Contributo para a caracterização dos sarcomas dos tecidos ... · na Classificação Histológica dos Tumores Mesenquima-tosos da Pele e Tecidos Moles dos Animais Domésticos, da

R E V I S T A P O R T U G U E S A

CIÊNCIAS VETERINÁRIASDE

ARTIGO DE REVISÃO

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Contributo para a caracterização dos sarcomas dos tecidos moles do gato eidentificação de factores de prognóstico

Characterization of soft tissue sarcomas in cats and prognostic factorsidentification – a tribute

Cristina Ochôa1*, Carlos Lopes2

1Laboratório de Patologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, INRB-IP, 4485-655 Vairão VCD2Departamento de Patologia e Imunologia Molecular, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar.4099-003 Porto

Resumo: No presente trabalho foram analisados 62 sarcomascutâneos do gato. Realizámos uma caracterização morfológicarecorrendo a técnicas de histologia, histoquímica (Azul Alçião)e de imunohistoquímica com marcadores para os filamentosintermédios (vimentina, α actina de músculo liso, desmina e citoqueratina 14), para a proteína S-100 e para os linfócitos T (CD3). Foram estudadas algumas variáveis clínicas, incluindoa sobrevida dos animais, desenvolvendo esforços para a identificação de factores de prognóstico. As neoplasias ocorreram em gatos maioritariamente de raça Europeu Comum,de ambos os sexos, com idade média de 8,9 anos. A maioria dos sarcomas estava localizada na parede costal. Apresentaram frequentemente grau histológico elevado e padrão de crescimentoinfiltrativo. Observámos agregados linfocitários peritumoraisem 58 neoplasias. Os fibrossarcomas foram o tipo histológicomais representativo do nosso estudo com 42 neoplasias, ocor-rendo também 9 mixossarcomas, 8 fibro histiocitomas malignosde células gigantes, 2 tumores malignos das bainhas nervosasperiféricas e um lipossarcoma mixóide. Três fibrossarcomasevidenciaram diferenciação cartilagínea e um fibrossarcoma eracomposto por células neoplásicas do tipo rabdomiossarcoma.As células neoplásicas revelaram padrão de imunomarcaçãocaracterístico dos miofibroblastos em todos os tipos histológicos.O valor da mediana para o tempo de sobrevida total para osgatos foi de 277 dias (9 meses) e para o tempo de sobrevida livrede doença de 198 dias (6 meses). O tamanho, o padrão decrescimento e a necrose das neoplasias foram associados aoprognóstico.

Palavras chave: gato, sarcomas, factores de prognóstico.

Summary: In this study, 62 feline soft tissue sarcomas havebeen evaluated by histopathology, histochemistry (Alcian Blue)and immunohistochemistry with intermediate filaments markers(vimentin, smooth muscle actin, desmin and cytokeratin 14), S-100 protein marker and CD3, a lymphoid T cell marker. We have also evaluated some clinical variables including catssurvival, having developed efforts to identify prognostic factors.

Sarcomas affected mainly short haired breed cats, of both sexes,with 8,9 years old in inaverage.The most frequent anatomiclocation observed was the thoracic wall. The majority of the sarcomas presented high histological grade and infiltrativegrowth pattern. We observed peritumoral lymphocytic aggregates on 58 neoplasms. Fibrosarcoma was the most frequent histological type observed, 42 neoplasms. Moreover, 9myxosarcomas, 8 giant cells malignant fibrous histiocytomatumours, 2 malignant peripheral nerve sheath tumours and 1myxoide liposarcoma, also ooccurred. Three fibrosarcomasshowed cartilaginous differentiation and one fibrosarcoma wascomposed by "rhabdomyosarcoma-like" neoplastic cells. It waspossible to identify myofibroblast immunopattern in all histological types. The median for time of global survival was277 days (9 months) and for time of survival disease free was198 days (6 months). Features such as tumour size, growth pat-terns and necrosis were associated with prognosis

Keywords: cat; sarcomas, prognostic features.

Introdução

Os sarcomas dos tecidos moles aparecem com relativa frequência nos gatos. Classicamente, obser-vam-se dois tipos distintos de apresentação clínica: aforma multicêntrica dos gatos jovens (geralmente commenos de 4 anos de idade), causado pelo Vírus doSarcoma Felino (FeSV), um Oncornavírus da famíliaRetroviridae, e uma forma solitária tanto nos jovenscomo nos adultos, em que o FeSV não parece estarimplicado (Snyder, 1969; Brown et al., 1978; Hoovere Mullins, 1991; Pereira e Tavares, 1998). Em 1990observou-se um aumento dos sarcomas solitários dérmicos e subcutâneos, em gatos de várias faixasetárias, localizados na porção dorsal do pescoço e naregião interescapular (Hendrick e Goldschmidt, 1991)que diferiam das formas clássicas pela presença deinfiltrado inflamatório peritumoral linfo-granulo-matoso, semelhante ao descrito em reacções inflama-tórias pós vacinais por Hendrick e Dunagan (1991)tendo sido designadas de "fibrossarcomas pós vacinais"

*Correspondência: [email protected]: +351 252660669; Fax: +351 252660699

na Classificação Histológica dos Tumores Mesenquima-tosos da Pele e Tecidos Moles dos Animais Domésticos,da OMS (Hendrick et al., 1998). Para além da vacinação,a inoculação parentérica de substâncias como a peni-cilina, a metilprednisolona, a lufenurona ou utilizaçãode material de sutura, também já foram associadas àformação dos sarcomas no gato (Gagnon, 2000; Cohenet al., 2001).

Para alguns autores, estes sarcomas têm origem emmecanismos oncogénicos diferentes dos observadosnos clássicos, constituindo uma entidade patológicadistinta (Kass et al., 1993; Hendrick et al., 1994b;Doddy et al., 1996). Nesta hipótese, a vacinaçãoinduziria a inflamação crónica com transformaçãoneoplásica das células mesenquimatosas participantesno processo de reparação, os fibroblastos e os miofi-broblastos (Hendrick e Dunagan, 1991; Hendrick eGoldschmidt, 1991; Dubielzig et al., 1993; Esplin etal., 1993; Kass et al., 1993; Hendrick e Brooks, 1994;Hendrick et al., 1994a; Hendrick et al., 1994b; Doddyet al., 1996; Macy e Hendrick, 1996; Schultze et al.,1997). As citocinas e os radicais livres oxidantes libertados pelas células inflamatórias, a alteração dosfactores de crescimento e dos seus receptores, o Vírusdo Sarcoma Felino (FeSV), a activação de oncogenes,as mutações dos genes supressores tumorais e dosgenes envolvidos na apoptose (Hendrick e Brooks,1994) interrelacionados com as características genéti-cas do gato, produzirão efeitos mitogénicos e perda da homeostasia celular, aumentando a possibilidadede transformação neoplásica de células tão lábeis e heterógeneas como os miofibroblastos (Bergman,1998; Doliger e Devauchelle, 1998; Hendrick, 1998a).

O presente trabalho pretende ser um contributo parao estudo das características anatomoclínicas, dos fac-tores de prognóstico e do padrão de imunorrectividadedos sarcomas, na tentativa de compreender melhor asua biopatologia. Com esse propósito estudaram-sealgumas variáveis clínicas como o sexo, idade, raça,localização tumoral e reuniram-se informações clínicaspara o estudo da sobrevida. Não foi nosso objectivoestudar o processo de cancerização nem a histogénese,que exigiriam metodologias diferentes e menosdisponíveis.Para o estudo dos sarcomas utilizámos astécnicas de histologia convencional, histoquímica(Azul de Alçião) e de imunohistoquímica com mar-cadores para os filamentos intermédios (vimentina,α actina de músculo liso, citoqueratina 14) para a proteína S-100 e para os linfócitos T (CD3).

Material e métodos

Neste trabalho estudaram-se 62 sarcomas dos tecidos moles de gatos, recorrendo a amostras doarquivo histológico do Laboratório de AnatomiaPatológica da Faculdade de Medicina Veterinária daUniversidade Técnica de Lisboa (n=58) e do Sector de

Diagnóstico Anatomohistopatológico do LaboratórioNacional de Investigação Veterinária – Campus Vairão(n=4).

As neoplasias, diagnosticadas entre 1999 e 2001,estavam disponíveis em blocos de parafina. Forameliminadas do estudo todas as neoplasias cujas peçasapresentavam tamanho insuficiente, limites periféricosmal definidos e localização anatómica incerta, peloque as preparações histológicas utilizadas eram repre-sentativas do tumor, continham margens tumoraisdefinidas e áreas de pele íntegra para controlo interno.Para o estudo da macroscopia, características dasuperfície de corte e tamanho das neoplasias, foramconsultados os registos laboratoriais.

A partir dos blocos de parafina, efectuaram-secortes de 4 µm em micrótomo rotativo para o estudohistopatológico, histoquímico e imunohistoquímico.

Os dados clínicos considerados, tais como a idade àdata da primeira cirurgia, o sexo, a raça e a localiza-ção das neoplasias, descritas nas folhas de requisiçãopara análise, foram confirmados com os clínicosassistentes por telefone.

Os animais do estudo foram sujeitos a excisão cirúrgica para extirpação do tumor primário, semtratamento adicional. O seguimento clínico foi possívelpara 51 animais e a data do final do estudo foi 31 deDezembro de 2002. Foram descartados, 8 animais porimpossibilidade de acesso à sua ficha clínica, 2 porabandono das consultas sem que tivesse havido possi-bilidade de contactar os proprietários e 1 cuja colheitada neoplasia coincidiu com o acto de necrópsia, num total de 11 animais. Foram registadas as datas da cirurgia, da primeira recidiva e a eventual data da eutanásia ou morte natural, através de contactotelefónico com o clínico veterinário assistente.Quando alguma destas informações não estavadisponível, e sempre que possível, foram contactadosos proprietários dos animais. Os resultados ambíguosou incompletos foram eliminados do estudo. Estasinformações foram utilizadas para a determinação dosseguintes parâmetros:

Tempo de sobrevida livre de doença – o intervalo detempo (em dias) desde a data da primeira excisão atéà data declarada da primeira recidiva;

Tempo de sobrevida total – o intervalo de tempo (emdias) desde a data da primeira excisão até à data damorte do animal ou à data final do estudo.

Características histopatológicas

As preparações histológicas foram coradas pela coloração de Hematoxilina e Eosina (H&E) pelo procedimento de rotina. As neoplasias foram agru-padas em 5 tipos histológicos pelos critérios morfoló-gicos observados e padrão imunofenótipico das célulasneoplásicas, com base na Classificação Histológicados Tumores Mesenquimatosos da Pele e TecidosMoles dos Animais Domésticos da OrganizaçãoMundial da Saúde (OMS) (Hendrick et al., 1998).

Ochôa C e Lopes C RPCV (2008) 103 (565-566) 5-15

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Procedeu-se à avaliação do padrão de crescimentotendo-se considerado infiltrativo quando ocorriainvasão e dissociação dos tecidos vizinhos pelas célulasneoplásicas ou expansivo quando as lesões apresen-taram vários nódulos delimitados por uma fina cápsulade tecido conjuntivo.

O grau histológico foi obtido adicionando os trêsvalores da pontuação atribuídos para a diferenciaçãotumoral, contagem de mitoses e quantidade de necrose(ver Tabela 1), de acordo com um dos sistemas degraduação mais utilizados em Medicina Humana, osistema FNCLCC (French Fédération Nationale desCentres de Lutte Contre le Cancer) (Fletcher et al.,2002) que tem sido adaptada em tumores animais(Couto et al., 2002; Bettini et al., 2003).

Tabela 1 - Sistema de Graduação da FNCLCC: Definição deparâmetros (Adaptado de Fletcher et al., 2002)

Diferenciação Tumoral:

Pontuação 1: Células neoplásicas semelhantes ao tecidomesenquimatoso normal

Pontuação 2: Células neoplásicas pouco diferenciadas, mascom alguma semelhança com tecido mesenquimatoso normal

Pontuação 3: Células neoplásicas sem semelhança com tecidomesenquimatoso normal

Contagem de Mitoses (em 10 campos a 400x):

Pontuação 1: 0-9 Mitoses

Pontuação 2: 10-19 Mitoses

Pontuação 3: ≥20 Mitoses

Necrose Tumoral:

Pontuação 0: ausente

Pontuação 1: <50% Necrose

Pontuação 2: ≥ 50% Necrose

Grau Histológico:

Grau 1: Total pontuação: 2,3

Grau 2: Total de pontuação: 4,5

Grau 3: Total de pontuação: 6,7,8

Quando presente, o infiltrado inflamatório intra eperitumoral foi avaliado em relação à intensidade, distribuição e tipo celular constituinte. A intensidadedo infiltrado peritumoral foi avaliada qualitativamente(abundante, moderada, baixa ou ausente) pelaobservação dos agregados inflamatórios nos camposperitumorais em fraca ampliação (40x), à semelhançado realizado em outro estudo (Couto et al., 2002).

Estudo histoquímico

Foram avaliados os mucopolissacáridos em dez neoplasias com maior quantidade de estroma de

natureza mixóide (9 mixossarcomas e um lipossarcomamixóide). Fizeram-se dois cortes de 4 µm em micrótomorotativo e as preparações histológicas foram submeti-das em simultâneo à coloração Azul Alcião, a pH 1 ea pH 2,5 utilizando o "kit" de coloração (Bioóptica,161802). Os corantes alcião unem-se aos polianiõesconstituídos por radicais sulfúricos e carboxílicos dosmucopolissacáridos, só reagindo com as mucinas ácidas. Para o procedimento de coloração seguiram-seas indicações do fabricante.

Estudo imunohistoquímico

Utilizou-se o método indirecto de Avidina-Biotina-Peroxidase (ABC) usando como cromogéneo otetrahidrocloreto de 3´3 Diaminobenzina (DAB). Asincubações foram realizadas em câmara húmida e aslavagens foram efectuadas numa solução de TampãoTris Salino (TBS). Utilizou-se o tratamento térmico narecuperação antigénica. Para tal, os cortes foram colo-cados numa "cuvette" de plástico contendo TampãoCitrato de Sódio a 0,01 M (pH 6,0) e colocados embanho-maria a 99º C durante 20 minutos. Em seguidaforam arrefecidos, durante 20 minutos e colocados emTBS.

Após terem sido desparafinados e hidratados, oscortes colados em lâminas previamente revestidascom Poli-L-Lisina (Sigma) foram incubados durante30 minutos numa solução aquosa de Peróxido deHidrogénio a 3% (Merck) para a inibição da peróxi-dase endógena dos tecidos. Posteriormente para bloqueio de reacções inespecíficas, as preparaçõesforam incubadas em soro normal, diluído a 1/5 emTBS. Utilizou-se soro normal de coelho (Dako,X0902) para os anticorpos monoclonais e soro normalde suíno (Dako, X0901) para os anticorpos policlonais.Seguiram-se as incubações com os anticorposprimários, de acordo com o descrito na Tabela 2.

Após a exposição ao anticorpo primário, os cortesforam incubados durante 30 minutos com o anticorposecundário biotinilado adequado, soro de coelho anti-ratinho (Dako, E0354) diluído a 1/400 (anticorposmonoclonais) ou soro de suíno anti-coelho (Dako,E0353) diluído a 1/500 (anticorpos policlonais).

Os cortes foram incubados 30 minutos com o sorocomplexo Avidina-Biotina-Peroxidase (Dako, K0377)para amplificar o reconhecimento dos epítopes e utili-zou-se o cromógeneo DAB (Dako, K0391) durante 8minutos para visualizar a reacção. A reacção foi inter-rompida com água destilada e as preparações foram


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Anticorpo Tipo Referência Diluição Tempo de IncubaçãoAnti-vimentina (Clone V9) Monoclonal Dako, M0725 1/50 60 minutosAnti-desmina (Clone D33) Monoclonal Dako, M0760 1/50 60 minutosAnti-α Actina de músculo liso (Clone 1A4) Monoclonal Dako, M0851 1/50 60 minutosAnti-S-100 Policlonal Dako, Z0311 1/200 60 minutosAnti-citoqueratina 14 (Clone LL002) Monoclonal Serotec, MCA890H 1/10 Durante a noiteAnti-CD3 Policlonal Dako, A0452 1/50 60 minutos

Tabela 2 - Anticorpos primários utilizados, diluições e tempos de exposição

contrastadas com Hematoxilina de Gill, durante 5minutos, desidratadas, clarificadas e montadas comEntellan® (Merck).

Para todas as proteínas avaliadas utilizaram-se controlos positivos adequados e para controlo negativoutilizou-se o procedimento habitual referido anterior-mente, tendo-se substituído o anticorpo primário porTBS.

A imunorreactividade foi avaliada qualitativamentetendo-se considerado positiva quando a marcaçãoocorria no citoplasma das células neoplásicas inde-pendentemente do grau de intensidade, com excepçãopara a proteína S-100 em que a marcação nuclear também foi considerada.

Análise estatística

Os resultados foram expressos em frequências absolutas e relativas (percentagens) e para as variáveisnuméricas foi calculada a média, desvio padrão,mediana e valores mínimo e máximo.

As variáveis contínuas foram estudadas através dostestes t de Student ou ANOVA. Quando necessário, asvariáveis foram categorizadas, utilizando a médiacomo valor "cut off" nas variáveis numéricas.

A sobrevida global foi calculada pelo método deKaplan-Meier. Os dados foram censurados quando osgatos estavam vivos no final do estudo. As variáveis:tamanho, padrão de crescimento, necrose e grau histológico das neoplasias, foram relacionadas com otempo de sobrevida total. Foram calculadas as media-nas da sobrevida total para cada uma das categorias, eas diferenças entre os grupos foram comparadas peloteste de log-Rank, com o objectivo de estudar a suaimportância como possíveis factores de prognóstico.

As associações encontradas foram consideradas significativas para valores de p <0,05.

Resultados

No nosso estudo utilizámos 62 gatos, com idadescompreendidas entre os 8 meses e os 20 anos, à data dacirurgia, sendo a média de idade de 8,9 anos (desviopadrão=2,9). As neoplasias ocorreram em 32 machos(51,6%) e 30 fêmeas (48,4%). A raça Europeu Comumfoi a predominante, 49 gatos (79,0%), estando tambémrepresentadas as raças Siamesa (14,5 %, n= 9), Persa(4,9%, n=3) e Bosque da Noruega (1,6%, n=1). Todos

os animais apresentavam neoformações cutâneas dis-tribuídas maioritariamente na parede costal (86.7%)ocorrendo também na mama (6,5%, n=4), no membro(3,2%, n=2), na axila (1,6%, n=1), no sacro (3,2%, n=2)e na zona inguinal (1,6%, n=1).

Dos 51 gatos utilizados no estudo de sobrevida, 4apresentaram sintomas de metástases (7,8%), recor-rendo à consulta com estado de saúde precário, comdispneia grave (confirmação radiográfica em 2 casos)e linfadenomegália inguinal num caso. O valor damediana do tempo de sobrevida total foi de 277 dias(9 meses), variando entre os 19 a 1263 dias (42meses). No final do estudo o total de animais mortosfoi de 38 (74,5%). Permaneciam vivos 13 animais(25,5%). Dois destes casos apresentaram tempos desobrevida superiores a 1000 dias. Foram observadasrecidivas em 44 casos (86,3%) e o tempo mediano doseu aparecimento foi de 198 dias (6,6 meses), variandoentre 19 a 515 dias. Apenas 3 animais apresentaramtempos de primeira recidiva superiores a 1 ano.

Caracterização das neoplasias

Os sarcomas foram agrupados em fibrossarcomas,mixossarcomas, fibrohistiocitoma maligno de célulasgigantes, tumores malignos das bainhas nervosas periféricas e lipossarcoma mixóide (Tabela 3).

Os fibrossarcomas (Figura 1) foram o tipo histológicomais representativo do nosso estudo, num total de 42neoplasias. Eram caracterizados por densidade celularelevada e células neoplásicas fusiformes, com acentua-do pleomorfismo citonuclear organizados em feixesmultidireccionais.


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Tabela 3 - Classificação histológica dos sarcomas observados

Tipo histológico Total n (%) Parede costal Outras localizações

Mixossarcoma 9(14,5) 9 0

Fibrohistiocitoma maligno de células gigantes 8(12,9) 6 2

Tumor maligno das bainhas nervosas periféricas 2(3,2) 1 1

Lipossarcoma mixóide 1(1,6) 1 0

TOTAL 62 (100) 52 (86,7) 10 (13,3)

Figura 1 - Fibrossarcoma composto por feixes multidireccionados decélulas neoplásicas fusiformes. Anisocitose e hemorragia. H&E.100x

Dentro deste grupo, destacámos três neoplasias(Figura 2), multinodulares, compostas por pequenascélulas indiferenciadas misturadas em ilhotas de carti-lagem hialina que ocupavam a quase totalidade dasmassas neoplásicas.

Outra das neoplasias (Figura 3) enquadrada nestegrupo era composta na sua totalidade por célulasredondas bastante atípicas, com citoplasma claro,eosinófilo e abundante, com um ou dois núcleos,encostados à periferia, sugerindo imagens de célulasneoplásicas do tipo rabdomiossarcoma.

Os mixossarcomas (Figura 4) apresentaram estromade mucopolissarídeos ácidos moderado a abundante.No geral, apresentaram áreas hipocelulares com célulasneoplásicas dispostas perpendicularmente a finos septosde tecido conjuntivo, e produção de mucina, para ocentro da lesão, frequentemente necrosado.

Nos fibro-histiocitomas malignos, variante decélulas gigantes (Figura 5) observámos a presença deabundantes células gigantes multinucleadas do tipoosteoclasto, num substrato de células neoplásicasfusiformes, de núcleos ovóides a redondos.

Os tumores malignos das bainhas nervosas periféricascaracterizaram-se pela presença de fascículos multidirec-cionados de células fusiformes pequenas, ocasional-mente justapostas em paliçada (Figura 6).

O lipossarcoma mixóide (Figura 7) apresentavaáreas menos densas, de matriz do tipo mixóide, comcélulas de características fusiformes a poligonais. Ascélulas poligonais dispersas na matriz possuíam, porvezes, vacúolos lipídicos múltiplos e de variadostamanhos, que deformavam as células e indentavam onúcleo, revelando diferenciação no sentido do lipoblasto.


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Figura 2 - Fibrossarcoma evidenciando diferenciação cartilagínea.H&E, 200x

Figura 3 - Fibrossarcoma composto por células neoplásicas pleomórficas com abundante citoplasma eosinofilico do tipo "rabdomiossarcoma". H&E.200x

Figura 4 - Mixossarcoma com estroma mixóide moderado.Anisocitose e anisocariose das células neoplásicas. H&E.100x

Figura 7 - Lipossarcoma Mixóide. Estroma de natureza mixóide moderado, células estreladas e contendo vacúolos lipídicos. H&E.100x

Figura 5 - Fibro-histiocitoma maligno, variante de células gigantes.Células gigantes multinucleadas reactivas, não neoplásicas ou do tipoosteoclasto H&E.100x

Figura 6 - Tumor Maligno das Bainhas Nervosas Periféricas, localizadono membro posterior e intimamente relacionado com a presença denervos periféricos. Células neoplásicas justapostas em paliçada.H&E.100x

Padrão de crescimento

Observámos padrão de crescimento infiltrativo cominvasão e dissociação dos tecidos vizinhos em 48 sarcomas. Os restantes apresentaram vários nódulosdelimitados por uma fina cápsula de tecido conjuntivoe padrão de crescimento expansivo, estando represen-tados nesta categoria cinco fibrossarcomas (dois dosquais com diferenciação cartilagínea), cinco mixos-sarcomas e quatro fibrohistiocitomas malignos decélulas gigantes.

Imunorreactividade das células neoplásicas aos filamentos intermédios e proteína S-100

As células neoplásicas revelaram imunorreactivi-dade de padrão difuso para o marcador vimentina emtodos os tipos histológicos (Figura 8). Este filamentointermédio tradicionalmente associado a célulasmesenquimatosas, esteve presente numa grande variedade de células, tendo sido identificado emfibroblastos, condroblastos, células musculares lisas eendotélio. A expressão das células neoplásicas aos filamentos intermédios desmina, α actina de músculoliso e à proteína S-100 foi variável (Tabela 4), tendosido utilizada na determinação da sua linha de diferen-ciação. O anticorpo anti-desmina apresentou marcaçãofocal em quatro das neoplasias estudadas, ocorrendotambém no músculo esquelético e de forma variávelnos vasos. O marcador anti-α actina de músculo lisoapresentou ampla distribuição nos sarcomas tendo-seobservado imunorreatividade em todos os tipos his-tológicos. Foi possível identificar imunofenótipomiofibroblasto em todos os tipos histológicos, numtotal de 50 neoplasias, das quais 46 expressaramantigénios vimentina/α actina (tipo VA), 2 vimentina/αactina/desmina (tipo VAD) e 2 vimentina/desmina (tipoVD).

O anticorpo anti-proteína S-100 foi útil na identifi-cação dos tumores com origem nas baínhas nervosasperiféricas. Estas neoplasias eram compostas por célu-las intensamente imunorreactivas a este marcador(Figura 9). As células com diferenciação cartilagínea elipoblástica também foram imunorreactivas a estemarcador (Figuras 10 e 11).

A imunorreactividade ao marcador citoqueratina 14foi avaliada nas neoplasias localizadas na mama. Estaproteína, em geral presente nas células mioepiteliais


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Tabela 4 - Expressão dos marcadores desmina,α actina e proteína S-100 das células neoplásicas nos diferentes tipos histológicos.FMCG- Fibrohistiocitoma maligno de células gigantes. TMBN- Tumor maligno das bainhas nervosas.

Tipo Histológico Desmina (n/T) α Actina (n/T) S-100 (n/T)

+ ++ +++ % + ++ +++ % + ++ +++ %

Fibrossarcoma 2/42 1/42 _ 7,1 6/42 12/42 18/42 85,7 2/42 _ 3/42 11,9

Mixossarcoma 1/9 _ _ 11,1 1/9 1/9 1/9 33,3 1/9 _ _ 11,1

FMCG _ _ _ 0 _ 1/8 5/8 75 _ _ 2/8 25

TMBN _ _ _ 0 _ 1/2 1/2 100 _ _ 2/2 100

Lipossarcoma _ _ _ 0 _ _ 1/1 100 _ _ 1/1 100

Figura 8 - Fibrossarcoma Imunorreactividade ao marcador vimentina.Intensa marcação citoplasmática. ABComplex-HRP, 200X

Figura 9 -Tumor maligno das bainhas nervosas periféricas.Imunorreactividade ao marcador proteína S-100. ABComplex-HRP,100X

Figura 10 - Fibrossarcoma. Imunorreactividade ao marcador proteínaS-100. Intensa marcação das células de diferenciação cartilagínea.ABComplex-HRP, 100X

da mama, não foi evidenciada nestes sarcomas. Assimexcluímos a hipótese de estarmos a abranger no nossoestudo mioepiteliomas malignos da mama.

Graduação histológica

Dos 62 sarcomas do nosso estudo, 51 apresentaramgrau histológico 3 (82,3%), 10 apresentaram grau 2(16,1%) e uma apresentou grau 1 (1,6%). O grau histológico esteve associado à localização tumoral(p=0,02), tendo-se verificado que 88,4% das neoplasias de grau 3 e 70% das neoplasias de grau 2 estavam localizadas na parede costal. Os mixossar-comas, os fibrohistiocitomas malignos de célulasgigantes e o lipossarcoma mixóide da nossa série deneoplasias apresentaram sempre grau 3.

Infiltrado inflamatório

A presença de infiltrado inflamatório peritumoralfoi observada em 58 neoplasias. Era constituído porcélulas do tipo linfo-plasmocitário e macrofágico,organizado em agregados foliculares linfogranulo-matosos, perivasculares ou em pequenos folículos.Observámos linfócitos imunorreactivos ao anticorpoanti-CD3, o que sugere a presença dos linfócitos Tnestes agregados.

Em 20 neoplasias (32,3%) observou-se a presençade linfócitos intratumorais. Em 12 neoplasias, foi possível observar grandes quantidades de neutrófilosnas proximidades de áreas necrosadas. Em duas neoplasias localizadas na parede costal, observaram-seaglomerados de células macrofágicas, compatíveiscom células espumosas. O infiltrado inflamatórioesteve associado a neoplasias localizadas na paredecostal (p=0,000001) e de elevado grau histológico(p=0,03).

Estudo dos factores de prognóstico

O tamanho (p=0,02), o padrão de crescimento(p=0,04) e a necrose das neoplasias (p=0,05) influen-ciaram a sobrevida dos animais. As menores dimensões

(Figura 12), o padrão de crescimento expansivo(Figura 13) e a ausência de necrose (Figura14) reve-laram-se factores de prognóstico favoráveis. Nãoforam observadas diferenças significativas entre asobrevida total e o grau histológico (p=0,32).


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Discussão

Os sarcomas estudados ocorreram em gatos comidade média de 8,9 anos, não se observando predis-posição entre sexos, o que está de acordo com a literatura consultada (Kass et al, 1993 ;Hendrick et al.,1994b; Doddy et al., 1996; Lester et al., 1996;Davidson et al., 1997; Cronin et al., 1998; Doliger e

Figura 11 - Lipossarcoma mixóide. Imunorreactividade ao marcadorproteína S-100. Intensa marcação das células de diferenciação lipoblástica. ABComplex-HRP, 200x

Figura 12 - Curva de sobrevida e o efeito do tamanho das neoplasias(p=0,02).

Figura 13 - Curva de sobrevida e o efeito da variável patológicapadrão de crescimento (p=0,04).

Figura 14 -Curva de sobrevida e o efeito da variável patológicanecrose (p=0,05).

Davauchelle, 1998; Hershey et al., 2000; Cohen et al.,2001; Couto et al., 2002; Kobayashi et al., 2002.

A raça Europeu Comum foi a mais frequentementeobservada neste estudo. Este facto pode reflectir a suamaior frequência em Portugal. No entanto, existemvários estudos em que o mesmo foi observado (Brownet al., 1978; Bostock e Dye, 1979; Davidson et al.,1997; Cronin et al., 1998; Hershey et al., 2000; Cohenet al., 2001; Kobayashi et al., 2002).

As neoplasias estavam preferencialmente locali-zadas em áreas anatómicas para a vacinação (paredecostal). Estas apresentaram características histopatológi-cas de maior malignidade relativamente às localizadasem outras regiões. Este facto, também observado emestudos anteriores (Doddy et al., 1996) sugere origemiatrogénica para estas neoplasias (Hendrick eGoldschmidt, 1991; Doliger et al., 1992; Kass et al.,1993; Esplin et al., 1993; Gruffydd-Jones e Sparkes,1994; Hendrick et al., 1994b; Doddy et al., 1996;Davidson et al., 1997; Macy e Hendrick, 1996; Cohenet al., 2001; Doliger e Devauchelle, 1998; Gagnon,2000; Gobar e Kass, 2002).

Neste estudo, os gatos foram sujeitos ao tratamentocirúrgico para a extirpação do tumor primário, semrecurso a terapias adicionais e apresentaram valormediano para a sobrevida total de 277 dias (9 meses),ou seja menor sobrevida do que a apresentada emestudos anteriores (Brown et al., 1978; Bostock &Dye, 1979; Davidson et al., 1997; Hershey et al.,2000). Têm sido publicados vários trabalhos sobre autilização de múltiplas modalidades terapêuticas,tendo-se observado aumento dos tempos de sobrevidatotal para os gatos recorrendo à radioterapia neoadju-vante (Macy & Bergman, 1995; Couto & Macy, 1998;Cronin et al., 1998; Doliger & Devauchelle, 1998),radioterapia adjuvante (Couto & Macy, 1998;Bregazzi et al., 2001), radioterapia intersticial eimunogenoterapia (Macy & Bergman, 1995; Doliger& Devauchelle, 1998). Outros tratamentos incluíram acriocirurgia e a imunoterapia adjuvante com ou semquimioterapia, mas sem grande sucesso (Brown et al.,1978; Miller et al., 1991). A utilização da quimioterapiaadjuvante com ou sem radioterapia já foi avaliada,mas a sua importância permanece controversa. Foramutilizados vários agentes quimioterápicos, como ametotrexato (Brown et al., 1978), adriamicina (Macy& Bergman, 1995; Doliger & Devauchelle, 1998),doxorrubicina (Cronin et al., 1998; Barber et al.,2000; Cohen et al., 2001; Kobayashi et al., 2002),vincristina (Brown et al., 1978; Kobayashi et al.,2002), ciclofosfamida (Brown et al., 1978; Cohen etal., 2001 Kobayashi et al., 2002) e a carboplatina(Kobayashi et al., 2002).

O nosso estudo parece reforçar a ideia de que acirurgia por si só, não parece ser suficiente, no trata-mento dos sarcomas felinos reforçando a necessidadede pesquisar novas formas de tratamento. A utilizaçãodestas terapias em Medicina Veterinária, é, no entanto

condicionada pela sua grande exigência quer emrecursos económicos quer técnicos, sendo a extir-pação cirúrgica a principal terapêutica. A precocidadeda intervenção e a extensão alargada da exerése sãofactores que contribuem para o sucesso do tratamentocirúrgico (Brown et al., 1978; Bostock & Dye, 1979;Davidson et al., 1997; Devauchelle et al., 1997;Doliger & Devauchelle, 1998; Couto & Macy, 1998;Hershey et al., 2000).

No nosso estudo 86,3% dos gatos apresentaramrecidivas. A frequência de recidivas foi superior àdescrita em outros estudos, que ronda os 30 a 60%(Couto & Macy, 1998; Hershey et al., 2000; Cohen etal., 2001; Kobayashi et al., 2002). O tempo medianodo seu aparecimento foi de 198 dias (6,6 meses).

Foram registadas quatro mortes associadas a metas-tização neoplásica dos sarcomas, correspondendo a7,8% dos animais avaliados neste estudo. Este valorpode ser um número abaixo do valor real, pois, algunsanimais permaneciam em risco no final do estudo enão foram clinicamente avaliados e noutros casos, a sua detecção não foi possível pela ausência denecrópsias. Alguns estudos sugerem que a metastiza-ção destas neoplasias seja mais frequente, do que inicialmente se pensava, atingindo 10 a 25% dos gatos(Couto & Macy et al., 1998; Cronin et al., 1998;Hershey et al., 2000; Kobayashi et al., 2002). Pela sintomatologia descrita as metástases ocorreramsobretudo no pulmão e nos linfonodos. Estudos anteriores citam os pulmões como os órgãos maisafectados, seguidos dos linfonodos regionais, rim,baço, intestino, pele, esqueleto e fígado (Brown et al.,1978; Bostock & Dye, 1979; Hendrick et al., 1994b;Esplin et al., 1996; Davidson et al., 1997; Couto &Macy, 1998; Cronin et al., 1998; Hershey et al., 2000;Kobayashi et al., 2002).

Os fibrossarcomas representaram 67,7% das neo-plasias estudadas. Foram na sua maioria, morfologica-mente semelhantes ao "fibrossarcoma pós-vacinalfelino", descrito na Classificação Histológica dosTumores Mesenquimatosos da Pele e Tecidos Molesdos Animais Domésticos da OMS (Hendrick et al.,1998). No entanto, dentro deste grupo, incluímos neo-plasias com características morfológicas particulares.Três fibrossarcomas evidenciaram diferenciação cartilagínea e um fibrossarcoma era composto porcélulas neoplásicas do tipo rabdóide. A criação emclassificações futuras, dos subtipos histológicos - con-drossacoma e de sarcoma do "tipo rabdomiossacoma"-para os sarcomas pós vacinais no gato, permitiria caracterizar com mais pormenor, neoplasias com características semelhantes às observadas neste estudo.Estes tipos histológicos já foram referenciados na literatura, tendo-se identificado também os osteossar-comas e os hemangiossacomas (Hendrick & Brooks,1994; Macy & Bergman, 1995; Doddy et al., 1996;Lester et al., 1996; Coyne et al., 1997; Hershey et al.,2000; Cohen et al., 2001).


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As neoplasias do nosso estudo eram maioritaria-mente compostas por miofibroblastos, reconhecidospelo padrão de imunomarcação. As células neoplásicasexpressaram antigénios vimentina/α actina (tipo VA),vimentina/α actina/desmina (tipo VAD) e vimentina/desmina (tipo VD). É geralmente aceite que os miofi-broblastos representam células "transicionais" entrefibroblastos e células musculares lisas sendo caracte-rizados pelos seus imunofenótipos diversos, podendoocorrer variações dentro da mesma lesão à medida queesta progride (Mentzel e Fletcher, 1997).

Na literatura consultada encontramos referências daocorrência de sarcomas miofibroblásticos no gato(Dubielzig et al., 1993; Doliger & Devauchelle,1998), assim como da presença de miofibroblastos,estreitamente associadas aos sarcomas felinos(Hendrick & Brooks, 1994; Hendrick et al., 1994b;Doddy et al., 1996; Couto et al., 2002). Já foi possível,inclusive, a identificação dos miofibroblastos emestudos de ultraestrutura (Dubielzig et al., 1993;Hershey et al., 2000; Madewell et al., 2001). Com oadvento da imunohistoquímica, os miofibroblastosforam reconhecidos com maior frequência numagrande variedade de tecidos normais e patológicos. Ascicatrizes e as fibromatoses, pelo menos inicialmentesão compostas por miofibroblastos proliferativos,contudo à medida que as lesões envelhecem ou hiali-nizam, as células com as características de fibroblastosmaduros tornam-se progressivamente mais predomi-nantes (Mentzel & Fletcher, 1997; Coffin & Fletcher,2002). Os miofibroblastos, além de participarem emrespostas reparativas e na resposta estromal de neo-plasias, representam ainda um componente importantede numerosas neoplasias mesenquimatosas malignas ebenignas (Miettinen, 1988; Roche, 1990; Mentzel &Fletcher, 1997). Para alguns autores, os sarcomasmiofibroblásticos são provavelmente mais frequentesdo que se pensava e incluem grande variedade de formas clínico-patológicas. O estabelecimento domiofibroblasto como tipo celular distinto não só veioaumentar o nosso entendimento da biologia das células mesenquimatosas e da sua plasticidadefenotípica, como também veio permitir uma melhorcaracterização das lesões mesenquimatosas reactivas,benignas ou malignas (Mentzel & Fletcher, 1997;Couto et al., 2002).

A presença de infiltrado inflamatório peritumoralfoi observada em 93,5% dos sarcomas do nosso estudo. Alguns autores sugerem que a pseudocápsulade miofibroblastos, geralmente presente nestas neo-plasias, será responsável por exercer uma barreiramecânica que impede a penetração de linfócitos e de macrófagos na massa neoplásica, formando-se agregados foliculares peritumorais (Couto et al.,2002). Os folículos linfóides observados na periferiados tumores revelaram a presença de linfócitos comimunofenótipo T. Esta observação está de acordo como descrito em estudos anteriores (Hendrick, 1998b;

Couto et al., 2002).A caracterização da população linfocitária, associada

a este tipo tumoral parece importante para desvendaro papel que desempenham na patogenia, já que ainflamação pode ter um papel preponderante na carcinogénese e na progressão tumoral. Os linfócitosT activados e os macrófagos produzem várias citocinasindutoras de angiogénese e providenciam mitogéniospotentes para os fibroblastos, influenciando diversasactividades enzimáticas envolvidas na remodelação damatriz extra-celular (Tazawa et al., 2003; Pikarsky E.et al., 2004). Hendrick, (1998b) identificou imunorre-actividade a factores de crescimento, tais como PDGF(factor de crescimento derivado das plaquetas) em linfócitos e ao seu receptor nos macrófagos associadosaos sarcomas pós vacinais do gato. Estes dados sugerem que os linfócitos secretam PDGF para orecrutamento de macrófagos e causam proliferação defibroblastos. Os factores de crescimento representamreguladores importantes no crescimento celular normal e neoplásico e podem indicar auto-estimulaçãodo crescimento tumoral e reflectir comportamentobiológico mais adverso (Calonje e Fletcher, 1995).

A localização tumoral (Bostock e Dye, 1979;Hendrick et al., 1994b; Hershey et al., 2000), o índicemitótico (Bostock e Dye, 1979), o tipo de excisãocirúrgica (Bostock e Dye, 1979; Hershey et al., 2000;Cohen et al., 2001; Kobayashi et al., 2002), as margens cirúrgicas livres de células neoplásicas(Cronin et al., 1998, Doliger e Devauchelle, 1998;Hershey et al., 2000; Kobayashi et al., 2002), o tamanhoda neoplasia, a presença de metástases e a precocidadeda radioterapia adjuvante (Cohen et al., 2001) jáforam significativamente associados com a sobrevidatotal.

Foi objectivo do nosso trabalho reconhecer factoresde prognóstico associados aos sarcomas nos parâmetrosestudados. As neoplasias de menores dimensões, compadrão de crescimento expansivo e ausência denecrose estiveram associadas a melhor prognóstico.Estas características permitem uma abordagem cirúr-gica mais eficaz. A necrose está também relacionadacom o rápido crescimento neoplásico e elevadotamanho das neoplasias. Estes factores já foram relacionados, por outros autores, com tempos desobrevida menores (Bostock e Dye, 1979; Davidson etal., 1997; Cronin et al., 1998; Hershey et al., 2000;Cohen et al., 2001; Kobayashi et al., 2002). Estaobservação permite-nos sugerir que o tamanho dasneoplasias seja considerado na avaliação do estadia-mento dos gatos, à semelhança do que ocorre em outrasespécies (Clemo et al., 1994; Queiroga e Lopes,2002).

O grau histológico não revelou associação estatísticasignificativa com a sobrevida total à semelhança doobservado num estudo anterior (Davidson et al.,1997). Este facto pode ser atribuído à tendência damaioria dos sarcomas apresentarem grau elevado de


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malignidade. A determinação do grau histológico foibaseada na observação histológica das neoplasias enão exigiu procedimentos diferentes para além dosconvencionais utilizados num laboratório deHistopatologia. Desta forma sugere-se a sua aplicaçãonos diagnósticos de rotina. A caracterização do grauhistológico disponibiliza ao clínico informação adicional sobre a agressividade biológica destas neoplasias. Estudos futuros são necessários para a suaavaliação, de forma a ser considerado como factor deprognóstico para os sarcomas, tal como observado emMedicina Humana (Jensen et al., 1998; Fletcher et al.,2002).

Agradecimentos

Ao Prof. Doutor Júlio Carvalheira pela colaboraçãoprestada na análise estatística dos dados; à CláudiaCapela e à Fátima Falcão pela colaboração na realizaçãodos procedimentos técnicos.

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