Aplicação da Citometria de Fluxo (técnica citológica avançada)

ao estudo de populações de levedurasÁrea/Laboratório Microbiologia

Trabalho realizado por:Adriana América da Silva Manuel António Gonçalves de Pinho Sara Sofia dos Santos Marques 

Universidade do MinhoEscola de CiênciasDepartamento de Biologia

21 a 27 de Julho de 2010

Citometria de Fluxo = Citologia analítica/ Citologia quantitativa

“Cito” +    “metria” de              Fluxo

células medição Suspensas em meio líquido

(em movimento) 

‐> A técnica de Citometria de Fluxo é definida como sendo uma técnica citológicaavançada utilizada para contar, analisar e classificar partículas microscópicas em suspensão. 

Citometria:

Citometria de Fluxo Citometria de Imagem

Células em suspensão Amostra estática 

Citometria de FluxoVantagens:

Análise multiparamétrica;Num curto espaço de tempo analisa 

um grande nº de células;Análise célula a célula;

‐> Grande importância no estudo de populações celulares não sincronizadas (as  células encontram‐se em diferentes fases do ciclo celular).

‐> Avaliação da homogeneidade ou heterogeneidade da população.  

Citómetro de Fluxo

‐> Tamanho  (FSC) ‐> Dispersão frontal da luz ‐“forward scatter”

‐> Complexidade (SSC) ‐> Dispersão lateral da luz ‐ “side scatter”

‐> Fluorescência Relativa (FL1, FL2, FL3, FL4…)

Componentes de um Citómetro de Fluxo: ‐> Suspensão de partículas

‐> Fluxo laminar ( as células fluem em fila uma a uma)MecânicaMecânicaMecânica

ÓpticaÓÓpticaptica

Electrónica

ElectrElectróónicnicaa

‐> Conversão do sinal em valores analógico‐digitais

‐> Aquisição, processamento, análise e armazenamento de dados no computador

‐> Fonte de iluminação (feixe de luz)

‐> Captação da luz dispersa e da fluorescência emitida

‐>  Na  câmara  de  fluxo,  a  suspensão  de partículas  que  vão  ser  analisadas  é colhida  por uma agulha e é imersa num  líquido que se move a uma velocidade superior. O fluido envolvente édesignado de líquido de embaínhamento. 

‐>  O  líquido  de  embaínhamento cria  uma pressão  positiva  e  faz  com  que    as  partículas sejam  forçadas  a  moverem‐se  em  fila,  uma  a uma,  no  centro  do  fluido  por  um  processo designado por focagem hidrodinâmica. 

‐> As partículas são analisadas, uma a uma, avelocidades de 100 a 1000 partículas/s

Funcionamento do Citómetro de Fluxo

‐>  As  partículas  em  suspensão,  de  uma  forma alinhada, são interceptadas por um feixe de luz.

‐> A  interacção das partículas com o  feixe gera sinais  que  são  captados  por  detectores apropriados. 

‐> A informação produzida pode ser gerada:‐Pela dispersão do feixe de luz;‐Pela  fluorescência  emitida  por  fluorocromosapós excitação pelo feixe de luz.

Funcionamento do Citómetro de Fluxo

‐>  Capta  a  intensidade  da  luz  dispersa  frontalmente  o  que  nos  fornece  informações 

sobre o tamanho relativo das partículas (células);

‐> A  intensidade  luz  dispersa  frontalmente  é proporcional  ao  tamanho  e  forma  das 

partículas.

Sensor de FS

Laser

Foto-sensor de Dispersão Frontal (FS)

Laser

Sensor de FS

Sensor SS 900

Foto-sensor de Dispersão Lateral (SS)‐> Capta a intensidade de luz dispersa a 90o 

‐> A intensidade da luz dispersa a 90o é proporcional à complexidade, 

granularidade e  forma das partículas.

‐> Capacidade de uma dada molécula emitir uma radiação electromagnética a um comprimento de onda superior ao da radiação incidente.

Luz fluorescente emitidatem menor energia e maiorcomprimento de onda

Fluoresceínaλ = 530 nm

Luz Incidente de maior energía Fluorocromo

CO2H

OOHλ = 480 nm

Fluorescência

Dispersão da Fluorescência‐> A fluorescência emitida é detectada por foto‐sensores que captam a  luz 

com um comprimento de onda seleccionado.

‐> A especificidade da detecção de cada sensor é controlada pela selecção do  comprimento de onda,  através de uma  conjugação de  filtros  e  de espelhos dicróicos.

Laser

Sensor de FS

Detectores de Fluorescência(PMT1, PMT4 etc.)

Espelho Dicróico -Colocado a 45o

Luz ReflectidaLuz Reflectida

Luz TransmitidaLuz TransmitidaFonte de LuzFonte de Luz

Espelhos Dicróicos‐> Os  Espelhos Dicróicos são  Filtros  responsáveis por separar a radiação (divisão  da  fluorescência  em  várias cores,  FL‐1,  FL‐2,  FL‐3  e  FL‐4), permitindo  medições  simultâneas de  vários  parâmetros  numa  sóamostra.

Cell Sorting‐> Os separadores físicos permitem separar partículas de interesse para compartimentos alvo; 

‐> A separação é conseguida por vibração da corrente de fluido por aplicação de umafrequência muito elevada levando à formação de gotículas com 0 ou 1 partícula (idealmente);

‐> Se as partículas satisfizerem os critérios impostos é adicionada uma carga eléctrica;

‐> As gotículas ao caírem passam por duas placasmetálicas, fortemente carregadas positivamenteou negativamente – as gotículas são conduzidaspelas placas de polaridade oposta para umcompartimento de colheita.

Cytometric Bead Array (CBA) Assays

‐> O CBA consiste numa mistura de esferas fluorescentes com diferentes intensidades, mas uniformes no tamanho e conjugadas com anticorpos. Desta forma, o analíto é capturado pela partícula e marcado com outro anticorpo, este com fluorescência distinta da esfera. Assim, a fluorescência obtida torna‐se proporcional à concentração do analíto na amostra.

Aplicação da Citometria de Fluxo (técnica citológica avançada)

ao estudo de populações de leveduras

Trabalho de laboratório …

Objectivos:Avaliação do efeito do etanol e do ácido acético na perda de integridade da membrana plasmática e na degradação mitocondrial na levedura  Saccharomyces cerevisiae

Princípios:‐>  O iodeto de Propídeo (IP)  é uma sonda fluorescente que permite avaliar a integridade da membrana plasmática;

‐> se a célula integrar IP poderemos concluir que houve perda da integridade da membrana plasmática uma vez que em situações normais as células são impermeáveis a IP.

‐> a degradação mitocondrial pode ser monitorizada pela expressão de uma fusão da Green Fluorescent Protein (GFP) com a citrato sintetase da matriz mitocondrial;

‐> esta fusão permite visualizar a morfologia do compartimento mitocondrial e monitorizar a sua degradação pela detecção da perda de fluorescênciaverde.

Protocolo:

Procedeu‐se à preparação e recolha das células e à sua suspensão nas seguintes condições:

Tubo0‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP.Tubo1‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP, pH 3.0, 140mM ácido acético.Tubo2‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP, 10% (v/v) de etanol. Tubo3‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP, 12% (v/v) de etanol. Tubo4‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP, 14% (v/v) de etanol. 

Observou‐se ao microscópio de fluorescência de uma amostra do Tubo 0.

A estirpe Saccharomyces cerevisiaeW303‐ 1A transformada com o plasmídeo pYX‐mtGFP foi cultivada  overnight em meio de cultura Synthetic Complete com galactosesem triptofano, a 30⁰C, 160 r.p.m. 

Resultados e discussão dos resultados:1º observação ao

microscópio:

‐ Sem qualquer tratamento

‐ Com ácido acético 

Retiraram‐se amostras dos diferentes meios de cultura para análise no citómetrode fluxo aos seguintes tempos:

‐> T75 (75 min. )‐> T145 (145 min.)‐> T230 (230 min.)‐> T380  (380min.)

para análise da fluorescência verde (degradação mitocondrial) e para análise da fluorescência vermelha (integridade da membrana plasmtica) após  5 min. de incubação à temperatura ambiente, no escuro.

Protocolo:1ª parte- Citómetro de Fluxo

Resultados e discussão :1ª parte- Citómetro de Fluxo

AF_W303_T0 (autofluorescência aos 0 min) 

‐> A partir da análise do scattergram podemos avaliar a homogeneidade da população no que respeita ao tamanho relativo e complexidade relativa

‐> as células que se encontram rodeadas, no scattergram,  pelo gate A  são analisadas quanto àsua fluorescência vermelha no 2º gráfico (histograma monoparamétrico de FL‐4)

‐> Toda a população analisada localiza ‐se na zona  D, pelo que a amostra não tratada apresenta marcação IP ‐. 

A

D E

Resultados e discussão:IP_W303_T0GFP_W303_T0

Resultados e discussão:

Resultados e discussão:

Resultados e discussão:

IP_W303_T0

IP_W303_10%_T380

IP_W303_14%_T380 

2ª parte- Imunofluorescência

Protocolo:

Colocou‐se 10 μl de células (previamente sujeitas a 14% de etanol, sendo submetidas a várias centrifugações, incubações e lavagens em que se utilizou sorbitol 1.2M; β‐mercaptoetanol; zymolyase 20T 1000 mg/ml, etc ) em cada poço de uma lâmina para imunofluorescência. 

Os anticorpos utilizados foram o anti‐citocromo c diluído 1:100 e o mouse‐FITC diluído 1:20 (ambos diluídos em leite).

No final, montou‐se com vectashield, selou‐se com verniz e observou‐se ao microscópio.

Resultados e discussão

Cyc_W303_T0 Cyc_W303_14%_T400

Conclusão:Tanto o ácido acético como o etanol causam danos nas leveduras uma vez 

que, como podemos  constatar pelas experiências realizadas, a partir de determinadas concentrações estes tornam‐se citotóxicos;

O ácido acético apresenta maior citotoxicidade que o etanol;

Quanto maior for a concentração de etanol e maior o tempo de incubação, maior será a degradação das mitocôndrias e  perda de integridade da membrana celular;

Através da citometria de fluxo conseguimos confirmar a degradação do compartimento mitocondrial e a perda de integridade da membrana plasmática;

Através da microscopia conseguimos confirmar a alteração na morfologia das mitocôndrias e a sua fragmentação.

Bibliografia:• Kitagaki H., Arakia Y., Funatob K., e Shimoi H. (2007) Ethanol‐induced death in yeast exhibits features of apoptosis mediated by mitochondrial fission pathway, FEBS Letters, Japan,  2935–2942

• Gregori G., Ragheb K., Robinson, J. P. (2003) Introduction to WinMDI 2.8 for the Analysisof Flow Cytometry Listmode Data Files, Purdue University Cytometry Laboratories, July, Versão1.0

Agradecemos a participação de

Ana Patrícia Pimenta Martins Ribeiroe

agradecemos a colaboração das investigadoras:

Manuela Côrte-Real e Susana Chaves

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