Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico

Dra. Nydia Strachman BacalHematologista e Patologista Clínica

Dra. Nydia Strachman BacalHematologista e Patologista Clínica

Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico

Essas partículas estão suspensas em meio líquido

CCÂÂMERA DE FLUXOMERA DE FLUXO

FOCO HIDRODINFOCO HIDRODINÂÂMICOMICO

LASERLASER

Orifício com Diâmetro: 50 a 250 µmOrifício com Diâmetro: 50 a 250 µm

Sistema que gera um fluxo contínuo laminar de partículas, que passam uma a uma frente a um feixe de laser

Fotomultiplicadores

Freq

Fluorescence

FSC Sensor

Detector de Fluorescência(FL1,FL2, FL3 e FL4)

(tubos fotomultiplicadores)

Impulsos elétricos Sinais analógicos

Sinais digitais

Distribuição por frequênciaHistogramas

Lasers - FluorocromosFluorocromo Laser (nm) Emissão (nm)

FITC 488 525R-PE (PE) 488 575Pe-Cy5 (TC1) 488 667PerCP (BD2) 488 675PerCP/Cy5.5 (BD) 488 6957-AAD 488 655Iodeto de propidium 488 570

Texas Red 595 615

APC 633, 635 660Cy5 633, 635 667

Citometria de Fluxo Imunofenotipagem

• Análise da expressão antigênica das células através da ligação antígeno – anticorpo - fluorocromo

Anticorpos monoclonaisdesignados “CDs” Clusters of differentiationligam-se as células nos determinantes antigênicos ou epítopos em sua membrana, citoplasma e intranuclearmente.

Citometros de Fluxo - Fluorocromos

444321XL

6544321FC500

654321FACSCanto

433321FACSalibur

33321FACScan

9876544321CYAN

Alexa450Alexa405APC-Cy7APC/Cy5PE-Cy7PE-Cy5.5PE-Cy5PE-TRPEFITC

ALGUMAS APLICAÇÕES CLÍNICAS ATUAIS

• Análise do conteúdo de DNA• Quantificação de reticulócitos• Análise da Subpopulação Linfocítica• Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias e Linfomas• Diagnóstico e acompanhamento de Mieloma Multiplo• Mielodisplasia / Doenças Mieloproliferativas• Diagnóstico de Hemoglobinúria Paroxística Noturna• Detecção de Anticorpos Antiplaquetários• Disfunção plaquetária• Quantificação de células progenitoras (stem cell)• Detecção de Células Neoplásicas não hematopoéticas• Monitoramento Quimioterapia / Doença Residual Mínima• Avaliação imunológico de paciente transplantado e de infusão linfocitária

Outras aplicações : Estudos da função celular, Apoptose, MDR (Múltipla Resistência à Drogas) , Procedimentos em Hemoterapia (Detecção de Anticorpo em Anemia Auto-imune, Detecção de hemorragia feto materna, Controle de Qualidade de Leucodepleção, etc...) , HLA-B27, Teste de Antígeno Leucocitário(HLA) e Cross Match.

Anti-CD3 PerCP

Anti-CD8 PE

Anti-CD4FITC

Análise da Subpopulação LinfocíticaIMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA

Anti-CD3 PerCP

Anti-CD16 /CD56PE

Anti-CD19 FITC

Aplicações:

Monitorar Imunodeficiência Adquirida (AIDS)Imunofenotipagem de LinfomasImunofenotipagem de LeucemiasMonitorar transplantesMonitorar sistema imunológicoFunção plaquetária

Estratégia de Gatesjanelas

1. FS x SSCtamanho x granularidade

2.CD45 x SSC

3. Gates sequenciais•CD19•CD3•CD138•CD34

EXPRESSÃO DO CD45 em Leucemia Aguda

Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias, Linfomas e Mieloma

• Leucemias agudas• Linfóides x Mielóides

• Leucemias Crônicas• Linfocítica, Mielomonocítica• Linfomas leucemizados• Discrasia de Células Plasmáticas

Diferenciação Granulocítica – MO normal

Painéis de anticorpos monoclonais

CD34CD34CD117CD117HLAHLA--DRDR

I II III IV V

Mieloblasto Pro- Mielócito Meta- Neutrófilomielócito mielócito

Bastão

CD117CD117

CD15CD15CD11b CD11b

CD15CD15CD11bCD11bCD16CD16

CD15CD15CD11b+forteCD11b+forteCD16+forteCD16+forte

CD13+forteCD13+forteCD33+forteCD33+forte

CD13+forteCD13+forteCD33+forteCD33+forte

CD13+fracoCD13+fracoCD33+fracoCD33+fraco

CD13+CD13+CD33+fracoCD33+fraco

CD13+forteCD13+forteCD33+fracoCD33+fraco

CD15CD15

CD34/CD117/CD45/CD13.33

CD16/CD13/CD45/CD11bDra.Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia -SC

CD2xCD45CD45xSS

LMA M3

HLA-DRxCD45

CD33xCD45 CD13xCD45

CD34xCD45

CD117xCD45

MPO(c)xCD45 CD56xCD45

CD71xCD45

Diferenciação Linfóide B – MO Normal

Painéis de anticorpos monoclonais

CD34CD34TdTTdTCD10+forteCD10+forte

I II III IV V

CD45+fracoCD45+fracoCD20+fracoCD20+fracoCitCit IgIgµµ

CD45CD45CD20CD20CitCit IgIgµµIgMIgM supsup..

CD45+forteCD45+forteCD20+forteCD20+forte

IgMIgM supsup..

CD45CD45--/+/+

CitCit IgIgµµ

CD34CD34TdTTdT

CD19CD19CD22CD22CD22CD22CD45+fracoCD45+fraco

((TdTTdT))CD10+forteCD10+forteCD19CD19CD22CD22

CD10+fracoCD10+fracoCD19CD19CD22CD22

CD19CD19CD22+forteCD22+forte

CD19CD19

Pró B Pré-pre-BI Pré-pre-BII Pré-pre-BIII Madura Plasmáticaimatura B IV

TdT/CD20/CD19/CD10

CD34/CD22/CD19/CD45Marcações AlternativasMarcações Alternativas

sIgĸ/sIgλ/CD20/CD10 CitCit IgIgµµ/ IgIgµµ supsup /CD20/CD10Dra. Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia - SC

LLA B MADURA

LINFOMA DE BURKITT

CD45xSS TdTxCD19

CD34xCD45

CD19xCD45 HLA-DRxCD45 CD10xCD45 IgM (sup)xCD19

CD20xCD45 CD22xCD45 KAPPA(sup)xCD19

P.O. 32a – LMA M0

ASF, 28a – LMA M0

LLC- B: Células linfóides B com restrição de cadeia leve monoclonal para kappabaixa expressão e expressão antigênica de CD5+ e CD20+ baixa expressão

Leucemia de Células Cabeludas - Hairy cell

Mieloma Múltiplo

Mieloma Múltiplo

Histograma CD138 x ComplexidadeHistograma de Tamanho x Complexidade

Mieloma Múltiplo

Histograma de Monoclonalidade em Kappa intracitoplasmática

Mieloma Múltiplo

CD19 (-) nas células CD138 (+)CD56 x CD138

Mieloma Múltiplo

Histograma CD45 x CD138 Histograma HLA-DR x CD138

Mieloma Múltiplo

Histograma de Conteúdo de DNA com Hiperdiploidia

Mielodisplasia

• PAPEL DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO

• Técnica complementar / análise dentro de um contexto

• Quantificar blastos de forma exata • Discriminar Mieloblastos de Promielócitos e dos

Pró-monócitos• Estudo de mudanças fenotípicas na MDS

M.O normal

Normal: CD34:2%

MO nl

SÍNDROME MIELODISPLÁSICA

FENÓTIPO ALTERADO QUALITATIVAMENTE

Expressão antigênica assincrônicaCD34/CD15/HLA-DR(-)

Expressão antigênica diminuída ou aumentada CD45 fraca em MonócitosCD33 intenso / HLA-DR(+) em Neutrófilos

Coexpressão aberrante CD56 em monócitos /CD2 ou CD19 em linhagem granulocítica

FENÓTIPO COM ALTERAÇÕES NUMÉRICAS

Linhagem celular ou maturaçãoAumento de células CD34(+) - mielóide, aumento de células monocíticas e eritróides e diminuição de neutrófilos

M.C.DelCanizo et al Immunophenotypic analysis of myelodysplastic syndromesHaematologica/Journal of hematology vol.88(04):april 2003

BAND/NEUTROPHIL

META-MYELOCYTE

MYELOCYTEPROMYELOCYTEMYELOBLAST

103

102

101

CD34

HLA-DR CD117

CD13

CD33CD11b

CD15

CD64CD65

CD54

CD10

CD16

CD35

CD13

Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004

BAND/NEUTROPHIL

META-MYELOCYTE

MYELOCYTEPROMYELOCYTEMYELOBLAST

103

102

101

CD34

HLA-DR CD117

CD13

CD33CD11b

CD15

CD64CD65

CD54

CD10

CD16

CD35

CD13

Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004

HPN - Hemácias

Ausência de expressão antigênica do CD59 em 34,9% das células identificadas por Glicoforina A

Ausência de expressão antigênica do CD55 em 46,5% das células identificadas por Glicoforina A

HPN - Neutrófilos

Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do CD55 em 97,7% dos neutrófilos.

HPN - Neutrófilos

Controle normal: CD59 (+) = 100,0%

Ausência de expressão antigênica de CD59 em 82,7% das células identificadas pelo CD13.

HPN - Monócitos

Ausência de expressão do CD14 em 98,3% das células CD 64 (+)

Controle normal: CD14(+) = 99,8%

Pesquisa de Anticorpo Anti-plaquetas Método Direto

Total de casos 115 pacientes com plaquetopenia.Amostra: 10 ml de sangue em EDTA.Equipamento: Citômetro de Fluxo – EPICS XL-MCL da Beckman CoulterMaterial:

- Anti-Human IgG FITC conjugate SIGMA (F-1641)- CD41 ou CD61 PE Immunotech (PN – IM1416)- Tampão PBS-EDTA

Método:As Plaquetas separadas do sangue total coletada em EDTA, são

lavadas e marcadas com CD41PE e IgG FITC e analisadas no Citômetro de Fluxo.

João Carlos C. Guerra, MD, Ruth H Kanayama, PhD, Sonia S.Nozawa, PhD, Márcia R. Ioshida, PhD, Irina Y Takiri, PhD, Robson J. Lazaro, PhD, Nelson Hamerschlak, MD, Luiz Gastão M. Rosenfeld, MD, Celso Carlos C. Guerra MD and Nydia S. Bacal, MD. Low Platelet Counts: Diagnosis Using Flow

Cytometry and Anti Platelet Antibody – Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2006 108: abstract 3966.

0.114

1.47

Controle Negativo

Plaquetas – 375.000/mm³ CSMCSM, 20 anos ,masc.

Plaquetas – 65.000/mm³

AVS

AVS, 31 anos, fem.

Plaquetas – 16.000/mm³

O antígeno está ausente ou presente em baixa expressão em pacientes com Síndrome de Bernard-Soulier é identificado pelo anticorpo CD42b que é específico para a glicoproteina plaquetária GPIbEssa glicoproteina plaquetária serve como receptor para o Fator Von Willebrande tem alta afinidade ao receptor de trombina.CD42a(GPIX), CD42d(GPV) raramente utilizadas.CD41 (GPIIb) and CD61 (GPIIIa) – TrombasteniaTrombastenia de de GlanzmannGlanzmann

Quantificação de células progenitorasCD34 (+) - Citometria de Fluxo

Protocolo “ISHAGE” Plataforma dupla

Sangue periféricoMedula ÓsseaAféreseCordão Umbilical

Marcação fluorescente ligada aocálcio permite o estudo deativação celular

Imunofenotipagem – PaineisProliferativos - utilizados no HIAE

1. Leucose Aguda :• MPO, CD79a, CD3intra e/ou

• CD45 x SS

• Primeiro passo : 2 CD por linhagem

CD2-CD7 / CD10-CD19 / CD13-CD33 /CD4-CD14(My4) e CD34 / HLA-DR

• Conforme linhagem segue com outros Atc específicos :– CD20, CD22, IgM intra, Kappa e Lambda intra e/ou sup.

– CD 3sup., CD38, CD5, CD8

– raramente TdT

– CD11b, CD14(MO2), CD15, CD41,CD64, CD71, Glicoforina A, CD117

Imunofenotipagem – Painéis Proliferativos utilizados no HIAE

2. Doenças Linfoproliferativas B CD19 (+) ou CD20(+) ou CD138 :

CD5, CD10, CD11c, CD22,CD23,CD25, FMC- 7; IgM,

Kappa e Lambda intra ou sup.,CD103, IgG,CD38,

CD56 e HLA-DR

3. Doenças Linfoproliferativas T-CD2, CD3intra e sup., CD4, CD5, CD7, CD8,

-CD11b, CD16, CD25, CD38, CD56, CD71 e HLA-DR,

Outros CD disponíveis:-CD30, CD1-A, CD79b, IgG, IgD e IgA, TCRαβ/TCRγλ, Ti -gamma.

LEUCEMIA AGUDA

FITC PE PE-Cy5MPO c CD79a c CD3 cCD15 CD33 CD45CD2 CD7 CD45HLADR CD34 CD45CD10 CD19 CD45IgG1FITC IgG1PE CD45PE-Cy5

Painel inicial

FITC PE PE-Cy5 FITC PE PE-CY5 FITC PE PE-Cy5CD22 CD20 CD45 CD14 CD45 CD5 CD1a CD45kappa CD19 CD15 CD13 CD45 TCR g//d TCR al/b CD45Lambda CD19 CD71 glicofor. CD45 CD8 CD4 CD3IgM c CD41 CD117 CD45

CD38 CD56 CD45CD22c ? CD64 CD11b CD45

CD4 CD45

LLA-B LMA LLA T

Doenças Linfoproliferativas Crônicas

** Para suspeita de Linfoma de Hodgkin ou Linfomas agressivos de grandes células, marcar com CD30 e CD15.

FITC PE PE Cy-5HLA DR CD20 CD19CD2 CD7 CD3IgG IgG IgG

PlasmocitáriaFITC PE PE Cy-5 FITC PE PE Cy-5 FITC PE PE-Cy5kappa CD19 CD8 CD4 CD3 CD138 CD117 CD19Lambda CD19 CD16 CD56 CD3 CD38 CD56 CD19CD5 CD20 CD19 CD25 CD56 CD3 CD138 CD56 CD117CD22 CD23 CD19 CD5 HLADR CD3 CD138 CD38 CD117FMC7 CD11c CD19CD79b CD38 CD19CD103* CD25* CD19* *somente p/ HCLIgMIgDIgG

CD30 CD15CD15

Painel inicial

linoproliferativa B linfoprolifertativa T

IMUNOFENOTIPAGEM PAINEL PROLIFERATIVO NOVEMBRO/1991 A JULHO/2007

PATOLOGIAS N° DE CASOS

LEUCEMIAS AGUDAS 1954 (31,3%)LMA 1084 (17,4%)LLA 854 (13,7%)L. Bifenotipica 16 (0,2%)

NEOPLASIAS DE CÉLULAS B MADURAS 1441 (23,1%)DLPC-B/LNH-B 1238 (19,9%)NEOPLASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS 203 (3,2%)DLPC-T / NK 83 (1,3%)

DOENÇAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS 55 (0,9%)

SMD e LMMoC 79 (1,3%)Linfoma de Hodgkin 1 (0,02%)MO SEM DOENÇAS ONCOHEMATOLOGICAS, CONTROLES 2589 (41,5%)PÓS TRATAMENTOS, MO NORMAL e OUTRAS PATOLOGIASHEMATOGONIAS 30 (0,49%)

6232 (100%)

Imunofenotipagem de Doenças Oncohematológicas – nov/91 a julho/07

Nº total de casos analisados: 6 234

Diagnósticos acima de 60 casos entre os 6234 casos nov/91 a julho/07

OBRIGADA PELA ATENÇÃO !OBRIGADA PELA ATENÇÃO !

Nydia S. Bacal

nsbacal@einstein.br

Grupo de Grupo de CitometriaCitometria de Fluxo do de Fluxo do Laboratório Clínico HIAE Laboratório Clínico HIAE -- 20072007

Ana Claudia Miranda BritoAlexandra M.P. CavalcanteJoão Carlos de C. GuerraSonia Tsukasa NozawaRuth Hissae Kanayama

Citometro de Fluxo- nova geração

FC – 500 – Beckman Coulter

Laboratórios Externos: 65%

HIAE: 35%

1991 - 1ª geração Epics Profile II1994 - 2ª geração Epics XL – MCL2007 - 3ª geração FC – 500

• Imunofenotipagem Linfocitária• Imunofenotipagem em doenças

oncohematológicas• Quantificação de células CD34+• Pesquisa de HPN• Avaliação de disfunção e ativação plaquetária• Analise do conteúdo de DNA

Fotomultiplicadores captam a fluorescência Impulsos elétricos/Sinais analógicos

Sinais digitais

Distribuição por frequência/Histogramas

R1

Fenotipos alterados Síndrome MielodisplásicaDr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização

das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004

Anormalidades Stetler-Stevenson et al Wells et alImunofenotípicas Blood, 2001 Blood, 2003

MieloblastosNúmeros anormais 24/42 (53%) 72/115 (62%)CD2+ 12/45 (27%) NR

Maturação de neutrófilos:SSC anormal 35/45 (84%) 9/115 (8%) CD45Be NR 4/115 (3%)Padrão anormal CD13/CD16 21/27 (78%) 27/115 (23%)Relação anormal HLADR/CD11b NR 6/115 (5%)Padrão anormal CD11b/CD16 19/27 (70%) NRDesvio à esquerda assincrônico NR 26/115 (23%)CD56+ 7/33 (21%) 18/115 (16%)CD33- NR 6/115 (5%)CD34+ NR 7/115 (6%)Presença de Ags linfóides 17/45 (38%) 4/115 (3%)

Fenotipos alterados Síndrome Mielodisplásica

Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004

Anormalidades Stetler-Stevenson et al Wells et alImunofenotípicas Blood, 2001 Blood, 2003

Células MonocíticasSSC anormal NR 1/115 (1%) CD13- ou CD16- NR 1/115 (1%)Relação anormal HLADR/CD11b NR 5/115 (4%)CD56+ 11/33 (33%) 19/115 (17%)CD33- or CD14- NR 3/115 (3%)CD34+ NR 14/115 (12%)

Presença de Ags linfóides NR 38/115 (33%)

Células EritróidesCD71 alterado, GphA ou CD45 34/44 (77%) NR

Células MegacariocíticasNúmero aumentado 26/44 (59%) NR