Citometria de Fluxo e Separação Celular

Oeiras, 25 Janeiro, 2012

O que é a Citometria de Fluxo?

Cito-metria: Medição de propriedades físico-químicas das células.

Citometria de Fluxo: Caracterização dessas propriedades num fluxo.

Fluídica Células em suspensão fluem em fila indiana

Óptica através de um volume iluminado onde refletem a luz e emitem fluorescência, que é filtrada, processada e

Electrónica digitalizada para ser analisada num computador

O citómetro de fluxo

Citómetros de Fluxo

Citómetros de Fluxo

Lasers

Detetores

LSR Fortessa/FACSAria

LSR Fortessa MoFlo

MoFlo

UV/514 nm

561 nm

488 nm

633nm 561 nm

442 nm

488 nm

Porquê a Citometria de Fluxo?

• Poder estatístico • Medição de milhares de células/partículas por segundo • Medição simultânea de múltiplos parâmetros.

• Deteção e separação de eventos raros.

• Separação Celular • Pureza, Rendimento e velocidade.

0.02%

Marcadores Fluorescentes

Célula expressa proteína A

Anticorpo anti-A conjugado com

fluorocromo VERMELHO

Célula expressa proteína B

Anticorpo anti-B conjugado com

fluorocromo Verde

Detetores ou canais de fluorescência

Azul

Verde

Amarelo

Vermelho

Análise: Histograma

100 101 102 103 104

FL1 Log

0

2393

4787

7180

9574

Counts

Fluorescência total da célula - VERMELHO

Nú

mer

o d

e c

élu

las

100 101 102 103 104

FL1 Log

0

2393

4787

7180

9574

Counts

Análise: Histograma Bidimensional

Fluorescência - VERMELHO

Fluo

rescência - V

ERD

E Flu

ore

scên

cia

- V

ERD

E Fluorescência - VERMELHO

Imunofenotipagem

CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD4+ CD25-

CD3+ CD4+ CD25+

CD3+

CD4+ CD25- CD25+

anti

-CD

3 -

Ver

de

anti

-CD

4 -

Lar

anja

anti

-CD

4 -

Lar

anja

anti-B220 - Azul anti-B220 - Amarelo anti-CD25 - Vermelho

Separação Celular

Câmara de fluxo

Ponto de quebra

cuvete

Carga

Placas eléctricas de alta voltagem

6000V

Lixo

Tubo de coleção

Gota contendo partícula de interesse é carregada Gotas são geradas

Vibração quebra fluxo formando gotas (30-70,000 gotas/sec)

Gota carregada é defletida

Separação física de uma célula (ou partícula) de interesse presente numa suspensão heterogénea de células (ou partículas).

Separador celular separa gotas, não células!

Imunofenotipagem

CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD4+ CD25-

CD3+ CD4+ CD25+

CD3+

CD4+ CD25- CD25+

Transcritómica(RNA) Genómica (DNA) Metabolómica (metabolitos)

Microscopia de Fluorescência FISH – Hibridização in situ Estudos funcionais

Etc.

anti

-CD

3 -

Ver

de

anti

-CD

4 -

Lar

anja

anti

-CD

4 -

Lar

anja

anti-B220 - Azul anti-B220 - Amarelo anti-CD25 - Vermelho

Depois de separar:

Proteínas Fluorescentes

Promotor Proteína A

A proteína GFP (Green Fluorescent Protein) foi inicialmente descoberta por Shimomura et al., na medusa Aequorea victoria em1962, mas apenas clonada 30 anos mais tarde.

Proteínas fluorescentes derivadas de GFP e mRFP

Wang et. al (2004) PNAS

GFP

Int J Med Sci 2007; 4(5):267-277. doi:10.7150/ijms.4.267

Proteínas Fluorescentes

http://www.glofish.com/

http://www.nichd.nih.gov/news/releases/green_brown_mice.cfm

http://www.biostatus.com

http://www4.utsouthwestern.edu/olsonlab/

http://john.maloney.org

Sondas Fluorescentes

Cálcio Membrana pH Cell Tracker DNA Mitocôndria

Fura 2 FM 1-43 SNAFLE CMRA DAPI Nonyl Acridine O

Indo 1 FM 4-64 SNARF CMTPX HOECHST MitoSox

Bapta/dye DiO BCECF BMQC TOPRO3 Mitotracker

Calcium Green ANNINE 6 pHRodo DMFDA PI Rhodamine 123

Fluo 4 Di4ANNEPS hq lysosensor CMTMR DRAQ5 MitoProbe

Sondas que medem funções celulares específicas ou que quantificam propriedades funcionais das células

Ciclo celular

G2

M

G1

S

G0

G0/G1

Fase S

G2/M

G1

1

Fase S

M

G1

G2

2

1 Conteúdo de DNA

Agentes intercalantes

DNA Iodeto Propídio (PI)

DRAQ5 Hoechst DAPI

Fluorescência

Nú

mer

o c

élu

las

Proliferação celular

Marcação com CFSE

Célula

Diluição de CFSE

Divisões celulares

www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry

CFSE - Verde

An

ti-B

22

0 -

Azu

l

CFSE - Verde

Nú

mer

o d

e cé

lula

s

Perguntas?

Oeiras, 25 Janeiro, 2012