UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

VALÉRIA FERREIRA FERNANDES

CRESCIMENTO, PRODUÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL E ANATOMIA FOLIAR DE Ocimum gratissimum L. (LAMIACEAE) EM DIFERENTES

NÍVEIS DE RADIAÇÃO LUMINOSA

ILHÉUS – BAHIA

2012

VALÉRIA FERREIRA FERNANDES

CRESCIMENTO, PRODUÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL E ANATOMIA FOLIAR DE Ocimum gratissimum L. (LAMIACEAE) EM DIFERENTES

NÍVEIS DE RADIAÇÃO LUMINOSA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Produção Vegetal da Universidade

Estadual de Santa Cruz-UESC como parte dos

requisitos para a obtenção do título de Mestre em

Produção Vegetal.

Área de concentração: Cultivos em Ambiente

Tropical Úmido

Orientadora: Profª Drª Larissa C. do B. Costa

Co-Orientador: Prof. Dr. Marcelo Mielke

ILHÉUS – BAHIA

2012

VALÉRIA FERREIRA FERNANDES

CRESCIMENTO, PRODUÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL E ANATOMIA FOLIAR DE Ocimum gratissimum L. (LAMIACEAE) EM DIFERENTES

NÍVEIS DE RADIAÇÃO LUMINOSA Ilhéus - BA, 13/02/2012

______________________________________ Larissa Corrêa do Bomfim Costa - DS

DCB/ UESC (Orientadora)

______________________________________ Delmira da Costa Silva - DS

DCB/ UESC

________________________________________ Fábio Pinto Gomes- DS

DCB/ UESC

_________________________________________ José Eduardo Brasil Pereira Pinto- PhD

UFLA/ DAG

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, João e Jeruza e irmãs Emília e Fernanda, pelo amor incondicional, compreensão e incentivos.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelas bênçãos recebidas, por iluminar minhas escolhas e colocar

pessoas especiais em meu caminho.

Aos meus pais, João e Jeruza, por acreditarem nos meus sonhos e ideais, e

por não terem medido esforços para que muitos destes fossem concretizados. É

para e por vocês mais esta vitória.

Às minhas irmãs, Emília e Fernanda, pelos momentos compartilhados, por

todo amor, companheirismo e por tornarem minha vida mais feliz.

Aos meus cunhados, Hugo e Miguel, pelos auxílios e amizade.

À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), pela minha formação

profissional, e em especial ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal,

pela oportunidade concedida. Ao coordenador do programa, Prof. Dr. Jadergudson

Pereira, pelo auxílio durante o experimento e à secretária Caroline Tavares, pela

gentileza e competência e aos colegas pela amizade e incentivo.

À Coordenação do Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela concessão da bolsa de estudo.

À Profª Drª Larissa Corrêa do Bomfim Costa pelo apoio e excelente

orientação. Muito obrigada pelo exemplo de competência e profissionalismo, pelos

conselhos e por ter me ensinado, nos momentos de dúvidas e angústias, a olhar as

dificuldades como barreiras a serem transpostas.

À Profª Drª Delmira da Costa Silva, pelo apoio incondicional em todas as

etapas da minha vida acadêmica, por ter me acolhido tão carinhosamente, tornando-

se fundamental no meu crescimento profissional. Além de contar com sua amizade e

confiança.

Aos Professores Doutores, Eduardo Gross e Pedro Mangabeira, pelos

ensinamentos valiosos, conselhos e amizade.

Ao Professor Dr. Marcelo Mielke, pela co-orientação e principalmente, pelo

exemplo de competência, simplicidade e generosidade em todo o período de

convivência.

Aos professores Doutores, Fábio Pinto, Rosilene Oliveira, José Olímpio de

Souza Júnior pelos auxílios nas análises dos experimentos. Ao professor Luis Alberto pelo apoio e amizade e aos funcionários, Adelino e

Roberto, pelos auxílios prestados na condução do experimento.

Aos professores doutores e amigos, Alba Chaves, Cristina Oliveira, Fábio Flores e Jane Lima pela amizade, conselhos e pelos momentos maravilhosos de descontração.

À Emilly Feijó e Lais Almeida, pelos auxílios, companheirismo, amizade e por

toda dedicação na condução do experimento.

À minha querida AMIGA Patricia. Muito obrigada pela ajuda, carinho,

conselhos e parceria. Sem você essa longa caminhada e muitos outros momentos da minha vida seriam mais difíceis.

Aos amigos, Ana Paula, Caroline, Elionai, James, Kamila, Gilmara, Ivanildes,

Lucas, Marcela, Stella e Vanda, pela amizade, incentivos e por momentos

maravilhosos de descontração.

Ao amigo Alberto por todo carinho e companheirismo. À colega Vânia pela amizade e auxílios nas análises estatísticas.

À Gisele Rocha (UEFS) pela amizade e contribuição nas análises de

microscopia eletrônica de varredura. Aos colegas e amigos do Centro de Microscopia Eletrônica, Ana Carolina,

Augusto, Carol, Célia, Cristian, D.Jaci, Diego, Laíze, Lane, Lidiane, Lucinéia, Luiza,

Martielly, Mary, Ricardo e Verônica pela convivência e amizade.

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DE LITERATURA

FIGURA 01 A espécie Ocimum gratissimum L., conhecida popularmente como alfavaca- cravo.

18

FIGURA 02 Fotomicrografia do tricoma glandular capitado (A) e

eletromicrografia de varredura do tricoma glandular peltado (B) observados na folha de Ocimum gratissimum. Barra = 20 µm.

20

CAPÍTULO I FIGURA 01 Curso diurno da radiação fotossinteticamente ativa (RFA)

a pleno sol e nos diferentes ambientes de atenuação da radiação luminosa. T1 = 20; T2 = 11; T3 = 7,4 e T4 = 4 mol m-2 d-1. Ilhéus-BA, 23 de outubro de 2010.

43

FIGURA 02 Variáveis de crescimento de plantas de Ocimum

gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA). Biomassa seca de raiz (BSR) (A), biomassa seca de caule (BSC) (B) biomassa seca de folhas (BSF) (C), biomassa seca de inflorescências (BSI) (D), biomassa seca total (BST) (E) e razão raiz: parte aérea (R:PA) (F) **Significativo P ≤ 0,01, *Significativo P ≤ 0,05 , teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média (n=10).

45

FIGURA 03 Variáveis de crescimento de plantas de plantas de

Ocimum gratissimum em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA). Altura das plantas (ALT) (A), Número de folhas (NF) (B) (Número de folhas), área foliar (AF) (C), massa foliar específica (MFE) (D), taxa de crescimento relativo (TCR) (E), taxa assimilatória líquida (TAL) (F) **Significativo P ≤ 0,01, *Significativo P ≤ 0,05, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média (n=10).

46

FIGURA 04 Eletromicrografias de varredura das superfícies adaxial (A, C, E, G) e abaxial (B, D, F, H) de folhas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de RFA: A e B = 4; C e D = 7,4; E e F = 11; G e H = 20 (mol m-2 d-

1) TT = tricoma tector; TGP= tricoma glandular peltado; TGC = tricoma glandular capitado Barra = 40 µm.

47

FIGURA 05 Densidade de tricoma tector (mm-2) (A) e tricoma peltado

(mm-2) (B) nas duas faces foliares de Ocimum gratissimum, cultivada em diferentes ambientes de RFA. FACE ADA = face adaxial; FACE ABA= face abaxial **Significativo P ≤ 0,01, *Significativo P ≤ 0,05, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=20.

48

FIGURA 06 Teor (%) e rendimento (g planta -1) do óleo essencial em

folhas secas de plantas de Ocimum gratissimum, cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA). **Significativo P≤ 0,01, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=4.

49

CAPÍTULO II FIGURA 01 Secções transversais da região mediana de folhas de O.

gratissimum, submetidas a (A) 4,0 (B) 7,4 (C) 11 e (D) 20 (mol m-²d-¹) EAD= epiderme da face adaxial, EAB = epiderme da face abaxial, PP= parênquima paliçádico, PE=parênquima esponjoso. Escala: 20 µm.

66

FIGURA 02 Espessura dos tecidos foliares (µm): limbo foliar (LF) ŷ =

2,3166x** + 95,0513**(R2 = 0,91),parênquima esponjoso (PE) ŷ = 1,0204x** + 41,6116** (R2 = 0,57), parênquima paliçádico (PP) ŷ= 1,1524**x + 27,2346** (R2 = 0,99); epiderme da face adaxial (EAD) ŷ = 0,1699**x + 14,5135* (R2 = 0,82); epiderme da face abaxial (EAB) ŷ = 11,18; em folhas de plantas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) ** Significativo P≤ 0,01, * Significativo P≤ 0,05, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=40.

68

FIGURA 03 Número de cloroplasto por célula de parênquima paliçádico (A) e tamanho do cloroplasto em (µm2) (B), em plantas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) **Significativo P ≤ 0,01, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=20.

69

FIGURA 04 Número de grãos de amido por cloroplasto (A) e tamanho

do grão de amido (µm2) (B), em plantas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA),*Significativo P ≤ 0.05, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=20.

70

FIGURA 05 Eletromicrografias de transmissão (MET) mostrando

cloroplastos e grãos de amido nas células do parênquima paliçádico de lâminas foliares de O. gratissimum, cultivada em diferentes ambientes de RFA (A) 4,0 (B) 7,4 (C) 11 e (D) 20 (mol m-2d-1). Barra= 2 um.

71

FIGURA 06 Detalhe do empilhamento dos tilacóides (T) nos

cloroplastos das células do parênquima paliçádico das folhas de Ocimum. gratissimum, cultivadas em diferentes intensidades de RFA: (A) 4 (B) 7,4 (C) 11 e (D) 20 mol m-

2d-1. Barra= 2 um

72

FIGURA 07 Teor de pigmentos cloroplastídicos (mg dm-2): clorofila

total (ChlT) .ŷ = -0,0086**x2 + 0,1805**x + 6,2536** (R2 = 0,94); clorofila a (Chl a) ŷ = -0,0045**x2 + 0,0946**x+4,1617** (R²=0,94); clorofila b (Chl b) ŷ = - 0,0041**x2+0,0865*x + 2,0902** (R²=0,93); razão clorofila a/b (a/b) ŷ = 0,0013**x2 - 0,0289**x + 1,9826 ** (R2=0,95); carotenóides (Carot) ŷ = -0,0020**x2+ 0,0422*x + 0,9137** (R2=0,93) em folhas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes intensidades de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) ** Significativo P≤ 0,01 teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=40.

73

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I

TABELA 1 Porcentagem de radiação luminosa de cada ambiente em relação à condição de pleno sol (%) e médias diárias da radiação fotossinteticamente ativa (RFA) registrada no período de 07/10/10 a 06/01/11 na condição de pleno sol e nos quatro ambientes de atenuação da radiação luminosa.

40

TABELA 2 Percentagem relativa dos constituintes do óleo essencial

em plantas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA).

50

SUMÁRIO

RESUMO

xiii

ABSTRACT

xiv

1 INTRODUÇÃO 15

2 REVISÃO DE LITERATURA 17

2.1 A espécie Ocimum gratissimum 17

2.2 Óleo essencial 18

2.3 Fatores que interferem na biossíntese dos óleos essenciais 20

2.4 Crescimento e desenvolvimento de plantas em diferentes intensidades de radiação luminosa 21

2.5 Alterações morfológicas e micromorfólogicas da folha em diferentes níveis de radiação luminosa 23

2.6 Efeitos das diferentes intensidades de radiação luminosa nas características anatômicas e ultra-estruturais da lâmina foliar 24

2.7 Efeitos da radiação luminosa no teor de pigmentos cloroplastídicos 25

2.8 Referências 27

3 CAPÍTULO I - Crescimento das plantas, micromorfologia foliar e produção do óleo essencial de Ocimum gratissimum em diferentes ambientes de radiação luminosa 35

3.1 INTRODUÇÃO 37

3.2 MATERIAL E MÉTODOS 39

3.2.1 Material vegetal e condições de cultivo 39

3.2.2 Avaliação do crescimento 40

3.2.2 Micromorfologia foliar 40

3.2.3 Teor, rendimento e composição química do óleo essencial 41

3.2.4 Análise estatística 42

3.3 RESULTADOS 42

3.3.1 Intensidade da radiação fotossinteticamente ativa (RFA) 42

3.3.2 Avaliação do crescimento das plantas 43

3.3.3 Micromorfologia foliar 47

3.3.4 Teor, rendimento e composição química do óleo essencial 49

3.4 DISCUSSÃO 50 3.5 CONCLUSÕES 54 3.6 REFERÊNCIAS 54 4 CAPÍTULO II - Anatomia e ultra-estrutura foliar e teor de

pigmentos cloroplastídicos em plantas de Ocimum gratissimum submetidas a diferentes ambientes de radiação luminosa 60

4.1 INTRODUÇÃO 62

4.2 MATERIAL E MÉTODOS 63

4.2.1 Material vegetal e condições de cultivo 63

4.2.2 Estudo anatômico 64

4.2.3 Análise ultraestrutural 64

4.2.4 Teor de pigmentos cloroplastídicos 65

4.2.5 Análise estatística 65

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 66

4.4 CONCLUSÕES 73

4.5 REFERÊNCIAS 74

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS 78

xiii

CRESCIMENTO, PRODUÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL E ANATOMIA FOLIAR DE Ocimum gratissimum L. (LAMIACEAE) EM DIFERENTES NÍVEIS DE RADIAÇÃO

LUMINOSA

RESUMO

Ocimum gratissimum L. (Lamiaceae), conhecida popularmente como alfavaca-cravo é uma planta medicinal e aromática utilizada na medicina popular. Seu óleo essencial é rico em eugenol, com propriedades antibactericida, antifúngica e antioxidante comprovadas. Diversos fatores abióticos, como a intensidade de radiação luminosa, podem alterar o crescimento das plantas e a produção de metabólitos secundários. Dessa forma, foi realizado um estudo para investigar a influência de quatro ambientes de radiação luminosa (20; 11; 7,4 e 4 mol m-2 d-1) no crescimento das plantas, produção do óleo essencial e pigmentos cloroplastídicos, além de um estudo anatômico e ultra-estrutural da lâmina foliar de plantas de O. gratissimum. Verificou-se que a produção de biomassa de raiz, caule, folha e inflorescência, a razão raiz:parte aérea, a taxa de crescimento relativo, a taxa assimilatória liquída e massa foliar específica aumentaram linearmente com incremento da radiação luminosa. No entanto, a biomassa seca de caule, o número de folhas e a área foliar, apresentaram ajustes quadráticos. Em relação à produção de pigmentos cloroplastídicos, observou-se uma pequena redução, com o aumento da radiação luminosa incidente, com exceção da razão clorofila a/b. O teor de óleo essencial manteve-se constante, porém verificou-se aumento do rendimento e variações nos componentes minoritários do óleo essencial. Apesar disso, o eugenol, foi o componente majoritário do óleo essencial em todos os tratamentos. Ocorreu um acréscimo da densidade de tricomas tectores e nos glandulares do tipo peltado com o aumento da radiação luminosa. Alterações na anatomia foliar também foram verificadas, observando-se um aumento no espessamento dos tecidos, com exceção da epiderme da face adaxial que se manteve constante, com o incremento da disponibilidade de radiação luminosa. Em relação aos aspectos ultra-estruturais, ocorreu um aumento do número de cloroplasto por célula do parênquima paliçádico, assim como do tamanho dos cloroplastos e dos grãos de amido, apesar da quantidade média de grãos de amido presentes nos cloroplastos não ter variado em função da intensidade de radiação luminosa. Verificou-se um aumento do empilhamento dos tilacóides com a redução da intensidade de radiação luminosa. Os resultados demonstraram que os ambientes de radiação luminosa influenciaram no crescimento em altura e produção de biomassa das plantas, no rendimento e composição química do óleo essencial e nos aspectos anatômicos, micromorfológicos e ultra-estruturais da lâmina foliar de Ocimum gratissimum.

Palavras-chave: eugenol, RFA, sombreamento.

xiv

GROWTH, ESSENTIAL OIL PRODUCTION AND LEAF ANATOMY OF Ocimum

gratissimum L. (LAMIACEAE) AT DIFFERENT LIGHT LEVELS

ABSTRACT

Ocimum gratissimum (L.), popularly known as Alfavaca-cravo is an aromatic and medicinal plant widely used in folk medicine. Essential oil from this species is rich in eugenol, a substance with antibacterial, antifungal and antioxidant proven properties. Several abiotic factors such as light radiation intensity, can affect the cultivation of medicinal plants. Thus, a study was conducted to investigate the influence of four light radiation environments (20, 11, 7.4 e 4.0 mol m-2 d-1) on plant growth, essential oil production and photosynthetic pigments. In addition, we performed anatomical and ultrastructural study on leaf blade of O. gratissimim plants. It was found that biomass production of root, stem, leaves and inflorescence, the root:shoot ratio, relative grown rate, net assimilation rate and specific leaf mass increased linearly with increasing light radiation intensity. However, stem dry biomass, leaf number and leaf area showed quadratic fits. Results in chloroplastide pigment production showed a downward trend, with increasing incident light radiation, except for the chlorophyll a/b ratio, which increase with increased light radiation. The essential oil content remained constant, but there was an increase in the yield and in the variations in the minor components of the oil. Nevertheless, eugenol, was the major component of the essential oil in all treatments. There was an increase in density of the non-glandular trichomes and in the peltate glandular trichomes with the increase of light radiation. Changes in leaf anatomy were also verified by observing a greater thickening of the tissues, except for adaxial epidermis, with the increase of the light radiation intensity. In relation to ultrastructural features, we detected the same trend of increased number of chloroplast per cell of the palisade parenchyma, as well as the size of chloroplast and starch grains, although the average amount of starch grains present in chloroplast didn’t change under light radiation intensity variation. There was an increase in thylakoids stacking by reducing the light radiation intensity. The results showed that the environments of light radiation influenced on the height growth and biomass production of plants, yield and chemical composition of essential oil, and on leaf blade anatomical, micromorphological and ultrastructural aspects of Ocimum gratissimum.

Keywords: eugenol, PAR, shading.

15

1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais no tratamento de diversas doenças é uma prática

bastante comum, principalmente em países subdesenvolvidos, onde a população

possui menor poder aquisitivo para consumir medicamentos industrializados.

(MARTINS et al., 1994). O Ministério da Saúde tem inclusive incentivado o uso deste

recurso, através da criação de uma relação de plantas medicinais de interesse ao

Sistema Único de saúde - RENISUS. Trata-se de uma lista que orienta os estudos e

pesquisas no Brasil para subsidiar a elaboração de fitoterápicos que deverão ser

disponibilizados para uso da população. A finalidade da RENISUS é contribuir para o

desenvolvimento de toda cadeia produtiva, desde a regulamentação, cultivo/manejo,

produção, comercialização até a dispensação de plantas medicinais e fitoterápicos

(NASCIMENTO JUNIOR, 2009).

Nas últimas décadas tem ocorrido um aumento no consumo de fitoterápicos

em todo mundo. No ano de 1999, os mercados Europeus e dos Estados Unidos,

atingiram cerca de US$ 7 bilhões e 5 bilhões, respectivamente e, dessa forma, têm

atraído o interesse de grandes empresas de fitoterápicos (CALIXTO, 2000). A

comercialização de plantas medicinais no Brasil, com base em estimativas de venda

de indústrias, envolve um valor aproximado de 800 milhões de dólares, despertando

assim o interesse dos produtores rurais no cultivo de plantas medicinais e

aromáticas (CORRÊA JÚNIOR et al., 2006). Dessa forma, espera-se que o Brasil

possa avançar significativamente no mercado de fitoterápicos, em razão da grande

biodiversidade da sua flora (YUNES et al., 2001).

As propriedades medicinais das plantas vêm sendo exploradas pelos

pesquisadores brasileiros e, mais recentemente, pela indústria farmacêutica,

interessada em desenvolver novos medicamentos. Estima-se que de 30% dos

medicamentos disponíveis para a terapêutica, são derivados das plantas (CALIXTO;

SIQUEIRA, 2008).

As plantas medicinais produzem princípios ativos, que lhe conferem uma ação

terapêutica tais como: alcalóides, mucilagem, flavonóides, taninos e óleos

16

essenciais, sendo que aquelas que produzem óleos essenciais, com teor superior a

1%, são denominadas de aromáticas (CASTRO et al., 2004; SIMÕES; SPITZER,

2000). A utilização em diversas indústrias, dentre elas, a farmacêutica, cosmética e

química têm incentivado no crescente cultivo das plantas aromáticas (SANGWAN et

al., 2001).

Diversos fatores abióticos como temperatura, sazonalidade, nutrição,

disponibilidade hídrica e a intensidade de radiação luminosa podem influenciar no

crescimento e desenvolvimento das plantas (LARCHER, 2000; PAEZ et al., 2000)

bem como na produção e composição química dos óleos essenciais (CORRÊA

JÚNIOR; SCHEFFER, 2009; GOBBONETO; LOPES, 2007; LIMA et al., 2003).

Dessa forma, o estabelecimento de técnicas de manejo, como a adequação do nível

de luminosidade para uma espécie, pode favorecer o crescimento e

desenvolvimento das plantas e maximizar a produção dos princípios ativos. Além

disso, os estudos micromorfológico, anatômico e ultra-estrutural da lâmina foliar

podem contribuir, fornecendo dados sobre a plasticidade da espécie em função de

diferentes intensidades de radiação luminosa, que podem ser úteis para o

estabelecimento de condições ideais de cultivo.

A espécie Ocimum gratissimum L., (Lamiaceae) conhecida popularmente

como alfavaca, alfavacão ou alfavaca-cravo é utilizada na medicina popular

brasileira na cura de diversas doenças por isso foi incluída na relação de plantas

medicinais de interesse ao SUS. Apesar das comprovações científicas das suas

propriedades terapêuticas, ainda são escassas pesquisas sobre técnicas de cultivo.

Dessa forma, o presente estudo tem por objetivo avaliar a influência da intensidade

de radiação luminosa no crescimento das plantas, na produção do óleo essencial e

no teor de pigmentos cloroplastídicos, bem como nos aspectos micromorfológicos,

anatômicos e ultra-estruturais da lâmina foliar.

17

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A espécie Ocimum gratissimum

A família Lamiaceae destaca-se pela grande quantidade de espécies

aromáticas, dentre elas: alfavaca (Ocimum basilicum L.), orégano (Origanum vulgare

L.), alecrim (Rosmarinus offinalis L.), tomilho (Thymus vulgaris L.) e hortelã-da-folha-

grossa (Plectranthus barbatus Andrews), com utilização na medicina popular

(LORENZI; MATOS, 2008) e nas indústrias farmacêutica, química e cosmética

(SIMÕES; SPITZER, 2000). A mesma possui distribuição cosmopolita, incluindo

cerca de 7.500 espécies, agrupadas em 130 gêneros. No Brasil ocorrem 26 gêneros

e cerca de 350 espécies (LORENZI; MATOS, 2008), dentre as quais se destacam

Plectranthus, Salvia, Mentha e Ocimum (LORENZI; SOUZA, 2008).

O gênero Ocimum contém aproximadamente 30 espécies nativas dos trópicos

e subtrópicos (VIEIRA; SIMON, 2000) ricas em óleos essenciais para produção de

fármacos, perfumes e cosméticos (SIMON et al., 1990). As espécies deste gênero

são cultivadas com freqüência na Europa e América, mas também são adaptadas às

condições edafoclimáticas do Brasil. A espécie Ocimum gratissimum L. (Lamiaceae),

conhecida popularmente como alfavaca, alfavacão ou alfavaca-cravo é um

subarbusto aromático, com até um metro de altura, originário do Oriente e

subespontâneo em todo território brasileiro. Suas folhas apresentam formato

ovalado-lanceolado, de bordos dentados com cerca de 4-8 cm de comprimento e

possuem pequenas flores dispostas em racemos paniculados (Figura 1). A espécie

é utilizada na medicina popular na cura de diversas doenças além de ser utilizada

como condimento na culinária (LORENZI; MATOS 2008). Seu óleo essencial é rico

em eugenol (CORTEZ et al., 1998; SARTORATTO et al.,2004) e estudos têm

comprovado sua eficácia contra diversos microorganismos patogênicos, como

Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Botryosphaeria

rhodina, dentre outros (FARIA et al., 2006; NAKAMURA et al., 1999; MATASYOH et

al., 2007).

18

Figura 1- A espécie Ocimum gratissimum L., conhecida popularmente como alfavaca- cravo.

2.2 Óleo essencial

O metabolismo primário fornece moléculas que são utilizadas como

precursoras nas principais rotas da biossíntese dos metabólitos secundários.

Através da fotossíntese, as plantas utilizam a energia solar para a produção de

compostos orgânicos que servem como precursores dos metabólitos secundários

(CASTRO et al., 2004). Entre os diversos metabólitos produzidos pode-se destacar

os alcalóides, flavonóides, mucilagens, taninos, glicosídeos cardiotônicos e os óleos

essenciais (SIMÕES; SPITZER, 2004; TAIZ; ZEIGER, 2006).

Os óleos voláteis, como também podem ser chamados, são produtos obtidos

através da destilação por arraste de vapor d’água ou por prensagem dos pericarpos

de frutos cítricos. São geralmente misturas complexas de substâncias voláteis,

lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. Diferem dos óleos fixos que são

misturas de substâncias lipídicas obtidas normalmente de sementes. As

denominações de óleos essenciais, óleos etéreos ou essência estão relacionadas

19

com a presença de algumas características físico-químicas, como a de serem

líquidos de aparência oleosa à temperatura ambiente, contudo sua principal

característica, consiste na volatilidade (SIMÕES; SPITZER, 2004). Os monoterpenos

e os sesquiterpenos são os principais constituintes dos óleos essenciais e são

originados de rotas diferentes do metabolismo primário (TAIZ; ZEIGER, 2006).

Os óleos voláteis extraídos das plantas aromáticas são sintetizados,

armazenados e liberados para o ambiente por uma variedade de estruturas

secretoras especializadas, tais como células oleíferas (Lauraceae, Piperaceae,

Poaceae), canais secretores (Apiaceae), bolsas lisígenas ou esquizolisígenas

(Pianaceae, Rutaceae) e tricomas glandulares (Lamiaceae). Os óleos essenciais

podem ser armazenados em diversos órgãos, tais como: flores, folhas, nas cascas

de caules, raízes, frutos e sementes. No entanto, tem sido verificado que a

composição química pode variar segundo a sua localização (SIMÕES; SPITZER,

2004; SVOBODA; SVOBODA, 2000).

A produção de óleos essenciais está diretamente relacionada com as funções

ecológicas da planta, tais como proteção contra predadores e atração de

polinizadores (EVERT; EICHORN, 2006; SVOBODA; SVOBODA, 2000). Além disso,

os óleos essenciais podem ser utilizados no controle de fitopatógenos em diversas

espécies de plantas cultivadas (DINIZ, 2008; NASCIMENTO et al., 2008; SILVA,

2007).

Segundo Fahn (1979), os óleos essenciais na família Lamiaceae são

sintetizados e armazenados em dois tipos de tricomas glandulares: peltado e

capitado. Os tricomas do tipo peltado apresentam uma célula basal, um pedúnculo

ou haste curto e uma cabeça composta por um disco de várias células secretoras

dispostas em uma camada. Já os tricomas capitados são constituídos de uma célula

basal, uma ou mais células no pescoço e uma cabeça uni ou bicelular. Os tricomas

capitados secretam uma pequena quantidade de óleo essencial e uma variedade de

polissacarídeos (WERKER, 1993), enquanto os tricomas peltados se diferenciam

pelo número maior de células apicais e são responsáveis pela maior produção dos

óleos essenciais (TURNER et al., 2000).

Os tricomas podem estar localizados em órgãos vegetativos e reprodutivos de

algumas espécies e muitos já foram estudados quanto à sua composição química e

morfologia (ASCENSÃO; PAIS, 1998; CORSI; BOTTEGA, 1999; SERRATO-

VALENTI et al., 1997). A folha da espécie Ocimum gratissimum possui tricoma

20

glandular capitado com cabeça bicelular e tricoma glandular peltado com quatro

células secretoras (Figura 2).

Os tricomas também podem ser utilizados na farmacognosia para

identificação correta de espécies vegetais, em caso de suspeita de adulteração

(SVOBODA; SVOBODA, 2000).

Figura 2- Fotomicrografia do tricoma glandular capitado (A) e eletromicrografia de varredura do tricoma glandular peltado (B) observados na folha de Ocimum gratissimum. Barra = 20 µm. 2.3 Fatores que interferem na biossíntese dos óleos essenciais

Apesar da composição química do óleo essencial ser determinada

geneticamente, diversos fatores abióticos tais como: luz, temperatura, sazonalidade,

nutrição e disponibilidade hídrica podem modificar significativamente a produção

dos metabólitos secundários. Os estímulos ambientais podem alterar as rotas

metabólicas de produção destes compostos, ocasionando a biossíntese de

diferentes compostos (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; LIMA et al., 2003).

Além de fatores ambientais, os tratos culturais e as condições de cultivo,

podem ser responsáveis por grandes variações nos constituintes do óleo essencial

(COSTA et al., 2008; FIGUEIREDO et al., 2006; MAPELI et al., 2005). A qualidade,

intensidade e duração da luz podem alterar o teor, rendimento e composição

química do óleo essencial, dependendo da espécie. O teor de óleo essencial em

Salvia officinais L. cultivada a pleno sol, foi reduzido quando comparado às plantas

cultivadas sob o sombreamento, enquanto o tomilho (Thymus vulgaris L.)

21

apresentou maior teor de óleo essencial nas plantas mantidas a pleno sol ( LI et al.,

1996). Em três espécies de Mentha foram verificadas alterações significativas na

composição química do óleo essencial das plantas sob diferentes regimes de luz

(FAROOQI et al., 1999). Hyptis marrubioides, cultivada sob diferentes níveis de

irradiância, apresentaram maior rendimento de óleo essencial nas plantas cultivadas

na maior intensidade de radiação luminosa (SALES et al., 2009).

2.4 Crescimento e desenvolvimento de plantas em diferentes intensidades de radiação luminosa

A intensidade de radiação luminosa atua no crescimento e desenvolvimento

vegetal, pois está relacionada diretamente aos processos fisiológicos, bioquímicos,

morfológicos e histológicos (LARCHER, 2000; TAIZ; ZEIGER, 2006). A aclimatação

das plantas em determinado ambiente depende de alterações complexas entre as

características morfológicas, anatômicas e fisiológicas, a fim de maximizar o ganho

de carbono (CLAUSSEN, 1996; GIVNISH, 1988; VALLADARES, NIINEMETS; 2008).

Segundo Morelli e Robertti (2000), as respostas das plantas à intensidade de

radiação luminosa são diversas, sendo o estímulo de crescimento em altura, uma

das respostas mais rápidas ao sombreamento. As espécies medicinais Tanacetum

parthenium e Bacharis trimera apresentaram maior crescimento em altura nos

tratamentos sombreados (SILVA et al., 2006; CARVALHO et al., 2006).

Diversas variáveis de crescimento podem ser alteradas de acordo com a

intensidade de radiação luminosa disponível, dentre elas, destacam-se: i) alocação

de biomassa seca na raiz, caule, folha e inflorescência, ii) área foliar, iii) biomassa

seca total, iv) razão raiz: parte aérea ( MIYAZAWA et al., 2006; MIRRALLES et al.,

2011; SOUZA et al., 2004). Além disso, verificam-se alterações na taxa de

crescimento relativo, taxa assimilatória liquída e massa foliar específica (LIMA et al.,

2010; SANCHES et al., 2009). A intensidade de radiação luminosa influencia a

produção de biomassa seca da planta e, dessa forma, exerce um papel importante

no crescimento vegetal. Na espécie medicinal Ocimum basilicum ocorreu uma

redução significativa da produção de biomassa seca total nos tratamentos com

menores níveis de radiação luminosa (CHANG et al., 2008).

22

Diversas variáveis podem ser utilizadas para avaliar a adaptação das plantas

a diferentes condições ambientais, e a taxa de crescimento relativo (TCR) é um

indicativo que representa o incremento em biomassa a partir da biomassa pré-

existente (HUNT, 1990). As espécies medicinais Schinus terebinthifolius e Gallesia

integrifolia apresentaram reduções na TCR, com o aumento do sombreamento

(FEIJÓ et al., 2009).

Em relação à alocação de biomassa para os diferentes órgãos das plantas,

verifica-se que sob baixa intensidade de radiação luminosa, a maioria das espécies

tende a aumentar a absorção de luz, alocando mais biomassa para as folhas do que

para raízes, proporcionando, dessa forma, uma maior captação de radiação

luminosa (GIVINISH, 1988).

A área foliar é uma característica muito utilizada na avaliação da adaptação

das plantas à radiação luminosa, sendo relatada com um índice de produtividade

(BENINCASA, 2003). Em geral, verifica-se um incremento da área foliar em plantas

cultivadas em níveis reduzidos de radiação, proporcionando um aumento da

superfície fotossintética, contribuindo para uma absorção mais eficiente da radiação

disponível (LARCHER, 2000). Na espécie medicinal Glycyrrhiza uralensis, ocorreu

um aumento da área foliar com a redução da intensidade de radiação luminosa

(HOU et al., 2010 ).

A taxa assimilatória liquída (TAL) é outro índice utilizado nos estudos de

análise de crescimento e, segundo Benincasa (2003), representa a taxa de

fotossíntese líquida, matéria seca produzida por unidade de área foliar. No estudo

realizado por Nakazono et al. (2001), para avaliar o crescimento inicial de Euterpe

edulis em diferentes regimes de luz, verificou-se uma maior taxa assimilatória

líquida, nas plantas submetidas ao tratamento de maior intensidade de radiação

luminosa. Resultado similar foi encontrado por Duz et al., (2004) no estudo realizado

com três espécies arbóreas, em resposta à variação na quantidade de luz,

constatou-se um aumento na taxa assimilatória líquida da espécie Cecropia glazioui

Sneth, com o incremento da intensidade de radiação luminosa.

Em relação à alocação de biomassa da raiz:parte aérea verifica-se que

plantas de ambientes sombreados apresentam menores valores, em relação às

plantas que se desenvolvem em ambientes com maior disponibilidade de radiação

luminosa. De acordo com Válio (2001), quando mudas de Trema micrantha foram

submetidas ao sombreamento, a alocação de biomassa para folhas aumentou com

23

redução simultânea da biomassa seca para raiz. Segundo Claussen, (1996) a razão

raiz: parte aérea é um importante parâmetro para avaliar a aclimatação de mudas à

intensidade de radiação luminosa.

2.5 Alterações morfológicas e micromorfólogicas da folha em diferentes níveis

de radiação luminosa

As plantas normalmente apresentam uma ampla plasticidade fenotípica em

resposta a diferentes regimes de radiação luminosa (VALLADARES et al., 2000).

Segundo Larcher (2000), a adaptação fenotípica às condições de radiação do

ambiente ocorre principalmente durante a diferenciação do órgão assimilador. Dessa

forma, verificam-se alterações bioquímicas, morfológicas, histológicas e

ultraestruturais. A folha é o principal órgão fotossintetizante e, geralmente, apresenta

plasticidade fenotípica em decorrência da disponibilidade de radiação luminosa para

manutenção de um balanço positivo de carbono (VALLADARES; NIINEMETS, 2008;

SANCHES et al., 2009). A luz pode alterar o desenvolvimento, o tamanho e a

espessura das folhas, aquelas que crescem sob altas intensidades luminosas - as

chamadas folhas de sol – são menores e mais espessas do que as folhas que

crescem sob baixas intensidades luminosas (LARCHER, 2000).

A massa foliar específica, razão entre a biomassa da folha e sua área, tem

sido utilizada como parâmetro indicador no estudo da adaptação das plantas a

diferentes condições ambientais e o seu aumento está diretamente relacionado com

o espessamento da folha (BOEGER; WISNIEWSKI, 2003).

Em condições de sombreamento, verifica-se também um aumento da área

foliar e conseqüentemente uma diminuição da espessura foliar. Isto ocorre em

função do consumo de fotoassimilados durante a expansão da área foliar. As

alterações mencionadas proporcionam uma captação mais eficiente da radiação

luminosa e aumentam a eficiência fotossintética da planta (FAHL et al.,

1994;LAMBERS et al., 2008). Na espécie Pothomorphe umbellata foi verificado um

aumento da área foliar em plantas submetidas ao sombreamento (MATTANA et al.,

2006).

24

O estudo da micromorfologia foliar pode ser uma importante ferramenta para

determinar o tipo de estrutura secretora responsável pela produção e

armazenamento do óleo essencial (ASCENSÃO; PAIS, 1998; CORSI; BOTTEGA,

1999), além de indicar a capacidade de produção de óleos essenciais nas espécies

aromáticas (DESCHAMPS et al., 2006). A intensidade de radiação luminosa pode

alterar de forma significativa a densidade destas estruturas (COSTA et al., 2010).

Nas espécies medicinais Mikania glomerulada e Vitex megalopotamica, ocorreu uma

redução da densidade de tricomas com o aumento do sombreamento (BOEGER et

al., 2009), assim como na espécie Lippia citriodora (GOMES et al., 2009). Os

resultados encontrados sugerem que quando a radiação luminosa é reduzida, ocorre

um decréscimo no número de tricomas, podendo refletir em uma redução no teor de

óleo essencial (GOMES et al., 2009).

2.6 Efeitos das diferentes intensidades de radiação luminosa nas

características anatômicas e ultra-estruturais da lâmina foliar

A intensidade de radiação luminosa pode alterar significativamente a

anatomia e ultra-estrutura foliar constituindo um aspecto decisivo de aclimatação das

espécies a diferentes condições ambientais (HANBA et al., 2002; KIERZKOWSKI et

al., 2007; LLICHTENTHALER et al., 1981). Segundo Cutter, (1986) por manter

contato direto com o ambiente, a epiderme pode ser alterada, em decorrência de

vários fatores ambientais. A espessura da epiderme das faces adaxial e abaxial de

Cupania vernalis, apresentaram redução com o sombreamento (LIMA JÚNIOR et al.,

2006). No entanto, MIRRALIS et al (2011) não encontraram diferenças significativas

na espessura das epidermes de Rhamnus alaternus em condições de

sombreamento.

As alterações ocasionadas no mesofilo, principalmente no parênquima

paliçádico, garantem a absorção uniforme da radiação luminosa do ambiente (TAIZ;

ZEIGER, 2006). De acordo com Larcher (2000), o aumento da intensidade de

radiação luminosa proporciona um aumento na espessura foliar devido o

alongamento e/ou adição de células do parênquima paliçádico. Pode-se verificar

alterações na densidade estomática, índice estomático, densidade de tricomas e

25

tamanho dos espaços intercelulares (CASTRO et al., 2007., HANBA et al., 2002;

POMPELLI et al., 2010).

Alguns estudos com espécies medicinais evidenciam plasticidade anatômica

foliar decorrente do efeito da intensidade de radiação luminosa. Plantas de Mikania

glomerata Sprengel (Asteraceae) submetidas a diferentes níveis de luz,

apresentaram um aumento da espessura do limbo foliar em condições de pleno sol

(CASTRO et al., 2007), o que foi observado também para a espécie Aloysia

gratissima (PINTO et al., 2007). Além das alterações nos tecidos fotossintetizantes

do mesofilo, ocorrem mudanças no número dos cloroplastos e no seu tamanho. A

redução do número de cloroplastos por área foliar, em folhas de sombra pode estar

relacionada à redução da espessura do mesofilo (LAMBERS et al., 2008).

A ultra-estrutura dos cloroplastos também pode ser afetada pela intensidade

de radiação luminosa do ambiente. Folhas de plantas mantidas sob sombreamento

intenso apresentam maior empilhamento dos tilacóides. Dessa forma, o granum é

maior e mais desenvolvido do que nas folhas encontradas sob pleno sol (LUTTIGE,

1997; SCHULZE et al., 2005), favorecendo a produção de clorofila (LAMBERS et al.,

2008). Verificam-se ainda alterações no tamanho dos cloroplastos, no acúmulo de

grãos de amido, bem como no número de cloroplastos por célula do parênquima

paliçádico (GOMES et al., 2008; KIERZKOWSKI et al., 2008; LICHTENTHALER et

al., 1981).

2.7 Efeitos da radiação luminosa no teor de pigmentos cloroplastídicos

Os pigmentos cloroplastídicos estão correlacionados com a eficiência

fotossintética das plantas e, conseqüentemente, são essenciais para o crescimento

vegetal, além de estarem relacionados com a adaptação das plantas a diversos

ambientes (ENGEL; POGGIANI, 1991).

A intensidade e qualidade da luz incidente podem causar alterações na

concentração total dos pigmentos, no teor da clorofila a e b e também na razão entre

as clorofilas a/b (ATROCH et al., 2001; SCALON et al., 2003; OLIVEIRA et al.,

2009). Na maioria das vezes, verifica-se que a razão clorofilas a/b, tende a diminuir

26

com a redução da radiação luminosa, devido a uma maior proporção relativa de

clorofila b em ambientes sombreados (GIVINISH, 1988; LUTTIGE, 1997).

As folhas que crescem em ambientes sombreados apresentam maior teor de

clorofila, especialmente a clorofila b, por unidade de peso e volume foliar, porém

apresentam menor teor de clorofila por unidade de área foliar (BJÖRKMAN et al.,

1972). O aumento do tamanho do cloroplasto e da quantidade de clorofila em folhas

sombreadas, compensam a redução do número de cloroplastos por unidade de área

foliar (BOARDMAN, 1977). Além disso, verifica-se que folhas de sombra

apresentam maior quantidade de grana nos cloroplasto, proporcionando uma maior

produção de clorofila (LAMBERS et al., 2008). A variação da concentração total dos

pigmentos fotossintéticos, bem como a proporção entre os mesmos, em função da

intensidade de radiação luminosa, proporciona uma maior absorção da luz sob baixa

irradiância (BORDMAN, 1977; CARVALHO et al., 2006; VALLADARES;

NIINEMETS., 2008).

As plantas que crescem em ambientes com sombreamento intenso

apresentam alterações que levam a maximizar a captura de luz, como aumento na

proporção de clorofila b em relação à clorofila a que é uma resposta adaptativa que

possibilita a captação de energia de outros comprimentos de onda e transferência

para uma molécula específica de clorofila a, que efetivamente participa das reações

fotoquímicas da fotossíntese (TAIZ ; ZEIGER, 2006).

Croton urucurana cultivada sob diferentes níveis de sombreamento,

apresentou maiores teores de clorofila nos níveis mais elevados de sombreamento

(ALVARENGA et al., 2003), como também foi verificado com Cryptocaria

aschersoniana (Almeida et al.,2004). Na espécie Eugenia uniflora também ocorreu

alteração no teor de clorofila a, clorofila b e clorofila total em plantas submetidas a

diferentes intensidades de radiação luminosa (MIELKE et al., 2010).

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35

3. CAPÍTULO I - CRESCIMENTO DAS PLANTAS, MICROMORFOLOGIA FOLIAR E PRODUÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Ocimum gratissimum L. EM

DIFERENTES AMBIENTES DE RADIAÇÃO LUMINOSA

RESUMO

A intensidade de radiação luminosa pode alterar o crescimento e

desenvolvimento das plantas e a produção do óleo essencial em espécies

aromáticas. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito de quatro ambientes de

radiação luminosa (20; 11; 7,4 e 4 mol m-2 d-1) no crescimento, micromorfologia

foliar, teor, rendimento e composição química do óleo essencial de plantas de

Ocimum gratissimum. Avaliou-se a produção de biomassa seca de raiz, caule,

folhas, inflorescências e a área foliar no início e no final do experimento. A partir dos

dados estimou-se a massa foliar específica, a taxa de crescimento e taxa

assimilatória liquida. A produção de biomassa dos diferentes órgãos, a razão

raiz/parte aérea, as taxas de crescimento relativo e assimilatória liquída e a massa

foliar específica aumentaram linearmente com incremento da intensidade de

radiação luminosa enquanto a biomassa seca de caule, o número de folhas, a área

foliar e a altura das plantas apresentaram ajustes quadráticos. Verificou-se um

acréscimo da densidade de tricomas tectores e glandulares peltados com o aumento

da radiação luminosa. O teor de óleo essencial manteve-se constante, porém

verificou-se aumento do rendimento e variações nos componentes minoritários do

óleo essencial. O componente majoritário do óleo essencial de O. gratissimum foi o

eugenol, independente do nível de radiação luminosa. Conclui-se que apesar do

aumento da intensidade de radiação luminosa favorecer o acúmulo de biomassa das

plantas e a densidade de tricomas glandulares peltados nas folhas, não ocorreu

alteração no teor de óleo essencial, apenas no rendimento e pequenas modificações

na sua composição química.

Palavras-chave: eugenol, planta medicinal, RFA.

36

3. CHAPTER I- PLANT GROWTH, LEAF MICROMORPHOLOGY AND ESSENTIAL OIL PRODUCTION OF Ocimum gratissimum L. UNDER DIFFERENT LIGHT RADIATION ENVIRONMENTS

ABSTRACT

Light radiation intensity can modify plant growth, development and production

of essential oil in aromatic species. The aim of this research was verify the effect of

four light radiation environments in the growth, leaf micromorphology, and

concentration and composition of Ocimum gratissimum plants oil. We evaluated the

root, branches, leaves, inflorescences and total dry biomass production the

beginning and end of the experiment, and with these values it was estimated the

specific leaf mass, growth rate and net assimilatory rate. Biomass production in the

different organs, the root:shoot ratio, relative growth rate, net assimilatory rate and

specific leaf mass increased linearly in response to increase in light radiation

intensity while the branches dry biomass, number of leaves and leaf area showed a

quadratic fit. The light radiation reduction promoted an increase in plants height and

leaf area. There was an increase in density of glandular trichomes and peltate with

the increase of light radiation. The essential oil content remained constant, but there

was an increase in the yield variations and minor components of the oil. The major

component of O. gratissimum essential oil was eugenol, independent of the light

radiation level. We conclude that despite the increase in the intensity of light

radiation favor the accumulation of plant biomass and density of peltate glandular

trichomes on the leaves, no change in essential oil content, only on your income

and small changes in their chemical composition.

Keywords: eugenol, medicinal plant, PAR.

37

3.1 INTRODUÇÃO

A radiação luminosa é um fator fundamental ao crescimento e

desenvolvimento vegetal, pois está relacionada diretamente aos processos

fisiológicos, bioquímicos e morfológicos (ASTOLFI et al., 2001; LÜTTIGE, 1997;

PAEZ et al., 2010). Geralmente, plantas cultivadas sob baixa intensidade de

radiação luminosa, apresentam uma redução significativa na produção de biomassa,

podendo ser observadas alterações na alocação de biomassa para os diferentes

órgãos (CLAUSSEN, 1996; HOU et al., 2010; SILVA et al., 2006).

A folha é o principal órgão fotossintetizante e, geralmente, apresenta

plasticidade fenotípica em decorrência da radiação luminosa para manutenção de

um balanço positivo de carbono (VALLADARES; NIINEMETS, 2008; SANCHES et

al., 2009). Dessa forma, verifica-se um aumento da área foliar em plantas cultivadas

sob baixa intensidade de radiação luminosa, proporcionando uma maior captação da

radiação incidente (CARVALHO et al., 2006; KIM et al., 2011).

Os óleos essenciais das espécies da Lamiaceae são produzidos e

armazenados em tricomas glandulares peltados e capitados (GERSBACH, 2002;

HUANG et al., 2008). Os tricomas glandulares capitados podem secretar uma

pequena quantidade de óleo essencial e uma variedade de polissacarídeos

(WERKER, 1993), enquanto os tricomas glandulares peltados são responsáveis pela

maior produção dos óleos essenciais, pois apresentam um maior número de células

apicais, geralmente variando de duas a dezesseis células, onde são sintetizados e

armazenados os óleos essenciais (CORSI ; BOTTEGA, 1999; TURNER et al., 2000;

SERRATO- VALENTI et al., 1997).

A densidade de tricomas glandulares pode ser alterada em função da

disponibilidade de radiação luminosa incidente (COSTA et al., 2010) . O estudo da

densidade destas estruturas pode ser um indicativo da capacidade de produção de

óleos essenciais nas espécies aromáticas. Na espécie Lippia citriodora, ocorreu uma

redução significativa na densidade de tricomas glandulares, no tratamento de menor

intensidade de radiação luminosa (GOMES et al., 2009).

38

A produção dos metabólitos secundários, dentre estes os óleos essenciais,

também pode ser afetada, pois o carbono fixado na fotossíntese é um importante

componente para a produção de diversos compostos (PAEZ et al., 2000; SANGWAN

et al., 2001). Plantas de Ocimum basilicum apresentaram reduções significativas no

conteúdo do óleo essencial e alterações na composição química com a diminuição

da radiação luminosa (CHANG et al., 2010). Na espécie Ocimum selloi, cultivada sob

telas coloridas, ocorreu um maior rendimento do óleo essencial e maior

porcentagem de methil chavicol, componente majoritário do óleo essencial, no

cultivo das plantas ao pleno sol (COSTA et al., (2010).

A espécie Ocimum gratissimum L., (Lamiaceae) conhecida popularmente

como alfavaca, alfavacão ou alfavaca-cravo é utilizada na medicina popular

brasileira na cura de diversas doenças e por isso foi incluída na relação de plantas

de interesse ao Sistema Único de Saúde - RENISUS. As espécies pertencentes ao

gênero Ocimum caracterizam-se por serem ricas em óleos essenciais para produção

de fármacos, perfumes e cosméticos (SIMON et al.,1990) e O. gratissimum possui o

eugenol como componente majoritário (CORTEZ et al., 1998; SARTORATTO et al.,

2004). Diversos estudos têm comprovado as propriedades antibactericida (Matasyoh

et al., 2007; Nakamura et al., 1999) antifúngica (Faria et al., 2006, Lemos et al.,

2005) antioxidante e hipoglicêmica do extrato e do óleo essencial (Aguiyi, 2000;

Pereira et al., 2007; Trevisan et al., 2006). Além disso, o óleo essencial tem sido

utilizado no controle de fitopatógenos (Rodrigues et al., 2006).

O conhecimento da condição ideal de luminosidade pode favorecer o

crescimento e desenvolvimento das plantas e contribuir para o aumento da produção

de óleo essencial. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos dos

diferentes ambientes de radiação luminosa no crescimento das plantas, nos

aspectos da micromorfologia foliar, no teor, rendimento e composição química do

óleo essencial de Ocimum gratissimum.

39

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

3.2.1 Material vegetal e condições de cultivo

Para a produção de mudas foi realizada a propagação vegetativa por meio de

estacas de caule basais com aproximadamente dez centímetros de comprimento

obtidas de uma planta matriz do Horto de plantas medicinais da Universidade

Estadual de Santa Cruz (UESC). Uma exsicata do material está deposita no herbário

da HUESC sob o número 14.427. Após o enraizamento, as mudas foram

transplantadas para vasos contendo 10 L de substrato na proporção 3:1:1

(solo:esterco:areia) e submetidas a quatro ambientes de radiação luminosa ( T1, T2,

T3 e T4) obtidos pela cobertura com telas pretas. T1 correspondeu às condições

naturais de radiação luminosa do viveiro que mede 15 m x 20 m coberto por tela

que proporciona 25 % de atenuação da radiação luminosa e dentro do qual foram

colocadas três estruturas individuais (4,3 x 1,6 x 1,2 m) também cobertas com telas

pretas de (25, 50 e 75% de atenuação da radiação luminosa), constituindo os

ambientes T 2, T3 e T4, respectivamente.

Durante todo o período de execução do experimento (07/10/10 a 06/01/11), a

radiação fotossinteticamente ativa (RFA) foi monitorada no exterior do viveiro (pleno

sol) e em cada ambiente por meio de sensores de radiação luminosa S-LIA-M003,

acoplados a uma estação climatológica Hobo Micro Station Data Logger (Onset

Computer, Massachusetts,USA) e programados para realizarem leituras em

intervalos de um minuto armazenando uma leitura a cada dez minutos. A

porcentagem da radiação luminosa dos ambientes em relação à condição de pleno

sol foi calculada, assim como médias diárias de cada ambiente que representam os

quatro tratamentos de radiação luminosa aos quais as plantas foram submetidas.

(Tabela 1).

40

Tabela 1- Porcentagem de radiação luminosa de cada ambiente em relação à condição de pleno sol (%) e médias diárias da radiação fotossinteticamente ativa (RFA) registrada no período de 07/10/10 a 06/01/11 na condição de pleno sol e nos quatro ambientes de atenuação da radiação luminosa

Ambientes da radiação

luminosa

RFA (mol-2 d-1)

% Pleno sol Mínima Máxima Média

Pleno sol 100 13,9 51,9 33,5

T1 59 7,1 31,1 20,0

T2 33 3,8 17,8 11,0

T3 21 2,6 12,2 7,4

T4 12 1,4 6,7 4,0

3.2.2 Avaliação do crescimento

Variáveis de crescimento foram avaliadas, em dez plantas por tratamento, no

início (04/10/10) e no final do experimento (05/01/11). Foram avaliadas a biomassa

seca de raízes (BSR), caules (BSC), folhas (BSF) total (BST) e a área foliar (AF). A

biomassa seca foi obtida por meio de secagem em estufa de circulação forçada de

ar a 70 ºC, até atingir peso constante, a área foliar foi estimada por meio de um

medidor de área LI-3100 (Li-Cor, inc. Lincoln, Nebraska, USA) e a altura das plantas

foi estimada com auxílio de uma fita métrica. A partir dos dados de biomassa seca e

de área foliar foram calculadas a massa foliar específica (MFE = MSF/AF), a taxa de

crescimento relativo (TCR = lnMST2- lnMST1/T 2 - T1) e a taxa assimilátoria liquida

(TAL = [ ( MST2 – MST1) / (T2 – T1) ] x (ln AF2 – lnAF1) / (AF2 – AF1)]; segundo

Hunt (1990).

2.3 Micromorfologia foliar

O material foi fixado em glutaraldeído 2,5 % em tampão cacodilato de sódio

0,1 M, pH 6,9 por 4 h. Posteriormente, os fragmentos foram lavados em tampão

cacodilato de sódio (três vezes de 10 minutos) e pós-fixado com o tetróxido de

41

ósmio por 2 horas e lavados novamente no mesmo tampão ( três vezes de 10 min)

desidratado em série etanólica e levado à secagem até o ponto crítico em aparelho

modelo CPD030, marca BALZERS, e cobertos com uma camada de ouro de 30 nm

de espessura de ouro, utilizando o aparelho SPUTTER COATER, modelo SCD 050,

marca BALZERS. Posteriormente, foi observado em microscópio eletrônico de

varredura LEO 1430VP. Para avaliação da densidade de tricomas, foi retirado um

fragmento da região mediana de quatro folhas para cada tratamento. Em cada

fragmento, foram escolhidos aleatoriamente cinco campos de observação,

totalizando vinte campos por tratamento.

3.2.4 Teor, rendimento e composição química do óleo essencial

Utilizou-se o método de hidrodestilação em aparelho de Clevenger, utilizando-

se 50 g de biomassa seca de folhas em balão de 3L contendo 1,5L de água

destilada. Foram utilizadas quatro repetições para cada tratamento e o óleo

essencial foi separado do hidrolato usando diclorometano e em seguida seco com

sulfato de sódio anidro (em excesso) e concentrado. O teor foi determinado com

base no volume extraído de biomassa seca de folhas (% p/v) em balança analítica.

O rendimento foi obtido pela multiplicação calculado por meio do teor de óleo

essencial pelo valor médio da biomassa seca de folhas das plantas (g. planta-1).

A análise da composição química do óleo foi realizada no Laboratório de

Fisiologia Vegetal da UESC, por cromatografia gasosa, utilizando o aparelho Varian

Saturno 3800 equipado com detector de ionização de chama (FID), utilizando coluna

capilar de sílica fundida (30m X 0,25mm X 0,25µm) com fase estacionária VF5-ms

(0,25 µm de espessura de filme). O hélio foi utilizado como gás de arraste com fluxo

de 1,2 ml /min. As temperaturas do injetor e do detector foram de 250oC e de 280oC,

respectivamente. A temperatura da coluna no início da análise foi de 70oC, sendo

acrescida de 8oC/mim até 200oC seguido de aumento de 10oC ate 260oC, sendo

mantida nessa temperatura por 5 minutos. Foi injetado 1uL de solução do óleo a

10% em clorofórmio (CHCl3), na razão split 1:10.

A concentração dos constituintes dos óleos voláteis foi calculada através da

área da integral de seus respectivos picos, relacionadas com a área total de todos

42

os constituintes da amostra. As análises qualitativas dos óleos foram realizadas

usando-se um a um espectrômetro de massas Varian Chromopack 2000 MS/MS,

equipado com a mesma coluna capilar de sílica fundida. A temperatura do trap foi de

220o C e da transferline 250o C. O modo de operação foi impacto eletrônico a 70eV.

As programações de temperatura da coluna foram às mesmas usadas nas análises

de cromatografia a gás e os constituintes químicos dos óleos essenciais foram

identificados através da comparação computadorizada com a biblioteca do aparelho,

literatura e índice de retenção de Kovats (ADAMS, 1995). Os índices de retenção de

Kovats (IK) foram calculados através da injeção de uma série de padrões de n-

alcanos (C8-C26), injetados nas mesmas condições cromatográficas das amostras.

3.2.5 Análise estatística

Foi realizada a análise de variância considerando o delineamento

inteiramente casualizado. Para análise das variáveis de crescimento foram utilizadas

dez repetições, nas análises da micromorfologia foliar, teor e rendimento de óleo

essencial quatro repetições. Realizou-se a análise de regressão utilizando o

programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2008).

3.3 Resultados

3.3.1 Intensidade da radiação fotossinteticamente ativa (RFA)

O curso diário da RFA em um dia ensolarado para o ambiente a pleno sol e

nos tratamentos de intensidade de radiação luminosa, apresentaram valores

máximos entre 11:00 e 11:30 h, com picos correspondentes a 2.110, 1.319, 767,

514 e 277 µmol m-2 s-1 para o pleno sol, T1, T2, T3 e T 4, respectivamente (Figura

1). A RFA dos ambientes de atenuação da radiação luminosa T1, T2, T3 e T4

corresponderam a aproximadamente 59, 33, 21 e 12 %, respectivamente da

condição de pleno sol (Tabela 1). Não foram verificadas variações na temperatura

43

do ar nos ambientes de radiação luminosa em estudos realizados nas mesmas

condições (FEIJÓ et al., 2009; SANTOS et al., 2012). .

0

500

1000

1500

2000

2500

06:00 09:00 12:00 15:00 18:00

RFA

(µ

mo

l m-2

s-1)

HORA

Pleno sol T1 T2 T3 T4

Figura 1 - Curso diurno da radiação fotossinteticamente ativa (RFA) a pleno sol e nos diferentes ambientes de atenuação da radiação luminosa. T1 = 20; T2 = 11; T3 = 7,4 e T4 = 4 mol m-2 d-1. Ilhéus-BA, 23 de outubro de 2010.

3.3.2 Avaliação do Crescimento das plantas

As plantas de Ocimum gratissimum apresentaram alterações no crescimento

em relação aos ambientes de radiação luminosa. Ocorreu um aumento na produção

de biomassa seca da raiz (Figura 2 A), folhas (Figura 2 C), inflorescências (Figura 2

D) biomassa seca total (Figura 2 E) e da razão raiz : parte aérea ( Figura 2 F) com o

aumento da intensidade de radiação luminosa, seguindo uma tendência linear

crescente. A biomassa seca do caule apresentou um ajuste quadrático, com

44

produção máxima de 52,72 g a 14,8 mol m-2d-1 (Figura 2 B). A produção de

biomassa seca de inflorescências foi bastante reduzida nos tratamentos de 7,4 e 4

mol m-2 d-1 (Figura 2 D) e a altura das plantas apresentou uma resposta quadrática,

atingindo um valor máximo de 111,63 cm na intensidade de 9,58 mol m-2 d-1 (Figura

3 A).

A massa foliar específica (Figura 3B) e as taxas de crescimento relativo e

assimilatória líquida (Figuras 3 C e 3 D) apresentaram um comportamento linear

crescente com o aumento da intensidade de radiação luminosa. O número de folhas

e a área foliar apresentaram ajustes quadráticos com pontos de máxima estimados

em 1.090,4 e 9.264,6 cm2, nas intensidades de 16,71 e 12,24 mol m-2 d-1,

respectivamente (Figura 3E e 3F).

45

Figura 2- Variáveis de crescimento de plantas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA). Biomassa seca de raiz (BSR) (A), biomassa seca de caule (BSC) (B) biomassa seca de folhas (BSF) (C), biomassa seca de inflorescências (BSI) (D), biomassa seca total (BST) (E) e razão raiz: parte aérea (R:PA) (F) **Significativo P ≤ 0,01, *Significativo P ≤ 0,05 , teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média (n=10).

ŷ = 2,0832**x - 4,2755*R² = 0,98

0

10

20

30

40

50

BSR (g

)

A

ŷ = -0,2737**x2 + 8,1044**x - 7,2457*R² = 0,92

0

10

20

30

40

50

60

BSC (g)

B

ŷ = 1,6491**x + 13,4613**R² = 0,93

0

10

20

30

40

50

BSF (g

)

C

ŷ = 0,9278**x - 3,1491**R² = 0,94

0

5

10

15

20

BSI (g)

D

y = 5,9784**x + 30,2204**R² = 0,89

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 5 10 15 20 25

BST(g)

RFA (mol m-2 d-1)

E

ŷ = 0,0151*x + 0,0467*R² = 0,97

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0 5 10 15 20 25

R:PA

RFA ( mol m-2 d-1)

F

46

Figura 3- Variáveis de crescimento de plantas de plantas de Ocimum gratissimum em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA). Altura das plantas (ALT) (A), Número de folhas (NF) (B) (Número de folhas), área foliar (AF) (C), massa foliar específica (MFE) (D), taxa de crescimento relativo (TCR) (E), taxa assimilatória líquida (TAL) (F) **Significativo P ≤ 0,01, *Significativo P ≤ 0,05, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média (n=10).

ŷ = 0,0333**x + 0,1134**R² = 0,98

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

TAL (m

g cm

2d-1)

D

ŷ = -3,3310**x2 + 111,3787**x + 159,3792*R² = 0,96

0

200

400

600

800

1000

1200

0 5 10 15 20 25

N F

RFA ( mol m-2 d-1)

E ŷ = -30,4410**x2 + 745,7749**x + 4697.0055**R² = 0,89

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 5 10 15 20 25

AF (cm 2)

RFA (mol m-2 d-1)

F

ŷ = 0,7447**x + 34,7845**R² = 0,83

0

10

20

30

40

50

60

TCR (m

g g -1

d -1

)

C

ŷ = 2,2962**x + 13,9899**R² = 0,99

0

10

20

30

40

50

60

70

MFE (g

m -2)

Bŷ = -0,2876**x2 + 5,5157**x + 85,1954**

R² = 0,99

0

20

40

60

80

100

120

140

ALT

(cm)

A

47

3.3.3 Micromorfologia foliar

De forma geral, em todos os tratamentos foi possível observar a presença de

tricomas tectores pluricelulares, tricomas glandulares peltados com quatro células

secretoras na cabeça e tricomas capitados com cabeça bicelular nas duas faces da

folha de O.gratissimum (Figura 4).

Figura 4 - Eletromicrografias de varredura das superfícies adaxial (A, C, E, G) e abaxial (B, D, F, H) de folhas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de RFA: A e B = 4; C e D = 7,4; E e F = 11; G e H = 20 (mol m-2 d-1) TT = tricoma tector; TGP= tricoma glandular peltado; TGC = tricoma glandular capitado Barra = 40 µm.

48

y = -0,2789**x2 + 10.2639**x - 17,4887*R² = 0,92

ŷ= -0,7479**x2 + 22,8264**x - 31,3723*R² = 0,95

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Trico

ma tector (m

m-2 )

FACE ABA

FACE ADA

A

y = -0,2399**x2+ 7,9248**x-3,8543*R² = 0,97

ŷ = -0,1815**x2 + 5,7672**x + 18,1510*R² = 0,98

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25

Trico

ma p

eltado (mm -2)

RFA (mol m-2 d-1)

FACE ABA

FACE ADA

B

Não houve influência dos tratamentos na densidade de tricomas capitados, no

entanto, a densidade de tricomas tectores e tricomas peltados foi influenciada pela

intensidade de radiação luminosa (Figuras 5 A e 5 B), bem como pela posição na

folha. A densidade de tricomas tectores apresentou ajustes quadráticos, com valores

de 76, 94 tricomas mm-2 na face adaxial e 142, 78 tricomas mm-2 na face abaxial,

nas intensidades de 18,40 e 15,25 mol m-2 d-1, respectivamente. Na face abaxial,

foi possível observar uma maior densidade (Figura 5 A). A densidade de tricomas

peltados também apresentou um comportamento quadrático. Na face adaxial, foram

observados 61,58 e na face abaxial 63, 47 mm-2 tricomas glandulares peltados nas

intensidades de 16,51 e 15,71mol m-2 d-1, respectivamente (Figura 5B).

Figura 5 - Densidade de tricoma tector (mm-2) (A) e tricoma peltado (mm-2) (B) nas duas faces foliares de Ocimum gratissimum, cultivada em diferentes ambientes de RFA. FACE ADA = face adaxial; FACE ABA= face abaxial **Significativo P ≤ 0,01, *Significativo P ≤ 0,05, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=20.

49

3.3.4 Teor, rendimento e composição química do óleo essencial

Não foi verificado efeito significativo da intensidade de radiação luminosa

sobre o teor de óleo essencial de Ocimum gratissimum, sendo observado um valor

médio de 1,22%. No entanto, o rendimento de óleo por planta, foi significativamente

alterado (Figura 6). Foram identificados oito componentes, totalizando 99% da

composição química do óleo essencial (Tabela 2). O componente majoritário

eugenol, com teor médio de 91% manteve-se praticamente estável

independentemente do ambiente de radiação fotossinteticamente ativa. No óleo

essencial das plantas mantidas sob maiores intensidades de radiação luminosa (11

e 20 mol m-2 d-1), foram verificadas pequenas variações na composição química,

com a presença de três componentes (terpin-4-ol, β-bourboneno e o óxido de

cariofileno) que não foram identificados nos outros tratamentos.

Figura 6- Teor (%) e rendimento (g planta -1) do óleo essencial em folhas secas de plantas de Ocimum gratissimum, cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA). **Significativo P≤ 0,01, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=4.

ŷ = 0,0202**x + 0,1588**R² = 0,94

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 5 10 15 20 25

Ren

dim

ento (g

planta

-1)

Teo

r de óleo essen

cial (%)

RFA ( mol m-2 d-1)

Teor

Rendimento

ŷ= 1,2 (p>0,05)

50

Tabela 2 - Percentagem relativa dos constituintes do óleo essencial em plantas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA).

Componentes

RFA (mol m-2 d-1)

IK * 4 7,4 11 20

Percentagem relativa (%)

cis-ocimeno 1034 1,47 3,86 4,13 3,49

trans-4-tujanolou hidrato de cis-sabineno 1073 0,52 0,63 0,53 0,54

terpin-4-ol 1185 - - 0,43 0,64

eugenol 1358 91,97 91,66 89,76 90,70

β-bourboneno 1388 - - 0,43 0,43

E-cariofileno 1429 1,37 1,29 1,41 1,49

germancreno D 1486 3,92 2,56 2,83 2,22

óxido de cariofileno 1589 - - 0,41 0,49

Total identificado (%) 99,25 100 99,93 100

Ik *= índice de Kovats

3.4 DISCUSSÃO

A aclimatação das plantas em resposta às condições ambientais pode refletir

em mudanças fisiológicas, morfológicas, nas variáveis de crescimento e na

produção dos metabólitos secundários (CHANG et al.,2008 ; HOU et al., 2010;

SOUZA et al., 2004). Durante o período de realização do experimento verificou-se

que houve diferença, nos valores de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) para

os ambientes de radiação luminosa, os quais interferiram nas variáveis analisadas. A

maior produção de biomassa seca de raiz, folha e inflorescência foi obtida em

condições de maior radiação luminosa disponível. Na espécie medicinal Baccharis

trimera, ocorreu um aumento significativo na produção de biomassa seca da parte

51

aérea e da raiz, em condições de pleno sol (SILVA et al., 2006). A redução da

produção de biomassa seca de caule observada nos ambientes com maior

incidência da RFA sugere um desvio da alocação de carbono na planta para

produção de novos órgãos reprodutivos que aumentaram significativamente nestes

ambientes. A redução da radiação luminosa foi um fator limitante para a produção

de inflorescências, nos ambientes com menores níveis de RFA. O fotoperíodo, a

temperatura e a disponibilidade hídrica, também interferem no processo de floração

(BERNIE et al., 1993). Na espécie Vaccinium corymbosum também ocorreu uma

redução significativa na produção de flores nas plantas crescidas em ambiente de

sombra (Kim et al., 2011). O aumento da intensidade de radiação luminosa

favoreceu a produção de flores em plantas de seis espécies no gênero Kalanchoe

(CURREY; ERWIN, 2011) e na espécie Antirrhinum majus L. (MUNIR et al., 2004).

Não foi possível determinar o ponto de máxima produção de biomassa seca

total nos ambientes de radiação luminosa testados. A alteração no particionamento

de biomassa seca entre a raiz e a parte aérea é uma resposta comum das

plantas às mudanças na intensidade de radiação luminosa durante o crescimento

(MIELKE et al., 2010). O aumento da razão raiz:parte aérea em resposta ao

incremento da intensidade de radiação luminosa encontrada para O. gratissimum é

uma resposta de aclimatação que proporciona maior absorção de água e nutrientes,

estratégia que provavelmente permite que as plantas suportem as maiores taxas de

fotossíntese e transpiração (CLAUSSEN, 1996). Plantas de Euterpe edulis também

apresentaram maior razão raiz:parte aérea em condições de maior intensidade de

radiação luminosa (NAKAZONO et al., 2001).

Plantas de Ocimum gratissimum apresentaram maior crescimento em altura

nos ambientes com menor incidência da RFA. Segundo Morelli e Robertti, 2000, as

respostas das plantas à intensidade de radiação luminosa são diversas, sendo o

estímulo de crescimento em altura, uma das mais rápidas ao sombreamento. As

espécies medicinais Hyptis marrubioides (SALES et al.,2009), Baccharis trimera

(SILVA et al., 2006) e Aloe vera (PAEZ et al., 2000) também apresentaram maior

crescimento em altura, nos tratamentos sombreados. Quando as plantas são

submetidas ao sombreamento, a dominância apical aumenta, em virtude do

decréscimo de fotoassimilados e do maior teor de auxina no ápice caulinar

(VANNEST; FRIML, 2009). A tendência de aumento da massa foliar específica nos

tratamentos de maior intensidade de radiação fotossinteticamente ativa

52

possivelmente foi resultante do maior espessamento das folhas nestes tratamentos.

Segundo Lambers et al., (2008) folhas de sol apresentam maior espessura do que

folhas de sombra. A massa foliar específica, razão entre a massa da folha e sua

área, tem sido utilizada como parâmetro indicador da adaptação das plantas a

diferentes condições ambientais e o seu aumento, está diretamente relacionado com

o espessamento da folha (BOEGER; WISNIEWSKI, 2003).

O incremento na taxa de crescimento relativo observada em O. gratissimum

nos níveis crescentes de RFA sugere que ocorreu uma alteração na fisiologia da

planta, medida pela capacidade fotossintética em relação à área fotossintetizante, ou

seja, pelo aumento da taxa assimilatória líquida. Mudanças na morfologia da planta,

como o aumento da razão de área foliar, também podem alterar de forma

significativa a taxa de crescimento relativo. Segundo Hunt (1990) a taxa de

crescimento relativo (TCR) é um indicativo da adaptação das plantas a diferentes

condições ambientais, pelo fato de representar o incremento em biomassa a partir

da biomassa pré-existente. Nas espécies medicinais Gallesia integrifolia e Schinnus

terebinthifolius, foram verificadas aumentos significativos na TCR, com o acréscimo

dos níveis de luz (FEIJÓ et al., 2009) .

Houve uma tendência de aumento do número de folhas das plantas de O.

gratissimum e diminuição da área foliar com incremento da radiação luminosa.

Apesar de ser comum o aumento da área foliar em plantas cultivadas em níveis

reduzidos de radiação, proporcionando um aumento na superfície fotossintética e

contribuindo para uma absorção mais eficiente da radiação disponível (GIVINISH,

1988; LAMBERS et al., 2008), a maior área foliar de O. gratissimum foi observada

em torno de 12 mol m-2 d-1, sugerindo que intensidades de luz inferiores são

limitantes para a expansão foliar desta espécie. O aumento da área foliar com a

redução da intensidade luminosa foi observado nas espécies medicinais

Pothomorphe umbellata (Mattana et al., 2006) e Glycyrrhiza uralensis (HOU et al.,

2010).

O aumento da densidade de tricomas tectores de O. gratissimum com o

incremento da intensidade de radiação luminosa, principalmente na face abaxial,

pode ser uma estratégia adaptativa para reduzir a taxa de transpiração, aumentando

a reflexão da luz solar e diminuindo a temperatura da folha (EVERT; EICHORN,

2006). Comportamento semelhante foi observado nas folhas da espécie Elaeagnus

angustifolia coletadas em diferentes exposições de radiação luminosa na copa das

53

árvores, onde ocorreu um decréscimo na densidade de tricomas estrelados nas

folhas coletadas em condições de sombra (KLICH, 2000).

A maior densidade de tricomas glandulares encontrados nas duas faces

foliares de O. gratissimum com aumento da intensidade de radiação luminosa,

provavelmente está associada à menor área foliar nesta mesma condição. Nas

espécies aromáticas Lippia cidriodora (GOMES et al., 2009) e Ocimum selloi

(COSTA et al., 2010) também foi encontrada maior densidade de tricomas no cultivo

a pleno sol. O aumento da densidade das principais estruturas de secreção e

armazenamento de óleo essencial não refletiu no teor de óleo essencial de O.

gratissimum, possivelmente devido ao efeito de outros fatores externos como maior

temperatura ou menor umidade relativa do ar que podem ter contribuído para o

rompimento da cutícula, causando perdas de secreção (ASCENSÃO et al., 1995).

A ausência do efeito da intensidade luminosa sobre o teor de óleo essencial

também já foi verificado em plantas de Ocimum selloi, mantidas sob radiação solar

plena e sombreamento parcial (GONÇALVES et al., 2001) e em Aloysia gratissima

cultivada sob diferentes níveis de sombreamento (PINTO et al., 2007). No entanto ,

Souza et al., 2007, verificaram alterações no teor de óleo essencial de Lippia

sidoides cultivada em diferentes níveis de sombreamento. Resultado similar também

foi encontrado por Li et al.,(1996), onde o teor de óleo essencial em Salvia officinais

L. cultivada a pleno sol, foi reduzido quando comparado a plantas cultivadas sob

sombreamento. Logo, verifica-se que os efeitos da intensidade de radiação luminosa

sobre o teor de óleo essencial são variáveis conforme a espécie. Por outro lado, o

aumento significativo do rendimento de óleo essencial diante do incremento de

radiação luminosa, está diretamente relacionado ao aumento da produção de

biomassa foliar nestas mesmas condições, conforme também já foi observado em

Bacharis trimera (SILVA et al.,2006).

As pequenas alterações verificadas na composição química do óleo essencial

de O. gratissimum podem estar relacionadas tanto com a disponibilidade de

radiação luminosa quanto ao estádio de desenvolvimento das plantas, uma vez que

nos ambientes com maior RFA as plantas já se encontravam em fase reprodutiva e

plenamente floridas. A composição química dos óleos essenciais é determinada por

fatores genéticos, mas fatores ambientais podem causar alterações significativas na

produção de metabólitos secundários (GOBBO-NETO; LOPES; LIMA, 2003). Em O.

54

basilicum foram observadas maiores porcentagens de linalol e o eugenol nas plantas

submetidas a maior intensidade de radiação, enquanto o metileugenol, apresentou

maior teor no tratamento mais sombreado (CHANG et al., 2008). Além disso, a

composição química dos óleos essenciais também pode ser influenciada pela

fisiologia da planta e depende do seu estádio de desenvolvimento (SANGWAN et al.,

2001). Lippia verbenaceae em fase de desenvolvimento vegetativo e em estádio de

floração apresentou mudanças significativas na porcentagem de citral e limoneno,

componentes majoritários do seu óleo essencial, atribuída como uma estratégia

adaptativa para a defesa contra patógenos ou atração de insetos polinizadores

(ARGYROPOULOU et al., 2007). Alterações na composição química do óleo

essencial de plantas em diferentes estádios de desenvolvimento, também foram

encontradas para Hyptis suaveolens (OLIVEIRA et al., 2005), Artemisia annua

(MOHAMMADREZA,2008) e Laurus nobilis (MOHAMMADREZA, 2009).

3.5 CONCLUSÃO

A intensidade de radiação luminosa afetou o crescimento, a micromorfologia

foliar, o rendimento e a composição química do óleo essencial de O. gratissimum. O

aumento da intensidade de radiação luminosa causou um incremento da densidade

de tricomas glandulares e da produção de biomassa seca foliar, refletindo no

rendimento de óleo essencial sem alterar o seu teor. Apesar do eugenol manter-se

como componente majoritário em todos os ambientes, pequenas alterações nos

componentes minoritários foram atribuídas aos fatores ambientais e fisiológicos.

3.6 REFERÊNCIAS

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55

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4 CAPÍTULO II - ANATOMIA E ULTRA-ESTRUTURA FOLIAR E TEOR DE PIGMENTOS CLOROPLASTÍDICOS EM PLANTAS DE Ocimum gratissimum

SUBMETIDAS A DIFERENTES AMBIENTES DE RADIAÇÃO LUMINOSA

RESUMO

Espécies que possuem plasticidade fenotípica são aquelas capazes de

ajustar características fisiológicas, anatômicas e ultra-estruturais sob efeito de

alguns fatores ambientais como, por exemplo, a intensidade de radiação luminosa

incidente. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de quatro ambientes de

radiação luminosa (20; 11; 7,4 e 4 mol m-2 d-1) sobre a anatomia e ultra-estrutura

foliar, além do teor de pigmentos cloroplastídicos em Ocimum gratissimum L.. O

incremento da intensidade de radiação proporcionou um aumento linear no

espessamento dos tecidos foliares, com exceção da epiderme da face abaxial, que

não apresentou alteração. A mesma tendência de aumento foi verificada para o

número de cloroplasto por célula do parênquima paliçádico, bem como do tamanho

dos cloroplastos e dos grãos de amido, apesar da quantidade média de grãos de

amido presentes nos cloroplastos, não ter variado em função das intensidades de

radiação luminosa. Verificou-se aumento do empilhamento dos tilacóides com a

redução da intensidade de radiação luminosa. Além disso, ocorreram pequenas

alterações no teor de pigmentos cloroplastídicos. As variações encontradas no

espessamento dos tecidos foliares, bem como no número e tamanho de cloroplastos

e grãos de amido nas células do parênquima paliçádico, podem proporcionar uma

maior eficiência fotossintética e sugerem plasticidade fenotípica de Ocimum

gratissimum em função dos ambientes de radiação luminosa.

Palavras chave: planta medicinal, plasticidade fenotípica, RFA.

61

CHAPTER II- LEAF ANATOMY, ULTRA-STRUCTURE AND LEAF CHLOROPLASTIDE PIGMENT CONTENTS IN PLANTS OF Ocimum gratissimum

UNDER DIFFERENT LIGHT RADIATION ENVIRONMENTS

ABSTRACT

Phenotypic plasticity in plants refers to its ability to adjust physiological,

anatomical and ultrastructural features under influence of some environmental

factors such as, for example, incident light radiation intensity. The aim of this study

was to evaluate the influence of four light radiation environments (20, 11, 7.4 and 4

mol m-2 d-1) on the anatomy, ultrastructure and chloroplastide pigment contents of

Ocimum gratissimum L. leaves. The increase of the radiation intensity provided a

linear increase in the leaf tissues thickness, with exception of the abaxial epidermis,

which remained unchanged. The same trend was observed for increasing the

number of chloroplasts per cell of the palisade parenchyma, as well as the size of

chloroplasts and starch grains, although the average amount of starch grains present

in the chloroplasts didn’t change according to the intensities light radiation. An

increase of the stacking of thylakoids with reducing of light radiation intensity was

identified. In addition, there were subtle changes in chloroplastide pigment contents.

The variations found in the leaf tissue thickness, as well as the number and size of

chloroplasts and starch grains in the palisade parenchyma cells, may provide a

higher photosynthetic efficiency and suggest phenotypic plasticity of Ocimum

gratissimum as a function of light radiation environments.

Keywords: medicinal plant, phenotypic plasticity,PAR.

62

4.1 INTRODUÇÃO

A espécie Ocimum gratissimum, é um subarbusto aromático, pertencente à

família Lamiaceae e conhecida popularmente como alfavaca, alfavaca-cravo ou

alfavacão. É originária da Ásia e África do Sul e espontânea em todo o território

brasileiro e amplamente utilizada na medicina popular (LORENZI; MATOS 2008).

Possui óleo essencial rico em eugenol (CORTEZ et al., 1998; SARTORATTO et al.,

2004) com propriedades antibactericida (MATASYOH et al., 2007; NAKAMURA et

al., 1999) antifúngica (FARIA et al., 2006, LEMOS et al., 2005) e antioxidante

(PEREIRA; MAIA, 2007; TREVISAN et al., 2006) comprovadas.

A estrutura foliar pode ser alterada pela radiação luminosa durante o seu

desenvolvimento (VALLADARES; NIINEMETS, 2008) e, geralmente, são

observadas variações anatômicas e ultra-estruturais que constituem aspectos

decisivos de aclimatação ao ambiente (HANBA et al., 2002; LAMBERS et al., 2008;

OGUCHI et al., 2005). As folhas que crescem sob altas intensidades de radiação

luminosa, apresentam maior espessamento do limbo foliar, devido principalmente,

ao aumento da espessura do parênquima paliçádico (LARCHER, 2000; LAMBERS

et al., 2008). Bauhinia forficata e Maytenus ilicifora apresentaram maior espessura

do limbo foliar, quando cultivadas ao pleno sol (BOEGER et al., 2009). Além das

alterações nos tecidos fotossintetizantes do mesofilo, também podem ser verificadas

variações ultra-estruturais no tamanho dos cloroplastos e dos grãos de amidos e no

empilhamento dos tilacóides nos cloroplastos (LAMBERS et al., 2008;

KIERZKOWSKI et al.,2007).

O teor dos pigmentos cloroplastídicos também pode ser modificado, pois os

mesmos estão relacionados com a adaptação das plantas a diferentes intensidades

de radiação luminosa (GIVINISH, 1988; VALLADARES; NIINEMETS, 2008). Além

disso, estão correlacionados com a eficiência fotossintética das plantas e,

63

conseqüentemente, são essenciais para o crescimento vegetal (ENGEL; POGGIANI,

1991). A variação da concentração total dos pigmentos, bem como a proporção

entre os mesmos, em função da intensidade de radiação luminosa, permite uma

maior eficiência de absorção da luz sob baixa irradiância (BORDMAN, 1977; LIMA

et al., 2011; VALLADARES; NIINEMETS., 2008). Na maioria das vezes, verifica-se

que a razão clorofilas a/b, tende a diminuir com a redução da radiação luminosa,

devido a uma maior proporção relativa de clorofila b em ambientes sombreados

(LUTTIGE, 1997; OGUCHI et al., 2005; SCALON et al., 2003 ).

Estudos que relacionam características fisiológicas, anatômicas e ultra-

estruturais da lâmina foliar de espécies medicinais, podem fornecer subsídios para o

conhecimento das condições ideais de cultivo (BOEGER et al., 2009; MARTINS et

al., 2009). Neste estudo, objetivou-se avaliar o efeito de diferentes ambientes de

radiação luminosa sobre a anatomia e ultra- estrutura foliar e no teor de pigmentos

cloroplastídicos de O. gratissimum.

4.2 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.1 Material vegetal e condições de cultivo

Para a produção de mudas foi realizada a propagação vegetativa por meio de

estacas de caule basais com aproximadamente dez centímetros de comprimento

obtidas de uma planta matriz do Horto de plantas medicinais da Universidade

Estadual de Santa Cruz (UESC). Uma exsicata do material está deposita no herbário

da HUESC sob o número 14.427. Após o enraizamento, as mudas foram

transplantadas para vasos contendo 10 L de substrato na proporção 3:1:1

(solo:esterco:areia) e submetidas a quatro ambientes de radiação luminosa ( T1, T2,

T3 e T4) obtidos pela cobertura com telas pretas. T1 correspondeu às condições

naturais de radiação luminosa do viveiro que mede 15 m x 20 m coberto por tela

que proporciona 25 % de atenuação da radiação luminosa e dentro do qual foram

colocadas três estruturas individuais menores (4,3 x 1,6 x 1,2 m) também cobertas

64

com telas pretas de (25, 50 e 75% de atenuação da radiação luminosa), constituindo

os ambientes T 2, T3 e T4, respectivamente.

Durante todo o período de execução do experimento (07/10/10 a 06/01/11), a

radiação fotossinteticamente ativa (RFA) foi monitorada em cada ambiente por meio

de sensores de radiação luminosa S-LIA-M003, acoplados a uma estação

climatológica Hobo Micro Station Data Logger (Onset Computer,

Massachusetts,USA) e programados para realizarem leituras em intervalos de um

minuto armazenando uma leitura a cada dez minutos. As médias diárias da radiação

fotossinteticamente ativa registradas no período foram de 20; 11; 7,4 e 4 (mol m-2 d-

1) para os respectivos tratamentos.

4.2.2 Estudo anatômico

Foram coletadas folhas completamente expandidas do terceiro nó, do ápice

para a base, do eixo principal da planta. Foram utilizadas quatro repetições por

tratamento, perfazendo um total de 16 amostras. Porções da região mediana foliar

foram fixadas em glutaraldeído 2,5 % em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 6,9,

desidratadas em série etanólica crescente e embebidas com a resina Lr-white. O

material foi seccionado em ultramicrótomo, modelo Ultracut E Reichert-Jung,

obtendo-se secções transversais de 2 µm de espessura e coradas com azul de

toluidina a 1%. As análises e a documentação dos resultados foram realizadas em

microscópio fotônico, modelo DMI 3000 B. Para cada tratamento, foram observados

dez campos em cada repetição, totalizando quarenta observações e as variáveis

analisadas foram: espessura da epiderme da face adaxial (EPAD) e face abaxial

(EBAD), parênquimas paliçádico (PP) e esponjoso (PE) e o limbo foliar (LB),

utilizando o software Leica application suite V3.

4.2.3 Estudo Ultraestrutural

Porções da região mediana foliar foram fixadas em glutaraldeído 2,5% em

tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 6,9, pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1%,

65

desidratadas em série etanólica crescente e embebidas em resina Lr-white. Foram

obtidas seções ultra-finas de 70-90 nm, utilizando-se um ultramicrotomo Reichrt-

Jung, com navalha de diamante. Os cortes foram recolhidos em grades de cobre e

contrastados com acetato de uranila 5% por 15 min e citrato de chumbo por 20 min.

Em seguida, o material foi observado em microscópio eletrônico de transmissão

marca Philips, modelo Morgagni 260 D, à voltagem de aceleração a 80kV. Foram

utilizadas quatro repetições e avaliados cinco cloroplastos em cada fragmento de

folha, totalizando vinte observações para cada parâmetro analisado.

4.2.4 Teor de pigmentos cloroplastídicos

Foram realizadas leituras com o medidor portátil, SPAD (Konica, Minolta,

Japan) SPAD- 502 com dez repetições de cada tratamento ao final do experimento.

Com base nos valores do medidor portátil, foi possível estimar o teor de pigmentos

cloroplastídicos, utilizando equações previamente estabelecidas em ensaio de

calibração com quarenta repetições. Quatro discos foliares de 5mm de diâmetro

foram imersos solução de dimetilsulfóxido (DMSO) e colocados em banho-maria a

60 ºC por um período de 24 h para a extração total dos pigmentos. Utilizou-se um

espectrofotômetro de microplacas (VERSAmax) para obtenção das absorbâncias

das amostras, nos comprimentos de onda correspondentes a 480, 649 e 665 nm. A

determinação dos teores de clorofila a, b, clorofila total, razão clorofila a/b e

carotenóides foi calculada utilizando as equações propostas Wellburn (1994).

.2.5 Análise estatística

Foi realizada a análise de variância considerando o delineamento

inteiramente casualizado. Para análise das variáveis da anatomia e ultra-estrutura

foliar foram utilizadas quatro repetições e na quantificação dos pigmentos

fotossintéticos quarenta repetições. Realizou-se a análise de regressão utilizando o

programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2008).

66

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

De forma geral a epiderme foliar de O. gratissimum em seção transversal é

unisseriada, constituída por células retangulares, em ambas as faces e revestida por

uma cutícula delgada. A folha apresenta estômatos anomocíticos em ambas as

faces, sendo mais frequentes na face abaxial, caracterizando a folha como

anfihipoestomática. O mesofilo é do tipo dorsiventral, constituído por uma camada

de parênquima paliçádico e três a cinco camadas de parênquima esponjoso (Figura

1).

Figura 1- Secções transversais da região mediana de folhas de O. gratissimum, submetidas a (A) 4,0 (B) 7,4 (C) 11 e (D) 20 (mol m-²d-¹) EAD= epiderme da face adaxial, EAB = epiderme da face abaxial, PP= parênquima paliçádico, PE=parênquima esponjoso. Escala: 20 µm.

Apenas a espessura da epiderme da face adaxial de O. gratissimum

aumentou linearmente em relação à intensidade de radiação luminosa, enquanto a

epiderme da face abaxial manteve-se constante (Figura 2). Segundo Cutter (1986), o

contato direto da epiderme com o ambiente, pode provocar alterações em

decorrência de vários fatores ambientais, favorecendo uma distribuição mais

67

uniforme da luz no interior das folhas (VOLGELMAN; MARTIN, 1993). Em folhas de

Cupania vernalis (LIMA JÚNIOR et al., 2006) e de Aloysia gratissima (PINTO et al.,

2007), a espessura da epiderme de ambas as faces foi alterada sob diferentes

condições de sombreamento. Dessa forma, verifica-se que alterações nas

espessuras das epidermes em função da intensidade de radiação luminosa podem

variar conforme a espécie.

A tendência de espessamento do parênquima paliçádico de O. gratissimum

com o aumento da intensidade de radiação luminosa (Figura 2) foi resultante do

alongamento das células, sem afetar o número de camadas, como já foi relatado

para outras espécies como Alchornea triplinervia (ROÇAS et al., 1997) Brachiaria

decumbens cv. Basiliskem e Arachis pintoi cv. Amarillo (GOBBI et al., 2011).

Segundo Larcher (2000), o aumento na espessura da folha causado por maiores

níveis de luz pode ser tanto devido à adição de novas camadas de parênquima

paliçádico quanto pelo alongamento de células. O aumento da espessura da

camada de parênquima paliçádico pode contribuir para uma melhor eficiência

fotossintética (VOLGEMANN,1989).

A espessura do parênquima esponjoso também aumentou linearmente com o

incremento da intensidade de radiação luminosa (Figura 2). Resultado similar foi

observado na espécie Aloysia gratissima (Pinto et al., 2007). No entanto, Vogelmann

et al., (1996), reportam que folhas de sombra apresentam maior proporção de

parênquima esponjoso como estratégia adaptativa para proporcionar um maior

aproveitamento da luz, devido a sua maior dispersão interna. Esta estratégia

representa uma forma de aclimatação à fotossíntese em ambientes com baixa

disponibilidade de radiação luminosa (IVANOVA;P’YANKOV, 2002). As alterações

nos tecidos fotossintetizantes ainda propiciam uma distribuição uniforme de luz e

CO2 entre os cloroplastos (EVANS, 1999; VOLGEMANN et al., 1996).

A tendência de espessamento do limbo foliar de O. gratissimum, com o

aumento da intensidade de radiação luminosa (Figura 2) é função direta da soma

dos seus componentes que apresentaram mesma resposta (epiderme adaxial,

parênquima paliçádico e esponjoso). De forma geral, verifica-se que folhas de sol

possuem maior espessura de limbo foliar (SCHULZE et al., 2005). Em condições de

baixa intensidade de radiação luminosa, as plantas apresentam folhas menos

espessas, devido ao consumo de fotoassimilados para a expansão da área foliar

(FAHL et al., 1994). Em três espécies do gênero Acer (A. rufinerve, A. palmatumum

68

e A. mono) verificou-se um aumento da espessura do limbo foliar com o aumento da

intensidade de radiação luminosa (HANBA et al., 2002). A espessura foliar das

espécies Acer rufinerve, Betula ermanni e Fagus crenata também apresentou

maiores valores no tratamento submetido à maior irradiância (OGUCHI et al., 2005).

Resultados similares foram também encontrados nas espécies medicinais Vaccinium

corymbosum cv. Bluecrop (KIM et al., 1997) e Aloysia gratissima (PINTO et al.,

2007).

Figura 2 - Espessura dos tecidos foliares (µm): limbo foliar (LF) ŷ = 2,3166x** + 95,0513**(R2 = 0,91),parênquima esponjoso (PE) ŷ = 1,0204x** + 41,6116** (R2 = 0,57), parênquima paliçádico (PP) ŷ= 1,1524**x + 27,2346** (R2 = 0,99); epiderme da face daxial (EAD) ŷ = 0,1699**x + 14,5135* (R2 = 0,82); epiderme da face abaxial (EAB) ŷ = 11,18; em folhas de plantas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) ** Significativo P≤ 0,01, * Significativo P≤ 0,05, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=40.

Alterações ultra-estruturais também foram evidenciadas em função dos

tratamentos adotados. O número médio e o tamanho de cloroplastos nas células de

parênquima paliçádico aumentaram linearmente com o incremento da intensidade

de radiação luminosa, o que provavelmente está associado ao alongamento celular

deste tecido (Figuras 3 e 5).

69

y = 0,2833**x + 6,3597**R² = 0,94

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20 25

Tam

anho do cloroplasto (µm

2 )

RFA (mol m-2d-1)

B

ŷ = 0,4082**x + 9,3673**R² = 0,94

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25

Nº de cloroplasto/célula

A

Figura 3- Número de cloroplasto por célula de parênquima paliçádico (A) e tamanho do cloroplasto em (µm2) (B), em plantas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) **Significativo P ≤ 0,01, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=20.

Apesar de não ter ocorrido diferença significativa do número médio de grãos

de amido por cloroplasto das células do parênquima paliçádico de O. gratissimum,

verificou-se aumento linear do tamanho destas estruturas com o incremento da

radiação luminosa (Figuras 4 e 5). Nas espécies Calophyllum brasiliense (NERY et

al., 2007) e Coffea arabica (GOMES et al., 2008), também ocorreu um aumento do

tamanho dos cloroplastos em maiores intensidades de radiação luminosa, bem

como, o maior tamanho dos grãos de amido com o aumento da intensidade de

radiação luminosa, foi verificado nas espécies Fagus sylvatica (LICHTENTHALER et

70

y = 0,3288*x + 0,6176*R² = 0,98

0

2

4

6

8

0 5 10 15 20 25

Tam

anho do amido (µm

2)

RFA (mol m-2 d-1)

B

al., 1981) e Abies alba (KIERZKOWSK et al., 2007). Geralmente, grânulos de amido

grandes, estão associados com uma fotossíntese mais intensa nos cloroplastos de

plantas mantidas sob maiores intensidades de radiação luminosa (ROBAKOWSKI et

al., 2004).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 5 10 15 20 25

Nº de grãos de amido/ cloroplasto

ŷ = 1,29

A

Figura 4 - Número de grãos de amido por cloroplasto (A) e tamanho do grão de amido (µm2) (B), em plantas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes ambientes de radiação fotossinteticamente ativa (RFA),*Significativo P ≤ 0.05, teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=20.

71

Figura 5 - Eletromicrografias de transmissão (MET) mostrando cloroplastos e grãos de amido nas células do parênquima paliçádico de lâminas foliares de O. gratissimum, cultivada em diferentes ambientes de RFA (A) 4,0 (B) 7,4 (C) 11 e (D) 20 (mol m-2d-1). Barra= 2 um.

O empilhamento dos tilacóides nos cloroplastos de O. gratissimum,

aumentou com a redução da radiação luminosa (Figura 6). Em geral, verifica-se

maior empilhamento em níveis reduzidos de radiação luminosa. Dessa forma, o

granum é maior e mais desenvolvido do que nas folhas encontradas sob pleno sol

(LUTTIGE, 1997; SCHULZE et al., 2005) proporcionando uma maior produção de

clorofila em plantas sombreadas (LAMBERS et al., 2008). Resultados similares

foram encontrados nas espécies Fagus sylvatica (LICHTENTHALER et al., 1981) e

Abies alba (KIERZKOWSK et al., 2007).

72

Figura 6 - Detalhe do empilhamento dos tilacóides (T) nos cloroplastos das células do parênquima paliçádico das folhas de Ocimum. gratissimum, cultivadas em diferentes intensidades de RFA: (A) 4 (B) 7,4 (C) 11 e (D) 20 mol m-2d-1. Barra= 2 um

Os teores de pigmento cloroplastídicos apresentaram pequenas variações. Os

teores de clorofila a, clorofila b, clorofila total e carotenóides, apresentaram

comportamentos quadráticos, observando-se mínimas alterações com o aumento da

intensidade de radiação luminosa (Figura 6). Em relação à razão clorofila a/b, foi

observado um aumento, com incremento da intensidade de radiação luminosa.

Vários estudos evidenciam alterações significativas na concentração de clorofila a,

clorofila b e na razão de clorofila a/b com o aumento do sombreamento (ALMEIDA et

al., 2004; ALVARENGA et al., 2003; MIELKE et al., 2010). A maior produção de

clorofila, especialmente a clorofila b, bem como a redução da razão das clorofilas

73

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25

Teo

r (m

g dm-2)

RFA (mol m-2 d-1)

ChlT

Chl a

Chl b

a/b

Carot

a/b, são estratégias adaptativas para maior captação da radiação luminosa em

ambientes sombreados (LUTTIGE, 1998; LAMBERS, 2008; VALLADARES,

NIINEMETS 2009).

Figura 7- Teor de pigmentos cloroplastídicos (mg dm-2): clorofila total (ChlT) .ŷ = -0,0086**x2 + 0,1805**x + 6,2536** (R2 = 0,94); clorofila a (Chl a) ŷ = -0,0045**x2 + 0,0946**x+4,1617** (R²=0,94); clorofila b (Chl b) ŷ = - 0,0041**x2+0,0865*x + 2,0902** (R²=0,93); razão clorofila a/b (a/b) ŷ = 0,0013**x2 - 0,0289**x + 1,9826 ** (R2=0,95); carotenóides (Carot) ŷ = -0,0020**x2+ 0,0422*x + 0,9137** (R2=0,93) em folhas de Ocimum gratissimum cultivadas em diferentes intensidades de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) ** Significativo P≤ 0,01 teste t. Barras correspondem ao erro padrão da média, n=40. .

4.4 CONCLUSÃO

As alterações observadas no espessamento dos tecidos foliares, no número

de cloroplasto por célula de parênquima paliçádico e no tamanho dos cloroplastos e

grãos de amido, evidenciam que Ocimum gratissimum apresenta uma plasticidade

fenotípica anatômica e ultra-estrutural na lâmina foliar em decorrência da radiação

luminosa incidente.

74

4.5 REFERÊNCIAS

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78

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Com base nos resultados obtidos e nas condições que o experimento foi

realizado, pode-se afirmar que o aumento da radiação luminosa favoreceu uma

maior produção de biomassa das plantas e alterações morfológicas nas folhas que

proporcionaram um acréscimo da densidade de tricomas glandulares e da produção

de biomassa seca foliar, refletindo no maior rendimento de óleo essencial sem

alterar o seu teor. Portanto, o cultivo da espécie para extração do óleo essencial, em

ambientes com maiores intensidades de radiação luminosa pode aumentar sua

produtividade.

.