PROTOCOLO

CITOMETRO DE FLUXO

Prof. Enrique R. Argaaraz Lab Virologia Molecular

Faculdade de Cincias da Sade Universidade de Braslia

FLUXOGRAMA

I. Iniciar Sistema

1. Ligar o aparelho na seguinte ordem: Ligar o aparelho na seguinte ordem:

Ligar estabilizador.

Ligar o Citmetro de Fluxo.

Ligar o Computador; deixar 5 a 10 (para atingir mxima potncia)

2. Checagem de Reservatrios

Vasilhame de Descarte gaveta esquerda (descartar o liquido e acrescentar 50-100 ml hipoclorito concentrado)

- Observar se est em Standby (S assim o equipamento est pronto para uso).

Vasilhame FACS FLOW Verificar presso ( puxar alavanca em direo ao operador) 1. Apertar bem a tampa 2. Encaixe do tubo Nota: No esquecer de desligar a presso ante de abrir o vasilhame

Apertar RUN e HIGH Objetivo: para que o sistema se complete com o FACS flow novo. Nota: monitorar ate ausncia de bolhas na mangueira (tirar a mangueira do

filtro e tirar as bolhas)

Se as bolhas no desaparecerem, apertar HIGH e PRIME esperar voltar a Stanby. Objetivo: tirar bolhas e a soluo velha.

3. Abrir o programa Cell Quest Pro.

Fechar a folha em branco Untitle (Dont Save).

Abrir a planilha, pode estar pronta : File Open Document Abrir a Planilha de Aquisio Open.

File Document Size Criar uma Folha.

4. Conectar o computador ao aparelho:

Acquire Connect to Cytometer (ma + B) Ao conectar, a janela do Browser aparece automaticamente (Parameter Description).

Iniciar Sistema

Controle de Qualidade

Ajustar Parmetros

Gravar Dados

Analisar Dados

Desligar Sistema

Figura 1

Ao conectar o computador ao FACS aparecer o menu aquisio Aquisio control

Figura 2

5. Nmero e Tipos de Eventos que sero Adquiridos)

Clicar em Acquire mais uma vez;

Clicar em Aquisio and Storage aparecer menu abaixo

Figura 3

Neste menu se podem escolher os critrios para salvar e exibir os eventos.

Aquisio Gate: quais eventos sero salvos ou rejeitados, os eventos podem compor uma dada populao (morfologica ou fenotpica)

Nota: em geral se deixa como All para ter salvos todos os eventos e excluir apenas na anlise

Collection Criteria: se define com que nmeros de eventos a aquisio ser encerrada ( seja de eventos totais ou uma dada populao);

Storage Gate: os eventos que sero salvos se aconselha deixar em All ; Resolution: selecionar o valor 256;

Parameters saved: quais parmetros sero salvos. Devem ser selecionados FSC, SSC ( morfologia, tamanho) e as fluorescncias

Figura 4

6. Identificao das Amostras ( nome e destino dos arquivos)

Ao conectar o citmetro aparecera automaticamente o menu abaixo

Figura 5

Folder: em que pasta sero gravados os dados, ex iniciais do operador.

custom prefixmudar para simple ID

File name prefix: nome do experimento

File name suffix: se mantido enumerar de forma crescente

Figura 6

Ainda no parametr description se repete no item Sample ID: o nome do tubo ex. Mock;

Se deve colocar dos eixos dos grficos: P1-FSC; P2-SSC; P3-FL1; P4-FL2; P5-FL3. Pode-se ainda se escolher outros eixos ex anti-CD3 FITC ao invez de FL1, como nome do eixo P1.

Nota: possvel s se existe um tipo de Ac conjugado a FITC. Fechar, no tem ok

7. Abrir as 4 janelas (maa 1,2,3,4) ou Cytometer abrir as seguintes janelas:

i. Detectors/Amp (ma + 1) (mudar para log FL1,2 e3) ii. Threshold (ma + 2).

iii. Compensation (ma + 3). iv. Status (ma + 4)

v. Instrument Settings Open Procurar uma Compensao

(Feita com as Beads ou CD3-CD4-CD8) Set Done.

Figura 7

Detectors/ Amp: FSC e SSC devem ser mantidos em Linear e as fluorescncias em Log; Pode-se ligar o seh]gundo laser four color (635 nm-vermelho)

Compensation usado se houver 2 ou mais marcaes

Threshold: usado para tirar debris

8. Na pagina principal abrir Plot

Figura 8

Em Plot Source: selecionar Axquisition e em seguida parecero X e Y parameters que foram previamente selecionados parameters saved;

Escolher os eixos desejados: ex para 3 fluorescencias FSC x SSC; FL1 x FL2, FL1 x FL3 e FL2 x FL3.

Pode-se escolher No Gate ou apenas os eventos que interessam, selecionando uma regio de interesse. Nota: Mesmo que selecione um gate todos os eventos estaro sendo salvos

como determinado em Aquisio & Store

Para abrir Histogramas selcioanr plots e depois Histogram

Neste ponto poder ser adquiridas as amostras controles para ajustar os parmetros. Sempre com o item Setup selecionado Figura 2

0 200

400

600

800

1000

0

200

400

600

800

1000

Linfcitos

Moncitos

Neutrfilos

II. Ajuste de Parmetros ( Settings)

Deve ser seguido o roteiro abaixo

A. Ajuste de morfologia

- Passar a amostra Mock e no plot de Foward / Side- Sacatter; - Mexer no Detector / Amp para distribuir a populao e distinguir as diferentes

populaes, vide exemplo

Figura 9 - Em A a voltagem SSc esta muito alta e B a de FSC esta alta, permitindo a aquisio de

debris o que diminuir os eventos plauciveis de serem analizados.

- A voltagem de FSC deve ser mantida em E00 e como em B tem muito debris o valor de FSc deve ser diminudo ou mesmo para SSC, at ficarem satisfatrios como figura abaixo

. Figura 10

Passos da otimizao Amostras para otimizao

A. Ajustar as voltagens de FSC e SSC.

B. Ajustar threshold.

C. Seleo de populao de interesse gate.

D. Ajustar as voltagens dos PMT.

Controle No Marcado

E. Compensao.

Controle com FITC Controle com PE Controle com PerCP

FSC-H

0 200

400

600

800

1000

0

200

400

600

800

1000

DEBRIS

B. Ajustar o Threshold -Excluso do Debris

Existem duas formas de excluir o debris: a) Baixar a voltagem do FSC b) Aumentando o Threshold, at que o debris deixe de ser visualizada

Figura 11

C. Seleo de populao de interesse gate.

D. Ajuste de voltagens (FSC e SSC)

Fazer gate na populao de interesse e ajustar as voltagens dos PMT.

Objetivo: evitar falso positivo e falso negativo clulas no marcadas como controle

SSC-H

Em qual parmetro

usa-se o treshold?

Sem ajuste Com ajuste

E. Compensao- Vazamento

Muitas fluorescncias apresentam superposio-vazamento para outros canais, pelo que tem que ser realizada a compensao

Sobreposio de Espectros

a) Passar os controles (+) para cada fluorescncia e compensar, ou seja aumentar as diferencias entre as fluorescencias para tirar o vazamentoi-sobreposio das fluorescencias.

Compensao do FITC ( +FITC/-PEC)

Sem ajuste Com ajuste

Relative

Intensity

500nm

550nm

600nm

650nm

700nm Wavelength (nm)

FITC

530/3

0

PE

585/42

Aumente o

valor

0.0

PERCP

670nm

Compensao PEC (- FITC/+ PEC)

Compensao (-FITC / - PEC) Ajustar as populaes para que a populao fique no quadrante duplo

negativo. Salvar

Aquire ---- Adquisio store: - definir R1 e o nmero de eventos Parmeter description--- Sample ID---nome de cada tubo passar os controles novamente clicando no settting para que grave Onde os valores de parmetros ficam armazenados?

II. Aquisio das Amostras

c) Salvar Aquire ---- Adquisio store: - definir R1 e o nmero de eventosParmeter description--- Sample ID---nome de cada tubo

Sem ajuste Com ajuste

Relative

Intensity Aumente o valor

1.2

Wavelength

(nm)

PE

585/42 PERCP

670nm

FITC

530/3

0

PE-Cy7

780/60

Apndice I. Calibrao automtica por beads - FACS comp.

1. Preparar os seguintes tubos a) 1 ml de FACS Flow + 1 gota de beads no marcados b) 3 ml de FACS Flow + 1 gota de cada fluorescncia

2. Abrir o FACS Comp a) defenir o tipode clula: se lavada ou no b) Cdigos: colocar os cdigos de cada beads c) Se vai se gravar ou no

II. Para puxar uma calibrao anterior

a) Uma calibrao anterior Abrir Citometer---- Instrument setting---Open----Puxar a calibrao anterior

b) Calibrao do FACS Comp Abrir FACS station-----BD files---- Instrument setting----Calibration files--- ---- Open--- set----Done

III. Imprimir relatrio

Abrir FACS station-----BD files ---FACS comp files--- Pasta do dia---- cliques

OBSERVAOES IMPORTANTES

Limpeza do filtro de ar. Lavar periodicamente com detergente neutro, deixando ele secar e recolocando na grade do filtro, sempre lembrando com a proteo metlica para baixo.

Limpeza do tanque de isoton Para a retirada da sonda tomar cuidado para no rodar toda a sonda, rodar somente a parte branca que envolve a sonda, pois pode levar a quebrar o fio que leva a informao para o aparelho se o isoton esta cheio ou vazio

Nvel dos tanques A importncia de verificar o nvel dos tanques: se o isoton estiver abaixo do nvel mnimo a coluna de ar ser maior que a de lquido, levando a adquirir muito ar podendo prejudicar as amostras.

Enchendo o tanque de isoton No momento em que for encher o tanque de isoton tomar cuidado com a limpeza do funil e do Becker, que poder a levar a cair partculas de sujeira que

acarretara no mal uso do citmetro podendo levar ate o entupimento do aparelho.

Tanque de waste O tanque de waste quando estive cheio descartar na pia, e depois colocar 100ml de hipoclorito concentrado e levar de volta ao citmetro.

Kit bsico importante ter um kit bsico na sala de citometria, que composto por um esguicho de gua bi destilada,de hipoclorito a 1% e outro de isoton, com uma observao importante, o hipoclorito no pode ficar em um frasco transparente por que s ira durar 1 dia e a gua tem que ser trocada diariamente por que pode criar alga.

Entupimento do citmetro Caso ocorra o entupimento do citmetro, temos 3 procedimentos que poderamos fazer para resolver. O 1 dando o prime no prprio aparelho com a gua no SIP, este procedimento ira provocar uma presso para o lado de fora do SIP tentando limpar o sugador. 2 passo usando uma seringa com um cano de plstico que ira ligar ao SIP que atravs da presso exercida que ser maior que a do prime para o desentupimento do SIP. 3 passo utilizando um fio muito fino que colocaremos dentro do SIP e empurrando de um lado e puxando do outro para desobstruir o SIP.