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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS APLICADAS EM PRODUTOS PARA SAÚDE
DARLAN FERREIRA DE SOUZA
“Escherichia coli e Staphylococcus warneri: FORMAÇÃO DE BIOFILME E AÇÃO DE
SANITIZANTES”
NITERÓI
2018
DARLAN FERREIRA DE SOUZA
“Escherichia coli e Staphyloccocus warneri: FORMAÇÃO DE BIOFILME E
AÇÃO DE SANITIZANTES”
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em
Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade
de Farmácia da Universidade Federal Fluminense.
Campo de Confluência: Microbiologia de Alimentos.
Orientadora:
Prof.a Dr.ª Luciana Maria Ramires Esper
Niterói
2018
DARLAN FERREIRA DE SOUZA
“Escherichia coli e Staphyloccocus warneri: FORMAÇÃO DE BIOFILME E
AÇÃO DE SANITIZANTES”
Dissertação apresentado ao Curso de Pós-graduação em
Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade
de Farmácia da Universidade Federal Fluminense.
Campo de Confluência: Microbiologia de Alimentos.
Aprovada em 25/04/2018
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________________
Prof.a Dr.ª Luciana Maria Ramires Esper – UFF
Orientadora
_________________________________________________________________
Prof.a Dr.ª Karen Signori Pereira - UFRJ
__________________________________________________________________
Prof. Dr. Robson Maia Franco - UFF
Niterói
2018
DEDICATÓRIA
Á esposa e companheira, Gabriela, pelo amor, incentivo e paciência.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Luciana Maria Ramires Esper pela amizade, por ter aceitado o
desafio, pela oportunidade, confiança e ensinamentos. Meu reconhecimento por tudo nesta
caminhada.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde e seus
docentes, o meu muito obrigado.
À CAPES pela bolsa de mestrado, possibilitando que eu me dedicasse a esse projeto.
Aos professores Dr.ª Lenise Arneiro e Dr.ª Geraldo Renato por acompanharem o meu
caminhar e contribuírem com incentivos e opiniões; bem como cedendo matérias primas,
materiais e instrumentos.
Às minhas amigas Caroline Nicolleti e Letícia Gonçalves que estiveram comigo tornando os
momentos nesta jornada mais agradáveis e produtivos.
RESUMO
SOUZA, D.F. “Escherichia coli e Staphylococcus warneri: Formação de biofilme e ação de
sanitizantes”. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a
Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2018.
Nas indústrias de alimentos devido à diversidade das matérias primas e dos produtos, pode
ocorrer a formação de biofilmes por diferentes micro-organismos e com comportamentos
variáveis. Em um biofilme composto por multi-espécies, fato este mais comum na natureza,
os produtos metabólicos de um microrganismo podem servir para a multiplicação e adesão de
outros. No presente trabalho avaliou-se a capacidade de formação de biofilmes microbianos
mono e multi-espécies em aço inoxidável AISI 304, amplamente utilizado na indústria, por
cepas de de Escherichia coli e Staphylococcus warneri isoladas de Vegetais Mínimamente
Processados (VMP), a ação de um programa de higienização que utiliza os sanitizantes ácido
peracético e hipoclorito de sódio sobre os biofilmes formados. Outro ponto relevante foi a
avaliação da resistência a agentes antimicrobianos. Das amostras avaliadas foram isoladas
colônias provenientes das análises de Staphylococcus spp e Coliformes a 45 ºC dos VMP. A
microbiota isolada foi identificada pela técnica de MALDI-TOF sendo Escherichia coli
obtido a partir de amostras de couve e Staphylococcus warneri obtido a partir de amostras de
rúcula. Evidenciou-se a capacidade de aderência e formação de biofilmes por Escherichia coli
e Staphylococcus warneri , atingindo valores superiores a 2 log UFC/cm2 após 24 horas de
contato evoluindo, após sete dias (168 horas), para os níveis mais elevados, 4,5 log UFC/cm2
para Staphylococcus warneri e 4,7 log UFC/cm2
Escherichia coli. Após a avalição da
resistência a antimicrobianos observou-se que houve resistência à Cefoxitina (30μg)
apresentado por Escherichia coli e à Penicilina (10un) por Staphylococcus warneri. Ambos
microrganismos apresentaram sensibilidade para os dois agentes sanitizantes hipocloríto de
sódio e ácido peracético. O presente estudo demonstrou a presença de microrganismos e a
relevância de uma ferramenta de identificação importante como a técnica de MALDI TOF
para a identificação mais precisa de microrganismos, possibilitando maiores estudos e
atualizações das recomendações referentes a inocuidade alimentar. Verificou-se que tanto a
Escherichia coli quanto o Staphylococcus warneri têm capacidade de formar biofilme
microbiano sendo estas potenciais fontes de contaminação, no entanto, também observou-se
que após a correta utilização do sanitizante os biofilmes foram eliminados ressaltando-se a
importância dos estabelecimentos manipuladores de alimentos investirem capacitação e
desenvolvimento de protocolos adequados de limpeza e desinfecção de áreas e equipamentos
envolvidos na produção de alimentos e manutenção e troca sempre que se fizer necessário.
Palavras-chave: Adesão; Alimentos; Antimicrobianos; Microbiota.
ABSTRACT
SOUZA, D.F. “Escherichia coli e Staphylococcus warneri: Biofilm formation and
sanitizing action”. Dissertation (Master’s degree). Programa de Pós-Graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal
Fluminense, 2018.
In food industries due to the diversity of the production of raw materials and products, the
formation of biofilms by different microorganisms and with varying behaviors may occur. In
a biofilm composed of multi-species, a fact that is more common in nature, the metabolic
products of a microorganism can serve for the multiplication and adhesion of others. The
present work evaluated the capacity of formation of mono and multi-species microbial
biofilms in stainless steel AISI 304, widely used in the industry, by strains of Escherichia coli
and Staphylococcus warneri isolated from minimally processed vegetables (VMP), the action
of a program of sanitizing that uses peracetic acid sanitizers and sodium hypochlorite on
formed biofilms. Another relevant point was the evaluation of resistance to antimicrobial
agents. From the evaluated samples, colonies were isolated from the analyzes of
Staphylococcus spp and Coliform at 45 ºC of VMP. They were identified by the MALDI-TOF
technique and Escherichia coli obtained from cabbage and Staphylococcus warneri samples
obtained from arugula samples. It was evidenced the capacity of adherence and formation of
biofilms by Escherichia coli and Staphylococcus warneri, reaching values higher than 2 log
CFU / cm 2 after 24 hours of contact after 7 days (168 hours), at the highest levels, 4, 5 log
CFU / cm 2 for Staphylococcus warneri and 4.7 log CFU / cm 2 Escherichia coli. After the
evaluation of antimicrobial resistance, resistance to Cefoxitin (30 μg) was observed by
Escherichia coli and Penicillin (10 μg) by Staphylococcus warneri. Both microorganisms
presented sensitivity to the two sanitizing agents sodium hypochlorite and peracetic acid. The
present study demonstrated the presence of microorganisms and importance of an
identification tool such as the MALDI TOF technique for more precise identification of
microorganisms, allowing for further studies and updates of recommendations regarding food
safety. It was verified that both Escherichia coli and Staphylococcus warneri have the ability
to form microbial biofilms being potential sources of contamination. However, it was also
observed that after the correct use of the sanitizer biofilms were eliminated.
Keywords: Biofilm; Food; Antimicrobian; Microbiota
.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Processo de formação do biofilme.........................................................................13
Figura 2 - Evolução da população de células sésseis de Escherichia coli..............................32
Figura 3 - Evolução da população de células sésseis de Staphylococcus warneri..................33
Figura 4 - Evolução da população de células sésseis de cultivo misto....................................33
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 09
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................11
2.1 BIOFILME........................................................................................................................11
2.2 Escherichia coli e Staphylococcus warneri........................................................................15
2.3 CONDIÇÕES SANITÁRIAS NA INDÚSTRIA.............................................................19
3. OBJETIVO..........................................................................................................................22
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................23
4.1 ISOLAMENTO DE Staphylococcus warneri...................................................................23
4.2 ISOLAMENTO DE Escherichia coli...............................................................................24
4.3 CARACTERIZAÇÃO POR MALDI –TOF MS............................................................23
4.4 TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS DOS ISOLADOS..............25
4.5 PREPARO DOS CUPONS DE AÇO INOXIDÁVEL...................................................26
4.6 DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS SÉSSEIS.....................................27
4.7 AÇÃO DOS AGENTES DE SANITIZANTES..............................................................27
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................................................27
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................... 29
6.CONCLUSÕES....................................................................................................................37
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................38
9
1. INTRODUÇÃO
O ritmo de vida atual faz com que os consumidores tenham cada vez menos tempo para
se dedicar à alimentação, preferindo alimentos que sejam saudáveis e, simultaneamente, de
preparação fácil e rápida. Os vegetais minimamente processados (VMP) surgiram para dar
resposta a essa nova tendência de consumo e têm tido uma aceitação cada vez maior nos
mercados mundiais (KORHONEN, 2002; RAGAERT et al.; 2004). Diversos autores
verificaram a ocorrência de microrganismos patogênicos em vegetais, particularmente em
VMP, como Salmonella spp (BHAGWAT, 2004; ELVISS et al.; 2009; KHOO et al.; 2009),
Escherichia coli (BALAGUÉ et al.; 2006) e Listeria monocytogenes
(CORDANO;JACQUET, 2009; LITTLE et al.; 2007; PONNIAH et al.; 2010).
Segundo a Organização Mundial da Saúde, cerca de 2,2 milhões de pessoas morrem
anualmente em função de contaminação alimentar, sendo sua maioria crianças. Estas doenças
são causadas por patógenos já conhecidos, principalmente bactérias.
Um dos desafios é a correta identificação dos microrganismos envolvidos nos casos e
surtos para ações preventivas e corretivas de inocuidade alimentar. Os métodos tradicionais de
análise microbiológica ainda são os mais utilizados. A identificação dos microrganismos
demora pelo menos dois dias podendo chegar a semanas dependendo do microrganismo em
questão. Outro ponto importante nos métodos citados é a dificuldade de diferenciação de
microrganismos de gênero e espécies diferentes, mas com características fenotípicas
similares. Para tanto, há necessidade de complementação com métodos sorológicos e
genotípicos. Em geral, os testes sorológicos têm baixo nível de discriminação e estão restritos
às espécies para as quais os anticorpos estão disponíveis, já os métodos genotípicos são
rápidos e de alta sensibilidade e especificidade, porem são caros e exigem grande
conhecimento técnico, não sendo viável para uma rotina laboratorial (PAVLOVIC et al,
2013). A ionização por dessorção a laser assistida por matriz, cuja sigla em inglês é MALDI
(Matrix Assisted Lazer Desorption Ionization), seguido pela detecção em um analisador do
tipo tempo de vôo, sigla TOF (do inglês Time of flight), é uma tecnica de análise por
espectrometria de massas, que tem sido, na ultima década, utilizada como um método rápido e
confiável para identificação de microrganismos. Ao contrario dos métodos genotípicos, este
método pode ser facilmente incorporado na rotina de analises. Todos os microrganismos
oriundos de alimentos podem ser analisados pelo mesmo protocolo, tendo como tempo total
de analise de 16 horas (JANG;KIM, 2018, PAVLOVIC et al; 2013)
10
O gênero Staphyloccocus é amplamente disseminado no ambiente tem sido
frequentemente isolado em alimentos e ambientes além de sua importância clinica. A
presença de enterotoxinas estafilocócicas em alimentos pode causar doenças. Embora a
produção de toxinas seja a maior causa de doenças relacionadas a alimentos por
Staphyloccocus spp.; outros aspectos químicos e biofísicos como formação de biofilmes,
resistência a antimicrobianos, sensibilidade a sanitizantes e produção de aminas biogênicas
podem contribuir para a patogenicidade destes microrganismos (MARINO et al; 2011). A
legislação brasileira não exige a identificação das espécies de Staphyloccocus, somente a
classificação como coagulase positiva. Porém é notório que os microrganismos coagulase
negativa tem importância em saúde pública, reforçando a necessidade de um método de
identificação confiável, preciso e rápido para que microrganismos importantes não sejam
negligenciados
Outro ponto importante na inocuidade de alimentos e o local de processamento e
consumo. As superfícies ou utensílios que entram em contato com os alimentos não deveriam
contaminar os produtos durante o processamento e industrialização, porém sabe-se que em
determinadas situações microrganismos patogênicos e/ou deteriorantes se depositam, aderem
e interagem com as superfícies onde iniciam o crescimento celular. Ao se multiplicarem,
formam micro-colônias e quando a massa celular é suficiente para serem agregados
nutrientes, resíduos e outros microrganismos forma-se o que é denominado biofilme
microbiano (ANDRADE et al; 2008).
Nas indústrias de alimentos devido à diversidade da produção, das matérias primas e
dos produtos, pode ocorrer a formação de biofilmes por diferentes microrganismos e com
comportamentos variáveis. Em um biofilme multi-espécies, fato este mais comum na
natureza, os produtos metabólicos de um microrganismo podem servir para a multiplicação da
outra espécie e a adesão de uma espécie pode prover substâncias ligantes que permitem a
adesão de outras. Todavia, a competição por nutrientes e o acúmulo de produtos tóxicos
gerados podem limitar a diversidade microbiana em um biofilme. (ANDRADE et al; 2008).
A habilidade dos microrganismos de origem alimentar aderirem e formarem biofilmes
em superfícies são descritos em diversos trabalhos (GANDARA et al; 2000; JAIN; CHEIN;
2007; SHARMA et al; 2002;).
Microrganismos aderidos a superfícies de contato com alimentos podem constituir um
potencial perigo pela possível contaminação cruzada no processamento desses alimentos
(POULSEN, 1999; SHI et al; 2009).
11
Diversas superfícies utilizadas no processamento de alimentos são passíveis de
apresentar adesão ou formação de biofilme de origem bacteriana. O material usualmente
utilizado na fabricação de equipamentos e utensílios na indústria de alimentos são as chapas
de aço inoxidável tipo AISI 304 acabamento n°4. Porém, frequentemente, superfícies de aço
inoxidável são reconhecidas como importantes fontes de contaminação microbiana
(CHMIELEWSKI;FRANK, 2003).
Quando as células do biofilme se desprendem, os microrganismos podem contaminar
os alimentos e/ou serem disseminados para outros pontos da superfície, equipamentos e
ambientes (POULSEN, 1999).
Nas mais diversas indústrias de processamento de alimentos, outros microrganismos
aderidos à superfícies que entram em contato com os alimentos já foram identificados, como
Salmonella spp, Campylobacter spp, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fragi, Micrococcus spp,
Enterococcus faecium, Bacillus cereus (GUNDUZ; TUNCEL; 2006; SZCZUKA;
KRZYMIŃSKA; KAZNOWSKI; 2016; ZOTTOLA et al, 1995).
Um biofilme é definido como um agregado de microrganismos que vivem juntos como
uma comunidade e muitas vezes são encontrados em superfícies sólidas em ambiente úmido.
Os microrganismos em um biofilme secretam uma variedade de substâncias protetoras
denominadas exopolissacarideos (EPS) que aumentam a eficiência da sobrevivência
(SZCZUKA et al, 2016).
Escherichia coli é o principal agente causador de muitas infecções intestinais. As
células bacterianas densas no biofilme comunicam entre si por via de sinalização química
conhecida como Quorum Sensing (QS). Durante o QS, as células bacterianas segregam
substâncias autoinductoras (AI) para o meio extracelular e, uma vez que a alta densidade
requerida é alcançada, aumentam a formação e a maturação do biofilme (STURBELLE et al,
2015).
Depois de formados os biofilmes são de difícil remoção das superfícies devido às
dificuldades associadas à limpeza de complexos equipamentos e ambiente de processamento,
transformando-se assim em potenciais fontes de contaminação para alimentos como os
vegetais minimamnte processados (PARIZZI et al; 2004).
12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 BIOFILME
Grande parte das atividades bacterianas não ocorre com as células individualizadas
crescendo de maneira planctônica (livres em suspensão), mas sim organizadas em
comunidades com diferentes níveis de complexidade (DUNNE, 2002). As bactérias são
dotadas de capacidade de crescer e aderir em quase todas as superfícies, formando
comunidades complexas denominadas biofilmes. (Figura 1) (DUNNE, 2002).
Nestes biofilmes, as células crescem formando agregados multicelulares que são
incorporados a uma matriz extracelular produzida pelas próprias bactérias composta por
substâncias poliméricas extracelulares que podem conter polissacarídeos, proteínas,
fosfolipídios, ácidos nucléicos e teicóicos entre outras substâncias poliméricas hidratadas,
podendo ter de 85% a 95% de água (BRANDA et al, 2005; SUTHERLAND, 1983). Para que
ocorra o processo de adesão bacteriana são observadas variáveis importantes como: a espécie
bacteriana, as propriedades físico-químicas da superfície de adesão, fatores ambientais e a
expressão de genes responsáveis pela formação do biofilme (DUNNE, 2002; DI
BONAVENTURA et al, 2008). As substâncias poliméricas extracelulares proporcionam
proteção aos habitantes do biofilme, impedindo o acesso de biocidas, metais, toxinas,
prevenindo a dessecação e promovendo a concentrando os nutrientes (CARPENTIER; CERF;
1993).
O crescimento celular ocorre abaixo da matriz, formando um biofilme mono-espécie
ou em uma associação com outros microrganismos (biofilme multi-espécie), conferindo desta
maneira o aumento na resistência contra a ação de agentes sanitizantes, radiação UV e
alterações de pH (VESTBY et al.; 2009).
Os mecanismos celulares subjacentes de formação de biofilme microbiano estão
começando a ser compreendidos e são alvo para estratégias de intervenção específica com o
objetivo de controlar os problemas causados pela sua formação nestas diferentes áreas e em
particular para o ambiente de processamento de alimentos. (PARIZZI et al; 2004).
13
Figura 1 – Processo de formação do biofilme. Retirado de Tremblay et. al.; 2014
A formação de biofilmes é um processo dinâmico que envolve uma série de etapas. A
adesão a um substrato pode ser ativa ou passiva dependendo da motilidade celular. Na adesão
ativa, a superfície da célula bacteriana auxilia a fixação inicial. A fixação passiva é
impulsionada pela gravidade, difusão e dinâmica de fluidos. Propriedades da superfície
celular como os flagelos permitem as bactérias se movam para um sítio de ligação específico.
Fatores como pili, proteína adesina, cápsulas e interação à superficie influênciada pela carga
podem contruir de maneira significativa ao processo de adesão (DAVEY; O'TOOLE; 2000;
KUMAR et al; 1998).
O LPS desempenha um papel na adesão inicial. Nos mutantes de E. coli, a perda de
LPS resultou na diminuição da capacidade das células de se fixarem a superfícies (DAVEY;
O'TOOLE; 2000). Pili agem na ancoragem de bactérias em algumas superfícies (NETTING,
2001) e também atuam como sensores direcionando as células a se moverem para locais
específicos de fixação. A adesão de células bacterianas é influenciada pelas propriedades
físico-químicas da superfície das células, que por sua vez são influenciadas por fatores como
taxa de crescimento microbiano, meio de crescimento e condições de cultura (tempo e
temperatura). As bactérias têm uma carga superficial negativa e geralmente se comportam
como partículas hidrofóbicas, mas o grau de hidrofobicidade pode mudar com a fase de
14
crescimento. A hidrofobicidade geralmente diminui à medida que a taxa de crescimento
aumenta (BOULANGE-PETERMAN, 1996).
A adesão pode ser clasificada em dois estágios: Reversível seguido de Irreversível
(MITTELMAN, 1998). A adesão reversível é uma interação inicial fraca de bactérias com um
substrato ou superfície inanimada, envolvendo interações intermoleculares como van der
Waals, forças eletrostáticas e interações hidrofóbicas. Durante esta fase ainda é possivel
removê-las facilmente pela aplicação de força de cisalhamento leve (CHMIELEWSKI;
FRANK, 2003).
A fixação irreversível resulta da produção de polímeros extracelulares resultando na
ancoragem de anexos (SUTHERLAND, 1983). As cargas negativas podem gerar forças
repulsivas geralmente quando o substrato e a célula bacteriana estão carregados
negativamente impedindo desta maneira o contato bacteriano direto com o substrato (PRATT;
KOLTER, 1998; VATANYOOPAISARN et al; 2000). Pesquisadores indicaram que o tempo
para a adesão irreversível varia de apenas 20 minutos podendo chegar a um máximo de 4h
com uma variação na temperatura de 4°C à 20°C (GILBERT et al, 1991;
VATANYOOPAISARN et al, 2000).
A ligação irreversível é um processo fisiológico sob regulação genética. Estudos
utilizando S. aureus, E. coli e S. epidermis demonstram que os genes responsáveis pela
expressão de proteinas de superfície, ligação e produção de EPS são ativados em resposta a
estímulos externos, como densidade populacional, estresse ou limitação de nutrientes
(ADAMS-MCLEAN, 1999; CRAMTON et al, 1999; DALTON et al 1998; PRATT-
KOLTER, 1998).
A formação de microcolônias prosseguirá após a adesão irreversível e em condições
adequadas de crescimento resultando em agregação e crescimento simultâneos de
microorganismos, acompanhada pela produção de EPS (CHMIELEWSKI-FRANK, 2003)
Após este estágio de adesão irreversível a remoção das células fica mais difícil e
requer a aplicação de força de cisalhamento forte ou ainda a utilização de substâncias
químicas como detergentes, surfactantes ou sanitizantes para ruptura das forças de fixação
(BOWER et al 1996).
Briandet et al (1999) demonstraram que a maior adesão de bactérias ao aço inoxidável
ocorreu em uma solução de alta força iônica, enquanto a menor fixação ocorreu sob condições
15
alcalinas. A repulsão eletrostática entre a célula e a superfície de fixação é importante para a
solução de suspensão fornecer uma camada de condicionamento na superfície de fixação para
superar a repulsão.
Quando existirem condições adequadas ao crescimento e para aglomeração, o biofilme
pode se desenvolver pela formação de uma estrutura organizada. Este processo é chamado de
maturação. O biofilme maduro pode ser consistituido em uma única camada de células em
polímero extracelular poroso mantidas juntas com EPS e canais de água (CHMIELEWSKI ;
FRANK, 2003).
2.2 Escherichia coli e Staphylococcus warneri
As bactérias do género Escherichia coli pertencem à família Enterobacteriaceae, são
bactérias Gram-negativas, anaeróbias facultativas, fermentadoras de açúcares. Podem crescer
a temperaturas entre 8ºC e 48ºC. A temperatura ótima de crescimento é de aproximadamente
39ºC e o pH ótimo para crescimento é de 6,0 à 8,0, podendo crescer lentamente em até o pH
4,3 (CHAURET, 2011). Descrita em 1885 pelo pesquisador Theodore Escherich, recebendo
inicialmente a denominação de Bacillus coli comune. Após uma revisão foi renomeada para
Escherichia coli em sua referência (CHEN et al 2005).
Escherichia coli coloniza o trato gastrointestinal de bebês humanos dentro de algumas
horas após o nascimento. Normalmente, Escherichia coli e seu hospedeiro humano coexistem
com benefício mútuo por décadas. Essas cepas de Escherichia coli raramente causam doença,
exceto em hospedeiros imunocomprometidos. No entanto, existem vários clones de
Escherichia coli altamente adaptados que adquiriram atributos específicos de virulência, o
que confere uma maior capacidade de adaptação a novos nichos e permite que eles causem
um amplo espectro de doenças (XIONG et al, 2012).
Três síndromes clínicas gerais podem resultar da infecção por um dos clones: doença
entérica / diarreica, infecções do trato urinário (ITUs) e sepse / meningite. As doenças
diarréicas são um problema de saúde muito importante especialmente nos países em
desenvolvimento. Vários fatores biológicos contribuem para levar à morte centenas de
milhares de pessoas, incluindo crianças. A diarréia infecciosa ocorre especialmente em áreas
com baixos índices de saneamento básico e educação, uma das maiores taxas de prevalência e
16
muitos destes casos são causados por cepas de Escherichia coli (DE PAULA; CASARIN;
TONDO; 2014).
Com base em diferenças antigênicas e mecanismo de patogenicidade a bactéria
Escherichia coli causadora de diarréia é dividida em 6 grupos: Escherichia coli
Enteroaggregative (CEEA), Escherichia coli Enterohemorrhagica (EHEC), Escherichia coli
Enteroinvasiva (EIEC), Escherichia coli Enteropathogênica (EPEC), Escherichia coli
Enterotoxigênica (ETEC), e Escherichia coli difusa aderente (DAEC). ETEC é uma das
causas mais importantes de diarréia bacteriana em países em desenvolvimento e é um
importante grupo de patógenos emergentes transmitidos por alimentos nos últimos anos
principalmente o sorotipo E. coli 0157:H72 (XIONG et al, 2012).
Em 1992 a cepa E. coli O157:H7 ganhou notoriedade, quando acometeu mais de 700 pessoas
em um surto de colite hemorrágica que resultou na morte de quatro crianças. Desde então,
esse microrganismo vem sendo reconhecido como um importante patógeno alimentar
emergente a nível mundial (DE PAULA; CASARIN; TONDO; 2014).
Praticamente todos alimentos de origem vegetal e animal podem carrear Escherichia
coli desde que não tenham sido devidamente processados e tenham contato com possíveis
contaminantes. Os alimentos crus, especialmente os de origem animal como exemplo leite
não pasteurizado, são frequentemente contaminados com Escherichia coli (ELSA, 2011;
FERENS; HOVDE; 2011). O número de surtos de origem alimentar associados a esses
produtos aumentou consideravelmente (BUCK; WALCOTT; BEUCHAT; 2003; LYNCH;
TAUXE; HEDBERG; 2009). Neste contexto, os alimentos consumido in natura são
considerados alimentos de alto risco. O surto de Escherichia coli O104: H4 de sementes
germinadas na Alemanha ressalta a relevância emergente do consumo desses produtos em
questões de segurança alimentar (SOON; SEAMAN; BAINES; 2013).
Callejón et al (2015) correlacionam evidências substanciais onde sugerem que a
contaminação de produtos frescos com patógenos é significativa e pode contribuir para a
carga de doenças alimentares. Sugeriram ainda que Salmonella e Escherichia coli são
enquadrados como os patógenos mais comuns relacionados aos surtos de produtos frescos,
principalmente ao consumo de saladas nos Estados Unidos.
17
Wright et al; 2013 demosntram que E. coli colonizam / persistem na superfície, bem
como nos tecidos internos das plantas, tanto no estilo de vida epifítico quanto endofítico,
respectivamente (WRIGHT et al, 2013).
Verma et al; 2018 demonstraram que as bacterias Escherichia coli e Salmonella spp
isoladas apartir de vegetais e frutas exibem características fenotípicas / virulência distintas
que podem estar ligadas a questões de segurança alimentar. Escherichia coli foi o segundo
patógeno mais comum identificado como a causa de surtos em várias localidades nos Estados
Unidos dentre estas a cepa E. coli O157 foi a mais prevalente estando associada ao consumo
de vários vegetais frescos, frutas e brotos, mas especialmente na alface e nos sucos de maçã
não pasteurizados.
Nos relatórios da organização mundial da saúde, o número de mortes por diarréia
causada Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC), foi estimada em cerca de 157 mil pessoas
por ano. Em 2013, foram registrados uma média de 42.000 mortes por diarréia causada por
Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC) em crianças menores de 5 anos. No mesmo ano na
África e no sul da Ásia, mais de 89 mil mortes de crianças foram registradas.
No Brasil, existem poucos dados epidemiológicos disponíveis que associam alimentos
com a ocorrência de E. coli O157:H7, contudo, observam-se registros de ocorrência de casos
nos últimos anos.
Staphylococcus warneri é um dos mais predominantes Staphylococcus coagulase
negativa novobiocina sensivel encontrados na pele humana (NAGASE et al, 2002). É um
patógeno oportunista causador de graves infecções entre as quais endocardite, osteomielite,
infecções do trato urinário e sepse em neonatos (ANNOUN et al, 2004; ARSLAN et al.;
2011; BUTTERY et al, 1997; KAMATH et al, 1992; LEGIUS et al, 2012; MEHR et al, 2002;
STÖLLBERGER et al, 2006; TORRE et al, 1992; WESLEY et al, 1975; WOOD; 1992).
Estas infecções ocorrem predominantemente em pacientes imunocomprometidos e oriundos
de cirurgias com implante de dispositivos de aplicação médica (ARCIOLA et al.; 2006).
Outras espécies de Staphylococcus coagulase negativo vem sendo caracterizado como
patógeno emergente. Staphylococcus warneri tem sido capaz de causar infecções graves
geralmente associadas à presença de materiais de implantes inclusive em alguns casos em
pacientes considerados imunocompetentes (CAMPOCCIA et al, 2010).
18
Wood, 1992 relatou que a partir dos anos 1990 uma quantidade considerável de dados
foi observado o papel patogênico para bactéria, estando diretamente atrelado ao refinamento
progressivo das técnicas de identificação nas últimas três décadas o que fazia o patógeno até
então ter sua identificação negligenciada.
Marino et al; 2011 isolaram Staphylococcus warneri apartir de 52 amostras refeições
quentes e frias coletados em vários restaurantes no nordeste da Itália. Segundo Campoccia et
al; 2010 Staphylococcus warneri pode ser frequentemente identificado em vários tipos de
alimentos, incluindo queijo e salsichas e ainda constataram que infecções ortopédicas que
envolviam cepas de Staphylococcus warneri possuiam baixo potencial de resistência a
antimicrobianos, contrapondo a cepas isoladas em unidades de terapia intensiva neonatal,
onde esta espécie foi descrita dentre os principais agentes causadores de sepse e que exibem
um perfil alarmante de resistência à antimicrobianos.
Musharrafieh et al 2014 afirmaram que Staphylococcus warneri faz parte da
microbiota residente da epiderme da pele da truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss). Em baixas
concentrações, Staphylococcus warneri parece ser inócuo para o hospedeiro, induzindo
citocinas antiinflamatórias. No entanto eventualmente a ruptura com a simbiose ou outra
alteração da homeostase da pele pode levar ao crescimento excessivo desta bacteria,
possibilitando o aumento do potencial para intoxicação alimentar caso não seja higienizado ou
preparado corretamente.
Fijałkowski et al; 2016 sugeriram a importância para a saúde pública ressaltando a alta
prevalência de genes da enterotoxina estafilocócica em Staphylococcus warneri destacando o
potencial para intoxicação alimentar causada pela espécie bacteriana.
Szczuka et al; 2016 sugerem que os isolados clínicos de Staphylococcus warneri têm a
capacidade de invadir células não fagocíticas permitindo que as células facilitem sua
persistência e, portanto, podem ser um importante fator de virulência. Um mecanismo
multifatorial de patogenicidade existente em Staphylococcus warneri faz com que sejam
capazes de aderir, produzir biofilme, invadir e destruir células epiteliais conferindo desta
maneira uma forma de resistência bacteriana. Algumas cepas de Staphylococcus warneri
possuem a capacidade de se aderir a superfície de poliestireno para a formação de biofilme in
vitro.
19
Um caso relatado em uma unidade de tratamento intensivo neonatal, de um clone de
Staphylococcus warneri resistente a vancomicina. A importância etiológica das cepas de
Staphylococcus coagulase negativo tem sido negligenciada, o que gera classifcações errôneas,
em alguns casos, sendo classificado como um mero contaminante (TERÁN et al; 2013).
2.3 CONDIÇÕES SANITÁRIAS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS
A manutenção das condições sanitárias é um grande desafio encontrado pelas
indústrias de alimentos. Os equipamentos utilizados na linha de processamento possuem
fendas, válvulas e juntas que dificultam a ação eficiente dos agentes sanitizantes. (POULSEN,
1999).
Objetiva-se, principalmente, no processo de limpeza a remoção de resíduos.
Indiretamente, a remoção destes resíduos é também um ponto crítico na destruição celular e
controle de biofilmes. Métodos adequados são usados para remover o produto depositado
sobre a superfície de contato e também remover a matriz do biofilme existente (ZOTTOLA;
SASAHARA,1994), considerando que a remoção incompleta possibilita a religação de
bactérias a superfície e a formação de um novo biofilme (GIBSON et al; 1999), além de
contaminar os alimentos e/ou serem disseminados para outros pontos da superfície,
equipamentos e ambientes (POULSEN, 1999).
A limitação de nutrientes e água, o design de equipamentos e o controle de
temperatura são importantes no controle do biofilme. Contudo, muitas vezes não é possível
alterar de maneira significativa tais condições ao ponto de garantir um controle eficaz à
formação do biofilme, necessitando aplicar um sistema de limpeza efetiva nos potenciais
locais de crescimento (FRANK, 2000).
O crescimento de biofilmes em ambientes de processamento de alimentos leva a uma
maior oportunidade de contaminação microbiana do produto processado aumentando o risco
de redução na validade comercial e pode levar a transmissão de agentes etiológicos de
doenças. Microorganismos dentro de biofilmes são protegidos de desinfetantes (FRANK,
2000), aumentando a probabilidade de sobrevivência e contaminação subsequente nos
alimentos.
20
A técnica de sanitização inadequada possibilita que resíduos se acumulem gerando um
ambiente propenso a colonização por bactérias especialmente sob forma de biofilmes. A
colonização das superfícies onde são processados os alimentos podem desencadear vários
problemas de saúde pública pois o biofilme pode ser fonte de contaminação de
microrganismos patogênicos, além dos problemas de ordem econômica com as bactérias
deteriorantes, que podem contaminar produtos alimentícios alterando suas características e
levando a perdas econômicas (CAIXETA, 2008).
A maior parte dos agentes químicos de limpeza usados na indústria de processamento
de alimentos são compostos alcalinos que atuam como detergentes para gordura e proteína.
Podem ser usados em combinação com sequestrantes ou quelantes e agentes umectantes
aniônicos (compatíveis com produtos de limpeza ácidos ou alcalinos). Em muitas situações é
necessário o uso de agentes químicos para limpar as superfícies (CHMIELEWSKI;FRANK,
2003).
Os agentes sanitizantes utilizados em muitas indústrias de processamento de alimentos
geralmente são o hipoclorito de sódio, cloraminas orgânicas, dióxido de cloro, iodóforos,
compostos de amônia quaternaria, àcido peracético, peróxido de hidrogênio, álcool-
clorexidina (ANDRADE; PINTO; LIMA; 2008). A eficácia dos agentes sanitizantes é
limitada por alguns fatores dentre os quais a dureza da água, temperatura de aplicações e
capacidade de contato físico com os microrganismos sobreviventes (GIBSON et al, 1999).
Em geral, descobriu-se que o ácido peracético é eficaz contra bactérias de biofilme e é
vantajoso usar se o biofilme contiver resíduos de alimentos (CHMIELEWSKI; FRANK;
2003).
O cloro é comumente aplicado como um desinfetante devido ao seu poder oxidante e
desinfetante. É altamente tóxico para os microrganismos sob forma de hipoclorito em uma
faixa de pH 4 a 7. (DE BEER; SRINIVASAN; STEWART; 1994).
Rossoni e Gaylarde (2000) demonstraram que o hipoclorito foi mais eficaz na
inativação de uma cultura mista de E. coli, P. fluorescens e S. aureus ligada ao aço inoxidável
do que o ácido peracético.
Zottola; Sasahara (1994) forneceram evidências de que os tratamentos químicos
podem destruir os biofilmes. A remoção do biofilme foi influenciada pelo tempo e
temperatura em que ocorreu a limpeza e ainda pela presença de quelantes na solução de
21
limpeza e que a aplicação de sanitizantes é essencial para inativar microrganismos
remanescentes na superfície após a limpeza.
O Aço inoxidável tipo 304, com acabamento 2B (laminado a frio), nº 4 ou
eletropolido, é frequentemete usado para fabricação de equipamentos e utensílios. Essas
superfícies podem ser desgastadas ao longo do tempo favorecendo capacidade das bactérias se
aderirem (HOLAH;THORNE, 1990). Esta condição cria proteção contra a limpeza e a
sanitização e consequentemente cria um refúgio para o crescimento bacteriano
(CHMIELEWSKI-FRANK, 2003). Os microrganismos são dotados de capacidade de se
aderir a superfícies inertes e desta maneira estabelecer o processo de formação do biofilme
(CHAURET, 2011).
Nesse et al; 2014 demonstraram que isolados de três sorotipos de Escherichia coli
investigados podem produzir biofilme em aço inoxidável, vidro e poliestireno a 12° C, 20° C
e 37°C, indicando a possibilidade da formação de biofilme em várias superfícies e em
variadas temperaturas relevantes para a produção e manejo de alimentos. Analisaram ainda
que existe uma boa correlação geral entre os resultados obtidos nas diferentes superfícies,
constatando que os isolados de E coli O103:H2 produziram muito mais biofilme que os
outros dois sorotipos nas três temperaturas.
Em instalações produtoras de alimentos, o biofilme pode servir como um reservatório
para a contaminação cruzada dos produtos e como um ambiente para a disseminação de genes
de virulência e achados de novos isolados patogênicos de Escherichia coli (NESSE et al,
2014).
22
3. OBJETIVOS
Avaliar a capacidade de formação de biofilmes microbianos mono e multi-espécies em
aço inoxidável AISI 304, por cepas de Escherichia coli e Staphylococcus warneri isoladas de
vegetais minimamente processados (VMP) adquiridos no município de Niteroi-RJ
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Testar a ação dos agentes sanitizantes, ácido peracético e hipoclorito de sódio na
eliminação desses biofilmes.
Estudar a sensibilidade aos agentes antimicrobianos das cepas de Escherichia coli e
Staphylococcus warneri.
Caracterizar utilizando a técnica MALDI-TOF MS os coliformes termotolerantes e
Staphylococcus spp
Analizar a ação dos sanitizantes sobre as células sésseis.
23
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ISOLAMENTO DE Staphylococcus warneri
O isolamento de Staphylococcus warneri foi realizado pela pesquisa de
Staphylococcus spp em Vegetais Minimamente Processadas (VMP) prontos para consumo
(couve, beterraba, cenoura e rúcula) adquiridas no comércio local (Niterói-RJ) utilizando o
método de contagem direta em placas segundo a “American Public Health Association” do
“Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods” (APHA, 2001).
Foi procedida a homogeneização, em stomacher, de 25 g da amostra em 225 mL de água
peptonada a 0,1%. Em seguida foram realizadas diluições 10-2
e 10-3
. Foi inoculado 1 mL da
diluição 10-1 na superfície de três placas (0,4; 0,3 e 0,3 mL para cada placa) contendo o meio
Ágar Baird-Parker (BP) suplementado com emulsão gema de ovo com telurito de potássio a
1%, usando-se a técnica “spread plate”. Para as diluições 10-2
e 10-3
foram semeados 0,1 mL
em diferentes placas. O inóculo foi espalhado com auxílio de uma alça de Drigalski, das
placas de maior para as placas de menor diluição, até que todo o excesso da diluição fosse
absorvido. Após a total absorção as placas foram invertidas e incubadas a 35-37°C por 24-48
horas.
Foram selecionadas para contagem as placas com 20 a 200 colônias. Foram contadas
as colônias típicas de Staphylococcus aureus, que são circulares, pretas ou cinza escuras, com
2-3 mm de diâmetro, lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de células esbranquiçadas
nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para além
da zona opaca. As colônias atípicas, pretas ou cinza escura, sem um ou ambos os halos típicos
foram contadas separadamente. Foram selecionadas ao menos cinco colônias típicas e atípicas
para posterior identificação, exceto nas placas em que havia menos de cinco colônias, nas
quais todas foram selecionadas. As colônias selecionadas nas placas foram inoculadas, com
auxílio de uma alça bacteriológica, em tubos contendo 2 mL de caldo Tryptic Soy Broth
(TSB). Os tubos foram incubados a 350C± 2
0C por 24 ± 2 horas. Após a incubação, o caldo
TSB contendo crescimento foi transferido para Eppendorfs contendo 20% de glicerol,
homogeneizados e incubados a -200C para posterior identificação das espécies pela técnica de
24
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight mass
spectrometry (MALDI-TOF).
4.2 ISOLAMENTO DE Escherichia coli
Para o isolamento de Escherichia coli, realizou-se inicialmente a contagem de
coliformes termotolerantes a 450C em vegetais minimamente processadas (VMP) prontas para
consumo adquiridas no comercio local (Niterói-RJ) pela técnica do Número Mais Provável
(NMP) conforme preconizado pela “American Public Health Association” do “Compendium
of Methods for the Microbiological Examination of Foods”(APHA, 2001). Foi realizada a
homogeneização, em stomacher, de 25 g da amostra em 225 mL de água peptonada a 0,1%.
Em seguida foram realizadas diluições 10-2
e 10-3
. A partir das três diluições foi transferido 1
mL de cada diluição para uma série de três tubos contendo 10 mL de Caldo Lauril Sulfato
Triptose (LST) com um tubo de Durham invertido em cada. Em seguida, os tubos foram
incubados a 350C ± 0,5ºC por 24-48±2horas.
Os tubos positivos, em que houve crescimento e produção de gás,foram separados e
semeados com o auxílio de uma alça bacteriológica em tubos contendo 10mL de Caldo
Escherichia coli (EC) e, incubados em banho-maria a 44,5°C + 0,2°C por 24-48 horas.
Ao passar o tempo estabelecido, os tubos que apresentaram crescimento com produção
de gás foram classificados como positivos.
A partir dos tubos positivos para coliformes termotolerantes a 450C foram feitas estrias
de esgotamento em placas de Petri contendo Trypticase Soy Agar (TSA), que, em seguida,
foram incubadas à 35°C ± 1°C por 24 ± 2 horas. Colônias de diferentes tipos morfológicos
foram selecionadas nas placas e inoculadas, com auxílio de uma alça bacteriológica, em tubos
contendo 2 mL de caldo TSB (Tryptic Soy Broth). Esses tubos foram incubados a 350C ± 2
0C
por 24 ± 2 horas. Após a incubação, o caldo TSB contendo as colônias foi transferido para
eppendorfs contendo 20% de glicerol, homogeneizados e incubados a -200C para posterior
identificação das espécies pela técnica de MALDI-TOF.
25
4.3 CARACTERIZAÇÃO POR MALDI-TOF MS
Esta etapa foi realizada para 40 cultivos de coliformes termotolerantes e
Staphylococcus spp selecionadas a partir dos resultados obtidos nas etapas relativas aos itens
anteriores. As amostras foram semeadas em placas de ágar TSA e incubadas a 37°C por 24 h.
A partir do crescimento obtido, algumas colônias foram depositadas em tubos Eppendorfs
onde foram adicionados 5 µL de ácido fórmico 70 % e 5 µL de acetonitrila. Após
centrifugação a 5000 g por 3 min, 1 µL do sobrenadante foi aplicado em áreas demarcadas da
placa de aço inoxidável polida fornecida pelo fabricante do equipamento (MSP 96 target
polished steel BC, Bruker Daltonics, Alemanha) e coberto com 1 µL da matriz HCCA
[constituida por uma solução de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico a 10mg/ml em acetonitrila a
50% e ácido tricloroacético a 2,5%]. Os espectros foram gerados com auxílio do
espectrômetro de massa Microflex LT, utilizando o software FlexControl no modo
automático. A calibração do aparelho foi realizada conforme as instruções do fabricante. Os
espectros obtidos foram analisados com auxílio do software BioNumerics v7.1 (Applied
Maths, Bélgica).
4.4 TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS DOS ISOLADOS
Os microganismos selecionados (S. warneri e E. coli) foram testados frente a
antimicrobianos, segundo método recomendado pelo “Clinical and Laboratory Standards
Institute” (CLSI, 2014). A partir das amostras congeladas em TSB com glicerol, foi retirada
uma alçada para semeadura em placas contendo TSA, seguida por incubação em estufa a 350C
± 0,5ºC por 24-48 ± 2 horas. A superfície de cada colônia foi tocada com uma alça
esterilizada e os microrganismos foram transferidos para um tubo contendo 5 mL de solução
salina a 0,9%. Após agitação dos tubos em vórtex, a turbidez da cultura com solução salina foi
ajustada de modo a obter uma turbidez óptica comparável à da solução padrão de McFarland a
0,5. Na suspensão ajustada, foi mergulhado um swab de algodão estéril para, em seguida,
inocular a superfície de uma placa contendo ágar Müeller-Hinton, espalhando o swab por toda
a superfície do ágar, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo. Depois que todo o
inóculo foi absorvido pelo ágar, foram aplicados os discos impregnados de antimicrobianos.
26
Os discos utilizados foram selecionados de acordo com a tabela 1A do CLSI. As
placas incubadas a 35° C por 18-24 horas.
Após incubação, a leitura dos resultados de sensibilidade aos antimicrobianos foi
realizada medindo-se o tamanho dos halos de inibição de crescimento bacteriano com um
halômetro, sendo a cepa bacteriana classificada em sensível, intermediário ou resistente, em
função do diâmetro da zona de sensibilidade padrão estabelecida para cada antimicrobiano
(CLSI, 2012).
4.5 PREPARO DOS CUPONS DE AÇO INOXIDÁVEL
Foi utilizado como corpo de prova cupons de aço inoxidável AISI 304 # 4, material
mais utilizado na construção de equipamentos para o processamento de alimentos. Cada
cupom tem dimensões de 10 x 10 x 1mm de espessura. Os cupons foram submetidos aos
procedimentos limpeza manual utilizando esponjas de poliuretano, água e detergente neutro
líquido. Foram enxaguados com água destilada com posterior imersão em álcool etílico 70%
(v/v) por 1 hora a temperatura ambiente. Em seguida foram lavados com água destilada
seguidos de esterilização em autoclave a 121º C por 15 minutos.
4.5 FORMAÇÃO DE BIOFILME EM SUPERFÍCIE DE AÇO INOXIDÁVEL
A formação de biofilmes microbianos foi avaliada em cupons de aço inoxidável (AISI304
#4). Os cupons teste de aço inoxidável ASI 304 #4 foram imersos em frascos contendo 100
ml de caldo BHI inoculados com 102 UFC/g de:
i) Escherichia coli ;
ii) Staphylococcus warneri
iii) Escherichia coli e Staphylococcus warneri, sendo realizado três experimentos
independentes em duplicata.
27
As amostras foram incubadas a 30 ºC e analisadas nos tempos 0 hora, 4 horas, 8 horas,
24 horas e 48 horas e 7 dias.
4.6 DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS SÉSSEIS
Dois cupons de aço inoxidável foram retirados dos meios de cultivo com o auxílio de
pinça estéril e imersos em 10 mL de Phosphate Buffer Salt (PBS), por 1 minuto, para a
remoção de células planctônicas. Em seguida foram introduzidos em tubos contendo 5 mL de
PBS e agitados em vortex, durante 2 minutos para remoção de células sésseis (PARIZZI et
al.; 2004 adaptado). Diluições apropriadas foram transferidas para placas de Petri com Ágar
MacConkey sorbitol (SMAC) e ágar Baird Parker (BP), incubadas a 30 °C determinado o
número de UFC/cm2.
4.7 AÇÃO DOS AGENTES DE SANITIZANTES
Foram retirados dois cupons após a formação do biofilme e avaliada a ação de
sanitizantes, hipoclorito de sódio 100 mg/L e sanitizante a base de ácido peracético 600
mg/L. Após 10 minutos de contato, os cupons foram removidos e lavados com 10 ml de
solução salina fisiológica, transferidos para tubos contendo neutralizantes para os referidos
sanitizantes.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Inicialmente foi realizado o teste de normalidade de Shapiro-Wilk (número de dados
da amostra inferior a 50), indicando a distribuição normal entre os grupos. Após, os dados
foram apresentados na forma de Média e Desvio Padrão, seguindo a estatística descritiva. O
nível de significância adotado para todos os testes foi p ≤ 0,05.
28
Para a avaliação estatística dos dados obtidos foi utilizada a análise de variância
univariada (ANOVA), utilizando o programa Statistic 7 (StatSoft, OK, USA). Foram
avaliadas as diferenças entre as contagens microbianas dos biofilmes, assim como as
diferenças entre os micro-organismos estudados e a efetividade das etapas de higienização na
redução e/ou eliminação dos biofilmes formados.
Os resultados obtidos nas contagens de UFC foram transformados em log para todas as
análises estatísticas.
29
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das amostras de VMP analisadas as colônias isoladas foram identificadas pela técnica de
MALDI-TOF sendo: Escherichia coli (couve), Serratia marcescens (couve), Morganella
morganii (couve), Citrobacter freundii (beterraba), Raoultella ornithinolytica (cenoura e
couve), Staphylococcus warneri, Arthrobacter castelli e Serratia fonticola (rúcula).
A técnica de MALDI-TOF, pela técnica de espectrometria de massa, surgiu como uma
possibilidade de identificação rápida e mais precisa de microrganismos com potencial de
revolucionar o diagnóstico clínico microbiológico. Tem uma grande importância nos
laboratórios microbiológicos de rotina (ERZSÉBET, et al 2014).
Nos laboratórios de microbiologia, a identificação de microrganismos em amostras de
pacientes tem sido principalmente baseada na detecção de características fenotípicas dos
patógenos. Tais características dependem de processos metabólicos ativos dos
microrganismos envolvidos, o crescimento e, portanto, longos períodos de incubação que o
torna muito demorado (BIZZINI, GREUB 2010).
A técnica de MALDI TOF também tem sido utilizada na ultima década no monitoramento
e pesquisas de qualidade e inocuidade de alimentos (JANG-KIM, 2018). A identificação de
microrganismos do ambiente e de alimentos e mais desafiador do que amostra clinica de
pacientes, devido à enorme diversidade dos microrganismos. Considerando o tempo curto de
analise e o poder de discriminação, esta técnica torna-se uma importante ferramenta para
tomadas de decisão e correta implementação de ferramentas de qualidade e inocuidade
(PAVLOVIC et al, 2013).
A técnica MALDI-TOF MS tem sido utilizado para identificação de microrganismos em
alimentos como por exemplo, Campylobacter spp.; Cronobacter spp.; Listeria spp.;
Salmonella spp.; Vibrio spp, Enterococcus spp, Staphylococcus spp e bactérias láticas
(JANG-KIM; 2018, PAVLOVIC et al; 2013)
Seng et al (2010) avaliaram 1660 isolados bacterianos que representavam 109 espécies
diferentes, e cerca de 84% foram identificados corretamente pela técnica de MALDI-TOF
MS. Segundo os autores, identificações erradas ou ausentes foram atribuíveis às entradas
inadequadas do banco de dados do software MALDI-TOF em um número de
aproximadamente 1,7% dos casos. Os autores estimaram um tempo médio para resultar em
amostras identificadas por MALDI-TOF MS de 6 min, enquanto as técnicas convencionais
renderiam as mesmas identificações em 5-48 h.
30
Considerando a ubiquidade da bactéria Escherichia coli presente em casos e surtos
relacionados a alimentos, área medica e ambiental e a importância clinica da bactéria
Staphylococcus warneri alem do fato de ter sido isolado de um alimento, fato este pouco
estudado e negligenciado pelo setor alimentício, selecionou-se estas duas importantes
bactérias para verificar a sensibilidade a antimicrobianos, assim como a capacidade de
formação de biofilmes, importantes estruturas, fontes de contaminação em superfícies.
No Brasil nos anos de 2007 a 2017 a bactéria Escherichia coli foi responsável por
aproximadamente 7%, dos casos de surtos identificados de doenças transmitidas por
alimentos (BRASIL,2018).
Na legislação brasileira de padrões microbiológicos para alimentos RDC12/2001
(ANVISA, 2001) e determinada a enumeração de “estafilococos coagulase positiva”, devido
à correlação entre a produção de coagulase e a capacidade enterotoxigênica (BRASIL, 2001).
Entretanto, além de espécies de estafilococos coagulase positiva, algumas espécies coagulase
negativa possuem capacidade de produção de enterotoxinas como foi evidenciado em meio de
cultivo laboratorial. Algumas das espécies coagulase negativa relatadas como produtoras de
enterotoxinas em meio de cultivo laboratorial foram: S. epidermides , S. saprophyticus, S.
haemolyticus e S. xylosus (PEREIRA et al, 2001).
A capacidade potencial destas cepas em produzir toxinas, as quais já foram
correlacionadas a surtos de intoxicação alimentar (PEREIRA et al, 2001).
Segundo Vernozy e Rozand (1996), onze de 187 cepas de estafilococos coagulase
negativa isoladas de queijos, soro e leite de cabra eram enterotoxigênicas. Chou e Chen
(1997) observaram que S. warneri CCR 12929, uma cepa coagulase negativa, apresentou
capacidade de produção das toxinas SEA e SED.
Uhli et al.; (2017), analisaram a eficiência da lavagem apenas com água de alface e
salada mista prontas para o consumo. Os autores verificaram que com um fluxo alto de água,
houve redução da contagem de aeróbios mesofilos totais e Enterobacterias, porém a
concentração de E. coli não foi reduzida significativamente. Os microrganismos foram
identificados por sequenciamento rRNA16S, sendo predominante o gênero
Pseudomonadaceae, sendo encontrado também Enterobacteriaceae and Staphylococcaceae.
Ressalta-se que foram identificadas duas cepas de Staphylococcus warneri, porém estas
somente foram encontradas após a lavagem com água. Por este microrganismo ser
comumente encontrado na microbiota da pele, pode-se correlacionar à contaminação pelo
manipulador, reforçando a importância das Boas Praticas de Fabricação. Devido a
importância clínica, realizou-se o teste de sensibilidade a antimicrobianos dos isolados,
31
segundo método recomendado pelo “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI,
2012). Nos testes de sensibilidade a antimicrobianos a cepa de Escherichia coli utilizada neste
trabalho foi sensível aos antimicrobianos: Amicacina (30μg), Gentamicina (10μg) ,
Piperacilina + tazomicina (100 /10μg ) Ampicilina (10μg), Cefepime (30μg), Cefotaxima
(30μg), Ciprofloxacima (5μg), Imipenem (10μg), Meropenem(10μg ) Trimetoprim+
sulfametoxazol (23,75 / 1,25μg ) com sensibilidade intermediária ao antimicrobiano
Amoxicilina+Ac.clavulânico (10μg) e Cefuroxima (30μg) e resistência à Cefoxitina (30μg).
Verma et al (2018) analisaram a presença de E.coli e Salmonella spp em 520 amostras
de frutas e vegetais. Isolaram 73 E. coli, sendo quatro STEC e vinte e seis Salmonella spp.
Destes, 61,6% e 38,5 % das cepas de E.coli e Salmonella spp respectivamente, apresentaram
resistência a um antimicrobiano.
A estiper de Staphylococcus warneri foi sensível a Eritromicina (15μg), Oxacilina
(1μg), Cefoxitina (30μg), Tetraciclina (30μg), Levofloxacino (5μg), Gentamicina (10μg),
Rifampicina (5μg) e resistentes à Penicilina (10un). Marino et al; 2011 isolaram de alimento
e superfícies da industrias, cepas de S. epidermidis, S. saprophyticus e S. pasteuri e em
menor porcentagem S. sciuri, S. warneri e S. xylosus. Os isolados de S. warneri foram
resistentes à Penicilina, corroborando com este trabalho, além dos antimicrobianos
Ampicilina e Eritromicina. Segundo os autores, a resistência a penincilina é plasmidial, e
portanto pode se disseminar rapidamente a varias outras cepas.
Segundo, CLSI (2012) a Categoria de Interpretação ‘Sensível’ do Teste de
Sensibilidade Antimicrobiana (TSA), implica que a infecção causada pelo isolado possa ser
tratada apropriadamente com a dosagem de um agente antimicrobiano recomendado para esse
tipo de infecção e patógeno, salvo quando de outra forma indicado; a Categoria de
Interpretação ‘Intermediária’ do Teste de Sensibilidade Antimicrobiana implica que uma
infecção causada por este isolado pode ser tratada apropriadamente em locais do corpo, onde
os fármacos se concentram fisiologicamente ou quando for possível a prescrição de uma
dosagem mais alta do fármaco que a habitual; na Categoria de Interpretação ‘Resistente’ do
Teste de Sensibilidade Antimicrobiana, os isolados considerados resistentes não são inibidos
pelas concentrações do agente antimicrobiano normalmente prescrito em tratamentos
habituais (freqüência e dosagem) e/ou caem na faixa em que a ocorrência de mecanismos de
resistência antimicrobiana específicos é mais provável e a eficácia clínica não tem sido
confiável em estudos clínicos.
32
A resistência aos antimicrobianos é uma grave ameaça a saúde pública. A seleção e
disseminação de bactérias resistentes torna o tratamento com os antimicrobianos ineficaz
(WHO, 2014).
Considerando a relevância científica deste microrganismo, pesquisou-se a capacidade
dos mesmos aderirem e formarem biofilmes em superfícies utilizadas na industria de
alimentos.
A evolução do número de células sésseis aderidas à superfície de aço inoxidável após
remoção das células planctônicas, caracterizando a formação de biofilmes de Escherichia coli
e Staphylococcus warneri cultivos isolados e misto é apresentada nas Figuras 1,2 e 3.
Figura 1. Evolução da população (log UFC/cm2) de células sésseis de Escherichia coli sobre
cupons de aço inoxidável AISI 304 #4. Cada ponto corresponde à média de três repetições
em triplicata.
33
Figura 2. Evolução da população (log UFC/cm2) de células sésseis de Staphylococcus
warneri sobre cupons de aço inoxidável AISI 304 #4. Cada ponto corresponde à média de
três repetições em triplicata.
Figura 3. Evolução da população (log UFC/cm2) de células sésseis de cultivo misto de
Escherichia coli e Staphylococcus warneri sobre cupons de aço inoxidável AISI 304 #4.
Cada ponto corresponde à média de três repetições em triplicata.
34
Na análise dos resultados, evidenciou-se capacidade de aderência e formação de
biofilmes pela Escherichia coli e Staphylococcus warneri , atingindo valores superiores a 2
log UFC/cm2 após 24 horas de contato evoluindo, após 7 dias (168 horas), para os níveis mais
elevados, 4,5 log UFC/cm2 para Staphylococcus warneri e 4,7 log UFC/cm2 Escherichia coli.
Não houve diferença significativa entre os valores encontrados no tempo de 0 e 4 horas para
os dois microrganismos e tempos 48 e 168 horas para Staphylococcus warneri. Nos demais
tempos ocorreram diferenças significativas para cada um dos microrganismos. Quando
comparado o desempenho dos dois microrganismos entre si observou-se que houve diferença
significativa no tempo de 24 horas. Na legislação brasileira RDC 12 /2001 (BRASIL, 2001) é
preconizado limites de 10 a 103 UFC/g ou ml para alimentos comercializados no país para
coliformes termotolerantes ou 45 ºC, sendo a Escherichia coli a principal representante desta
classe de microrganismos. Segundo a legislação, caso seja determinada a presença de
Escherichia coli nas analises, deve dado deve constar no laudo. Se considerar-se que
biofilmes microbianos são fontes de contaminação e que microrganismos aderidos a
superfícies de contato com alimentos podem constituir um perigo potencial, pela possível
contaminação cruzada, pelo fato de que quando as células do biofilme se desprendem, os
microrganismos podem contaminar os alimentos. Após 8 horas de contato com a superfície a
Escherichia coli estudada foram encontradas de 10 UFC/cm2, logo o risco de contaminação
em níveis considerados impróprios para o consumo é verificado em pouco tempo de
exposição , tempo de uma jornada de trabalho (8 horas).
Amrutha et al (2017) avaliaram o potencial de cepas de E. coli e Salmonella spp,
isoladas de frutas frescas e vegetais. Os autores verificaram que os microrganismos
associados a estes produtos são formadores de biofilmes, um importante fator de virulência
dos microrganismos patogênicos. As cepas avaliadas apresentaram a presença do gene sdiA e
a produção de acil homoserinas lactonas, presentes na comunicação célula célula (quorum
sensing), ambos fatores importantes que estão associados a formação de biofilme. Os autores
alertam sobre a patogenicidade dos isolados e do potencial destes alimentos causarem
doenças.
Em relação ao Staphylococcus warneri verificou-se um perfil de gráfico inicial
semelhante à Escherichia coli, porém a bactéria entrou na fase estacionária após 48 horas de
incubação conforme pode ser observado na Figura 2. Até o tempo analisado168 h (7 dias) não
verificou-se no gráfico a fase estacionaria da Escherichia coli (Figura 1).
Martini et al (2016) analisaram Concentrados de Plaquetas (CP), com objetivo de
encontrar estafilococos coagulase-negativos (CoNS). Neste estudo foram investigados a
35
formação de biofilmes de 16 unidades contaminadas de 691 PCs testadas por métodos
fenotípicos e genotípicos. Neste foi demonstrado que 25% das espécies identificadas como
contaminantes de CP são Staphylococcus warneri, consideradas habitantes da microbiota
normal da pele e podem se tornar agentes patogênicos importantes.
Szczuka et al (2016) avaliaram as propriedades associadas à virulência de 23
espécimes isolados de sangue. Os isolados de S. warneri pareciam estar clonalmente não
relacionados e foi observado um alto grau de diversidade genética. Todos os isolados
aderiram se às células epiteliais e 43,5% das cepas invadiram as células. Além disso, 52% dos
isolados formaram biofilme in vitro. Na análise por microscopia de varredura laser confocal
foi revelado que as cepas formadoras de biofilmes formaram uma estrutura tridimensional,
composta principalmente de células vivas. Todas as cepas tiveram citotoxicidade de contato
celular fortemente associada à formação de biofilmes. Os resultados foi indicativo que S.
warneri tem a capacidade aderir, formar biofilme, invadir e destruir células epiteliais, que
podem ser mecanismos importantes contribuindo para o desenvolvimento de doenças.
Oliveira et al (1999) indicaram que a variabilidade inter e intraspécie na composição
dos biofilmes com S. warneri é um fenômeno comum.
Nas pesquisas bibliográficas realizadas foram encontradas diversidade de trabalhos
referentes a formação de biofilmes por S.warneri isolados de alimentos. Bertelloni et al
(2014), ao pesquisar 74 isolados de Staphylococcus coagulase negativa de um tanque de leite
bovino, identificou Staphylococcus xylosus (28.4 %), Staphylococcus chromogenes (20.3 %),
Staphylococcus sciuri (12.2 %), Staphylococcus hominis (9.4 %), Staphylococcus
haemolyticus (6.8 %), Staphylococcus capitis (5.4 %), Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (4.1
%), Staphylococcus saprophyticus (4.1 %), e Staphylococcus simulans (4.1 %). Um isolado
(1.3 %) de cada uma das espécies seguintes foram identificados Staphylococcus caprae,
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lentus, e Staphylococcus warneri. Apesar da
pequena ocorrência, a cepa continha o gene codificador para enterotoxina C (sec), mas não
possuia o gene codificador para a formação de biofilmes (icaA/D). Os resultados destes
autores e a capacidade de formação de biofilmes neste trabalho, justifica a importância em
entender o real papel dos Staphylococcus coagulase negativa nos alimentos e não se deve
ignorar estes microrganismos nas investigações epidemiológicas de surtos causados por
alimentos.
As contagens dos microrganismos no biofilme misto não houve diferença
significativa para nenhum tempo da Escherichia coli e em relação ao Staphylococcus
warneri. Houve diferença significativa no tempo de 24 horas. A possível dominância da
36
Escherichia coli sobre o Staphylococcus warneri no biofilme misto pode ser explicado pelas
evidências de que bactérias Gram negativas tenham maior capacidade de adesão em
superfícies inertes, devido, provavelmente, a eletronegatividade de suas membranas. Outra
hipótese seria ao menor tempo da Escherichia coli, que permitiria um desenvolvimento mais
rápido e manutenção de seu domínio conforme relatado por BANKS-BYRES, 1991;
POMPERMAYER-GAYLARDE, 2000; SPEERS-GILMOUR, 1985).
As contagens microbianas após a ação dos sanitizantes ácido peracético 500 mg.L-1 e
hipoclorito de sódio 100 mg.L-1 sobre as células sésseis foram reduzidas a níveis inferiores a
1 log UFC/cm2 após sanitização com ambos sanitizantes.
Beuchat et al (2006) avaliaram a formação de biofilme mono-espécie utilizando a cepa
de Escherichia coli O157:H7 na superfície de aço inoxidável a 25 ° C durante sete dias e ação
50 µg de cloro /ml como sanitizante. Constataram que houve formação do biofilme com um
aumento de 3 log10 UFC/cupom após 1 dia e esses níveis foram mantidos por 7 dias e ainda
obtiveram a redução na utilização do agente sanitizante com valores < 1 UFC/cupom nos
achados da presente pesquisa encontra-se similaridade com os resultados dos autores acima
mencionados.
37
6 CONCLUSÕES
Poucos trabalhos foram encontrados na revisão de literatura com referência a
importância clínica do Staphylococcus warneri, é um microrganismo pouco isolado e estudado
na microbiologia alimentar, tendo maior repercussão na microbiologia medica.
Verificou-se a capacidade de formação de biofilme pelas cepas de Escherichia coli e
Staphylococcus warneri, importante fator de virulência. Tais resultados demonstram que se for
aplicado o programa de Higienização correto, que inclui a sanitização com os parâmetros
adequados, destacando tempo e concentração adequadas, os microrganismos presentes são
eliminados em níveis seguros. O isolamento deste microrganismos em produtos já higienizados
pode ser oriundo tanto da falha de higienização do próprio produto quanto por contaminação
cruzada por superfícies mal higienizadas ou com biofilmes pré formados.
Considera-se muito importante o investimento e desenvolvimento de protocolos
adequados para limpeza e desinfecção de superfícies em estabelecimentos manipuladores de
alimentos para a inocuidade do alimento, pois conclui-se nesta pesquisa que os biofilmes foram
eliminados nos experimentos “ in vitro” de desinfecção.
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