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Curso 4: Toxicogenômica e Genotoxicidade
GENOTOXICIDADE: Aplicação do Teste de Ames, Micronúcleos, Aberrações Cromossômicas e Cometa
em avaliações ocupacionais e ambientais
Dr. Juliana da Silva (ULBRA)
Dr. Miriana Machado (GENOTOX – Centro de Biotecnologia, UFRGS)
Porto Alegre, 27 de abril de 2014
2
Capacidade que algumas substâncias têm em
causar distúrbios da estrutura do genoma
(DNA) ou de sua função (expressão).
GENOTOXICIDADE
3
DNA
adaptado de Baylin & Schuebel, 2007
octâmero de histonas
H2A, H2B, H3, H4
células humanas
citosina, guanina, adenina, timina
4
AGENTES QUÍMICOS/
FÍSICOS
REPARAÇÃO
fiel
incorreta
MORTE CELULAR
± Metabolismo endógeno
MUTAÇÕES
5
Ghosal & Chen 2013
6
Importância do estudo das Mutações:
Mutações: se não ocorre morte celular, as células podem
proliferar e passar o gene mutado para as células filhas...
Mutações em células somáticas ou germinativas:
50 % abortos
30 % problemas de aprendizado
20 % defeitos congênitos
2 % infertilidade masculina
Câncer…
7
MUTAÇÃO
Mutação gênica
Alteração em um gene, tornando-se um alelo diferente. Podem
envolver substituição, adição ou perda de uma única base
Mutação cromossômica
mutações estruturais
Modificações maiores, alteração nos cromossomos. Mutações
estruturais ou numéricas
Leucemia mielóide crônica
Fibrose cística
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CÂNCER
GENOTOXICIDADE / MUTAÇÃO
9Adaptado de H. Ellinger-Ziegelbauer et al., 2009
EXPRESSÃO GÊNICA
ALTERADA
Reparação de DNA
Checkpoint
Ciclo celular Oncogenes
MUTAÇÃO
CÂNCER
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Antimetabólitos:5-FluorouracilAnálogos de folato
Alquilantes monofuncionais:TemozolomidaNitrosuréiasTrabectedina
Alquilantes bifuncionais:Mostarda nitrogenadaMitomicina CCisplatina
Inibidores da TopoisomeraseCampotencinaEtoposídeoDoxorrubicina
Inibidores da ReplicaçãoHidróxiuréiaAfidicolina
Radiomiméticos e agentes oxidativos:BleomicinaDoxorrubicina
Por outro lado…
GENOTOXICIDADE
Hurley, 2002, Chabner & Roberts Jr., 2005Reichert & Wenger, 2008, Helleday et al., 2008
CÂNCER
11
ENSAIOS DE
GENOTOXICIDADE
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- Predição do potencial carcinogênico de produtos para usohumano e/ou veterinário
BATERIA DE ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE:Segurança Toxicológica - Registro de Produtos
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- Avaliação dos efeitos da exposição ocupacional e ambiental
BATERIA DE ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE:Risco Ocupacional / Ambiental
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In vitro In vivo Assays for Gene Mutations Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames test, bactéria)
X
Escherichia coli reverse mutation assay (bacteria) X Gene mutation in mammalian cells in culture X Drosophila sex-linked recessive lethal assay (fruit fly) X Gene mutation in Saccharomyces cerevisiae (yeast) X Mouse Spot test X Assays for Chromosomal and Genomic Mutations In vitro cytogenetic assay (CHO/SHE/Human lymphocyte)
X
In vivo cytogenetic assay X Micronucleus test X Dominant lethal assay X Herutable translocation assay X Mammalian germ cell cytogenetic assay X Assays for DNA Effects DNA damage and repair: unscheduled DNA synthesis in vitro
X
Mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae (yeast)
X
In vitro sister chromatid exchange(SCE) assay X
PRINCIPAIS ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE
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Limitações de cada modelo...
(Jena et al., 2002)
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Ensaios de Genotoxicidade utilizados no Desenvolvimentode Produtos, Análises Ambientais e Ocupacionais
Ensaio Tipo de dano Medicamentos Cosméticos Agroquímicos Ambiente Ocupacional
Ames Mutação Gênica X X X X
Mouse Lymphoma
Mutação Gênica X* X
Aberrações Cromossômicas in vitro
Mutação Cromossômica X* X X
Micronúcleos in vitro
Mutação Cromossômica X* X X X
Micronúcleosin vivo
Mutação Cromossômica X X X
Cometa in vitro Quebras no DNA X X
Cometa in vivo Quebras no DNA X* X X
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Teste de Ames
- Mutagenicidade gênica – ensaio de mutação reversa
- Salmonella typhimurium: mutação no operon da histidina(his-)
2º mutação prototrófica para histidina (his+)
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Teste de Ames
- Produtos químicos
- Medicamentos
- Cosméticos
- Águas
- Sedimentos
- Lodos
- Efluentes
- Amostras atmosféricas
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Ativação Metabólica (S9 mix): utilizado em todos os experimentos in vitro
Aroclor 1254
Fração microssomal
S9S9-mix
20
Erro no quadro de leitura
Substituição de pares de bases
S. Typhimurium TA97a
S. Typhimurium TA98
S. Typhimurium TA100
S. Typhimurium TA102
S. Typhimurium TA1535
21
Resultado negativo: o nº de revertes/placa similar ao nº de revertentes espontâneos
Resultado positivo: Índice mutagênico (MI) 2
MI= nº rev./placa amostra
nº rev./ placa C-
22
Sorcerer – Contador Automático de Colônias
23
Ensaio Mouse Lymphoma
- Mutagenicidade gênica em células de mamífero em cultura
- Linhagem L5178Y tk+/-: heterozigota no locus TK1 (timidina cinase)
24
Ensaio Mouse Lymphoma
- A timidina cinase é uma enzima não essencial que recicla a timidina
que pode ser incorporada no DNA.
- Trifluorotimidina (TFT) é um análogo tóxico da timidina que quanto
incorporado no DNA no lugar da timidina, interfere no metabolismo do
DNA, sendo tóxico para a célula.
- Se a cópia funcional do gene TK é perdida por decorrência de
mutações, o TFT não é incorporado e as células conseguem sobreviver
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3 h treatmentwith or without S9-mix
L5178Y cells, 37 °C, 5% CO2
24 h, 37 °C
Ensaio Mouse Lymphoma
-TFT +TFT
Agar + medium
wash-out
2 days, 37 °C
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- Avaliação de quebras cromossômicas (mutações cromossômicas).
Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro
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Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro
Manual or automatedanalysis
KCl (75 mM) 20’, RT
3 or 4 h treatmentwith or without S9-mix
Colchicine, 1,5 h
V79 cells or lymphocytes, 1.5 x 105 cells/well
37 °C, 5% CO2
24 or 48 h, 37 °C
Fixation(2x, 5’)
Staining(2 % Giemsa, 5-8’) 24 h
Slide preparation
24 h
4 °C
24 h
4 °C
1,5-2 x cell cycle
37 °C
28
-Avaliação de divisão celular (viabilidade):
Índice Mitótico – quantificação de metáfases em 2000 células
Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro
Céluas de sangue periférico humano
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Avaliação de mutagenicidade:
Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro
- Contagem de cromossomos (46 ± 2 humanos)
- Quantificação de metáfases contendo cromossomos
aberrantes
(200 metáfases/grupo /doador)
30
Metáfase normal de sangue periférico humano
Metáfase aberrante de sangue periférico humano
31
Chinese hamster lung fibroblast (V79 cells)
Ensaio de Micronúcleos in vitro
- Avaliação de quebras cromossômicas (clastogênese) e aneugênese.
32Fenech, 2007
Ensaio de Micronúcleos in vitro
33
Ensaio de Micronúcleos in vitro
Manual or automatedanalysis
KCl (75 mM) 3’, 4 °C
3 h treatmentwith or without S9-mix
Cytochalasin B (3 µg/mL), 21 h
V79 cells, 1.5 x 105 cells/well
37 °C, 5% CO2
24 h, 37 °C
21 h treatmentwithout S9-mix and with Cytochalasin B, 37 °C
Fixation(2x, 5’)
Staining(2 % Giemsa, 5-8’) 24 h
Slide preparation
24 h
4 °C
24 h
4 °C
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Análise Manual:
• Viabilidade celular: contagem de células mononucleadas, binucleadas
(BN) e multinucleadas em 1000 células por cultura – Índice de
Replicação.
Índice de Replicação (IR %) = [(nº cél. BN) + (nº cél. multinucleadas x2)]/nº total de cél. analisadas (grupo tratamento) x 100[(nº cél. BN) + (nº cél. multinucleadas x2)]/nº total de cél. analisadas (controle negativo)
• Mutagenicidade: avaliação da presença de células
BN com micronúcleos (BNm) em no mínimo 1000
células BN por cultura.
Ensaio de Micronúcleos in vitro
35
Análise Automatizada
Pathfinder ScreenTox Cytometry System (IMSTAR, França).
Ensaio de Micronúcleos in vitro
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Análise Automatizada
• Captura de imagens em uma área pré-selecionada de cada lâmina;
• Identificação automatizada de células
mononucleadas, binucleadas e multinucleadas;
• Identificação automatizada de
micronúcleos em todas as
células;
• Validação das células BNm por
um técnico treinado;
Ensaio de Micronúcleos in vitro
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Análise Automatizada
• Viabilidade celular: contagem de células mononucleadas, binucleadas
(BN) e multinucleadas em no mínimo 1000 células por cultura – Índice
de Replicação.
• Mutagenicidade: avaliação da presença de células BN com
micronúcleos (BNm) em no mínimo 1000 células BN por cultura.
Ensaio de Micronúcleos in vitro
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- Avaliação de quebras simples, duplas e sítios álcali-lábeis.
- Danos recentes.
- Sensibilidade.
- Vários tipos celulares in vitro
- Vários tecidos in vivo
(sangue, fígado, pulmão etc).
Linfócito de sangue periférico
Sutherland e Costa, 2001
Células V79 (fibroblastos de pulmão de hasmter chinês)
Ensaio Cometa Alcalino in vitro
Hemócitos de Mexilhão Dourado (Villela et al., 2006)
(Azqueta & Collins, 2013)
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Neutralização
Eletroforese
(300 mA, 25V, 20 min)
Coloração (SYBR Gold)
Lise pH 10
Células+
Agarose LMP
Cultivo e tratamento das células
(3 h)
Preparo das
lâminas
PathFinderScreen Tox
Ensaio Cometa Alcalino in vitro
40
Análise no PathFinder (SYBR Green)
Classificação pelo conteúdo de DNA na cauda (% Tail DNA) e tipo de cauda (Olive Tail Moment)
41
Métodos Alternativos ao Uso de Animais de Experimentação – 3 R
(Replacement Reduction and Refinement)
Teste de Ames
Teste Mouse Lymphoma
Micronúcleos in vitro
Aberrações cromossômicas in vitro
Cometa
- Únicos considerados para registro de cosméticos
- Avaliação de vários endpoints no mesmo ensaio
(Toxicidade)
42(Goodsaid et al., 2010)
Futuro…
BATERIA DE ENSAIOS DE
GENOTOXICIDADE
TOXICOGENÔMICA
&
43
Normas de Referência:
OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS - Bacterial Reverse Mutation Test – 471/97
OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS - In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test – 473/97
OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS – Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test – 474/97
OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS - In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test – 476/97
OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS - In Vitro Micronucleus Test – 487/10
ICH Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1)
(2011)
DRAFT OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS – Rodent Alkaline single cell gel electrophoresis (Comet)
assay.
RESOLUÇÃO CONSEMA 129/2006
