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ImunoensaiosRubens de Oliveira Santos Fev/2012
Definio Imunoensaio: prova que usa complexos Ag-Ac (imunocomplexos) para gerar um resultado perceptvel desta interao Imuno relacionado a resposta imunolgica Ensaio referente a prova ou teste
Difere dos ensaios colorimtricos: Colorimetria: reagente + amostra = cor02:04 Rubens de Oliveira santos 2
Anticorpo, antgeno e analito Anticorpo (Ac) Produzido pelo sistema imune (SI) frente a um antgeno
Antgeno (Ag) Substncia que interage com o Ac, de natureza qumica diversa
Analito aquilo que se quer medir, dosar, determinar Em imunoesaio: Antgeno Anticorpo
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Anticorpo, antgeno e analito O analito pode ser: Substncia naturalmente presente no organismo Ex: hormnios, anticorpos, etc.
Substncias que o corpo produz mas no esto presente em condies normais: Ex. protenas de clulas tumorais
Substncias que no esto presentes naturalmente no organismo Ex.: drogas de abuso, microrganismos patognicos, etc.02:04 Rubens de Oliveira santos 4
TCNICAS DE IMUNOENSAIO
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Tcnicas de imunoensaio A utilidade dos imunoensaios atribuda aos Ac empregados: Especificidade pelo Ag Afinidade pelo Ag
Pela forma de deteco do complexo Ag-Ac, derivam diversas tcnicas A escolha de uma tcnica mais adequada dependente dos objetivos clnicos e laboratoriais02:04 Rubens de Oliveira santos 6
Tcnicas de imunoensaio Referente a produo e performance do anticorpo empregado como reagente em imunoensaios, distinguem duas categorias: Ac policlonais
Ac monoclonais
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Estrutura dos anticorpos Regio Fab Ponto de unio com o Ag e varivel conforme entre os Ac
Regio Fc Regio de estrutura constante dentro de uma classe de Ac
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Propriedades dos anticorpos Reversibilidade das interaes Ag-Ac Regida pela lei de ao das massas
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Propriedades dos anticorpos Especificidade Capacidade de distinguir uma estrutura no meio de outras
Afinidade Fora da ligao dos Acs com um Ag monovalente
Avidez Fora da ligao dos Acs com um Ag polivalente
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Propriedades dos anticorpos Reao cruzada: Dois Ag diferentes apresentam um eptopo idntico Ac especficos para um eptopo se ligam a um eptopo no relacionado, mas com propriedades qumicas similares
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Propriedades dos anticorpos IgG Corresponde a aproximadamente 85% das imunoglobulinas presente nos adultos Peso molecular de 154kD com duas cadeias leves de 22.000D e duas pesadas de 55.000D cada Imunoglobulina que dura mais tempo em circulao, em mdia 23 dias
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Propriedades dos anticorpos IgM Corresponde a 5% das imunoglobulinas presentes no indivduo adulto Vida mdia de 5 dias
Imunoglobulina mais eficiente na fixao do complemento Pentamrica
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Propriedades dos anticorpos IgA Corresponde a 5% das imunoglobulinas presentes em um adulto Vida mdia de 6 dias
Encontrada na forma monomrica, dimrica, trimrica ou multimrica
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Propriedades dos anticorpos IgD Encontrada ligada a membrana de linfcitos B maduros, peso molecular aproximado de 185kD
IgE Encontrada sob a forma monomrica na circulao, seu peso molecular de aproximadamente 200kD Est implicada nas reaes alrgicas, principalmente quando ligada a membrana de mastcitos e basfilos.
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Anticorpos policlonais So produzidos por animais (coelho, ovelha ou cabras) O Ag (imungeno) escolhido injetado nos animais e estes reagem com a produo de Ac pelo seu SI Aps mltiplas injees, colhe o sangue e separa o soro rico am Ac especficos ao Ag, o anti-soro02:04 Rubens de Oliveira santos 16
Anticorpos policlonais Os Ac assim produzidos constituem uma mistura de Ac que interagem com diferentes eptopos do Ag Ag com vrios stios de ligao com Acs so denominados Ag polivalentes Os Acs assim produzidos, reagentes com eptopos diversos de um mesmo Ag, so denominados anticorpos polivalentes02:04 Rubens de Oliveira santos 17
Anticorpos policlonais Vantagens Maior avidez que os Ac monoclonais Reconhecem vrios eptopos de um Ag
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Anticorpos policlonais
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Anticorpos monoclonais So anticorpos especficos para um eptopo de um Ag polivalente So produzidos por uma linhagem celular nica (hibridomas) produtor de Ac O antgeno de interesse injetado no animal (geralmente o rato)
Isolam os LyB do bao do animal Funde os LyB com clulas tumorais de rato Separam as colnias de interesse Como cada colnia prevem de uma nica clula hdrida, esta produz Ac que reagem apenas com um eptopo do Ag polivalente.02:04 Rubens de Oliveira santos 20
Anticorpos monoclonais
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Anticorpos monoclonais
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Anticorpos monoclonais
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Anticorpos monoclonais So anticorpos especficos para um eptopo de um Ag polivalente So produzidos por uma linhagem celular nica (hibridomas) produtor de Ac O antgeno de interesse injetado no animal (geralmente o rato)
Isolam os LyB do bao do animal Funde os LyB com clulas tumorais de rato Separam as colnias de interesse Como cada colnia prevem de uma nica clula hdrida, esta produz Ac que reagem apenas com um eptopo do Ag polivalente.02:04 Rubens de Oliveira santos 24
CLASSES DE IMUNOENSAIOS
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Imunoensaios no marcados e imunoensaios marcados No marcados Imunoensaios de precipitao Imunoensaios de aglutinao
Marcados Redioimunoensaios Imunoensaios enzimticos Imunoensaios fluorescentes Imunoensaios quimioluminescentes02:04 Rubens de Oliveira santos 26
Imunoensaios no marcados
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Imunoensaios de precipitaoImunoprecipitao Reao de Ag solves com Ac solvel com formao de grandes complexos Ag-Ac insolveis A interao Ag-Ac revelada diretamente pela visualizao de turvao do meio reacional Especificidade Simplicidade Sensibilidade entre 0,1 a 0,5 mg/dL (baixa) Suficiente para determinao de protenas sricas02:04 Rubens de Oliveira santos 28
Imunoensaios de precipitaoImunoprecipitao
Fatores interferentes: pH Temperatura Fora inica Proporo entre [Ag] e [Ac] ponto de equivalncia e prozona
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Imunoensaios de precipitaoImunoprecipitao
Mtodos qualitativos: Imunodifuso simples Imunodifuso dupla Imunodifuso dupla em duas dimenses Imunoeletrofores
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Imunoensaios de precipitaoImunoprecipitao
Mtodos: Imunodifuso simples Imunodifuso dupla Imunodifuso dupla em duas dimenses Imunoeletrofores
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Imunoensaios de precipitaoTurbidimetria/nefelometria
Envolve a quantificao de luz dispersa ao por complexos Ag-Ac formados em meio lquido Sensibilidade de 0,5 g/mL ou 0,5 mg/dL Tcnica quantitativa Pode ser empregadas partculas como suporte
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Imunoensaios de aglutinao A interao Ag-Ac revelada diretamente pela visualizao de aglutinao de partculas presentes no meio reacional Pode ser classificada em: Aglutinao passiva: Pesquisa Ac solvelis numa amostra e os Ag esto presentes natural ou artificialmente na superfcie da partcula usada
Aglutinao reversa: Pesquisa Ag solveis numa amostra e o Ac especfico e adsorvido artificialmente superfcie usada atravs da regio Fc do Ac02:04 Rubens de Oliveira santos 33
Imunoensaios de aglutinao Aglutinao direta: O Ag faz parte da constituio natural da partcula usada
Aglutinao indireta: Ag ou Ac no faz parte da constituio natural da partcula usada na reao, sendo adsorvida artificialmente sua superfcie
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Imunoensaios de aglutinao Aglutinao direta: O Ag faz parte da constituio natural da partcula usada
Aglutinao indireta: Ag ou Ac no faz parte parte da constituio natural da partcula usada na reao, sendo adsorvida artificialmente sua superfcie
Sensibilidade moderada, semelhante a precipitao Alta especificidade Praticidade
Tcnica semiquantitativa02:04 Rubens de Oliveira santos 35
Imunoensaios de aglutinao Partculas mais empregadas: Hemcias: Hemaglutinao direta: ex. tipagem ABO/Rh Hemaglutinao indireta (HAI): ex. HAI para sfilis, para Chagas, para HIV, para HVB, para HCV, etc
Partculas de ltex: Aglutinao indireta: pesquisa de protena C reativa (PCR), fator reumatide (FR), pesquisa de rotavrus, HCG, etc. Nos trs exemplos pesquisa-se Ag02:04 Rubens de Oliveira santos 36
Imunoensaios de aglutinao Partculas mais empregadas: Partculas de gelatina: Empregada como substituta dos testes de HAI
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Fenmeno pr-zona Partculas mais empregadas: Partculas de gelatina: Empregada como substituta dos testes de HAI
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Fenmeno pr-zona
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Imunoensaios marcados
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Imunoensaios marcados Empregam um reagente marcado para medir a concentrao do analito As substncia marcadoras podem ser: Composto radioativo, Enzima que catalise uma reao colorimtrica Substncia que produza luz Composto fluorescente
A substancia marcadora pode ser incorporada ao Ag ou ao Ac, conforme o analito Complexo formado denomina-se conjugado02:04 Rubens de Oliveira santos 41
Imunoensaios marcados
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Classificao Imunoensaios competitivos Imunoensaios no competitivos Imunoensaios homognios Imunoensaios heterognios
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Imunoensaios competitivos O analito da amostra (no marcado) compete com o analito marcado presente como reagente no imunoensaio O analito no marcado impede o marcado de reagir com o ligante Quanto mais analito no marcado presente na amostra, menos sinal ser quantificado no final da reao Alta sensibilidade
Podem ser de uma etapa ou de duas etapas
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Imunoensaios competitivos
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Imunoensaios competitivosImunoensaio competitivo de uma etapa
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Imunoensaios competitivosImunoensaio competitivo de duas etapas
Apresenta maior sensibilidade que o de uma etapa
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Imunoensaios no competitivos Maior sensibilidade e especificidade
Usado para analitos em concentraes muito baixas Conhecido como sanduche: analito ligado entre anticorpos reagentes altamente especficos
A concentrao do analito diretamente proporcional ao sinal
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Imunoensaios no competitivos
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Imunoensaios no competitivos
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