIA-25 73 69 64 64 73 65PIA-26 63 82 62 65 63 65PIA-28 70 86 85 86 80 82PIA-29 80 97 85 81 69 62PIA-35 139 144 105 145 134 124
SoroNCPanaftosa Teste de Triagem (PP)b
Tempo transcorrido (meses)
a ver Tabela 04 e resultados item 4.2.2 b PP = os valores representam a média de duplicatas (CV ≤ 10%).
55
4.2.4. Reprodutibilidade dos valores de referência em outros laboratórios (PIBs e PIA)
Considerando que os soros PIBs e o PIA, são ferramentas para a harmonização e
conseqüentemente devem ser utilizados por outros grupos trabalho, particularmente
em laboratórios de referência, foi realizado um estudo para a avaliação da
reprodutibilidade do valor de referência dos soros, no sistema índice, em três
laboratórios da América do Sul. Os laboratórios escolhidos utilizam rotineiramente o
sistema em suporte aos programas de controle e sorovigilância da FA. Resultados
representando a média de seis determinações obtidas no NCPanaftosa Teste de
Triagem, como descrito no item 3.5.1.3 são mostrados na Tabela 06. Os CVs
calculados para cada soro positivo que compõe o painel em cada laboratório
demonstraram, em todos os casos valores dentro da variação esperada de
repetibilidade interplaca. Da mesma forma, os CVs entre as médias dos resultados
obtidos nos três laboratórios, incluindo ou não o laboratório do PANAFTOSA,
apresentaram resultados satisfatórios em todos os casos.
Os resultados relatados para o teste de EITB apresentaram concordância com os
resultados obtidos no PANAFTOSA (dado não mostrado).
Em relação aos soros PIBs ressaltamos que os mesmos foram fornecidos
liofilizados aos laboratórios participantes e que o processo de reconstituição não
gerou falta de reprodutibilidade.
Os resultados aqui descritos corroboram, tanto para os soros PIBs como para os
soros do PIA os resultados de referência obtidos no PANAFTOSA, pois não foi
observada nenhuma variação ou tendência contrária nos resultados obtidos pelos
laboratórios quando comparados com os valores obtidos no PANAFTOSA.
56
Tabela 06 – Resultados dos soros PIBs e PIA obtido em Laboratórios Nacionais
de Referência
PPb CVc PPb CVc PPb CVc PPf CVg
Neg (PIB) 0 0 - 0 - 1 - 0 - 0 -Fraco Pos (PIB) 32 35 10 28 14 30 12 31 12 31 10Forte Pos (PIB) 118 122 6 116 5 124 2 121 3 120 3
PIA- 1 0 1 - 0 - 1 - 1 - 1 -PIA- 2 -1 0 - 0 - 1 - 0 - 0 -PIA- 3 0 0 - 1 - 0 - 0 - 0 -PIA- 4 3 4 - 4 - 4 - 4 - 4 -PIA- 5 0 -1 - 0 - 0 - 0 - 0 -PIA- 6 3 2 - 2 - 3 - 2 - 2 -PIA- 7 0 -1 - 0 - 0 - 0 - 0 -PIA- 8 -1 -1 - 0 - 0 - 0 - 0 -PIA- 9 1 -1 - 0 - 0 - 0 - 0 -
PIA- 10 5 7 - 8 - 4 - 6 - 6 -PIA- 15 18 17 6 17 15 15 17 16 6 17 7PIA- 12 13 9 14 12 19 9 17 10 19 11 19PIA- 14 11 12 7 13 11 13 7 13 6 12 9PIA- 16 23 28 7 26 12 29 5 27 4 26 9PIA- 17 30 37 8 38 9 34 10 36 5 35 11PIA- 22 60 62 11 57 9 60 3 60 4 60 3PIA- 30 78 78 11 78 5 91 4 82 9 81 8PIA- 31 75 94 7 79 10 86 8 86 9 83 10PIA- 32 97 89 7 101 13 81 7 90 11 92 9PIA- 33 126 143 7 140 2 137 8 140 2 136 5PIA- 34 110 135 3 132 7 134 5 134 1 128 9PIA- 19 53 63 8 50 9 65 11 59 14 57 13PIA- 21 55 65 4 56 8 68 10 63 10 61 11PIA- 23 65 70 17 67 5 65 9 67 4 67 4PIA- 24 55 71 8 66 5 73 9 70 5 66 12PIA- 27 69 73 3 65 7 69 5 69 5 69 4PIA- 13 11 13 13 12 20 11 14 12 9 12 8PIA- 18 31 30 6 33 14 28 6 30 7 31 6PIA- 20 39 42 5 48 9 41 2 44 9 43 9PIA- 25 73 72 5 77 5 70 8 73 5 73 4PIA- 26 63 52 5 66 8 46 12 55 19 57 16PIA- 28 70 68 3 69 9 54 16 63 13 65 11PIA- 29 80 91 7 88 4 75 7 84 10 83 9PIA- 35 139 163 4 148 3 190 5 167 13 160 14
Laboratórios Nacionais 1 2 3Soro
Média PPd CVeValor Ref (PP) PANAFTOSAa LNs
Panaftosa +
a Ver tabela 04 b Média das seis determinações c CV – Coeficiente de variação do laboratório d Média dos valores médios obtidos nos três laboratórios e CV – Coeficiente de variação interlaboratório f Média dos valores médios obtidos em cada laboratório, incluindo os valores de
referência do PANAFTOSA. g CV – Coeficiente de variação interlaboratório, incluindo os valores de referência do
PANAFTOSA. LN – Laboratórios nacionais de referência
57
4.3. Aplicações dos Padrões Internacionais (PIBs e PIA)
4.3.1. Desempenho comparativo de imunoensaios
Um dos principais mandatos da OIE é a regulamentação do comércio de
animais e seus derivados entre os países membros. Com esse objetivo a OIE tem a
responsabilidade de recomendar os testes de diagnóstico utilizados e identificar para
cada doença os testes que apresentam alto grau de confiabilidade categorizando-os
como testes índices.
A disponibilidade de vários kits comerciais para PNCs tem gerado a
necessidade de avaliação e comparação do desempenho destes frente ao teste índice.
Estudos de comparação de testes foram realizados, a nível internacional, com
um elevado número de soros, e algumas vezes, os resultados obtidos foram
contraditórios. Para simplificar esse processo e garantir que avaliações corretas sejam
realizadas, é essencial que o teste índice disponibilize painéis e soros em menor
número capazes de apontar diferenças em sensibilidade (analítica e diagnóstica). O
parâmetro de especificidade, por ser intrínseco a cada teste, necessita de um maior
número de soros para avaliação e normalmente, a falta de especificidade é suficiente
para excluir o teste do mercado, principalmente quando esse é aplicado em áreas de
baixa prevalência. Dessa forma, as ferramentas descritas neste trabalho estão
destinadas principalmente a avaliação de sensibilidade analítica e diagnóstica.
Para comprovar a eficácia dos PIBs e do PIA em discriminar diferenças de
sensibilidade foram utilizados 4 kits ELISA para PNCs comercialmente disponíveis,
um teste “in house” e o tests luminex em desenvolvimento.
Cabe ressaltar que as características de desempenho dos testes comercialmente
utilizados nesse trabalho não são descritas pelos fabricantes em seus instrutivos de
uso. Apenas o teste da empresa UBI, indica uma sensibilidade de 94% quando soros
coletados de animais entre 10 e 14 dias após infecção experimental são testados
58
4.3.1.1. Testes em uso (ELISAs comerciais e “in house”)
4.3.1.1.1. Sensibilidade analítica
Para a avaliação da sensibilidade analítica os soros positivos PIBs liofilizados
foram reconstituídos e diluídos em base 2 utilizando como matriz o soro bovino
negativo PIB e testados simultaneamente na Prova de triagem do PANAFTOSA e nos
ELISAs da CEDI, Svanova, UBI e IDEXX.
Os dois soros foram analisados separadamente. Para o soro forte positivo as
últimas diluições que resultaram positivas nos testes do PANAFTOSA, CEDI,
IDEXX, Svanova e UBI foram 1:32; 1:32; 1:16; 1:8 e 1:2, respectivamente (Figura
11). Logo, os kits podem ser categorizados, segundo a sensibilidade analítica, em três
grupos. Os que apresentam maior sensibilidade analítica (PANAFTOSA e CEDI), os
kits com uma sensibilidade intermediária (IDEXX e Svanova) e o kit com baixa
sensibilidade analítica (UBI).
Para o soro fraco positivo as maiores diluições que resultaram positivas nos
testes do PANAFTOSA, IDEXX e Svanova foram 1:2; 1:2; e 1:1, respectivamente.
Esse soro, mesmo antes da diluição, não foi detectado como positivo nos kits da CEDI
e da UBI. Entretanto, deve ser ressaltado que para o kit da CEDI o soro fraco positivo
apresentou reatividade próxima ao ponto de corte da prova PP igual a 41 (esse valor
corresponde a média de 6 determinações com CV igual 4%). Já para o kit da UBI a
reatividade apresentada pelo soro fraco positivo (T/C=0,2) está muito abaixo do valor
do ponto de corte da prova (T/C=1) ± 20%. Dessa forma, considerando os resultados
do soro fraco os kits do PANAFTOSA e IDEXX apresentam maior sensibilidade
analítica, seguidos pelo teste da Svanova com sensibilidade intermediária e UBI que
apresentam menor sensibilidade analítica. O teste da CEDI como pode ser visto na
Figura 11, mesmo não detectando o soro fraco positivo puro apresenta um
comportamento que parece se assemelhar mais ao teste da Svanova que ao teste da
UBI.
A Figura 11 apresenta a curva de diluição dos soros PIBs em cada kit utilizado e
uma tabela indicando as últimas diluições reconhecidas como positivas, em cada kit,
para cada soro.
59
Panaftosa
0102030405060708090
100110120
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
Forte Pos Fraco Pos
CEDI
-20-10
0102030405060708090
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PI
Forte Pos Fraco Pos
Svanova
-20-10
0102030405060708090
100110120
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
Forte Pos Fraco Pos
UBI
0
1
2
3
4
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
T/C
Forte Pos Fraco Pos
IDEXX
-51535557595
115135155175
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
Forte Pos Fraco Pos
Soro Panaftosa CEDI IDEXX Svanova UBIForte Pos (PIB) 1/32 1/32 1/16* 1/8 1/2Fraco Pos (PIB) 1/2 - 1/2* 1/1 -
Figura 11 – Curva de diluição em base 2 dos soros PIBs. Valor de reatividade da diluição do soro apresentada em porcentagem de inibição (PI) para o teste da CEDI; Valor de DO do soro teste/valor de corte (T/C) para o teste da UBI e porcentagem de positividade (PP) para os demais. Pontos de corte de cada teste. Últimas diluições detectadas como positivas. Diluições identificadas como indeterminadas no teste da IDEXX. A tabela apresenta a última diluição identificada como reativa em cada teste. Indica para cada soro a maior diluição com resultado positivo * Indica que a próxima diluição foi classificada como indeterminada no teste da IDEXX – Resultado negativo obtido para o soro não diluído.
60
Para ampliar a análise da sensibilidade analítica comparativa incluindo um
maior número de soros possibilitando estudar a incidência das eventuais diferenças
intrínsecas de cada soro assim como a relação da sensibilidade analítica com o
formato de ELISA adotado por cada kit, os soros positivos do PIA foram
seriadamente diluídos em base 2 e estudados nos 4 kits comercialmente disponíveis
no PANAFTOSA (CEDI, IDEXX, Svanova e UBI). Esta análise também possibilitou
avaliar melhor a correlação entre as sensibilidades analítica e diagnóstica.
Para facilitar a análise os soros foram agrupados segundo a reatividade obtida
no teste de triagem do PANAFTOSA em dois grupos (PP < 60 e PP ≥ 60) e foram
construídas curvas de diluição para cada soro. As curvas de cada soro em cada teste
avaliado estão demonstradas nas Figuras 12 e 13.
Os soros com PP acima de 60 no teste de triagem do PANAFTOSA
demonstraram sensibilidade analítica semelhante para os kits do PANAFTOSA e
CEDI, uma sensibilidade analítica intermediária para IDEXX, seguida pela Svanova e
uma menor sensibilidade para o kit da UBI. As curvas de diluição de cada soro em
cada teste estão nos gráficos da Figura 12.
61
Panaftosa
020406080
100120
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-22 PIA-23 PIA-25 PIA-26PIA-27 PIA-28 PIA-29
Cedi
0
20
40
60
80
100
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PI
PIA-22 PIA-23 PIA-25 PIA-26PIA-27 PIA-28 PIA-29
Svanova
020406080
100120140
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-22 PIA-23 PIA-25 PIA-26PIA-27 PIA-28 PIA-29
UBI
0123456
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
T/C
PIA-22 PIA-23 PIA-25 PIA-26PIA-27 PIA-28 PIA-29
IDEXX
04080
120160200240
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-22 PIA-23 PIA-25 PIA-26PIA-27 PIA-28 PIA-29
Panaftosa
020406080
100120140160
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-30 PIA-31 PIA-32PIA-33 PIA-34 PIA-35
Cedi
0
20
40
60
80
100
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
DiluiçõesPI
PIA-30 PIA-31 PIA-32PIA-33 PIA-34 PIA-35
Svanova
020406080
100120140
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-30 PIA-31 PIA-32PIA-33 PIA-34 PIA-35
UBI
012345678
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
T/C
PIA-30 PIA-31 PIA-32PIA-33 PIA-34 PIA-35
IDEXX
020406080
100120140160180200
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-30 PIA-31 PIA-32PIA-33 PIA-34 PIA-35
62
Soro Panaftosa CEDI IDEXX Svanova UBIPIA-22 1/32 1/64 1/16 1/8 1/2PIA-23 1/8 1/8 1/2 1/1 1/2PIA-25 1/8 1/16 1/4* 1/4 1/2PIA-26 1/64 1/16 1/64* 1/32 1/1PIA-27 1/8 1/4 1/1* 1/1 1/2PIA-28 1/64 1/64 1/64* 1/32 1/4PIA-29 1/32 1/16 1/16* 1/8 1/2PIA-30 1/32 1/32 1/16 1/16 1/8PIA-31 1/8 1/16 1/2 1/2 1/2PIA-32 1/64 1/64 1/32* 1/32 1/8PIA-33 1/32 1/32 1/2 1/4 1/4PIA-34 1/16 1/8 1/2* 1/4 1/1PIA-35 1/32 1/32 1/2 1/4 1/4
Figura 12 – Curva de diluição em base 2 dos soros PIA. Valor de reatividade da diluição do soro apresentada em porcentagem de inibição (PI) para o teste da CEDI; Valor de DO do soro teste/valor de corte (T/C) para o teste da UBI e porcentagem de positividade (PP) para os demais. Pontos de corte de cada teste. A tabela apresenta a última diluição identificada como reativa em cada teste. Indica para cada soro a maior diluição com resultado positivo * Indica que a próxima diluição foi classificada como indeterminada no teste da IDEXX – Resultado negativo obtido para o soro não diluído.
Na avaliação das curvas de diluição utilizando soros com reatividade baixa foi
possível observar que alguns soros não diluídos não foram identificados como
reativos por alguns kits.
Seguindo às tendências já apresentadas os soros dessa categoria identificam
uma maior sensibilidade para o teste de triagem do PANAFTOSA, seguido pelo teste
da CEDI e IDEXX. Os kits da Svanova e UBI apresentaram menor sensibilidade. A
curva de diluição desses soros e uma tabela resumindo a sensibilidade analítica estão
apresentadas na Figura 13.
63
Panaftosa
0
10
20
30
40
50
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-12 PIA-13 PIA-14PIA-15 PIA-16
Cedi
0
20
40
60
80
100
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PI
PIA-12 PIA-13 PIA-14PIA-15 PIA-16
Svanova
0
20
40
60
80
100
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-12 PIA-13 PIA-14PIA-15 PIA-16
UBI
0
1
2
3
4
5
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
T/C
PIA-12 PIA-13 PIA-14PIA-15 PIA-16
IDEXX
0
20
40
60
80
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-12 PIA-13 PIA-14PIA-15 PIA-16
Panaftosa
01020304050607080
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-17 PIA-18 PIA-19PIA-20 PIA-21 PIA-24
Cedi
0
20
40
60
80
100
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PI
PIA-17 PIA-18 PIA-19PIA-20 PIA-21 PIA-24
IDEXX
0
20
40
60
80
100
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8Diluições
PP
PIA-17 PIA-18 PIA-19PIA-20 PIA-21 PIA-24
Svanova
0
20
40
60
80
100
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
PP
PIA-17 PIA-18 PIA-19PIA-20 PIA-21 PIA-24
UBI
0
1
2
3
4
5
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
Diluições
T/C
PIA-17 PIA-18 PIA-19PIA-20 PIA-21 PIA-24
64
Soro Panaftosa CEDI IDEXX Svanova UBIPIA-12 1/1 - 1/1 - -PIA-13 1/1 - - - 1/1PIA-14 1/2 1/2 1/1 - -PIA-15 1/1 1/1 1/1 - -PIA-16 1/1 - 1/1 - -PIA-17 1/2 1/1 1/1 - 1/1PIA-18 1/4 1/16 - 1/2 1/2PIA-19 1/4 1/4 1/1* 1/2 -PIA-20 1/4 1/4 1/1 1/1 1/1PIA-21 1/4 1/4 1/1* 1/1 1/1PIA-24 1/8 1/4 1/1 1/1 1/2
Figura 13 – Curva de diluição em base 2 dos soros PIA. Valor de reatividade da diluição do soro apresentada em porcentagem de inibição (PI) para o teste da CEDI; Valor de DO do soro teste/valor de corte (T/C) para o teste da UBI e porcentagem de positividade (PP) para os demais. Pontos de corte de cada teste. A tabela apresenta a última diluição identificada como reativa em cada teste. Indica para cada soro a maior diluição com resultado positivo * Indica que a próxima diluição foi classificada como indeterminada no teste da IDEXX – Resultado negativo obtido para o soro não diluído.
A avaliação das curvas de titulação dos soros do PIA em todos os kits,
principalmente os soros de alto título, permitiu observar o padrão de redução de
reatividade de cada teste. Cabe ressaltar, que o kit da CEDI apresenta um maior
número de soros que sustentam a reatividade nas diluições seriadas, isto é, esses soros
apresentam uma queda de reatividade de forma menos acentuada. Essa característica
pode estar associada ao formato do kit (ELISA competitivo/bloqueio). Dos testes
analisados, o teste da CEDI é o único que apresenta este formato competitivo, todos
os demais são ensaios indiretos. Esse parâmetro deve ser cuidadosamente considerado
ante qualquer extrapolação sobre a expectativa de sensibilidade do teste baseado na
análise de sensibilidade analítica.
Os resultados com os soros positivos do PIA corroboram as tendências
observadas com os soros PIBs, isto é, os kits podem ser divididos em três grupos os
mais sensíveis (PANAFTOSA, CEDI e IDEXX), os de sensibilidade intermediária
(Svanova) e o grupo com baixa sensibilidade (UBI).
65
4.3.1.1.2. Sensibilidade diagnóstica relativa
Os resultados de sensibilidade analítica obtidos até o momento indicam
diferenças no comportamento dos kits. Nesse contexto, foi relevante o estudo da
sensibilidade diagnóstica relativa já que este parâmetro é relevante quando o objetivo
do ensaio está direcionado a aplicação de uma população para detectar uma
determinada condição de infecção. Como anteriormente explicado, a sensibilidade
diagnóstica de um teste é a habilidade do mesmo em detectar animais ou indivíduos
com a condição de interesse em uma população ou grupo e é expressa em
porcentagem. A sensibilidade diagnóstica está mais relacionada com a habilidade de
detectar a substância alvo em uma amostra processada a partir de um indivíduo, que
apresenta a condição, do que com a própria habilidade do teste de detectar baixas
concentrações do analito. Nesse contexto, esse parâmetro reflete melhor o
desempenho que o teste pode apresentar a campo. A seleção de soros para a
constituição do PIA incluiu soros abrangendo um amplo espectro de reatividade de
forma a melhor avaliar a sensibilidade diagnóstica comparativa. Com o PIA foram
testados quatro kits comercialmente disponíveis (CEDI; IDEXX, Svanova; UBI) e um
teste “in-house” (IZSLER). As informações detalhadas de cada teste e as condições de
avaliação dos soros estão descritos em nos itens 3.3 e 3.4.
A Tabela 07 apresenta os dados obtidos em cada ELISA.
Os soros de animais negativos tanto de áreas livres (AL) quanto os de áreas
livres com intenso programa de vacinação (ALV) não apresentaram reatividade em
nenhum dos testes utilizados, com exceção do soro PIA-5 que no kit da IDEXX foi
avaliado como suspeito.
A análise dos soros de animais experimentalmente infectados ou
conhecidamente expostos/infectados em áreas afetadas, apresentando um amplo
espectro de reatividade no teste índice, se mostrou de grande relevância para
discriminar a sensibilidade diagnóstica relativa nos referidos kits.
Quatro dos cinco testes avaliados não detectaram pelo menos dois soros dos 10
soros coletados de animais logo após o foco (F), todos apresentando resultado
positivo nos testes de triagem e confirmatório do PANAFTOSA e no teste da IDEXX.
O teste de IZSLER e CEDI apresentaram resultado negativo para os soros PIA-12 e
PIA-16. SVANOVA e UBI apresentaram resultado negativo em quatro amostras
66
(PIA-12, PIA-14 e PIA-16 em ambos os testes; PIA-17 em SVANOVA e PIA-34 em
UBI).
Dos soros coletados de bovinos em áreas endêmicas (E), um soro (PIA-23)
apresentou resultado negativo em SVANOVA e dois apresentaram resultado negativo
em UBI. Todos os soros nesse grupo foram positivos no sistema do PANAFTOSA,
como também nos testes da CEDI, IDEXX e IZSLER.
Os sete soros pertencentes ao grupo dos animais não vacinados e infectados
(Exp Inf) apresentaram resultado positivo na CEDI, IZSLER e no sistema do
PANAFTOSA. Para esse grupo resultados negativos foram observados para os soros
PIA-18 e PIA-20 nos testes da Svanova e UBI, respectivamente. O soro PIA-18 foi
classificado como suspeito no kit IDEXX.
O soro do animal vacinado e desafiado (PIA-13), com resultado positivo no
sistema do PANAFTOSA e no teste da UBI foi classificado como suspeito no teste da
IDEXX e apresentou resultado negativo nos testes da CEDI, IZSLER e SVANOVA.
A partir dos resultados apresentados pode-se concluir que os testes apresentam
desempenho diferente com relação à sensibilidade diagnóstica. Os testes da CEDI,
IDEXX e IZSLER demonstraram sensibilidade próxima ao observado no teste índice.
Dos 23 soros de animais expostos/infectados mencionados acima, todos positivos nos
ensaios de triagem e confirmatório do PANAFTOSA, 21 foram identificados como
reativos e dois foram classificados como suspeitos no teste da IDEXX e 20 foram
positivos nos testes de IZSLER e CEDI. Dentre os quatro soros que apresentaram
resultado negativo em pelo menos 1 dos 3 ensaios (CEDI, IDEXX, IZSLER), o soro
PIA-13 de um animal experimentalmente desafiado e sangrado a 11 dias após o
desafio apresentou resultado suspeito no kit da IDEXX e negativo nos kits CEDI e
IZSLER. Os soros PIA-12 e PIA-16, coletados de animais logo após o foco (em
fazendas onde a maioria dos animais apresentou sinais clínicos), não foram
identificados pela CEDI e IZSLER, mas apresentaram resultado positivo no teste da
IDEXX. Para o soro PIA-12 deve ser ressaltado que o teste de IZSLER apresentou
reatividade aumentada quando comparado com os valores obtidos para a população
negativa. O soro PIA-18, de um animal experimentalmente infectado, foi classificado
como suspeito no teste da IDEXX e foi positivo no teste da CEDI e IZSLER.
Os soros não identificados pela CEDI, IDEXX e IZSLER estavam limitados aos
que apresentaram baixa reatividade no sistema índice. Contrariamente, os ensaios de
Svanova e UBI não somente falharam em detectar os soros de baixo título, mas
67
também os soros com intermediário e alto título de anticorpos, demonstrando uma
baixa sensibilidade diagnóstica. O ensaio da SVANOVA apresentou resultado
negativo para sete dos 23 soros. O teste da UBI também falhou em detectar sete soros,
mas detectou como positivo o soro de baixo título do animal desafiado (PIA-13).
O soro PIA-15 de um animal imunizado com uma vacina experimental com
limitada purificação, apresentou resultado positivo nos testes de triagem e
confirmatório do PANAFTOSA, na CEDI, IDEXX e IZSLER e apresentou resultado
negativo no teste da SVANOVA e da UBI. Da mesma forma, apresentar reatividade
positiva para esse soro indica alta sensibilidade, pois, os anticorpos encontrados são
provavelmente provenientes de indução gerada por impurezas de antígenos PNCs nas
vacinas, que são produzidas por inativação de suspensão de células infectadas com
VFA que quando não devidamente purificadas podem carrear traços de antígenos
PNCs, os quais atuam na replicação do vírus
68
Tabela 07 – Resultados obtidos utilizando o PIA para a comparação de testes
Sistema NCPanaftosabSoro Origema
Triagem (PP) ConfirmatórioCedi* (PI)
IDEXX* (PP)
Svanova* (PP)
UBI* (T/C)
IZSLER** (PP)
PIA-1 AL 0 Neg -8 12 2 0.1 1PIA-2 AL -1 Neg -6 17 -1 0.1 0PIA-3 AL 0 Neg -5 17 -2 0.1 0PIA-4 AL 3 Neg 13 18 11 0.1 2PIA-5 ALV 0 Neg 18 26 -4 0.1 2PIA-6 ALV 3 Neg 38 18 7 0.2 4PIA-7 ALV 0 Neg 22 6 -6 0.1 2PIA-8 ALV -1 Neg 13 13 -5 0.2 2PIA-9 ALV 1 Neg 16 15 -5 0.1 0
PIA-10 ALV 5 Neg 14 9 0 0.1 1PIA-15 Exp Vac 18 Pos 61 31 16 0.2 11PIA-12 F 13 Pos 34 33 9 0.1 9PIA-14 F 11 Pos 65 49 17 0.3 29PIA-16 F 23 Pos 27 39 -4 0.3 1PIA-17 F 30 Pos 58 53 30 1.2 11PIA-22 F 60 Pos 86 111 94 2.8 111PIA-30 F 78 Pos 92 201 113 5.2 116PIA-31 F 75 Pos 86 62 59 2.3 59PIA-32 F 97 Pos 87 178 119 5.0 123PIA-33 F 126 Pos 90 107 97 3.9 74PIA-34 F 110 Pos 77 63 66 0.7 64PIA-19 E 53 Pos 76 41 64 0.7 32PIA-21 E 55 Pos 77 42 63 0.7 27PIA-23 E 65 Pos 93 78 46 1.6 30PIA-24 E 55 Pos 88 49 54 2.1 20PIA-27 E 69 Pos 88 38 49 2.1 21PIA-13 Exp Vac Des 11 Pos 27 21 8 1.1 6PIA-18 Exp Inf 31 Pos 78 26 47 2.1 51PIA-20 Exp Inf 39 Pos 75 52 50 0.9 54PIA-25 Exp Inf 73 Pos 86 141 82 2.3 109PIA-26 Exp Inf 63 Pos 83 236 98 1.5 107PIA-28 Exp Inf 70 Pos 87 245 129 3.5 129PIA-29 Exp Inf 80 Pos 78 116 92 3.4 113PIA-35 Exp Inf 139 Pos 94 86 110 4.8 87
Ponto de corte Pos ≥ 10 Pos ≥ 50 Pos ≥ 30c Pos ≥ Pos ≥ 1 Pos ≥ 10 Os resultados estão expressos em porcentagem de positividade (PP) comparada ao controle positivo, porcentagem de inibição (PI) comparada ao controle negativo ou OD do soro teste / valor do soro ponto de corte (T/C). Os números sombreados indicam os resultados não concordantes com o teste de referência. a Para detalhes ver Tabela 01 b Resultados de referência ver Tabela 04 c Amostras suspeitas 20 ≤ PP ≥ 30 * media de 6 determinações; ** media de 2 determinações
69
4.3.1.2. Teste em desenvolvimento (Luminex)
4.3.1.2.1. Luminex – “Liquid array” – desenvolvido como Multiplex
A tecnologia de Luminex surge como uma proposta de desenvolvimento de um
imunoensaio multiplex, isto é, capaz de detectar simultânea e individualmente
anticorpos contra dois ou mais PNCs em forma semi-quantitativa. O ensaio multiplex
aqui avaliado se baseia na utilização de quatro PNCs, 3ABC, 3B, 3A e 3D, sendo a
3ABC uma proteína recombinante e os demais peptídeos sintéticos. Os antígenos são
adsorvidos em diferentes microesferas de poliestireno, cada uma florescendo em um
comprimento de onda distinto. Os anticorpos específicos para cada antígeno são
capturados e os imunocomplexos detectados com um anticorpo conjugado com
biotina. Para a revelação é utilizada streptavidina conjugada a ficoeritrina. A
irradiação das microesferas com dois comprimentos de ondas de raio laser, permite a
identificação e quantificação. Dessa forma, o ensaio de multiplex está sendo
desenvolvido pela Universidade da Califórnia em parceria com o Centro Nacional
para Doenças Animais Exógenas do Canadá como um teste confirmatório alternativo
capaz de quantificar os anticorpos contra PNCs no soro.
Para a análise mais extensa do teste Luminex e a eventual determinação do
ponto de corte da prova foram selecionados, além do PIA, dois painéis adicionais de
soros, o PIC 3 constituído de 121 soros de animais verdadeiramente positivos e o PAL
1 constituído de 295 soros verdadeiramente negativos.
Os painéis foram utilizados para avaliar o ensaio multiplex. Os soros foram
processados e os valores de intensidade média de fluorescência (IMF) utilizados para
a construção de gráficos de distribuição de freqüência. Esse tipo de análise permite
avaliar os resultados e eventualmente identificar a necessidade de ajuste no teste
prévio a determinação do ponto de corte. A Figura 13 apresenta os gráficos de
distribuição da IMF obtida para os soros dos painéis PIC 3 e PAL 1 em cada antígeno
utilizado.
Como pode ser observado nos gráficos de distribuição (Figura 13) na
configuração utilizada, nenhum dos antígenos estudados permitiu uma separação clara
entre os soros verdadeiramente positivos e os negativos, que possibilitasse a definição
de um ponto de corte sem perdas expressivas de sensibilidade e especificidade.
70
Observa-se nos gráficos uma superposição dos valores de IMF para os soros positivos
e negativos que se apresenta mais crítica no caso dos antígenos 3B e 3D.
Antígeno 3A
0,02,04,06,08,0
10,012,014,016,018,020,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 910
,5 12 13,5 15 16
,5 18 60 120
180
IMF
Porc
enta
gem
PAL 1 PIC 3
A Antígeno 3B
0,02,04,06,08,0
10,012,014,016,018,020,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 910
,5 12 13,5 15 16
,5 18 60 120
180
IMF
Porc
enta
gem
PAL 1 PIC 3
B
Antígeno 3D
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 910
,5 12 13,5 15 16
,5 18 60 120
180
IMF
Porc
enta
gem
PAL 1 PIC 3
C Antígeno 3ABC
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 910
,5 12 13,5 15 16
,5 18 60 120
180
IMF
Porc
enta
gem
PAL 1 PIC 3
D
Figura 13 – Curva de distribuição dos soros dos painéis PIC 3 e PAL 1 no teste Luminex. As barras indicam para cada intensidade média de fluorescência (IMF) a porcentagem de soros. Barras vermelhas PIC 3 (verdadeiros positivos) e barras azuis PAL 1 (verdadeiros negativos)
Para o antígeno 3B, 99,7 % da população negativa (PAL 1) apresentou
reatividade menor ou igual a 10,5 IMF. Contudo, 72,7 % da população
verdadeiramente positiva (PIC 3) também apresentou reatividade menor ou igual a
10,5 IFM, o que inviabilizou a definição do ponto de corte da prova sem perda de
sensibilidade (gráfico B - Figura 13).
O antígeno 3D também não demonstrou capacidade para discriminar as duas
populações. Aproximadamente 100 % da população negativa (PAL 1) e 83,5% da
população positiva (PIC 3) apresentaram distribuições de IMF até 10,5 (gráfico C –
Figura 13).
71
Entretanto, os antígenos 3A e 3ABC demonstraram ser mais promissores,
apresentando 48 % e 42,1 % da população positiva, respectivamente, sobrepostas à
aproximadamente 100% da população negativa. Ambos precisam de ajustes para uma
adequada definição de ponto de corte entre os soros positivos e negativos.
Da mesma forma a utilização do PIA permitiu avaliar o teste Luminex e
concluir que o mesmo não apresenta sensibilidade e especificidade suficiente para
iniciar um processo de validação e deve ser reajustado. Apesar do painel PIA estar
destinado a avaliação de sensibilidade a inclusão de soros negativos no painel é
fundamental para verificar, principalmente em ensaios novos, a capacidade de
distinção de soros positivos e negativos.
A Figura 14 apresenta os gráficos de distribuição da IMF obtida para os soros
do PIA em cada antígeno utilizado.
Antígeno 3A
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 910
,5 12 13,5 15 16
,5 18 60 120
180
IMF
Porc
enta
gem
PIA Neg PIA Pos
A Antígeno 3B
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 910
,5 12 13,5 15 16
,5 18 60 120
180
IMF
Porc
enta
gem
PIA Neg PIA Pos
BB
Antígeno 3D
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 910
,5 12 13,5 15 16
,5 18 60 120
180
IMF
Porc
enta
gem
PIA Neg PIA Pos
C Antígeno 3ABC
0,05,0
10,015,020,025,030,035,040,045,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 910
,5 12 13,5 15 16
,5 18 60 120
180
IMF
Porc
enta
gem
PIA Neg PIA Pos
D
Figura 14 – Curva de distribuição dos soros do painel de avaliação (PIA) no teste Luminex. As barras indicam para cada intensidade média de fluorescência (IMF) a porcentagem de soros. Barras vermelhas soros positivos do PIA e barras azuis soros negativos do PIA
Para o antígeno 3B, 100% da população negativa apresentou reatividade menor
ou igual a 10,5 IMF. Contudo, 54,2 % da população verdadeiramente positiva também
72
apresentou reatividade menor ou igual a 10,5 IMF, o que inviabilizou a definição do
ponto de corte da prova sem perda de sensibilidade (gráfico B - Figura 14).
O antígeno 3D também não demonstrou capacidade para discriminar as duas
populações. Toda a população negativa (100%) e 62,5% da população positiva
apresentaram distribuições de IMF até 10,5 (gráfico C – Figura 14).
Já os antígenos 3A e 3ABC também demonstraram ser mais promissores
quando analisados com os soros do PIA. E, apresentaram 41,7 % e 37,5 % da
população positiva, respectivamente, com IMF abaixo de 10,5.
Os resultados da Figura 14 apontam a necessidade de ajuste na prova Luminex
prévio ao processo de validação e a eficácia do PIA em apontar a necessidade de
recalibração do ensaio.
4.3.2. Teste de proficiência
Considerando a amplitude e importância da utilização dos testes PNCs
principalmente para respaldar a ausência de circulação viral e o movimento de
animais, com a conseqüente abertura de mercados, é necessário demonstrar que os
laboratórios que os executam geram resultados de alta confiabilidade. Nesse contexto,
tão importante quanto dispor de ferramentas de diagnóstico robustas e confiáveis é
necessário garantir que os laboratórios responsáveis por utilizar essas metodologias
estejam trabalhando de forma adequada.
Para fortalecer a harmonização dos resultados regionais, o laboratório do
PANAFTOSA promove, como apoio à implementação de normas de qualidade,
exercícios interlaboratoriais de proficiência. O painel PIA foi utilizado para avaliar o
desempenho dos laboratórios que utilizam os testes do PANAFTOSA (triagem e
confirmatório), nos programas de vigilância ativa. Para esse estudo o painel foi
codificado e fornecido aos laboratórios nacionais de referencia da América do Sul
Os critérios para a análise dos resultados estão detalhados no item 3.4.2.2.
A Tabela 08 indica a porcentagem de soros com resultado satisfatório em cada
critério avaliado para a prova de triagem. Foi considerado satisfatório até 95% de
acerto
73
Tabela 08 – Resultado do Teste de Proficiência utilizando o PIA no Teste de
Triagem do PANAFTOSA
A B C D E F Gacertos/n acertos/n acertos/n acertos/n acertos/n acertos/n acertos/n
Categoria 33/34 (97%) 34/34 (100%) 34/34 (100%) 34/34 (100%) 32/34 (94%) 34/34 (100%) 34/34 (100%)intra-placa 68/72 (94%) 48/48* (100%) 70/72 (97%) 71/72 (99%) 68/72 (94%) 71/72 (99%) 69/72 (96%)inter-placa 23/24 (96%) 24/24 (100%) 24/24 (100%) 20/24 (83%) 21/24 (88%) 24/24 (100%) 23/24 (96%)
Laboratórios
Repetibilidade
I-ELISA 3ABC
* O laboratório B apresentou resultado de 2 placas
O primeiro critério para a avaliação do desempenho dos laboratórios foi a
correta categorização dos soros. Nesse caso, foram aceitas mudanças de categorias
para os soros que se encontram na zona cinza, próximos ao ponto de corte da prova,
desde que o valor informado não tenha ultrapassado ± 20% do valor de referência.
Cinco dos sete laboratórios que participaram apresentaram 100% de acerto na
classificação dos soros (categoria) e os laboratórios A e E apresentaram 97% e 94%,
respectivamente. Nestes casos, os erros estiveram relacionados à incorreta
categorização dos soros positivos PIA-12 e PIA-13, com valores de PP =13 e PP = 11,
respectivamente.
A inclusão de soros de baixa reatividade no teste de proficiência é relevante para
lograr uma análise mais detalhada das diferenças de procedimento nos laboratórios.
Pequenas variações nos mesmos procedimentos não seriam detectadas se as análises
de categoria se limitassem a soros com valores extremos de reatividade.
Em relação à repetibilidade intra-placa, os mesmos cinco laboratórios que
apresentaram bom desempenho na classificação dos soros, apresentaram valores de
concordância acima de 95%. Novamente os laboratórios A e E obtiveram
porcentagem menor de acerto (94%). Ambos laboratórios totalizaram 4 valores de CV
intra-placa acima do valor aceitável (10%) para diferentes soros.
Para a repetibilidade inter-placa, somente os laboratórios D e E apresentaram
valores concordância abaixo de 95%. O laboratório D apresentou valores de CV inter-
placa acima do recomendável, isto é maior que 20% em 4 oportunidades. Já o
laboratório E apresentou 3 soros, todos eles com baixo título de anticorpos, com CV
inter-placa acima de 20%. Contudo, os valores médios de PP obtidos pelo laboratório
D estiveram próximos ao valor de referência. Já para o laboratório E, as variações
refletiram também um distanciamento dos valores médios obtidos com relação ao
74
valor de referência, o que acarretou na classificação equivocada de dois soros
(gráficos 16A, 16B, 16C e 16D), como descrito anteriormente.
Adicionalmente, a reprodutibilidade obtida em cada laboratório em relação ao
valor de referência do PANAFTOSA foi analisada mediante a construção de gráficos
onde as médias dos valores PP obtidos por cada laboratório estão dispersos para a
comparação com os valores de referência ± 20%, variação máxima aceitável. Os
gráficos das figuras 16A, 16B, 16C e 16D apresentam os resultados das médias de PP
obtidas por cada laboratório, para cada soro, frente ao valor de referência do Painel.
Os resultados dos soros negativos não foram apresentados em gráficos, pois, em
todos os laboratórios participantes nenhum soro foi identificado como falso positivo,
na prova de triagem do PANAFTOSA.
O laboratório B apresentou a melhor exatidão, pois todos os soros apresentaram
média de PP dentro da margem de 20% do valor de referência. Os laboratórios F e D
também apresentaram boa exatidão com 22 e 21 soros, respectivamente,
compreendidos nos limites referência. Os laboratórios A e C apresentaram 20 soros
dentro da margem aceitável e, no laboratório A a variação obtida para o soro PIA-12,
ocasionou a classificação equivocada do mesmo. Já os laboratórios E e G
apresentaram baixa exatidão com 13 e 17 soros, respectivamente, com valores médios
fora da margem aceitável. O laboratório E apresentou além da falta de exatidão, uma
variação de repetibilidade intra-placa e inter-placa também acima do esperado. Nesse
caso, dois soros foram classificados equivocadamente. Entretanto, o laboratório G
apresentou de uma maneira consistente um aumento nos valores de PP obtidos para os
soros positivos do painel frente aos valores de referência. Dessa forma, mesmo
apresentando falta de exatidão, o laboratório não apresentou equívoco na classificação
dos soros. Esses laboratórios foram acompanhados para a identificação das não
conformidades e, conseqüente aperfeiçoamento da aplicação do teste de triagem do
PANAFTOSA.
75
PIA - 17
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 30
PIA - 13
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 11
PIA - 16
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 23
PIA - 14
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 11
PIA - 12
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 13
PIA - 15
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 18
Figura 16A – Valores de reatividade obtidos pelos laboratórios participantes do exercício de proficiência com teste de triagem de PANATOSA utilizando os soros do PIA. Os gráficos apresentam para cada soro (PIA-12 ao PIA-17) a dispersão do resultado dos laboratórios frente ao valor de referência em porcentagem de positividade. Valor de referência. ±20% do valor de referência ● PP – valor de porcentagem de positividade, média das seis determinações obtidas em cada laboratório. A barra de erro indica o desvio padrão obtido com as médias das três placas.
76
PIA - 21
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 55
PIA - 20
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 39
PIA - 23
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 65
PIA - 22
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 60
PIA - 18
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 31
PIA - 19
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 53
Figura 16B – Valores de reatividade obtidos pelos laboratórios participantes do exercício de proficiência com teste de triagem de PANATOSA utilizando os soros do PIA. Os gráficos apresentam para cada soro (PIA-18 ao PIA-23) a dispersão do resultado dos laboratórios frente ao valor de referência em porcentagem de positividade. Valor de referência. ±20% do valor de referência ● PP – valor de porcentagem de positividade, média das seis determinações obtidas em cada laboratório. A barra de erro indica o desvio padrão obtido com as médias das três placas.
77
PIA - 25
0
50
100
150
200
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 73
PIA - 29
0
50
100
150
200
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 80
PIA - 26
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 63
PIA - 24
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 55
PIA - 27
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 69
PIA - 28
0
50
100
150
200
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 70
Figura 16C – Valores de reatividade obtidos pelos laboratórios participantes do exercício de proficiência com teste de triagem de PANATOSA utilizando os soros do PIA. Os gráficos apresentam para cada soro (PIA-24 ao PIA-29) a dispersão do resultado dos laboratórios frente ao valor de referência em porcentagem de positividade. Valor de referência. ±20% do valor de referência ● PP – valor de porcentagem de positividade, média das seis determinações obtidas em cada laboratório. A barra de erro indica o desvio padrão obtido com as médias das três placas.
78
PIA - 32
0
50
100
150
200
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 97
PIA - 34
0
50
100
150
200
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 110
PIA - 33
0
50
100
150
200
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 126
PIA - 35
0
50
100
150
200
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 139
PIA - 31
0
50
100
150
200
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 75
PIA - 30
0
50
100
150
200
A B C D E F G
Lab.
PP
Valor Ref PP = 78
Figura 16D – Valores de reatividade obtidos pelos laboratórios participantes do exercício de proficiência com teste de triagem de PANATOSA utilizando os soros do PIA. Os gráficos apresentam para cada soro (PIA-30 ao PIA-35) a dispersão do resultado dos laboratórios frente ao valor de referência em porcentagem de positividade. Valor de referência. ±20% do valor de referência ● PP – valor de porcentagem de positividade, média das seis determinações obtida em cada laboratório. A barra de erro indica o desvio padrão obtido com as médias das três placas.
79
Para a prova confirmatória, da mesma forma que na prova de triagem, foram
definidos critérios para análise da classificação dos soros. Os critérios adotados estão
detalhadamente descritos no item 3.4.2.2.
A Tabela 9 apresenta os resultados obtidos nos 7 laboratórios participantes. Os
laboratórios A, B, C, e F apresentaram 100% de acerto na classificação dos soros. O
laboratório E classificou corretamente todos os soros reativos, contudo, apresentou
um resultado falso positivo ao informar o soro PIA-10, negativo, como reativo. O
laboratório D apresentou dois resultados falso negativos, pois, classificou os soros
PIA-13 e PIA-15, classificados como reativo/indeterminado como não reativo.
O painel permitiu verificar diferenças no desempenho dos laboratórios, nos
vários parâmetros avaliados, apontando as distorções que acarretaram a liberação de
resultados equivocados.
80
Tabela 09 – Resultado no teste confirmatório do PANAFTOSA para os soros do
PIA determinados durante o exercício de proficiência
A B C D E F GPIA- 1 NR NR NR NR NR NR NR NRPIA- 2 NR NR NR NR NR NR NR NRPIA- 3 NR NR NR NR NR NR NR NRPIA- 4 NR NR NR NR NR NR NR NRPIA- 5 NR NR NR NR NR NR NR NRPIA- 6 NR NR NR NR NR NR NR NRPIA- 7 NR NR NR NR NR NR NR NRPIA- 8 NR NR NR NR NR NR NR NRPIA- 9 NR NR NR NR NR NR NR NR
PIA- 10 NR NR NR NR NR R NR NRPIA- 12 R/I I R R I R R IPIA- 13 R/I I R I NR R R NRPIA- 14 R R R R R R R RPIA- 15 R/I R I I NR R R IPIA- 16 R R R R R R R IPIA- 17 R R R R R R R NRPIA- 18 R R R R R R R RPIA- 19 R R R R R R R NRPIA- 20 R R R R R R R RPIA- 21 R R R R R R R IPIA- 22 R R R R R R R RPIA- 23 R R R R R R R RPIA- 24 R R R R R R R RPIA- 25 R R R R R R R RPIA- 26 R R R R R R R RPIA- 27 R R R R R R R RPIA- 28 R R R R R R R RPIA- 29 R R R R R R R RPIA- 30 R R R R R R R RPIA- 31 R R R R R R R RPIA- 32 R R R R R R R RPIA- 33 R R R R R R R RPIA- 34 R R R R R R R RPIA- 35 R R R R R R R R
LaboratóriosReferênciaSoros
R – Reativo; I – Indeterminado; NR – Não reativo; R/I – soros que apresentam até duas bandas (3ABC; 3D; 3B e 3A) com intensidades próximas as intensidades apresentadas pelo soro limite (CP1).
O laboratório G não apresentou desempenho aceitável e classificou
equivocadamente 5 soros positivos (PIA-13; PIA-16; PIA-17; PIA-19 e PIA-21),
desses soros relatados como falso negativos, apenas o soro PIA-13, encontra-se com
resultados reativo/indeterminado, os demais apresentam, para as bandas das proteínas
3ABC, 3D, 3B e 3A, intensidade de reação próxima ao soro controle CP2. Esse
laboratório foi acompanhado para correção das não conformidades.
81
4.4. Estudos Adicionais para a comparação de kits
4.4.1. Resultados de provas comparativas com painéis adicionais
Dentro das funções de laboratório de referência da OIE e após o
desenvolvimento e produção do atual teste índice para PNC, estudos para comparação
do desempenho de testes PNC comercialmente disponíveis são realizados pelo
PANAFTOSA. Nesses estudos são utilizadas amostras de campo representativas da
América do Sul e modelos experimentais, com as quais foram constituídos painéis
adicionais, que apresentam um maior número de soros com volume reduzido. Nesse
estudo foram utilizados os testes comerciais da CEDI, UBI e Bommeli, atualmente
fabricado pela IDEXX.
Para a avaliação da sensibilidade diagnóstica soros de animais representando
diferentes etapas e condições de infecção foram estudados em 3 grupos. Os
experimentalmente infectados com 16 animais, os de foco com 115 animais e os
animais de foco com vacinação (2 animais). A Tabela 02 resume o estado de infecção
dos animais utilizados.
Dois animais (bovino 1 e bovino 2) experimentalmente infectados foram
submetidos a sangrias seqüenciais do oitavo ao décimo primeiro dia após a infecção.
Esses animais foram utilizados para avaliação da capacidade de detecção de
soroconversão (Tabela 10).
Os soros coletados a 8 dpi dos bovinos B1 e B2, positivos no ELISA do
PANAFTOSA, foram confirmados positivos pelo teste confirmatório do
PANAFTOSA. Dos testes comerciais o teste da CEDI apresentou sensibilidade para
detecção de soroconversão semelhante ao teste índice, detectando positividade, para
as amostras coletadas a 8dpi nos bovinos B1 e B2. O kit ELISA da Bommeli detectou
a soroconversão para o bovino B1 somente a 11dpi e para o bovino B2 a 9 dpi. O kit
ELISA da UBI detectou para os dois bovinos a soroconversão a 10 dpi.
82
Tabela 10 – Resultado dos soros dos bovinos 1 e 2 (B1 e B2) sangrados
sequencialmente para a análise de soroconversão.
PP PP PI T/C8 10 4 63 0,39 13 10 82 0,10 22 21 88 1,111 35 47 90 1,68 10 10 68 0,9 13 38 84 0,10 19 115 89 2,211 22 198 91 3,8
Ponto de corte PP ≥ 10 20 ≥ PP ≥ 30 PI ≥ 50 T/C ≥ 1
B1
B2
Bommeli CEDI UBI
Kits
Bovino dpi Triagem Panaftosa
4
27
Os números sombreado representam os resultados não concordantes com o teste índice. dpi – dias após infecção; PP – porcentagem de positividade; PI – Porcentagem de inibição e T/C - Densidade óptica do soro teste / valor do ponto de corte.
Outros seis animais experimentalmente infectados foram utilizados para a
avaliação da sensibilidade diagnóstica em tempos iniciais de infecção, soros
denominados Sd1 a Sd 6. A Tabela 11 apresenta por soro o resultado obtido com cada
kit. O kit ELISA do PANAFTOSA detectou todos os soros como positivos, os quais
foram confirmados positivos por EITB. O kit da Cedi também identificou todos os
soros como positivos. O kit da Bommeli identificou 3 soros como positivos, 1 como
negativo e 2 como indeterminados. Já o kit da UBI identificou 3 soros como positivos
e 3 como negativos.
Para a investigação do desempenho dos kits em detectar soro de animais com
reduzido número de anticorpos, condição esperada para animais portadores
assintomáticos. Foram utilizados soros de animais experimentalmente infectados com
cepas atenuadas para bovinos (Sd 7 a Sd 11) (Tabela 11). Esses soros (Sd.7 a Sd. 11)
foram reativos no ELISA do PANAFTOSA e no EITB. O teste da CEDI também
apresentou reatividade para todos os soros, os kits da Bommeli e da UBI não foram
capazes de detectar nenhum destes soros como reativos.
83
Tabela 11 - Resultados obtidos para cada soro dos animais experimentalmente
infectados e sangrados.
Bommeli CEDI UBI
PP PP PI T/CSd.1 13 O1Campos 60 244 86 2,7Sd.2 11 O1Campos 38 221 83 1,1Sd.3 34 O1Campos 18 8 83 0,8Sd.4 25 O1Campos 24 163 82 0,1Sd.5 30 O1Campos 19 24 90 0,9Sd.6 37 O1Campos 68 26 90 4,6Sd.7 49 O1C atenuada 19 6 84 0,7Sd.8 56 O1C atenuada 16 5 80 0,7Sd.9 63 O1C atenuada 15 4 78 0,5Sd.10 77 O1C atenuada 10 4 71 0,4Sd.11 70 O1C atenuada 12 7 74 0,5
Ponto de corte PP ≥ 10 20 ≥ PP ≥ 30 PI ≥ 50 T/C ≥ 1
Bovino Cepa
Kits
dpi Triagem Panaftosa
Os números sombreado representam os resultados não concordantes com o teste índice. dpi – dias após infecção; PP – porcentagem de positividade; PI – Porcentagem de inibição e T/C - Densidade óptica do soro teste / valor do ponto de corte.
Em seguimento a avaliação de soros reativos, amostras de três animais
experimentalmente infectados, que apresentaram LEF positivos ocasionais após a
infecção, foram coletadas em tempos tardios (532, 602, 615 dpi) (Sd.12, Sd.13 e
Sd.14). O estudo comparativo desse material demonstrou que o sistema do
PANAFTOSA foi capaz de detectar positividade no soro dos três animais, seguido
pelo teste da Cedi e Bommeli. Apenas o teste da UBI não detectou positividade nos
três soros (Tabela 12).
84
Tabela 12 - Resultados obtidos para cada soro dos animais experimentalmente
infectados e sangrados em tempos tardios.
PP PP PI T/CSd.12 532 21 56 91 0,4
Sd.13 602 18 35 85 0,3
Sd.14 615 17 32 78 0,5
Ponto de corte PP ≥ 10 20 ≥ PP ≥ 30 PI ≥ 50 T/C ≥ 1
Triagem Panaftosa Bommeli CEDI UBIBovino dpi
Kits
Os números sombreado representam os resultados não concordantes com o teste índice. dpi – dias após infecção; PP – porcentagem de positividade; PI – Porcentagem de inibição e T/C - Densidade óptica do soro teste / valor do ponto de corte.
Para avaliação do desempenho a campo, soros de 115 animais que estavam
presentes em episódios foram estudados. Seguindo a tendência observada para os
modelos experimentais, o sistema do PANAFTOSA detectou o maior número de
soros como positivos 113, os dois animais restantes foram classificados como
indeterminados. Já o teste da CEDI foi capaz de detectar 99 soros reativos, a Bommeli
73, sendo 9 indeterminados e o teste da UBI 67soros.
Fechando a avaliação do grau de detecção a campo animais vacinados e
presentes em região de foco, em que foi recuperado vírus a 90 dpfoco, foram
avaliados. Os dois animais foram detectados como positivos pelo sistema do
PANAFTOSA e pelo kit da CEDI. Os kits da Bommeli e da UBI não foram capazes
de detectar o soro Sd.15 (tabela 13).
85
Tabela 13 - Resultados obtidos para cada soro dos animais vacinados, presentes em
áreas de foco e com recuperação de vírus a 90 dpfoco.
PP PP PI T/CSd.15 90 36 9 96 0,5Sd.16 90 66 227 96 5,9
Ponto de corte PP ≥ 10 20 ≥ PP ≥ 30 PI ≥ 50 T/C ≥ 1
Bovino dpo
KitsTriagem
Panaftosa Bommeli CEDI UBI
Os números sombreado representam os resultados não concordantes com o teste índice. dpi – dias após-infecção; PP – porcentagem de positividade; PI – Porcentagem de inibição e T/C - Densidade óptica do soro teste / valor do ponto de corte.
Para estimar a sensibilidade diagnóstica comparativa e o grau de detecção a
campo dos testes em questão, os soros foram agrupados em modelos experimentais e
de campo (tabela 14). Quando são analisados apenas os modelos experimentais, o
sistema do PANAFTOSA e o teste da CEDI apresentam a mesma sensibilidade
(100%). Com desempenho bem inferior encontram-se os testes da Bommeli,
(sensibilidade 44%) e da UBI (sensibilidade 25%). Entretanto, com os soros de campo
o sistema do PANAFTOSA apresenta um índice de detecção a campo de 98% seguido
pela CEDI com 86%, pela Bommeli com 63% e a UBI com 58%.
Tabela 14 - Resumo dos valores de sensibilidade diagnóstica e o índice de detecção a
campo obtida para cada kit em cada classe de animais.
Panaftosa Bommeli Cedi UBIPos. (Ind.) / n Pos. (Ind) / n Pos. / n Pos./ n
16/16 7/16 16/16 4/16100% 44% 100% 25%113(2)/115 73(9)/115 99/115 67/115
98% 63% 86% 58%
Kits
Animais experimentais
Animais de campo
Pos – Positivo; Ind – Indeterminado e n - negativo
86
5. DISCUSSÃO
Desde a última década os testes PNCs são utilizados, amplamente e
principalmente na América do Sul, para monitorar o progresso das campanhas de
erradicação de FA, para o rastreamento sorológico após emergências em áreas livres,
para o respaldo das áreas livres de enfermidade (demonstração de ausência de
circulação viral), e para a certificação como livre de infecção de animais individuais
ou produtos para o comércio ou movimentação (Bergmann, I.E., Malirat, V., Neitzert,
E. 2005). O sucesso da aplicação desses testes promoveu a ampliação do uso em
outras partes do mundo (Blanco et al., 2002; Chung et al., 2002; Paton et al.,2006).
Para atender aos propósitos acima mencionados são necessários testes com alta
sensibilidade e especificidade, necessidades que são atendidas pelo sistema de PNC
do PANAFTOSA que é composto por um teste de triagem de alta sensibilidade,
seguido por um teste confirmatório altamente sensível e específico. A alta
sensibilidade permite a detecção de baixos títulos de anticorpos os quais podem ser
encontrados em estágios tardios de uma infecção persistente ou em um animal
vacinado e infectado. Contar com um teste confirmatório com alta sensibilidade e,
principalmente, alta especificidade permite contornar possíveis distorções de valores
preditivos positivos em regiões de baixa prevalência (Bergmann et al. 2000).
A experiência de utilização dos testes PNCs incentivou o surgimento de novos
kits PNCs comerciais e testes “in house”, para a avaliação de atividade residual, o que
desencadeou a aplicação mundial dos mesmos, demandando esforços internacionais
para o desenvolvimento de padrões destinados a avaliação de equivalências dos kits
disponíveis, principalmente frente ao teste índice.
Este trabalho descreve o desenvolvimento, a caracterização e a aplicação de
dois grupos de soros padrões internacionais (PIBs e PIA) que acompanham o teste
índice. Os soros PIBs estão destinados principalmente a calibração e avaliação de
sensibilidade analítica relativa e o painel PIA foi construído principalmente para
avaliação de sensibilidade diagnóstica relativa.
Os soros PIBs e o PIA provaram ser estáveis após ciclos repetidos de
congelamento e descongelamento, durante o período de 1 ano (Tabela 05), e após o
transporte como demonstrado pelos resultados obtidos nos três laboratórios da
América do Sul (Tabela 06). Essas características aliadas ao fato dos soros terem sido
87
inativados usando a metodologia internacionalmente reconhecida são requisitos
importantes para a aceitação dessas ferramentas como padrões internacionais.
O painel PIA foi constituído preferencialmente de amostras de campo, a fim de
representar ao máximo as amostras que serão avaliadas nos testes estudados. Embora
os soros de animais experimentais sejam de obtenção mais fácil, especialmente em
grande volume, sob condições controladas, esses podem não refletir a resposta
humoral típica (Wright P.F., 1998).
Os padrões descritos nesse trabalho não visam à avaliação de especificidade,
pois cada teste apresenta um universo particular de reações não específicas e para a
comparação precisa desse parâmetro são necessárias um grande número de amostras
de animais de áreas livres. E, considerando que, o principal propósito de aplicação dos
testes PNCs na América do Sul é a vigilância ativa, uma baixa especificidade já é
capaz de impossibilitar a utilização dos mesmos.
Os valores de referência e os resultados obtidos nos testes de triagem e
confirmatório do PANAFTOSA (Tabela 04 e Figura 10) aliados à estabilidade e à
robustez para utilização em outros laboratórios, qualificam os soros PIBs e o PIA para
a avaliação comparativa da sensibilidade. Cabe ressaltar que o painel PIA se destaca
por conter soros positivos com vários níveis de reatividade, em seus diferentes grupos,
o que permite detectar diferenças sutis de sensibilidade.
Devido à relevância dos soros PIBs e o PIA, os mesmos devem ser utilizados
para construção de padrões secundários utilizados para a rotina do controle de
qualidade em processo e de produto acabado. Os padrões secundários podem ser
construídos por laboratórios nacionais de referência aplicados e, quando necessário,
distribuídos (Wright P.F., 1998). Apesar da padronização e validação dos processos
industriais, normalmente adotados com a implementação das normas de qualidade, a
avaliação de homogeneidade, especialmente nos sistemas biológicos, não deve ser
descartada. Atualmente, as empresas produtoras de kits PNCs não descrevem em seus
certificados de análise, a metodologia e as ferramentas que utilizaram para o controle
de qualidade dos seus reativos. A disponibilidade dessas informações nos certificados
de análise dos kits permite uma melhor orientação do usuário durante a utilização do
mesmo.
Os soros PIBs foram preparados principalmente para a avaliação de
sensibilidade analítica relativa. Esta pode ser determinada pela última diluição
detectada como positiva em cada teste quando os soros PIBs diluídos são testados. A
88
avaliação comparativa dos quatro kits comerciais (CEDI, IDEXX, Svanova e UBI),
no PANAFTOSA, demonstrou que tanto os resultados obtidos com os PIBs e os soros
do painel PIA apontaram a mesma tendência de desempenho para os kits estudados. A
análise geral dos resultados apresenta os testes do PANAFTOSA, CEDI e IDEXX
como os mais sensíveis, o teste da Svanova com a sensibilidade intermediária e o teste
da UBI com baixa sensibilidade.
A análise de um maior número de curvas de diluição permitiu observar que cada
teste de diagnóstico apresenta um perfil de diminuição de reatividade, e que
provavelmente estes perfis estão relacionados com a metodologia adotada no teste
diagnóstico (indireto, competitivo / bloqueio). Observando o comportamento do soro
forte positivo no teste da IDEXX, verificamos que o mesmo apresenta nas duas
primeiras diluições a formação de um platô seguido de uma acentuada redução de
reatividade (gráfico IDEXX, Figura 11). A redução de reatividade acentuada também
foi observada nos soros do PIA, e isso pode explicar a menor sensibilidade analítica
demonstrada pelo teste da IDEXX, apesar de ser um teste que apresenta alta taxa de
detecção, como será discutido na análise de sensibilidade diagnóstica. Da mesma
forma, o kit da CEDI apresenta para o soro forte positivo uma diminuição gradativa
de reatividade (gráfico CEDI, Figura 11). Esse padrão de diminuição de reatividade
pode ser confirmado quando os soros do PIA foram analisados em diluições seriadas,
demonstrando que, essa tendência parece estar associada à metodologia e não ao soro
selecionado para análise.
Os resultados de sensibilidade analítica relativa apresentados com o estudo dos
soros PIBs de forma conjunta permitiu observar tendências correlacionáveis com as
tendências observadas na avaliação de sensibilidade diagnóstica descrita a seguir.
Dessa forma, a utilização dos soros PIBs para a calibração inicial de um teste é de
extrema relevância.
Para a avaliação de desempenho dos testes também é necessário conhecer a
sensibilidade diagnóstica. Esse parâmetro depende não apenas da concentração do
anticorpo, mas também da complexidade gerada pelo universo de interferências
possíveis na interação antígeno-anticorpo encontrados em amostras de campo. A
determinação desse parâmetro permite inferir o desempenho do kit na população alvo.
Os resultados obtidos para ao PIA nos 5 kits PNCs estudados prova a sua
capacidade de discriminar as diferenças em sensibilidade diagnóstica relativa. Dos 23
soros originados de animais experimentalmente infectados ou de animais com
89
concreto status de infecção/exposição, todos positivos nos testes NCPanaftosa de
triagem e confirmatório, 11 demonstraram capacidade de apontar variações na
sensibilidade diagnóstica dos 5 testes avaliados (Tabela 07). Em cada categoria pelo
menos um soro não foi corretamente classificado por um dos testes.
A relevância epidemiológica de detectar esses 11 soros como falso negativos está
exemplificada, por exemplo, na categoria de foco, na qual os quatro soros capazes de
apontar diferenças foram coletados de animais entre 10 e 26 dias após a detecção da
doença, sendo a identificação destes, crítica durante a vigilância de emergências.
Adicionalmente, apenas os soros positivos de baixo título foram capazes de
apontar diferenças entre os testes mais sensíveis. Da mesma forma, o impacto
epidemiológico da não detecção desses soros está refletido na possibilidade dos
mesmos estarem presentes em rebanhos vacinados e infectados ou em rebanhos com
infecção persistente. Esta última observação fortalece a importância da correta seleção
dos soros para a avaliação da sensibilidade comparativa.
O soro PIA-15 obtido de um animal imunizado com uma vacina experimental com
semi-purificada, que apresentou resultado negativo nos dois testes menos sensíveis
(UBI e Svanova). Esse soro representa os soros de animais vacinados com vacinas
que não atingem os requisitos de purificação. A inclusão desse soro no painel é
importante para apontar os testes que não seriam eficazes para o controle de qualidade
de pureza de vacinas.
Embora os PIBs e o PIA só incluam soros de animais infectados com os sorotipos
O, A e C, resultados prévios com amostras de animais infectados com outros
sorotipos (SAT1, SAT2 e Ásia 1) demonstraram o mesmo comportamento em provas
de desempenho comparativo (Bronsvoort et al., 2006; Brocchi et al., 2006). Este
resultado não surpreende considerando a natureza conservada das PNCs.
O comportamento observado quando o PIA foi usado para comparar kits e testes
está de acordo com os resultados previamente obtidos por outros grupos. Estudos têm
sido publicados descrevendo a sensibilidade relativa de testes PNCs, alguns incluem
análises baseadas nas curvas ROC (“receiver operating curves”) e também em
formulações bayesianas (“Hui-Walter latent class analysis”) (Bronsvoort et. al., 2006;
Brocchi et. al., 2006; Dekker et al., 2006). Esses estudos foram realizados com um
grande número de soros. A concordância desses resultados com os resultados obtidos
pelo PIA comprova a aplicabilidade do mesmo para analisar a sensibilidade relativa
entre testes, com grande vantagem de trabalhar com um número reduzido de soros. A
90
possibilidade de contar com um PIA contendo soros corretamente selecionados é de
grande importância. Pois, o uso inapropriado de grupos de soros pode gerar resultados
contraditórios. Efetivamente, Neidbalski (2004) publicou que os ELISAs da Chekit
FMDV-3ABC da Bommeli Diagnostics, Suíça, o teste CEDI da Cedi Diagnosis B.V.
e o teste “in house” IZSLER, Brescia apresentavam a mesma sensibilidade,
contradizendo os resultados publicados por Bronsvoort et al., 2006; Brocchi et al.,
2006; e Dekker et al., 2006.
Da mesma forma, o painel pode ser usado para avaliar a viabilidade de testes em
desenvolvimento utilizando um número reduzido de soros, essa aplicação foi
comprovada com a avaliação do teste Luminex. O painel foi capaz de demonstrar que
nenhum dos antígenos utilizados no novo teste discrimina populações negativas e
positivas. O teste não se encontra em condições de utilização, a sensibilidade e
especificidade dos antígenos deve ser melhorada. Dos antígenos utilizados apenas as
proteínas 3ABC e 3A se apresentam como os mais promissores (Figura 14). Cabe
ressaltar, que para a análise de metodologias em desenvolvimento é fundamental a
presença de soros negativos no painel, apesar do mesmo não estar enfocado a análise
de especificidade. A avaliação dos 10 soros positivos do painel permitiu concluir que
o teste Luminex, na padronização atual, não discrimina soros negativos e positivos.
A avaliação do desempenho de kits deve ser um processo contínuo e realizado
com ferramentas adequadas. Estudos comparativos abrangendo um maior número de
soros também foram realizados no PANAFTOSA. Na época da realização desta
comparação, o kit da Svanova não estava disponível na América do Sul e o kit da
Bommeli, ainda estava sendo produzido pela empresa Bommeli Diagnostics –
INTERVET. Durante essas análises podemos concluir que o kit CEDI apresentava
sensibilidade relativa mais próxima ao teste índice e que o kit UBI apresentava a
menor sensibilidade. Essas características de desempenho permanecem até hoje e
foram mais uma vez corroboradas pela a utilização do painel. Contudo, o desempenho
do teste da Bommeli não foi o mesmo. O kit atualmente produzido pela empresa
IDEXX apresentou uma melhora significativa na sensibilidade. Cabe ressaltar, que
esse estudo é o primeiro trabalho em que o desempenho do teste fabricado pela
empresa IDEXX está sendo relatado. É recomendado para a adoção desse teste
estudos adicionais destinados à determinação dos valores intrínsecos de sensibilidade
diagnóstica e especificidade de acordo com o propósito desejado. Da mesma forma
que já descrito para o Luminex, a utilização dos soros negativos para o teste da
91
IDEXX também foi importante já que um deles foi classificado como indeterminado,
indicando que a especificidade desse teste deve ser melhor avaliada.
Outro ponto importante que deve ser ressaltado é a comparação dos resultados
obtidos com os soros de modelos experimentais e de campo nas provas comparativas.
Resguardando o número distinto de amostras, os dois modelos não indicam as
mesmas tendências (Tabela 14). Como na maioria das vezes, os modelos
experimentais trabalham em condições forçadas e com cepas padrões, gerando soros
com alto título de anticorpos, que quando utilizados para comparação apresentam
tendência a harmonização dos resultados comparativos. Além do alto título, o
universo restrito pode gerar distorções nos resultados, como por exemplo, os dois
soros PIA-13 e PIA-18 oriundos de animais inoculados que apresentaram baixo título
no teste de triagem do PANAFTOSA e foram classificados como positivos pelo teste
da UBI (Tabela 07), o qual tem sido reiteradamente identificado como o teste que
apresenta menor sensibilidade. Esse resultado fortalece a necessidade do
desenvolvimento de ferramentas direcionadas à utilização de soros de campo.
Diferenças na utilização de soros que apontam extremos também foram claramente
visualizadas no trabalho comparativo, realizado em conjunto com o laboratório
IZSLER (Brocchi et al., 2006), soros de modelos experimentais, coletados próximos à
infecção aguda apresentam maior tendência em harmonizar o desempenho dos testes.
Para melhor ilustrar o acima exposto, os resultados descritos estão resumidos na
Tabela 15. Os valores de porcentagem de sensibilidade estão relacionados à categoria
dos soros e ao número total de amostra. Dessa forma, não devem ser comparados
valores de categorias distintas. Contudo, as tendências de desempenho obtidas entre
os testes nos diferentes estudos (estudos comparativos realizados nos laboratórios
IZSLER e PANAFTOSA) e com o PIA pode ser comparada. No trabalho comparativo
realizado no laboratório IZSLER diversas categorias foram utilizadas, entre todas,
estão aqui transcritas, na Tabela 15, as categorias de maior importância no contexto
epidemiológico da América do Sul. Os resultados das provas comparativas realizadas
em PANFTOSA também estão incluídos para a comparação. O teste da IDEXX está
tratado separadamente uma vez que, os kits utilizados durante as provas comparativas
e o painel foram produzidos por fabricantes distintos.
92
Tabela 15- Resumo dos resultados obtidos em provas comparativas e os resultados
obtidos com o PIA para a avaliação comparativa de ELISAs
Panaftosa IZSLER CEDI Svanova UBI IDEXX
Lab IZSLER Exp inf. 28-100dpia 26 100 % 100 % 100 % 96,2 % 100 % 92, 3%Portador 28-100 dpia 66 93,9 % 86,4 % 86,4 % 71,2 % 77,3 % 68,2 %
25% 44 %58% 63 %
70 % 70 %
Campoa 326 99,7 % 99,5 % 97,2 % 85,0 % 84,0 % 84,4 %
Lab PANAFTOSA Experimentaisb 16 100 % - 100 % -Campob 115 98 % - 86 % -
PIAc 23 100 % 87 % 87 % 91 % *
PopulaçãoProvas comparativas N Testes
Valores de sensibilidade relativa entre 100 e 91% - preto; entre 90 71% - azul e
valores abaixo de 70% - vermelho. dpi – dias após infecção; PIA – Painel Internacional de Avaliação e N – número de amostras
a Brocchi et al, 2006 b Ver Tabela 02 para informações complementares c Ver Tabela 01 para informações complementares * Resultado obtido com o kit produzido pela empresa IDEXX, os demais resultados
foram obtidos com o mesmo kit produzido pela empresa Bommeli Diagnostica – Intervet.
Como demonstrado na tabela, o PIA é capaz de separar os kits em dois grupos
quando comparados ao teste índice: os mais sensíveis, que incluem os testes IZSLER,
CEDI e IDEXX, e os menos sensíveis, que incluem Svanova e UBI.
Ampliando a aplicação dos PIBs e do PIA, os mesmos foram utilizados para
teste de proficiência. No exercício realizado em 7 laboratórios o PIA se mostrou
eficaz para avaliar o desempenho dos laboratórios na utilização individual dos testes
de triagem e confirmatório do PANAFTOSA. O painel pode ser utilizado para a
avaliação de diversos parâmetros de qualidade. O desenho de prova solicitado em um
teste de proficiência também é importante para ampliar o espectro de atuação do
painel. Os exercícios não devem ser baseados apenas na classificação final dos soros.
Pois, como observado para o laboratório G no teste de triagem, apesar da correta
classificação dos soros, os valores obtidos apresentam uma variação acima do
aceitável. Da mesma forma como observado na aplicação do painel em provas
comparativas, os soros de baixo título são importantes para a discriminação do
desempenho. Contudo, os soros de alto título não devem ser desprezados, pois
possibilitam uma visão mais ampla e a identificação de problemas graves. É
importante ressaltar que os Testes NCPanaftosa Teste de Triagem e NCPanaftosa
93
Teste Confirmatório são utilizados nos laboratórios da América do Sul principalmente
na forma de sistema ou algoritmo de provas e para a análise populacional. O exercício
de proficiência realizado em forma individual se apresenta mais exigente.
Com relação ao desenvolvimento de painéis de avaliação, Parida et al (2007)
descreveram recentemente um painel bovino para detectar anticorpos contra PNCs.
Apesar do painel possibilitar a discriminação de sensibilidade dos testes, o mesmo
apresenta restrições para a sua aplicação internacional. O processo de inativação por
calor escolhido pelos autores, não atende as exigências internacionais (75 Sessão
Geral da OIE endereço eletrônico http:// www.oie.in), e não garante a ausência de
vírus vivo, como enfatizado pelo autor. Outras desvantagens incluem a falta de
resultados no teste Índice, a falta de soros de animais de campo e a ausência de dados
de estabilidade. Esse painel inclui soros de animais infectados pelos sorotipos SAT2,
Ásia, O e A, mas não apresenta os sorotipos C, SAT 1 e SAT3.
As características dos PIBs e do PIA descritos nesse trabalho, que incluem um
amplo espectro de reatividade, estabilidade satisfatória, a preparação das amostras
seguindo os padrões internacionais, e a capacidade de apontar diferenças no
desempenho, no teste índice ou em comparação com os demais testes, tornam
ferramentas apropriadas para controlar se o teste índice e os testes disponíveis estão
apresentando o desempenho descrito e se, métodos equivalentes estão sendo
utilizados para os controles epidemiológicos e os parceiros comerciais.
Os soros PIBs e o PIA foram aceitos como padrões de referência internacional e
podem ser disponibilizados para os laboratórios de referência da OIE, e destinam-se a
avaliação de testes em estágios avançados de validação e que já tenham apresentado
seus dossiês de validação a OIE.
94
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7. ANEXO
100
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Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
