Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas - CiPharma
LUAN SILVESTRO BIANCHINI SILVA
COPOLÍMEROS DE D,L-LACTÍDEO E GLICIDIL
ÉTERES FUNCIONALIZADOS: SÍNTESE, USO
EM NANOESFERAS, CITOTOXICIDADE E
ENCAPSULAÇÃO DE FÁRMACO MODELO
Ouro Preto
2016
LUAN SILVESTRO BIANCHINI SILVA
COPOLÍMEROS DE D,L-LACTÍDEO E GLICIDIL
ÉTERES FUNCIONALIZADOS: SÍNTESE, USO
EM NANOESFERAS, CITOTOXICIDADE E
ENCAPSULAÇÃO DE FÁRMACO MODELO
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação
em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Ouro
Preto, como requisito parcial à
obtenção do título de mestre
em ciências farmacêuticas.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Vanessa Carla Furtado Mosqueira
Co-orientadora: Dr.ª Gwenaelle Pound-Lana
Ouro Preto 2016
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
B577c Silva, Luan Silvestro Bianchini. Copolímeros de D,L-lactídeo e glicidil éteres funcionalizados [manuscrito]:síntese, uso em nanoesferas, citotoxicidade e encapsulação de fármaco modelo / Luan Silvestro Bianchini Silva. - 2016. 123f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Vanessa Carla Furtado Mosqueira. Coorientadora: Dr.ª Gwenaelle Elza Nathalie Pound-Lana.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola deFarmácia. Departamento de Farmácia. Programa de Pós-Graduação emCiências Farmacêuticas. Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos.
1. Copolímeros. 2. D,L-lactídeo. 3. Éteres glicídicos. 4. Nanoesferas. 5.Benznidazol. I. Mosqueira, Vanessa Carla Furtado. II. Pound-Lana, GwenaelleElza Nathalie. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.
CDU: 620.3
mi ijlli?iMa
S3“sssasr
LISTA DE PRESENÇA
Sessão de defesa da 118a dissertação do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro
Preto, que conferiu o grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas a Luan Silvestro
Bianchini Silva, com a defesa da dissertação intitulada: “Copolímeros de D, L-
lactídeo e glicidil éteres funcionalizados: Síntese, uso em nanoesferas, citotoxicidade
e encapsulação de fármaco modelo”, avaliada pela banca examinadora abaixo:
Ouro Preto, 05 de agosto de 2016.
dia,GjyAuProfa. Dra. Gisele Rodrigues da Silva
UFSJ
rrof. Dr. Leandro Vicícius Ãwe:UFOP (J
Profa. Dra. Vanessa Carla Furtado MosqueiraUFOP S
LOCAL DE REALIZAÇÃO DO PROJETO
Laboratório de Desenvolvimento Galênico e Nanotecnologia (LDGNANO)/ Cipharma/
Escola de Farmácia/ UFOP.
LABORATÓRIOS DE APOIO
Laboratório Multiusuário/ CiPharma/ Escola de Farmácia/ UFOP.
Laboratório NanoLab do Centro Mínero-Metalúrgico da Rede Temática em
Engenharia de Materiais (CMM-REDEMAT)/ Escola de Minas/ UFOP.
Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear (LAREMAR)/ Departamento de
Química/ UFMG.
AGRADECIMENTOS
Sou grato a Deus e aos amigos espirituais por todas as bênçãos que tenho
alcançado nesta existência.
À CAPES pelo auxílio financeiro. À UFOP, ao Cipharma e à gloriosa Escola
de Farmácia (EFAR) pela confiabilidade e transparência das instituições.
Aos técnicos do Cipharma e da EFAR, em especial à Patrícia Capelari e à
Renata Branquinho por serem sempre tão prestativas. À secretaria do CiPharma,
nas figuras da secretária Mirela Pena e da coordenadora Prof.a Dr.a Neila Barcellos,
pela atenção recebida. Aos professores pela formação acadêmica e por cultivarem a
semente da ciência em seus alunos. Expresso aqui, meu respeito e admiração a
estes profissionais.
Às minhas orientadoras Prof.a Dr.a Vanessa Mosqueira e Dr.a Gwenaelle
Pound-Lana pela orientação, projeto e confiança. Ao Prof. Sidney (Bibo) pela sua
gentileza em ceder vidrarias indispensáveis à elaboração deste trabalho e levar com
boa vontade amostras para análises de RMN. Ao técnico Ney Sampaio do NanoLab
(REDEMAT – UFOP) pela realização das análises de MEV e à técnica Dr.a Ivana
Silva Lula (LAREMAR – UFMG) pela realização das análises de RMN.
Aos colegas do LDGNANO: Carlos Henrique, Izabel, Douglas, Kelly, Elton,
Polly, Líliam, Larissa e Giani, por tornarem o ambiente de trabalho mais prazeroso
com as suas companhias, além de serem solícitos na execução de técnicas e
experimentos. Em especial à Ana Lia pelo fornecimento do benznidazol e à Mônica
pela sua amizade. Agradeço por pertencermos ao mesmo grupo de pesquisa.
Aos demais colegas da Pós-graduação: Lucas, Janaína, Régis, Tamara,
Débora, Thales, Tamires Guedes, Luana, Thaís, Hebert, Stella e Walyson; pelo
aprendizado, convivência, bons momentos. Ao meu querido amigo farmacêutico
Hebert Mendes.
À minha namorada Fernanda Perasoli, pelo seu apoio e otimismo. Mesmo
passando por tribulações parecidas como a minha; foi otimista e companheira.
Ao meu pai Paulo César (i.m) pelo exemplo de homem de bem e à minha
mãe Antônia pelo esforço em criar e educar seus filhos. Aos meus irmãos Renan e
Priscila pelo apoio e à minha linda sobrinha Kaianne pelo carinho.
À todo cidadão de bem que pagando os seus impostos investe na educação
por um Brasil melhor. Por fim, a todos que acreditam em mim.
“Naître, mourir, renaître encore et progresser sans cesse, telle est la Loi”
(Kardec)
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
AGE alil glicidil éter
ANOVA Análise de Variância
BGE benzil glicidil éter
BHT 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol
BNZ N-benzil-2-nitro-1-imidazol acetamida (benznidazol)
BzOH álcool benzílico
CPG cromatografia de permeação em gel
DCM diclorometano
CDCl3 clorofórmio deuterado
DMAP 4-(dimetilamino)piridina
DMEM meio Eagle Modificado por Dulbecco
DMSO dimetilsulfóxido
DMSO-d6 dimetilsulfóxido deuterado
DP desvio padrão
ECF espectroscopia de correlação de fótons
Et2O éter etílico
FDA Food and Drug Administration
GE glicidil éter
HEX n-hexano
IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada
LAC lactídeo; D,L-lacítdeo
MALDI-ToF-MS matrix assisted laser desorption/ionization - time of flight mass-
mass spectroscopy
MEV microscopia eletrônica de varredura
MeOH metanol
mPEG metoxi-polietileno glicol
MTT brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazólio
NC nanocápsulas
NP nanopartículas
NS nanoesferas
PBS tampão fosfato salino
PDLA poli-(D-lactídeo)
PDLLA poli(D,L-lactídeo)
PEG polietileno glicol
PLA ácido poliláctico
PLA-co-AGE ácido poliláctico-co-glicidil éter de alila
PLA-co-BGE ácido poliláctico-co-glicidil éter de benzila
PLA-b-mPEG ácido polilático-b-metoxi-polietileno glicol
PLLA poli(L-lactídeo)
RMN-1H ressonância magnética nuclear de hidrogênio
ROP polimerização por abertura de anel
RPMI meio “Roswell Park Memorial Institute”
SFB soro fetal bovino
SMF sistema mononuclear fagocítico
Sn(Oct)2 2-etil-hexanoato de estanho; octanoato de estanho
TCM clorofórmio
THF tetrahidrofurano
TMS tetrametilsilano
UV/CLAE cromatografia líquida de alta eficiência com detecção no
ultravioleta
d dupleto
Dh diâmetro hidrodinâmico
Đ dispersidade
M massa molar
m multipleto
�̅�𝑛 massa molar numérica média
�̅�𝑤 massa molar ponderal média
q quarteto
R2 coeficiente de determinação
r coeficiente de correlação
s simpleto
t tripleto
δ deslocamento químico
λ comprimento de onda
π-π pi-pi
ζ zeta
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Classificação dos polímeros quanto à organização monomérica das cadeias
poliméricas. ......................................................................................................................... 19
Figura 2: Representação esquemática de nanocápsulas (NC) e nanoesferas (NS)
poliméricas seccionadas ao meio. (A) fármaco dissolvido no núcleo das NC. (B) fármaco
adsorvido à parede polimérica das NC. (C) fármaco retido na matriz polimérica das NS. (D)
fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica das NS. (E) fármaco
adsorvido na superfície das NS. .......................................................................................... 21
Figura 3: O lactídeo (3,6-dimetil-1,4-dioxano-2,5-diona) é um diéster cíclico obtido a partir
de duas moléculas de ácido láctico e que apresenta três isômeros distintos (L,L-lactídeo,
D,L-lactídeo e o D,D-lactídeo). ............................................................................................. 22
Figura 4: Rotas sintéticas de obtenção do PLA. O ácido láctico é o monômero percursor da
síntese. Massas molares e etapas distintas caracterizam as diversas rotas apresentadas. . 23
Figura 5: Esquema reacional da ativação do catalisador Sn(Oct)2 por uma molécula
contendo hidroxila (ROH). Em uma primeira etapa (A) é formado o alcóxido de estanho; na
etapa subsequente (B) o alcóxido de estanho forma o iniciador di-alcóxido de estanho; as
reações ocorrem na presença de um grupo doador de hidrogênio (ROH). .......................... 25
Figura 6: Esquema reacional das etapas de iniciação e propagação na copolimerização via
ROP do monômero D,L-lactídeo. Iniciador de cadeia di-alcoxilado derivado do BzOH ou do
mPEG levam a síntese do homopolímero PLA ou do copolímero dibloco PLA-b-mPEG,
respectivamente, pelo mecanismo de coordenação-inserção e propagação da cadeia de
PLA. ..................................................................................................................................... 26
Figura 7: Proposta de mecanismo da ROP do lactídeo na presença de DMAP como
catalisador. (1) O DMAP é capaz de ativar o monômero e iniciar a polimerização da cadeia
de PLA. (2) A reação de ativação do monômero acontece repetida vezes. (3) A presença de
um álcool é capaz de interromper a reação liberando o DMAP no meio reacional e inserindo
grupos terminais na cadeia de PLA. .................................................................................... 27
Figura 8: Diferença organizacional entre micela (á esquerda) e nanoesfera (á direita). A
massa molar dos polímeros PLA-b-mPEG envolvidos na formação destes sistemas
determina o tipo de partícula constituída. ............................................................................. 27
Figura 9: Esquema reacional teórico da copolimerização estatística do D,L-lactídeo com
BGE ou AGE, em função do tempo e da temperatura; na presença de um catalisador e de
um iniciador de cadeia, originando os copolímeros PLA-co-AGE ou PLA-co-BGE. Δ =
Temperatura; t = tempo. ...................................................................................................... 29
Figura 10: Fórmulas estruturais da molécula de BNZ. (A) Fórmula estrutural condensada
linear evidenciando as ligações de hidrogênio entre as moléculas. (B) Fórmula estrutural
espacial do estado de mais baixa energia da molécula evidenciando os três grupamentos
planares: 1 – imidazol, 2 – fragmento acetamida, 3 – anel benzila ...................................... 30
Figura 11: Ilustração dos módulos experimentais utilizados. (A) O Ar é fornecido
diretamente para a linha de gás a partir de um cilindro de gás comprimido, saindo da linha
de distribuição através de um borbulhador de óleo. Entre a linha de vácuo e a bomba de alto
vácuo (Edwards® RV5) é conectada uma câmara de captação de vapores, com a função de
impedir que vapores de solventes entrem na bomba e degradem o seu óleo ou motor. A
câmara de captação é imersa em um frasco de Dewar (Nalgene®) contendo N2 líquido para
resfriamento da mesma. Com o vácuo ligado, os vapores do balão volumétrico são sugados
para o interior frio da câmara de captação e condensados. (B) Esquema do aparato
reacional durante a condução das sínteses. O balão volumétrico contendo os reagentes é
imerso em um banho de óleo de silicone sobre placa agitadora magnética (IKA® RCT) com
controlador de temperatura (IKA® ETS-D5). ......................................................................... 41
Figura 12: Espectros de RMN-1H do monômero comercial. (A) Espectro do monômero antes
da recristalização; (B) Espectro do monômero após a recristalização. ................................ 50
Figura 13: Distribuições de massas molares obtidas por CPG dos polímeros PLA em função
das alterações de parâmetros: tempo de reação, temperatura e tipo de catalisador. ........... 54
Figura 14: Espectro de RMN-1H do PLA L1202. ................................................................. 55
Figura 15: Distribuições de massas molares obtidas por CPG dos copolímeros PLA-b-
mPEG em função das alterações de parâmetros: temperatura e tempo de reação,
quantidade de catalisador, quantidade de iniciador e ativação do catalisador. .................... 58
Figura 16: Espectro de RMN-1H dos copolímeros PLA-b-mPEG. (A) L0901. (B) L0903. ..... 59
Figura 17: Gráfico da porcentagem molar de glicidil éter (GE) no polímero, 𝑀𝑛 e do número
de GE por cadeia em função da porcentagem molar de GE no meio reacional variados os
tipos de comonômeros (AGE ou BGE) e os sistemas de catalisadores (Sn(Oct)2 ou
Sn(Oct)2/DMAP) utilizados nas sínteses. ............................................................................. 62
Figura 18: Distribuições de massas molares obtidas por CPG dos copolímeros sintetizados
variando-se os catalisadores. (A) PLA-co-AGE. (B) PLA-co-BGE. ....................................... 63
Figura 19: Aspecto físico dos copolímeros sintetizados com DMAP/Sn(Oct)2. (LAC) D,L-
lactídeo. (A) PLA-co-AGE. (B) PLA-co-BGE. ....................................................................... 64
Figura 20: Espectro de RMN-1H do PLA-co-AGE L1206. .................................................... 65
Figura 21: Espectro de RMN-1H do PLA-co-BGE L1205. .................................................... 65
Figura 22: Ilustração esquemática do preparo de nanoesferas pelo método de
nanoprecipitação. Os polímeros e o fármaco são solubilizados na fase orgânica e esta é
vertida sobre a fase aquosa. A rápida difusão do solvente orgânico no meio aquoso propicia
a formação de nanoesferas após completa evaporação dos solventes. .............................. 78
Figura 23: Representação esquemática do procedimento adotado para a dosagem de
benznidazol (BNZ) nas formulações de nanoesferas (NS) para os estudos de encapsulação.
............................................................................................................................................ 86
Figura 24: Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura das nanoesferas (NS)
preparadas. À esquerda são mostradas as NS brancas e à direita as NS contendo
benznidazol 0,3 mg/mL. (A e B) NS de PLA26K; (C e D) NS de PLA21K-co-AGE2,4; (E e F) NS
de PLA24K-co-BGE2,6. (C) circunferência. (r) raio. ................................................................. 95
Figura 25: Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura da formulação branca
de PLA26K. Ambas as imagens são do mesmo campo amostral, à esquerda (A) são
mostradas as nanoesferas após aplicação de um potencial de 20 kV. À direita (B) as
nanoesferas após aplicação de um potencial de 25 kV. ....................................................... 96
Figura 26: Curva de calibração obtida a partir do padrão de benznidazol com o respectivo
coeficiente de determinação (R2) e com a equação da reta. ................................................ 96
Figura 27: Gráficos relativos ao estudo da encapsulação do benznidazol (BNZ). (A) BNZ
precipitado (B) porcentagem de encapsulação (C) eficiência de encapsulação (D)
capacidade de carga; sendo todos apresentados em função da concentração teórica de BNZ
na formulação. (ns) grupos comparados e que não apresentaram diferença estatisticamente
significativa entre si. Todas as demais comparações intragrupos (partículas de diferentes
polímeros em uma mesma concentração) e intergrupos (partículas do mesmo polímero em
diferentes concentrações) apresentaram diferença estatística. ............................................ 97
Figura 28: Curvas de viabilidade celular das diferentes formulações em cultura de célula
Vero (A) e macrófagos J774A.1 (B) em função da concentração de polímero na forma de
nanoesferas (µg/mL) em 24h. Para (A) (*) diferença significativa das NS de PLA-co-AGE e
PLA-co-BGE em relação as NS de PLA. Para (B) (*) diferença significativa entre as NS de
PLA-co-AGE e PLA; (**) Diferença significativa entre as NS de PLA-co-AGE e PLA-co-BGE.
............................................................................................................................................ 99
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Reagentes e insumos utilizados com seus respectivos fornecedores comerciais,
massas molares e densidades. ............................................................................................ 38
Tabela 2: Variações das condições experimentais utilizadas na síntese do PLA. ............... 42
Tabela 3: Variações das experimentais utilizadas na síntese do PLA-b-mPEG. .................. 43
Tabela 4: Condições experimentais utilizadas nas sínteses dos copolímeros PLA-co-AGE e
PLA-co-BGE. ....................................................................................................................... 43
Tabela 5: Impurezas residuais estimadas por RMN-1H para os polímeros sintetizados em
função das condições de purificação empregadas. .............................................................. 52
Tabela 6: Efeito da variação das condições experimentais na síntese de homopolímeros
PLA caracterizados por CPG e RMN-1H. ............................................................................. 53
Tabela 7: Efeito da variação das condições experimentais na síntese de copolímeros PLA-b-
mPEG caracterizados por CPG e RMN-1H. ......................................................................... 56
Tabela 8: Caracterização dos copolímeros PLA-co-AGE e PLA-co-BGE por CPG e RMN-1H.
............................................................................................................................................ 60
Tabela 9: Materiais utilizados com seus respectivos fornecedores comerciais. ................... 81
Tabela 10: Relação dos constituintes PLA-b-mPEG, solventes e suas quantidades utilizadas
no preparo de nanoesferas de PLA26K. ................................................................................ 82
Tabela 11: Relação dos constituintes e suas quantidades utilizadas ao preparo das
diferentes formulações. ........................................................................................................ 83
Tabela 12: Avaliação da estabilidade de nanoesferas de PLA26K obtidas a partir dos
copolímeros PLA-b-mPEG em diferentes porcentagens nas formulações. .......................... 92
Tabela 13: Valores médios de diâmetro hidrodinâmico, dispersão de tamanho e potencial
zeta das formulações de nanoesferas brancas e com benznidazol. ..................................... 93
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação (1): ....................................................................................................................... 40
Equação (2): ....................................................................................................................... 45
Equação (3): ....................................................................................................................... 46
Equação (4): ....................................................................................................................... 46
Equação (5): ....................................................................................................................... 47
Equação (6): ....................................................................................................................... 47
Equação (7): ....................................................................................................................... 48
Equação (8): ....................................................................................................................... 49
Equação (9): ....................................................................................................................... 87
Equação (10): ..................................................................................................................... 88
Equação (11): ..................................................................................................................... 88
Equação (12): ..................................................................................................................... 88
Equação (13): ..................................................................................................................... 91
RESUMO
O domínio das rotas sintéticas de polímeros biocompatíveis e funcionalizados para
acoplamento de diferentes tipos de ligantes são focos de intensas pesquisas. Estes
polímeros podem ser associados com bioativos e utilizados na terapêutica e no
diagnóstico. A síntese de copolímeros estatísticos a partir da polimerização por
abertura de anel do D,L-lactídeo na presença dos comonômeros alil glicidil éter
(AGE) e benzil glicidil éter (BGE) permitiu avaliar a inserção destes grupos nas
cadeias poliméricas. Os polímeros sintetizados foram caracterizados por
ressonância magnética nuclear de hidrogênio e cromatografia de permeação em gel.
Foram avaliadas as influências dos comonômeros, das condições de síntese e dos
catalisadores utilizados na polimerização. Houve uma relação direta entre maiores
quantidades de glicidil éter no meio reacional, maior inserção deste nas cadeias e a
obtenção de copolímeros de massas molares mais baixas. O acréscimo do co-
catalisador 4-(dimetilamino)piridina associado com o octanoato de estanho não
proporcionou maiores inserções dos comonômeros nas cadeias poliméricas quando
comparado ao uso isolado do octanoato de estanho. O BGE foi inserido em maior
proporção do que o AGE nas cadeias. Foram selecionados para o preparo de
nanoesferas por nanoprecipitação os polímeros que apresentaram massas molares
próximas (≅ 23.000 g/mol), menores dispersidades (1,1-1,3) e com inserções de
comonômeros por cadeia próximas (≅ 2,3 unidades por cadeia). Foram preparadas
nanoesferas a partir dos polímeros sintetizados com e sem benznidazol como
fármaco modelo. Foi observado um aumento no diâmetro hidrodinâmico médio e
diminuição, em módulo, do potencial zeta, com valores de (91 a 92 nm) e (- 25 a - 32
mV), para as nanoesferas brancas, e (94 a 117 nm) e (- 17 a - 21 mV), para as
nanoesferas com benznidazol, sendo todas monodispersas. Variações significativas
destes parâmetros foram observadas devido à presença de fármaco associado ao
vetor em relação às nanoesferas brancas. A porcentagem de encapsulação,
eficiência de encapsulação e capacidade de carga das nanoesferas com
benznidazol foram significativamente maiores para as nanoesferas de PLA-co-AGE
para a formulação com 0,65 mg/mL de benznidazol, sugerindo maior associação do
fármaco com este copolímero. As imagens de nanoesferas por microscopia
eletrônica de varredura mostraram estruturas com estreita faixa de diâmetro (50 a
120 nm) e forma esférica. O teste de viabilidade celular em cultura de células
J774A.1 e Vero evidenciaram uma baixa toxicidade das nanoesferas obtidas com os
diferentes polímeros sintetizados mesmo em altas concentrações (500 µg/mL). A
partir da obtenção de polímeros funcionalizados, este estudo abre perspectivas para
o melhor entendimento da inserção de glicidil éteres em cadeias de poli(D,L-
lactídeo) e das relações intermoleculares entre fármacos e polímeros no subsídio de
novas alternativas terapêuticas.
Palavras-chave: copolímeros, D,L-lactídeo, éteres glicídicos, polimerização por
abertura de anel, nanoesferas poliméricas, encapsulação, benznidazol,
citotoxicidade.
ABSTRACT
Synthetic routes to obtain biocompatible and functionalized polymers for coupling
biological ligands are the focus of intense studies by major research groups. These
polymers can be associated with bioactive compounds and used in therapy and
medical diagnosis. The synthesis of statistic copolymers via ring opening
polymerization of D,L-lactide in the presence of allyl glycidyl ether (AGE) and benzyl
glycidyl ether (BGE) comonomers allowed evaluating the insertion of these groups in
the polymeric chains. The synthesized polymers were characterized by 1H-NMR and
gel permeation chromatography. The influence of the comonomers, synthetic
conditions and catalysts used in the polymerizations were evaluated. There was a
direct relationship between increasing the amounts of glycidyl ether in the reaction
feed, a higher degree of insertion in the copolymer and lower molecular weights. The
addition of 4-(dimethylamino)pyridine co-catalyst associated with tin octanoate did
not provide higher comonomer insertion in the polymeric chain compared to tin
octanoate alone. A higher degree of insertion was achieved with BGE than with AGE.
The polymers that were selected for the preparation of nanospheres by the
nanoprecipitation method had similar molecular weights (≅ 23,000 g/mol), low
dispersities (1.1-1.3) and similar numbers of comonomer units per chain (≅ 2.3).
Nanospheres were prepared from the synthesized polymers with and without
benznidazole as a model drug. An increase in the average hydrodynamic diameter
and a decrease in the zeta potential (in module) were observed, with values of (91 to
92 nm) and (- 25 to - 32 mV) for blank nanospheres, and (94 to 117 nm) and (- 17 to
- 21 mV) for the nanospheres with benznidazole, all being monodisperse. Significant
variations in these parameters due to the presence of drug associated with the vector
as compared to blank nanospheres. The percentage of encapsulation, encapsulation
efficiency and drug loading of benznidazole in the nanospheres were significantly
higher for the PLA-co-AGE nanospheres with benznidazole at a concentration of 0.65
mg/mL, suggesting higher drug association with this copolymer. The nanosphere
images by scanning electron microscopy showed structures with a narrow diameter
range (50 a 120 nm) and spherical shape. The cell viability test on J774A.1 and Vero
cells culture showed a low toxicity of the nanospheres obtained from the different
copolymers even at high nanospheres concentrations (500 µg/mL). By allowing the
preparation of functionalized polylactide derivatives this study opens perspectives for
a better understanding of the insertion of glycidyl ethers in polylactide chains and of
intermolecular interactions between drugs and polymers towards new therapeutic
alternatives.
Keywords: copolymers, D,L-lactide, glycidyl ethers, ring opening polymerization,
polymeric nanospheres, encapsulation, benznidazole, cytotoxicity.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................ 17
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................ 19
2.1. Polímeros e copolímeros: definições e classificações .......................................... 19
2.2. Vetorização de fármacos e nanoesferas poliméricas ............................................ 20
2.3. Ácido poliláctico .................................................................................................... 22
2.4. Síntese do PLA e do PLA-b-mPEG ...................................................................... 24
2.5. Copolimerização do D,L-lactídeo com glicidil éteres ............................................. 28
2.6. Benznidazol .......................................................................................................... 30
2.7. Métodos para aprimorar a encapsulação de fármacos ......................................... 31
3. OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 33
CAPÍTULO I ........................................................................................................................ 34
I.1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 35
I.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................ 37
I.3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 38
I.3.1. Materiais ......................................................................................................... 38
I.3.2. Preparo e purificação dos reagentes .............................................................. 39
I.3.3. Purificação do D,L-lactídeo ............................................................................. 39
I.3.4. Sínteses dos polímeros .................................................................................. 40
I.3.4.1. Procedimentos gerais .............................................................................. 40
I.3.4.2. Síntese dos homopolímeros PLA............................................................. 42
I.3.4.3. Síntese dos copolímeros PLA-b-mPEG ................................................... 42
I.3.4.4. Síntese dos copolímeros PLA-co-AGE e PLA-co-BGE ............................ 43
I.3.5. Purificação dos polímeros............................................................................... 44
I.3.6. Caracterização físico-química dos polímeros.................................................. 44
I.3.6.1. Cromatografia de permeação em gel ....................................................... 44
I.3.6.2. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio ........... 45
I.4. RESULTADOS .................................................................................................... 50
I.4.1. Purificação do D,L-lactídeo ............................................................................. 50
I.4.2. Purificação dos polímeros............................................................................... 51
I.4.3. Caracterização físico-química dos polímeros.................................................. 53
I.4.3.1. Caracterização físico-química dos homopolímeros PLA .......................... 53
I.4.3.2. Caracterização físico-química dos copolímeros PLA-b-mPEG ................ 56
I.4.3.3. Caracterização físico-química dos copolímeros PLA-co-AGE e PLA-co-
BGE ................................................................................................................ 59
I.5. DISCUSSÃO ........................................................................................................ 67
I.6. CONCLUSÃO PARCIAL ...................................................................................... 75
CAPÍTULO II ....................................................................................................................... 76
II-1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 77
II-2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................ 80
II-3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 81
II-3.1. Materiais ......................................................................................................... 81
II-3.2. Preparo das nanoesferas ............................................................................... 81
II-3.3. Caracterização físico-química das nanopartículas .......................................... 84
II-3.3.1. Determinação de tamanho e dispersão ................................................... 84
II-3.3.2. Determinação do potencial zeta .............................................................. 84
II-3.3.3. Análise das formulações por microscopia eletrônica de varredura........... 84
II-3.3.4. Estudo de encapsulação do benznidazol nas nanopartículas .................. 85
II-3.3.4.1. Condições de quantificação do benznidazol por cromatografia líquida
de alta eficiência ................................................................................................... 85
II-3.3.4.2. Estabelecimento da curva padrão ..................................................... 85
II-3.3.4.3. Determinação da porcentagem de encapsulação ............................. 86
II-3.3.4.4. Determinação da eficiência de encapsulação ................................... 87
II-3.3.4.5. Determinação da porcentagem de benznidazol precipitado .............. 88
II-3.3.4.6. Determinação da porcentagem de capacidade de carga .................. 88
II-3.4. Avaliação da citotoxicidade das nanopartículas .............................................. 89
II-3.4.1. Manutenção da cultura de células ........................................................... 89
II-3.4.2. Ensaio colorimétrico de citotoxicidade ..................................................... 90
II-3.5. Análise estatística dos dados ......................................................................... 91
II-4. RESULTADOS .......................................................................................................... 92
II-4.1. Preparo das nanoesferas ............................................................................... 92
II-4.2. Caracterização físico-química das nanopartículas .......................................... 93
II-4.2.1. Determinação de tamanho, dispersão e potencial zeta ............................ 93
II-4.2.2. Análise das formulações por microscopia eletrônica de varredura........... 94
II-4.2.3. Estudo de encapsulação do benznidazol nas nanoesferas ...................... 96
II-4.3. Avaliação da citotoxicidade dos polímeros na forma de nanoesferas ............. 98
II-5. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 100
II-6. CONCLUSÃO PARCIAL ......................................................................................... 108
4. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 109
5. PERSPECTIVAS DO TRABALHO ................................................................................ 110
6. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 111
17
1. INTRODUÇÃO GERAL
Um dos grandes desafios presentes na área de nanotecnologia farmacêutica
consiste no desenvolvimento de vetores poliméricos biocompatíveis e capazes de
encapsular altos teores de bioativos. Este desafio é centrado na necessidade de
diminuição das doses; redução de efeitos indesejados dos fármacos, aumento da
eficácia terapêutica, melhoria das características de direcionamento para o alvo
terapêutico, entre outros (MUDSHINGE et al., 2011; NICOLAS et al., 2013).
Neste contexto as nanopartículas (NP) poliméricas, tais como as nanoesferas
(NS), de natureza matricial, podem apresentar vantagens como: ampla área
superficial, diâmetro pequeno, boa estabilidade físico-química em meios biológicos e
capacidade para carreamento e liberação controlada de diversos ativos. As NS
ainda são sistemas passíveis de sofrerem modificações químicas para vetorização
ativa de fármacos (RAWAT; SINGH; SARAF, 2006; SWATI; GOEL; SINGLA, 2012).
A produção de NS a partir de polímeros biodegradáveis e obtidos a partir de
fontes renováveis, como o ácido poliláctico (PLA), é interessante uma vez que este
polímero é biocompatível e apresenta baixa toxicidade; sendo ainda aprovado pela
“Food and Drug Administration” (FDA) para uso humano por diferentes vias de
administração, na confecção de implantes e de próteses ósseas (GARLOTTA,
2002). As vantagens do PLA são somadas à do metoxi-polietileno glicol (mPEG) na
síntese de copolímeros em blocos do tipo PLA-b-mPEG obtendo-se polímeros com
características anfifílicas para a produção de NP sem o uso de outros tensoativos e
características biológicas únicas de estabilização estérica frente ao processo de
opsonização por proteínas plasmáticas (GREF et al., 1995; RABANEL; HILDGEN;
BANQUY, 2014).
Vetores poliméricos modificados são obtidos a partir da síntese de novos
polímeros, que expressem grupos funcionais ao longo da cadeia polimérica com
possibilidade de pós-modificações químicas para inserção de ligantes biológicos e
alterar biodistribuição (BANQUY et al., 2008) e/ou aprimoramento da encapsulação
de fármacos (SHI et al., 2013). O foco deste trabalho foi a obtenção de PLA
modificado a partir da polimerização estatística por abertura de anel do monômero
D,L-lactídeo, utilizando comonômeros de inserção no meio reacional, no caso, alil
glicidil éter (AGE) (BANQUY et al., 2008) e benzil glicidil éter (BGE) (RABANEL et
al., 2015) com a perspectiva de oferecer novas plataformas terapêuticas.
18
Entretanto, os níveis de inserção dos epóxidos são ainda questionáveis na
literatura, bem como a influência destes na massa molar dos polímeros obtidos. Há
necessidade também da otimização de parâmetros reacionais para a síntese de PLA
funcionalizado e que resultem em polímeros de massas molares numéricas médias
mais elevadas (�̅�𝑛 ≥ 45.000 g/mol) para a formação de NS, tais como: a avaliação
da associação dos catalisadores 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) com octanoato de
estanho (Sn(Oct)2), temperatura, tempo de reação e quantidade de iniciador.
Na literatura não são encontrados trabalhos envolvendo a síntese de
copolímeros estatísticos com grupos AGE e BGE via polimerização por abertura de
anel (ROP) a partir do monômero D,L-lactídeo com a finalidade de aprimorar a
encapsulação de fármacos com estes grupamentos. Os trabalhos descritos
envolvem a síntese destes copolímeros com a finalidade de pós-modificações para a
inserção de grupos funcionais (BANQUY et al., 2008; RABANEL et al., 2015).
Somado a isto, não existem relatos de síntese do PLA com elevada �̅�𝑛 contendo
estes comonômeros inseridos aleatoriamente ao longo da cadeia polimérica,
promovendo maior número de sítios para acoplamento de ligantes de interesse
biológico e/ou para interações intermoleculares entre fármaco e polímero,
possibilitando maior capacidade de carreamento.
Foi utilizado o benznidazol (BNZ) como molécula modelo neste estudo, pela
sua dificuldade de encapsulamento devido à formação de cristais compactos e
estáveis. Assim, foi avaliada a influencia de grupo aromático benzila ou alila nos
copolímeros sintetizados na encapsulação do BNZ. A hipótese da interação destes
grupos com o BNZ foi investigada, com um estudo dos teores de encapsulação do
BNZ a partir das NS constituídas com estes polímeros modificados.
Diante do exposto, configuraram perspectivas inéditas deste trabalho: a
síntese de PLA funcionalizado com AGE e BGE via ROP a partir do monômero D,L-
lactídeo, visando a síntese de polímeros com �̅�𝑛 ≥ 45.000 g/mol e inserções de
comonômeros ao longo da cadeia de PLA. A avaliação dos níveis de inserção dos
epóxidos, bem como a influência destes nas �̅�𝑛 dos polímeros obtidos. A otimização
do uso dos catalisadores DMAP e Sn(Oct)2 e de outros parâmetros reacionais, tais
como temperatura, tempo e quantidade de iniciador, para obtenção de polímeros
com as características descritas anteriormente. O estudo da citotoxicidade de NS
preparadas a partir destes polímeros frente a dois tipos de linhagens celulares e a
avaliação da influência dos comonômeros na encapsulação do BNZ.
19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Polímeros e copolímeros: definições e classificações
Um polímero é uma macromolécula composta por muitas dezenas ou
centenas de milhares de unidades de repetição denominadas monômeros, ligadas
por ligações covalentes. O percussor da síntese de um polímero é o monômero, isto
é, uma molécula com uma (mono) unidade de repetição. Assim, os polímeros são
obtidos por meio da polimerização dos monômeros. Polímeros formados por apenas
um tipo de monômero são denominados homopolímeros. Em contrapartida,
polímeros formados por várias unidades monoméricas diferentes são denominados
copolímeros, sendo classificados de acordo com o arranjo monomérico na cadeia
polimérica (Figura 1) (CALLISTER; RETHWISCH, 2012; RAVVE, 2012).
Figura 1: Classificação dos polímeros quanto à organização monomérica das cadeias poliméricas. Adaptado de RAVVE (2012).
Assim, copolímeros estatísticos apresentam distribuição de monômeros ao
longo da cadeia polimérica regulada pela quantidade e reatividade de cada espécie
monomérica empregada na síntese. Dentre os copolímeros estatísticos podem-se
distinguir dois subtipos: copolímero aleatório, com disposição dos diferentes
monômeros sem padrão definido, e copolímero alternado, com alternância dos
20
diferentes monômeros ao longo da cadeia polimérica. Os copolímeros em bloco são
constituídos por sequências de homopolímeros quimicamente ligadas através de
ligações covalentes, sendo que nos copolímeros grafitados essas sequências são
enxertadas em uma cadeia polimérica principal (IUPAC, 1996; RAVVE, 2012).
Podem ser utilizados no preparo de nanocarreadores de fármacos, polímeros
biocompatíveis de origem natural, natural modificada e sintética. Os polímeros
sintéticos tiveram seu uso aumentado para esta finalidade nas duas últimas
décadas, pois o aperfeiçoamento das rotas sintéticas possibilitou uma variedade de
modificações estruturais nas cadeias poliméricas, culminando no aprimoramento das
propriedades físico-químicas desses materiais (TIAN et al., 2012). Essas
propriedades podem modular as propriedades físico-químicas dos carreadores, tais
como hidrofobicidade, carga superficial, eficiência de incorporarão do fármaco,
estabilidade e sua cinética de liberação; influenciando no comportamento in vivo
desses sistemas (ANDERSON; SHIVE, 1997; PLAPIED et al., 2011). Assim, a
síntese de novos materiais poliméricos tem propiciado o desenvolvimento de
nanossistemas cada vez mais eficientes (NICOLAS et al., 2013).
2.2. Vetorização de fármacos e nanoesferas poliméricas
Sistemas vetorizados de fármacos podem oferecer vantagens em relação ao
sistema de liberação convencional (KIM et al., 2009). A liberação lenta e sustentada
de um fármaco no organismo a partir de um vetor nanométrico pode aumentar a
concentração do ativo no sítio de ação, promover redução da toxicidade, melhora da
eficácia e a adesão do paciente ao tratamento devido às propriedades de liberação
controlada (KUMAR, 2000; MUNDARGI et al., 2008).
A redução da toxicidade pode dar-se pela liberação plasmática do fármaco
em níveis abaixo do limiar tóxico, tornando-o menos disponível para efeitos tóxicos
sistêmicos (KUMAR, 2000; MUNDARGI et al., 2008). A melhora da eficácia dos
fármacos geralmente é o resultado do controle da distribuição, permitindo
incrementar as propriedades farmacocinéticas do fármaco como solubilidade
aparente, biodisponibilidade e velocidade de biotransformação quando comparado
com o fármaco livre (SWATI; GOEL; SINGLA, 2012). A adesão do paciente ao
tratamento tende a melhorar, uma vez que os efeitos tóxicos oriundos da distribuição
sistêmica do fármaco podem ser minimizados (RAWAT; SINGH; SARAF, 2006).
21
As formas de associação dos ativos aos vetores consistem na encapsulação,
dispersão, adsorção ou conjugação de moléculas ativas a uma série de
nanoestruturas, dentre as quais se destacam: nanopartículas poliméricas (NP),
nanopartículas lipídicas sólidas, nanoemulsões, nanocristais, nanotubos de carbono,
lipossomas, micelas poliméricas, ciclodextrinas e dendrímeros (SCHMIDT;
LAMPRECHT, 2009). A classe dos polímeros, pela sua versatilidade, variedade e
propriedades inerentes, são um dos materiais mais investigados no desenvolvimento
de NP. São designados por NP poliméricas os vetores conhecidos como
nanoesferas (NS) e nanocápsulas (NC) (MOHANRAJ; CHEN, 2006).
As NS apresentam uma matriz polimérica esférica; onde o fármaco se
encontra dissolvido, aprisionado, ligado quimicamente ou adsorvido ao polímero
(RAO; GECKELER, 2011). As NC diferem das NS quanto à composição e
organização estrutural, uma vez que elas são sistemas reservatórios, nos quais uma
parede polimérica envolve um núcleo aquoso ou oleoso. Nas NC o fármaco pode
estar dissolvido no interior do núcleo e/ou adsorvido na parede externa (VAUTHIER;
BOUCHEMAL, 2009). As estruturas das NS e NC bem como as possíveis formas de
associação dos fármacos nestes vetores são apresentadas na Figura 2.
Figura 2: Representação esquemática de nanocápsulas (NC) e nanoesferas (NS) poliméricas seccionadas ao meio. (A) fármaco dissolvido no núcleo das NC. (B) fármaco adsorvido à parede polimérica das NC. (C) fármaco retido na matriz polimérica das NS. (D) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica das NS. (E) fármaco adsorvido na superfície das NS.
Por suas características nanométricas, as NS têm capacidade de ultrapassar
algumas barreiras biológicas, podendo transportar com integridade o fármaco nos
meios biológicos, propiciando o seu direcionamento passivo e ativo para células e
22
tecidos específicos (TIAN et al., 2012). Podem ainda ser administradas por várias
vias, como oral (AL-QUADEIB et al., 2015), nasal (MAINARDES et al., 2006),
intraocular (ZHOU et al., 2013) e parenteral (MUDSHINGE et al., 2011). Os
polímeros empregados no preparo de NS devem apresentar produtos de
degradação de baixa toxicidade, passíveis de biotransformação e excreção pelas
vias fisiológicas normais do organismo; além de biocompatibilidade (GOLDBERG;
LANGER; JIA, 2007).
2.3. Ácido poliláctico
Os poli-α-hidroxiácidos são polímeros sintéticos da classe dos poliésteres
alifáticos, dentre os quais são representantes: o ácido poliláctico, o ácido
poliglicólico, os copolímeros de ácido poliláctico-co-glicólico e ácido poli-α-
hidroxibutírico. O ácido láctico (α-ácido 2-hidroxipropanóico), um ácido orgânico
obtido em biorrefinaria a partir da fermentação de produtos de origem natural; é o
monômero percursor na síntese dos poli-α-hidroxiácidos.
Os polímeros derivados do ácido láctico, cuja síntese envolve polimerização
por abertura de anel (ROP) do lactídeo são chamados de polilactídeos. O lactídeo
opticamente ativo pode ser encontrado em duas formas distintas, D,D-lactídeo e L,L-
lactídeo. Além disto, o lactídeo pode ser formado por uma molécula de ácido D-
láctico e outra de ácido L-láctico, formando o D,L-lactídeo (meso-lactídeo). Assim, o
lactídeo (3,6-dimetil-1,4-dioxano-2,5-diona), dímero cíclico do ácido láctico, existe
sob a forma de três estereoisômeros (RAQUEZ et al., 2013). As estruturas químicas
dos isômeros do lactídeo são representadas na Figura 3.
Figura 3: O lactídeo (3,6-dimetil-1,4-dioxano-2,5-diona) é um diéster cíclico obtido a partir de duas moléculas de ácido láctico e que apresenta três isômeros distintos (L,L-lactídeo, D,L-lactídeo e o D,D-lactídeo).
23
A composição estereoquímica dos polímeros derivados do lactídeo varia em
função dos isômeros envolvidos na síntese destes. Assim a polimerização do L-
lactídeo irá produzir poli-(L-lactídeo) (PLLA) e a polimerização do D-lactídeo
produzirá o poli-(D-lactídeo) (PDLA), ambos são polímeros cristalinos, em virtude da
alta estereorregularidade da cadeia polimérica e opticamente ativos, com
propriedades físico-químicas idênticas (URAYAMA; KANAMORII; KIMURA, 2002).
Entretanto, a polimerização do meso-lactídeo por abertura de anel, terá como
produto o poli(D,L-lactídeo) (PDLLA) que é um polímero amorfo, por causa da
ausência de estereorregularidade e opticamente inativo devido à distribuição
aleatória de unidades monoméricas de ácido L-láctico e ácido D-láctico
(GARLOTTA, 2002). O termo ácido poliláctico (PLA) é aceito como denominação
geral do polímero opticamente inativo (AHMED; VARSHNEY, 2010). A �̅�𝑛 do PLA
formado é relacionada à sua rota de obtenção, assim, a síntese de PLA via ROP
permite a obtenção de um polímero com �̅�𝑛 > 100.000 g/mol (GARLOTTA, 2002;
GUPTA; KUMAR, 2007). A estrutura química do PLA e as suas rotas sintéticas de
obtenção resumidas podem ser vistas na Figura 4.
Figura 4: Rotas sintéticas de obtenção do PLA. O ácido láctico é o monômero percursor da síntese. Massas molares e etapas distintas caracterizam as diversas rotas apresentadas. Adaptado de GARLOTTA (2002); GUPTA e KUMAR (2007).
24
O PLA é amplamente usado em próteses em humanos e tem despertado
interesse nos estudos de nanotecnologia farmacêutica, pois este polímero apresenta
biocompatibilidade, biodegradabilidade, capacidade de biorreabsorção e de gerar
produtos de degradação atóxicos (VERT et al., 1992; LI, 1999). Tais características
merecem destaque na concepção de novos sistemas vetorizados poliméricos.
A polimerização do lactídeo a partir do macroiniciador mPEG formando o
copolímero dibloco PLA-b-mPEG permite a formação de NS estericamente
estabilizadas e que possuem como resultado circulação sanguínea prolongada in
vivo (GREF et al., 1994). As nanoestruturas formadas a partir deste copolímero
podem alterar a distribuição de um fármaco aumentando o seu tempo de circulação
sanguínea (MOSQUEIRA et al., 2001) e podem também modificar a velocidade de
liberação do fármaco (KAWASHIMA, 2001; OWENS III; PEPPAS, 2006).
2.4. Síntese do PLA e do PLA-b-mPEG
A polimerização do monômero lactídeo por abertura de anel (ROP) pode
ocorrer em solução, em massa ou em suspensão. A síntese de PLA em massa é o
método habitual para a obtenção industrial do polímero, por ser uma técnica que não
envolve o uso de solventes orgânicos, logo é uma técnica mais econômica e
ecologicamente correta que as demais (KOWALSKI et al., 2005).
A síntese do PLA em massa via ROP é catalisada por catalisadores que
atuam via mecanismos de coordenação-inserções (KOWALSKI; DUDA; PENCZEK,
2000), catiônicos (MALGORZATA; PRZEMYSLAW, 2006) e aniônicos (CSIHONY et
al., 2004). A síntese do PLA envolvendo o mecanismo de coordenação-inserção é
possível a partir do Sn(Oct)2, comumente referido como octanoato de estanho, é o
catalisador mais utilizado neste tipo de reação, pois ele é aceito pelo FDA para fins
alimentícios, farmacêuticos e médicos. Além disto, este catalisador apresenta
solubilidade em solventes orgânicos e em monômeros de ésteres cíclicos, além de
alta atividade catalítica (KRICHELDORF; KREISER-SAUNDERS; STRICKER, 2000).
A síntese do PLA pelo mecanismo de coordenação-inserção envolve duas
etapas (Figura 5). Na primeira etapa da reação (Figura 5A), o catalisador Sn(Oct)2
reage com compostos doadores de hidrogênio (co-iniciadores) gerando o alcóxido
de estanho e na segunda etapa (Figura 5B) o di-alcóxido de estanho (ácido fraco de
25
Lewis), considerado o verdadeiro iniciador da reação é formado (KOWALSKI; DUDA;
PENCZEK, 2000; STOREY; SHERMAN, 2002).
Figura 5: Esquema reacional da ativação do catalisador Sn(Oct)2 por uma molécula contendo hidroxila (ROH). Em uma primeira etapa (A) é formado o alcóxido de estanho; na etapa subsequente (B) o alcóxido de estanho forma o iniciador di-alcóxido de estanho; as reações ocorrem na presença de um grupo doador de hidrogênio (ROH). Adaptado de KOWLSKI, DUDA e PENCZEK (2000); STOREY e SHERMAN (2002).
O metoxi-polietileno glicol (mPEG) diferentemente do PEG convencional, com
duas hidroxilas livres, possui um éter metílico em uma das extremidades de cadeia
que impede o crescimento bidirecional da cadeia de PLA durante a síntese. Assim,
apenas um lado da molécula de mPEG copolimeriza formando o copolímero em
bloco anfifílico com o PLA, o PLA-b-mPEG (ZHU; XIANGZHOU; SHILIN, 1990).
Quando o co-iniciador da polimerização do lactídeo é o mPEG ou um álcool
benzílico (BzOH) o di-alcóxido de estanho reage com o lactídeo (1). Assim é
formado um complexo coordenado que rapidamente se desfaz (2) o monômero
cíclico se insere entre a ligação Sn-OR do di-alcóxido, promovendo o crescimento
unidirecional da cadeia (etapa de propagação) na síntese do dibloco PLA-b-mPEG
ou do homopolímero PLA (3) (Figura 6).
26
Figura 6: Esquema reacional das etapas de iniciação e propagação na copolimerização via ROP do monômero D,L-lactídeo. Iniciador de cadeia di-alcoxilado derivado do BzOH ou do mPEG levam a síntese do homopolímero PLA ou do copolímero dibloco PLA-b-mPEG, respectivamente, pelo mecanismo de coordenação-inserção e propagação da cadeia de PLA. Adaptado de XIAO e colaboradores (2010).
Apesar das vantagens na utilização do Sn(Oct)2 na polimerização do PLA, a
utilização de catalisadores metálicos abre precedentes para a presença de
contaminantes desta natureza nos polímeros, o que poderia potencialmente
promover toxicidade in vitro e/ou quando administrado in vivo (TANZI et al., 1994).
Neste contexto, é promissora a utilização de 4-(dimetilamino)piridina (DMAP)
(NEDERBERG et al., 2001), um organocatalisador de baixa toxicidade
(NACHTERGAEL et al., 2015) na ROP do PLA. O DMAP é geralmente usado em
sínteses de acilação (XU et al., 2005) e esterificações (SAKAKURA et al., 2007).
NEDERBERG e colaboradores (2001), sugeriram pela primeira vez a
utilização de DMAP na síntese do PLA via ROP. A determinação da hidroxila e do
éster de finais de cadeia do PLA por técnicas espectrométricas corroboram para o
mecanismo apresentado na Figura 7, sugerindo a ativação do monômero a partir do
catalisador nucleofílico (NEDERBERG et al., 2001; CONNOR et al., 2002).
27
Figura 7: Proposta de mecanismo da ROP do lactídeo na presença de DMAP como catalisador. (1) O DMAP é capaz de ativar o monômero e iniciar a polimerização da cadeia de PLA. (2) A reação de ativação do monômero acontece repetida vezes. (3) A presença de um álcool é capaz de interromper a reação liberando o DMAP no meio reacional e inserindo grupos terminais na cadeia de PLA. Adaptado de NEDERBERG e colaboradores (2001).
Copolímeros de elevada massa molar são importantes na obtenção de NP
estáveis, enquanto copolímeros de baixa massa molar tendem a formar micelas. As
micelas são sistemas de agregados moleculares bem organizados, que se
desagregam quando diluídas em água, com tamanhos de partículas menores que as
NS e com baixa capacidade de carreamento de fármaco (RILEY et al., 1999; HEALD
et al., 2001). Na Figura 8 é mostrada a diferença entre a organização micelar e a de
NS obtidas a partir do copolímero PLA-b-mPEG.
Figura 8: Diferença organizacional entre micela (á esquerda) e nanoesfera (á direita). A massa molar dos polímeros PLA-b-mPEG envolvidos na formação destes sistemas determina o tipo de partícula constituída.
28
2.5. Copolimerização do D,L-lactídeo com glicidil éteres
O desenvolvimento de copolímeros anfifílicos em bloco de PLA e mPEG
representou grande avanço no delineamento de novos sistemas de liberação
controlada de fármacos. No entanto, para a entrega direcionada de um fármaco a
um determinado tipo celular ou tecido, é necessária a presença de ligantes na
superfície dos carreadores coloidais. Estes se ligam especificamente ao tecido alvo
mediando a captação celular por receptores de reconhecimento nos alvos
terapêuticos (BANQUY et al., 2008; SWATI; GOEL; SINGLA, 2012).
Neste contexto, uma estratégia para conferir capacidade de direcionamento
dos sistemas vetorizados é funcionalizar a sua superfície com um ligante específico.
A copolimerização de lactídeos com um “agente de funcionalização” permite a
formação de uma plataforma para a acoplagem ou reação química com ligantes na
cadeia polimérica. Essa estratégia torna-se ainda mais interessante quando o
agente de acoplagem pode ser inserido aleatoriamente ao longo da cadeia
polimérica durante a propagação da cadeia a partir do monômero D,L-lactídeo
(LEEMHUIS et al., 2006; JING; HILLMYER, 2008; TANG et al., 2010).
É bastante laborioso introduzir funcionalidades na cadeia de PLA. Os esforços
para funcionalizar o PLA são baseados principalmente em: modificação de final de
cadeia a partir do uso de iniciadores de cadeia funcionalizados (WOLF;
FRIEDEMANN; FREY, 2009) e/ou aproveitamento da hidroxila terminal da cadeia do
PLA (BEUILLE et al., 2013), modificação ao longo da cadeia de PLA por
polimerização com o uso de lactídeo funcionalizado (LEEMHUIS et al., 2006; NOGA
et al., 2008) e modificação de toda a estrutura do polímero via funcionalização pós-
polimerização (HABNOUNI et al., 2011). As principais desvantagens de muitas
destas abordagens são: sínteses complexas, onerosas e com várias etapas
sequenciais; além do risco de quebra da cadeia polimérica durante a polimerização
e a obtenção de polímeros com baixos rendimentos e massas molares.
Outro método de funcionalização do PLA é a polimerização estatística por
abertura de anel do monômero D,L-lactídeo, utilizando comonômeros de inserção no
meio reacional. Assim, podem ser citadas as copolimerizações entre lactídeos e
glicidil éteres (GE), tais como o benzil glicidil éter (BGE) (RABANEL et al., 2015) e
alil glicidil éter (AGE) (BANQUY et al., 2008) (Figura 9).
29
Figura 9: Esquema reacional teórico da copolimerização estatística do D,L-lactídeo com BGE ou AGE, em função do tempo e da temperatura; na presença de um catalisador e de um iniciador de cadeia, originando os copolímeros PLA-co-AGE ou PLA-co-BGE. Δ = Temperatura; t = tempo.
Em teoria, o anel epóxido é aberto nas condições reacionais e aleatoriamente
inserido à cadeia de PLA durante a ROP do D,L-lactídeo (KOMAROVA et al., 1978;
TESKE; VOIGT; SHASTRI, 2014). O carácter inerte do grupo alila e benzila nas
condições de síntese via ROP confere vantagem na escolha do AGE e BGE,
respectivamente, como agentes de acoplagem de cadeia e permitem seu uso
juntamente com os reagentes no meio reacional. No contexto da utilização do DMAP
nas copolimerizações entre anidridos de acido carboxílicos e epóxidos por abertura
de anel (NEJAD et al., 2013) e no uso deste catalisador na polimerização de
epóxidos (DELL'ERBA; WILLIAMS, 2006; BROCAS et al., 2013). O DMAP torna-se
uma alternativa interessante a ser avaliada na inserção de epóxidos na cadeia
polimérica do PLA.
A inserção de grupamentos alila e benzila ao longo da cadeia de PLA
possibilita pós-modificações químicas dos copolímeros para a inserção de ligantes
funcionais de interesse. São exemplos dessas modificações as reações de
desproteção por hidrogenação catalítica com paládio/carbono para copolímeros com
benzila (BANQUY et al., 2008) e com tiol-eno para copolímeros com alila
(OBERMEIER; FREY, 2011).
Alternativamente à inserção de ligantes funcionais de interesse na cadeia de
PLA, a presença de benzila nas cadeias poliméricas abre perspectiva para o
encapsulamento de fármacos contendo grupos aromáticos em sua estrutura, a partir
das interações entre polímero e fármaco (SHI et al., 2013). Alguns fármacos
30
hidrofóbicos, tal como o benznidazol (BNZ), em teoria, poderiam ser mais facilmente
associados às NP preparadas a partir destes polímeros modificados por meio da
afinidade entre grupamentos aromáticos.
2.6. Benznidazol
O benznidazol (BNZ) (N-benzil-2-nitro-1-imidazol acetamida) é o fármaco de
primeira escolha na terapia da doença de Chagas, sendo bastante efetivo na fase
aguda da doença, mas com baixa ou nenhuma eficácia na fase crônica tardia da
doença. Efeitos tóxicos associados à utilização deste fármaco têm sido reportados,
tendo como consequência a interrupção do tratamento medicamentoso (CALDAS et
al., 2008). Sua fórmula estrutural é apresentada na Figura 10.
Figura 10: Fórmulas estruturais da molécula de BNZ. (A) Fórmula estrutural condensada linear evidenciando as ligações de hidrogênio entre as moléculas. (B) Fórmula estrutural espacial do estado de mais baixa energia da molécula evidenciando os três grupamentos planares: 1 – imidazol, 2 – fragmento acetamida, 3 – anel benzila. Adaptado de SOARES-SOBRINHO e colaboradores (2008).
A conformação estrutural do BNZ pode ser descrita em termos da orientação
relativa aos três fragmentos planares (Figura 10B): o grupo imidazol (1), um
fragmento de acetamida (2) e o grupo benzila (3). O BNZ forma cristais visíveis em
água, o que torna sua a encapsulação em NS problemática, uma vez que esses
31
cristais não são bem acomodados na matriz hidrofóbica polimérica. O
empacotamento cristalino é reforçado por uma rede de interações intermoleculares
fortes do tipo ligação de hidrogênio (Figura 10A) (SOARES-SOBRINHO et al., 2008).
A molécula do BNZ se caracteriza por ser pouco solúvel em água
(MAXIMIANO et al., 2010). As NP têm desempenhado um papel importante no
aumento da dispersibilidade em água de um grande número de fármacos
hidrofóbicos com baixa solubilidade aparente em água. É bem conhecido que muitas
moléculas candidatas à fármacos são insolúveis em água, configurando um dos
principais obstáculos para o desenvolvimento de formulações farmacêuticas
clinicamente viáveis (SERAJUDDIN, 2007). Nestes casos é possível aprimorar a
encapsulação destes fármacos em nanossistemas poliméricos.
2.7. Métodos para aprimorar a encapsulação de fármacos
A encapsulação de fármacos em NP poliméricas pode ser realizada por meio
de três técnicas: o fármaco é ligado covalentemente ao polímero; o fármaco é
adsorvido na superfície do polímero; ou o fármaco é aprisionado na matriz
polimérica durante a preparação das NP (KAMALYA et al., 2012). O aprisionamento
de um fármaco durante o preparo de NP consiste na técnica mais comum para a
incorporação de fármacos. Para fármacos hidrofóbicos a codissolução com
polímeros hidrofóbicos em solventes orgânicos faz com que seja muito mais fácil o
preparo da formulação. Porém, nem todos os fármacos são facilmente encapsulados
no interior de NP poliméricas por meio desta abordagem devido às suas
características estruturais cristalinas ou amorfas (KAMALYA et al., 2012).
Visando o aprimoramento da encapsulação de fármacos via aprisionamento
durante o preparo das NP, algumas estratégias podem ser adotadas: uso de agente
de reticulação (ABULATEEFEH; TAHA, 2014); modificações do método de preparo
(GOVENDER et al., 1999; SONG et al., 2008), uso de nanoreservatórios (GAO et al.,
2008); uso de sais policátions (JANES et al., 2001); uso de pares iônicos (FATTAL et
al., 1998); derivatização do fármaco (ZHIGALTSEV et al., 2010); modificação da
composição estrutural da matriz polimérica (DE MARTIMPREY et al., 2010).
Dentre os métodos da modificação da composição estrutural da matriz
polimérica estão as estratégias que têm como alvo as interações intermoleculares
entre fármaco e polímero, as quais incluem: sobreposição pi-pi (π-π) (CARSTENS et
32
al., 2008; LAI et al., 2012), ligações intermoleculares (KIM; PARK; HAMMOND,
2008), formação de estereocomplexos (KANG et al., 2005) e cristalinidade (ZHANG
et al., 2006). Estas abordagens podem aumentar a porcentagem de encapsulação, a
solubilidade de fármacos no interior dos vetores e a estabilidade das partículas (KIM
et al., 2010; SHI et al., 2013).
A sobreposição de orbitais π-π (do inglês π-π stacking), foco inicial deste
estudo, refere-se à interações atrativas, não covalentes entre anéis aromáticos ou
entre anéis aromátios e elétrons π de um grupamento vinil (HUNTER; SANDERS,
1990). As interações π-π têm desempenhado um papel importante na melhoria da
capacidade de encapsulamento de moléculas aromáticas em vetores que
apresentam grupamentos aromáticos em sua composição (YAN et al., 2011;
ZHENG; LI, 2012; SHI et al., 2013).
Neste trabalho foram então sintetizados polímeros modificados do PLA com
inserções de alila e benzila na cadeia polimérica a partir da ROP do lactídeo. Foi
também realizado o estudo da influencia do DMAP e da quantidade de epóxido no
meio reacional sobre a formação dos polímeros. A citotoxicidade das NS produzidas
a partir destes polímeros foi estudada frente a duas linhagens celulares com
diferentes susceptibilidades a presença de xenobióticos. Também foi investigada
experimentalmente a hipótese de interação dos grupamentos alila e benzila com o
fármaco modelo BNZ, por meio de um estudo dos teores de encapsulação de BNZ a
partir de NS constituídas pelos polímeros modificados.
33
3. OBJETIVO GERAL
Este trabalho teve como objetivo geral sintetizar copolímeros de D,L-lactídeo
com glicidil éteres como possíveis plataformas para aprimorar a encapsulação de
fármacos, inserção de marcadores fluorescentes ou de ligantes biológicos. Para tal,
foi buscado investigar o papel dos catalisadores e da proporção dos comonômeros
no meio reacional na inserção dos grupamentos alila e benzila nas cadeias
poliméricas de PLA e analisar a influência destes grupos no preparo de nanoesferas,
na citotoxicidade dos polímeros e na capacidade de encapsulação de um fármaco
modelo, no caso o benznidazol.
Para uma melhor compreensão a dissertação foi divida em dois capítulos:
Capítulo I - Polímeros: síntese e caracterização;
Capítulo II - Nanoesferas: preparo, caracterização, estudo de encapsulação
do benznidazol e avaliação de citotoxicidade.
34
CAPÍTULO I
Polímeros: síntese e caracterização
35
I.1. INTRODUÇÃO
A síntese de polímeros envolve a padronização dos parâmetros experimentais
que influenciam no rendimento da reação. O estudo destas variáveis é importante na
obtenção de polímeros com massas molares mais elevadas, com menos impurezas
e na diminuição da formação de produtos de secundários no meio reacional
(KAIHARA et al., 2007). As técnicas de caracterização de polímeros são
normalmente utilizadas para se determinar a massa molar média, a estrutura
molecular, propriedades térmicas e as propriedades mecânicas destes materiais
(CANEVAROLO JÚNIOR, 2010).
Polímeros geralmente possuem estruturas complexas e são formados por
uma mistura de moléculas com diferentes tamanhos de cadeia, o que dificulta a
caracterização destes materiais. Assim é necessário cruzar os resultados de várias
técnicas de caracterização para a obtenção de informações de interesse
(CAMPBELL; PETHRICK; WHITE, 2000). Duas técnicas merecem destaque na
caracterização de polímeros, cromatografia de permeação em gel (CPG) e
espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN-1H).
A CPG é utilizada na determinação da distribuição de massa molar de
materiais poliméricos. É caracterizada como uma técnica rápida, simples e segura
de fracionamento das cadeias poliméricas com relação ao volume hidrodinâmico que
cada uma delas ocupa em solução (SKOOG et al., 2006).
A distribuição de massa molar da amostra é descrita pela razão de dois
parâmetros: massa molar ponderal média (�̅�𝑤) e massa molar numérica média (�̅�𝑛)
onde o primeiro descreve o peso molecular médio em massa de moléculas nas
diferentes faixas de distribuição e o outro o peso molecular médio em número de
moléculas nas diferentes faixas de distribuição (CANEVAROLO JÚNIOR, 2010).
Na recomendação da União Internacional de Química Pura e Aplicada
(IUPAC) (2009) foi criada a palavra “dispersity” (dispersidade), representada pelo
símbolo Đ (pronunciado D-stroke), para representar a razão (�̅�𝑤/�̅�𝑛). Foram
também adotados os termos uniforme (Đ < 1,3) e não uniforme (Đ > 1,3) para
denotar uma medida da dispersão de uma distribuição das espécies
macromoleculares em amostras (IUPAC, 2009).
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear é uma técnica bastante
usada para determinação estrutural de compostos, permitindo determinar as
36
propriedades de uma substância através do registro gráfico das frequências dos
picos de absorção contra suas intensidades, sendo a frequência regida pelas
características estruturais da amostra (FEINSTEIN, 1995). Os espectros obtidos por
RMN-1H permitem confirmar estruturas químicas relativas aos polímeros
sintetizados. Além de estimar quantitativamente as impurezas presentes nos
polímeros e no D,L-lactídeo antes e após a purificação.
Com os resultados obtidos por CPG é possível avaliar se houve influência de
vários parâmetros nas sínteses dos polímeros sintetizados, tais como: temperatura,
tempo de reação, quantidade de catalisador, de monômero e de iniciador de cadeia
nas massas molares e Đ dos polímeros obtidos. Os espectros obtidos por RMN-1H
permitem confirmar estruturas químicas relativas aos polímeros sintetizados. Além
de estimar quantitativamente as impurezas presentes nos polímeros e no D,L-
lactídeo antes e após a purificação. A análise combinada dos resultados de CPG e
RMN-1H permite avaliar a influência da quantidade de comonômeros adicionada no
meio reacional em relação à massa do polímero obtida.
Neste estudo a inserção dos comonômeros AGE e BGE no bloco de PLA foi
estimada por CPG e RMN-1H. Foi avaliada também a influência do DMAP nas
polimerizações, em relação ao número de unidades glicidil éter (GE) inseridas por
cadeia, efeitos na massa molar e na dispersidade de massa molar obtidos para os
polímeros sintetizados.
37
I.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a influência de certas variáveis na polimerização por abertura de anel
do D,L-lactídeo, tais como: temperatura, tempo, razão catalisador/iniciador,
razão monômero/iniciador e a ativação do mPEG nas massas molares e
dispersidades dos polímeros obtidos;
Desenvolver uma metodologia satisfatória para sintetizar os copolímeros
funcionalizados; ácido poliláctico-co-glicidil éter de alila (PLA-co-AGE) e ácido
poliláctico-co-glicidil éter de benzila (PLA-co-BGE);
Avaliar a influência do catalisador DMAP nas sínteses e na inserção de alila e
benzila nas cadeias poliméricas;
Avaliar a influência da quantidade de epóxido no meio reacional em relação à
inserção de alila e benzila nas cadeias poliméricas.
38
I.3. MATERIAIS E MÉTODOS
I.3.1. Materiais
Os reagentes e insumos utilizados nesta parte do trabalho são apresentados
na Tabela 1 com seus respectivos fornecedores comerciais, massas molares e
densidades, quando aplicável.
Tabela 1: Reagentes e insumos utilizados com seus respectivos fornecedores comerciais, massas molares e densidades.
Reagentes e insumos Fornecedor comercial
M (g/mol)
Densidade (g/mL) (1atm a 20 °C)
D,L-lactídeo Sigma-Aldrich® 144,13 -
Alil glicidil éter (AGE) Sigma-Aldrich® 114,14 0,962
Benzil glicidil éter (BGE) Sigma-Aldrich® 164,20 1,077
Octanoato de estanho (Sn(Oct)2) Sigma-Aldrich® 405,12 1,251
4-(dimetilamino)piridina (DMAP) Sigma-Aldrich® 122,17 -
Álcool benzílico (P.A.) (BzOH) Vetec® 108,14 1,045
Metoxi-polietileno glicol (mPEG) Sigma-Aldrich® 2000 -
Metoxi-polietileno glicol (mPEG) Sigma-Aldrich® 5000 -
Tolueno anidro (UV/CLAE) Sigma-Aldrich® 92,14 0,867
Metanol (P.A.) (MeOH) Tedia® 32,04 0,792
Diclorometano (P.A.) (DCM) Tedia® 84,93 1,330
Clorofórmio (P.A.) (TCM) Tedia® 119,38 1,490
n-hexano (P.A.) (HEX) Merck® 86,18 0,655
Éter etílico (P.A.) (Et2O) Vetec® 74,12 0,713
Nitrogênio líquido (N2) (99,99% de pureza) White Martins® 28,01 0,808*
Argônio (Ar) (99,99% de pureza) White Martins® 39,94 1,666
Tetrahidrofurano (THF) (UV/CLAE) Sigma-Aldrich® 72,11 0,889
2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (BHT) Sigma-Aldrich® 220,35 1,048
Graxa de silicone para alto vácuo Vetec® - -
Óleo de silicone Sigma-Aldrich® - -
Legenda: (M) massa molar; (-) dado não aplicável ou não fornecido; (*) densidade no ponto de ebulição a 1 atm.
39
I.3.2. Preparo e purificação dos reagentes
Para o preparo da solução estoque de BzOH, certa quantidade de BzOH foi
destilada à vácuo (7 × 102 mbar, 148 °C) para remoção de impurezas, sendo
preparada uma solução a 10% (v/v) do destilado em tolueno anidro.
Para o preparo da solução estoque de Sn(Oct)2, 1 mL de Sn(Oct)2 foi seco em
alto vácuo (≤ 2,8 × 10-2 mbar) por no mínimo 5 horas. Este volume foi então diluído
em 9 mL de tolueno anidro de modo a obter uma solução 10% (v/v). Para o preparo
da solução estoque de DMAP, 31,4 mg de DMAP foi diluída em 2 mL de tolueno
anidro de modo a obter uma solução 1,57% m/v. Todas as soluções foram
acondicionadas em frascos de vidro hermeticamente fechados.
Não foi necessário preparar solução estoque diluída dos monômeros AGE e
BGE, já que estes foram usados em volumes maiores nas sínteses. Em todos os
frascos de reagentes preparados foram adicionadas peneiras moleculares (3 Å) e os
frascos armazenados sob atmosfera de Ar. A cada abertura dos frascos era
renovada a atmosfera inerte. Os reagentes descritos foram depositados em
dessecador com sílica gel anidra azul (Synth®) com exceção do D,L-lactídeo e do
BGE, acondicionados em geladeira (4 ºC).
I.3.3. Purificação do D,L-lactídeo
O monômero foi purificado através de recristalizações em tolueno para que as
reações de síntese não fossem influenciadas por impurezas residuais e umidade. A
certa quantidade de D,L-lactídeo foi adicionado tolueno anidro na proporção de 1:1
(m/v). Em seguida a mistura foi aquecida a 80 ºC para completa solubilização dos
cristais. A solução foi então resfriada à temperatura ambiente até a completa
recristalização, sendo os cristais recuperados manualmente. A fração líquida
contendo impurezas foi descartada e este processo foi realizado três vezes para
maior purificação.
Finalizada as três recristalizações o tolueno residual foi removido por
evaporação da mistura azeotrópica formada em rotavapor (Büchi® R3) (60 RPM, 40
°C, 10 mbar, 1 h). Após este período o monômero foi submetido à alto vácuo (≤ 3,6 ×
10-1 mbar) por no mínimo 5 h para eliminação do solvente residual. Foi realizada
análise do ponto de fusão (triplicata) (Büchi® M-560) e de RMN-1H (400 MHz)
40
(Bruker Avance® Drx-400 MHz) do D,L-lactídeo antes e após a recristalização para
se verificar a eficiência do processo na eliminação de impurezas. A pureza foi
estimada a partir integração da área dos prótons relativos à impureza majoritária, no
caso o lactato de lactila, um produto formado a partir da abertura do monômero por
hidrólise. Assim, a porcentagem de pureza foi calculada através da Equação 1.
Equação (1):
𝑃𝑈 =𝐴5.07
𝐴5.07 + 𝐴5.18 + 𝐴4.37 × 100
Onde:
PU = Pureza (%);
A5.07 = Integração da área dos picos dos prótons metínicos do D,L-lactídeo (δ = 5.07
ppm);
A5.18 e A4.37 = Integração da área dos picos dos prótons metínicos do lactato de
lactila (δ = 5.18 ppm) e (δ = 4.37 ppm), respectivamente.
I.3.4. Sínteses dos polímeros
I.3.4.1. Procedimentos gerais
Os polímeros foram sintetizados através da reação de polimerização em
massa por abertura de anel do monômero D,L-lactídeo, com base no protocolo
adaptado de KAIHARA e colaboradores (2007). Uma polimerização típica foi
realizada da seguinte maneira: em um balão volumétrico de 50 mL previamente seco
em estufa a 70 °C foram adicionados 2 g de D,L-lactídeo recristalizado, 14 µL de
uma solução a 10% (v/v) em tolueno de Sn(Oct)2 e 20 µL de uma solução a 10%
(v/v) de BzOH destilado em tolueno sob agitação magnética. Foi adaptada uma
torneira ao balão e a esta uma mangueira de silicone que permitiu a dosagem dos
reagentes em 9 ciclos alternados de Ar/alto vácuo terminando em Ar, com o suporte
de um aparato experimental conforme ilustrado na Figura 11A.
41
Figura 11: Ilustração dos módulos experimentais utilizados. (A) O Ar é fornecido diretamente para a linha de gás a partir de um cilindro de gás comprimido, saindo da linha de distribuição através de um borbulhador de óleo. Entre a linha de vácuo e a bomba de alto vácuo (Edwards® RV5) é conectada uma câmara de captação de vapores, com a função de impedir que vapores de solventes entrem na bomba e degradem o seu óleo ou motor. A câmara de captação é imersa em um frasco de Dewar (Nalgene®) contendo N2 líquido para resfriamento da mesma. Com o vácuo ligado, os vapores do balão volumétrico são sugados para o interior frio da câmara de captação e condensados. (B) Esquema do aparato reacional durante a condução das sínteses. O balão volumétrico contendo os reagentes é imerso em um banho de óleo de silicone sobre placa agitadora magnética (IKA® RCT) com controlador de temperatura (IKA® ETS-D5).
O balão volumétrico foi fechado e transferido para um banho de óleo de
silicone termostatizado (147 ou 137 °C) sobre placa agitadora magnética (300 RPM)
com controlador de temperatura (Figura 11B). Não foram pré-determinados tempos
de reação para as sínteses, salvo quando indicado ao contrário, as reações foram
interrompidas após observação visual indireta da formação de polímero, indicada
pelo impedimento do movimento do agitador magnético, devido ao aumento da
viscosidade do meio reacional. Finalizadas as reações, as polimerizações foram
interrompidas submetendo o frasco a um banho de gelo (0 ºC) e os polímeros foram
isolados por precipitação e acondicionados em geladeira (4 ºC).
42
I.3.4.2. Síntese dos homopolímeros PLA
As diferentes condições utilizadas na síntese dos homopolímeros PLA são
apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2: Variações das condições experimentais utilizadas na síntese do PLA.
Código TBO (ºC) Catalisador Razão molar
LAC:CAT Razão molar
INI:CAT Razão molar
LAC:INI
GP1026 147 Sn(Oct)2 900:1 1:1 1000:1
L0601 147 Sn(Oct)2 900:1 1:1 1000:1
L0602 147 Sn(Oct)2 900:1 1:1 1000:1
L0801 137 Sn(Oct)2 900:1 1:1 1000:1
L1201 137 DMAP 500:1 1:2 1000:1
L1202 137 DMAP/Sn(Oct)2 500:1 1:2 1000:1
Legenda: (TBO) temperatura do banho de óleo; (LAC) D,L-lactídeo; (INI) iniciador; (CAT) catalisador.
I.3.4.3. Síntese dos copolímeros PLA-b-mPEG
Os copolímeros PLA-b-mPEG foram sintetizados usando o mPEG como
iniciador de cadeia no lugar do BzOH. Em cada balão volumétrico de 50 mL (secos
em estufa a 70 °C) foram adicionados 2 g do iniciador mPEG e 2 mL de tolueno
anidro. O tolueno foi evaporado em rotavapor (Büchi® R3) (60 RPM, 40 °C, 10 mbar,
0,5 h) para remoção de potenciais traços de água por evaporação azeotrópica, o
processo foi repetido duas vezes. Diferentemente das demais sínteses, na síntese
de L0901, o catalisador foi adicionado ao balão contendo mPEG juntamente com 2
mL de tolueno no segundo ciclo de evaporação no rotavapor, um processo
denominado ativação do mPEG. Na sequência foram adicionados o Sn(Oct)2, exceto
no caso de L0901, e o D,L-lactídeo em cada balão e aplicados os ciclos de Ar/vácuo
como descrito anteriormente. As diferentes condições de sínteses são apresentadas
na Tabela 3.
43
Tabela 3: Variações das experimentais utilizadas na síntese do PLA-b-mPEG.
Código �̅�𝒏 mPEG
(g/mol) TBO (ºC)
Razão molar LAC:CAT
Razão molar INI:CAT
Razão molar LAC:INI
GP1027 2.000 147 555:1 1:1 555:1
L0802 2.000 137 555:1 1:1 555:1
L0803 5.000 137 555:1 1:1 555:1
L0804 5.000 137 2200:1 4:1 555:1
L0903 5.000 137 2200:1 8:1 278:1
L0901 5.000 137 2200:1 4:1 555:1
Legenda: (�̅�𝑛) massa molar numérica média; (TBO) temperatura do banho de óleo; (LAC) D,L-lactídeo; (CAT) catalisador; (INI) iniciador.
I.3.4.4. Síntese dos copolímeros PLA-co-AGE e PLA-co-BGE
Os copolímeros PLA-co-AGE e PLA-co-BGE foram sintetizados
acrescentando ao meio reacional os comonômeros AGE e BGE, respectivamente,
nas porcentagens molares de 6, 24 e 46% em relação ao D,L-lactídeo. Sínteses
usando DMAP como co-catalisador foram realizadas mantendo uma razão molar de
Sn(Oct)2:DMAP = 1:1. As diferentes condições de sínteses são apresentadas na
Tabela 4.
Tabela 4: Condições experimentais utilizadas nas sínteses dos copolímeros PLA-co-AGE e PLA-co-BGE.
CAT GE Código % molar GE:LAC
Razão molar LAC:CAT:INI
Razão molar (LAC+GE):INI
Sn(Oct)2
AGE
L0902 6 968:1:1 1032:1
GP1030 24 864:1:1 1137:1
GP1031 46 702:1:1 1300:1
BGE
L1205 6 967:1:1 1136:1
L0207 24 864:1:1 1136:1
L0206 46 224:1:1 413:1
Sn(Oct)2
/DMAP
AGE
L0201 6 968:1:1 1032:1
L1206 24 864:1:1 1137:1
L0202 46 704:1:1 1296:1
BGE
L0203 6 968:1:1 1032:1
L0204 24 864:1:1 1136:1
L0205 46 704:1:1 1296:1
Legenda: (CAT) catalisador; (GE) glicidil éter; (BGE) benzil glicidil éter; (AGE) alil glicidil éter; (LAC) D,L-lactídeo; (INI) iniciador.
44
I.3.5. Purificação dos polímeros
Foram testadas diferentes condições de purificação para os polímeros. Para
cada 2 g destes foram testados como solventes 15 mL de metanol, diclorometano e
clorofórmio, com agitação até completa dissolução. Depois de dissolvidos foram
testadas as precipitações em 300 mL de não solvente (n-hexano ou éter etílico). Os
polímeros foram recuperados por filtração e/ou manualmente com o auxílio de uma
espátula, dependendo das características do material. Sendo este processo
realizado em duplicata para alguns polímeros. O resíduo de solvente/não solvente
foi removido em rotavapor (Büchi® R3) (60 RPM/40 °C/10 mbar/1 h). Após este
período foi avaliada a aplicação de alto vácuo com e sem aquecimento a 40 °C para
eliminar quaisquer traços de solvente/não solvente residuais dos polímeros
purificados. O processo foi realizado em diferentes tempos.
I.3.6. Caracterização físico-química dos polímeros
I.3.6.1. Cromatografia de permeação em gel
A análise por CPG foi realizada em cromatógrafo de permeação em gel
(Agilent® 1260 Series) com detector de índice de refração (Infinity G1362ARID), pré-
coluna PL gel 5 µm Mini MIX-D Guard (50 x 4,6 mm), duas colunas PL gel 5 µm Mini
MIX-D (250 x 4,6 mm), unidas em série e aquecidas a 35 °C. O THF (estabilizado
com 250 ppm de BHT) foi utilizado como fase móvel e no preparo das amostras nas
concentrações de 4 mg/mL.
Após a filtração em filtros de seringa de 0,22 μm (Millex®) as amostras foram
injetadas por sistema automatizado em volumes de 20 μL, com eluição ao fluxo de
0,25 mL/min. A curva de calibração foi gerada a partir de padrões de poliestireno
(Supelco®) injetados, com massas molares compreendidas na faixa de 162 a
371.100 g/mol. A análise por CPG permitiu determinar os valores médios de �̅�𝑛, �̅�𝑤
e a Đ. O tratamento dos dados foi realizado utilizando o programa Agilent GPC/SEC
versão 1.2 (Agilent Technologies©) e os cromatogramas foram reproduzidos com o
auxílio do programa OriginPro versão 9.0.0 (OriginLab Corporation©).
45
I.3.6.2. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio
Os espectros de RMN-1H foram obtidos no espectrômetro (Bruker Avance®
Drx-400 MHz) do Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear (LAREMAR) do
Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os
deslocamentos químicos (δ) foram expressos em ppm. As multiplicidades das
bandas foram indicadas segundo as convenções: s (simpleto), d (dupleto), t
(tripleto), q (quarteto) e m (multipleto). Como referência interna foi utilizado
tetrametilsilano (TMS) (δ = 0 ppm) e como solventes clorofórmio deuterado (CDCl3)
ou dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6). O tratamento dos dados foi realizado com
o auxílio do programa SpinWorks versão 4.1.0.0 (University of Minitoba©).
A partir dos espectros obtidos foi calculada a razão molar entre os hidrogênios
alila ou benzila e hidrogênios lactídeos. Foi calculado também o grau de
polimerização, ou seja, a razão molar entre a �̅�𝑛 obtida por CPG e a massa molar
do monômero D,L-lactídeo. O produto destes cálculos permitiu estimar
quantitativamente a proporção dos comonômeros AGE ou BGE inseridos no bloco
de PLA, conforme representado na Equação 2.
Equação (2):
𝑈𝐺𝐸/𝐶𝐴𝐷 =�̅�𝑛 𝐶𝑃𝐺
𝑀 𝐿𝐴𝐶 ÷ 2 ×
𝐼𝑝𝐺𝐸𝑛° 𝑝𝐺𝐸𝐼𝑝𝑀𝑒𝑡
𝑛° 𝑝𝑀𝑒𝑡
Onde:
UGE/CAD = Número de unidades glicidil éter por cadeia polimérica;
�̅�𝑛 CPG = �̅�𝑛 obtida por CPG (g/mol);
M LAC = Massa molar do D,L-lactídeo (M LAC = 144,13 g/mol);
IpGe = Integração da área relativa aos prótons dos glicidil éteres: para o AGE (δ =
5.8-5.9 ppm) e para o BGE (δ = 7.2-7.4 ppm);
n° pGE = Número de prótons glicidil éteres correspondentes à IpGe: para o AGE (n°
pGE = 1) e para o BGE (n° pGE = 5);
IpMet = Integração da área relativa aos prótons metínicos do PLA (δ = 4.9-5.5 ppm);
46
n° pMet = Número de prótons correspondentes à um grupamento metínico da cadeia
de PLA (n° pMet = 1).
O cálculo estimado da proporção dos comonômeros AGE ou BGE inseridos
no bloco de PLA e o grau de polimerização do monômero D,L-lactídeo permitiram
estimar a porcentagem molar de GE no polímero, conforme representado na
Equação 3.
Equação (3):
% 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝐺𝐸 𝑛𝑜 𝑝𝑜𝑙í𝑚𝑒𝑟𝑜 =𝑈𝐺𝐸/𝐶𝐴𝐷
𝑈𝐺𝐸/𝐶𝐴𝐷 +�̅�𝑛 𝐶𝑃𝐺𝑀 𝐿𝐴𝐶
× 100
Onde:
UGE/CAD = Número de unidades glicidil éter por cadeia polimérica;
�̅�𝑛 CPG = �̅�𝑛 obtida por CPG (g/mol);
M LAC = Massa molar do D,L-lactídeo (M LAC = 144,13 g/mol).
Os espectros obtidos permitiram estimar a �̅�𝑛 para os copolímeros diblocos
PLA-b-mPEG sintetizados, a partir da integração dos prótons metila do mPEG e da
integração dos prótons metínicos do bloco PLA conforme representado na Equação
4. Neste cálculo foi considerado que no espectro de RMN-1H todas as cadeias foram
iniciadas pelo mPEG. Foi utilizado o próton metila do grupo metoxila do mPEG como
referência para a integração dos picos marcados, com valor de integração de (3,000)
(δ = 3.3 ppm).
Equação (4):
�̅�𝑛 𝑅𝑀𝑁-1𝐻 = (𝐼𝑝𝑚𝑃𝐸𝐺
𝑛° 𝑝𝑚𝑃𝐸𝐺 × 𝑀 𝑚𝑃𝐸𝐺 ) + ([𝑀 𝐿𝐴𝐶 ÷ 2] ×
𝐼𝑝𝑀𝑒𝑡
𝑛° 𝑝𝑀𝑒𝑡)
Onde:
IpmPEG = Integração dos prótons metilenos do mPEG (δ = 3.4-3.8 ppm);
47
nº pmPEG = Número de prótons metilenos do monômero mPEG (nº pmPEG = 4);
M mPEG = Massa molar do monômero mPEG (M mPEG = 44 g/mol);
M LAC = Massa molar do D,L-lactídeo (M LAC = 144,13 g/mol);
IpMet = Integração da área relativa aos prótons metínicos do PLA (δ = 4.9-5.5 ppm);
n° pMet = Número de prótons correspondentes à um grupamento metínico da cadeia
de PLA (n° pMet = 1).
Com base na razão entre as �̅�𝑛 obtidas por CPG e as estimada por RMN-1H
para os copolímeros PLA-b-mPEG sintetizados, foi calculada a porcentagem de
cadeias que foram iniciadas pelo mPEG (Equação 5). Este cálculo foi possível uma
vez que no cálculo estimado da �̅�𝑛 por RMN-1H foi considerado que todas as
cadeias foram iniciadas pelo mPEG, enquanto que a �̅�𝑛 obtida por CPG não leva
em consideração o iniciador de cadeia.
Equação (5):
𝐶𝑎𝑑𝑒𝑖𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑒𝑙𝑜 𝑚𝑃𝐸𝐺 (%) = �̅�𝑛 𝐶𝑃𝐺
�̅�𝑛 𝑅𝑀𝑁-1𝐻 × 100
Onde:
�̅�𝑛 CPG = �̅�𝑛 obtida por CPG (g/mol);
�̅�𝑛 RMN-1H = �̅�𝑛 estimada por RMN-1H (g/mol).
A técnica de RMN-1H também permitiu estimar as porcentagens em mol de
monômero e de não solvente residuais nos polímeros purificados em relação ao
bloco PLA, conforme explicitado na Equação 6.
Equação (6):
𝑀𝑜𝑙% 𝑋 = 𝐼𝑝𝑋
𝑛° 𝑝𝑋 ×
𝑛° 𝑝𝑀𝑒𝑡
𝐼𝑝𝑀𝑒𝑡 + 𝐼𝑝𝑋 × 100
Onde:
48
Mol% X = Porcentagem em mol de monômero ou não solvente;
IpX = Integração da área do pico relativo aos prótons de interesse do monômero ou
do não solvente;
n° pX = Número prótons do monômero ou do não solvente relativos à área de
interesse;
IpMet = Integração da área relativa aos prótons metínicos do PLA (δ = 4.9-5.5 ppm);
n° pMet = Número de prótons correspondentes à um grupamento metínico da cadeia
de PLA (n° pMet = 1).
Os polímeros foram pesados após a secagem, com a finalidade de determinar
as massas reais dos produtos das reações. As massas obtidas foram comparadas
com as massas teóricas para um rendimento de 100% (massa total dos reagentes).
O rendimento experimental das reações foi corrigido levando-se em consideração as
porcentagens molares de monômero e de não solventes residuais encontradas
conforme descrito anteriormente. Assim, o rendimento experimental corrigido foi
calculado conforme a Equação 7.
Equação (7):
𝑅𝐸𝐶 = 𝑀𝑂
𝑀𝑅 × [1 − (𝑀𝑜𝑙% 𝑋1 + 𝑀𝑜𝑙% 𝑋2)] × 100
Onde:
REC = Rendimento experimental corrigido (%);
MO = Massa do produto obtido (g);
MR = Massa total dos reagentes (g);
Mol% X1 = Porcentagem em mol de monômero;
Mol% X2 = Porcentagem em mol de não solvente.
Com base na �̅�𝑛 teórica e no rendimento experimental corrigido foi calculada
a �̅�𝑛 teórica corrigida para os copolímeros PLA-b-mPEG, conforme explicitado na
Equação 8. Este cálculo corresponde à proporção inicial de D,L-lactídeo e iniciador
no meio reacional (�̅�𝑛 teórica) corrigida pela conversão de D,L-lactídeo
experimental.
49
Equação (8):
�̅�𝑛 𝑇𝐶 = 𝑅𝐸𝐶 × �̅�𝑛 𝑇𝐸
100
Onde:
�̅�𝑛 TC = �̅�𝑛 teórica corrigida (g/mol);
REC = Rendimento experimental corrigido (%);
�̅�𝑛 TE = �̅�𝑛 teórica (g/mol).
Foram considerados altos os rendimentos experimentais acima de 50%. Nos
resultados foram apresentados apenas os espectros de RMN-1H dos polímeros
sintetizados e que foram utilizados no preparo de NS; com as suas respectivas
estruturas moleculares, contendo as atribuições dos prótons.
50
I.4. RESULTADOS
I.4.1. Purificação do D,L-lactídeo
Foram obtidos espectros de RMN-1H do monômero antes e após a
recristalização com o intuito de verificar a eficiência do processo na eliminação de
impurezas. Os espectros do D,L lactídeo comercial são apresentados na Figura 12.
Figura 12: Espectros de RMN-1H do monômero comercial. (A) Espectro do monômero antes da recristalização; (B) Espectro do monômero após a recristalização.
Nos espectros de RMN-1H apresentados foram considerados para o D,L-
lactídeo, os picos localizados nos seguintes deslocamentos químicos: δ = 1.64-1.68
ppm (d, 3 H, a) e δ = 5.04-5.14 ppm (q, 1 H, b). Foi adotado como referência o
próton (b) do monômero para a integração das áreas dos picos marcados, com valor
de integração de (1,000). A razão de 3:1 entre os valores de integração das áreas
dos prótons (a) e (b) do D,L-lactídeo confirma a sua estrutura.
Foi observado que o espectro A, correspondente ao D,L-lactídeo não
recristalizado, possui mais picos de impureza referentes ao lactato e em maior
51
quantidade do que o espectro B, obtido para o monômero após a recristalização. As
porcentagens de pureza quantificadas para o monômero antes e após a
recristalização foram de 23% e 86% respectivamente. A determinação do ponto de
fusão do monômero antes e após a recristalização indicou faixa de fusão entre
121,0-123,6 °C e 125,4-125,9 °C respectivamente, ou seja, um aumento e
estreitamento da faixa de fusão.
Nos espectros de RMN-1H apresentados foram considerados para a impureza
lactato de lactila, os picos localizados nos seguintes deslocamentos químicos: δ =
1.66 ppm (t, 3 H, c), δ = 1.56 ppm (d, 3 H, d), δ = 4.37 ppm (m, 1 H, b) e δ = 5.18
ppm (q, 1 H, a). A razão entre os valores de integração das áreas dos prótons
confirma a estrutura da molécula.
I.4.2. Purificação dos polímeros
Na Tabela 5 são apresentados os valores das porcentagens molares de
monômeros e não solventes residuais calculados a partir dos espectros de RMN-1H
dos polímeros sintetizados. São também apresentados dados experimentais, tais
como tempo de secagem em alto vácuo, a utilização ou não de aquecimento no
processo, o sistema de solvente/não solvente testado e o número de purificações
(ciclos de solubilização/precipitação) realizadas.
Não foi observada diferença entre a utilização de clorofórmio ou
diclorometano como solventes na dissolução dos polímeros. Já o uso de metanol a
frio como não solvente na purificação de GP1027 não se mostrou eficiente, pois o
aspecto viscoso do polímero dificultou a sua recuperação, além de alta turbidez no
sobrenadante.
Em relação ao não solvente foram observados para os copolímeros de PLA-
co-AGE e PLA-co-BGE precipitados em éter, um aspecto muito fluido que dificultou
o recolhimento dos mesmos após a precipitação em béquer. Com base nesta
observação foi utilizado para as sínteses com glicidil éter, o n-hexano como não
solvente, com uso do éter etílico apenas para “lavar” superficialmente os polímeros
antes da aplicação do alto vácuo/40° C.
Em suma, os resultados sugerem que: tempos maiores de aplicação de vácuo
com aquecimento durante a secagem, propiciaram a evaporação mais eficiente dos
solventes residuais. Já o processo de purificação realizado duas vezes favoreceu
52
uma melhor eliminação do monômero que não reagiu, enquanto o uso do éter etílico
favoreceu a evaporação do n-hexano. Estes processos foram úteis na obtenção de
polímeros sem cheiro residual de solvente, com bom aspecto visual, tátil e mais
puros como indicado pelos espectros de RMN-1H e foram considerados sistemas
satisfatórios para purificação dos polímeros neste estudo.
Tabela 5: Impurezas residuais estimadas por RMN-1H para os polímeros sintetizados em função das condições de purificação empregadas.
Tipo de amostra
Código TS (h)
AQ (40 °C)
Solvente /Não
solvente NU
RMN-1H
mol% de monômero#
mol% de solvente/não
solvente#
PLA
GP1026 01,00 Sim DCM/MeOH 1 < 1 < 1
L0601 01,00 Não DCM/HEX 1 18 3
L0602 01,00 Não DCM/HEX 1 - -
L0801 02,00 Não TCM/HEX 1 24 2
L1202 07,00 Sim TCM/Et2O 1 < 1 < 1
PLA-b-mPEG
GP1027 02,00 Não DCM/HEX 1 1 4
L0802 02,50 Não DCM/HEX 1 13 1
L0803 02,00 Não DCM/HEX 1 20 3
L0804 02,00 Não TCM/HEX 1 32 < 1
L0903 13,17 Sim TCM/Et2O 1 < 1 < 1
L0901 09,00 Não TCM/Et2O 1 < 1 < 1
PLA-co-AGE
L0902 08,25 Sim TCM/Et2O 1 < 1 < 1
GP1030 - Sim DCM/HEX 1 27 4
GP1031 - Sim TCM/HEX 1 6 3
L0201 06,67 Sim TCM/Et2O 2 < 1 < 1
L1206 04,00 Sim TCM/Et2O 1 < 1 < 1
L0202 05,50 Sim TCM/HEX * 2 < 1 < 1
PLA-co-BGE
L1205 06,00 Sim TCM/Et2O 1 < 1 < 1
L0207 10,30 Sim TCM/HEX * 2 < 1 < 1
L0206 11,17 Sim TCM/HEX * 2 < 1 < 1
L0203 07,83 Sim TCM/HEX * 2 < 1 < 1
L0204 07,50 Sim TCM/HEX * 2 < 1 < 1
L0205 07,00 Sim TCM/HEX * 2 < 1 < 1
Legenda: (TS) Tempo de secagem; (AQ) Aquecimento; (NU) Número de purificações; (DCM) Diclorometano; (MeOH) Metanol; (HEX) n-hexano; (TCM) clorofórmio; (Et2O) Éter etílico; (–) Dados não coletados; (*) Purificação seguida de lavagem com Et2O antes da aplicação de vácuo; (
#)
Calculado em relação ao bloco PLA.
53
I.4.3. Caracterização físico-química dos polímeros
I.4.3.1. Caracterização físico-química dos homopolímeros PLA
Os resultados das caracterizações obtidos para os homopolímeros de PLA
sintetizados em função das alterações dos parâmetros de síntese avaliados podem
ser observados na Tabela 6.
Tabela 6: Efeito da variação das condições experimentais na síntese de homopolímeros PLA caracterizados por CPG e RMN-1H.
Variáveis avaliadas em pares
Tempo reacional Temperatura
reacional Tipo de Catalisador
Código GP1026 L0601 L0602 L0801 L1201 L1202
TEO
TBO (ºC) 147 147 147 137 137 137
Catalisador Sn(Oct)2 Sn(Oct)2 Sn(Oct)2 Sn(Oct)2 DMAP DMAP/
Sn(Oct)2
EXP Tempo de
reação (min) 120 60 17 34 960* 72
EXP + RMN
REC (%) 84 100 100 85 - 50
CPG
�̅�𝒏 (g/mol)
77.500 40.100 59.600 31.500 6.100 25.600
Đ 1,9 1,4 1,3 1,4 1,9 1,2
Legenda: (TEO) teórico; (EXP) experimental; (TBO) temperatura do banho de óleo; (REC) rendimento experimental corrigido; (-) polímero não purificado; (*) síntese interrompida sem que houvesse término da agitação pelo agitador magnético.
Entre as sínteses dos polímeros GP1026 e L0601 o tempo de reação variou.
A síntese de GP1026 foi encerrada com 2 h, sendo que o agitador magnético cessou
a agitação aos 50 min. Nesta reação foi obtido o produto de maior �̅�𝑛, não obstante,
com maior Đ observada, sendo classificado como um polímero não uniforme. A
síntese de L0601 foi interrompida quando o agitador magnético cessou a agitação,
com 1 h. A análise de CPG mostrou um polímero com �̅�𝑛 e Đ menores que GP1026.
A cessação da agitação do meio reacional pelo agitador magnético está intimamente
ligada ao aumento da viscosidade do meio devido à conversão do monômero D,L-
lactídeo em polímero em proporção significativa.
54
O segundo parâmetro observado foi a alteração de temperatura. O polímero
L0801 foi sintetizado nas mesmas condições reacionais que o polímero L0602, com
variação das temperaturas de sínteses, 137 °C e 147 °C respectivamente. Os
resultados mostram que a síntese de L0801 foi duas vezes mais lenta e formou um
polímero com �̅�𝑛 reduzida à metade em relação à L0602, enquanto a Đ não variou.
O terceiro parâmetro avaliado foi o tipo de catalisador utilizado, no caso,
L1201 e L1202 foram sintetizados nas mesmas condições reacionais e modificados
os sistemas de catalisadores, DMAP e DMAP/Sn(Oct)2 respectivamente. Na síntese
do PLA L1201 unicamente com DMAP, o meio reacional foi se tornando amarelado
gradualmente até atingir a cor marrom. Não houve formação visível de polímero, ou
seja, o meio reacional não ficou viscoso e o agitador magnético não cessou a
agitação sendo necessária a interrupção mecânica da síntese com 960 min. O
polímero não precipitou em nenhum dos não solventes testados, o que inviabilizou a
sua purificação.
Quando foi utilizado o DMAP/Sn(Oct)2 na síntese do PLA L1202, a agitação
magnética cessou com 72 min, em virtude da viscosidade. Assim, a utilização de
apenas DMAP como catalisador na condição de síntese avaliada, não reduziu o
tempo de síntese, com base na observação visual do aumento da viscosidade do
meio reacional. Todos os PLA purificados apresentaram altos rendimentos
experimentais (≥ 50%). Os perfis de distribuições das massas molares analisados
por CPG dos homopolímeros de PLA sintetizados são mostrados na Figura 13.
Figura 13: Distribuições de massas molares obtidas por CPG dos polímeros PLA em função das alterações de parâmetros: tempo de reação, temperatura e tipo de catalisador.
Largos perfis de distribuição de massas molares foram visualizados para os
polímeros sintetizados em tempos maiores GP1026 e L1201. Para os outros
55
polímeros as distribuições de massas molares foram mais estreitas, embora as
curvas tenham apresentado perfis de distribuição bimodais. Na Figura 14 é
apresentado o espectro de RMN-1H do PLA L1202.
Figura 14: Espectro de RMN-1H do PLA L1202.
No espectro de RMN-1H do PLA L1202 foram avaliados os picos localizados
nos seguintes deslocamentos químicos: δ = 1.0-1.8 ppm (m, 3 H, a) e δ = 4.9-5.5
ppm (m, 1 H, b). Foi adotado como referência o sinal b para a integração dos picos
marcados, com valor de integração de (1,002). A razão de ≅ 1:3 entre os valores de
integração dos prótons (a) e (b) corrobora para a confirmação da estrutura do
homopolímero PLA.
Com base nos perfis de distribuições de massas molares e nos valores de �̅�𝑛
e Đ encontrados para os PLA sintetizados até então, foi inferido que com a
interrupção da reação no momento que o agitador magnético cessasse a agitação
seriam obtidos polímeros de Đ mais baixas; a condução das sínteses a 147 °C
propiciaria reações mais rápidas e na formação de polímeros de �̅�𝑛 maiores; e que
a utilização de apenas DMAP na concentração avaliada não permitiria o término da
reação com base no aspecto visual do incremento da viscosidade.
56
I.4.3.2. Caracterização físico-química dos copolímeros PLA-b-mPEG
Os resultados das caracterizações obtidos para os copolímeros PLA-b-mPEG
sintetizados em função das alterações dos parâmetros de síntese avaliados podem
ser observados na Tabela 7.
Tabela 7: Efeito da variação das condições experimentais na síntese de copolímeros PLA-b-mPEG caracterizados por CPG e RMN-1H.
Parâmetros avaliados em pares
A A B B,C,D C D
Código GP1027 L0802 L0803 L0804 L0903 L0901
TEO
�̅�𝒏 mPEG (g/mol)
2.000 2.000 5.000 5.000 5.000 5.000
Razão molar mPEG:Sn(Oct)2
1:1 1:1 1:1 4:1 8:1 4:1
Temperatura do banho de óleo (ºC)
147 137 137 137 137 137
EXP
Tempo reacional (min)
120 19 16 50 260 180
�̅�𝒏 teórica corrigida (g/mol)
82.000 78.000 68.900 53.600 28.400 62.000
EXP + RMN
REC (%) 100 95 81 63 63 73
RMN �̅�𝒏 (g/mol) 81.000 65.000 61.000 58.000 27.000 70.000
CPG
�̅�𝒏 (g/mol) 46.900 47.800 44.800 47.200 17.500 26.200
Đ 2,0 1,3 1,2 1,2 1,1 1,3
RMN +
CPG
Cadeias iniciadas por mPEG (%)
79 74 73 81 65 37
Legenda: (A) temperatura do banho de óleo e tempo reacional; (B) quantidade de catalisador; (C) quantidade de iniciador; (D) ativação do catalisador; (TEO) teórico; (EXP) experimental; (REC) rendimento experimental corrigido.
Entre as sínteses do PLA-b-mPEG GP1027 e L0802, foram alterados
concomitantemente os parâmetros temperatura e tempo de reação. Foi observado
que embora as �̅�𝑛 obtidas por CPG fossem próximas para os dois copolímeros,
GP1027 resultou em polímero não uniforme (Đ = 2,0), o que também foi encontrado
na síntese do PLA GP1026. A síntese de GP1027 foi interrompida com 2h, com a
agitação magnética cessada a partir dos 14 min de reação. Na síntese de L0802 a
57
reação foi interrompida em função da alta viscosidade do meio, resultando em um
copolímero com boa dispersidade (Đ = 1,3).
A literatura indica que copolímeros anfifílicos de PLA com PEG 5.000 g/mol
utilizados no preparo de NS e nanocápsulas foram efetivos no prolongamento do
tempo de circulação sanguínea in vivo (GREF et al., 1994; MOSQUEIRA et al.,
2001). Portanto, o PEG (�̅�𝑛 = 5.000 g/mol) resultou em melhor estabilização estérica
frente à adsorção de proteínas em comparação ao PEG (�̅�𝑛 = 2.000 g/mol) na
superfície de NS poliméricas (GREF et al., 2000). Assim, nas sínteses subsequentes
deste trabalho foi utilizado o PEG 5.000 g/mol como macroiniciador.
Embora a condução das sínteses a 147 °C tenha propiciado até então a
obtenção de polímeros de PLA e PLA-b-mPEG com �̅�𝑛 mais elevadas que a 137 °C;
optou-se nas sínteses subsequentes conduzir as sínteses a 137 °C, uma vez que
esta temperatura foi suficiente para fundir o monômero e que quanto maior a
temperatura do meio reacional maiores as possibilidades de reações de
transesterificação na polimerização do D,L-lactídeo (SCHWACH et al., 1994). Optou-
se também nas sínteses subsequentes, interromper as reações quando fosse
observada alta viscosidade no meio reacional com imobilidade do agitador.
Comparando-se as sínteses de L0803 com L0804 foi observado que o
aumento da razão molar entre iniciador e catalisador não resultou em variação da Đ
e da �̅�𝑛 do polímero, resultou somente no prolongamento do tempo de reação. Com
o objetivo de avaliar o efeito da variação da razão molar entre monômero e iniciador,
o copolímero PLA-b-mPEG L0903 foi sintetizado com o dobro de iniciador em
comparação à L0804. Houve um prolongamento do tempo de reação de cerca de
cinco vezes e os resultados obtidos por CPG mostraram que a relação entre as �̅�𝑛
foi de quase três vezes. O copolímero PLA-b-mPEG L0901 foi sintetizado com as
mesmas razões molares de reagentes que L0804. Com a exceção do processo de
ativação do mPEG com o catalisador na síntese de L0901. Na ativação, o PEG e
catalisador são colocados em contato antes da adição do monômero para permitir
uma formação mais eficiente do alcóxido de estanho, o verdadeiro iniciador da ROP
do D,L-lactídeo (HERZBERGER et al., 2015). Foi observado que com este processo
a �̅�𝑛 do copolímero foi menor e a Đ maior do que a do copolímero sem a ativação,
porém era esperado o inverso.
58
Foi encontrada boa correlação entre a �̅�𝑛 teórica corrigida pela conversão em
monômero D,L-lactídeo e a �̅�𝑛 calculada por RMN-1H. Para todos os copolímeros
sintetizados foi observado que a �̅�𝑛 calculada por RMN-1H foi maior que a �̅�𝑛 obtida
por CPG. Os rendimentos experimentais foram altos para todos os copolímeros
também (≥ 63%). A exceção do copolímero L0901 as porcentagens de cadeias
iniciadas por mPEG foram altas para os copolímeros sintetizados (≥ 64%). As
distribuições de massas molares dos copolímeros PLA-b-mPEG sintetizados são
mostradas na Figura 15.
Figura 15: Distribuições de massas molares obtidas por CPG dos copolímeros PLA-b-mPEG em função das alterações de parâmetros: temperatura e tempo de reação, quantidade de catalisador, quantidade de iniciador e ativação do catalisador.
Um perfil largo de distribuição de massa molar foi obtido para o copolímero
sintetizado pelo maior tempo GP1027. Para os demais polímeros as distribuições de
massas molares foram mais estreitas e semelhantes entre si, apresentando perfis de
distribuição bimodais. Na Figura 16 são apresentados os espectros de RMN-1H dos
copolímeros diblocos PLA-b-mPEG L0901 e L0903.
59
Figura 16: Espectro de RMN-1H dos copolímeros PLA-b-mPEG. (A) L0901. (B) L0903.
No espectro de RMN-1H dos copolímeros L0901 e L0903 foram avaliados os
picos localizados nos seguintes deslocamentos químicos: δ = 1.2-1.8 ppm (m, 3 H,
a); δ = 3.3 ppm (s, 3 H, b); δ = 3.4-3.8 ppm (m, 4 H, c) e δ = 4.9-5.5 ppm (m, 1 H, d).
Foram adotados como referência os prótons (b) referentes ao grupo metoxila do
mPEG para a integração dos picos marcados, com valor de integração de (3,000). A
razão de ≅ 1:3 entre os prótons (a) e (d), em ambos os espectros, corrobora para a
confirmação da estrutura do bloco PLA.
I.4.3.3. Caracterização físico-química dos copolímeros PLA-co-AGE e
PLA-co-BGE
Com base nos resultados da influência de alguns parâmetros experimentais
na síntese do PLA e do PLA-b-mPEG, nas �̅�𝑛 e Ð dos produtos formados:
temperatura, momento de encerrar a reação, quantidade de iniciador, de catalisador
60
e associação de catalisadores; foram sintetizados os copolímeros PLA-co-AGE e
PLA-co-BGE. Os resultados das caracterizações físico-químicas por CPG e RMN-1H
obtidos para os copolímeros PLA-co-AGE e PLA-co-BGE sintetizados podem ser
observados na Tabela 8.
Tabela 8: Caracterização dos copolímeros PLA-co-AGE e PLA-co-BGE por CPG e RMN-1H.
GE CAT Código
TEO EXP EXP+ RMN
CPG RMN + CPG
% molar de GE no
meio reacional
TR (min)
REC (%)
�̅�𝒏 (g/mol)
Đ Unidades GE/CAD
% molar de GE no polímero
AG
E Sn
(Oct)
2 L0902 6 52 71 25.600 1,3 0,3 < 1
GP1030 24 99 61 18.500 1,6 2,1 2
GP1031 46 192* 59 6.900 1,5 4,0 8
Sn
(Oct)
2/
DM
AP
L0201 6 152 21 20.700 1,1 1,1 < 1
L1206 24 107* 57 21.300 1,2 2,4 2
L0202 46 260* 86 10.100 1,4 2,5 4
BG
E Sn
(Oct)
2 L1205 6 63 45 24.400 1,2 2,6 2
L0207 24 264* 58 8.000 1,2 3,4 6
L0206 46 267* 99 6.800 1,4 5,6 11
Sn
(Oct)
2/
DM
AP
L0203 6 191* 49 11.800 1,2 1,8 2
L0204 24 270* 69 5.500 1,4 2,2 5
L0205 46 272* 71 4.100 1,4 2,4 8
Legenda: (GE) glicidil éter; (CAT) catalisador; (TEO) teórico; (EXP) experimental; (TR) tempo de reação; (REC) rendimento experimental corrigido; (CAD) cadeia; (*) sínteses interrompidas sem que houvesse término da agitação pelo agitador magnético.
Nas sínteses dos copolímeros PLA-co-AGE foi observado que o aumento da
porcentagem molar de epóxido de 6% para 46% em relação ao D,L-lactídeo resultou
na obtenção de polímeros com menores �̅�𝑛, maiores Đ e maiores inserções dos
comonômeros. Foi observado que a inserção de AGE na cadeia de PLA variou entre
as séries de catalisadores utilizadas. No caso da série sintetizada com DMAP houve
um limite da inserção de AGE por cadeia (2,4-2,5) em relação ao aumento da
porcentagem molar de epóxido de 24% para 46%. Já na série sintetizada sem
DMAP o aumento da inserção do comonômero foi progressivo de 0,3 para 4,0 e foi
61
acompanhado da diminuição da �̅�𝑛 do copolímero e aumento da Đ. Quantidades
maiores de AGE no meio reacional dificultaram a determinação do ponto de
interrupção da síntese, não havendo formação visível de copolímero, ou seja, o meio
reacional não ficou viscoso ao ponto de cessar a agitação do agitador magnético. Os
rendimentos experimentais foram altos à exceção da síntese de L0201 cujo
rendimento foi de 21%. Este copolímero foi precipitado duas vezes em éter,
apresentando um aspecto viscoso que dificultou o seu recolhimento do béquer de
precipitação, o que pode explicar o baixo rendimento encontrado.
Na síntese dos copolímeros PLA-co-BGE foi observado que maiores
porcentagens molares de BGE no meio reacional em relação ao D,L-lactídeo
resultaram na obtenção de polímeros com menores �̅�𝑛, maiores Đ e maiores
inserções dos comonômeros. A inserção de BGE na cadeia de PLA variou entre as
séries de catalisadores utilizadas. No caso da série sintetizada com DMAP também
parece ter havido um limite da inserção de BGE por cadeia (2,2-2,4) em relação ao
aumento da porcentagem molar de epóxido de 24% para 46%. Já na série
sintetizada sem DMAP o aumento da inserção do comonômero foi progressivo de
2,6 para 5,6 e acompanhado da diminuição da �̅�𝑛 do copolímero e aumento da Đ. À
exceção do que foi observado para a síntese de L1205, para as demais sínteses não
foi possível determinar um ponto de interrupção das mesmas, não havendo
formação visível de polímero pela mudança de viscosidade do meio reacional. Os
rendimentos experimentais foram altos a exceção da síntese de L1205 e L0203
cujos rendimentos foram inferiores a 50%.
Na Figura 17 são apresentadas as curvas das porcentagens molares de GE
nos polímeros, das �̅�𝑛 e do número de GE por cadeia em função das porcentagens
molares de GE no meio reacional para os polímeros PLA-co-AGE e PLA-co-BGE
sintetizados com as séries de catalisadores avaliadas.
62
Figura 17: Gráfico da porcentagem molar de glicidil éter (GE) no polímero, �̅�𝑛 e do número de GE por cadeia em função da porcentagem molar de GE no meio reacional variados os tipos de comonômeros (AGE ou BGE) e os sistemas de catalisadores (Sn(Oct)2 ou Sn(Oct)2/DMAP) utilizados nas sínteses.
Para a série sintetizada apenas com Sn(Oct)2 foi observado que a diminuição
da �̅�𝑛do polímero com o aumento da quantidade epóxido no meio reacional, foi
relacionada à maiores porcentagens molares de GE nos polímeros e inserções dos
comonômeros nas cadeias. Para os copolímeros sintetizados com Sn(Oct)2/DMAP,
foi observado que a diminuição da �̅�𝑛 do polímero com o aumento da quantidade
epóxido no meio reacional, favoreceu maiores porcentagens molares de GE nos
polímeros, embora não tenha favorecido um aumento do número de inserções dos
comonômeros nas cadeias. Assim, a utilização do DMAP como co-catalisador com o
Sn(Oct)2 não favoreceu a inserção do epóxido da cadeia. Houve um limite de
número de GE inseridos por cadeia quando foi utilizado DMAP (≈ 2,3), enquanto
para a série catalisada apenas com Sn(Oct)2 o número de GE por cadeia foi
crescente mesmo com a redução da �̅�𝑛 do polímero. Para uma mesma série de
catalisador, a porcentagem molar de benzila inserida nos copolímeros foi maior que
a inserção de alila independente da porcentagem molar inicial de GE no meio
Nú
me
ro
de
GE
po
r c
ad
eia
0
1
2
3
4
5
6
Mn
(g
/mo
l)
0
1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 0 0
% m o la r d e G E n o m e io re a c io n a l
% m
ola
r d
e G
E
no
po
lím
ero
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0
0
2
4
6
8
1 0
1 2
A G E : S n (O c t)2
A G E : S n (O c t)2 /D M A P
B G E : S n (O c t)2
B G E : S n (O c t)2 /D M A P
63
reacional. As distribuições de massas molares dos copolímeros sintetizados com
AGE e BGE são mostradas na Figura 18.
Figura 18: Distribuições de massas molares obtidas por CPG dos copolímeros sintetizados variando-se os catalisadores. (A) PLA-co-AGE. (B) PLA-co-BGE.
Para os copolímeros PLA-co-AGE (Figura 18A) as distribuições de massas
molares mostram que a série de copolímeros sintetizados somente com Sn(Oct)2
resultaram em picos de distribuição bimodal, enquanto a série sintetizada com
DMAP e Sn(Oct)2 apresentou perfil monomodal. Para os copolímeros PLA-co-BGE
(Figura 18B) foram observadas para ambas as séries de catalisadores distribuições
de massas molares com aspectos bimodais, embora o caráter bimodal tenha sido
mais pronunciado para os copolímeros sintetizados sem DMAP. Os aspectos físicos
dos copolímeros sintetizados com DMAP e Sn(Oct)2 são apresentados na Figura 19.
A
B
64
Para a série PLA-co-AGE (Figura 19A) o copolímero L0202 apresentou
coloração marcante amarela, sendo este copolímero sintetizado com a maior
proporção de AGE e DMAP no meio reacional em relação ao D,L-lactídeo. Para a
série PLA-co-BGE (Figura 19B) os copolímeros apresentaram coloração amarela
gradativa, assim como nas sínteses com AGE, esta coloração foi mais marcante
para o copolímero sintetizado com a maior proporção de GE e DMAP no meio
reacional em relação ao D,L-lactídeo.
Figura 19: Aspecto físico dos copolímeros sintetizados com DMAP/Sn(Oct)2. (LAC) D,L-lactídeo. (A) PLA-co-AGE. (B) PLA-co-BGE.
Na Figura 20 é apresentado o espectro de RMN-1H do copolímero PLA-co-
AGE L1206. Neste espectro foram avaliados os seguintes deslocamentos químicos:
δ = 1.3-1.7 ppm (s, 3 H, a); δ = 4.9-5.5 ppm (s, 3 H, c + d); δ = 5.8-5.9 ppm (m, 1 H,
e) e δ = 3.9 ppm (d, 2 H, b). Foi usado como referência o próton (e) para a
integração dos picos marcados, com valor de integração de (1,000). A razão de ≅
1:3 entre os valores de integração dos prótons (a) e (c) corrobora para a
confirmação da estrutura do bloco PLA, sendo que da integração dos prótons (c + d)
foram subtraídos dois hidrogênios relativos aos prótons (d).
65
Figura 20: Espectro de RMN-1H do PLA-co-AGE L1206.
Na Figura 21 é apresentado o espectro de RMN-1H do copolímero PLA-co-
BGE L1205.
Figura 21: Espectro de RMN-1H do PLA-co-BGE L1205.
66
Neste espectro foram avaliados os seguintes deslocamentos químicos: δ =
1.1-1.9 ppm (m, 3 H, a); δ = 4.9-5.5 ppm (s, 1 H, b); δ = 4.0-4.4 ppm (m, 2 H, c) e δ =
7.2-7.4 ppm (m, 5 H, d). Foi utilizado como referência o próton (d) para a integração
dos picos marcados, com valor de integração de (5,000). A razão de ≈ 1:3 entre os
valores de integração dos prótons (a) e (b) corrobora para a confirmação da
estrutura do bloco PLA.
67
I.5. DISCUSSÃO
O D,L-lactídeo comercial pode apresentar impurezas tais como a água, ácido
láctico e oligômeros. No espectro de RMN-1H foram observados os sinais
correspondentes ao dímero do ácido lático (lactato de lactila), produto de hidrólise do
lactídeo, como maior contaminante. Este composto e a água, mesmo que em
quantidades residuais, podem interferir com o curso das reações de polimerização,
resultando na diminuição da �̅�𝑛, juntamente com o alargamento da distribuição da
massa molar do polímero formado. Assim, a purificação, secagem e manutenção do
lactídeo em atmosfera inerte são etapas críticas a serem realizadas antes da
polimerização (ZHANG et al., 1992; GUPTA; KUMAR, 2007; KAIHARA et al., 2007).
O método de purificação escolhido para o monômero foi a recristalização com
tolueno, por ser o método mais simples e eficiente descrito na literatura para esta
finalidade. Foi obtido monômero com pureza de 86% e não foram encontrados picos
residuais de tolueno, único solvente utilizado na recristalização. No rótulo do produto
é descrito que a faixa de fusão do D,L-lactídeo é entre 116-119 °C, na literatura é
proposta esta faixa (SÖDERGÅRD; INKINEN, 2011) e a faixa entre (124-126 °C)
(TSUJI, 2002). Assim o resultado de ponto de fusão encontrado para o D,L-lactídeo
após a recristalização está compreendido na segunda faixa citada. O aumento e
estreitamento da faixa de fusão para o lactídeo recristalizado e o espectro de RMN-
1H indicam que o processo de recristalização minimizou as impurezas presentes no
monômero comercial.
Em relação às purificações dos polímeros, a otimização dos processos
empregados propiciou a evaporação mais eficiente dos solventes residuais e melhor
eliminação do monômero que não reagiu. Em trabalho de HYON, JAMSHIDI e
IKADA (1998) foi mostrado que a existência de monômero residual aumentou a
degradação hidrolítica do PLA. Assim, são encontrados trabalhos na literatura nos
quais o processo de purificação do PLA foi repetido três vezes, com secagem do
polímero em alto vácuo e com aplicação de temperatura a 40 °C por até por uma
semana (SCHWACH et al., 2002). Todavia, o processo de purificação otimizado
neste estudo foi considerado satisfatório para a obtenção de polímeros mais puros
como indicado pelos espectros de RMN-1H.
Com relação às sínteses do homopolímero PLA e do copolímero PLA-b-
mPEG, foram estudados os efeitos da temperatura e do tempo reacional na �̅�𝑛 e Đ
68
dos polímeros obtidos. O incremento da temperatura de 137 para 147 °C aumentou
a cinética de polimerização, porém acréscimos de temperatura favorecem a
ocorrência de reações de transesterificações e consequentemente a formação de
polímeros com maiores Đ, como observado neste estudo e em trabalhos anteriores
(SCHWACH et al., 1994; PLADIS et al., 2014). A interrupção das sínteses com o
incremento da viscosidade do meio reacional foi necessária, sendo que sínteses por
tempos mais longos até alcançar conversões próximas a 100% levam à obtenção de
PLA com maiores �̅�𝑛; porém favorecem a formação de produtos de
transesterificações e aumento da Đ, tal como foi observado neste estudo e descrito
por SCHWACH e colaboradores (1997).
Foi avaliado também na síntese do PLA o uso de apenas DMAP como
catalisador. Nesta condição foi obtido um polímero com �̅�𝑛 semelhante às
encontradas no trabalho de NEDERBERG e colaboradores (2001). Os autores
encontraram uma �̅�𝑛 máxima de 17.000 g/mol quando foi utilizado excesso de
DMAP em relação ao iniciador BzOH (2DMAP:1BzOH) porém as Đ encontradas
foram maiores. O tempo elevado de reação (960 min) pode ter favorecido até
mesmo a degradação da cadeia polimérica e aumento de Đ. Assim, a utilização de
DMAP em excesso em relação ao iniciador poderia ter formado polímero em maior
proporção.
Na síntese do PLA-b-mPEG, foram estudados os efeitos da variação da
quantidade de iniciador e de catalisador na �̅�𝑛 e Đ dos copolímeros obtidos.
Reduzida à quarta parte a concentração de catalisador, mantendo as concentrações
de monômero e iniciador constantes, foram obtidos polímeros com �̅�𝑛 e Đ
semelhantes; foi alterado apenas o tempo de reação, praticamente três vezes mais
lento, uma vez que havia mais cadeias para serem iniciadas para uma mesma
quantidade de catalisador. Os resultados mostraram que duplicada a quantidade de
iniciador foi reduzida à metade a �̅�𝑛 dos polímeros porque foi aumentado o número
de cadeias em crescimento para uma mesma quantidade de monômero, e como o
catalisador foi mantido constante as reações foram mais lentas. Estes resultados
eram esperados, pois estão de acordo com o mecanismo de polimerização via ROP,
onde cada molécula de iniciador inicia uma cadeia e o catalisador acopla com o final
da cadeia permitindo a inserção de lactídeo. Assim a �̅�𝑛 das cadeias é pré-
determinada pela razão entre monômero e iniciador e aumenta proporcionalmente à
69
conversão do monômero D,L-lactídeo (KRICHELDORF; KREISER-SAUNDERS;
STRICKER, 2000).
Foi buscado entender melhor o efeito destas variáveis nas condições
experimentais disponíveis e utilizadas na ROP do D,L-lactídeo antes de sintetizar os
copolímeros com AGE e BGE visando a obtenção de polímeros modificados com
melhores características. Uma vez que o rendimento das reações e as
transesterificações são afetados, em ordem, pela temperatura de polimerização >
razão monômero/catalisador > tempo de polimerização > tempo de secagem do
monômero (SCHWACH et al., 1994); o estudo de algumas destas variáveis foi
importante.
Neste estudo, muitos polímeros sintetizados quando analisados por CPG
apresentaram picos de distribuição de massas molares bimodais, o que não era
esperado. Em trabalho de PENCZEK, DUDA e SZYMANSKI (1998) envolvendo ciclo
ésteres foi observado o aspecto bimodal de distribuição de massa molar, sendo este
aspecto explicado pelo fato de existirem duas populações coexistentes de cadeias
poliméricas com distribuições de massas molares que são suficientemente diferentes
para distinguir-se no cromatograma.
Nem todos os polímeros sintetizados apresentaram perfis bimodais de
distribuição. Nestes casos, o perfil monomodal foi acompanhado de elevada Đ dos
polímeros (1,9-2,0) e de maiores tempos de reação. Alguns trabalhos explicam que
o caráter bimodal das distribuições de massas molares é ocultado com tempos
maiores de reação e com rendimentos experimentais mais altos, observando-se
picos mais largos e achatados; embora as �̅�𝑛 destes polímeros sejam mais altas,
suas Đ também o são (BARAN et al., 1997; PENCZEK; DUDA; SZYMANSKI, 1998).
A presença de impurezas residuais, como o lactato de lactila e água oriunda
da umidade no meio reacional podem ter influenciado no aparecimento da
bimodalidade nos cromatogramas por CPG. Ambas as moléculas possuem
grupamentos hidroxilas suscetíveis de interagir com o Sn do catalisador e
consequentemente de agirem como iniciadores de cadeias poliméricas. Nos
trabalhos de KARIDI e colaboradores (2015) e KORHONEN, HELMINEN e
SEPPÄLÄ (2001), os autores observaram bimodalidade e concluíram que algumas
cadeias foram iniciadas por grupos hidroxilas provenientes de vestígios de água
presentes no meio reacional.
70
A ROP ideal do lactídeo deve ocorrer em uma câmara purgada em atmosfera
inerte mantendo a seco catalisador, monômeros, iniciador e o meio reacional, e
assim evitando umidade, pois traços de água no meio poderão provocar reações
secundárias como: competição com o iniciador formando um copolímero de baixa
massa molar e/ou decomposição do catalisador a ácido, inativando-o. Durante a
polimerização, a acidificação do meio na presença de umidade, pode catalisar a
hidrolise do bloco PLA em formação (LI; MCCARTHY, 1999). A água deve ser
removida do lactídeo e do catalisador antes da polimerização, porém traços de água
são difíceis de remover (GARLOTTA, 2002; HYON; JAMSHIDI; IKADA, 1997).
Além do aspecto bimodal, a presença de água residual no meio reacional e do
lactato de lactila poderia também explicar porque o valor das �̅�𝑛 obtidas em todas as
sínteses foram abaixo do esperado para a polimerização do D,L-lactídeo por
abertura de anel pelo mecanismo de coordenação-inserção. Este valor depende da
razão molar entre monômero e iniciador, podendo ser limitado pela ocorrência de
reações secundárias. Foram descritos na literatura valores de �̅�𝑛 na faixa de 70.000
a 540.000 g/mol para o sistema Sn(Oct)2 na temperatura entre 130-180 °C em
massa (DEGÉE et al., 1999; SCHWACH et al., 2002). Os rendimentos experimentais
corrigidos a partir da massa de polímero obtida foram elevados para a maioria das
sínteses, não obstante, a obtenção por CPG de �̅�𝑛 menores do que o esperado a
partir da razão inicial entre iniciador e D,L-lactídeo sugerem que nem todas as
cadeias foram iniciadas pelo iniciador de escolha BzOH e PEG.
ZHANG e colaboradores (1994) estudaram o efeito do grupamento hidroxila
sobre a polimerização do lactídeo na presença de Sn(Oct)2. O grupo contendo a
hidroxila que permite a formação do alcóxido de estanho, verdadeiro iniciador da
ROP, poderia afetar a polimerização por meio de reações que levam à formação de
produtos de transesterificações. Por esta razão, foi usado o catalisador em pequeno
excesso em relação ao iniciador para garantir que não sobrassem espécies
contendo hidroxila durante a polimerização, não obstante, como nem todas as
cadeias foram iniciadas pelo BzOH ou mPEG, houve espécies livres para formação
de produtos de transesterificações.
A ativação do mPEG foi realizada previamente à síntese do copolímero
L0901, colocando o mPEG em contato com o catalisador no rotavapor durante a
remoção azeotrópica da água. Pelo espectro de RMN-1H do copolímero foi possível
quantificar a proporção de mPEG no copolímero e comparar com a quantidade
71
inicialmente introduzida no meio reacional. Foi verificado que grande parte do mPEG
foi removido no processo de purificação, pois apenas 37% das cadeias foram
iniciadas pelo mPEG neste caso, o que indicou que mais da metade do iniciador
mPEG adicionado ao meio reacional não participou da formação deste copolímero.
Este processo resultou na obtenção de um polímero com baixa �̅�𝑛 e alta Đ quando
comparado ao polímero sintetizado sem ativação. Era esperado que com menos
cadeias iniciadas o polímero tivesse �̅�𝑛 mais alta. Porém os resultados obtidos
indicaram a possível presença de água em quantidade maior. Consequentemente,
nas sínteses subsequentes não foi aplicado este processo, pois ele não favoreceu a
obtenção de maior �̅�𝑛 do copolímero e nem garantiu a participações de todo mPEG
na formação das cadeias.
Nas sínteses do dibloco PLA-b-mPEG foi verificado por RMN-1H que a
proporção de mPEG no copolímero correspondeu a proporção inicial no meio
reacional corrigida pela conversão em monômero D,L-lactídeo, baseando-se na
hipótese de que cada cadeia de mPEG iniciaria uma cadeia de PLA e levaria à
formação de copolímero em bloco PLA-b-mPEG. Assim, foi avaliada a ocorrência de
reações secundárias levando à formação de homopolímero PLA. Estas podem
decorrer da iniciação de cadeias de PLA por outras moléculas que o mPEG, por
exemplo contaminantes como água e lactato de lactila, ou da cisão de cadeias,
como no caso de transesterificações entre cadeia e monômero, entre outros. As �̅�𝑛
obtidas por RMN-1H foram maiores que as obtidas por CPG. Por CPG a
bimodalidade indicou duas espécies de cadeias poliméricas crescendo
concomitantemente, como no caso das amostras de homopolímero PLA.
Comparando as �̅�𝑛 calculadas a partir do espectro de RMN-1H e determinadas por
CPG, foram calculadas porcentagens de cadeias iniciadas pelo mPEG entre 37% e
81%. Estes resultados fortalecem a hipótese que nem todas as cadeias no meio
reacional foram iniciadas por este iniciador. Assim, possivelmente, outras espécies
químicas presentes no meio reacional competiram pela iniciação das cadeias. Esta
discrepância entre �̅�𝑛 obtida por RMN-1H e por CPG também foram encontradas em
outros estudos (STEFANI; COUDANE; VERT, 2006; LI et al., 2009).
Em relação à copolimerização do D,L-lactídeo com epóxidos, foi observado
que os GE inseriram nas cadeias de PLA, como verificado pela presença dos sinais
relativos aos prótons dos grupamentos alila e benzila nos espectros de RMN-1H dos
72
copolímeros PLA-co-AGE e PLA-co-BGE sintetizados. A inserção de benzila às
cadeias poliméricas foi mais favorável que a inserção de alila independente da
porcentagem molar inicial GE. Esse resultado era esperado, pois como a ROP do
D,L-lactídeo é exotérmica, as polimerizações ocorreram acima da temperatura em
que foram conduzidas as sínteses (137 °C); e uma vez que a temperatura de
ebulição do AGE (154 °C) é menor que a temperatura de ebulição do BGE (171 °C),
o comonômero AGE estaria menos disponível para ser inserido nas cadeias. Outra
hipótese para maior inserção de BGE seria a de que o Sn do catalisador interagiria
com os elétrons π aromáticos deste comonômero, levando a sua aproximação com
o catalisador no meio reacional e aumentando a probabilidade de inserção em
detrimento ao AGE que possuí menos densidade eletrônica no grupo alceno. Esta
hipótese é baseada na interação entre metais de coordenação e elétrons π e é
descrita na literatura (MEISNER et al., 2012; HAZARI et al., 2016).
A maioria das copolimerizações com os GE foram encerradas sem aumento
de viscosidade aparente do meio reacional. Uma vez as conversões experimentais
foram altas para a maioria das sínteses com epóxidos, há a possibilidade que haja
uma competição entre os comonômeros AGE e BGE com o D,L-lactídeo na etapa de
propagação das cadeias de PLA, o que tornaria o crescimento destas mais lentos e
a na obtenção de maiores tempos de reação.
Em geral, maiores inserções de GE nos copolímeros foram acompanhadas da
diminuição de sua �̅�𝑛 e aumento da Đ. Algumas hipóteses foram sugeridas para
explicar este fato: uma vez inserido o GE, a reatividade do final de cadeia para
inserção da próxima unidade de lactídeo pode ter diminuído, levando a tempos de
ração mais longos e maiores Đ, o que foi observado neste estudo. A diminuição da
�̅�𝑛 com aumento da quantidade inicial de GE sugere cisão de cadeias. Neste caso,
a determinação da estrutura química dos finais de cadeias, poderia ajudar na
identificação de reações secundárias como reações de eliminação ou reações de
transferências de grupo intra e/ou intermoleculares.
Com o aumento da porcentagem molar inicial de GE de 6% para 46%, foram
obtidas maiores inserções de GE nos copolímeros, mas este aumento foi limitado há
quatro e seis unidades por cadeia, respectivamente, quando a porcentagem molar
de GE no meio reacional foi de 46%. Isto indica baixa taxa de copolimerização entre
lactídeo e GE, como já observado em outros trabalhos (NADEAU et al., 2005;
TESKE; VOIGT; SHASTRI, 2014). Estes resultados eram esperados, uma vez que o
73
Sn(Oct)2 é um bom catalisador do D,L-lactídeo e permite a coordenação do Sn pelos
grupamentos carboxilas, o que não acontece no caso de epóxidos. Assim, foi
introduzido DMAP como co-catalisador numa tentativa de aumentar a reatividade
dos GE. Este procedimento foi executado no contexto das copolimerizações entre
anidridos de acido carboxílicos e epóxidos por abertura de anel (NEJAD et al.,
2013); e na observação que o DMAP favorece a homopolimerização de epóxidos
(DELL'ERBA; WILLIAMS, 2006; BROCAS et al., 2013) e do D,L-lactídeo via ROP
(NEDERBERG et al., 2001) . No entanto, neste estudo não foi observada influência
deste catalisador na inserção dos GE nas cadeias poliméricas; ao contrário, houve
um limite para a inserção dos comonômeros com o DMAP, acompanhado de
diminuição da �̅�𝑛 e aumento da Đ dos polímeros.
A influência do catalisador também precisa ser questionada na síntese do
bloco PLA, pois a extensão das reações de transesterificação depende fortemente
do catalisador utilizado. Com a utilização de Sn(Oct)2, ocorrem reações secundárias
desde o início da polimerização do D,L-lactídeo (KRICHELDORF; KREISER-
SAUNDERS; STRICKER, 2000). Neste contexto, embora a utilização do DMAP não
tenha propiciado uma maior incorporação dos epóxidos ao longo das cadeias, os
perfis de distribuição de massas molares obtidos quando este catalisador foi usado
concomitantemente com o Sn(Oct)2 foram mais estreitos.
No RMN-1H não aparecem sinais relativos ao DMAP, ou seja, é pouco
provável que a cor amarelada observada para os copolímeros contendo GE seja
devida à presença de DMAP residual. O significado da cor observada pode ser
proveniente de elétrons π conjugados, o que pode sugerir a presença de
insaturações na cadeia polimérica. Por outro lado, mesmo em quantidade muito
baixa, uma impureza ou uma imperfeição na cadeia polimérica pode gerar uma cor
intensa. Seriam necessárias análises de espectrometria de massa para estudos
mais conclusivos sobre impurezas formadas na presença deste catalisador.
Este estudo permitiu avaliar o processo de copolimerização do lactídeo com
GE como estratégia sintética para a inserção de grupamentos funcionais na cadeia
de PLA. O processo de inserção de GE durante a etapa de propagação da cadeia
polimérica permitiu a inserção de até seis unidades de GE por cadeia no polímero;
porém este processo foi limitado em relação à �̅�𝑛 e inserção de epóxidos. Assim,
quando foram obtidas melhores inserções dos GE, as �̅�𝑛 foram mais baixas.
74
Consiste como alternativa sintética para introdução de grupamentos
funcionais em cadeias poliméricas o uso de um iniciador e/ou de um agente de
terminação de cadeia funcionalizados, podendo-se obter até duas inserções na
cadeia polimérica (WOLF; FRIEDEMANN; FREY, 2009). Alternativa mais eficiente
para inserir ligantes em cadeias poliméricas é a copolimerização do lactídeo com o
seu comonômero funcionalizado. Desse modo, a taxa de copolimerização entre as
espécies reacionais é alta (LEEMHUIS et al., 2006; NOGA et al., 2008). Porém esta
abordagem é limitada devido à necessidade de sintetizar o comonômero
funcionalizado, tornando o processo laborioso e caro.
Assim, a abordagem utilizada para inserir ligantes em cadeia de PLA nesse
estudo mesmo que limitada à (4) AGE e (6) BGE por cadeia, pode ser uma boa
estratégia para a obtenção de polímeros funcionalizados. Principalmente para a
ligação de marcador fluorescente ou de ligante biológico, onde um ligante por cadeia
já é interessante. A inserção de até seis moléculas por cadeia também é possível,
quando se leva em consideração a obtenção de polímeros com �̅�𝑛 mais baixas (<
10.000 g/mol) e a formação de micelas.
As avaliações individuais e combinadas dos resultados de caracterização por
CPG e RMN-1H permitiram selecionar dentre os polímeros sintetizados aqueles com
melhores perfis para o preparo de NS. Com base nos resultados de CPG foram
selecionados polímeros com �̅�𝑛 semelhantes (≅ 23.000 g/mol) e com menores Đ
(1,1-1,3). As análises dos espectros de RMN-1H propiciaram a escolha de polímeros
com inserções de AGE e BGE por cadeia próximas (2,2 e 2,4, respectivamente) e
com menos traços de impurezas (monômeros e solventes residuais).
Assim, os polímeros escolhidos foram: PLA L1202, PLA-b-mPEG L0903 e
L0901, PLA-co-AGE L1206 e PLA-co-BGE L1205. No Capítulo II estes polímeros
foram denominados: PLA26K; PLA12K-b-mPEG5k; PLA21K-b-mPEG5k; PLA21K-co-AGE2,4
e PLA24K-co-BGE2,6 respectivamente, em função das suas massas molares,
composições químicas e do número de GE inseridos por cadeia.
75
I.6. CONCLUSÃO PARCIAL
A avaliação da influência de certas variáveis na ROP do D,L-lactídeo foram
úteis na otimização experimental da síntese de copolímeros com alila e benzila.
Foram obtidos copolímeros com inserção máxima de (4) AGE e (6) BGE por cadeia,
respectivamente. Foi constada uma discrepância entre a composição inicial da
mistura reacional e composição química dos polímeros obtidos em relação à
iniciação das cadeias. Houve redução da �̅�𝑛 com a presença de quantidades
maiores de epóxidos no meio reacional, embora maiores inserções dos
comonômeros tenham sido obtidas. O uso de DMAP como co-catalisador não foi
capaz de melhorar os rendimentos das inserções de GE. Além disso, as �̅�𝑛 obtidas
foram baixas em relação ao que foi objetivado neste estudo para estes copolímeros
(�̅�𝑛 ≥ 45.000 g/mol). Nesse estudo foi possível observar, nas condições de síntese
avaliadas, que embora a reatividade dos comonômeros epóxidos com o D,L-lactídeo
seja baixa; essa é uma estratégia útil para a inserção de um ou poucos ligantes na
cadeia de PLA.
76
CAPÍTULO II
Nanoesferas: preparo, caracterização, estudo de
encapsulação do benznidazol e avaliação de
citotoxicidade
77
II-1. INTRODUÇÃO
Existem várias técnicas úteis para o preparo de nanoesferas (NS) poliméricas
biodegradáveis (RAO; GECKELER, 2011). O método de precipitação de polímero
pré-formado seguido do deslocamento do solvente, também denominado de
nanoprecipitação (FESSI et al., 1989); se destaca por ser uma técnica simples,
rápida, de baixo custo, de fácil transposição de escala e bastante reprodutível
(VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009). Na técnica de nanoprecipitação descrita
originalmente por FESSI e colaboradores (1989), basicamente, uma solução de um
solvente orgânico miscível com a água (geralmente acetona ou etanol), contendo o
fármaco e o polímero dissolvidos; é vertida sobre um não solvente, geralmente água
sob agitação moderada e constante. Um polímero anfifílico tal como o PLA-b-mPEG
pode ser adicionado na fase orgânica (GREF et al., 2000).
A rápida difusão da fase orgânica na fase aquosa gera uma turbulência na
interface entre as fases. Assim, o fármaco e o polímero são precipitados e se
aglomeram, formando instantaneamente uma dispersão coloidal de NS estabilizadas
pelo polímero anfifílico que se auto-organiza com a parte hidrofóbica formando a
matriz interna (core interno) da NP e com direcionamento das cadeias de PEG para
a fase aquosa (corona externa) (GREF et al., 2000). A mistura de solventes é
evaporada à pressão reduzida para remoção do solvente orgânico e da água até o
volume cuja concentração de NS e fármaco sejam de interesse (Figura 22) (FESSI
et al., 1989; MORA-HUERTAS, 2010).
Para a administração segura e eficaz de nanopartículas poliméricas (NP),
particularmente por vias parenterais, é necessário o conhecimento de suas
características físico-químicas, as quais influenciam diretamente nas suas
propriedades farmacocinéticas (MOGHIMI; HUNTER; ANDRESEN, 2012). Estas
características são importantes parâmetros na avaliação do método de preparo, na
predição da estabilidade das NP em meio biológico e no entendimento da
associação fármaco/vetor (WU; ZHANG; WATANABE, 2011). Assim, a determinação
do tamanho médio e sua dispersão na população de partículas, a determinação do
potencial zeta (ζ), bem como as características morfológicas são amplamente
investigadas por diferentes técnicas complementares.
78
Figura 22: Ilustração esquemática do preparo de nanoesferas pelo método de nanoprecipitação. Os polímeros e o fármaco são solubilizados na fase orgânica e esta é vertida sobre a fase aquosa. A rápida difusão do solvente orgânico no meio aquoso propicia a formação de nanoesferas após completa evaporação dos solventes. Adaptado de MORA-HUERTAS (2010).
Existem várias técnicas para determinação dos parâmetros supracitados,
cada uma apresentando vantagens e limitações. A espectroscopia de correlação de
fótons (ECF) é uma técnica não destrutiva para determinar a dispersão e o tamanho
das partículas com tamanho menor que 1 µm em uma formulação (BROWN, 1996).
A ECF se baseia na determinação das variações, em função do tempo, da
intensidade de luz espalhada pelas partículas em um dado ângulo, quando
iluminadas por um feixe de luz laser. A técnica fornece informações diretas sobre o
movimento translacional das partículas no meio e permite o cálculo do raio
hidrodinâmico (XU, 2008; LIU et al., 2015).
O potencial ζ é determinado a partir da técnica de microeletroforese
associada à anemometria do laser Doppler, através da aplicação de um campo
elétrico a uma dispersão coloidal. Cada partícula, bem como os íons mais
fortemente ligados à mesma, se move como uma unidade e o potencial no plano de
cisalhamento entre esta unidade e o meio circundante é denominado potencial ζ. O
potencial ζ reflete indiretamente o potencial de superfície das partículas, o qual é
influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da
dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de
espécies iônicas presentes no meio aquoso de dispersão (LEGRAND et al., 1999).
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é uma técnica que permite a
obtenção de imagens de alta resolução em escala nanométrica, com a vantagem da
79
relativa facilidade de preparação da amostra (GOLDSTEIN et al., 1992). O
revestimento desta por um filme metálico condutor é necessário para aumentar a
emissão de elétrons secundários, o que possibilita a aquisição de imagens das NP
com maior qualidade (REIMER, 1998).
Os diferentes polímeros e suas diferentes características de
hidrofilicidade/hidrofobia podem ser selecionados para o design de nanopartículas
com alta capacidade de carreamento de bioativos, particularmente fármacos de
natureza hidrofóbica (KAMALYA et al., 2012). Diante disso, novos polímeros podem
ser concebidos para uma melhor interação entre a matriz e o material carreado.
Fármacos modelos que exibem grandes dificuldades de encapsulamento devido as
suas energias de interação intermoleculares são um grande desafio neste campo.
Neste trabalho foi utilizado o benznidazol (BNZ) como modelo deste tipo de
fármaco para o estudo da interação entre os copolímeros modificados com AGE e
BGE. O estudo envolvendo a quantificação do BNZ encapsulado e/ou associados às
NS preparadas é importante para a determinação da eficiência de carreamento
pelas NS desenvolvidas. A observação experimental da influência dos grupamentos
alila e benzila inseridos ao longo do bloco PLA na encapsulação do BNZ foi também
foco do estudo neste capítulo.
A avaliação da citotoxicidade de NPs é a fase inicial do teste de
biocompatibilidade de um material com potencial para aplicações farmacêuticas, o
qual é avaliado quanto à sua interação com um tecido biológico in vitro. Assim,
alterações no crescimento e na permeabilidade da membrana celular, bem como
citólise frente às diferentes substâncias podem ser verificadas (SCHMALZ, 1994;
FRESHNEY, 2010). Um dos métodos de avaliação de citotoxicidade é o ensaio
colorimétrico com o sal brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazólio
(MTT), sendo o ensaio desenvolvido originalmente por MOSMANN (1983). O método
é baseado na avaliação quantitativa de células viáveis, pois as células
metabolicamente saudáveis reduzem o MTT por meio da enzima succinil
desidrogenase em cristais de formazan de coloração violácea (FRESHNEY, 2010).
Diante da importância de todas as técnicas abordadas tanto para o preparo
quanto para a caracterização físico-química de NP. Neste capítulo são apresentados
e discutidos os resultados da caracterização físico-química, da análise por MEV, do
estudo de encapsulação do BNZ, bem como da avaliação de citotoxicidade das NS
preparadas a partir dos polímeros sintetizados e selecionados no capítulo 1.
80
II-2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Investigar a estabilização de nanoesferas de PLA com o uso de copolímeros
PLA-b-mPEG pelo método de nanoprecipitação;
Avaliar a influência dos glicidil éteres inseridos nas cadeias poliméricas na
encapsulação do benznidazol, nas características físico-químicas e
morfológicas das nanoesferas;
Avaliar a influencia dos glicidil éteres inseridos nas cadeias poliméricas
quando na forma de nanoesferas na citotoxicidade de células Vero e J774A.1.
81
II-3. MATERIAIS E MÉTODOS
II-3.1. Materiais
Os reagentes, tipos celulares e insumos utilizados nesta parte do trabalho
estão apresentados na Tabela 9.
Tabela 9: Materiais utilizados com seus respectivos fornecedores comerciais.
Material Fornecedor
comercial
Acetona (UV/CLAE) Vetec®
Benznidazol (BNZ) Lote: 0442380 Roche®
Acetonitrila (UV/CLAE) Baker®
Raspador de células “cell scraper” Biofil®
Placas de cultivo de 96 poços Sarstedt®
Tampão fosfato salino (PBS) com Ca2+ e Mg2+ Lonza®
Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazólio (MTT) Sigma-Aldrich®
Dimetilsulfóxido (DMSO) Tedia®
Meio “Dulbecco's Modified Eagle's” (DEMEM) Lonza®
Soro fetal de bovino (SFB) Cultilab®
Antibiótico penicilina/estreptomicina em tampão citrato Sigma-Aldrich®
Meio “Roswell Park Memorial Institute” (RPMI) Lonza®
Células Vero ATCC®
Células J774A.1 BCRJ®
Filtro de seringa de 0,45 μm Millipore®
Filtro de seringa de 0,8 μm Millipore®
Dispositivo Amicon de 100 kD Millipore®
Membrana PTFE (47 mm de diâmetro e poro de 0,45 μm) Millipore®
Sistema purificador de água Milli-Q (Symplicity/System 185) Millipore®
Legenda: (ATCC) American Type Culture Collection; (BCRJ) Banco de Células do Rio de Janeiro; (PTFE) Politetrafluoretileno.
II-3.2. Preparo das nanoesferas
Os polímeros em bloco anfifílicos PLA21K-b-mPEG5k e o PLA12K-b-mPEG5k foram
testados quanto à capacidade de atuarem como estabilizantes estéricos ou
82
surfactantes não-iônicos das partículas. Assim, foram utilizadas blendas destes
copolímeros com o homopolímero de PLA26K em diferentes proporções conforme
apresentado na Tabela 10. Para o preparo das NS, em um béquer de 10 mL foram
adicionados 4 mL de acetona, o PLA26K e os copolímeros em bloco PLA-b-mPEG
nas quantidades descritas na Tabela 10; previamente pesados em balança analítica
(Shimadzu® AUY220). Os constituintes foram então mantidos sob agitação
magnética a 500 RPM em agitador magnético (Corning® PC-220) até a completa
solubilização.
Na sequência, a solução (fase orgânica) foi vertida em 8 mL de água ultrapura
contida em um béquer de 20 mL, sob agitação magnética a 500 RPM (Corning® PC-
220). A mistura foi então mantida sob agitação por mais 10 min para permitir a
formação das NS. Posteriormente, o solvente foi evaporado à pressão reduzida de
20 mbar, a temperatura de 40 ºC em rotavapor (Büchi® R3), até o volume final de 2
mL, obtendo-se dispersões com concentrações poliméricas finais variadas. As
formulações foram classificadas como estáveis (sem precipitado) e instáveis (com
presença de precipitado).
Tabela 10: Relação dos constituintes PLA-b-mPEG, solventes e suas quantidades utilizadas no preparo de nanoesferas de PLA26K.
Fase orgânica FA
Blendas poliméricas AC
(mL) H2O (mL)
VF (mL)
CF (mg/mL) PLA-b-mPEG (mg)
PLA26K
(mg) % mPEG
(p/p)
PLA21K-b-mPEG5k
4 20 3
4 8 2
12
7 20 5 13,5
10,5 20 7 15,3
10 10 10
10 15,8 4,2 15
PLA12K-b-mPEG5k 10 10 14
Legenda: (mPEG) metoxi-polietileno glicol; (AC) acetona; (FA) fase aquosa; (VF) volume final; (CF) concentração polimérica final.
Selecionado o PLA12K-b-mPEG5k como polímero anfifílico de escolha para as
formulações subsequentes; os polímeros PLA26K, PLA21K-co-AGE2,4 e PLA24K-co-
BGE2,6 foram utilizados na formação de NS para os estudos de encapsulação do
BNZ. Para a produção de formulações homogêneas quanto ao teor de BNZ e por
83
serem requeridas massas pequenas do fármaco, foi utilizada uma solução estoque
de BNZ em acetona na concentração de 1 mg/mL. Assim, foram aliquotados os
volumes correspondentes às massas desejadas com o objetivo de produzir
formulações com concentrações finais teóricas de 0,10; 0,30 ou 0,65 mg/mL de
BNZ. Os constituintes das formulações preparadas e suas quantidades utilizadas
são apresentados na Tabela 11.
Tabela 11: Relação dos constituintes e suas quantidades utilizadas ao preparo das diferentes formulações.
CT de BNZ (mg/mL)
FA Fase orgânica VF
(mL) CF
(mg/mL) H2O (mL)
S.E. BNZ (mL)
AC (mL)
Polímeros
0,10
4,0
0,2 1,8 10 mg de (PLA, PLA-co-
AGE ou PLA-co-BGE) +
10 mg PLA12K-b-mPEG5k
2 10 0,30 0,6 1,4
0,65 1,3 0,7
Legenda: (CT) Concentração teórica; (FA) Fase aquosa; (S.E.) Solução estoque; (AC) Acetona; (VF) Volume final da dispersão de nanoesfera; (CF) Concentração polimérica final.
De forma geral, para o preparo das NS contendo BNZ, em um béquer de 5
mL foram adicionados 10 mg de polímero (PLA, PLA-co-AGE ou PLA-co-BGE) e 10
mg do copolímero dibloco PLA12K-b-mPEG5k, previamente pesados em balança
analítica (Shimadzu® AUY220). O BNZ foi adicionado a partir da solução estoque
(1mg/mL) e o volume da fase orgânica foi completado com acetona para um volume
de 2 mL de modo a obter as diferentes concentrações teóricas finais de BNZ
conforme apresentado na Tabela 11. A solução foi então colocada sob agitação
magnética a 500 RPM (Corning® PC-220) até completa solubilização dos
constituintes.
Na sequência, a fase orgânica foi vertida em 4 mL de água ultrapura contida
em um béquer de 10 mL sob agitação magnética a 500 RPM (Corning® PC-220). A
mistura foi então mantida sob agitação por mais 10 min para permitir a formação das
NS. As formulações de NS brancas foram produzidas da mesma forma, sem o
acréscimo da solução estoque de BNZ e adicionados 2 mL de acetona na fase
orgânica. Posteriormente, o solvente foi evaporado à pressão reduzida de 20 mbar,
a temperatura de 40 ºC em Rotavapor (Büchi® R3), até o volume final de 2 mL, no
qual a concentração de polímero na dispersão é de 10 mg/mL e as concentrações
84
de BNZ na formulação são de 0,10; 0,30 ou 0,65 mg/mL. As formulações foram
armazenadas em geladeira (4 °C).
II-3.3. Caracterização físico-química das nanopartículas
II-3.3.1. Determinação de tamanho e dispersão
O diâmetro hidrodinâmico médio (Dh) e a dispersão de tamanho das NS foram
determinados por ECF, utilizando o equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern
Instruments®) com laser de Hélio/Neônio, λ = 633 nm e com detecção no ângulo de
173°. As amostras foram analisadas após diluição de 1 μL em 1000 μL de água
ultrapura à temperatura de 25 ºC. As leituras das formulações brancas foram obtidas
a partir de três formulações distintas e realizadas em triplicata utilizando-se alíquotas
da mesma amostra. Para as formulações com BNZ as leituras foram realizadas em
triplicata utilizando-se alíquotas da mesma amostra. Os resultados obtidos foram
expressos como média + desvio padrão.
II-3.3.2. Determinação do potencial zeta
As formulações, previamente filtradas em filtro de seringa de 0,8 μm, foram
analisadas no equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments®) após diluição
de 1 μL em 1000 μL de água ultrapura à temperatura de 25 ºC. As amostras foram
introduzidas em uma cubeta com dois eletrodos de cargas opostas e a esta foi
aplicado um potencial elétrico de 150 V/cm. As leituras das formulações brancas
foram obtidas a partir de três formulações distintas e realizadas em triplicata
utilizando-se alíquotas da mesma amostra. Para as formulações com BNZ as leituras
foram realizadas em triplicata utilizando-se alíquotas da mesma amostra. Os
resultados obtidos foram expressos como média + desvio padrão.
II-3.3.3. Análise das formulações por microscopia eletrônica de varredura
As análises de MEV foram realizadas no Laboratório NanoLab do Centro
Mínero-Metalúrgico da Rede Temática em Engenharia de Materiais da UFOP (CMM-
REDEMAT-UFOP). Esta análise permitiu observar a forma e o tamanho médio das
85
NP. As formulações foram analisadas em microscópico de varredura por emissão de
campo (Tescan® MIRA-3) após diluição de 100 μL em 1000 μL de água ultrapura.
Cerca de 300 µL de cada diluição foi então depositada sobre uma lamínula de vidro,
que foi seca à temperatura ambiente e revestida em um metalizador com ouro
(Quorum Tech® 150RES) durante 10 min sob vácuo (1x10-1 mbar). As amostras
foram analisadas com aplicação de um potencial elétrico de 15 a 25 kV. As imagens
foram registradas em diferentes ampliações.
II-3.3.4. Estudo de encapsulação do benznidazol nas nanopartículas
II-3.3.4.1. Condições de quantificação do benznidazol por cromatografia líquida
de alta eficiência
A quantificação do BNZ nas amostras foi realizada empregando-se um
método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com o uso de
detector ultravioleta (UV), descrito e validado por MOREIRA DA SILVA e
colaboradores (2012). Foi empregada uma pré-coluna C18 (2 mm x 4,6 mm, 5 µm)
(Phenomenex® AJO-7597) e uma coluna analítica C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm)
(Phenomenex® Gemini-NX). A fase móvel foi composta da mistura: acetonitrila e
água, na proporção 30:70 (v/v), filtrada em membrana de PTFE e degaseificada em
banho ultrassônico (Unique® Ultracleaner 1400 A) por 30 min.
O cromatógrafo líquido de alta eficiência (Waters® Alliance 2695) foi
programado para um fluxo isocrático de 1 mL/min, temperatura do forno de colunas
de 40°C, volume de injeção das amostras e das soluções padrões de 25 μL e tempo
de corrida de 6 min. O eluente da coluna foi monitorado com um detector de UV
(Waters® UV 2489) no comprimento de onda de 324 nm. As amostras das
formulações e os padrões de calibração foram preparados e injetados em triplicata
no mesmo dia da quantificação das amostras.
II-3.3.4.2. Estabelecimento da curva padrão
Uma curva analítica padrão foi preparada para que a quantificação do BNZ,
presente nas amostras, fosse realizada a partir da equação da reta obtida. A curva
foi preparada a partir de diluições seriadas de uma solução estoque de BNZ em
86
acetonitrila na concentração de 1 mg/mL até a obtenção de seis amostras com
concentrações iguais a 0,005; 0,01; 0,05; 0,15; 0,3 e 0,5 mg/mL; que foram injetadas
no cromatógrafo. A média das áreas (n=3) correspondentes às concentrações foi
utilizada para determinar a equação da reta de linearidade e o coeficiente de
determinação (R2).
II-3.3.4.3. Determinação da porcentagem de encapsulação
Na Figura 23 estão representados os procedimentos gerais empregados a
partir das formulações para a obtenção das frações de interesse na determinação da
porcentagem de encapsulação, eficiência de encapsulação, porcentagem de BNZ
precipitado e capacidade de carga.
Figura 23: Representação esquemática do procedimento adotado para a dosagem de benznidazol (BNZ) nas formulações de nanoesferas (NS) para os estudos de encapsulação.
A porcentagem de encapsulação é a quantidade percentual de fármaco
associado às NS em relação ao total de fármaco presente na dispersão coloidal final
de NS. O seu cálculo foi realizado pela diferença entre a concentração total de BNZ
no coloide após a filtração em filtro de seringa de 0,8 μm (Figura 23B) e a
concentração solúvel não encapsulada representada pelo ultrafiltrado (Figura 23E),
dividido pela concentração total na formulação após a filtração (Figura 23B),
conforme a Equação 9.
87
Equação (9):
% 𝑒𝑛𝑐𝑎𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎çã𝑜 =(𝐶 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝐵) − 𝐶 𝑢𝑙𝑡𝑟𝑎𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 (𝐸))
𝐶 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙(𝐵)× 100
Assim, para calcular a concentração total de BNZ não precipitada no coloide
(C total (B) em mg/mL), uma alíquota de 300 μL da formulação filtrada em filtro de 0,8
μm foi diluída em 1200 μL de acetonitrila em tubo Eppendorf®, que foi levado ao
vórtex (IKA® Genius 3) por 5 min e posteriormente submetido à força gravitacional de
500 × g por 30 min em microcentrífuga (Eppendorf® 5415D). Este procedimento
dissolveu as NS e solubilizou o BNZ encapsulado. O sobrenadante foi filtrado em
filtro de seringa de 0,45 μm e injetado no cromatógrafo para a quantificação.
Para determinar a concentração de BNZ livre solúvel (C ultrafiltrado (E) em mg/mL)
400 μL da amostra filtrada previamente em filtro de 0,8 μm foi colocada em um
dispositivo Amicon® de 100 kD acoplado a um tubo Eppendorf® (Figura 23C). O
sistema foi então submetido à força gravitacional de 500 × g por 30 min em
microcentrífuga (Eppendorf® 5415D) (Figura 23D) de maneira que todo BNZ
associado às NS ficou retido no dispositivo, passando através da membrana
somente a quantidade solúvel na fase aquosa externa da dispersão (ultrafiltrado,
Figura 23E). Em seguida, 170 μL do ultrafiltrado foi diluído em 170 μL de acetonitrila.
A solução foi agitada em vórtex (IKA® Genius 3) por 15 min e centrifugada à força
gravitacional de 500 × g por 15 min em microcentrífuga (Eppendorf® 5415D). O
sobrenadante foi filtrado em filtro de seringa de 0,45 μm e injetado no cromatógrafo
para a quantificação.
II-3.3.4.4. Determinação da eficiência de encapsulação
A eficiência de encapsulação é a determinação do rendimento do processo de
encapsulação como um todo. É a porcentagem de BNZ efetivamente associada às
NS sobre a quantidade total colocada na formulação (expressa pela concentração
teórica de BNZ na formulação). Desta forma, esse cálculo evidencia as perdas que
ocorrem durante todas as etapas de preparo, conforme explicitado na Equação 10.
88
Equação (10):
% 𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖ê𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑐𝑎𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎çã𝑜 =(𝐶 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝐵) − 𝐶 𝑢𝑙𝑡𝑟𝑎𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 (𝐸))
𝐶 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑝𝑒𝑠𝑎𝑑𝑎× 100
II-3.3.4.5. Determinação da porcentagem de benznidazol precipitado
A porcentagem de BNZ precipitado nas formulações foi calculada pela
diferença entre a concentração total de BNZ no coloide (C total (A) em mg/mL) (Figura
23A) e a concentração total de BNZ no coloide após a filtração em filtro de seringa
de 0,8 μm (C total (B) em mg/mL) dividido pela concentração total de BNZ na
formulação como mostrado na Equação 11.
Equação (11):
% 𝐵𝑁𝑍 𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑡𝑎𝑑𝑜 =(𝐶 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝐴) − 𝐶𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝐵))
𝐶 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝐴) × 100
Assim, para calcular a concentração total de BNZ no coloide (C total (A) em
mg/mL), uma alíquota de 300 μL de cada formulação foi adicionada a 1200 μL de
acetonitrila em tubo Eppendorf®, que foi levado ao vórtex (IKA® Genius 3) por 5 min
e posteriormente submetido à força gravitacional de 500 × g por 30 min em
microcentrífuga (Eppendorf® 5415D). Este procedimento dissolveu as NS e
solubilizou todo o BNZ presente na amostra. O sobrenadante foi filtrado em filtro de
seringa de 0,45 μm e injetado no cromatógrafo para a quantificação.
II-3.3.4.6. Determinação da porcentagem de capacidade de carga
A relação massa/massa entre fármaco e polímero (capacidade de carga,
chamado em Inglês de “payload”), conforme Equação 12.
Equação (12):
𝐶𝑎𝑝𝑎𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑟𝑔𝑎 (%) =𝐸𝐸 % × 𝐶𝑇 (𝑚𝑔/𝑚𝐿)
𝐶𝑃 (𝑚𝑔/𝑚𝐿)× 100
89
Onde:
EE = Eficiência de encapsulação;
CT = Concentração teórica de BNZ na formulação;
CP = Concentração polimérica.
A capacidade de carga foi calculada através da razão entre (o produto da
eficiência de encapsulação com a concentração teórica de BNZ na formulação) e a
concentração de polímero na formulação, no caso 10 mg/mL para todas as
formulações.
II-3.4. Avaliação da citotoxicidade das nanopartículas
II-3.4.1. Manutenção da cultura de células
Na manutenção da linhagem de células Vero (linhagem isolada de células
normais do epitélio renal de macaco verde africano “Chlorocebus aethiops”) foram
utilizados meio DEMEM contendo vermelho de fenol, glucose e L-glutamina;
suplementado com 10% (v/v) de SFB e 1% de antibiótico (10.000 UI/mL de penicilina
e 10 mg de estreptomicina/mL) solubilizado em tampão citrato. As células foram
incubadas em estufa (Thermo Scientific® 3111) a 37 °C e 5% CO2.
Na manutenção da linhagem de células J774A.1 (linhagem isolada de
macrófagos tumorais de camundongo) foram utilizados meio RPMI contendo
vermelho de fenol, glucose e L-glutamina; suplementado com 10% (v/v) de SFB e
1% de antibiótico (10.000 UI/mL de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL)
solubilizado em tampão citrato. As células foram incubadas em estufa (Thermo
Scientific® 3111) a 37 °C e 5% CO2.
O desprendimento dos macrófagos a partir das garrafas de cultivo foi
realizado através de PBS sem cálcio e magnésio, seguido do uso de “cell scraper”,
enquanto que para as células Vero o procedimento foi realizado utilizando tripsina a
5%. Ambas as células foram centrifugadas a 1500 RPM por 7 min a 4 °C em
centrífuga para microplaca (Heraeus Multifuge® X3R). O sobrenadante foi
descartado e as células ressuspendidas nos meios respectivos como descrito
90
anteriormente. Em seguida, foi realizada a contagem manual das células em câmara
de Neubauer acoplada ao microscópio óptico invertido (Zeiss® Axio Vert. A1),
através do teste de exclusão de viabilidade pelo azul de tripan, no qual as células
inviáveis são coradas de azul. Finalmente, o volume de suspensão celular foi
ajustado para uma concentração de 12.000 células/poço para J774A.1 e 3.000
células/poço para Vero, conforme padronizado no Laboratório de Cultivo de
Células/Nanobiomg para a realização do ensaio colorimétrico de citotoxicidade.
II-3.4.2. Ensaio colorimétrico de citotoxicidade
As formulações brancas de NS nas concentrações poliméricas de 10 mg/mL
foram filtradas em filtro de seringa de 0,8 μm e a partir delas preparadas soluções
estoque na concentração de 500 μg/mL em meio DEMEM com 10% de soro fetal
bovino (SFB) e em meio RPMI com 10% SFB, para os testes com células Vero e
J774A.1 respectivamente. Em ambos os meios foi adicionado 1% de antibiótico
(10.000 UI/mL de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL) solubilizado em tampão
citrato. Foram realizadas diluições seriadas a partir das soluções estoque de modo a
obter concentrações poliméricas nas concentrações de 500, 100, 50, 10, 5; e 1
μg/mL.
As suspensões de células foram plaqueadas a uma concentração de (12.000
ou 3.000 células/poço) para um volume de 200 μL em microplacas de 96 poços e
incubadas por 24 h a 37 °C e 5% CO2 em estufa (Thermo Scientific® 3111) para
aderência das células no fundo dos poços. Após este tempo de incubação foram
removidos os sobrenadantes dos poços, sendo estes lavados com PBS contendo
cálcio e magnésio. Foram adicionados 200 μL das formulações diluídas em meio de
cultivo nas devidas concentrações conforme descrito acima. As placas de cultura
foram incubadas por 24 horas a 37 °C e 5% CO2 em estufa (Thermo Scientific®
3111).
Após 24 h o sobrenadante foi retirado e os poços lavados 2 vezes com PBS
com cálcio e magnésio. Foram adicionados 200 μL de solução de MTT (0,5 mg/mL)
diluído em meio de cultivo em cada poço. As placas de cultivo foram incubadas por
mais 4 horas em estufa a 37 °C e 5% CO2. Após este tempo as placas foram
coletadas, retirado o MTT e adicionados 200 μL de DMSO 10% v/v diluído nos
respectivos meios de cultura celular em todos os poços. Em seguida, as placas de
91
cultura foram centrifugadas por 5 min a 1700 RPM, novamente incubadas em estufa
nas condições descritas acima por um período de 15 min e agitadas em vórtex por
mais 10 min. Todos estes procedimentos são adotados para a máxima solubilização
dos cristais de formazan, o que foi confirmado em microscópio óptico invertido
(Zeiss® Axio Vert. A1).
Em alguns poços foram feitos os controles com células cultivadas sem
tratamento correspondendo a 100% de viabilidade celular. As diferentes diluições
foram colocadas na placa em triplicata e o teste foi realizado três vezes em dias
diferentes. A leitura das absorbâncias (A) foi realizada em espectrômetro leitor de
microplaca (Molecular Devices®) no comprimento de onda de 570 nm com referência
em 650 nm. A citotoxicidade foi calculada conforme a Equação 13.
Equação (13):
% 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 =(𝐴 𝑑𝑎𝑠 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠 − 𝐴 𝑑𝑜 𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜)
(𝐴 𝑑𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 − 𝐴 𝑑𝑜 𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜)× 100
II-3.5. Análise estatística dos dados
Os dados coletados foram analisados, sendo as diferenças entre as variáveis
avaliadas através do teste de ANOVA (análise de variância), seguida do pós-teste
de Tukey para comparações múltiplas, com o auxilio do programa Prisma versão
6.01 (GraphPad Software©). Empregou-se intervalo de confiança de 95%, sendo os
valores de P inferiores a 0,05 considerados como estatisticamente significativos.
92
II-4. RESULTADOS
II-4.1. Preparo das nanoesferas
Na Tabela 12 são apresentados os resultados relativos à estabilidade física
macroscópica das formulações obtidas a partir do uso dos copolímeros PLA-b-
mPEG como surfactantes.
Tabela 12: Avaliação da estabilidade de nanoesferas de PLA26K obtidas a partir dos copolímeros PLA-b-mPEG em diferentes porcentagens nas formulações.
Copolímero Porcentagem (p/p) de mPEG Estabilidade
PLA21K-b-mPEG5k
3
Precipitou
5
7
10
15
PLA12K-b-mPEG5k 14 Não precipitou
O copolímero PLA21K-b-mPEG5k não foi eficiente para formar NS nas
quantidades testadas em misturas com o PLA. As formulações precipitaram
grosseiramente durante a remoção do solvente no rotavapor; enquanto o copolímero
PLA12K-b-mPEG5k na quantidade usada foi adequado como surfactante, uma vez
que as NS foram estáveis quando armazenadas em geladeira e não houve formação
de agregados visíveis por pelo menos 1 mês. Assim, para o preparo das NS
objetivando o estudo de encapsulação do BNZ foi utilizado o copolímero PLA12K-b-
mPEG5k como agente estabilizador estérico em misturas com o homopolímero de
PLA ou com os copolímeros contendo glicidil éteres.
Os polímeros PLA26K, PLA21K-co-AGE2,4 e PLA24K-co-BGE2,6 sintetizados se
mostraram adequados para o preparo de NS brancas quando estabilizados pelo
copolímero PLA12K-b-mPEG5k, uma vez que não houve formação de precipitados
visíveis para estas formulações por pelo menos 1 mês. Já para as NS contendo
BNZ, apenas as formulações com (0,1 mg/mL de BNZ) não apresentaram
precipitados na forma de cristais visíveis. Para as demais concentrações
93
desenvolvidas (0,3 e 0,65 mg/mL) foi observada a formação de cristais de BNZ
poucos minutos após o preparo das formulações.
II-4.2. Caracterização físico-química das nanopartículas
II-4.2.1. Determinação de tamanho, dispersão e potencial zeta
Na Tabela 13 são apresentados os resultados de Dh, dispersão média e
potencial ζ das formulações preparadas.
Tabela 13: Valores médios de diâmetro hidrodinâmico, dispersão de tamanho e potencial zeta das formulações de nanoesferas brancas e com benznidazol.
Formulação Polímero Dh ± DP (nm) Dispersão média ± DP
Potencial zeta ± DP (mV)
Branca
PLA26K 92 ± 10 0,15 ± 0,05 - 25 ± 4
PLA21K-co-AGE2,4 91 ± 7 0,17 ± 0,05 - 32 ± 6
PLA24K-co-BGE2,6 92 ± 6 0,11 ± 0,02 - 31 ± 4
BNZ 0,1 mg/mL
PLA26K 103,1 ± 1,0 * a 0,06 ± 0,02 - 18,6 ± 0,2 *
PLA21K-co-AGE2,4 105,2 ± 0,3 * a 0,10 ± 0,01 - 17 ± 1 *
PLA24K-co-BGE2,6 96,1 ± 0,3 * 0,06 ± 0,03 - 18,2 ± 0,6 *
BNZ 0,3 mg/mL
PLA26K 96,5 ± 0,3 * a b 0,07 ± 0,01 - 18,8 ± 0,9 *
PLA21K-co-AGE2,4 111,2 ± 0,5 * a b 0,08 ± 0,02 - 21 ± 3 *
PLA24K-co-BGE2,6 94,3 ± 0,2 * b 0,06 ± 0,01 - 18 ± 1 *
BNZ 0,65 mg/mL
PLA26K 93,5 ± 0,2 b 0,07 ± 0,01 - 16,8 ± 0,5 *
PLA21K-co-AGE2,4 117,1 ± 0,9 * b 0,1 ± 0,03 - 21 ± 1 *
PLA24K-co-BGE2,6 98,5 ± 0,1 * b 0,07 ± 0,02 - 17,4 ± 0,3 *
Legenda: (BNZ) Benznidazol. (Dh) diâmetro hidrodinâmico. (DP) desvio padrão. (*) diferença estatisticamente significativa em relação à formulação branca para um mesmo tipo de polímero. (
a)
diferença estatisticamente significativa entre as concentrações de 0,1 e 0,3 mg/mL de BNZ para um mesmo tipo de polímero. (
b) diferença estatisticamente significativa entre as concentrações de 0,3 e
0,65 mg/mL de BNZ para um mesmo tipo de polímero.
As formulações avaliadas apresentaram NP com Dh médio entre 91,1-92,4 nm
(brancas) e 93,5-117,1 nm (BNZ). Não foi observada diferença estatisticamente
significativa do Dh entre as NS brancas contendo comonômeros em relação às
obtidas com o homopolímero PLA. Com a exceção da NS de PLA26K (0,65 mg/mL de
BNZ), um aumento significativo do Dh foi observado nas NS contendo BNZ em
94
relação às NS brancas. Houve diferença significativa do Dh das NS de um mesmo
polímero conforme foram variadas as concentrações de BNZ nas formulações. Os
valores de dispersão obtidos para todas as NS foram inferiores a 0,3, o que
caracterizou estes sistemas coloidais como monodispersos.
As análises do potencial ζ para as formulações avaliadas indicaram a
obtenção de NS de carga predominantemente negativas. As formulações avaliadas
apresentaram NP com potencial ζ em módulo entre 25-32 mV (brancas) e 16,8-21,1
mV (BNZ). Não foi observada diferença significativa de potencial ζ entre as NS
brancas contendo comonômeros em relação às obtidas com o homopolímero PLA.
Uma diminuição estatisticamente significativa do potencial ζ em módulo foi
observada nas NS contendo BNZ em relação às NS brancas para um mesmo tipo de
polímero.
II-4.2.2. Análise das formulações por microscopia eletrônica de varredura
Na Figura 24 são apresentadas as imagens obtidas por MEV das formulações
brancas e das formulações contendo BNZ na concentração de 0,3 mg/mL. As
imagens obtidas por MEV mostraram que as NS preparadas com e sem BNZ
apresentaram tamanho de partícula muito disperso, com estruturas em escala
nanométrica e diâmetros compreendidos entre 50 e 120 nm. Embora as amostras
fossem analisadas sob um feixe de elétrons de energia relativamente baixa (15-20
kV) e sob camada fina de ouro (100 Å), a rápida deformação e o alargamento de
diâmetro das NS em virtude da fusão destas sob aquecimento foi observada com o
aumento do potencial aplicado de 20 para 25 kV. Este efeito foi exemplificado para
as NS brancas de PLA26K na Figura 25. As imagens de MEV da Figura 25B mostram
NS de diâmetros aumentados em relação à Figura 25A, sendo possível observar nas
regiões demarcadas a deformação e alargamento das NS, inclusive com
sobreposição na região circundada.
95
Figura 24: Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura das nanoesferas (NS) preparadas. À esquerda são mostradas as NS brancas e à direita as NS contendo benznidazol 0,3 mg/mL. (A e B) NS de PLA26K; (C e D) NS de PLA21K-co-AGE2,4; (E e F) NS de PLA24K-co-BGE2,6. (C) circunferência. (r) raio.
A B
C D
F E
96
Figura 25: Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura da formulação branca de PLA26K. Ambas as imagens são do mesmo campo amostral, à esquerda (A) são mostradas as nanoesferas após aplicação de um potencial de 20 kV. À direita (B) as nanoesferas após aplicação de um potencial de 25 kV.
II-4.2.3. Estudo de encapsulação do benznidazol nas nanoesferas
Um pico único e uniforme, com tempo de retenção de 1,94 min foi encontrado
em todas as concentrações do padrão e amostras avaliadas e atribuído ao BNZ. A
curva de calibração do padrão de BNZ juntamente com a equação da reta e o
coeficiente de determinação (R2) são apresentados na Figura 26.
Figura 26: Curva de calibração obtida a partir do padrão de benznidazol com o respectivo coeficiente de determinação (R2) e com a equação da reta.
A B
97
O valor do R2 obtido foi de 0,9992; assim o valor do coeficiente de correlação
(r) foi de 0,9995. Na Figura 27 estão apresentados os resultados referentes às
quantificações de BNZ por CLAE a partir das formulações preparadas. Foi utilizada a
equação da reta apresentada na Figura 26 para calcular a quantidade de fármaco
em cada amostra.
Figura 27: Gráficos relativos ao estudo da encapsulação do benznidazol (BNZ). (A) BNZ precipitado (B) porcentagem de encapsulação (C) eficiência de encapsulação (D) capacidade de carga; sendo todos apresentados em função da concentração teórica de BNZ na formulação. (ns) grupos comparados e que não apresentaram diferença estatisticamente significativa entre si. Todas as demais comparações intragrupos (partículas de diferentes polímeros em uma mesma concentração) e intergrupos (partículas do mesmo polímero em diferentes concentrações) apresentaram diferença estatística.
Foi observado que os valores de porcentagem e eficiência de encapsulação;
além da porcentagem de capacidade de carga foram baixos para as NS preparadas,
C
B A
D
98
enquanto a porcentagem de fármaco precipitado foi elevada, principalmente na
maior concentração de BNZ (0,65 mg/mL). Um aumento significativo da
porcentagem de BNZ precipitado foi observado na concentração de 0,65 mg/mL em
relação às demais (Figura 27A), o que foi compatível com a observação visual de
que a formulação de BNZ (0,65 mg/mL) possuía mais cristais que a formulação de
BNZ (0,3 mg/mL); enquanto que a formulação de BNZ (0,1 mg/mL) não apresentou
cristais visíveis.
Em relação à porcentagem de encapsulação (Figura 27B) foi observada uma
tendência significativa, na qual a porcentagem de encapsulação foi crescente para
as NS de PLA21K-co-AGE2,4 conforme foram aumentadas as concentrações teóricas
de BNZ na formulação; enquanto que para as demais NS foi observado o
comportamento oposto. Quando avaliado o rendimento do processo de
encapsulação como um todo, representado pela eficiência de encapsulação, tal
comportamento foi análogo (Figura 27C), a eficiência de encapsulação foi crescente
para as NS de PLA21K-co-AGE2,4 conforme foram aumentadas as concentrações
teóricas de BNZ na formulação; enquanto que para as demais NS foi observado o
comportamento oposto.
Na avaliação da capacidade de carga (p/p) de BNZ em relação aos polímeros
(Figura 27D) foi observada uma tendência significativa, na qual a porcentagem de
capacidade de carga foi crescente para as NS de PLA21K-co-AGE2,4 conforme foram
aumentadas as concentrações teóricas de BNZ na formulação. Para as demais
formulações não foram observadas tendências. Quando foram relacionados os
resultados de Dh e potencial ζ (Tabela 13) com os resultados de porcentagem de
encapsulação (Figura 27B); foi observado que diâmetros e potenciais ζ
estatisticamente diferentes para formulações de um mesmo polímero, em diferentes
concentrações teóricas de BNZ, estavam relacionados às variações significativas
das porcentagens de encapsulação.
II-4.3. Avaliação da citotoxicidade dos polímeros na forma de nanoesferas
Na Figura 28 são apresentadas as curvas de viabilidade de células Vero e de
macrófagos J774A.1 em função da concentração de polímeros na forma de NS após
incubação por um período de 24h.
99
Figura 28: Curvas de viabilidade celular das diferentes formulações em cultura de célula Vero (A) e macrófagos J774A.1 (B) em função da concentração de polímero na forma de nanoesferas (µg/mL) em 24h. Para (A) (*) diferença significativa das NS de PLA-co-AGE e PLA-co-BGE em relação as NS de PLA. Para (B) (*) diferença significativa entre as NS de PLA-co-AGE e PLA; (**) Diferença significativa entre as NS de PLA-co-AGE e PLA-co-BGE.
A análise dos dados de citotoxicidade para Vero (Figura 28A) mostrou que há
diferença significativa quando foram comparadas as viabilidades de NS de PLA com
PLA-co-AGE e PLA-co-BGE nas maiores concentrações (50, 100 e 500 µg/mL),
sugerindo que os dois últimos polímeros sejam mais tóxicos nestas concentrações.
A análise dos dados de citotoxicidade para J774A.1 (Figura 28B) mostrou que há
diferença significativa quando foram comparadas as viabilidades de NS de PLA com
PLA-co-AGE na concentração de 50 e 100 µg/mL e as NS de PLA-co-AGE com
PLA-co-BGE na concentração de 50 µg/mL. Não obstante, na maior concentração
analisada não houve diferença significativa entre a viabilidade das formulações. Não
houve citotoxicidade significativa para nenhuma das formulações nas concentrações
poliméricas testadas. De acordo com a ISO 10.993 (2009) valores de viabilidade
celular acima de 70% caracterizam toxicidade significativa da substância analisada.
100
II-5. DISCUSSÃO
O copolímero PLA21K-b-mPEG5k quando utilizado como blenda com o PLA26K
com porcentagem (p/p) de mPEG de 3-15%; não foi capaz de estabilizar as NS
formadas na formação de NS estáveis, provavelmente devido ao baixo teor de
cadeias de PEG. O uso de blendas de PLA-b-mPEG com PLA foi estudado por
GREF e colaboradores (2000), os autores concluíram que uma porcentagem (p/p)
de mPEG acima de 5% foi suficiente para garantir o efeito estabilizador estérico e
formando NS estáveis. Logo, estes resultados ajudaram a fortalecer a hipótese de
que nem todas as cadeias de PLA21K-b-mPEG5k são iniciadas pelo mPEG. De fato,
como já abordado, este copolímero possui a menor porcentagem estimada de
cadeias iniciadas pelo mPEG (37%).
Já o copolímero PLA12K-b-mPEG5k quando utilizado como blenda com o
PLA26K na porcentagem (p/p) de mPEG de 14%; foi capaz de estabilizar as NS pelo
efeito de repulsão estérica. O bloco de mPEG ligado covalentemente ao bloco PLA
exerce a função de redução da tensão superficial e estabilização estérica na
interface de NP (LUCKE et al., 2000; MOSQUEIRA et al., 2001). O copolímero
PLA12K-b-mPEG5k apresentou porcentagem estimada de cadeias iniciadas pelo
mPEG de 65%, o que poderia explicar porque este formou NS estáveis em
detrimento ao copolímero PLA21K-b-mPEG5k quando usados no preparo das
formulações com porcentagem (p/p) de mPEG próximas (≈ 14%).
O uso de PLA-b-mPEG atuando como surfactante não iônico na superfície de
NS é uma estratégia que visa à obtenção de partículas estáveis retardando a
interação com as opsoninas no plasma, reduzindo a captura de partículas pelas
células do sistema retículo endotelial e aumentando o tempo de circulação
sanguínea (GREF et al., 1995). Assim, o uso do PLA12K-b-mPEG5k como surfactante
na formação de NS estáveis abriu perspectivas em relação à estudos in vivo
posteriores.
Os resultados de diâmetros hidrodinâmicos (Dh), dispersões de tamanho e
potenciais ζ para as formulações brancas foram obtidos a partir da média de três
formulações preparadas em dias diferentes, o que mostra reprodutibilidade da
técnica de preparo das NS. Foram obtidas NS de populações uniformes, uma vez
que os valores de dispersão foram inferiores a 0,3. Os Dh e as dispersões médias
obtidas para as formulações foram condizentes com o preparo de NS por
101
nanoprecipitação, uma vez que a técnica é capaz de produzir NS nanométricas e
com estreita dispersão de tamanho, resultando em dispersões coloidais, nas quais
os Dh das NS de PLA são de aproximadamente 100 nm quando a �̅�𝑛 do polímero é
inferior a 30.000 g/mol (LEGRAND et al., 2007) e quando é utilizado PLA-b-mPEG
na estabilização estérica das partículas (GREF et al., 1994; MURAKAMI et al., 2000;
CHORNY et al., 2002).
A inserção de alila ou benzila nas cadeias poliméricas, não foi capaz de afetar
o tamanho médio das NS, provavelmente devido à pequena quantidade destes
grupamentos nas cadeias poliméricas. Provavelmente também, em função dos
grupamentos alila e benzila possuírem massas molares baixas (< 100 g/mol) estes
não foram capazes de causar um aumento do Dh na escala nanométrica. Em outros
trabalhos que trataram da funcionalização de polímeros e da formação de NPs
também não foram observados aumentos significativos dos diâmetros de partícula
quando comparadas partículas com e sem ligantes (BANQUY et al., 2008;
KORTHALS et al., 2010).
O aumento do Dh das NS com BNZ em relação às NS brancas, possivelmente
está relacionado à associação do BNZ na nanoestrutura. Desta forma, variações
maiores do Dh das NS estariam relacionadas a uma maior associação de BNZ aos
vetores, o que foi comprovado com os ensaios de porcentagem de encapsulação;
especialmente para a formulação de PLA21K-co-AGE2,4 (0,65 mg/mL de BNZ) que
apresentou maior porcentagem de encapsulação e maior variação do Dh nesta
concentração em relação à formulação sem fármaco quando comparada às demais
NS. Na literatura são encontrados casos de aumento do Dh de NS após
incorporação do fármaco (ROUZES et al., 2003; HAMMADY et al., 2009). Quando
foram comparados o Dh das NS de PLA26K com BNZ (0,65 mg/mL) com os Dh da
respectiva NS branca foi observado que não houve variação significativa deste
parâmetro. A porcentagem de encapsulação mostrou que nesta concentração a
encapsulação do BNZ na NS de PLA26K é praticamente nula, o que poderia explicar
a ausência de variação do Dh entre estas formulações.
Não houve diferenças significativas de potencial ζ entre as formulações
brancas contendo comonômeros em relação às obtidas com o homopolímero PLA.
Isto sugeriu que os grupamentos alila e benzila inseridos nos copolímeros, bem
como as características estruturais das cadeias poliméricas, não modificaram a
carga superficial das NS, uma vez que o potencial ζ é influenciado pela carga dos
102
diferentes componentes das formulações dissociados na superfície das NP
(LEGRAND et al., 1999; USKOKOVIC, 2007).
GREF e colaboradores (2000) determinaram o potencial ζ de NS formadas a
partir de blendas de PLA com PLA-b-mPEG; os autores observaram que para uma
porcentagem (p/p) de mPEG de aproximadamente 15%, o potencial ζ das partículas
foi próximo a (-15 mV), entretanto, o valor de potencial ζ médio obtido para as NS
brancas de PLA foi de aproximadamente (-25 mV). GREF e colaboradores (2000)
utilizaram meio salino (NaCl 10−3 M) enquanto neste estudo foi utilizada água
ultrapura. É conhecido que as diferenças entre as espécies presentes no meio são
mais distintas em água do que na solução de NaCl. Isso se deve ao fato de que o
sal no meio circundante reduz e equaliza os potenciais ζ devido à compressão da
camada difusa, aproximando o plano de cisalhamento da interface da partícula. Este
efeito foi observado no trabalho de HOFFMANN e colaboradores (1997).
O potencial ζ pode também ser usado comparativamente para determinar o
grau de associação de uma molécula à interface de uma NP ou na sua superfície.
Foi observada diferença estaticamente significativa de potencial ζ entre as
formulações com e sem BNZ, que possivelmente está relacionada à presença de
parte do BNZ associado à superfície das NS. O BNZ poderia interagir com os grupos
ionizados da superfície das NS e consequentemente reduzir o potencial ζ da
formulação. Dentre as formulações preparadas, a formulação de PLA21K-co-AGE2,4
(0,65 mg/mL de BNZ) foi a que apresentou maior variação do potencial ζ nesta
concentração em relação à formulação branca. Esta formulação apresentou maior
quantidade de BNZ associado às NPs, como mostrou os ensaios de porcentagem de
encapsulação.
A determinação do potencial ζ permite prever a estabilidade de dispersões
coloidais, após a sua produção, sendo esta relação diretamente proporcional, pois
quanto maiores os valores observados para o potencial ζ maior a repulsão entre as
partículas e menor tendência à formação de agregados (SCHAFFAZICK et al., 2003;
MORA-HUERTAS, 2010). Em geral o limite que configura as dispersões em estáveis
e instáveis é da ordem de 30 mV em módulo, assim, partículas com potencial
maiores que 30 mV em módulo são normalmente consideradas fortemente aniônicas
ou catiônicas, tornando a dispersão coloidal estável devido às repulsões elétricas
entre as partículas em meio aquoso (XU, 2008; CLOGSTON; PATRI, 2011). Todas
as formulações com BNZ apresentaram potencial ζ menor que 30 mV em módulo,
103
não obstante, estas formulações foram estáveis quando armazenadas em geladeira
a uma temperatura de 4 °C por um período de até 1 mês, não apresentando
precipitados. Estes resultados comprovam que as NS deste estudo são realmente
estabilizadas por forças estéricas devido ao uso de copolímero anfifílico não iônico,
o PLA21K-b-mPEG5k.
A avaliação de parâmetros tais como: forma, tamanho e superfície das
partículas por meio de microscopias eletrônicas corroboram no estudo morfológico
de sistemas nanoestruturados (LIU, 2005; ZHOU; WANG, 2007). A técnica de MEV
foi útil na confirmação das formas esféricas das NS. O fundo de algumas imagens
apresentou estruturas condizentes de agregação entre as NS. Este aspecto também
foi observado no trabalho de HOLBAN e colaboradores (2014) para NS de PLA.
Provavelmente isto foi associado às condições de fusão das NS sob o feixe de
elétrons durante a análise de MEV, pois os índices de polidispersão obtidos por ECF
foram relativamente baixos para estas partículas (≤ 0,17).
Em relação à variação de potencial elétrico aplicado sobre as amostras de 20
para 25 kV; foi possível atribuir o aumento dos diâmetros das partículas à
deformação causada pela fusão das NS sob aquecimento pelo feixe de elétrons em
virtude do aumento do potencial elétrico aplicado. Em outros trabalhos foram
observados efeitos semelhantes para nanocápsulas de PLA (ATTILI-QADRI et al.,
2013; GARCIA et al., 2015). GARCIA e colaboradores (2015) atribuíram o efeito de
diâmetro aumentado com o aumento do potencial elétrico aplicado, à natureza
líquida do núcleo e a sua fina membrana polimérica, adicionado ao fato de o PLA
apresentar baixa temperatura de transição vítrea (50-84 °C). Portanto, a obtenção de
imagens de MEV para NP a base de PLA é limitada pela escolha adequada da
potência do feixe de elétrons capaz de gerar um aquecimento que funde e alarga o
diâmetro das NPs.
É válido ressaltar que dependendo da técnica utilizada podem ser verificadas
diferenças de tamanho de partícula. A microscopia eletrônica fornece uma imagem
do diâmetro geométrico de poucas partículas isoladas após aplicação de um
potencial elétrico capaz de fundir e deformar as amostra (REIMER, 1998), enquanto
a ECF possibilita a determinação do diâmetro das partículas dispersas em meio
aquoso (BROWN, 1996). Foi observado neste trabalho, que as medidas de ECF
foram maiores que as obtidas por MEV nos campos observados, provavelmente
devido as partículas estarem hidratadas durante a leitura na técnica de ECF
104
possibilita a obtenção de maiores diâmetros. HOFFMANN e colaboradores (1997)
também observaram esta variação entre as duas técnicas.
Estes resultados sugerem que a avaliação morfológica dos diâmetros das NS
deve ser feito por duas ou mais técnicas complementares de dimensionamento,
considerando as limitações e vantagens de cada uma (HASSELLÖV et al., 2008).
Por exemplo, a utilização complementar neste caso da técnica de microscopia de
força atômica poderia proporcionar uma alta resolução de mapeamento em três
perfis tridimensionais da superfície das NP, o que não é possível com a MEV, uma
vez que as imagens obtidas com esta técnica possuem caráter bidimensional
(NEVES; VILELA; ANDRADE, 1998).
Em relação ao estudo de encapsulação do BNZ, a formação de cristais
visíveis de BNZ nas formulações com concentrações entre 0,3 e 0,65 mg/mL,
sugerem uma saturação do sistema e uma baixa capacidade de encapsulamento do
BNZ. No trabalho de MAXIMIANO e colaboradores (2010) o BNZ foi caracterizado e
sua solubilidade em água destilada foi determinada (0,237 mg/mL). Na concentração
de 0,1 mg/mL de BNZ não foi possível identificar visualmente os cristais, pois
mesmo que houvesse BNZ não associado às NS, ele estaria solúvel no meio aquoso
da formulação. Os resultados de porcentagem de encapsulação e de porcentagem
de BNZ precipitado nesta concentração corroboram com esta observação.
Assim como neste estudo, na literatura são encontrados trabalhos que
também apresentaram baixas porcentagens de encapsulação em NS de PLA para
fármacos como o paclitaxel (MUSUMECI et al., 2006), aciclovir (GIANNAVOLA et al.,
2003) e lidocaína (ROUZES et al., 2003). A encapsulação de um fármaco em um
dado vetor é governada essencialmente pelas interações intermoleculares entre
eles. As fracas interações intermoleculares entre o fármaco e polímero levam o
fármaco a precipitar mesmo após a encapsulação, indicando menor retenção do
fármaco na matriz e baixa estabilidade física (LI; YANG, 2015). Provavelmente o
BNZ e estes fármacos apresentaram baixa interação em relação ao constituinte
polimérico da formulação.
Era esperado devido ás interações entre grupamentos aromáticos do BNZ e
do polímero que as NS de PLA24K-co-BGE2,6 apresentassem melhores resultados de
porcentagem de encapsulação e de eficiência de encapsulação, bem como de
capacidade de carga, em relação às NS obtidas a partir dos demais polímeros. Esse
copolímero apresenta grupos benzila na cadeia polimérica e por meio de interações
105
intermoleculares de sobreposição de orbitais π esperar-se-ia uma melhor interação
com as moléculas do BNZ após a nanoprecipitação. Não obstante, os parâmetros
avaliados foram mais favoráveis para a encapsulação do BNZ nas NS de PLA21K-co-
AGE2,4.
Como já mencionado, o empacotamento cristalino do BNZ é reforçado por
uma rede de interações intermoleculares fortes do tipo ligação de hidrogênio que
possuem energias mais altas que as interações intermoleculares do tipo π-π, (10-40
kJ/mol e 8-9 kJ/mol) respectivamente (LI; YANG, 2015). O entendimento das
interações π-π também não é tão simples. No trabalho de MARTINEZ e IVERSON
(2012) é discutido que estas interações são afetadas por variados fatores,
reservadas para casos muito específicos, ou mesmo, não são aplicáveis às
interações intermoleculares de moléculas aromáticas comuns. Estes fatos
apresentados quando relacionados à baixa inserção de benzila nas cadeias de PLA
podem ter desfavorecido as interações entre o copolímero PLA24K-co-BGE2,6 e o
BNZ.
A constatação de que as NS de PLA21K-co-AGE2,4 conseguiram encapsular o
BNZ em maior porcentagem na maior concentração avaliada (0,65 mg/mL) e de
como a porcentagem de encapsulação aumentou com o aumento da concentração
de BNZ foi instigante. Nesta concentração cerca de 60% do fármaco precipitou e
40% foi encapsulado, assim houve um equilíbrio maior entre as forças que regem o
empacotamento cristalino do fármaco e a sua associação com as NP. Estas
observações podem ser resultado da combinação de forças de interações
intermoleculares que governam a encapsulação de um fármaco por um vetor, tais
como interações do tipo ligações de hidrogênio, iônicas, hidrofóbicas, π-π e de van
der Waals (LI; YANG, 2015).
O aumento da relação massa/massa entre fármaco e polímero foi crescente
para as NS de PLA21K-co-AGE2,4 em função da concentração de BNZ. Para a maior
concentração de BNZ (0,65 mg/mL) a porcentagem de capacidade de carga foi de (≈
0,9%). NS em geral possuem capacidade de carga baixa (< 5%) quando há pouca
afinidade entre o fármaco e a matriz polimérica (YOO et al., 1999; GIANNAVOLA et
al., 2003). Interações fortes entre fármaco e polímero podem potencialmente reduzir
a mobilidade molecular e reduzir a extensão de cristalização do fármaco (MISTRY et
al., 2015).
106
Mesmo para a maior porcentagem de encapsulação obtida (NS de PLA21K-co-
AGE2,4 com BNZ 0,65 mg/mL) a eficiência de encapsulação foi baixa (≈ 14%) o que
mostra o baixo rendimento do processo de encapsulação do BNZ como um todo.
Uma vez que a porcentagem de encapsulação foi crescente e que o BNZ só
precipitou efetivamente na concentração de 0,65 mg/mL para a NS de PLA21K-co-
AGE2,4; a eficiência de encapsulação acompanhou esta tendência. Assim como
neste trabalho, no estudo de MUSUMECI e colaboradores (2006) também foi
observado que a eficiência de encapsulação aumentou em NS de PLA conforme foi
aumentada a concentração de paclitaxel na formulação.
Ainda que as inserções principalmente de alila ao longo da cadeia de PLA
tenham modificado a porcentagem e a eficiência de encapsulação de BNZ; os
parâmetros avaliados no estudo de encapsulação (porcentagem de encapsulação,
eficiência de encapsulação e capacidade de carga) apresentaram valores muito
baixos o que não justificaria a síntese destes copolímeros para a finalidade proposta
de aprimoramento de encapsulação do BNZ.
Não obstante, a inserção destes grupos funcionais no PLA é uma estratégia
interessante levada em consideração a possibilidade de encapsulação de moléculas
com menor capacidade cristalina que o BNZ em meio aquoso, que contenha mais
grupamentos aromáticos em sua estrutura; ou que ainda sejam menos sujeitas a
realizarem interações intermoleculares fortes do tipo ligação de hidrogênio.
Outra potencial vantagem da inserção destes grupamentos é a possibilidade
de pós-modificações químicas dos copolímeros para a inserção de ligantes
funcionais de interesse, como visto no trabalho de GESCHWIND, PHILLIPS e FREY
(2013) para um copolímero com benzila e no trabalho de ERBERICH, KEUL e
MÖLLER (2007) para um copolímero com alila. Assim, permitindo que estes ligantes
de interesse aumentem também a encapsulação de ativos em NP (RABANEL et al.,
2015), atuem como sistemas sítio-específicos (BANQUY et al., 2008) ou
biomarcadores (TESKE; VOIGT; SHASTRI, 2014).
Em relação à citotoxicidade das NS, os resultados mostraram que os
polímeros de PLA modificados contendo alila e benzila possuem baixa toxicidade
nas concentrações avaliadas. NADEAU e colaboradores (2005) sintetizaram o
copolímero PLA-co-AGE e avaliaram sua citotoxicidade em culturas de macrófagos
murino RAW 264.7 e J774A.1. Utilizando a técnica do MTT foi demostrado que o
copolímero em concentração de até 1000 µg/mL não apresentou efeito sobre a
107
viabilidade celular quando comparado ao PLA homopolímero, mostrando que a
presença do grupo alila não interferiu na viabilidade celular. Porém, no estudo de
NADEAU e colaboradores (2005) não foi avaliado o grau de inserção do
comonômero na cadeia polimérica.
A importância da utilização das linhagens celulares Vero e J774A.1 neste
estudo é que se tratam de células não fagocíticas e fagocíticas, respectivamente,
que respondem de forma diferente em relação à toxicidade na presença de NP, uma
vez que as linhagens interagem de formas distintas com estas (SOHAEBUDDIN et
al., 2010). Isto pode explicar as diferenças encontradas nas curvas de viabilidade
entre os tipos celulares.
Para J774A.1, as curvas de citotoxicidade foram semelhantes para as três
formulações, enquanto que para as células Vero, as NS de PLA-co-AGE e PLA-co-
BGE foram mais tóxicas em relação às NS de PLA26K nas maiores concentrações.
Não foi possível correlacionar o Dh com este efeito, visto que não houve diferença
estatística entre os Dh destas NP. É conhecido que o diâmetro pode estar
relacionado com o aumento da toxicidade das NP, pois áreas superficiais maiores
permitem mais interações com as células (HE et al., 2010; SHINDE et al., 2012).
As partículas de PLA26K podem ter interagido com as células Vero de uma
maneira diferente do que as NS preparadas com copolímeros contendo alila e
benzila, uma vez que os resultados de potenciais ζ sugeriram a influência destes
grupos na superfície das NS. É documentado que as modificações de superfície de
nanomateriais podem afetar tanto a sua via de internalização como o seu destino
intracelular (DURÁN; GUTERRES; ALVES, 2014). O modelo utilizado foi útil para se
estudar a interferência das NS na viabilidade celular de duas linhagens de células
por 24h. Contudo, tal procedimento proporciona uma visão limitada dos complexos
celulares intrínsecos ao funcionamento de um organismo e das possíveis vias de
captação e internalização celulares, além da estabilidade das NS nos meios
biológicos (MOORE et al., 2015). Logo, esses resultados in vitro são preliminares,
porém encorajadores para mais estudos toxicológicos.
108
II-6. CONCLUSÃO PARCIAL
A utilização de blendas de PLA-b-mPEG com polímeros contendo alila e
benzila inseridos na cadeia de PLA se mostrou viável na formação de NS pelo
método de nanoprecipitação, com NS apresentando tamanhos inferiores a 117 nm,
forma esférica, estabilidade coloidal e baixa citotoxicidade até 500 µg/mL.
A associação do BNZ às NS preparadas foi maior para as NS de PLA21K-co-
AGE2,4 em função do aumento da concentração de BNZ na formulação quando
comparada aos demais tipos de NS. Essa maior associação foi indicativo de uma
possível participação e interação dos grupamentos alilas presentes nas cadeias
poliméricas com as moléculas de BNZ. As modificações das características das NP
com BNZ, tais como aumento do tamanho e redução do potencial ζ em módulo
quando comparadas às NS brancas indicou que o BNZ pode estar associado à
matriz polimérica bem como à superfície das NS. Contudo, a estratégia de síntese
de PLA funcionalizado utilizada neste trabalho não foi ideal para a finalidade
proposta de aprimoramento de encapsulação do BNZ a partir da interação de grupos
aromáticos; uma vez que os parâmetros avaliados (porcentagem de encapsulação,
eficiência de encapsulação e capacidade de carga) apresentaram valores muito
baixos.
109
4. CONCLUSÃO
Em relação às sínteses de polímeros derivados do D,L-lactídeo por abertura
de anel, nesse estudo foram obtidos polímeros modificados e avaliada a influência
de alguns parâmetros reacionais nas características dos produtos sintetizados. Foi
observada a influência da quantidade de epóxido no meio reacional nas massas
molares obtidas, dispersidades e no número de inserções de GE por cadeia. O
DMAP não contribuiu para maiores inserções dos comonômeros nas cadeias
poliméricas em relação ao Sn(Oct)2. Os comonômeros GE foram pouco inseridos
nas cadeias de PLA e as NS obtidas a partir desses copolímeros apresentaram
baixa capacidade de encapsulação do BNZ, sendo obtido no máximo 40% de
encapsulação para as NS de PLA21K-co-AGE2,4.
A capacidade destes copolímeros modificados na formação de NS estáveis e
de baixa toxicidade abre perspectivas de aprimoramento das rotas de síntese e
obtenção de polímeros com maiores massas molares e maiores inserções de GE por
cadeia. A partir das interações intermoleculares entre fármacos e grupos funcionais
podem ser oferecidas novas plataformas poliméricas para o preparo de
nanocarreadores e encapsulação de fármacos com diferentes composições
químicas e que sejam melhores alternativas terapêuticas.
110
5. PERSPECTIVAS DO TRABALHO
São perspectivas deste trabalho:
Aprimorar as metodologias de síntese desenvolvidas até o momento visando
à obtenção de polímeros com maiores massas molares e melhorar a inserção
de GE por cadeia;
Utilizar a espectroscopia de massa MALDI-TOF para identificar os locais de
inserção dos grupamentos AGE e BGE;
Avaliar para uma mesma série polimérica a relação entre o número de GE por
cadeia com a porcentagem de encapsulação de outra molécula modelo;
Analisar os polímeros sintetizados por técnicas calorimétricas;
Avaliar o perfil de liberação de uma molécula modelo a partir de NP
preparadas com os polímeros modificados com GE;
Dosar possíveis traços metálicos provenientes dos catalisadores nos
polímeros sintetizados.
111
6. REFERÊNCIAS
ABULATEEFEH, S. R.; TAHA, M. O. Enhanced drug encapsulation and extended release
profiles of calcium–alginate nanoparticles by using tannic acid as a bridging cross-linking
agent. Journal of Microencapsulation, v. 32, n. 1, p. 1-10, 2014.
AHMED, J.; VARSHNEY, S. K. Polylactides - chemistry, properties and green packaging
technology: a review. International Journal of Food Properties, v. 14, p. 37-58, 2010.
AL-QUADEIB, B. T.; RADWAN, M. A.; SILLER, L.; HORROCKS, B.; WRIGHT, M. C. Stealth
amphotericin B nanoparticles for oral drug delivery: in vitro optimization. Saudi
Pharmaceutical Journal, v. 23, n. 3, p. 290-302, 2015.
ANDERSON, J. M.; SHIVE, M. S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA
microspheres. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 28, p. 05-24, 1997.
ATTILI-QADRI, S.; KARRA, N.; NEMIROVSKI, A.; SCHWOB, O.; TALMON, Y.; NASSAR, T.;
BENITA, S. Oral delivery system prolongs blood circulation of docetaxel nanocapsules via
lymphatic absorption. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 110, n. 43, p.
17498–17503, 2013.
BANQUY, X.; LECLAIR, G.; RABANEL, J. M.; ARGAW, A.; BOUCHARD, J. F.; HILDGEN,
P.; GIASSON, S. Selectins ligand decorated drug carriers for activated endothelial cell
targeting. Bioconjugate Chemistry, v. 19, p. 2030–2039, 2008.
BARAN, J.; DUDA, A.; KOWALSKI, A.; SZYMANSKI, R.; PENCZEK, S. Intermolecular chain
transfer to polymer with chain scission: General treatment and determination of k(p)/k(tr) in
L,L-lactide polymerization. Macromolecular Rapid Communications, v. 18, p. 325-333,
1997.
BEUILLE, E.; DARCOS, V.; COUDANE, J.; LACROIX-DESMAZES, P.; NOTTELET, B.
Regioselective halogenation of poly(lactide) by free-radical process. Macromolecular
Reaction Engineering, v. 8, n. 2, p. 141-148, 2013.
BROCAS, A. L.; MANTZARIDIS, C.; TUNC, D.; CARLOTTI, S. Polyether synthesis: from
activated or metal-free anionic ring-opening polymerization of epoxides to functionalization.
Progress in Polymer Science, v. 38, n. 6, p. 845-873, 2013.
BROWN, W. Light scattering: principles and development. 1 ª. ed. Oxford: Clarendon
Press, 1996.
CALDAS, I. S.; TALVANI, A.; CALDAS, S.; CARNEIRO, C. M.; DE LANA, M.; DA MATTA
GUEDES, P. M.; BAHIA, M. T. Benznidazole therapy during acute phase of Chagas disease
reduces parasite load but does not prevent chronic cardiac lesions. Parasitology Research,
v. 103, p. 413-421, 2008.
CALLISTER, W. D.; RETHWISCH, D. G. Ciencia e engenharia de materiais: uma
introdução. 8. ed. Rio de Janeiro: LTC, 2012.
CAMPBELL, D.; PETHRICK, R. A.; WHITE, J. R. Polymer characterization: physical
techniques. 2ª. ed. Boca Raton: CRC Press, 2000.
112
CANEVAROLO JÚNIOR, S. V. Ciência dos Polímeros: um texto básico para tecnólogos e
engenheiros. 3. ed. São Paulo: Artliber Editora, 2010.
CARSTENS, M. G.; DE JONG, P. H.; VAN NOSTRUM, C. F.; KEMMINK, J.; VERRIJK, R.;
DE LEEDE, L. G.; CROMMELIN, D. J.; HENNINK, W. E. The effect of core composition in
biodegradable oligomeric micelles as taxane formulations. European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 68, n. 3, p. 596-606, 2008.
CHORNY, M.; FISHBEIN, I.; DANENBERG, H. D.; GOLOMB, G. Lipophilic drug loaded
nanospheres prepared by nanoprecipitation : effect of formulation variables on size, drug
recovery and release kinetics. Journal of Controlled Release, v. 83, n. 3, p. 389-400, 2002.
CLOGSTON, J. D.; PATRI, A. K. Zeta potential measurement. In: MCNEIL, S. E.
Characterization of nanoparticles intended for drug delivery. New York: Humana Press,
2011. p. 63-70.
CONNOR, E. F.; NYCE, G. W.; MYERS, M.; MÖCK, A.; HEDRICK, J. L. First Example of N-
Heterocyclic Carbenes as Catalysts for Living Polymerization: Organocatalytic Ring-Opening
Polymerization of Cyclic Esters. Journal of the American Chemical Society, v. 124, n. 6, p.
914-915, 2002.
CSIHONY, S.; BEAUDETTE, T. T.; SENTMAN, A. C.; NYCE, G. W.; WAYMOUTH, R. M.;
HEDRICK, J. L. Bredereck’s reagent revisited: organocatalytic ring-opening polymerization
and transesterification reactions. Advanced Synthesis & Catalysis, v. 346, p. 1081–1086.,
2004.
DE MARTIMPREY, H.; BERTRAND, J. R.; MALVY, C.; COUVREUR, P.; VAUTHIER, C.
New Core-Shell Nanoparticules for the Intravenous Delivery of siRNA to Experimental
Thyroid Papillary Carcinoma. Pharmaceutical Research, v. 27, n. 3, p. 498-509, 2010.
DEGÉE, P.; DUBOIS, P.; JÉRÔME, R.; JACOBSEN, S.; FRITZ, H. G. New catalysis for fast
bulk ring-opening polymerization of lactide monomers. Macromolecular Symposia, v. 144,
p. 289-302, 1999.
DELL'ERBA, I. E.; WILLIAMS, R. J. J. Homopolymerization of epoxy monomers initiated by
4-(dimethylamino)pyridine. Polymer Engineering & Science, v. 46, n. 3, p. 351-359, 2006.
DURÁN, N.; GUTERRES, S. S.; ALVES, O. L. Nanotoxicology: Materials, Methodologies,
and Assessments. New York: Springer Science+Business, 2014.
ERBERICH, M.; KEUL, H.; MÖLLER, M. Polyglycidols with Two Orthogonal Protective
Groups: Preparation, Selective Deprotection, and Functionalization. Macromolecules, v. 40,
p. 3070-3079, 2007.
FATTAL, E.; VAUTHIER, C.; AYNIE, I.; NAKADA, Y.; LAMBERT, G.; MALVY, C.;
COUVREUR, P. Biodegradable polyalkylcyanoacrylate nanoparticles for the delivery of
oligonucleotides. Journal of Controlled Release, v. 53, n. 1-3, p. 137-143, 1998.
FEINSTEIN, K. Guide to spectroscopic identification of organic compounds. Boca
Raton: CRC Press, 1995.
113
FESSI, H.; PIUSIEUX, F.; DEVISSAGUET, J. P.; AMMOURY, N.; BENITA, S. Nanocapsule
formation by interfacial polymer deposition following solvent displacement. International
Journal of Pharmaceutics, v. 55, p. R1-R4, 1989.
FRESHNEY, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized
Applications. 6ª. ed. New Jersey: John Wiley & Sons, 2010.
GAO, H.; JONES, M. C.; CHEN, J.; LIANG, Y.; PRUD'HOMME, R. E.; LEROUX, J. C.
Hydrophilic nanoreservoirs embedded into polymeric micro/nanoparticles: an approach to
compatibilize polar molecules with hydrophobic matrixes. Chemistry of Materials, v. 20, p.
4191-4193, 2008.
GARCIA, G. M.; OLIVEIRA, L. T.; PITTA, I. R.; LIMA, M. C. A.; VILELA, J. M. C.; ANDRADE,
M. S.; ABDALLA, D. S. P.; MOSQUEIRA, V. C. F. Improved nonclinical pharmacokinetics
and biodistribution of a new PPAR pan-agonist and COX inhibitor in nanocapsule
formulation. Journal of Controlled Release, v. 209, p. 207–218, 2015.
GARLOTTA, D. A Literature Review of Poly(Lactic Acid). Journal of Polymers and the
Environment, v. 9, n. 2, p. 63-84, 2002.
GESCHWIND, J.; PHILLIPS, A.; FREY, H. Poly(carbonate) Copolymers with Tailored
Number of Hydroxyl Groups from Glycidyl Ethers and CO2. Polymer Chemistry, v. 5, p.
814-818, 2013.
GIANNAVOLA, C.; BUCOLO, C.; MALTESE, A.; PAOLINO, D.; VANDELLI, M. A.; PUGLISI,
G.; LEE, V. H. L.; FRESTA, M. Influence of Preparation Conditions on Acyclovir-Loaded
Poly-d,l-Lactic Acid Nanospheres and Effect of PEG Coating on Ocular Drug Bioavailability.
Pharmaceutical Research, v. 20, n. 4, p. 584-590, 2003.
GOLDBERG, M.; LANGER, R.; JIA, X. Nanostructured materials for applications in drug
delivery and tissue engineering. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition, v. 18,
n. 3, p. 241–268, 2007.
GOLDSTEIN, J. I.; NEWBURY, D. E.; ECHIL, P.; JOY, D. C.; ROMIG, J. A. D.; LYMAN, C.
E. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. New York: Plenum Press,
1992.
GOVENDER, T.; STOLNIK, S.; GARNETT, M. C.; ILLUM, L.; DAVIS, S. S. PLGA
nanoparticles prepared by nanoprecipitation: drug loading and release studies of a water
soluble drug. Journal of Controlled Release, v. 57, n. 2, p. 171–185, 1999.
GREF, R.; DOMB, A.; QUELLEC, P.; BLUNK, T.; MÜLLER, R. H.; VERBAVATZ, J. M.;
LANGER, R. The controlled intravenous delivery of drugs using PEG-coated sterically
stabilized nanospheres. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 16, p. 215-233, 1995.
GREF, R.; LÜCK, M.; QUELLEC, P.; MARCHAND, M.; DELLACHERIE, E.; HARNISCH, S.;
BLUNK, T.; MÜLLER, R. H. "Stealth‟ corona-core nanoparticles surface modified by
polyethylene glycol (PEG): influences of the corona (PEG chain length and surface density)
and of the core composition on phagocytic uptake and plasma protein adsorption. Colloids
and Surfaces B: Biointerfaces, v. 18, p. 301–313, 2000.
114
GREF, R.; MINATAKE, Y.; PERACCHIA, M. T.; TRUBETSKOY, V.; TORCHILIM, V.;
LANGER, R. Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres. Science, v. 263, p.
1600-1603, 1994.
GUPTA, A. P.; KUMAR, V. New emerging trends in synthetic biodegradable polymers –
Polylactide: A critique. European Polymer Journal, v. 43, p. 4053–4074, 2007.
HABNOUNI, S. E.; DARCOS, V.; GARRIC, X.; LAVIGNE, J. F.; NOTTELET, B.; COUDANE,
J. Mild Methodology for the Versatile Chemical Modification of Polylactide Surfaces: Original
Combination of Anionic and Click Chemistry for Biomedical Applications. Advanced
Functional Materials, v. 21, n. 17, p. 3321-3330, 2011.
HAMMADY, T.; RABANEL, J. M.; DHANIKULA, R. S.; LECLAIR, G.; HILDGEN, P.
Functionalized nanospheres loaded with anti-angiogenic drugs: Cellular uptake and
angiosuppressive efficacy. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,
v. 72, p. 418–427, 2009.
HASSELLÖV, M.; READMAN, J. W.; RANVILLE, J. F.; TIEDE, K. Nanoparticle analysis and
characterization methodologies in environmental risk assessment of engineered
nanoparticles. Ecotoxicology, v. 17, p. 344-361, 2008.
HAZARI, D.; JANA, S. K.; SETH, S. K.; PUSCHMANN, H.; DALAI, S. Structural variability of
Ag(I) metal–organic networks: C–H⋯π and metal⋯π interactions. Journal of Coordination
Chemistry, v. 69, n. 3, p. 562-573, 2016.
HE, C.; HU, Y.; YIN, L.; TANG, C.; YIN, C. Effects of particle size and surface charge on
cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials, v. 31, p. 3657–
3666, 2010.
HEALD, C. R.; STOLNIK, S.; DE MATTEIS, C.; LEERMAKERS, F. A. M. Self-consistent field
modelling of poly(lactic acid)–poly(ethylene glycol) particles. Colloids and Surfaces A:
Physicochemical and Engineering Aspects, v. 179, p. 79-91, 2001.
HERZBERGER, J.; NIEDERER, K.; POHLIT, H.; SEIWERT, J.; WORM, M.; WURM, F. R.;
FREY, H. Polymerization of ethylene oxide, propylene oxide, and otheralkylene oxides:
synthesis, novel polymer architectures, and bioconjugation. American Chemical Society, v.
116, p. 2170−2243, 2015.
HOFFMANN, F.; CINATL JR., J.; KABICKOVÁ, H.; CINATL, J.; KREUTER, J.; STIENEKER,
F. Preparation, characterization and cytotoxicity of methylmethacrylate copolymer
nanoparticles with a permanent positive surface charge. International Journal of
Pharmaceutics, v. 157, n. 2, p. 189–198, 1997.
HOLBAN, A. M.; GRUMEZESCU, V.; GRUMEZESCU, A. M.; VASILE, B. Ş.; TRUşCă, R.;
CRISTESCU, R.; SOCOL, G.; IORDACHE, F. Antimicrobial nanospheres thin coatings
prepared by advanced pulsed laser technique. Beilstein Journal of Nanotechnology, v. 5,
p. 872–880, 2014.
HUNTER, C. A.; SANDERS, J. K. M. The Nature of π-π Interactions. Journal of the
American Chemical Society, v. 112, p. 5525-5534, 1990.
115
HYON, S. H.; JAMSHIDI, K.; IKADA, Y. Synthesis of polylactides with different molecular
weights. Biomaterials, v. 18, p. 1503–1508, 1997.
HYON, S. H.; JAMSHIDI, K.; IKADA, Y. Effects of Residual Monomer on the Degradation of
DL-Lactide Polymer. Polymer International, v. 46, p. 196-202, 1998.
ISO 10993. Biological, evaluation of medical devices - Part 5 - Tests for cytotoxicity: in vitro
methods, 2009.
IUPAC. Glossary of basic terms in polymer (IUPAC Recommendations 1996). International,
Union of Pure and Applied Chemistry, v. 68, n. 12, p. 2287-2311, 1996.
IUPAC. Dispersity in polymer science (IUPAC Recommendations 2009). Pure and Applied
Chemistry, v. 81, n. 2, p. 351–353, 2009.
JANES, K. A.; FRESNEAU, M. P.; MARAZUELA, A.; FABRA, A.; ALONSO, M. J. Chitosan
nanoparticles as delivery systems for doxorubicin. Journal of Controlled Release, v. 73, p.
255-267, 2001.
JING, F.; HILLMYER, M. A. A Bifunctional Monomer Derived from Lactide for Toughening
Polylactide. Journal of the American Chemical Society , v. 130, n. 42, p. 13826-13827,
2008.
KAIHARA, S.; MATSUMURA, S.; MIKOS, A. G.; FISHER, J. P. Kaihara, S.; Matsumura, S.;
Mikos, A. G.; Fisher, J. P. Synthesis of poly(L-lactide) and polyglycolide by ring-opening
polymerization, v. 2, n. 11, p. 2767-2771, 2007.
KAMALYA, N.; XIAO, Z.; VALENCIA, P. M.; RADOVIC-MORENO, A. F.; FAROKHZAD, O.
C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical
translation. Chemical Society Reviews, v. 41, n. 7, p. 2971-3010, 2012.
KANG, N.; PERRON, M. E.; PRUD'HOMME, R. E.; ZHANG, Y.; GAUCHER, G.; LEROUX, J.
C. Stereocomplex block copolymer micelles: core-shell nanostructures with enhanced
stability. Nano Letters , v. 5, n. 2, p. 315-319, 2005.
KARIDI, K.; MANTOURLIAS, T.; SERETIS, A.; PLADIS, P. Synthesis of high molecular
weight linear and branched polylactides: A comprehensive kinetic investigation. European
Polymer Journal, v. 72, p. 114–128, 2015.
KAWASHIMA, Y. Nanoparticulate systems for improved drug delivery. Advanced Drug
Delivery Reviews, v. 47, p. 1-2, 2001.
KIM, B. S.; PARK, S. W.; HAMMOND, P. T. Hydrogen-bonding layer-by-layer-assembled
biodegradable polymeric micelles as drug delivery vehicles from surfaces. ACS Nano, v. 2,
n. 2, p. 386-392, 2008.
KIM, J. Y.; KIM, S.; PAPP, M.; PARK, K.; PINAL, R. Hydrotropic solubilization of poorly
water-soluble drugs, v. 99, n. 9, p. 3953-3965, 2010.
KIM, S.; KIM, J. H.; JEON, O.; KWON, I. C.; PARK, K. Engineered polymers for advanced
drug delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 71, n. 3, p.
420-430, 2009.
116
KOMAROVA, L. I.; SALAZKIN, S. N.; BULGAKOVA, I. A.; MALANIYA, M. I.;
VINOGRADOVA, S. V.; KORSHAK, V. V. Interaction of polyesters with epoxy polymers:
Insertion of oxirane rings into ester bonds. Journal of Polymer Science Part a-Polymer
Chemistry , v. 16, n. 7, p. 1643-1657, 1978.
KORHONEN, H.; HELMINEN, A.; SEPPÄLÄ, J. V. Synthesis of polylactides in the presence
of co-initiators with different numbers of hydroxyl groups. Polymer, v. 42, n. 18, p. 7541-
7549, 2001.
KORTHALS, B.; MORANT-MIÑANA, M. C.; SCHMID, M..; MECKING, S. Functionalization of
Polymer Nanoparticles by Thiol-Ene Addition. Macromolecules, v. 43, p. 8071–8078, 2010.
KOWALSKI, A.; DUDA, A.; PENCZEK, S. Kinetics and mechanism of cyclic esters
polymerization initiated with Tin(II) octoate: polymerization of l,l-dilactide. Macromolecules,
v. 33, p. 7359-7370, 2000.
KOWALSKI, A.; LIBISZOWSKI, J.; BIELA, T.; CYPRYK, M.; DUDA, A.; PENCZEK, S.
Kinetics and mechanism of cyclic esters polymerization initiated with tin(II) octoate.
Polymerization of ε-caprolactone and L,L-Lactide co-initiated with primary amines, v. 38, n.
20, p. 8170–8176, 2005.
KRICHELDORF, H. R.; KREISER-SAUNDERS, I.; STRICKER, A. Polylactones 48.
SnOct(2)-initiated polymerizations of lactide: A mechanistic study. Macromolecules, v. 33,
n. 3, p. 702-709, 2000.
KUMAR, M. N. V. R. Nano and microparticles as controlled drug delivery devices. Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, v. 3, n. 2, p. 234-258, 2000.
LAI, Y.; LONG, Y.; LEI, Y.; DENG, X.; HE, B.; SHENG, M.; LI, M.; GU, Z. A novel micelle of
coumarin derivative monoend-functionalized PEG for anti-tumor drug delivery: in vitro and in
vivo study. Journal of Drug Targeting , v. 20, n. 3, p. 246-254, 2012.
LEEMHUIS, M.; VAN NOSTRUM, C. F.; KRUIJTZER, J. A. W.; ZHONG, Z. Y.; TEN
BRETELER, M. R.; DIJKSTRA, P. J.; FEIJEN, J.; HENNINK, W. E. Functionalized Poly(α-
hydroxy acid)s via Ring-Opening Polymerization: Toward Hydrophilic Polyesters with
Pendant Hydroxyl Groups. Macromolecules, v. 39, n. 10, p. 3500-3508, 2006.
LEGRAND, P.; BARRAT, G.; MOSQUEIRA, V. C. F.; FESSI, H.; DEVISSAGUET, J. P.
Polymeric nanocapsules as drug delivery systems. A review. S.T.P. Pharma Sciences, v. 9,
p. 411-418, 1999.
LEGRAND, P.; LESIEUR, S.; BOCHOT, A.; GREF, R.; RAATJES, W.; BARRATT, G.;
VAUTHIER, C. Influence of polymer behaviour in organic solution on the production of
polylactide nanoparticles by nanoprecipitation. International Journal of Pharmaceutics, v.
344, p. 33–43, 2007.
LI, S. Hydrolytic Degradation Characteristics of Aliphatic Polyesters Derived from Lactic and
Glycolic Acids. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials,
v. 48, p. 342–353, 1999.
LI, S.; MCCARTHY, S. Further investigations on the hydrolytic degradation of poly (DL-
lactide). Biomaterials, v. 20, n. 1, p. 35-44, 1999.
117
LI, Y.; QI, X. R.; MAITANI, Y.; NAGAI, T. PEG–PLA diblock copolymer micelle-like
nanoparticles as all-trans-retinoic acid carrier: in vitro and in vivo characterizations.
Nanotechnology, v. 20, n. 055106, p. 1-10, 2009.
LI, Y.; YANG, L. Driving forces for drug loading in drug carriers. Journal of
Microencapsulation, v. 32, n. 3, p. 1-18, 2015.
LIU, J. Scanning transmission electron microscopy and its application to the study of
nanoparticles and nanoparticle systems. Journal of electron microscopy, v. 54, n. 3, p.
251-278, 2005.
LIU, L.; CAI, X.; ZHANG, J.; CHENGZE, X. Particle-size Measurements in a Micro-channel
with Image Dynamic Light Scattering Method. Procedia Engineering, v. 102, p. 904–910,
2015.
LUCKE, A.; TEβMAR, J.; SCHNELL, E.; SCHMEER, G.; GÖPFERICH!, A. Biodegradable
poly(D,L-lactic acid)-poly(ethylene glycol)-monomethylether diblock copolymers: structures
and surface properties relevant to their use as biomaterials. Biomaterials, v. 21, p. 2361-
2370, 2000.
MAINARDES, R. M.; URBAN, M. C.; CINTO, P. O.; CHAUD, M. V.; EVANGELISTA, R. C.;
GREMIÃO, M. P. Liposomes and micro/nanoparticles as colloidal carriers for nasal drug
delivery. Current Drug Delivery, v. 3, n. 3, p. 275-285, 2006.
MALGORZATA, B.; PRZEMYSLAW, K. Cationic copolymerization of ε-caprolactone and L,L-
lactide by an activated monomer mechanism. Journal of Polymer Science Part A:
Polymer Chemistry, v. 44, n. 24, p. 7071–7081, 2006.
MARTINEZ, C. R.; IVERSON, B. L. Rethinking the term ‘‘pi-stacking’’. Chemical Science, v.
7, n. 3, p. 2191-2201, 2012.
MAXIMIANO, F. P.; COSTA, G. H. Y.; DE SOUZA, J.; CUNHA-FILHO, M. S. S.
Caracterização físico-química do fármaco antichagásico benznidazol. Química Nova, v. 33,
n. 8, p. 1714-1719, 2010.
MEISNER, J. S.; AHN, S.; ARADHYA, S. V.; KRIKORIAN, M.; PARAMESWARAN, R.;
STEIGERWALD, M.; VENKATARAMAN, L.; NUCKOLLS, C. Importance of direct metal-π
coupling in electronic transport through conjugated single-molecule junctions. Journal of the
American Chemical Society, v. 134, n. 50, p. 20440-20445, 2012.
MISTRY, P.; MOHAPATRA, S.; GOPINATH, T.; VOGT, F. G.; SURYANARAYANAN, R. Role
of the Strength of Drug–Polymer Interactions on the Molecular Mobility and Crystallization
Inhibition in Ketoconazole Solid Dispersions. Molecular Pharmaceutics, v. 12, n. 9, p.
3339–3350, 2015.
MOGHIMI, S. M.; HUNTER, A. C.; ANDRESEN, T. L. Factors Controlling Nanoparticle
Pharmacokinetics: An Integrated Analysis and Perspective. Pharmacology and
Toxicology, v. 52, p. 481-503, 2012.
MOHANRAJ, V.; CHEN, Y. Nanoparticles – a review. Tropical Journal of Pharmaceutical
Research, v. 5, p. 561-573, 2006.
118
MOORE, T. L.; RODRIGUEZ-LORENZO, L.; HIRSCH, V.; BALOG, S.; URBAN, D.; JUD, C.;
ROTHEN-RUTISHAUSER, B.; LATTUADAA, M.; PETRI-FINK, A. Nanoparticle colloidal
stability in cell culture media and impact on cellular interactions. Chemical Society
Reviews, v. 44, n. 17, p. 6287-6305, 2015.
MORA-HUERTAS, C. E. Polymer-based nanocapsules for drug delivery. International
Journal of Pharmaceutics, v. 385, n. 1-2, p. 113-142, 2010.
MOREIRA DA SILVA, R.; OLIVEIRA, L.. T.; BARCELLOS, N. M. S.; DE SOUZA, J.; DE
LANA, M. Preclinical Monitoring of Drug Association in Experimental Chemotherapy of
Chagas’ Disease by a New HPLC-UV Method. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
v. 56, n. 6, p. 3344 –3348, 2012.
MOSMANN, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays. Journal oflmmunological Methods, v. 65, p. 55-63,
1983.
MOSQUEIRA, V. C. F.; LEGRAND, P.; GULIK, A.; BOURDON, O.; GREF, R.; LABARRE, D.;
BARRATT, G. Relationship between complement activation, cellular uptake and surface
physicochemical aspects of novel PEG-modified nanocapsules. Biomaterials, v. 22, p.
2967-2979, 2001.
MUDSHINGE, S. R.; DEORE, A. B.; PATIL, S.; BHALGAT, C. M. Nanoparticles: Emerging
carriers for drug delivery. Saudi Pharmaceutical Journal, , v. 19, n. 3, p. 129–141, 2011.
MUNDARGI, R. C.; BABU, V. R.; RANGASWAMY, V.; PATEL, P. Nano/Micro technologies
for delivering macromolecular therapeutics using poly(D,L-lactide-co-glycolide) and its
derivatives. Journal of Controlled Release, v. 124, p. 193-209, 2008.
MURAKAMI, H.; KOBAYASHI, M.; TAKEUCH, H.; KAWASHIMA, Y. Further application of a
modified spontaneous emulsification solvent diffusion method to various types of PLGA and
PLA polymers for preparation of nanoparticles. Powder Technology, v. 104, p. 137–143,
2000.
MUSUMECI, T.; VICARI, L.; VENTURA, C. A.; GULISANO, M.; PIGNATELLO, R.; PUGLISI,
G. Lyoprotected Nanosphere Formulations for Paclitaxel Controlled Delivery. Journal of
Nanoscience and Nanotechnology, v. 6, n. 8, p. 1–8, 2006.
NACHTERGAEL, A.; COULEMBIER, O.; DUBOIS, P.; HELVENSTEIN, M.; DUEZ, P.;
BLANKERT, B.; MESPOUILLE, L. Organocatalysis Paradigm Revisited: Are Metal-Free
Catalysts Really Harmless? Biomacromolecules, v. 16, p. 507−514, 2015.
NADEAU, V.; LECLAIR, G.; SANT, S.; RABANEL, J. M.; QUESNEL, R.; HILDGEN, P.
Synthesis of new versatile functionalized polyesters for biomedical applications. Polymer, v.
46, p. 11263–11272, 2005.
NEDERBERG, F.; CONNOR, E. F.; MÖLLER, M.; GLAUSER, T.; HEDRICK, J. L. New
Paradigms for Organic Catalysts: The First Organocatalytic Living Polymerization.
Angewandte Chemie International Edition, v. 40, n. 14, p. 2712-2715, 2001.
119
NEJAD, E. H.; PAONIASARI, A.; VAN MELIS, C. G. W.; KONING, C. E.; DUCHATEAU, R.
Catalytic ring-ppening copolymerization of limonene oxide and phthalic anhydride: toward
partially renewable polyesters. Macromolecules, v. 46, n. 3, p. 631-637, 2013.
NEVES, B. R. A.; VILELA, J. M. C.; ANDRADE, M. S. Microscopia de varredura por sonda
mecânica: uma introdução. Cerâmica, v. 44, n. 290, p. 212-219, 1998.
NICOLAS, J.; MURA, S.; BRAMBILLA, D.; MACKIEWICZ, N.; COUVREUR, P. Design,
functionalization strategies and biomedical applications of targeted
biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chemical
Society Reviews, v. 42, n. 3, p. 1147-1235, 2013.
NOGA, D. N.; PETRIE, T. A.; KUMAR, A.; WECK, M.; GARCÍA, A. J.; COLLARD, D. M.
Synthesis and Modification of Functional Poly(lactide) Copolymers: Toward Biofunctional
Materials. Biomacromolecules , v. 9, n. 7, p. 2056-2062, 2008.
OBERMEIER, B.; FREY, H. Poly(ethylene glycol-co-allyl glycidyl ether)s: A PEG-Based
Modular Synthetic Platform for Multiple Bioconjugation. Bioconjugate Chemistry, v. 22, n.
3, p. 436–444, 2011.
OWENS III, D. E.; PEPPAS, N. A. Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of
polymeric nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, v. 307, p. 93-102, 2006.
PENCZEK, S.; DUDA, A.; SZYMANSKI, R. Intra- and intermolecular chain transfer to
macromolecules with chain scission. The case of cyclic esters. Macromolecular Symposia,
v. 132, p. 441-449, 1998.
PLADIS, P.; KARIDI, K.; MANTOURLIAS, T.; KIPARISSIDES, C. An Experimental and
Theoretical Investigation of the Ring-Opening Polymerization of L,L-Lactide.
Macromolecular Reaction Engineering, v. 8, p. 813–825, 2014.
PLAPIED, L.; DUHEM, N.; DES RIEUX, A.; PRÉAT, V. Fate of polymeric nanocarries for oral
drug delivery. Current Opinion in Colloid & Interface Science, v. 16, n. 3, p. 228-237,
2011.
RABANEL, J. M.; FAIVRE, J.; PAKA, G. D.; RAMASSAMY, C.; HILDGEN, P.; BANQUY, X.
Effect of polymer architecture on curcumin encapsulation and release from PEGylated
polymer nanoparticles: Toward a drug delivery nanoplatform to the CNS. European Journal
of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 96, p. 409–420, 2015.
RABANEL, J. M.; HILDGEN, P.; BANQUY, X. Assessment of PEG on polymeric particles
surface, a key step in drug carrier translation. Journal of Controlled Release, v. 185, p. 71–
87, 2014.
RAO, J. P.; GECKELER, K. E. Polymer nanoparticles: preparation techniques and size-
control parameters. Progress in Polymer Science, v. 36, n. 7, p. 887-913, 2011.
RAQUEZ, J. M.; HABIBI, Y.; MURARIU, M.; DUBOIS, P. Polylactide (PLA)-based
nanocomposites. Progress in Polymer Science, v. 38, p. 1504-1542, 2013.
RAVVE, A. Principles of Polymer Chemistry. 3ª. ed. New York: Springer, 2012.
120
RAWAT, M.; SINGH, D.; SARAF, S. Nanocarriers: promising vehicles for bioactive drugs.
Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 29, p. 1970-1978, 2006.
REIMER, L. Scanning Electron Microscopy: Physics of Image Formation and
Microanalysis. 2ª. ed. New York: InTech, 1998.
RILEY, T.; GOVENDER, T.; STOLNIK, S.; XIONG, C. D.; GARNETT, M. C.; ILLUM, L.
Colloidal stability and drug incorporation aspects of micellar-like PLA–PEG nanoparticles.
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 16, p. 147–159, 1999.
ROUZES, C.; LEONARD, M.; DURAND, A.; DELLACHERIE, E. Influence of polymeric
surfactants on the properties of drugloaded PLA nanospheres. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, v. 32, p. 125-135, 2003.
SAKAKURA, A.; KAWAJIRI, K.; OHKUBO, T.; KOSUGI, Y.; ISHIHARA, K. Widely Useful
DMAP-Catalyzed Esterification under Auxiliary Base- and Solvent-Free Conditions. Journal
of the American Chemical Society, v. 129, n. 47, p. 14775 – 14779, 2007.
SCHAFFAZICK, R. S.; GUTERRES, S. S.; FREITAS, L. L.; POHLMANN, R. A.
Caracterização e estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados para
administração de fármacos. Química Nova, v. 26, n. 5, p. 726-737, 2003.
SCHMALZ, G. Use of cell cultures for toxicity testing of dental materials - advantages and
limitations. Journal of Dentistry, v. 22, n. 2, p. S6-S11, 1994.
SCHMIDT, C.; LAMPRECHT, A. Nanotherapeutics – Drugs Delivery Concepts in
Nanoscience. In: LAMPRECHT, A. Nanocarriers in drug delivery - design, manufacture
and physicochemical properties. [S.l.]: Pan Stanford Publishing, 2009. Cap. 1, p. 3-37.
SCHWACH, G.; COUDANE, J.; ENGEL, R.; VERT, M. Stannous octoate versus zinc iniated
polymerization of racemic lactide. Polymer Bulletin, v. 32, p. 617– 623, 1994.
SCHWACH, G.; COUDANE, J.; ENGEL, R.; VERT, M. More about the polymerization of
lactides in the presence of stannous octoate. Journal of Polymer Science Part A: Polymer
Chemistry, v. 35, n. 16, p. 3431–3440, 1997.
SCHWACH, G.; COUDANE, J.; ENGEL, R.; VERT, M. Influence of polymerization conditions
on the hydrolytic degradation of poly(dl-lactide) polymerized in the presence of stannous
octoate or zinc-metal. Biomaterials, v. 23, p. 993–1002, 2002.
SERAJUDDIN, A. Salt formation to improve drug solubility. Advanced Drug Delivery
Reviews, v. 59, p. 603–616, 2007.
SHI, Y.; VAN STEENBERGEN, M. J.; TEUNISSEN, E. A.; NOVO, L.; GRADMANN, S.;
BALDUS, M.; VAN NOSTRUM, C. F.; HENNINK, W. E. Pi−Pi Stacking Increases the Stability
and Loading Capacity of Thermosensitive Polymeric Micelles for Chemotherapeutic Drugs.
Biomacromolecules, v. 14, n. 6, p. 1826-1837, 2013.
SHINDE, S. K.; GRAMPUROHIT, N. D.; GAIKWAD, D. D.; JADHAV, S. L.; GADHAVE, M. V.;
SHELKE, P. K. Toxicity induced by nanoparticles. Asian Pacific Journal of Tropical
Disease, v. 2, n. 4, p. 331-334, 2012.
121
SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, R. S. Fundamentos de Química
Analítica, tradução da 8ª edição norte-americana. São Paulo: Editora Thomson, 2006.
SOARES-SOBRINHO, J. L.; CUNHA-FILHO, M. S. S.; NETO, P. J. R.; TORRES-
LABANDEIRA, J. J.; DACUNHA-MARINHO, B. Supporting information: Benznidazole. Acta
Crystallographica Section E, v. o634, n. E64, p. sup-1-7, 2008.
SÖDERGÅRD, A.; INKINEN, S. Production, Chemistry and Properties of Polylactides. In:
PLACKETT, D. Biopolymers – New Materials for Sustainable Films and Coatings. 1ª.
ed. New Jersey: John Wiley and Sons Ltd, 2011. p. 334.
SOHAEBUDDIN, S. K.; THEVENOT, P. T.; BAKER, D.; EATON, J. W.; TANG, L.
Nanomaterial cytotoxicity is composition, size, and cell type dependent. Particle and Fibre
Toxicology, v. 7, n. 22, p. 1-17, 2010.
SONG, X.; ZHAO, Y.; HOU, S.; XU, F.; ZHAO, R.; HE, J.; CAI, Z.; LI, Y.; CHEN, Q. Dual
agents loaded PLGA nanoparticles: Systematic study of particle size and drug entrapment
efficiency. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 69, n. 2, p.
445-453, 2008.
STEFANI, M.; COUDANE, J.; VERT, M. Effects of polymerization conditions on the in vitro
hydrolytic degradation of plaques of poly(DL-lactic acid-block-ethylene glycol) diblock
copolymers. Polymer Degradation and Stability, v. 91, p. 2853-2859, 2006.
STOREY, R. F.; SHERMAN, J. W. Kinetics and mechanism of the stannous octoate-
catalyzed bulk polymerization of e-caprolactone. Macromolecules, v. 35, n. 5, p. 1504-1512,
2002.
SWATI, A.; GOEL, A.; SINGLA, S. Drug delivery special emphasis given on. Advances in
polymer science and technology: An International , v. 2, p. 1-15, 2012.
TANG, M.; DONG, Y.; STEVENS, M. M.; WILLIAMS, C. K. Tailoring Polylactide Degradation:
Copolymerization of a Carbohydrate Lactone and S,S-Lactide. Macromolecules, v. 43, n.
18, p. 7556–7564, 2010.
TANZI, M. C.; VERDERIO, P.; LAMPUGNANI, M. G.; RESNATI, M.; DEJANA, E.; STURANI,
E. Cytotoxicity of some catalysts commonly used in the synthesis of copolymers for
biomedical use. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, v. 5, n. 6, p. 393-
396, 1994.
TESKE, N. S.; VOIGT, J.; SHASTRI, V. P. Clickable Degradable Aliphatic Polyesters via
Copolymerization with Alkyne Epoxy Esters: Synthesis and Postfunctionalization with
Organic Dyes. Journal of the American Chemical Society, v. 136, p. 10527−10533, 2014.
TIAN, H.; TANG, Z.; ZHUANG, X.; CHEN, X.; JING, X. Biodegradable synthetic polymers:
Preparation, functionalization and biomedical application. Progress in Polymer Science, v.
37, n. 2, p. 237-280, 2012.
TSUJI, H. Polylactides. In: DOI, Y.; STEINBÜCHELL, A. Biopolymers, Polyesters III -
Applications and Commercial Products. Weinheim: Wiley-VCH, v. 4, 2002. p. 129-177.
122
URAYAMA, H.; KANAMORII, T.; KIMURA, Y. Properties and biodegradability of polymer
blends of poly(L-lactide)s with different optical purity of the lactate units. Macromolecules
Materials Engineer, v. 287, p. 116-121, 2002.
USKOKOVIC, V. Theoretical and practical aspects of colloid science and self-assembly
phenomena revisited. Reviews in Chemical Engineering, v. 23, p. 301–372, 2007.
VAUTHIER, C.; BOUCHEMAL, K. Methods for the preparation and manufacture of polymeric
nanoparticles. Pharmaceutical research, v. 26, p. 1025–1058, 2009.
VERT, M.; LI, S. M.; SPENLEHAUER, G.; GUERIN, P. Bioresorbability and biocompatibility
of aliphatic polyesters. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, v. 3, n. 6, p.
432-446, 1992.
WOLF, F. F.; FRIEDEMANN, N.; FREY, H. Poly(lactide)-block-Poly(HEMA) Block
Copolymers: An Orthogonal One-Pot Combination of ROP and ATRP, Using a Bifunctional
Initiator. Macromolecules, v. 42, n. 15, p. 5622-5628, 2009.
WU, L.; ZHANG, J.; WATANABE, W. Physical and chemical stability of drug nanoparticles.
Advanced Drug Delivery Reviews, v. 63, n. 6, p. 456-469, 2011.
XIAO, R. Z.; ZENG, Z. W.; ZHOU, G. L.; WANG, J. J.; LI, F. Z.; WANG, A. M. Recent
advances in PEG–PLA block copolymer. International Journal of Nanomedicine, v. 5, p.
1057–1065, 2010.
XU, R. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement.
Particuology, v. 6, n. 2, p. 112-115, 2008.
XU, S.; HELD, I.; KEMPF, B.; MAYR, H.; STEGLICH, W.; ZIPSE, H. The DMAP-Catalyzed
Acetylation of Alcohols—A Mechanistic Study (DMAP=4-(Dimethylamino)pyridine).
Chemistry - A European Journal , v. 11, p. 4751 –4757, 2005.
YAN, J.; YE, Z.; CHEN, M.; LIU, Z.; XIAO, Y.; ZHANG, Y.; ZHOU, Y.; TAN, W.; LANG, M.
Fine tuning micellar core-forming block of poly (ethylene glycol)-block-poly ("-caprolactone)
amphiphilic copolymers based on chemical modification for the solubilization and delivery of
doxorubicin. Biomacromolecules, v. 12, p. 2562–2572, 2011.
YOO, H. S.; OH, J. E.; LEE, K. H.; PARK, T. G. Biodegradable Nanoparticles Containing
Doxorubicin-PLGA Conjugate for Sustained Release. Pharmaceutical Research, v. 16, n. 7,
p. 1114-1118, 1999.
ZHANG, J.; WANG, L. Q.; WANG, H.; TU, K. Micellization phenomena of amphiphilic block
copolymers based on methoxy poly(ethylene glycol) and either crystalline or amorphous
poly(caprolactone-b-lactide). Biomacromolecules, v. 7, n. 9, p. 2492-2500, 2006.
ZHANG, X.; MACDONALD, D. A.; GOOSEN, M. F. A.; MCAULEY, K. B. Mechanism of
Lactide Polymerization in the Presence of Stannous Octoate: The Effect of Hydroxy and
Carboxylic Acid Substances. Journal of Polymer Science: Part A Polymer Chemistry, v.
32, p. 2965-2970, 1994.
123
ZHANG, X.; WYSS, U. P.; PICHORA, D.; GOOSEN, M. F. A. An investigation of the
synthesis and thermal stability of poly(DL-lactide). Polymer Bulletin, v. 27, p. 623-629,
1992.
ZHENG, X. T.; LI, C. M. Restoring basal planes of graphene oxides for highly efficient
loading and delivery of beta-lapachone. Molecular Pharmaceutics, v. 9, p. 615–621, 2012.
ZHIGALTSEV, I. V.; WINTERS, G.; SRINIVASULU, M.; CRAWFORD, J.; WONG, M.;
AMANKWA, L.; WATERHOUSE, D.; MASIN, D.; WEBB, M.; HARASYM, N.; HELLER, L.;
BALLY, M. B.; CIUFOLINI, M. A.; CULLIS, P. R.; MAURER, N. Development of a weak-base
docetaxel derivative that can be loaded into lipid nanoparticles. Journal of Controlled
Release, v. 144, n. 3, p. 332-340, 2010.
ZHOU, H.; HAO, J.; WANG, S.; ZHENG, Y.; ZHANG, W. Nanoparticles in the ocular drug
delivery. International Journal of Ophthalmology , v. 6, n. 3, p. 390-396, 2013.
ZHOU, W.; WANG, Z. L. Scanning Microscopy for Nanotechnology - Techniques and
Applications. 1ª. ed. New York: Springer, 2007.
ZHU, K. J.; XIANGZHOU, L.; SHILIN, Y. Preparation, Characterization, and Properties of
Polylactide (PLA) -Poly( ethylene Glycol) (PEG) Copolymers: A Potential Drug Carrier.
Journal of Applied Polymer Science, v. 39, n. 1-9, 1990.
![Apresentação Polímeros Inap [Modo de Compatibilidade]faculdadeinap.edu.br/materiais_didaticos_disciplinas/materiais e... · Poliestireno - PS • A combinação de copolímeros](https://img.document.onl/doc/110x75/5c2c82f209d3f2af358d9247/apresentacao-polimeros-inap-modo-de-compatibilidade-e-poliestireno-.jpg)
![[18-05-2011]Álcoois, Éteres e Tióis](https://img.document.onl/doc/110x75/5571fc054979599169964f91/18-05-2011alcoois-eteres-e-tiois.jpg)
