CURSO PRÉ – CONGRESSO: Citometria de fluxo

DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS

Dr. João Carlos de Campos GuerraDepartamento de Patologia Clínica - HIAEDepartamento de Patologia Clínica - HIAE

Centro de Hematologia de São Paulo - CHSPCentro de Hematologia de São Paulo - CHSP

CLASSIFICAÇÃO “REAL”/ WHO (98) Revised European Classification of Lymphomas

and World Health Organization

ENTIDADESENTIDADES (LEUCEMIA / LINFOMA) (LEUCEMIA / LINFOMA) BASEADAS EM DADOS: BASEADAS EM DADOS: CLÍNICOSCLÍNICOS

MORFOLÓGICOSMORFOLÓGICOS SP, MO, BMO, Biópsia de outros tecidosSP, MO, BMO, Biópsia de outros tecidos

IMUNOLÓGICOSIMUNOLÓGICOS Imunofenotipagem por citometria de fluxoImunofenotipagem por citometria de fluxo Imunocitoquímica / ImunohistoquímicaImunocitoquímica / Imunohistoquímica

CITOGENÉTICOS (FISH ) e MOLECULARES (PCR)CITOGENÉTICOS (FISH ) e MOLECULARES (PCR) Anormalidades genéticas com valor prognósticoAnormalidades genéticas com valor prognóstico

NEOPLASIAS DE CÉLULA B

• PRECURSORAS:• Leuc. / Linf. Linfoblástico de Célula B Precursora• PERIFÉRICAS:• LLC cel-B / Linf. de Pequenos Linfócitos• Leucemia Pró - Linfocítica de Célula B• Linfoma linfoplasmocitóide / Imunocitoma• Linfoma de células do manto• Linfoma de centro folicular / folicular• Linf. B da Z. M. / esplênico / extranodal (tipo MALT) / nodal• Tricoleucemia ; Plasmocitoma ; Mieloma Múltiplo• Linfoma de Grandes Células B Difuso• Subtipos: Mediastinal (tímico) e Intravascular• Linfoma de Burkitt

NEOPLASIAS DE CÉLULA T e NK-

T PRECURSORAS : Leucemia / Linfoma Linfoblástico T precursora T e NK PERIFÉRICAS: LLC de célula T e Leucemia Pró -Linfocítica Leucemia de Linfócitos Grandes Granulares Leucemia Tipo célula T e Tipo célula NK Micose Fungóide e Síndrome de Sézary Linfoma de Célula T periférica Não Especificado Doenças Linfoprolif. Cutâneas Prim. Cell T CD30+ Linfoma de Célula T γ/δ Hepatoesplênico Linfoma de Célula T Tipo Paniculite Subcutânea Linfoma de Célula T Angioimunoblástico Linfoma de Célula T Intest.(assoc.ou não a enteropatia) Leucemia/ Linfoma de Células T do Adulto, HTLV1+ Linf.Grandes Células Anaplásico, CD 30+, Tipos T e Nula Linfoma de Grandes Células Anaplásico, Tipo Hodgkin (REAL: provisório)

BImatura

Pró-B

DH-JH

Pré-B

VH-DHJH VL-JL

IgM

Medula óssea

MemóriaB

Célulado plasma

Mudança

IgD

B Naïve Centroblasto Centrócito

IgM

Mutações somáticas

Linfonodo

Geração e maturação de células B

Adpatado de Félix Reyes durante o EHA 2003 em Lyon, França, 12-15 de Junho

Maturação das células B normais e expressão do CD20

Célula tronco

Célula pré-pré B

Célula pré-B

Célula B imatura

Célula B madura Célula

B ativadaPlasmó-

cito

CD 38CD 38

Célula pré-B

Célula pré-B

TDTTDT

CD 19CD 19

CD 20CD 20 CD 22 CD 22

CD 21CD 21

Expressão antigênica na linhagem de células-B doentes

Pré-B B precoce B- Madura B Plasmacitóide

±CD5

CD19

CD20

CD22

CD52

PlasmócitoB Intermediária

?? ?

Célulatronco

Burkitt, LF, LDGC, TL

LLA LLC, LLPC

MW MM

Doenças Linfoproliferativas crônicas CITOMETRIA DE FLUXO

• Determinação da linhagem das células malignas

• Detecção de clonalidade

• Análise da maturação celular e heterogeneidade dentro das populações celulares malignas

• Avaliação da expressão antigênica

LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA

LLC-B é a mais comum leucemia nos EUA.

Incidência : 27 casos por 100.000 hab./ano – 40% leucemia > 65 anos

Ásia e Japão a incidência é mais baixa, sendo inexplicável essa observação. É de 20-30x mais comum na Europa, Austrália e Norte América

Os pacientes com LLC comumente tem mais de 50 anos, com idade média de 65 anos. Rara <30 anos. 20-30% ~ 55 anosIncidência homem/mulher de 2:1,

No estadiamento de Raí :

Bom prognóstico: score 0, Intermediário :I e II e Pobre prognóstico :III e IV.

CARACTERÍSTICAS LABORATORIAIS NO DIAGNÓSTICO DA LLC-B  Linfocitose periférica > 5.000/mm3

Linfocitose >30% na medula óssea Imunoglobulina de superfície monoclonal de intensidade baixa comumente IgM e Kappa (62%), Lambda (2%), CD19 (70%), CD20 (71%), HLA-DR (70%). CD19 ou CD20 / CD5 e CD23 (+).

Marcadores T: CD3 (24%), CD5 (93%), CD7(28%). Marcador de monócitos: CD14(5%). Resultados negativos para CD10 (Linfoma Folicular) FMC-7 (LPL), CD25/CD103 (Hairy cell) antígenos de célula T, outros que não CD5 (neoplasia de célula T), CD79B e CD22 Rearranjo gênico de imunoglobulina (+) Estudo citogenético: usualmente normal; trissomia do 12 é relativamente específica.

Figura 1: LLC-B (Linfócitos maduros, Sombras celulares de Gun Precht e Prolinfócito)

LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA-SP

LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA

Figura 3: Histogramas característicos da LLC-B: Células linfóides B com restrição de cadeia kappa (baixa expressão) e expressão antigênica de CD5+ e CD20+ (baixa expressão).

76,9% de células CD19 (+)

CD19/CD5 +

CD19/Kappa +Kappa de B.Ex

Sistema de Escore para diagnóstico da LLC

Marcados 1 ponto 0 ponto

SmgI fraca forte

CD5 positivo negativo

CD23 positivo negativo

FMC7 negativo positivo

CD22 ou CD79b fraco forte

Escores em LLC são geralmente >3, nas outras doenças células B são geralmente <3.

Fatores prognósticos em LLC

Fator Baixo risco Alto risco

Gênero F M

Estágio clínico Binet A/Rai 0-1 Binet B/C Rai II/III/IV

morfologia típico atípico

BMO Não-difusa difusa

Tempo de duplicação linfócito

> 12 meses < 12 meses

Marcadores séricos normais aumentados

Expressão CD38 <20-30% > 20-30%

citogenética Ausente/del13q Del 11q23 perda/mutação p53 trissomia do 12 e alteração 14q

IgVH mutação mutado Não mutado

Figura : LLC com anormalidade citogenética: Trissomia do 12 por cariótipo convencional e hibridização in situ por fluorescência (FISH).

Figura 2: A Síndrome de Richter (5-10%) é a transformação da LLC em um Linfoma difuso de grandes células.

Histologia da medula óssea Infiltrado intersticial e nodular de células linfóides maduras, intermediadas por células hematopoéticas normais. No caso de infiltração difusa maciça associa-se o quadro com um pior prognóstico. A infiltração paratrabecular não é normalmente observada na LLC.

LEUCEMIA PRÓLINFOCÍTICA

LPL pode ser “de novo” ou secundária a LLC.

A definição de LPL:> 55% de prólinfocitos no S.P. LLC/LPL : 10% a 55%LLC < 10%

A freqüência de LPL é de 10% em relação as LLCs. Média de idade: 70 anos Presença de esplenomegalia volumosa, raramente hepatomegalia e adenomegalia.

Na LPL-T a linfoadenomegalia é vista em 50% dos casos ehepatomegalia em 40%, infiltração de pele em 27% dos pacientes. A meningite leucêmica tem sido relatada, com tratamento intratecal eficaz.É comum a doença em estágio avançado (Raí IV ou Binet C).

A média de sobrevida da LPL é de 2 a 3 anos, comparado com 8 anos de LLC. Curso clínico variável. Anemia e trombocitopenia Relacionado com sobrevida curta.Pacientes com LPL-T apresentam média de sobrevida de 7 a 7,5 meses, e raramente sobrevivem por 2 anos.

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA LEUCEMIA PRÓLINFOCÍTICA

 1. Leucometria > 100.000/mm3 2. Prólinfócitos >55% no sangue periférico3. Em Citometria de Fluxo linfócitos grandes com

fluorescência intensa4. Ig de superfície monoclonal, mais comum IgM - kappa5. LPL-B: Positivo: CD19,CD20,CD22,FMC-7,HLA-DR e Negativo: TdT,CD10,CD5 (2/3)6. LPL-T: TdT-,CD2+,CD3+,CD5+,CD7+,CD4+/CD8- (55-64%)

CD4+/CD8+ (21-30%), CD4-/CD8+ (10-13%)7. Rearranjo gênico de imunoglobulina na LPL-B8. Rearranjo gênico de receptor de célula T na LPL-T1. Anormalidades citogenéticas: 14q+ para LPL-B, inv(14)(q11q32), t(14;14)(q11;q32) e trissomia 8q para LPL-T. 25% do pct – t(11;14)(q13;q32) – Linfoma do manto- evolução leucêmica nestes pacientes? 

Figura 6: LPL: O nucléolo único e proeminente é característico do prólinfocito.

COMPARAÇÃO ENTRE LLC, LLC/LPL, LPL 

LLC LLC/LPL LPL

Leucócitos (x109) 10-120 intermediário >100

Pro linfócitos (%) <10 10-55 >55

Infiltração esplênica infreq. intermediário presente

Adenomegalias freq intermediário raro

Ig de superfície fraca bifásica intensa

CD 5 (+) pres. bifásica <30%

FMC-7 (+) <20% <20% presente

Anorm.Citogenéticas trissomia 12 trissomia 12 14q+

LLC-T é rara, sendo 1% a 2% das LLC.

A Leucemia de células T é um grupo heterogêneo de doenças:

- Leucemia/Linfoma da célula T do Adulto (LLTA)- Doença de Linfócitos Grandes Granulares (LGLD) ou também chamada de Doença Linfoproliferativa T- Gamma - Leucemia Prólinfocítica de célula T (LPL-T)

O grupo britânico acredita que a LLC-T é uma variante da LPL-T pela similaridade clínica, genética e pela microscopia eletrônica (nucléolo). O grupo da Clínica Mayo classifica junto com a LLC-B pela morfologia.Na classificação Americana/Européia de Linfoma está em estudo e na Organização Mundial da Saúde (WHO) foi excluída, como entidade separada.

LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRONICA DE LINHAGEM T

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE LLC-T

Linfocitose > 5.000/mm3

Células leucêmicas: predomínio de linfócitos maduros

Linfocitose de medula óssea > 30%

Expressão de um ou mais antígenos T: CD2, CD3, CD5, CD7

Fenótipo mais freqüente : CD4(+)

Rearranjo gênico: TCR

Citogenética: t(14:14)(q11;q32), inv (14;14)(q11;32)

TdT e CD1 : negativos

Figura 5: LLC-T / LPL-T: Linfócitos pequenos com alta relação N/C, núcleo redondo, nucléolo pequeno ou ausente. Ausência de grânulos no citoplasma.

A incidência de HCL é de 2% do total das leucemias

Seu diagnóstico é essencial pela possibilidadae de cura

Linfocitose de longo tempo, hepatoesplenomegalia e três punções secas. Anemia 85%, trombocitopenia 60 - 80% e leucopenia 60%

LEUCEMIA DE CÉLULAS CABELUDAS - (HAIRY CELL LEUKEMIA)

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE HAIRY CELL LEUKEMIA

1. Células leucêmicas com projeções citoplasmáticas finas 2. Pancitopenia com monocitopenia3. TRAP positivo4. Imunofenótipo Positivo para: CD11c, CD22, CD25,

FMC-7 e CD103• Imunohistoquimica: DBA-44 (+)• Imunoglobulina de superfície monoclonal• Características histológicas: Medula óssea com aspecto de

“ovo frito”, “favo de mel”Formação de pseudosinus em baçoLesão angiomatosa em fígado

1. Microscopia Eletrônica : Projeções citoplasmáticas finas e complexo ribossomo-lamela

9. Rearranjo gênico de imunoglobulina

Leucemia das Células Cabeludas / Tricoleucemia: Células de hairy cell com as delicadas projeções citoplasmáticas em toda superfície celular.

Hairy cell

Hairy cell

Linfocitos B

Linfocitos B

Histograma Volume x Granularidade Histograma CD19 x Granularidade

Análise da Hairy cell Leukemia por Citometria de Fluxo

SISTEMA DE ESCORE PARA LLC

Doença CD5 CD23 CD79b FMC7 sIg escores

LLC (escore)

LPL-B

HCL

LCM

LF

LEZM

+ (1)

+/-

-

+

-

-

+ (1)

-

-/+

+/-

-/+

-/+

-/w (1)

+

+

+

+

+

-/w (1)

+

+/-

+

+

+

W (1)

+

+

+

+

+

4 - 5

0 - 1

0 - 1

1 - 2

0 - 1

0 - 1

CD79b - parte do receptor de antígeno da célula B; CD22 pode ser usado

FMC7 - liga-se a um epitopo na conformação do CD20. CD20 de baixa intensidade na LLC, porém FMC7 é melhor para o sistema de escore

Catovsky D. Hematol Oncol Clin N Am 2004; 18:783-794

Diferente do anterior em relaçãoAo CD22(-) / CD79b = 1 ponto

CARACTERÍSTICAS LABORATORIAIS DO ATCL: 

Presença de anticorpos contra o HTVL - I

Fenótipo de células T monoclonais

Positivo para CD2, CD3, CD4, CD5 e CD25

Negativo para TdT, CD7, CD8 e CD1

Identificação da presença do genoma pró-viral do HTLV-I por Southern blotting ou PCR

Isolamento do vírus HTLV-1

Hipercalcemia

LINFOMA E LEUCEMIA DA CÉLULA T DO ADULTO

O HTLV-1 pode ser transmitido sexualmente, transfusão sanguínea e aleitamento materno. A transmissão requer a transferência das células infectadas, não se transmitindo o vírus livre.

Linfoma/Leucemia da Célula T do Adulto: Células polilobuladas (flower cell) com citoplasma fracamente basofílico.

A cromatina nuclear é pouco condensada, raramente nucléolos.O citoplasma é moderadamente basofílico. Na forma aguda é comum um grande número de linfócitos atípicos no S.P. e as células variam de tamanho e forma. Na forma crônica as células tumorais são uniformes em tamanho, tendo menor porcentual do que a forma aguda.

LINFOMA NÃO - HODGKIN

gg linfáticos → adenomegalia proliferação clonal T, B, cells retics LNH-B são os mais freqüentes sintomas B: 20% dos casos freqüentemente extranodal

AGENTES ETIOLÓGICOS

Predisposição individualImunodeficiência ou estimulaçãoRadiações ionizantes / subst tóxicasInfecção viral Alteração citogenéticaTransplante de órgãos

AGENTES INFECCIOSOSENVOLVIDOS COM OS LNH

Burkitt ..................EBV e MALÁRIA

L. T/NK nasal......Vírus Epstein-Barr

L. MALT gástrico................H.pylori

L. / Leucemia cel -T....HTLV-I (adulto)

DIAGNÓSTICO CLÍNICO

Adenomegalia superficial ou Cadeias ganglionares profundas Hepato e esplenomegalia (freq)Tumorações em outros órgãos e tecidos (ossos, pele, glândulas, SNC (extranodais)

DIAGNÓSTICO CLÍNICO

Fraqueza, febreEmagrecimento e palidezHemorragias não são freqüentes tumoral em ossos e nervos sintomas neurológicos

Infiltração do tecido cutâneo

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

HEMOGRAMACitopenias: I.M.O.Leucocitose

(LLBDD ~ LLC)Grandes células

(leucossarcoma)BIÓPSIA GGDo maior gânglioCervical e axilarInguinal só se bem

patológico

MIELOGRAMAPode ser normalFreqüente infiltração

BIÓPSIA M.O. Células agrupadas (como

nódulos normais)Infiltração pode ser de

forma difusa no parênquima medular

IMUNOFENOTIPAGEM

Citometria de Fluxo: SP,MO,gg Clone de células B: CD10, CD19, CD20,CD22, CD23 Clone de células T: CD2, CD3, CD5,CD7, CD4, CD8

TRANSLOCAÇÕES CROMOSSÔMICASneoplasias de célula B

NEOPLASIA Transloc. Gene Envolv. Conseq.

Burkitt t(8;14) c-myc e IgH ativç c-myc

MALT t(11;18) AP12 e mlt apoptose

t(1;14) bcl-10 + agressiva

FOLICULARt(14;18) IgH e bcl-2 ativç bcl-2

MANTO t(11;14) bcl-1 e IgH ativç bcl-1/ciclD1

Gds Cells B Dif. t(3;14)→ bcl-6→ Dça extranod. Melhor prog.

TRANSLOCAÇÕES CROMOSSÔMICASneoplasias de célula T

NEOPLASIA transloc. Gene Envolv. Conseq.

L.linfoblástico t(1;14) tal-1/SCL transcrição

e a-TCR hematopoiética

LGC. Anaplásico t(2;5) ALK e NPM formação de tirosina-quinase

NPM-ALK híbrida

ESTADIAMENTO CLÍNICO

Tratamento, prognóstico, comparação Hemograma, DHL, ß2-microglobulina

Sorologias: HTLV I e II, EBV B.M.O., biópsia ganglionarDiagnósticos por imagemCintilografia com Gálio

ESTADIAMENTO CLÍNICO DE ANN ARBOR - 1971

I: 1 região nodal (R.N.):(I); ou de 1 órgão ou local extra-nodal (EN): (IE).

II: 2 R.N., mesmo lado do diafragma (II) ou envolv. localizado de 1 órgão ou local E.N. e 1 ou + R.N. do mesmo lado do diafragma (IIE)

III: envolv. R.N. em ambos os lados do diafragma (III) que se podem acompanhar de lesão no baço (IIIS), de local E.N. (IIIE) ou ambos (IIISE).

IV: doença disseminada em um ou mais órgãos ou tecidos E.N., com ou sem ↑ de gg linfáticos.

•

Índice Prognóstico InternacionalA . Pacientes de todas as idades Risco Relativo

IDADE < 60 anos x > 60 anos 1.96

DHL < normal x > normal 1.85

Estado Clínico 0.1 x 2-4 1.80

Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV 1.47

Envolvimento extra-nodal <1sítio x >1 1.48B. Pacientes com menos de 60 anos

Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV 2.17

DHL < normal x > normal 1.95

Estado Clínico 0.1 x 2-4 1.81

CLASSIFICAÇÃO DOS LNH

Baseada na biópsia tecidual

Características imunológicas

Características citogenéticas - moleculares

Freqüência dos LNH• LGCBD 30,6%• FOLICULAR 22,1%• Células B Z. Marginal, MALT 7,6%• Células T Periféricas 7,0%• Pequenos Linfócitos B 6,7%• Célula do Manto 6,0%• LGCB do mediastino 2,4%• Linfoblástico de cél T Precurs. 1,7%• lLinfoplasmocitóide 1,2%• Burkitt, Micose Fungóide < 1%• Outros tipos 6,1%

LINFOMA DE GRANDES CÉLULAS B DIFUSO

LGCB – CÉLULAS NÃO CLIVADAS

LGCBD

LINFOMA DE GRANDES CÉLULAS B - SP

LINFOMA FOLICULAR, difusode pequenas células clivadas

• Adultos com idade superior a 50 anos• IFT: CD20+,CD10 +/-, CD23+/-, CD43-, CD5-,

ciclina D1-• EUA: 40% de todos os linfomas• > representante dos indolentes: 70%• Kiel: Centrocícito-Centroblástico• Padrão de crescimento folicular• OMS: I e II (peq. e grandes células)

LINFOMA FOLICULAR

A estrutura folicular neoplásica contém células dendríticas.

LINFOMA FOLICULAR

LINFOMA FOLICULAR

LINFOMA FOLICULAR

PEQUENAS CÉLULAS CLIVADAS

LINFOMA FOLICULAR

Prevalência do rearranjo do gene bcl-2 em LNH

85%t(14;18)+

35%t(14;18)+

Linfoma Folicular Linfoma difuso de grandes células

Le Beau MM. Semin Oncol. 1990;17:20-29Longo DL, DeVita VT Jr, et al. Cancer Principies & Practice of Oncology. 1993

Positivo

Negativo

Coloração Bcl-2

LNH FOLICULAR DE PEQUENAS CÉLULAS CLIVADAS

LNH FOLICULAR DE PEQUENAS CÉLULAS CLIVADAS

LNH DE PEQUENAS E GRANDES CÉLULAS B

LINFOMAS MALT :

Associados às mucosas Podem acometer todo o TGI Tireóide Aparelho respiratório e uro-genital De baixo ou alto grau Sempre de linfócitos B Bom prognóstico (demoram diversos anos

para infiltrar outros órgãos)

Linfoma MALT Ocular

CD 20 +

Linfoma MALT Gástrico

LINFOMA DE PEQUENAS CÉLULAS DIFUSO

LINFOMA LINFOBLÁSTICO

Núcleo redondo ou oval e cromatina fina e dispersa. Os nucléolos apresentam-se de 1 à 3 e há pouco citoplasma.

LINFOMA LINFOBLÁSTICO - T

PADRÃO CELULAR CONVOLUTO

LINFOMA DE BURKITT

LNH-B de alto grau Relacionado ao EBV Raramente tem início em linfonodos Mitoses abundantes / Padrão celular de “céu estrelado”

Imuno-histoquímica com anticorpo anti EBV mostrando moderada imunorreatividade nuclear

LINFOMA DE BURKITT

Linfoblastos com membrana nuclear proeminente e macrófagos dando aspecto de “céu estrelado”.

LINFOMA CENTROCÍTICO - CENTROBLÁSTICO

LNH mais freqüente LNH-B, de baixo grau Acomete preferencialmente idosos Padrão folicular e/ou difuso Mitoses raras Duas populações linfocitárias

LINFOMA CENTROCÍTICO - CENTROBLÁSTICO

PEQUENAS E GRANDES CÉLULAS

MICOSE FUNGÓIDE

LNH cutâneo de células T CD4+ LNH de baixo grau (mitoses raras)Relacionada com o HTLV I e II Leucemização: 25% (S.de Sézary) Padrão difuso de infiltração da derme e epiderme por linfócitos com núcleo convoluto,cerebriforme

Micose Fungóide / Síndrome de Sézary: Núcleo cerebriforme com alta relação N/C.

Imunofenótipo

As células de Sézary são positivas para CD2, CD3, CD4 e CD5 e caracteristicamente negativas para CD7, CD8 , CD1 e TdT.

LINFOMA HISTIOCÍTICO

Células neoplásicas grandes, com núcleos redondos ou ovais com citoplasma abundante.

Linfoma Imunoblástico

LINFOMAS DE BAIXO GRAU

Evolução lenta , apesar do tto Índice mitótico baixo Sem RC, mesmo com tto precoce e adequado

Tratamento: prolongamento e melhoria da qualidade de vida

LINFOMAS DE ALTO GRAU

Evolução rápida sem tratamento (meses)

Índice mitótico alto Bom prognóstico com tto precoce e

adequado TTO-alvo: células em proliferação RC (“cura”): pode ser alcançada