UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DOMÉSTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE

ALIMENTOS

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E

MICROBIOLÓGICA DE KEFIR DE LEITE LIOFILIZADO

ELIZANDRA DOS SANTOS SILVA

Recife

2017

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DOMÉSTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE

ALIMENTOS

ELIZANDRA DOS SANTOS SILVA

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E

MICROBIOLÓGICA DE KEFIR DE LEITE LIOFILIZADO

ORIENTADORA: CELIANE GOMES MAIA DA SILVA

CO-ORIENTADORAS: ERILANE DE CASTRO LIMA MACHADO

AMANDA RAFAELA CARNEIRO DE MESQUITA

Recife

2017

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como requisito para obtenção do Grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema Integrado de Bibliotecas da UFRPE Nome da Biblioteca, Recife-PE, Brasil

S586d Silva, Elizandra dos Santos Desenvolvimento e caracterização físico-química e microbiológica de kefir de leite liofilizado / Elizandra dos Santos Silva. – 2017. 120 f. : il. Orientadora: Celiane Gomes Maia da Silva. Coorientadores: Erilane de Castro Lima Machado e Amanda Rafaela Carneiro de Mesquita. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Recife, BR-PE, 2017. Inclui referências, anexo(S) e apêndice(s). 1. Alimentos Funcionais 2. Desidratação 3. Maltodextrina 4. Probióticos 5. Sacarose I. Silva, Celiane Gomes Maia da, orient. II. Machado, Erilane de Castro Lima, coorient. III. Mesquita, Amanda Rafaela Carneiro de, coorient. IV. Título CDD 664

II

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DOMÉSTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE

ALIMENTOS

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E

MICROBIOLÓGICA DE KEFIR DE LEITE LIOFILIZADO

Elizandra dos Santos Silva

Esta dissertação foi julgada para obtenção do título de Mestre em Ciência e

Tecnologia de Alimentos e aprovada em 29/08/2017 pelo Programa de Pós-

Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimento em sua forma final.

Banca Examinadora:

_______________________________________________________

Profª Drª Thayza Christina Montenegro Stamford

Universidade Federal de Pernambuco

_______________________________________________________

Profª Drª Silvana Magalhães Salgado

Universidade Federal de Pernambuco

Prof Dr Paulo Roberto Campagnoli de Oliveira Filho

Universidade Federal Rural de Pernambuco

III

À Deus que com amor eterno me amou

e com benignidade me atraiu e, tem me

sustentado dia após dia com Sua Graça,

Bondade e Fidelidade sem fim.

IV

AGRADECIMENTOS

Ao meu amor maior, Jesus, que nunca desiste de mim, nunca me abandona

e me envolve em Seus braços de amor quando forças não tenho para continuar a

árdua jornada da vida. Senhor, sou tão pequena diante da Tua grandeza. Sem ti eu

não sei o que seria de mim e certamente não teria chegado até aqui. Obrigada por

todos os dias manifestar o Teu poder na fraqueza do meu ser. Tu és o meu tudo e

para Ti, por Ti e por meio de Ti são todas as coisas, te amo!

À minha mãe Elza Marcolino por todo amor, apoio (em todos os sentidos),

incentivo, palavras de encorajamento, por acreditar em mim e se fazer presente

sempre que possível, sendo um verdadeiro abrigo e porto seguro, tão essencial

para que eu não me deixasse levar pelas dificuldades encontradas pelo caminho

que tanto insistiram para que eu parasse. Mãe, obrigada por me suportar, mesmo

nos meus dias de maior estresse, simplesmente não tenho palavras para agradecer

e expressar sua importância não só na conclusão deste trabalho, mas, na minha

vida como um todo, te amo muito!

Ao meu pai Edesio (in memoriam) que embora não tenha acompanhado

minha trajetória acadêmica, sempre fez questão que a minha educação, os meus

estudos fossem uma prioridade. Pai, os anos, determinados por Deus, para que

desfrutássemos da companhia um do outro foram essenciais para a formação do

meu caráter e da mulher que hoje sou. O senhor, mesmo com seu jeito tímido e de

poucas palavras, demonstrava a cada dia, de forma prática, o seu amor. Obrigada

por todo amor, carinho, apoio e incentivo. E como sempre falo: Os dias passam, os

meses passam, os anos passam, mas a saudade e o meu amor pelo senhor nunca

irão passar...

À minha querida família, em especial aos meus avós (Maria Júlia e Antônio

Marcolino), sou muito abençoada e privilegiada por poder conviver com vocês,

poder desfrutar do carinho, do amor, do apoio e do incentivo de vocês até hoje.

Obrigada por tudo, amo demais vocês. Aos meus tios, tias, primos e primas por

nunca deixarem de me apoiar, sempre demonstrando um amor prático, incentivo

mais do que especial e das mais diversas formas para continuar e chegar até aqui,

amo vocês!

Aos amigos por sempre acreditarem em mim até quando eu mesma não

acreditava, vocês foram e são muito importantes para mim. O amor, o carinho,

V

apoio e incentivo de vocês me impulsionaram a prosseguir e a acreditar que eu

conseguiria chegar até aqui. Amo vocês!

À Amanda Souto Maior, Índina Mendes e Fátima Guimarães, amigas tão

preciosas, presentes de Deus em minha vida que tive o privilégio de encontrar ainda

na graduação e cuja amizade não acabou com o término da graduação, mas

levamos e levaremos por toda a vida. Amigas, vocês são verdadeiras pérolas

preciosas que estão sempre ao meu lado e tanto me apoiam em todas as áreas da

minha vida. É um privilégio compartilhar a minha vida com vocês. Obrigada pelo

amor, carinho, apoio e incentivo. Amo vocês!

À Elizângela Ferreira porque como você mesma diz: com você eu consigo

ser eu rsrsrsrs... Minha amiga-irmã, não poderia deixar de escrever para ti, você

que sempre acompanha meus altos e baixos, que independente das circunstâncias

está sempre ali para me apoiar, estender as mãos e não permitir que as lágrimas

me impeçam de enxergar aquilo que Deus já fez e tem feito por mim e, sobretudo,

não me deixas esquecer que as promessas de Deus para minha vida irão se

cumprir. Obrigada por não esquecer de mim e, por todos os dias, se fazer presente

em minha vida de alguma forma. O que seria de Elizandra sem Elizângela? És

muito especial para mim e tens uma grande parcela neste trabalho, você que foi a

primeira a saber que eu havia passado no processo seletivo e nunca deixou de

acreditar em mim, sempre fez questão de estar ao meu lado apoiando e

incentivando para que eu não me perdesse pelo caminho, mas que com luta,

trabalho e dedicação eu concluísse mais essa etapa em minha vida. Obrigada por

tudo! Amo você!

À Íris Luna por ter sido não só colega de turma, de laboratório e “irmã de

orientação”, mas, sobretudo, por ter se tornado uma amiga com quem pude

compartilhar alegrias, tristezas, momentos bobos e de seriedade. Obrigada por

sempre me ouvir e me incentivar quando forças já não tinha para continuar, foi um

grande presente de Deus poder te conhecer, aprender e crescer com você,

caminhar com você a árdua jornada do mestrado e, que outras jornadas, melhores

e maiores, venham. Obrigada por tudo!

Aos colegas de turma (Eron, Rodrigo, Saulo, Yasodhara, Gláucia e Marcella)

que juntos desbravamos novos caminhos e enfrentamos tantos altos e baixos.

Obrigada pela companhia, pelo apoio, por cada palavra de ânimo e incentivo, cada

VI

abraço nos momentos mais difíceis. Foi uma honra fazer parte desta turma. Nos

encontramos nos corredores da vida...

Aos companheiros de laboratório (Nathália Barbosa, Marcony Júnior e

Michele Barreto), obrigada pela companhia, pela força, pelo apoio, pelo incentivo,

pela torcida que tanto me impulsionou a prosseguir e acreditar que era possível

transformar a repetição de uma análise que não deu certo em bons resultados!

Aos técnicos dos laboratórios da UFPE-CAV: Gabriel Locatelli que desde

minha graduação tem participado da minha trajetória nos laboratórios da vida...

Gabriel, obrigada por todo suporte e dicas tão preciosas. Sílvio de Assis, obrigada

pelas dicas e ajustes na metodologia físico-química.

À Jaqueline Ferreira por todo suporte, até mesmo fora do horário. Obrigada

pelas dicas, pela ajuda, por sempre abraçar as novas ideias, métodos diferentes e

adaptações que, muitas vezes, eu levava para o laboratório e era sempre um

desafio rsrsrs (VALEU A PENA!). Jaque, você é excepcional e foi muito mais que

técnica do laboratório, você foi fundamental para me fazer acreditar que os

resultados viriam e este dia chegaria. Obrigada mesmo por tudo o que você fez por

mim, não só em relação as análises, mas por toda sensibilidade e preocupação

para comigo quanto pessoa.

Aos professores José do Egito de Paiva, Inaldo Galdino de Menezes e

Edleide Pires do laboratório de análise de alimentos da Departamento de

Tecnologia Rural (DTR) da UFRPE por terem aberto as portas do laboratório e

permitido que eu fizesse uso das instalações. As estagiárias do laboratório por toda

ajuda no preparo de materiais paras as análises.

À Amanda Mesquita que foi um verdadeiro anjo, abriu minha mente, trouxe

luz para solucionar os questionamentos que surgiram, e despertou a paixão e o

desejo pelo mundo da microbiologia que estavam adormecidos em mim. Amanda,

o que seria de mim com todas aquelas colônias sem você? Obrigada por toda ajuda,

suporte, dicas, ideias, disposição e incentivo em cada análise. Obrigada por cada

vibração com os resultados. Você foi fundamental para que eu tivesse forças para

concluir este trabalho! Muito obrigada!

À Ana Albertina que tive o prazer de conhecer nesta trajetória do mestrado

e foi tão graciosa e disposta a ajudar na identificação dos isolados.

À Erilane Machado por toda preocupação, disposição e ajuda ao longo de

todo o desenvolvimento deste estudo. Obrigada pela ideia desafiadora em trabalhar

VII

com o Kefir, foi um grande privilégio e uma caminhada de muito aprendizado para

mim. As dificuldades e adversidades foram muitas e, de diferentes formas, se

apresentaram ao longo do caminho, mas você sempre me apoiou, abriu portas de

laboratórios, correu atrás de materiais para que as análises pudessem ser

realizadas e sempre esteve acessível para sanar minhas dúvidas. O meu muito

obrigada!

À Celiane Maia pela compreensão em todos os momentos, sobretudo

quando a saúde me faltou e as dificuldades para prosseguir aumentaram. Obrigada

pelo compartilhar de conhecimentos, pelo suporte, pelo apoio e pelos

esclarecimentos e dicas no desenvolvimento e conclusão deste estudo.

À UFRPE e a UFPE pela formação acadêmica e científica, pelos recursos

físicos, materiais e conhecimentos transmitidos por cada profissional, seja do corpo

docente, seja do corpo técnico, seja do operacional.

À CAPES pelo apoio financeiro que viabilizou este estudo.

À todos que direta ou indiretamente contribuíram para que eu pudesse

chegar até aqui!

MUITO OBRIGADA!

VIII

“O êxito da vida não se mede pelo

caminho que você conquistou, mas

pelas dificuldades que superou no

caminho. ”

(Abraham Lincoln)

IX

RESUMO

O Kefir, bebida fermentada exclusivamente por grãos de Kefir, é constituído por

uma colônia de micro-organismos simbióticos imersos em uma matriz de

polissacarídeo e proteínas, que apresenta potencial probiótico. No entanto, devido

ao grau de perecibilidade da bebida e instabilidade dos micro-organismos,

procedimentos de secagem vêm sendo empregados, como a liofilização, visando o

aumento da estabilidade, maior flexibilidade para consumo e manutenção da

viabilidade celular. Todavia, o congelamento que antecede a liofilização é uma

etapa crítica, o que leva a necessidade de utilizar crioprotetores para evitar a

lioinjúria. Objetivou-se neste estudo desenvolver e caracterizar físico-química e

microbiologicamente Kefir de leite liofilizado, avaliando o efeito crioprotetor de

maltodextrina e sacarose na manutenção da viabilidade celular. O processo de

fermentação sem agitação, durante 24h, com a proporção de 5% de grãos de Kefir

foi realizado em leite UHT e em leite pasteurizado, e as bebidas obtidas foram

analisadas quanto ao pH, acidez, atividade de água, sólidos solúveis totais, lactose,

umidade, cinzas, proteínas, lipídeos e carboidratos. O perfil microbiológico foi

traçado pela contagem total de bactérias e leveduras e isolamento e identificação

dos gêneros Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Acetobacter spp.,

Enterococcus spp. e Candida spp. A bebida fermentada em leite pasteurizado

apresentou melhor composição nutricional e maior concentração celular, sendo

este submetido a liofilização por planejamento fatorial 22 crioprotegido por

maltodextrina (0-8%) e sacarose (0-10%). Ao final da liofilização, o ensaio com 10%

de sacarose apresentou maior concentração celular, com taxa de sobrevivência

celular de bactérias de 97,71% em MRS e 96,68% em M17 e 89,63% para

leveduras em YGC. A sobrevivência das bactérias isoladas dos pós liofilizados, em

escala decrescente, foi de Enterococcus durans, Acetobacter spp., Bifidobacterium

spp. e Lactobacillus spp. As concentrações de maltodextrina testadas foram

indiferentes na proteção dos micro-organismos, com resultados semelhantes ao

ensaio sem crioprotetor. Conclui-se que, formulados liofilizados de Kefir

crioprotegido com sacarose, nas condições de desenvolvimento deste trabalho,

apresenta concentração celular adequada e potencial efeito probiótico.

Palavras-chaves: Alimentos Funcionais. Desidratação. Maltodextrina. Probióticos.

Sacarose.

X

ABSTRACT

Kefir is a drink fermented exclusive by grains of Kefir, it is constituted by a colony of

symbiotic microorganism immerses in a matrix of polysaccharides and proteins, that

presents probiotic potential. Meanwhile, due to the high degree of perishability of

the drink and instability of the microorganisms, drying procedures are being used,

as lyophilization, to intend stability improvements, better flexibility for consumption

and maintenance of cell viability. Otherwise, the freezing process before the

lyophilization is a critic phase, which leads to the necessity to use cryoprotections

to avoid the injury cell. The objective of this study was to develop a characterized

physical-chemical e microbiologically Kefir of milk lyophilized, evaluating the effect

of the cryoprotections of maltodextrin and sucrose in the maintenance of cell

viability. The process of fermentation without agitation, among 24 hours, with the

proportion of 5% grains of Kefir was realized in UHT milk and in pasteurized milk,

the drinks obtained were analyzed in pH, acidity, activity on water, total soluble

solids, lactose, moisture, ashes, proteins, lipids and carbohydrates. The

microbiological profile of the samples was made by the total counting of bacteria

and yeast, isolation and identification of the genders Lactobacillus, Bifidobacterium,

Acetobacter, Enterococcus and Candida. The drink fermented in pasteurized milk

presented better nutritional composition and higher cell concentration, being

submitted to lyophilization by factorial planning 22 Cryoprotection by maltodextrin

(0-8%) and sucrose (0-10%). At the endo of lyophilization process, the analysis with

10% of sucrose presented higher cell concentration, with survival tax of bacteria

97,71% in MRS, 96,68% in M17 and 89,63% for yeast in YGC. The survival of

isolated bacteria after lyophilization, in decreasing scale, was Enterococcus durans,

Acetobacter spp., Bifidobacterium spp. e Lactobacillus spp. The concentration of

maltodextrin tested were indifferent in the protection of microorganism, with the

same results with the analysis without cryoprotection. This leads to, formulated

lyophilized of Kefir cryoprotected with sucrose, in this work conditions of

development, presents adequate cell concentration and potential probiotic effect.

Keywords: Functional Food. Dehydration. Maltodextrin. Probiotics. Sucrose.

XI

LISTAS DE FIGURAS

Figura 1 – Mecanismos de ação dos probióticos contra patógenos.......................24

Figura 2 – Grãos de Kefir. Retângulo preto corresponde a 1cm.............................27

Figura 3 – Estrutura do Kefiran...............................................................................28

Figura 4 – Homofermentação esquemático pela via metabólica da glicólise..........39

Figura 5 – Heterofermentação esquemático pela via metabólica da glicólise.........40

Figura 6 – Metabolismo dos micro-organismos durante a fermentação de Kefir....41

Figura 7 - Diagrama esquemático dos efeitos fisiológicos benéficos do Kefir na

saúde humana........................................................................................................42

Figura 8 – Diagrama de fases da água mostrando a sublimação do gelo...............49

Figura 9 – Liofilizador em funcionamento com bomba de vácuo............................50

XII

LISTAS DE TABELAS

Tabela 1 – Micro-organismos empregados como probióticos.................................23

Tabela 2 – Composição físico-química do Kefir recomendada pela FAO/WHO

(2003) e pelo MAPA (2007)....................................................................................29

Tabela 3 – Espécies de micro-organismos encontrados no Kefir e nos grãos de

Kefir........................................................................................................................30

Tabela 4 – Composição microbiológica do Kefir recomendada pela FAO/WHO

(2003) e MAPA (2007)............................................................................................31

Tabela 5 – Características dos principais gêneros de bactérias ácido láticas......32

XIII

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS RDC – Resolução da Diretoria Colegiada

EPA – Ácido Eicosapentaenoico

DHA – Ácido Docosahexaenoico

FOS – Fruto-oligossacarídeo

AGCCs – Ácidos Graxos de Cadeia Curta

FAO – Food and Agriculture Organization

WHO – World Health Organization

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

UFC – Unidade Formadora de Colônia

BAL – Bactérias Ácido Lácticas

MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

IgA – Imunoglubulina A

EPS – Exopolissacarídeos

EFSA – European Food Safety Authority

QPS – Qualified Presumption of Safety

BAA – Bactérias Ácido Acéticas

IFN-γ – Interferon γ

TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α

IL-10 – Isoleucina 10

DCV – Doença Cardiovascular

HDL-c – Colesterol - Lipoproteína de Alta Densidade

LDL-c – Colesterol - Lipoproteína de Baixa Densidade

TGF-α – Fator de Crescimento Transformante-α

TGF-β1 - Fator de Crescimento Transformante-β1

DMSO – Dimetilsulfóxido

Aw – Atividade de Água

TPF – Tripolifosfato de Sódio

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

MRS – Man, Rogosa & Sharpe

UHT – Ultra High Temperature

XIV

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................16

2 PROBLEMAS DE PESQUISA E HIPÓTESE.....................................................18

3 REVISÃO DA LITERATURA..............................................................................19

3.1 Alimentos funcionais........................................................................................19

3.1.1 Prebióticos....................................................................................................20

3.1.2 Probióticos....................................................................................................21

3.2 Kefir: definição e aspectos gerais....................................................................24

3.2.1 Composição dos grãos de Kefir....................................................................26

3.2.2 Composição química.....................................................................................27

3.2.3 Composição microbiológica..........................................................................29

3.2.3.1 Bactérias ácido láticas...............................................................................31

3.2.3.1.1 Gênero Lactobacillus..............................................................................33

3.2.3.1.2 Gênero Lactococcus...............................................................................34

3.2.3.1.3 Gênero Leuconostoc...............................................................................34

3.2.3.2 Leveduras..................................................................................................36

3.2.3.3 Bactérias ácido acéticas............................................................................37

3.2.4 Interação dos micro-organismos do Kefir durante a fermentação................38

3.2.5 Benefícios do Kefir na saúde humana..........................................................42

3.2.5.1 Atuação no trato gastrintestinal..................................................................42

3.2.5.2 Atuação no sistema imune.........................................................................43

3.2.5.3 Ação antibacteriana...................................................................................44

3.2.5.4 Ação hipocolesterolêmica..........................................................................45

3.2.5.5 Ação anticarcinogênica..............................................................................46

3.2.5.6 Ação do Kefir na intolerância a lactose......................................................47

3.3 Métodos de conservação de alimentos............................................................48

3.3.1 Liofilização....................................................................................................49

3.3.1.1 Liofilização na indústria de alimentos........................................................52

4 REFERÊNCIAS..................................................................................................55

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................68

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS..............................................................................111

APÊNDICE A.......................................................................................................112

APÊNDICE B.......................................................................................................113

XV

APÊNCIDE C.......................................................................................................114

APÊNCIDE D.......................................................................................................115

APÊNCIDE E.......................................................................................................116

APÊNCIDE F.......................................................................................................117

APÊNCIDE G.......................................................................................................118

APÊNDICE H.......................................................................................................119

ANEXO A.............................................................................................................120

16

1 INTRODUÇÃO

Desde a década de 70, o panorama da nutrição vem sofrendo alterações,

devido ao aumento do consumo de alimentos calóricos e de baixo valor nutricional,

através dos quais se tem uma inadequada ingestão de água, macronutrientes e

micronutrientes. Em consequência, há o surgimento das carências nutricionais e da

transição nutricional, na qual é observada um declínio da prevalência da

desnutrição em crianças e uma elevação da prevalência de sobrepeso/obesidade

em adultos (BATISTA FILHO; SOUZA; MIGLIOLI; SANTOS, 2008).

Como resposta a preocupação com a saúde, tem sido desenvolvido o hábito

de consumir alimentos que não apenas tenham qualidade sensorial e nutricional,

mas que ofereçam substâncias com funções fisiológicas e bioquímicas benéficas.

Estes são os chamados alimentos funcionais, cuja denominação foi utilizada pela

primeira vez na década de 80 pela legislação japonesa com o objetivo de

desenvolver alimentos saudáveis para uma população que envelhecia e

apresentava uma grande expectativa de vida (ANJO, 2004; CUPPARI, 2005;

GOMES, 2007; FRANÇA et al., 2010).

Dentro do grupo de alimentos funcionais, destacam-se os que possuem

micro-organismos probióticos em sua composição. Diferentes definições de

probiótios foram publicadas (PAKER, 1974; FULLER, 1989; CARNICÉ, 2006).

Entretanto, a definição aceita internacionalmente é que são micro-organismos vivos

que administrados em quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do

hospedeiro (FAO/WHO, 2001). Dentre estes destacam-se diversos gêneros:

Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Lactococcus spp.,

Pediococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Saccharomyces spp.,

Kluyveromyces spp., Candida spp. (WITTHUHN et al., 2005; MAGALHÃES et al.,

2011; SAAD et al., 2013).

O Kefir é uma bebida fermentada probiótica composta por uma simbiose de

bactérias e leveduras envolvidas em uma matriz polissacarídica solúvel,

denominada Kefiran. O processo fermentativo do Kefir de leite ocorre,

exclusivamente, pelos grãos de Kefir em leite reconstituído a 20-25ºC durante 24h.

Após a fermentação, a bebida apresenta consistência cremosa e sabor ligeiramente

ácido (LOPITZ-OTSOA; REMENTERIA; ELGUEZBAL; GARAIZAR, 2006;

MAGALHÃES et al., 2011; KÖK-TAS; SEYDIM; ÖZER; GUZEL-SEYDIM, 2013).

Entretanto, por se tratar de micro-organismos vivos, alimentos probióticos

como o Kefir, são instáveis e para minimizar tal instabilidade e manter a viabilidade

celular, procedimentos de secagem têm sido utilizados por possibilitar o aumento

da estabilidade e da concentração, maior flexibilidade para o consumo e menor

custo de armazenamento e acondicionamento (SOUZA et al., 2011; PRISCO;

MURIELO, 2016).

A liofilização é o meio mais eficaz de se obter produtos desidratados com

alta qualidade sensorial e com boa viabilidade celular (ATALAR; DERVISOGLU,

2015). Entretanto, a etapa que antecede a liofilização consiste no congelamento da

amostra a baixas temperaturas, o que pode causar danos irreversíveis nas células

a serem desidratadas, por isso, faz-se necessário proteger a amostra com uso de

crioprotetores para minimizar os efeitos negativos do congelamento (AGUIAR et al.,

2012).

Um dos maiores desafios da criopreservação é realizar um congelamento

sem a formação de cristais de gelo no interior das células através da redução da

atividade de água (COSTA, 2010). Na criomicrobiologia, o glicerol é o principal

álcool utilizado que atua penetrando na membrana celular através da difusão

passiva. Todavia, alguns açúcares, como a sacarose, a maltose, a frutose e a

maltodextrina, têm se mostrado capazes de atuar como agentes crioprotetores ao

promoverem alterações na permeabilidade ao induzir o aumento da osmolaridade

do meio externo, gerando a passagem da água do meio interno da célula para o

externo. Além disso, os carboidratos promovem o aumento da transição vítrea que

ao tornar-se acima da temperatura de estocagem, a estabilidade e a vida de

prateleira dos produtos aumentam (KENNEDY, 2000; AGUIAR et al., 2012;).

Diante do que foi abordado, o objetivo deste estudo foi produzir e caracterizar

físico-química e microbiologicamente o Kefir de leite submetido a secagem por

liofilização e avaliar o efeito crioprotetor de maltodextrina e sacarose sobre a taxa

de sobrevivência celular dos micro-organismos naturais do Kefir.

18

2 PROBLEMAS DE PESQUISA E HIPÓTESE

É possível obter Kefir desidratado por liofilização com viabilidade celular

adequada para um produto probiótico e boa qualidade nutricional?

A incorporação de crioprotetor mantém a concentração de células viáveis em

Kefir desidrato por liofilização?

Formulados liofilizados de Kefir adicionado de crioprotetor apresentam uma

boa qualidade nutricional e uma concentração de células viáveis adequada para

serem empregados como probiótico, visando sua incorporação em alimentos.

19

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Alimentos Funcionais

Os alimentos funcionais estão em evidência no mundo inteiro a medida que

vem se tornando parte da dieta diária da população, acarretando em um mercado

industrial global de alimentos e bebidas funcionais de grande potencial, estimado

em US$ 192 bilhões em 2020. Entretanto, apesar do ritmo acelerado das indústrias

em desenvolvê-los, para atender as expectativas dos consumidores, as ideias e o

desenvolvimento destes produtos ainda é bastante desafiador, necessitando de

análises dos estudos existentes para identificar as áreas que necessitam de

melhorias a fim de contribuir com uma melhor compreensão da escolha e do

comportamento do consumidor (KAUR; SINGH, 2017).

O termo alimentos funcionais foi usado pela primeira vez no Japão, na

década de 80, como uma definição para alimentos enriquecidos com componentes

especiais que possuem efeitos fisiológicos positivos e, a partir de então, o consumo

destes passou a se espalhar por todo o mundo como resultado da busca por

alimentos com propriedades promotoras de saúde que não são comumente

encontradas nos alimentos convencionais (PAPPALARDO; LUSK, 2016).

As definições legais de alimento contemplam todas as substâncias ou

misturas de substâncias destinadas à ingestão por humanos, que tenham como

objetivo fornecer nutrientes ou outras substâncias necessárias para a formação,

manutenção e desenvolvimento normais do organismo, independente do seu grau

de processamento e de sua forma de apresentação. Já a alegação de propriedade

funcional é aquela relativa ao papel metabólico ou fisiológico que o nutriente ou não

nutriente tem no crescimento, desenvolvimento, manutenção e outras funções

normais do organismo humano (BRASIL, 2013).

De um modo geral, um alimento pode ser considerado funcional se for

demonstrado que o mesmo pode afetar beneficamente uma ou mais funções alvo

no organismo, além de possuir os adequados efeitos nutricionais, de maneira que

seja tanto relevante para o bem estar e a saúde quanto para a redução do risco de

uma doença (MORAES; COLLA, 2006). Vale salientar também que os chamados

alimentos funcionais não podem provocar alergias e não podem representar

nenhum risco à saúde, e suas alegações devem ser passíveis de comprovação

científica (GOMES, 2007). Entretanto, a RDC Nº 2 de 7 de janeiro de 2002, alerta

20

que "Gestantes, nutrizes e crianças somente devem consumir estes produtos sob

orientação de nutricionista ou médico".

Os alimentos funcionais podem incluir os alimentos naturais, como frutas e

vegetais, cujos componentes próprio acarretam em beneficios para a saúde; Grãos

integrais e fibras em pães e cereais e cálcio no leite (produtos alterados pela adição

destes); Leite fortificado com vitamina D e sucos de frutas suplementados com

vitamina C; Margarina com fitoesteróis, prebióticos e probióticos (produtos

enriquecidos); Ovos com aumento de omega-3 induzido pela alteração da

alimentação de frangos (KAUR; SINGH, 2017).

A legislação brasileira vigente, lista uma gama de nutrientes e não nutrientes

com propriedade funcionais, incluindo: os ácidos graxos (EPA e DHA), carotenoides

(licopeno, luteína e zeaxantina), fibras alimentares, beta glucana em farelo de

aveia, aveia em flocos e farinha de aveia, dextrina resistente, fruto-oligosacarídeo

(FOS), goma guar parcialmente hidrolisada, inulina, lactulose, polidextrose,

psillium, quitosana, fitoesteróis, polióis (manitol, xilitol, sorbitol), proteína de soja e

probióticos (BRASIL, 2016).

3.1.1 Prebióticos

Os prebióticos foram observados pela primeira vez nos anos 80, durante um

cultivo in vitro tendo como inóculo fezes humanas, onde japoneses perceberam que

certos oligossacarídeos não digeríveis (fundamentalmente Fruto-oligossacarídeos

- FOS) eram fermentados seletivamente por bifidobactérias e que estes tinham a

capacidade de estimular seu crescimento. Esta observação foi confirmada por

Gibson e Roberfroid em 1995 que propuseram a primeira definição de prebióticos

como sendo um ingrediente alimentar não digerível que afeta beneficamente o

hospedeiro ao estimular o crescimento e/ou atividade de um ou de um limitado

número de espécies bacterianas no colón, e que, portanto, melhora a saúde

(CORZO et al., 2015).

O conceito de prebióticos foi revisto e ampliado por Roberfroid et al. em 2010,

os quais afirmaram que os prebióticos são ingredientes que produzem uma

estimulação seletiva do crescimento e/ou atividade (s) de um ou de um número

limitado de gêneros/espécies de micro-organismos, em especial Lactobacillus e

Bifidobacterium, na microbiota intestinal conferindo benefícios para a saúde do

hospedeiro.

21

Prebióticos compreendem os oligossacarídeos não digeríveis, como fruto-

oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, lactulose e inulina. Por sua

composição, os prebióticos não podem ser absorvidos até atingirem o cólon, onde

são fermentados por micro-organismos em ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs)

e lactato. Estudos evidenciam que os prebióticos são capazes de aumentar a

produção de AGCCs, o que, por sua vez, modula a produção de citoquinas dentro

da mucosa intestinal, modificando a composição do intestino. Em um estudo em

humanos, ficou evidenciado que a administração de 10g de

transgalactooligossacarídeos é capaz de aumentar o número de bifidobactérias e

modificar o metabolismo da fermentação colônica da flora intestinal (PATEL;

DUPONT, 2015).

3.1.2 Probióticos

O termo probiótico tem origem grega e significa “para a vida”, ou seja, “a

favor da vida”, e foi citado pela primeira vez em 1965 por Lilly e Stillwell ao

descrever qualquer substância ou organismo que contribui para manter o equilíbrio

intestinal nos animais. Anos depois, em 1974, Paker definiu probiótico como relativo

a organismos e substâncias que contribuem para o equilíbrio microbiano intestinal.

No entanto, esta definição não é adequada uma vez que a palavra “substância”

poderia incluir suplementos tais como antibióticos, cuja definição é justamente o

contrário “contra a vida” (CARNICÉ, 2006).

Atualmente, a definição mais aceita é a que são micro-organismos vivos que

administrados em quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do

hospedeiro (FAO/WHO, 2001). E, Segundo a Resolução RDC n.º 2, de 7 de janeiro

de 2002, probióticos podem ser definidos como sendo micro-organismos vivos

capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal produzindo efeitos benéficos

à saúde do indivíduo (BRASIL, 2002).

A legislação vigente determina que os probióticos, obrigatoriamente, devem

comprovar a segurança de uso, previamente à comercialização e comprovar um

efeito fisiológico ou metabólico específico, que será comunicado por meio de uma

alegação de propriedade funcional ou de saúde (BRASIL, 2013).

Além disso, os probióticos devem atender a alguns critérios, tais como: ser

de origem humana, não ser patogênico por natureza, ser resistente a destruição

22

por processamentos tecnológicos, ser resistente a destruição por secreções

gástricas e pela bile, deve aderir-se ao epitélio intestinal, ser capaz de colonizar o

trato gastrointestinal, produzir substâncias antimicrobianas, modular as respostas

imunes, exercer influência em algumas atividades metabólicas humanas, como

assimilação do colesterol, produção de vitaminas, etc. (CARNICÉ, 2006; MORAES;

COLLA, 2006).

A ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) (BRASIL, 2016)

preconiza que a comprovação da eficácia para efeitos funcionais de um produto

probiótico não deve estar baseada em quantidade mínima de micro-organismos

viáveis, mas, sim, em evidências científicas, construídas por meio de estudos

clínicos, randomizados, duplo-cego e placebo controlados cujos desfechos

demonstrem a relação proposta na alegação entre o consumo do produto e o efeito

funcional.

Uma vasta gama de alimentos tem sido enriquecida com probióticos para

serem possíveis portadores destes micro-organismos benéficos a serem colocados

no mercado. Principalmente pertencentes a bactérias lácticas (BAL), a maioria das

cepas probióticas (Tabela 1) comuns adicionados aos alimentos são pertencentes

a várias espécies de lactobacilos e bifidobactérias, mas também leveduras, como

a Saccharomyces cerevisiae, são utilizadas. Contudo, outros gêneros

(Enterococcus, Bacillus e Escherichia) incluem cepas reconhecidos como

probióticos (PRISCO; MURIELLO, 2016).

Os benefícios dos probióticos para a saúde é uma área de pesquisa intensiva

que, de acordo com os sítios alvo e mecanismos de ação podem ser distinguidos

em níveis intestinais e extra-intestinais. A nível intestinal, os probióticos têm

mostrado desempenhar um papel importante, por exemplo na manutenção da

microbiota intestinal normal, na proteção contra agentes patogênicos

gastrointestinais, na intolerância a lactose e na diarreia infantil. Por outro lado, entre

os efeitos extra-intestinais destaca-se a redução do nível de colesterol sérico e da

pressão arterial, redução da incidência de doenças urogenital e respiratórias e

prevenção de alguns tipos de câncer (PRISCO; MURIELLO, 2016).

Tabela 1 – Micro-organismos empregados como probióticos.

Lactobacillus Bifidobacterium Outras Bactérias

ácido láticas Outros

L. acidophilus L. casei

L. crispatus L. curvatus

L. delbrueckii L. farciminis L. fermentum

L. gasseri L. Johnsonii L. paracasei L. plantarum

L. reuteri L. rhamnosus

B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve

B. infantis B. lactis

B. longum B. thermophilum

Enterococcus faecium

Lactococcus lactis Leuconostoc

mesenteroides Pediococcus acidilacticis

Streptococcus thermophillus

Stheptococcus diacetylactis

Streptococcus intermedius

Escherichia coli strain Nissle

Saccharomyces cerevisae

Saccharomyces bourlardii

Adaptado de Saad et al., 2013

Entretanto, por se tratarem de micro-organismos vivos, o tempo de vida dos

probióticos é dependente das condições de armazenamento, de modo que, ao

serem ingeridos, possam atuar no intestino e, somando-se à microbiota intestinal,

ali possam se fixar para ajudarem na absorção dos nutrientes e desenvolverem

seus mecanismos de ação. Os mecanismos de ação (Figura 1) consistem,

principalmente, em: formação de uma barreira física às bactérias patogênicas

através de uma competição por nutrientes e por sítios de ligação, o que impede que

as bactérias patogênicas se liguem aos receptores; estímulo da resposta imune

através do aumento da produção de anticorpos; ativação de macrófagos;

proliferação das células T e produção de interferon e mudanças nas condições

ambientais (VARAVALLO; THOMÉ; TESHIMA, 2008).

Figura 1 – Mecanismos de ação dos probióticos contra patógenos.

1 – Exclusão e competição com o patógeno pela adesão as células epiteliais; 2 – Estimulação do sistema imune inato; 3 – Competição por nutrientes e prebióticos; 4 – Produção de substâncias antimicrobianas e, assim, o antagonismo dos patógenos; 5 – Proteção da integridade da barreira intestinal; 6 - Regulação da citocina anti-inflamatória e inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias.

Fonte: Adaptado de SAAD et al., 2013

Tradicionalmente, os probióticos são consumidos em forma de leites

fermentados, iogurte e Kefir (SAARELA; MOGENSEN; FONDÉN; MÄTTÖ;

MATTILA-SANDHOLM, 2000; ZAJEK; GOREK, 2010; MAGALHÃES et al., 2011).

3.2 Kefir: Definição e aspectos gerais

A busca por alimentos benéficos à saúde tem feito com que alimentos

fermentados estejam cada vez mais presentes na dieta humana, uma vez que o

processo de fermentação proporciona um aumento na biodisponibilidade de

minerais e na digestibilidade das proteínas e dos hidratos de carbono, além de

melhorar as qualidades sensoriais do produto (ALTAY et al., 2013).

Kefir é uma bebida fermentada probiótica e benéfica para a saúde, cujo

interesse de consumo tem aumentado. Historicamente, os grãos de Kefir foram

considerados um dom de Deus entre o povo muçulmano das montanhas do

Cáucaso do Norte. A palavra Kefir é derivada da palavra turca "keif", que pode ser

traduzida como bom sentimento que pode ser sentido após bebê-lo. Os grãos de

Kefir foram passados de geração em geração entre as tribos de Cáucaso sendo

considerada uma fonte de riqueza da família (LOPITZ-OTSOA; REMENTERIA;

ELGUEZBAL; GARAIZAR, 2006).

O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), define o Kefir

como leite fermentado, adicionado ou não de outras substâncias alimentícias,

obtidas por coagulação e diminuição do pH do leite, ou reconstituído, adicionado

ou não de outros produtos lácteos, cuja fermentação se realiza com cultivos ácidos-

lácticos elaborados com grãos de Kefir, Lactobacillus Kefir, espécies dos gêneros

Leuconostoc, Lactococcus e Acetobacter com produção de ácido láctico, etanol e

dióxido de carbono (BRASIL, 2007).

Inicialmente, havia apenas o Kefir tradicional e, em seguida, vários tipos de

Kefir, como Kefir de frutas e Kefir desnatado começaram a estar disponíveis no

mercado. Trata-se de uma bebida láctea fermentada de consistência cremosa e

sabor ligeiramente ácido, que se diferencia dos leites fermentados tradicionais

(iogurte) por ser produzida, apenas, a partir de uma mistura probiótica de leveduras

e bactérias conhecida como grãos de Kefir, fermentados em leite reconstituído de

vaca, ovelha, cabra integral ou desnatado ou ainda leites de fonte não animal, como

de coco, de soja, sucos de fruta e/ou soluções de açúcar e melaço (KABAK;

DOBSON, 2011).

Vale salientar que durante o armazenamento, a produção de CO2 por

leveduras ou BAL heterofermentativo pode causar estufamento na embalagem do

produto, um fato que deverá ser considerado na escolha desta (SARKAR, 2008).

A origem dos grãos e a tecnologia empregada para produção da bebida

podem gerar produtos com diferentes composições (OTLES E CAGINDI, 2003). De

uma maneira geral, a produção do Kefir pode ser de três formas: tradicional, método

russo ou método comercial utilizando culturas puras.

A produção artesanal tradicional envolve a inoculação de leite com uma

quantidade variável de grãos e fermentação por um período entre 18-24 horas a

20-25°C. No final do processo de fermentação, os grãos são peneirados e podem

ser usadas para uma nova fermentação ou mantidos (1-7 dias) no leite fresco,

enquanto que a bebida Kefir está pronta para o consumo (PRADO et al., 2015). O

Kefir pode ser consumido imediatamente após a separação dos grãos ou pode ser

refrigerado (fase de maturação) para consumo posterior. Durante a refrigeração, a

fermentação alcoólica leva ao acúmulo de CO2, etanol e vitaminas do complexo B.

Esta etapa reduz o teor de lactose, tornando o produto desejável para consumo por

indivíduos com intolerância à lactose e diabetes (FARNWORTH, 2005).

O "método russo" permite a produção de Kefir em maior escala, e utiliza um

processo de fermentação em série, a partir do percolado resultante da primeira

fermentação dos grãos - fermentado sem os grãos ou cultura mãe. O método

comercial com culturas puras é baseado no princípio da inoculação do leite com

culturas puras isoladas de grãos de Kefir e culturas comerciais. A fase de

maturação pode ser realizada ou não e consiste em manter o Kefir a 8-10°C por

até 24h, para permitir o crescimento, sobretudo de levedura, a fim de contribuir com

o sabor específico do produto (PRADO et al., 2015).

3.2.1 Composição dos grãos de Kefir

A concentração de inoculo inicial dos grãos (proporção de grãos/leite) afeta

o pH, viscosidade, concentração de lactose final e o perfil microbiológico do produto

final. E, as propriedades físico-químicas e a qualidade do Kefir são afetadas pela

qualidade microbiológica dos grãos, incubação, tempo e temperatura, condições de

saneamento e temperatura de armazenamento e a relação grão-leite, sendo o tipo

e quantidade do leite importante em termos sensoriais e afetam a microbiota dos

grãos a depender do seu teor de carboidratos, lipídeos e proteínas. Os grãos

(Figura 2) são uma massa cor branca a amarelo, macia, gelatinosa, e de tamanho

variando de 0,3-3,5 cm de diâmetro (NAJGEBAUER-LEJKO, 2007; DINC, 2008;

ERTEKIN; GUZEL-SEYDIM, 2010; USLU, 2010; CETINKAYA; ELAL-MUS, 2012;

ALTAY; KARBANCIOGLU-GÜLER; DASKAYA-DIKMEN; HEPERKAN, 2013;

SADY; DOMAGALA; GREGA; PRADO et al., 2015).

Figura 2 – Grãos de Kefir. Retângulo preto corresponde a 1cm

Fonte: Lopitz-Otsoa; Rementeria; Elguezbal; Garaizar, 2006

3.2.2 Composição química

Os grãos de Kefir são compostos de proteínas, lipídios e um polissacarídeo

solúvel, o complexo Kefiran, composto por quantidades iguais d-glicose e d-

galactose, classificado como um glucogalactan solúvel em água e produzido por

Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus plantarum, e outros. O Kefiran traz

vários efeitos benéficos para a saúde, incluindo a diminuição da pressão

sanguínea, imunomodulação, proteção do epitélio, aumento da atividade fagocitária

dos macrófagos peritoneais e pulmonares e aumento das células IgA nestes locais,

atividade antitumoral, atividade antimicrobiana e atividade anti-inflamatória (LIU,

WANG, LIN, LIN, 2002; MAEDA et al., 2004; RODRIGUES, CAPUTO, CARVALHO,

EVANGELISTA, SCHNEEDORF, 2005; DUARTE, VINDEROLA, RITZ,

PERDIGON, MATAR, 2006; VINDEROLA, PERDIGON, DUARTE, FARNWORTH,

MATAR, 2006; MOREIRA et al., 2008; PIERMARIA et al., 2010; MEI, GAO, LI,

2016).

O Lactobacillus Kefiranofaciens tem demonstrado que tem a capacidade de

produzir Kefiran sob diferentes condições. Contudo, o crescimento de células e as

taxas de produção de Kefiran foram mostrados aumentadas quando L.

Kefiranofaciens é cultivado numa cultura mista juntamente com Saccharomyces

cerevisiae, e sob as condições de cultura estabelecida imitando as ações de células

de leveduras, demonstrando a importância da simbiose entre bactérias e leveduras

em Kefir (PRADO et al., 2015).

O primeiro estudo sobre a estrutura do Kefiran foi publicado pela Kooiman

(1968), que propôs uma estrutura composta por duas unidades: Kefiran

(polissacarideo) e Kefirose (pentassacarideo). Em seguida, alguns autores

analisaram a estrutura do polissacarideo com as técnicas atuais, tais como

cromatografia, infravermelho, espectrofotometria e ressonância magnética nuclear,

chegando a estrutura mostrada na figura 3 (PRADO et al., 2015).

Figura 3 – Estrutura do Kefiran.

Fonte: Prado et al., 2015

Os exopolissacarídeos (EPS) produzidos pelo Kefir melhoram a textura e o

sabor do produto. Nos últimos anos, a utilização de Kefiran na indústria de

alimentos ganhou popularidade devido as suas excelentes propriedades

reológicas, podendo melhorar significativamente a viscosidade de produtos lácteos,

favorecer e manter as propriedades do gel e evitar a perda de água durante o

armazenamento. Além dos benefícios para a saúde supracitados, o Kefiran pode

ainda proporcionar efeito terepêutico como imunoestimulante, antimutagênico,

antialérgico, apresenta atividades antiúlcera, além de alto poder como um

composto de probióticos (KÖK-TAŞ; SEYDIM; ÖZER; GUZEL-SEYDIM, 2013;

PRADO et al., 2015).

A caracterização do Kefir não está totalmente descrita, tendo em vista que,

o tipo e o volume do leite utilizado e a composição dos grãos, bem como o processo

de produção utilizados afetam suas propriedades sensoriais, químicas e de textura.

O Kefir contém tipicamente 89-90% de umidade, 0,2% de lipídeos, 3,0% de

proteína, 6,0% de açúcar, 0,7% de cinzas, 1,0% de ácido láctico e 1,0% de álcool

(CAGINDI, 2003; SAKAR, 2007; OTLES; ALTAY et al., 2013).

Em estudo desenvolvido por Wszolek et al. (2001) as propriedades do Kefir

produzido na Escócia e na Polônia utilizando leite bovino, caprino e ovino com

diferentes culturas iniciais, mostrou que a composição química do Kefir variou de

10,6% a 14,9% para sólidos totais, 2,9-6,4% para proteína bruta, 3,8-4,7% para

carboidrato e 0,7-1,1% para cinzas. Magalhães et al. (2011) avaliaram o Kefir

brasileiro e evidenciaram que o mesmo continha 3,91% de proteína, 2,34% de

gordura e 9,62% de matéria seca após 24 h de fermentação. A recomendação da

composição físico-química do Kefir proposta pela FAO/WHO em 2003 e pelo MAPA

em 2007 está descrita na tabela 2.

Tabela 2 – Composição físico-química do Kefir recomendada pela FAO/WHO

(2003) e pelo MAPA (2007).

Parâmetro Padrões FAO Padrões MAPA

Proteína (% m/m) Min 2,7% Min 2,9%

Lipídeo (% m/m) < 10,0% Integral 3,0 a 5,9%

Parcialm. Desn.0,6 a 2,9% Desnatado Máx. 0,5%

Ácido Láctico (% m/m) Min 0,6% < 1% Etanol (% v/m) Não avaliado 0,5 a 1,5%

Os principais produtos formados durante a fermentação são ácido láctico,

CO2 e álcool (OTLES; CAGINDI, 2003). O ácido L (+) lático é o ácido orgânico em

maior quantidade após a fermentação, pois é derivado de aproximadamente 25%

da lactose. Entretanto, as quantidades de etanol e CO2 produzidas durante a

fermentação do Kefir dependem das condições de produção (FARNWORTH,

2005).

3.2.3 Composição Microbiológica

Os grãos de Kefir são compostos por uma mistura microbiana simbiótica de

bactérias de ácido láctico (108UFC / g), leveduras (106-107 UFC / g) e bactérias

ácido acéticas (105UFC / g). A manutenção da união da mistura simbiótica que

compõe o Kefir é possível pela presença do Kefiran (LOPITZ-OTSOA et al., 2006;

MAGALHÃES et al., 2011; KÖK-TAS et al., 2013; PRADO et al, 2015). Diversas

espécies de micro-organismos já foram isolados de Kefir (Tabela 3).

Tabela 3 – Espécies de micro-organismos encontrados no Kefir e nos grãos de Kefir

Espécie Referência

Lactobacillus Lactobacillus acidophillus Santos et al. (2003); Taş et al. (2012)

Lactobacillus brevis Simova et al. (2002); Mobili et al. (2009) Lactobacillus bulgaricus Yuksekdag et al. (2004)

Lactobacillus casei Zhou et al. (2009); Magalhães et al. (2011) Lactobacillus delbrueckii Santos et al. (2003); Simova et al. (2002)

Lactobacillus Kefir Magalhães et al. (2011) Lactobacillus Kefiranofaciens Wang et al. (2008); Leite et al. (2012)

Lactobacillus paracasei Magalhães et al. (2011) Lactobacillus rhamnosus Delfederico et al. (2006)

Lactobacillus mesenteroides Garbers et al. (2004) Lactococcus

Lactococcus lactis subsp. lactis Yuksekdag et al. (2004) Lactococcus lactis subsp. cremoris Yuksekdag et al. (2004)

Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis

Garrote et al. (2001)

Leuconostoc Leuconostoc mesenteroides Witthuhn et al. (2005)

Streptococcus Streptococcus cremoris Ergullu & Ucuncu (1983)

Streptococcus thermophilus Yuksekdag et al. (2004); Taş et al. (2012) Enterococcus

Enterococcus durans Yuksekdag et al. (2004); Yang et al. (2007);

Garofalo et al. (2015) Pediococcus

Pediococcus acidilactici Sabir et al. (2010) Pediococcus dextrinicus Sabir et al. (2010)

Pediococcus pentosaceus Sabir et al. (2010) Bactérias ácido acéticas

Acetobacter aceti Koroleva (1991) Acetobacter lovaniensis Magalhães et al. (2011)

Acetobacter syzgii Miguel et al. (2010) Outras Bactérias

Bacillus sp. Angulo et al. (1993) Genus Bifidobacterium Leite et al. (2012) Bifidobacterium bifidum Taş et al. (2012)

Leveduras Candida Kefir Wyder (2001)

Candida albicans Angulo et al. (1993) Candida krusei Witthuhn et al. (2005)

Kluyveromyces lactis Latorre-García et al. (2007); Magalhães et

al. (2011) Kluyveromyces marxianus Taş et al. (2012) Saccharomyces cerevisiae Zhou et al. (2009)

Saccharomyces lactis Motaghi et al. (1997) Saccharomyces exiguus Latorre-García et al. (2007)

Saccharomyces humaticus Latorre-García et al. (2007)

A bebida fermentada (Kefir), pode variar de acordo com a origem, o substrato

utilizado no processo de fermentação e os métodos de manutenção. O Kefir

tibetano, que é usado na China, é composto de Lactobacillus, Lactococcus e

levedura. Bactérias ácido acéticas, também, foram identificadas no Kefir tibetano,

dependendo da região da China de onde foram obtidas. A composição do Kefir

tibetano, difere do inglês, do russo, do irlandês, do originário de Taiwan e do

produzido na Turquia. Entretanto, sabe-se que esta diversidade microbiana é

responsável pelas características físico-químicas e pelas atividades biológicas de

cada Kefir (JIANZHONG et al., 2009; KABAK; DOBSON, 2011; GAO et al., 2012;

ALTAY et al., 2013).

A FAO/WHO (2003) e o MAPA (BRASIL, 2007) traz a composição

microbiológica recomendada para o Kefir, conforme mostra a tabela 4.

Tabela 4 – Composição microbiológica do Kefir recomendada pela FAO/WHO (2003) e MAPA (2007).

Parâmetro Padrões FAO Padrões MAPA

Contagem total de bactérias lácticas (UFC/g)

Min 107 Min 107

Leveduras (UFC/g) Min 104 Min 104

3.2.3.1 Bactérias ácido láticas

As bactérias ácido láticas (BAL) são bactérias Gram-positivas,

facultativamente anaeróbicas, geralmente não móveis e não formadoras de

esporos. São, predominantemente, produtoras de ácido láctico, como produto final

da fermentação, a partir de carboidratos (KHALID, 2011; PFEILER;

KLAENHAMMER, 2007). As características dos principais gêneros estão descritas

na tabela 5.

Possuem um metabolismo exigente, envolvendo requisitos nutricionais

complexos para seu crescimento, o que incluem aminoácidos, peptídeos, bases

nucleotídicas, vitaminas, minerais, ácidos graxos e carboidratos (VODNAR;

PAUCEAN; DULF; SOCACIU, 2010). Entretanto, são bactérias que podem ser

encontradas em larga escala e de forma natural em alimentos fermentados, nos

quais desempenham um importante papel nas propriedades nutritivas e sensoriais

nos tradicionais produtos de leite fermentado, chegando a compor o mais

importante grupo de micro-organismos utilizados em alimentos devido as suas

características fisiológicas que incluem suas propriedades probióticas

(HLADÍKOVA; SMETANKOVA; GREIF; GREIFOVA, 2012).

Tabela 5 – Características dos principais gêneros de bactérias ácido láticas.

Gênero Gram Catalase Forma Tolerância ao oxigênio

Fermentação Produto

Lactobacillus + -

Bacilos ou

Coco Bacilos

Anaeróbico facultativo

ou Microaerófilo

Obrigatoriamente Homofermentativo, Facultativamente

Heterofermentativo, Obrigatoriamente

Heterofermentativo

Ácido Láctico,

CO2

Lactococcus + - Cocos

em cadeia

Anaeróbico facultativo

Homofermentativo Ácido

Láctico

Leuconostoc + - Cocos

em cadeia

Anaeróbico facultativo

Heterofermentativo Ácido

Láctico, CO2

Pediococcus + - Cocos

em tétrades

Anaeróbico facultativo

ou Microaerófilo

Homofermentativo Ácido

Láctico

Streptococcus + - Cocos

em cadeia

Anaeróbico facultativo

Homofermentativo Ácido

Láctico

Enterococcus + - Cocos

em cadeia

Anaeróbico facultativo

Homofermentativo Ácido

Láctico

Fonte: CLAESSON et al, 2007; SARKAR, 2007; EDDINE et al., 2016

Muitas espécies são de importância biotecnológica devido aos seus

aspectos de segurança, alcançados pela utilização há anos na preservação e

manutenção de alimentos (OLIVEIRA et al., 2017). No entanto, a quantidade a ser

utilizada é variável, podendo produzir efeitos positivos, como na fermentação

alcoólica tradicional de cereais, propiciando um ambiente favorável para

fermentações em fases posteriores, além da contribuição no aroma e no sabor

característico da bebida através da produção de etanol, ou negativos, o que pode

ocorrer na produção de molho de soja, onde o teor de ácido indica baixa

fermentação, devendo ser evitado (REE; LEE, JANG-EUN; LEE, CHERL-HO,

2011).

Cepas de Lactobacillus e Leuconostoc desempenham um papel importante

no desenvolvimento do sabor de produtos lácteos fermentados. Por exemplo,

Lactobacillus helveticus e Lactobacillus fermentum, foram isolados de culturas

iniciantes de soro de leite natural autóctones e são importantes na produção de

queijos duros como Grana Padano e Parmigiano Reggiano (GATTI et al., 2013).

Em relação ao Leuconostoc, estes desempenham um papel importante na

produção de compostos de aroma em leites fermentados, manteiga e creme, além

de serem membros da microbiota autóctone de queijos tradicionais de leite cru,

contribuindo para sabores peculiares destes (POGA ČIĆ et al. 2013; MONTEL, et

al., 2014).

As bactérias ácido láticas também são reconhecidas no campo da

biorremediação, especialmente quando as estirpes bacterianas atuam como

sorventes (MONACHESE, BURTON, REID, 2012). Por exemplo, o mecanismo de

captação de cátions de prata por Lactococcus lactis e Lactobacillus casei foi

estudado por Milanowski et al. (2017) onde foi observado que L. casei poderia

crescer no ambiente de cátions de prata e que essas bactérias poderiam ligar mais

a esse elemento se fosse adicionado no momento da inoculação. Essa

dependência não foi observada no caso de L. lactis, visto que a bactéria captou

quase a mesma quantidade de prata adicionada durante a inoculação e após 24

horas.

3.2.3.1.1 Gênero Lactobacillus

O gênero Lactobacillus foi isolado pela primeira vez em 1900 por Moro a

partir das fezes de lactentes amamentados ao seio materno (GOMES; MALCATA,

1999). Este gênero tem uma ampla distribuição, podendo ser encontrado em

alimentos vegetais, no trato gastrintestinal e genital, sendo sua ocorrência

influenciada pelo pH, teor de oxigênio, temperatura (faixa ótima entre 30-40°C) e

interações com outras bactérias (ANTUNES et al., 2007).

Os lactobacilos, compõe o maior gênero das BAL com mais de 100 espécies

descritas, correspondendo a micro-organismos fermentativos e não formadores de

esporos. Muitas de suas espécies estão associadas com a produção de alimentos,

devido à ação conservadora mediante o processo de acidificação com alterações

nos atributos sensoriais e na composição nutricional (CLAESSON, M. J.;

SINDEREN, D. V.; O’TOOLE, P. W., 2007).

3.2.3.1.2 Gênero Lactococcus

Os Lactococcus, incialmente, foram classificados nos gêneros

Streptococcus e Lactobacillus, devido as suas semelhanças. O gênero

Lacotococcus pertence ao grupo das bactérias ácido láticas, sendo encontradas

em vários ambientes e são de grande importância para a indústrias de alimentos

agrícolas, veterinários, médicos e processados. Caracterizam-se como cocos,

geralmente em pares (diplococos) ou em cadeias curtas, Gram-positivos, catalases

negativos e homofermentativos, tendo como espécies reconhecidas L. lactis, L.

garvieae, L. piscium, L. plantarum e L. raffinolactis. As subespécies L. lactis subs.

lactis e L. lactis subs. cremoris são utilizadas em todo o mundo em culturas iniciais

para fermentação de alimentos, em especial, na indústria de laticínios (PU;

DOBOS; LIMSOWTIN; POWELL, 2002; EDDINE; SALIHA; NACERA; BATTACHE;

MILOUD; MEBROUK, 2016).

A atividade anti-inflamatória de Lactococcus lactis subsp. cremoris foi

avaliada usando modelos de inflamação in vivo e in vitro, sendo a colite induzida

em ratos C57BL / 6 por administração de 3% de sulfato de dextrano sódico em água

potável (NISHITANI et al., 2009). As propriedades probióticas de L. lactis subsp.

Cremoris IBB477 atraiu atenção devido aos seus mecanismos de adesão e

sobrevivência no ambiente intestinal, tendo sido estudada por Radziwill-

Bienkowska et al. (2016). Já Luerce et al. (2014) estudaram três cepas de L. lactis

in vitro utilizando células epiteliais intestinais, através da administração de L. lactis

NCDO 2118 durante 4 dias a ratos C57BL / 6 durante o período de remissão de

colite induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS).

3.2.2.1.3 Gênero Leuconostoc

Na França, em 1985, culturas de sangue de uma mulher diagnosticada com

lúpus eritematoso, cursando com choque séptico e tratada com vancomicina,

produziram cocos Gram-positivos resistentes à vancomicina. Os mesmos cocos,

resistentes à vancomicina, surgiram no sangue de outro paciente acometido de

pneumonia pós-operatória que, posteriormente, foi tratado com penicilina, tendo

melhorado clinicamente. Inicialmente, a bactéria foi identificada como

Streptococcus, porém, por apresentar um padrão de resistência atípico à

vancomicina, análises laboratoriais adicionais foram realizadas, levando a

identificação do gênero Leuconostoc (SINNOTT; GARLAND, 1991).

A sua nomenclatura deriva das palavras gregas leucos (claro) e nostoc

(algas), são caracterizados como cocos Gram-positivos e heterofermentativos, com

morfologia de colônia e bioquímica semelhante a Streptococcus e Lactobacillus,

entretanto, a produção de gás a partir da glicose é característica de Leuconostoc

spp., mas não de Streptococcus, permitindo assim a sua diferenciação. Já a

diferença bioquímica de Leuconostoc e Lactobacillus formadores de gás utiliza

hidrólise de arginina, que ocorre com Lactobacillus, mas não com Leuconostoc.

Incluem-se no género Leuconostoc quatro espécies, L. mesenteroides, L.

paramesenteroides, L. lactis e L. oenos (SINNOTT; GARLAND, 1991).

Os nichos naturais de Leuconostoc são as vegetações verdes e as raízes,

sendo estes também conhecidos habitantes de produtos lácteos e açúcar

processado, uma vez que a partir do seu habitat natural crescem facilmente para

outros meios (vegetais, frutas, cereais, carne e leite), são utilizados pela indústria

de alimentos para aromatizar produtos lácteos e para melhorar a decapagem e

processos de fermentação (FLÓRES et al., 2016).

Portanto, eles são frequentemente encontrados como parte da comunidade

BAL inicialmente envolvida na fabricação e amadurecimento de diversos alimentos

fermentados e bebidas, tais como azeitonas, carne, cacau, vinho e produtos

lácteos. Na tecnologia de laticínios, as cepas de Leuconostoc são benéficas para

inúmeros aspectos tecnológicos ligados à sua capacidade de produzir ácidos

orgânicos, dióxido de carbono, dextrans e, especialmente, compostos aromáticos,

como diacetil, acetaldeído e acetoína. Para isso, as cepas bem caracterizadas são

intencionalmente adicionadas como novas culturas variáveis em vários processos

de produção para controlar as fermentações e contribuir para as propriedades

sensoriais e reológicas do produto final (FLÓRES et al., 2016).

As cepas de Leuconostoc também estão ligadas a alguns aspectos

negativos, incluindo deterioração (por exemplo, na indústria de cana-de-açúcar e

produtos alimentares por formação de limo) e segurança (uma vez que foram,

ocasionalmente, identificados em isolados clínicos humanos). No entanto, sua

longa história de consumo seguro em alimentos tradicionais fermentados levou à

conclusão de que Leuconostoc é em geral considerado como micro-organismo

seguro. Neste sentido, a Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos

(EFSA) considera Leuconostoc como adequado para a abordagem qualificada de

presunção de segurança (QPS), o que exige que as cepas tecnológicas destinadas

a serem introduzidas na cadeia alimentar não sejam adquiridas ou transferíveis

determinantes de resistência aos antimicrobianos de importância clínica e

veterinária para prevenir a disseminação lateral destes (FLÓRES et al., 2016).

3.2.3.2 Leveduras

Classificadas no reino dos fungos e com mais de 1500 espécies descritas,

as leveduras são micro-organismos eucarióticos e unicelulares de grande

importância para a indústria de alimentos e bebidas. O Kefir é um produto que

apresenta algumas características que são atribuídas às atividades das leveduras

(KURTZMAN; FELL, 2006; QUEROL; FLEET, 2006).

Uraz et al. (2012) isolaram leveduras do Kefir da Turquia, foram encontrados

um total de 66 diferentes espécies, onde 51% das leveduras encontradas eram da

espécie Candida kefyr, 33% representavam a espécie Candida famata e apenas

2% das leveduras presentes no Kefir avaliado eram da espécie Saccharomyces

cerevisiae. Ainda com relação ao Kefir turco, mas de regiões diferentes, Kök-taş et

al. (2012) identificaram como maiores representantes de leveduras as espécies

Kluyveromyces marxianus e Kluyveromyces dobzhanskii.

As leveduras têm sido consideradas como um dos micro-organismos que

apresentam potencial probiótico, e estudos têm sido desenvolvidos para comprovar

este efeito. Martins et al. (2013) avaliaram a proteção da levedura S. boulardii

contra Salmonella typhimurium, os resultados mostraram que a levedura pode ser

útil como adjuvante em ratos doentes, infectados com febre tifóide, mesmo quando

iniciada após o aparecimento da doença.

Perricone et al. (2014) isolaram leveduras provenientes de Altamura (região

sul da Itália) e testaram a capacidade probiótica das mesmas, 18 isolados foram

submetidos à seleção para verificar suas características probióticas (sobrevivência

em pH 2,5 enriquecido com sais biliares, resistência à antibióticos, atividade

antimicrobiana para patógenos de origem alimentar, propriedades hidrofóbicas e

produção de biofilme), mas, apenas Saccharomyces cerevisiae estirpe 2 e

Saccharomyces cerevisiae estirpe 4 foram selecionados e avaliadas em relação a

simulação do trânsito gastrointestinal, estes isolados mostraram uma tendência

semelhante à S. boulardii em relação ao seu potencial probiótico.

Leveduras isoladas de Kefir proveniente da Argentina foram identificadas e

avaliadas em relação ao seu potencial probiótico, 34 estirpes foram isoladas e

identificadas por meio de métodos microbiológicos clássicos e genética molecular

clássica, destas, 13 isolados apresentaram-se resistentes aos sais biliares. Além

da resistência, K. marxianus CIDCA 8154 e S. cerevisiae CIDCA 8112 também

apresentaram capacidade de adesão às células epiteliais do intestino e a sobreviver

à passagem através do trato gastrointestinal de ratos (DIOSMA, et al. 2013).

3.2.3.3 Bactérias ácido acéticas

As bactérias ácido acéticas (BAA) compõem um grande grupo de bactérias

caracterizadas por se apresentarem como Gram-negativas ou Gram-variáveis,

obrigatoriamente aeróbicas e não formam esporos, são catalases positivas e

oxidase negativo. Segundo Ruiz et al. (2000), as bactérias ácido acéticas são

divididas nos gêneros Acetobacter, Acidomonas, Gluconobacter e

Gluconacetobacter, entretanto, Gluconobacter e Acetobacter são as mais

estudadas como produtoras de ácido acético para indústrias.

Acetobacter e Gluconobacter tem forma pleomórficas que pode ser esférica,

alongada, curvada ou filamentosa, em forma de haste, retas ou ligeiramente curvas,

cujo tamanho pode variar de 0,4-1,0 μm de largura por 0,6-0,8 μm de comprimento,

ocorrendo individualmente, em pares ou em cadeia. Em meios líquidos,

Acetobacter forma um anel, filme ou película, através do qual é observada uma

turbidez uniforme do meio e um depósito celular. Algumas cepas produzem um

pigmento rosa, não difuso, enquanto outros podem produzir um pigmento solúvel,

marrom escuro (KERSTERS; LISDIYANTI; KOMAGATA; SWINGS, 2006; MAAL;

SHAFIEE, 2009). De modo geral, as BAA têm sido enumeradas pela viabilidade de

colônias em meios sólidos, entretanto, nem todos os meios promovem o

crescimento de todas as bactérias de forma igualitária, ou seja, os meios são

seletivos para uma cepa ou outra (GULLO; CAGGIA; DE VERO; GIUDICI, 2006).

No campo da biotecnologia, o interesse pelas bactérias ácido acéticas é

devido ao seu processo de fermentação, através do qual ocorre por oxidação

incompleta de álcoois e açúcares em uma excreção quase quantitativa dos

produtos de oxidação correspondentes no meio de cultura (DEPPENMEIER et al.,

2002; ADACHI et al., 2003; MATSUSHITA et al., 2003). Como exemplo, tem a

produção de ácido acético a partir de etanol ou de ácido D-glucônico a partir de D-

glicose (DEPPENMEIER et al., 2002; LINO et al., 2012).

Sainz et al. (2016) testaram dezenove cepas pertencentes a oito espécies

diferentes de BAA para selecionar aqueles que poderiam produzir ácido D-

glucônico a partir de D-glicose sem consumir D-frutose em uma produção de bebida

fermentada não alcoólica de morangos. Ao final do estudo foi possível conseguir a

conversão seletiva de D-glicose em ácido D-glucônico sem fermentar a D-frutose.

G. japonicus CECT 8443 e G. oxydans Po5, pertencentes ao gênero

Gluconobacter, foram as melhores cepas para este processo. No entanto, a escolha

da cepa dependerá da concentração final de ácido D-glucônico desejado.

Ua-Arak et al. (2016), considerando que as BAA podem produzir

exopolissacarídeo (EPS) de peso molecular extremamente elevado, o que as torna

potenciais candidatas para a formação de estruturas em pães, fermentaram, em

condição aeróbica alternativa, cereal sem glúten com cepas de BAA que

produziram Gluconobacter albidus TMW 2.1191, Kozakia baliensis NBRC 16680 e

Neoasaia chiangmaiensis NBRC 101099 em massas de trigo sarraceno (mourisco)

contendo melaço como fonte natural de sacarose. As características das BAA nas

fermentações da massa asseguram os potenciais de usá-las para melhorar os pães

sem glúten com qualidade e sem o uso de aditivos, substituindo hidrocolóides

comerciais formadores de estrutura atualmente utilizados por EPS produzidos in

situ.

3.2.4 Interação dos micro-organismos do Kefir durante a fementação

O crescimento e a atividade dos micro-organismos em alimentos

fermentados são dependentes de vários fatores, tais como: disponibilidade de

fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes específicos para cada metabolismo do

micro-organismo submetido a fermentação, pH do substrato, teor de umidade,

temperatura de incubação e presença de outros micro-organismos competidores.

Ao produzir um único produto final principal os micro-organismos são chamados

homofermentativos (figura 4), e os que produzem mais de um produto são

chamados heterofermentativos (FELLOWS, 2006).

Figura 4 – Homofermentação esquemático pela via metabólica da glicólise.

Fonte: Adaptado de ABDEL-RAHMAN; TASHIRO; SONOMOTO (2013).

As BAL homofermentativas possuem enzimas aldolases e produzem ácido

lático como o principal produto final. São, portanto, de interesse para a produção

de ácido láctico em escala comercial. Em contrapartida, as BAL heterfermentativas

produzem outros subprodutos além do ácido láctico. O metabolismo

heterofermentativo usa o caminho alternativo de pentose monofosfato, convertendo

açúcares de 6-carbono (hexoses) em açúcares de 5 carbonos (pentoses) por

fosfocetolase, conforme ilustrado na figura 5 (ABDEL-RAHMAN et al., 2011).

Figura 5 – Heterofermentação esquemático pela via metabólica da glicólise.

Fonte: Adaptado de ABDEL-RAHMAN; TASHIRO; SONOMOTO (2013).

O processo fermentativo do Kefir ocorre por simbiose entre bactérias ácido

láticas, leveduras e bactérias ácido acéticas, que metabolizam e produzem seus

produtos finais, conforme ilustrado na figura 6. Os produtos da fermentação do Kefir

são, predominantemente, oriundos das fermentações láticas por BAL. A sequência

de bactérias lácticas em processo fermentativo é determinada pela sua tolerância

ácida (FELLOWS, 2006).

Figura 6 – Metabolismo dos micro-organismos durante a fermentação de Kefir.

BAL = Bactérias ácido láticas; BAA = Bactérias ácido acéticas

O gênero Lactococcus normalmente tem um crescimento mais rápido do que

as leveduras devido a sua capacidade em metabolizar a lactose liberando ácido

láctico. No entanto, quando o ambiente se torna muito ácido (0,7 a 1,0% de ácido

láctico), os Lactococcus são inibidos e superados por espécies mais tolerantes ao

ácido, como os Lactobacillus. As leveduras que são de extrema importância no

processo fermentativo, também são favorecidas com a acidez e encontram o

ambiente favorável para produção de fatores essenciais de crescimento, como

aminoácidos, vitaminas, alteração do pH, secreção de etanol e produção de CO2

(FELLOWS, 2006; LOPITZ-OTSOA et al., 2006). O etanol produzido torna-se

biodisponível para que as bactérias ácido acéticas exerçam seu metabolismo e

produzam ácido acético (MAGALHÃES et al., 2010).

3.2.5 Benefícios do Kefir na saúde humana

O processo fermentativo do Kefir atrelado a diversidade de sua microbiota,

seja atuando de forma independente ou sinérgica, acarreta em vários e importantes

benefícios para a saúde, entre estes: propriedades fisiológicas, profiláticas e

terapêuticas (Figura 7) (LEITE et al., 2013).

Figura 7 - Diagrama esquemático dos efeitos fisiológicos benéficos do Kefir na saúde humana.

Fonte: Adaptado de Rosa et al. (2017)

3.2.5.1 Atuação no trato gastrintestinal

Estudos e relatos clínicos evidenciam a eficácia das bactérias probióticas na

prevenção e tratamento de infecções intestinais, a medida que os probióticos atuam

no aumento da resistência do hospedeiro aos agentes patogênicos intestinais por

vários mecanismos: produção de substâncias inibitórias, bloqueio de locais de

adesão na superfície intestinal, competição por nutrientes e estimulação da

imunidade tanto na mucosa como a nível sistêmico (OHLAND; MACNAUGHTON,

2010; ZHANG et al., 2013). O Kefir por possuir uma gama de micro-organismos

com potencial probiótico, tem sido estudado como adjuvante no tratamento das

patologias a do trato gastrintestinal.

Bolla et al. (2013) testaram o efeito protetor de uma mistura constituída por

micro-organismos isolados do Kefir (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus Kefir,

Lactococcus lactis, Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisiae) em

ratos infectados com Clostridium difficile. Os ratos receberam oralmente 200 mg de

clindamicina no dia 7 e depois foram infectados com 1 x 108 UFC de C. difficile por

gavage, 6 dos 7 animais infectados desenvolveram diarreia e 5 de 7 do grupo

placebo morreram no final do experimento. No grupo de animais infectados e

tratados, apenas 1 de 7 ratos apresentou diarreia e nenhum deles morreu. As

seções histológicas mostraram apenas um ligeiro engrossamento da mucosa com

presença de infiltrado linfócito. Estes resultados demonstram que um tratamento

oral com uma mistura de bactérias e leveduras isoladas de Kefir foi capaz de

prevenir diarreia e enterocolite desencadeada por C. difficile.

Em outro estudo, Montijo-Prieto et al. (2015) isolaram Lactobacillus

plantarum C4 do Kefir e o testaram quanto à sua capacidade protetora e

imunomoduladora em yersiniose. Ratos foram infectados com uma estirpe de

sorotipo O9 de baixa patogenicidade de Yersinia enterocolitica que resulta em uma

infecção intestinal prolongada com colonização das placas de Peyer. O pré-

tratamento com C4 não teve efeito sobre a excreção fecal de Yersinia, mas reduziu

a colonização das placas de Peyer. Este efeito protetor foi associado ao status pró-

inflamatório na mucosa intestinal – aumento da produção do Fator de Necrose

Tumoral α (TNF-α) nos infectados tratados com C4 – e houve um aumento na

secreção total de Imunoglubulina A (IgA). A nível sistêmico, C4 não promoveu uma

resposta pró-inflamatória, embora a produção da citoquina imunorreguladora

Interferon-γ (IFN-γ) tenha sido melhorada. Esses achados sugerem que L.

plantarum C4 pode aumentar a resistência a infecções intestinais por meio de sua

atividade imunomoduladora.

3.2.5.2 Atuação no sistema imune

As interações entre bactérias comensais, epitélio intestinal e células do

sistema imune desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase

intestinal (KELLY; MULDER, 2012; RESCIGNO, 2011). O uso de probióticos para

modular as respostas imunes a nível da mucosa e a nível sistêmico tem

demonstrado ser uma interessante alternativa quanto à prevenção e tratamento de

doenças infecciosas e em casos de diversas imunopatologias, como doenças

inflamatórias intestinais e alergias (GAUDANA; DHANANI; BAGCHI, 2010;

HEINEMAN et al., 2012; TOH et al., 2012). Estudos têm relatado propriedades

imunomoduladoras para diferentes leveduras e bactérias isoladas de grãos de

Kefir.

Carasi et al. (2015) selecionaram e administraram a cepa Lactobacillus Kefiri

CIDCA 8348, isolados de grãos de Kefir, em ratos suíços saudáveis diariamente

durante 21 dias. A probioticoterapia aumentou a IgA em fezes e reduziu a

expressão de mediadores pró-inflamatórios em placas de Peyer e nos linfonodos

mesentéricos, onde também aumentou a isoleucina-10 (IL-10). Em conclusão,

cepas de L. Kefiri, isoladas de Kefir, estimularam a produção de diferentes

proporções de citocinas pró / anti-inflamatórias in vitro, demonstrando efeitos não

apenas na redução da expressão de mediadores pró-inflamatórios, mas também

no aumento das moléculas anti-inflamatórias em locais indutores e efetores do

sistema imunológico intestinal.

Entre as leveduras do Kefir, Romanin el al. (2010) verificaram que as cepas

Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 e Saccharomyces cerevisiae CIDCA 8112

reduzem a resposta inata no epitélio intestinal por meio de um mecanismo

dependente da modulação do fator nuclear kappa B (NF-kB), o que indica que o

Kefir contém micro-organismos capazes de abolir a resposta inflamatória epitelial

intestinal que pode explicar algumas das propriedades atribuídas a este leite

fermentado.

3.2.5.3 Ação antibacteriana

Desde o início do século XX os efeitos positivos do consumo regular de

iogurtes contendo micro-organismos têm sido estudados, o que levou a observação

da existência de uma importante competição entre BAL e patógenos que

desencadeia em benefícios à saúde. O Kefir, como probiótico, tem o seu potencial

contra micro-organismos patogênicos atribuída a produção de ácido láctico, ácido

acético, peróxido de hidrogênio, dióxido de carbono, etanol, diacetil e bacteriocinas

produzidas pelas BAL, BAA e leveduras durante o ciclo normal da fermentação

(FARNWORTH, 2005; LOPITZ-OTSOA et al., 2006).

Carasi et al. (2014) estudaram a atividade antibacteriana de Lactobacillus

Kefiri, onde todas as cepas de Kefiri foram capazes de inibir os patógenos Gram

(+) e Gram (-), em análises in vitro. O L. Kefiri CIDCA 8348 foi selecionado para

realizar estudos in vivo. Os ratos foram tratados diariamente com uma dose oral de

108 UFC durante 21 dias e não apresentaram sinais de dor, letargia, desidratação

ou diarréia. Além disso, não houve nenhuma diferença na secreção de citocinas

pró-inflamatórias entre ratos tratados e controlados. Também não foi observado

translocação de micro-organismos para o sangue, baço ou fígado. Tais

descobertas, evidenciaram que L. Kefiri CIDCA 8348 é um micro-organismo isolado

de um produto lácteo com um grande potencial como probiótico para uso humano

ou animal.

Miao et al. (2016) purificaram o peptídeo antimicrobiano F3 do Kefir,

demonstrando que este apresenta uma estrutura química especial, tem baixo peso

molecular e contém uma leucina e uma tirosina com dois radicais fosfato. Este

peptídeo apresentou atividade antimicrobiana em um amplo espectro de

organismos, incluindo várias bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, bem

como fungos, com valores de concentração inibitória mínima variando de 125 a 500

μg / mL. Por fim, o F3 tem o potencial de servir como conservante natural valioso

na indústria de alimentos.

3.2.5.4 Ação hipocolesterolêmica

Com o frequente aumento do índice de comorbidades, como as doenças

cardiovasculares (DCV), na população, sobretudo associadas aos níveis de

colesterol séricos elevados, estudos tem sido desenvolvidos acerca do consumo

diário de produtos probióticos visando a redução da concentração de colesterol na

circulação (ROSA et al., 2017).

Liu et al. (2006) avaliaram a propriedade hipocolesterolêmica do Kefir de leite

e do Kefir de “leite de soja”. Ratos machos foram alimentados com uma dieta livre

de colesterol ou enriquecida com colesterol contendo 10% de leite desnatado, Kefir

de leite e Kefir de “leite de soja” durante 8 semanas. A dieta de Kefir de “leite de

soja” levou a um aumento significativo na excreção fecal de esteróis neutros e

ácidos biliares em comparação com as outras duas dietas. E, também provocou

uma diminuição significativa na proporção sérica de colesterol não-HDL para HDL-

colesterol, em comparação com o controle, do que as outras dietas. Esses achados

demonstram que o Kefir de “leite de soja” pode ser considerado como um produto

promissor em termos de prevenção de doença cardiovascular (DCV) através de

sua ação hipocolesterolêmica.

Os efeitos do Lactobacillus plantarum MA2, isolados do Kefir tradicional

tibetano chinês, sobre a redução dos níveis de colesterol e na microbiota de ratos,

foram avaliados por Wang et al. (2009). Os ratos foram alimentados com uma dieta

enriquecida com colesterol e suplementada com L. plantarum MA2 liofilizado. Os

resultados mostraram que houve uma significativa redução do colesterol total

sérico, colesterol-Lipoproteína de baixa densidade (LDLc) e triglicerídeos, enquanto

não houve alteração no colesterol-lipoproteínas de alta densidade (HDLc). Além

disso, o colesterol total no fígado e os triglicerídeos também diminuíram. No

entanto, a excreção fecal de colesterol e triglicerídeos aumentaram

significativamente (p <0,05) em comparação com o controle. Além disso, L.

plantarum MA2 aumentou a população de bactérias ácido láticas e bifidobactérias

fecal, mas não alterou o número de Escherichia coli em relação ao controle.

Ostadrahimi et al. (2015) realizaram um ensaio clínico randomizado duplo-

cego controlado com placebo em 60 pacientes diabéticos com idade entre 35 e 65

anos. Os pacientes consumiram 600mL de Kefir diariamente durante 8 semanas.

Ao final do estudo, verificaram que os níveis séricos de triglicerídeos, colesterol

total, LDL e HDL do grupo que consumiu Kefir não apresentaram diferenças

significativas quando comparado com o grupo controle, evidenciando que o Kefir

não conseguiu reduzir os níveis plasmáticos dos lipídeos em portadores de

diabetes.

3.2.5.5 Ação anticarcinogênica

O potencial efeito do Kefir na modulação da carcinogênese pode ser

atribuída aos polissacarídeos e aos compostos bioativos. Os polissacarídeos

solúveis em água, mostraram efeito protetor contra metástases pulmonares,

enquanto a fração de polissacarídeo insolúvel em água inibiu a metástase de

melanoma em ratos. Além disso, os compostos bioativos de Kefir podem prevenir

o início do câncer ou suprimir o crescimento dos tumores já iniciados, dificultando

a ação de enzimas, impedindo a conversão de agentes pró-carcinogênicos em

carcinógenos (LOPITZ-OTSOA et al., 2006).

Liu et al. (2002) estudaram a resposta da imunoglobulina A na mucosa

intestinal e o efeito antitumoral de Kefir de leite e de leite de soja administrados, via

oral, em ratos portadores de tumores durante 30 dias. Ao final do estudo verificaram

que os Kefirs não apenas inibiram o crescimento tumoral e induziram a lise da forma

apoptótica das células tumorais, como também aumentou o nível total de IgA em

extratos de tecido da parede do intestino delgado, o que sugere que os Kefirs de

leite e de leite de soja podem ser considerados promissores para a prevenção e

aprimoramento da resistência da mucosa a infecções gastrointestinais e ao câncer.

Khoury et al. (2014) avaliaram a capacidade do Kefir em inibir a proliferação

e a motilidade e induzir a apoptose de células de câncer colorretal Caco-2 e HT29.

Os resultados mostram que Kefir foi capaz de induzir a prisão do ciclo celular na

fase G1, diminuir a expressão de mRNA do fator de crescimento transformante-α

(TGF-α) e do fator de crescimento transformante-β1 (TGF-β1) em HT29 e p21 foi

visto como independente de p53, o que pode ser o motivo da parada do ciclo celular

na fase G1 observada após o tratamento com Kefir. Além disso, a proporção dos

genes pró-apoptótico e anti-apoptótico, respectivamente, Bax: Bcl-2 aumenta,

consistentemente, após o tratamento com Kefir indicando seu efeito pró-apoptótico.

Os dados obtidos sugerem ainda, que o Kefir é capaz de inibir a proliferação e

induzir a apoptose em células HT-29 e Caco-2 de câncer colorretal mas não exibe

um efeito significativo sobre a motilidade e a invasão destas células in vitro.

3.2.5.6 Ação do Kefir na intolerância a lactose

A lactose é um dissacarídeo, formado por glicose e galactose, que para ser

adequadamente absorvido pela mucosa intestinal é necessário sofrer hidrólise

enzimática através de uma β-galactosidase conhecida como lactase. No entanto,

há pessoas que apresentam deficiência na atividade desta enzima acarretando no

diagnóstico de intolerância a lactose que leva a sintomas como meteorismo, dor ou

desconforto intestinal e diarreia osmótica. Tanto o leite quanto os seus derivados

contêm concentrações elevadas de lactose, o que faz com que estes produtos

sejam, normalmente, excluídos da dieta de um intolerante a lactose (DE VRESE;

MARTEAU, 2007).

Entretanto, produtos fermentados apresentam a característica de promover

um esvaziamento gástrico tardio, facilitando a digestão da lactose, uma vez que

prolongam a ação residual da lactase e, ainda, promovem a redução da

sensibilidade aos sintomas de má absorção. O Kefir, durante sua fermentação,

reduz o teor de lactose, pois a β-galactosidade é uma enzima naturalmente

presente nos grãos de Kefir, o que leva a produção de um produto final adequado

para pessoas que apresentam o quadro de intolerância a lactose (AHMED et al.,

2013).

Hertzler; Clancy (2003) fizeram um estudo pioneiro em adultos, clinicalmente

saudáveis, com diagnóstico de intolerância a lactose. Na pesquisa, ficou

evidenciado que o consumo de Kefir melhorou a digestão da lactose de forma

semelhante ao iogurte natural, reduzindo também a flatulência gerada pela digestão

do leite em uma média de 65%. Além disso, o percentual de β-galactosidade foi

60% maior do que o encontrado no iogurte natural.

3.3 Métodos de conservação de alimentos

A indústria alimentícia, através da tecnologia, tem desenvolvido ao longo dos

anos, técnicas de conservação que propiciem o aumento da vida de prateleira de

um produto inibindo alterações microbiológicas e bioquímicas e, assim, permite que

um alimento chegue com qualidade nutricional e sensorial ao seu consumidor final.

Os métodos utilizados são os mais diversos, o que engloba o emprego de calor ou

frio, modificações de pH, atmosfera e atividade de água (com redução do seu teor

ou sua imobilização). Porém, a escolha do método vai depender das características

do alimento, aspectos que se têm o interesse de preservar, tempo de vida útil

pretendido, pré-existência de maquinário na indústria e viabilidade econômica

(FELLOWS, 2006).

Nos alimentos que contém micro-organismos vivos, os diversos fatores que

podem afetar o comportamento destes, assim como as diferentes composições dos

alimentos nos quais estão inseridos tem que ser considerados, pois podem interferir

na concentração celular dos probióticos, impedindo que estes atinjam o intestino

vivos e metabolicamente ativos. Alguns destes fatores são a acidificação do produto

final, a quantidade de oxigênio tanto no produto quanto o que penetra através da

embalagem, nível de oxigênio, pH e ácidos produzidos no período de

armazenamento. Por conseguinte, também a perda de viabilidade ocorre durante o

trânsito gastrointestinal, onde os principais fatores de estresse são o pH e o

deslocamento biliar, que são considerados como um obstáculo que os probióticos

têm de superar para cumprir o seu papel biológico. Neste contexto, diferentes

estratégias tecnológicas que objetivam conservar e manter a viabilidade celular dos

probióticos têm sido utilizadas, entre estas a secagem por liofilização (SOUZA et

al., 2011; PRISCO; MURIELLO, 2016).

3.3.1 Liofilização

A liofilização ou secagem a frio (freeze dryer) trata-se de um método de

conservação que realiza uma secagem por sublimação sob vácuo. A pressão de

vapor d’água do alimento é mantida abaixo de 4,58 Torr (610,5 Pa) e a temperatura

abaixo de 0,0099ºC (pressão e temperatura características do ponto triplo), onde a

água encontra-se em estado sólido, o que faz com que ao promover o aquecimento

do alimento, o gelo sublima diretamente para o estado de vapor sem se fundir, ou

seja, sem passar pelo estado líquido (Figura 8), minimizando assim várias reações

de degradação que ocorrem durante a secagem, como a reação de Maillard,

desnaturação de proteínas e reações enzimáticas, e, portanto, é uma boa

alternativa de secagem para alimentos (FELLOWS, 2006; AGUIAR et al., 2012).

Figura 8 – Diagrama de fases da água mostrando a sublimação do gelo.

Fonte: Adaptado de Fellows, 2006

Segundo Baruffaldi e Oliveira (1998) o termo “liófilo” significa amigo do

solvente, o que define com fidelidade as características dos produtos liofilizados:

altamente higroscópicos e de fácil dissolução na água. A liofilização é um

importante processo industrial para secagem de alimentos, materiais cirúrgicos,

farmacêuticos e outros, os quais têm estrutura interna ou composição química

sujeitas à degradação térmica (BOSS, 2004).

O processo de liofilização consiste em três etapas: (1) congelamento de um

material úmido; (2) secagem primária: a água livre congelada sofre sublimação; (3)

secagem secundária: a água ligada é eliminada por dessorção. Para remover a

umidade a uma temperatura abaixo de 0ºC, a liofilização requer alto vácuo para

aumentar o gradiente de transferência de massa entre a frente de sublimação e o

meio de secagem (Figura 9). A remoção do vapor d’água do alimento ocorre de

forma contínua ao se manter a pressão na câmara do liofilizador abaixo da pressão

de vapor na superfície do gelo através de uma bomba de vácuo e da condensação

dos vapores diretamente em gelo (sublimação inversa) através de uma serpentina

de refrigeração, de forma que, a medida que a secagem prossegue, a frente de

sublimação se move para o interior do alimento congelado, promovendo a

desidratação deste (FELLOWS, 2006; REYES; MAHN; HUENULAF, 2011).

Figura 9 – Liofilizador em funcionamento com bomba de vácuo

Os fatores que controlam o tempo de secagem são descritos pela equação 1.

(1)

Onde td (s) = tempo de secagem; x (m) = espessura do alimento; ρ (Kg m-3)

= densidade total do alimento seco; M1 = teor de umidade inicial; M2 = teor de

umidade final na camada seca; λs = calor latente de sublimação; kd = condutividade

térmica da camada desidratada. Observa-se que o tempo de secagem é

proporcional ao quadrado da espessura do alimento, o que significa que ao duplicar

a espessura, o tempo de secagem irá aumentar por um fator de quatro, por isso,

recomenda-se que as camadas do produto a ser liofilizado sejam finas (FELLOWS,

2006).

Os alimentos liofilizados apresentam alta conservação das características

sensoriais, boa qualidade nutricional e retenção de 80 a 100% do aroma, uma vez

que este não é absorvido no vapor d’água produzido pela sublimação, ficando preso

na matriz do alimento (FELLOWS, 2006). Além disso, esta técnica facilita a

manutenção e o armazenamento das culturas e garante a estabilidade das

características morfológicas e bioquímicas das células estocadas (muitas de alto

valor agregado) e a não necessidade de manuseamento e estocagem do produto

em local refrigerado. Porém, uma etapa crítica da liofilização é o congelamento que

pode causar lioinjúrias celular irreversíveis, contudo, é possível fazer uso da

crioproteção para minimizar tais efeitos negativos, sendo um dos maiores desafios

da criopreservação realizar um congelamento com menores danos celulares

(AGUIAR et al., 2012).

As características físico-químicas ideais para um crioprotetor são baixo peso

molecular, alta solubilidade em água e baixa toxicidade celular. Estes podem ser

classificados em penetrantes ou intracelulares, como metanol, etilenoglicol,

propilenoglicol, dimetilformaldeído, metilacetamida, DMSO e glicerol; e

crioprotetores não penetrantes ou extracelulares, como os mono, oligo e

polissacarídeos, manitol, sorbitol, dextrana, metilcelulose, polietilenoglicol entre

outros. E, essas diferenças de permeabilidade afetam os mecanismos pelos quais

ocorre a proteção ao material biológico (LIMA, 2011; AGUIAR et al., 2012).

Os crioprotetores não penetrantes ou extracelulares induzem o aumento da

osmolaridade do meio externo, gerando a passagem da água do interior da célula

para o meio extracelular, prevenindo a formação de cristais de gelo durante o

congelamento. Portanto, são apropriados à preservação de micro-organismos por

se fixarem à superfície microbiana formando uma camada viscosa capaz de

proteger mais efetivamente suas paredes celulares e membranas. Já os

crioprotetores penetrantes ou intracelulares realizam ligações com as moléculas de

água, minimizando a formação e o tamanho dos cristais de gelo, bem como,

reduzem as concentrações de soluto tanto no meio extracelular quanto no

intracelular (HUBÁLEK, 2003).

Com isso, os agentes crioprotetores atuam prevenindo a cristalização ao

reduzir a atividade de água (COSTA, 2010). Na criomicrobiologia, o glicerol é o

principal álcool utilizado com sucesso que atua penetrando na membrana celular

através da difusão passiva. Todavia, alguns açúcares têm se mostrado capazes de

atuar como agentes crioprotetores ao promoverem alterações na permeabilidade e

na separação lateral dos componentes da membrana plasmática. A sacarose tem

sido frequentemente utilizada para a criopreservação de micro-organismos em

concentrações de 1-68% (média 10%). Outros agentes relatados são a trealose,

usada nas concentrações de 5 a 19% (média 10%), o glicerol a 10%, leite

desnatado a 10%, inositol a 10%, rafinose a 5 ou 10%, glicose de 1 a 18% (média

4%) e lactose de 1 a 10% (média 8%) (HUBÁLEK, 2003; AGUIAR et al., 2012).

Segundo Kennedy (2000), se o alimento puder ser formulado ou acrescido

com carboidratos, a temperatura de transição vítrea aumenta e, sendo este

aumento acima da temperatura de estocagem, a estabilidade e a vida de prateleira

dos produtos aumentarão. Com isso carboidratos típicos como sacarose, já citada,

a maltose, a frutose e a maltodextrina têm sido utilizados visando o aumento da

temperatura de transição vítrea.

Em estudo desenvolvido por CARVAJAL, MACDONALD e LANIERA (1999)

ficou evidenciado que a tensão superficial aumentou em soluções de

maltodextrinas 15 e 20 DE, em concentração de 8%, semelhantes à sacarose. Isto

suporta a hipótese de que os produtos de hidrólise de amido podem crioproteger

pelo mesmo mecanismo que a sacarose e o sorbitol.

3.3.1.1 Liofilização na indústria de alimentos

A atividade da água (aw) ou água livre disponível para que ocorram reações

químicas e biológicas, representa uma indicação de estabilidade alimentar em

relação ao crescimento microbiano. Com isso, vários processos industriais foram

desenvolvidos para promover a secagem de alimentos, com consequente redução

da aw e, promoção da preservação destes (OLIVEIRA; BRANDÃO; SILVA, 2016).

Os alimentos secos têm o seu peso reduzido, o que facilita o seu transporte e

armazenamento e devem apresentar como características um teor de água inferior

a 25g/100g e atividade de água abaixo de 0,6 (STEVENSON et al., 2015; DE

BRUIJN et al., 2016). Neste conceito, a liofilização tem sido empregada na indústria

de alimentos em diversos tipos de produtos.

Lilli et al. (2015) compararam a eficácia das secagens por liofilização e por

pulverização da proteína da clara do ovo fosforilada com tripolifosfato de sódio

(TPF). Os pós liofilizados foram superiores em termos de solubilidade, estabilidade

da emulsão, capacidade de retenção de água, capacidade de absorção de óleo e

água e resistência ao calor quando comparados aos pós secados por pulverização.

Os resultados na viscosidade não mostraram diferenças significativas entre

liofilizados e pulverizados. Já em termos de capacidade de formação de espuma e

estabilidade desta, os pós secos por pulverização foram melhores. No entanto, a

secagem por pulverização exigiu o tempo mais longo. Com isso, a liofilização foi

considerada o melhor método em termos de produção de pós da proteína da clara

do ovo modificados, com propriedades funcionais superiores.

A capacidade de retenção de compostos bioativos em framboesas

desidratadas por liofilização e por convecção a ar foi avaliada por Sette et al. (2017),

os resultados apontaram uma maior retenção de compostos bioativos nas amostras

submetidas a secagem por liofilização. López et al. (2016) avaliaram os efeitos de

cinco métodos de secagem diferentes: secagem por convecção, secagem a vácuo,

liofilização, secagem por radiação infravermelha e secagem solar em várias

propriedades características das bagas de murta do sul do Chile. O processo de

liofilização causou menos danos aos componentes bioativos, os flavonoides totais

permaneceram praticamente inalterados. As amostras liofilizadas apresentaram

ainda maior taxa de reidratação e a capacidade de retenção de água,

significativamente diferente das amostras dos outros métodos de secagem. A

microestrutura das amostras liofilizadas mostrou semelhança com a das bagas não

processadas, enquanto ocorreu colapso da parede celular notável durante os

demais processos de secagem.

Grãos de Kefir foram liofilizados para preservar a atividade microbiana e

prolongar a vida útil, determinando a melhor temperatura de armazenamento. Os

grãos foram liofilizados e posteriormente foram armazenados em um filme de

plástico multicamada com uma barreira de umidade durante 90 dias a temperaturas

variáveis. A atividade microbiana continuou até o 60º dia de armazenamento a 4ºC.

A análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada para determinar

o Lactobacillus Kefiranofaciens como um micro-organismo de indicação de

atividade constante. Concluiu-se que a conservação de grãos de Kefir por meio de

liofilização protege a microbiota interna incorporada, prolongando a vida útil dos

grãos (KOK-TAS, 2015).

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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Artigo 1

Efeito crioprotetor de maltodextrina e sacarose na viabilidade celular do Kefir de leite submetido à secagem por liofilização

RESUMO

Kefir é uma bebida fermentada exclusivamente por grãos de Kefir, constituída por

uma colônia de micro-organismos simbióticos imersos em uma matriz de

polissacarídeo e proteínas, que apresenta potencial probiótico. No entanto, a

instabilidade dos micro-organismos, tem levado a procedimentos de secagem,

como a liofilização, visando o aumento da estabilidade, maior flexibilidade para

consumo e manutenção da viabilidade celular. Todavia, o congelamento que

antecede a liofilização é uma etapa crítica, o que leva a necessidade de utilizar

crioprotetores para evitar a lioinjúria. Objetivou-se neste estudo desenvolver e

caracterizar físico-química e microbiologicamente Kefir de leite liofilizado, avaliando

o efeito crioprotetor de maltodextrina e sacarose na manutenção da viabilidade

celular. O processo de fermentação sem agitação, durante 24h, com a proporção

de 5% de grãos de Kefir foi realizado em leite UHT e em leite pasteurizado, as

bebidas obtidas foram analisadas em termos de pH, acidez, atividade de água,

sólidos solúveis totais, lactose, umidade, cinzas, proteínas, lipídeos e carboidratos.

O perfil microbiológico das amostras foi traçado pela contagem total de bactérias e

leveduras, isolamento e identificação dos gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium,

Acetobacter, Enterococcus e Candida. As bebidas apresentaram diferenças na

composição físico-química e microbiológica. O Kefir fermentado em leite

pasteurizado apresentou melhor composição nutricional e maior concentração

celular, sendo este submetido a liofilização. Foi realizado um planejamento fatorial

completo 22 com 4 pontos fatoriais e 3 pontos centrais, totalizando 7 ensaios. Os

efeitos crioprotetores de maltodextrina e sacarose foram avaliados pela contagem

total de bactérias e leveduras após a liofilização. Os resultados evidenciaram maior

influência da sacarose na preservação dos micro-organismos com taxa de

sobrevivência celular de bactérias de 97,71% em MRS e 96,68% em M17 e 89,63%

para leveduras. A sobrevivência das bactérias isoladas dos liofilizados, em escala

decrescente, foi de Enterococcus durans, Acetobacter spp., Bifidobacterium spp.,

Lactobacillus spp. Diante destes resultados, foi selecionado o ensaio com 10% de

sacarose e submetido à avaliação físico-química, cujos resultados demonstram boa

qualidade nutricional e viabilidade celular satisfatória com potencial efeito

probiótico.

Palavras-chaves: Alimentos Funcionais. Crioproteção. Desidratação. Probióticos.

ABSTRACT

Kefir is a drink fermented exclusive by grains of Kefir, it is constituted by a colony of

symbiotic microorganism immerses in a matrix of polysaccharides and proteins, that

presents probiotic potential. Meanwhile, the instability of the microorganism, has

conducted the dehydration procedures, as lyophilization, to intend stability

improvements, better flexibility for consumption and maintenance of cell viability.

Otherwise, the freezing process before the lyophilization is a critic phase, which

leads to the necessity to use cryoprotections to avoid the injury cell. The objective

of this study was to develop a characterized physical-chemical e microbiologically

Kefir of milk lyophilized, evaluating the effect of the cryoprotections of maltodextrin

and sucrose in the maintenance of cell viability. The process of fermentation without

agitation, among 24 hours, with the proportion of 5% grains of Kefir was realized in

UHT milk and in pasteurized milk, the drinks obtained were analyzed in pH, acidity,

activity on water, total soluble solids, lactose, moisture, ashes, proteins, lipids and

carbohydrates. The microbiological profile of the samples was made by the total

counting of bacteria and yeast, isolation and identification of the genders

Lactobacillus, Bifidobacterium, Acetobacter, Enterococcus and Candida. The drinks

presented differences in the physical-chemical composition and microbiological.

The Kefir fermented in pasteurized milk presented better nutritional composition and

higher cell concentration, when submitted to lyophilization. A complete factorial

planning was realized 22 with 4 factorial points and 3 central point, total of 7 analysis.

The cryoprotections of maltodextrin and sucrose were evaluated by the bacteria

total counting and yeast after lyophilization. The results evidenced major influence

of the sucrose in microorganism preservation with a tax of cell survival of the

bacteria of 97,71% in MRS, 96,68% in M17 and 89,63% for yeast in YGC. The

survival of the isolated bacteria of the lyophilized, in decreasing scale, was the

Enterococcus durans, Acetobacter spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. In

face of these results, the analysis selected was with 10% of sucrose and submitted

to physical-chemical evaluation, which results demonstrate good nutritional quality

and satisfactory cell viability with potential probiotic effect.

Keywords: Functional Food. Cryoprotection. Dehydration. Probiotics.

1 INTRODUÇÃO

Em busca da elaboração de produtos alimentícios que proporcionem

benefícios à saúde, a indústria de alimentos tem investido em tecnologia e

pesquisas para desenvolver produtos diferenciados pelas propriedades fisiológicas

e bioquímicas que são capazes de desempenhar no organismo humano (FRANÇA

et al., 2010). Neste contexto, destacam-se os probióticos, que através da ação de

micro-organismos vivos conferem benefícios para a saúde do hospedeiro

(FAO/WHO, 2001).

Dentre os probióticos utilizados na alimentação humana, pode-se destacar

o Kefir. Originário das montanhas do Cáucaso e considerado um dom de Deus

entre o povo muçulmano, o Kefir (derivada da palavra turca "keif", que pode ser

traduzida como bom sentimento que pode ser sentido após bebê-lo) é um produto

probiótico e benéfico para a saúde, cujo interesse de consumo tem aumentado

(LOPITZ-OTSOA; REMENTERIA; ELGUEZBAL; GARAIZAR, 2006). A bebida

láctea fermentada conhecida como Kefir, se diferencia dos leites fermentados

tradicionais (iogurte) por ser produzida, apenas, a partir de uma mistura de

leveduras e bactérias, com propriedades probióticas, conhecida como grãos de

Kefir, fermentados em leite reconstituído de vaca, ovelha, cabra integral ou

desnatado ou ainda “leites” de fonte não animal, como de coco e de soja, sucos de

fruta e/ou soluções de açúcar e melaço. Apresentando como características

sensoriais o aspecto cremoso e sabor ligeiramente ácido (KABAK; DOBSON, 2011;

MAGALHÃES et al., 2011).

Os grãos de Kefir são compostos de proteínas, lipídios e um polissacarídeo

solúvel, o complexo Kefiran, que envolve e mantém a simbiose entre leveduras e

bactérias. O Kefiran, no organismo, atua na diminuição da pressão sanguínea, na

imunomodulação, na proteção do epitélio, no aumento da atividade fagocitária dos

macrófagos peritoneais e pulmonares e aumento das células IgA nestes locais, na

atividade antitumoral, na atividade antimicrobiana e na atividade anti-inflamatória

(LIU et al., 2002; RODRIGUES et al., 2005; DUARTE et al., 2006; VINDEROLA et

al., 2006; MOREIRA et al., 2008; PIERMARIA et al., 2010; MEI et al., 2016).

Entretanto, diferentes fatores que podem afetar o comportamento de micro-

organismos e os diferentes ambientes onde os alimentos se encontram devem ser

considerados, pois podem interferir no requisito essencial onde os probióticos

necessitam atingir, o intestino. Com isso, diferentes estratégias tecnológicas que

objetivam conservar e manter a viabilidade celular dos probióticos têm sido

utilizadas, como tecnologias de secagem (SOUZA et al., 2011; PRISCO;

MURIELLO, 2016).

O processo de liofilização consiste em uma secagem por sublimação sob

vácuo, onde a água ou a substância aquosa passa da fase sólida direto para a fase

vapor, minimizando várias reações de degradação que ocorrem durante a

secagem, como a reação de Maillard, desnaturação de proteínas e reações

enzimáticas. Portanto, é considerado como o meio mais eficaz de se obter produtos

desidratados com alta qualidade sensorial e com boa viabilidade celular (ATALAR;

DERVISOGLU, 2015). Porém, uma etapa crítica da liofilização é o congelamento

que antecede o processo e pode causar lioinjúrias celulares irreversíveis. Assim,

objetivando minimizar tais efeitos indesejáveis tem sido feito uso da crioproteção

através de vários agentes, como álcoois e carboidratos (AGUIAR et al., 2012).

Portanto, objetivou-se com este estudo produzir Kefir de leite por liofilização,

a partir de um estudo avaliando a utilização de leites submetidos a diferentes

tratamentos térmicos e o efeito crioprotetor da maltodextrina e da sacarose na

viabilidade celular de micro-organismos presentes no produto desidratado.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Manipulação e manutenção dos grãos de Kefir

Os grãos de Kefir de leite foram adquiridos por doação proveniente do

laboratório de Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal de Pernambuco

– Centro Acadêmico de Vitória (CAV), localizado na Zona da Mata Sul de

Pernambuco. Os leites utilizados nesta pesquisa foram adquiridos no comércio

local. Os grãos foram inoculados em concentração de 5% (p/v) em duas bases

lácteas: leite integral UHT (Bom Leite®) e leite integral pasteurizado (Bom Leite®),

nomeadas como KA e KB, respectivamente. O desenvolvimento e obtenção das

bebidas seguiram as etapas descritas no fluxograma apresentado na figura 1.

Figura 1 – Fluxograma da metodologia para a obtenção das bebidas fermentadas a partir dos grãos de Kefir

Fonte: Adaptado de Prado et al, 2015.

As bebidas foram fermentadas no Laboratório de Processamento de

Alimentos do Departamento de Ciências Domésticas da Universidade Federal de

Pernambuco, campus sede, Recife – PE. A fermentação ocorreu sem agitação em

erlenmeyers de 500mL previamente esterilizados, sendo incubadas em estufa com

circulação e renovação de ar a 25ºC por 24h. A seguir, procedeu-se a tamisagem

em peneira, sob assepsia, onde os grãos retidos na tamisagem foram novamente

inoculados, repetindo-se as etapas acima descritas. As bebidas fermentadas

obtidas foram mantidas sob refrigeração a 6ºC em BOD (Biochemical Oxygen

Demand) para maturação, em seguida foram realizadas as etapas de

caracterização das mesmas.

Após o período de maturação, as bebidas foram analisadas quanto aos

parâmetros físico-químicos e microbiológicos, sendo a que apresentou melhores

resultados, selecionada para secagem por liofilização.

2.2 Caracterização físico-química

As análises físico-químicas foram realizadas no Laboratório de Análise

Físico-Química de Alimentos do Departamento de Ciências Domésticas da

Universidade Federal Rural de Pernambuco, campus sede, Recife – PE.

2.2.1Acidez titulável e pH

A determinação de acidez titulável foi realizada através da titulação com

solução de álcali padrão a acidez do produto, utilizando-se o indicador fenolftaleína

1% e NaOH (hidróxido de sódio) a 0,1N até se obter a coloração rósea permanente

por 30 segundos, conforme A.O.A.C (2002). Os resultados foram expressos g.100-

1 de ácido láctico.

O pH foi determinado utilizando phmetro de bancada calibrado com soluções

tampão de pH (4,0 e 7,0), conforme A.O.A.C (2002).

2.2.2 Atividade de água

A atividade de água foi determinada por meio do equipamento Aqualab

(4TE®, Washington, EUA), ao qual analisa a pressão do vapor de água do produto

sobre a pressão de vapor da água pura.

2.2.3 Determinação de açúcares redutores em lactose

Os açúcares totais e redutores das amostras foram determinados pelo

método volumétrico de Lane-Eynon (923.09) no qual se baseia na capacidade dos

glicídios, em meio fortemente alcalino e a quente, de formar enodiol, composto com

forte poder redutor, que em presença de Cu++ se oxida e reduz o cobre a Cu+, dando

origem a um precipitado vermelho tijolo de Cu2O. Para esta metodologia é utilizado

solução de ferrocianeto de potássio 15%, sulfato de zinco 30% com o objetivo de

retirar interferências como pigmentos, proteínas ao qual junto com as amostras

foram submetidas a filtragem para recolher o sobrenadante. Para a titulação foram

utilizadas Solução de Fehling A e Fehling B sob aquecimento até se obter o

desaparecimento da coloração azul e o surgimento da cor vermelho tijolo com a

formação de um precipitado. Para verificação do ponto de virada foi adicionado 4

gotas de azul de metileno 0,1 %, conforme A.O.A.C. (2002). Os resultados foram

expressos em g.100g-1.

2.2.4 Teor de umidade

A determinação de umidade foi realizada por balança de infravermelho

(MARTE – IDSO – Piracicaba/SP) a 105ºC durante 30 minutos. Os resultados foram

expressos em percentual (%).

2.2.5 Cinzas

A determinação de cinzas foi realizada pelo método termogravimétrico

935.42. Através da carbonização em temperatura baixa seguida da incineração das

amostras a temperatura de 550ºC em mufla. Seguindo-se de repetidas operações

de aquecimento e resfriamento até se atingir o peso constante, conforme A.O.A.C

(2002).

2.2.6 Sólidos Solúveis Totais (SST)

A determinação de sólidos solúveis totais através do uso de refratômetro

(Reichert® r2i300, New York. EUA) com os valores de índice de refração expresso

em ºBrix. A leitura das amostras foi realizada em temperatura ambiente.

2.2.7 Proteínas

A determinação de proteína foi realizada segundo o método clássico de

Kjeldahl (991.22) que se baseia na decomposição da matéria orgânica, por

combustão úmida através de aquecimento a 400ºC com ácido sulfúrico

concentrado, na presença de catalisador. O nitrogênio presente na solução ácida

resultante foi determinado por destilação por arraste de vapor, seguida de titulação

com ácido bórico diluído. O percentual da fração proteica foi calculado utilizando o

fator de conversão do nitrogênio para proteína de 6,38 (utilizado para produtos

lácteos) e fator de correção da solução de ácido clorídrico 0,1N, conforme A.O.A.C

(2002). Os resultados foram expressos em g.100g-1.

2.2.8 Lipídeos

A determinação de lipídeos foi realizada pelo método de Gerber, conforme

British Standards Institution (1989). O método se baseia na quebra da emulsão do

leite com ácido sulfúrico concentrado (densidade 1,820 – 1,830) e na utilização de

uma substância desemulsificante, o álcool isoamílico. A leitura do percentual de

gordura das amostras úmidas foi realizada de forma direta na escala do butirômetro

de Gerber. Os resultados foram expressos em g.100g-1.

2.2.9 Carboidratos Totais

A determinação de carboidratos totais foi calculada por diferença:

CT = 100 – (umidade + proteínas + lipídeos + cinzas)

Os resultados foram expressos em g.100g-1.

2.2.10 Valor Calórico

Os valores, expresso em kilocalorias (Kcal) foi calculado considerando os

fatores de Atwater para conversão dos macronutrientes:

1g Proteínas = 4Kcal

1g Carboidratos = 4Kcal

1g Lipídeos = 9Kcal

2.2.11 Cor

Os valores de cor no sistema CIE Lab foram mensurados por colorimetria,

em colorímetro (Konica Minolta, CR-400, Japão) operando em sistema CIELAB (L*

a* b*).

Onde:

L* = Luminosidade das bebidas;

a* = intensidades de cor vermelha ou verde das bebidas;

b* = intensidades da cor amarela ou azul das bebidas.

As aferições aconteceram em 5 locais diferentes com referência aos pontos

cardeais, totalizando toda a área da amostra e as leituras foram realizadas

utilizando o iluminante C.

2.3 Caracterização microbiológica

As análises microbiológicas foram realizadas no Laboratório de

Processamento e Análise de Alimentos do Departamento de Tecnologia Rural da

Universidade Federal Rural de Pernambuco, campus sede, Recife – PE e no

Laboratório Municipal de Saúde Pública do Recife – PE.

As bebidas desenvolvidas e os ensaios liofilizados foram submetidos a

diluições decimais seriadas em água peptonada 0,1% esterilizada. A primeira

diluição (10-1) foi realizada ao adicionar uma alíquota de 1 mL de cada bebida ou

1g do liofilizado em recipiente previamente esterilizado contendo 9 mL de água

peptonada 0,1%, seguindo-se de homogeneização. A partir desta diluição foram

realizadas diluições decimais seriadas até 10-7.

2.3.1 Contagem global e identificação de Leveduras

A partir das diluições decimais seriadas realizadas na etapa anterior, foram

retiradas alíquotas de 0,1 mL para serem semeadas na superfície do meio ágar

extrato de levedura enriquecido com glicose e adicionado de cloranfenicol (YGC)

com o auxílio da alça de Drigalski pelo método de espalhamento (Figura 2). As

placas foram incubadas invertidas, em condições de aerobiose, a 30ºC durante 72

horas, conforme metodologia adaptada de Manolopoulou et al. (2003).

A identificação foi realizada por automação com intermédio do sistema

VITEK® 2 Compact (Biomeurieux®) que se baseia na emissão do sinal colorimétrico

gerado pelas reações bioquímicas provocadas pelas leveduras em contato com os

reagentes presentes nos poços dos cartões YST YS07. As colônias foram diluídas

em 3mL de solução salina estéril 0,45% NaCl em tubo de ensaio, a turbidez da

suspensão foi ajustada de acordo com a escala 2 de McFarland por meio do

DensiChek (Biomeurieux®), e inoculadas nos poços do respectivo cartão.

Figura 2 – Plaqueamento pelo método de superfície para contagem global de leveduras

2.3.2 Contagem global e identificação de bactérias

A enumeração das células bacterianas viáveis foi realizada após diluições

seriadas (Item 2.4). O plaqueamento foi realizado através de pour plate, em meios

sólidos MRS (Man, Rogosa & Sharpe) (MERCK®) e M17 (SIGMA®) com alíquota

de 1mL de cada amostra (Figura 3). Em seguida, as placas foram incubadas

invertidas, em anaerobiose, a 37ºC durante 72 horas.

Figura 3 – Plaqueamento pelo método de pour plate para contagem global de bactérias

A identificação das bactérias foi realizada a partir das diluições decimais

seriadas descritas no item 2.4, com retiradas de alíquotas de 0,1 mL para serem

semeadas na superfície dos meios sólidos MRS e M17 modificados, contendo

0,002% de azul de bromofenol (Merck®) com o auxílio da alça de Drigalski pelo

método de espalhamento (Figura 4). Posteriormente, as placas foram incubadas,

em anaerobiose a 37ºC durante 48 horas. O azul de bromofenol é um indicador de

pH que promove o desenvolvimento de diferentes colorações nas colônias no meio

e detecta diferentes intervalos de pH de 3 (amarelo) a 5 (azul) gerados por bactérias

ácido-láticas, proporcionando uma maior diferenciação macroscópica entre elas

(LEE; LEE, 2008).

Figura 4 – Plaqueamento em meios modificados para isolamento de bactérias

Todas as colônias foram diferenciadas de acordo com o tempo de

crescimento, coloração, morfologia e tamanho. A coloração de Gram foi realizada

para verificar a forma celular, tamanho e características tintoriais. De acordo com

as características morfológicas de cada grupo bacteriano foram realizados testes

específicos conforme ilustra a figura 5.

Figura 5 – Desenho esquemático da identificação das bactérias

BGP: Bacilos Gram Positivos; CGP: Cocos Gram Positivos

Os Cocos Gram Positivos (CGP) foram submetidos ao teste para a presença

de catalase. As cepas com teste negativo foram identificadas por automação com

o uso do sistema VITEK® 2 Compact (Biomeurieux®) que se baseia na emissão do

sinal colorimétrico gerado pelas reações bioquímicas provocadas pelas bactérias

em contato com os reagentes presentes nos poços dos cartões AST 285. As

colônias foram diluídas em 3mL de solução salina estéril 0,45% NaCl em tudo de

ensaio, a turbidez da suspensão foi ajustada de acordo com a escala 0,5 de

McFarland determinada por meio do DensiChek (Biomeurieux®), e inoculadas nos

poços do repectivo cartão.

Isolados que apresentaram características microscópicas Gram variável, em

forma pleomórfica (esférica, alongada ou curvada) e produtoras da enzima catalase

foram inoculadas em tubos de ensaio contendo caldo GEY - glicose (2%), etanol

(5%) e extrato de levedura (1%) com pH do meio ajustado para 4,5. Os inóculos

foram incubados a 30ºC em aerobiose por 3-5 dias para se obter o crescimento

adequado verificado pela formação de uma película, através do qual foi observada

uma turbidez uniforme do meio e um depósito celular. Após o período de incubação,

uma alíquota de 10µL da cultura foi semeada em GEY-ágar contendo 0,3% de

CaCO3 (p/v). Bactérias do gênero Acetobacter spp. no meio GEY-ágar produzem

ácido acético a partir de etanol, promovendo a dissolução do carbonato de cálcio

em torno das colônias e ocasionando a formação de uma zona clara ao redor destas

(KOMMANEE et al., 2008).

Os Bacilos Gram Positivos (BGP) foram submetidos aos testes para a

presença de catalase e de citocromo oxidase (apenas para as colônias suspeitas

de pertencerem ao gênero Lactobacillus).

2.4 Delineamento experimental da obtenção da bebida liofilizada

Para obtenção da bebida liofilizada foi realizado um planejamento fatorial 22,

com 4 pontos fatoriais (níveis + 1) e 3 pontos centrais (nível 0), totalizando 7

ensaios. As variáveis independentes foram: Maltodextrina (%) e Sacarose (%),

conforme tabela 1. As variáveis dependentes foram: Contagem de Bactérias em

meio de cultura MRS (log UFC/g), Contagem de Bactérias em meio de cultura em

M17 (log UFC/g) e Contagem de Leveduras em meio de cultura YGC (log UFC/g).

Os dados obtidos foram ajustados ao seguinte polinômio:

MSSMtCTY 12210),,( (1)

Em que βn são os coeficientes de regressão, y é a resposta em questão

(contagens de bactérias nos meios MRS e M17 e leveduras no meio YGC) e M e S

são as variáveis independentes (Maltodextrina e Sacarose, respectivamente).

Tabela 1 – Níveis codificados e decodificados das variáveis independentes

Variáveis -1 0 1

Maltodextrina (%) 0 4 8 Sacarose (%) 0 5 10

Todas as etapas da liofilização foram realizadas no campus de Vitória de

Santo Antão da Universidade Federal de Pernambuco. O manuseio das bebidas

para adição dos crioprotetores foi realizado no Laboratório de Microbiologia de

Alimentos. Os 7 ensaios foram congelados em ultra freezer a –80ºC em overnight,

no Laboratório de Tecnologia de Biomateriais. Subsequentemente, foram

submetidas ao processo de liofilização (SP Scientific Sentry 2.0) a uma temperatura

de –50ºC e vácuo de 100mT no Laboratório de Tecnologia de Alimentos. A

estocagem dos pós liofilizados foi realizada em frascos de penicilina de vidro

estéreis e hermeticamente fechados sob refrigeração.

A sobrevivência dos micro-organismos foi determinada por meio da

contagem de células viáveis após a reidratação dos pós em água peptonada 0,1%

esterilizada, conforme ilustrado nas figuras 2 e 3. O cálculo para determinação da

taxa de sobrevivência foi realizado pela Equação 2:

(2)

Onde No e N representam o número de micro-organismos antes (Kefir) e

após a secagem (Kefir liofilizado), respectivamente.

O ensaio do planejamento que apresentou melhor resposta quanto as

variáveis dependentes foi submetido a caracterização físico-química (pH, acidez,

atividade de água, umidade, açúcares redutores em lactose, proteínas, e

carboidratos, conforme descritos no item 2.2. Os resultados das análises de

lipídeos e cor foram processados em fórmulas para melhor expressar tais

parâmetros.

A análise de lipídeos foi realizada pelo método de Gerber, conforme British

Standards Institution (1989). O teor lipídico do pó lifolizado foi obtido através da

equação:

% de Lipídeos = L x 11,33 / m (3)

Onde L = leitura no butirômetro; 11,33 = massa em gramas de 11mL da

amostra fluida usada nos butirômetros para leite; m = massa da amostra, em

gramas.

A análise de cor foi realizada no sistema CIE Lab foram mensurados por

colorimetria, em colorímetro (Konica Minolta, CR-400, Japão) operando em sistema

CIELAB (L* a* b*). A diferença de cor foi calculada por meio da média da cor (ΔE*)

entre bebidas fermentadas por grãos de Kefir antes e após a secagem por

liofilização, segundo a equação:

ΔE* = [(L*-L0)2 + (a*-a0*)2 + ((b*-b0*)2]1/2 (4)

Onde:

ΔE* = diferença de cor

L0* e L* = Luminosidades das bebidas antes e após a secagem por

liofilização, respectivamente;

a0* e a* = intensidades de cor vermelha ou verde das bebidas antes e após

a secagem por liofilização, respectivamente;

b0* e b* = intensidades da cor amarela ou azul das bebidas antes e após a

secagem por liofilização, respectivamente.

As aferições aconteceram em 5 locais diferentes com referência aos pontos

cardeais, totalizando toda a área da amostra e as leituras foram realizadas

utilizando o iluminante C.

2.5 Análise estatística

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as

médias comparadas pelo teste de Duncan (p < 0,05) para comparação entre as

médias, através do software estatístico Statistica for Windows 6.0 (STATSOFT,

1997).

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Composição físico-química de Kefir de leite integral pasteurizado e Kefir de

leite integral UHT

A composição físico-química das bebidas produzidas com leite pasteurizado

e leite UHT fermentados com concentração de 5% de grãos de Kefir durante 24h

estão descritos na tabela 2.

Tabela 2 – Composição físico-química de Kefir elaborado com leite pasteurizado (KA) e UHT (KB).

Análises Bebidas

KA KB

pH 3,68±0,015b 3,76±0,015a

Acidez (g.100g-1 de Ác. Láctico) 0,965±0,025a 0,936±0,025a

Sólidos Solúveis Totais (%) 6,6±0,0a 6,6±0,0a

Lactose (g.100g-1) 3,11±0,010b 3,38±0,020a

Aw 0,9903±0,0005a 0,9887±0,0002b

Cor

L* 86,52±0,88a 87,92±0,11a

a* -2,870±0,106a -1,950±0,062b

b* 5,48±0,43b 8,91±0,12a

Médias com letras iguais na horizontal não diferem significativamente ao nível de 5% pelo teste “t” de student;

KA = Kefir fermentado em leite integral pasteurizado; KB = Kefir fermentado em leite integral UHT

As duas amostras diferiram estatisticamente entre si quanto ao pH (p<0,05),

com valores mais baixos para KA, e ambos dados foram inferiores ao pH típico do

Kefir que varia entre 4,0 e 4,4 (IRIGOYEN; ARANA; CASTIELLA; TORRE; IBÁÑEZ,

2005). Isto pode ser esclarecido pela acidificação decorrente do aumento dos ciclos

fermentativos e consequente liberação dos ácidos advindos do metabolismo das

bactérias e leveduras que se tornam cada vez mais ativas durante o bioprocesso

(WANG et al., 2016). De forma semelhante, Fiorda et al. (2016) em estudo que

acompanhou as mudanças de pH do tempo 0 até 48h de fermentação verificaram

um decréscimo deste ao longo do processo, atingindo valores abaixo de 4,0 em

24h, mas diferentemente KöK-Taş et al. (2013) obtiveram pH de 4,47 após 22h de

fermentação possivelmente devido a menor concentração dos grãos de Kefir de

2%.

Quanto ao teor de ácido láctico, encontrado nas duas amostras, os dados

não diferiram significativamente entre si (p>0,05). Os valores encontrados

corroboram com a legislação brasileira vigente que preconiza um percentual menor

que 1% para leite fermentado com grãos de Kefir (BRASIL, 2007). Kavas (2015)

encontrou valor mais baixo para ácido láctico (0,81%) em leite de vaca fermentado

com 2,5% de grãos de Kefir, já no leite de camelo fermentado com 5% de grãos de

Kefir o teor de ácido lático foi maior (0,92%), semelhante a este estudo,

evidenciando que maiores concentrações de grãos de Kefir tendem a elevar a

quantidade de ácido láctico, acidificando a base láctea na qual foi inoculado.

Quanto ao teor de lactose, houve diferença significativa (p<0,05) nos

resultados encontrados, com menor teor na amostra KA. O valor obtido na análise

de KB assemelha-se ao encontrado por Ohlsson et al. (2017) que obtiveram 3,36%

em Kefir de leite integral, cujos valores foram inferiores aos encontrados por

Kucerová et al (2017) em leite (4,6%) e em iogurte (3,9%), comprovando a ação da

β-galactosidase, naturalmente presente nos grãos de Kefir, sobre a lactose,

reduzindo-a a valores toleráveis por pessoas com diagnóstico de intolerância a

lactose (AHMED et al., 2013).

Segundo Tronco (2010) o leite e grande parte de seus produtos lácteos é

formado predominantemente de água, com percentual de cerca de 87,3%, o que

representa valores elevados para atividade de água. No presente estudo, este

parâmetro, mostrou diferença significativa (p<0,05) entre as duas amostras, com

valores de 0,9903 em KA e 0,9887 em KB, próximos aos encontrados por Tavares

et al. (2011) que obtiveram média de 0,98% de água livre em Kefir.

Os sólidos solúveis totais (SST) presentes nas duas amostras não diferiram

estatisticamente entre si (p>0,05), com média de 6,6ºBrix. Os baixos valores

corroboram com a formulação das bebidas desenvolvidas que não receberam

adição de solutos. Ademais a fermentação do leite pelos micro-organismos propicia

menores valores de sólidos solúveis, conforme verificado por Fernandes et al.

(2017) ao analisar os SST em leite de soja não fermentado obtendo valores de 4,4

a 4,8ºBrix, enquanto que no leite de soja fermentado por Kefir encontrou uma

redução acentuada nos sólidos, chegando a níveis de 1,23 a 1,27ºBrix. A correlação

da fermentação e decréscimo dos SST também foi elucidada por Corona et al.

(2016) em estudo de sucos de cenoura, erva-doce, melão, cebola, morango e

tomate fermentados por Kefir, com valores de 3,38; 1,87; 3,83; 9,17; 2,47 e

1,97ºBrix, respectivamente, a medida que os mesmos sucos não fermentados

reportaram valores de 8,15; 4,45; 10,05; 9,95; 5,95 e 4,45ºBrix.

A análise de cor é de grande importância nos alimentos, uma vez que está

intimamente relacionada com a qualidade do produto analisado. O parâmetro L*

que indica luminosidade não apresentou diferença significativa (p>0,05) entre as

duas amostras, nas quais foram encontrados valores mais próximos de 100

(branco), justificado pelo uso de leite como base láctea. Entretanto, as amostras

diferiram estatisticamente entre si (p<0,05) nos valores de a* e b*. Ambas

apresentaram valores negativos para a* que corroboram com a ausência da

coloração vermelha e pouca incidência de verde, com valores mais negativos na

bebida KA. Os valores do parâmetro de cromaticidade b* apresentaram-se positivos

nas duas bebidas, devido a uma tendência para o amarelo justificada pela

integridade do teor de lipídeos das duas bases lácteas utilizadas. Todos os

parâmetros de cor (L*, a*, b*) corroboram com os encontrados por Ribeiro (2015),

em análises de Kefir de leite integral, com valores elevados de L*, negativos para

a* e positivos para b*.

3.2 Composição centesimal de Kefir de leite integral pasteurizado e Kefir de leite

integral UHT

Os valores relativos a composição centesimal (umidade, calorias, proteínas,

lipídeos, carboidratos e cinzas) das bebidas produzidas com leite pasteurizado e

leite UHT fermentadas com grãos de Kefir estão descritos na tabela 3.

Tabela 3 – Composição centesimal de Kefir elaborado com leite pasteurizado (KA) e UHT (KB).

Análises Bebidas

KA KB

Umidade (%) 88,41±0,40a 88,47±0,16a

Proteína (g.100g-1) 2,60±0,17a 2,83±0,11a

Lipídeos (g.100g-1) 2,80±0,10a 2,03±0,06b

Carboidratos (g.100g-1) 5,67±0,19a 5,99±0,13a

Cinzas (g.100g-1) 0,52±0,03b 0,68±0,06a

Calorias (Kcal.100g-1) 58,28±2,10a 53,55±1,00b

Médias com letras iguais na horizontal não diferem significativamente ao nível de 5% pelo teste “t” de student

Na composição centesimal, as bebidas não diferiram significativamente

(p>0,05) entre si quanto à umidade, proteínas e carboidratos, com valores médios

de 88,44%, 2,72g/100g e 5,83g/100g, respectivamente. O percentual de umidade

encontrado nas bebidas foi semelhante ao encontrado por Ribeiro (2015) que

constatou teores de 88,56 a 89,41% em amostras de Kefir oriundos da região

Noroeste do Rio Grande do Sul. Os valores de proteína revelaram um teor

ligeiramente abaixo do preconizado pela legislação brasileira vigente que

determina o mínimo de 2,9% (BRASIL, 2007). Os teores de carboidratos foram

inferiores aos encontrados por Carneiro (2010) que obteve 8,12g/100g em Kefir de

leite. Menores valores protéicos e de glicídeos estão relacionados a altas taxas de

crescimento de bactérias ácido lácticas, tendo em vista que estas para se

desenvolverem exigem nutrientes complexos como os aminoácidos e peptídeos,

além de promoverem a metabolização de carboidratos (ABDEL-RAHMAN et al.

2013).

Os valores encontrados para lipídeos diferiram significativamente (p<0,05)

entre as bebidas (KA e KB), com valores 2,80g e 2,03g, respectivamente, sendo

inferiores ao preconizado pela legislação brasileira vigente para Kefir em leite

integral que recomenda teores entre 3,00 e 5,9% (BRASIL, 2007). Em

contrapartida, a FAO/WHO (2003) traz uma maior abrangência para o parâmetro

lipídeos em Kefir, com percentual <10%, independente se a base láctea utilizada

na fermentação é integral, desnatada ou parcialmente desnatada. Em 2011,

Magalhães et al., avaliaram o Kefir brasileiro e evidenciaram que o mesmo continha

2,34% de gordura após 24h de fermentação, resultado semelhante ao encontrado

no presente estudo com mesmo tempo de fermentação.

Os teores de cinzas das bebidas analisadas diferiram significativamente

entre si (p<0,05), com maior teor para KB com 0,68%, semelhante ao encontrado

por Ribeiro (2015) que obteve 0,71% de cinzas em Kefir. O valor calórico diferiu

significativamente (p<0,05) entre as duas bebidas, sendo maior para KA

(58,28Kcal) em detrimento de KB (53,55Kcal). A maior quantidade de calorias em

KA é consequência do maior percentual lipídico encontrado na amostra. Entretanto,

Carneiro (2010) encontrou 70,56Kcal para Kefir de leite, sendo superior aos

achados neste estudo.

3.3 Concentração celular de bactérias e leveduras em Kefir de leite integral

pasteurizado e Kefir de leite integral UHT

Os resultados quanto a contagem microbiológica de bactérias e leveduras

nas bebidas analisadas estão descritos na tabela 4. A composição microbiológica

natural do Kefir, evidencia maior presença de bactérias que leveduras o que

corrobora com os resultados encontrados, cujos valores, para ambos tipos de

micro-organismos, estão de acordo com a legislação vigente que preconiza o

mínimo de 4 Log UFC/g para leveduras e 7 Log UFC/g para bactérias (BRASIL,

2007). Atalar et al. (2015) encontraram resultados inferiores para leveduras, entre

4,54-5,89 Log UFC/mL. As contagens de leveduras do presente estudo são

semelhantes aos descritos por Guzel-Seydim et al. (2005) que obtiveram 6,16 Log

UFC/mL. As leveduras foram identificadas por automação com 99% de

sensibilidade para Candida krusei, cuja espécie foi encontrada por Witthuhn et al.

(2005) compondo a microbiota do Kefir. Pedersen et al. (2012) isolaram C. krusei

de cereal fermentado da África e avaliaram seu potencial probiótico, o que foi

comprovado pela avaliação da sobrevivência em sais biliares, baixo pH,

crescimento em células epiteliais e resistência transepitelial.

Quanto a contagem de bactérias, os resultados encontrados corroboram

com Garofalo et al. (2015) que analisaram Kefir de diferentes regiões da Itália e

obtiveram concentrações celulares de bactérias variando de 7,38 a 9,04 Log UFC/g

em MRS.

Tabela 4 – Concentração celular total de bactérias e leveduras em Kefir elaborado com leite pasteurizado (KA) e UHT (KB).

Micro-organismo Meios de culturas

Bebidas

KA (Log UFC/g)

KB (Log UFC/g)

Bactérias MRS 7,41±0,07Ba 7,16±0,02Bb

M17 9,485±0,007Aa 9,447±0,003Ab Leveduras YGC 6,46±0,08a 6,29±0,09a

abc Médias com letras iguais na horizontal não diferem significativamente (p<0,05) pelo teste “t” de student; ABC Medias seguidas de letras iguais na vertical não diferem significativamente pelo teste de Duncan (p<0,05)

As interações entre bactérias e leveduras em Kefir são complexas e ainda

não foram totalmente elucidadas. Sabe-se que através desta interação pode

ocorrer estímulo ou inibição de uma ou ambas, uma vez que há competição por

nutrientes que favorecem o crescimento e, também, há produção de metabólitos

que podem inibir ou estimular umas em detrimento das outras (LOPITZ-OTZOA et

al., 2006). Entretanto, quando as bactérias do Kefir são separadas das leveduras,

não há um crescimento eficiente, evidenciando a importância da interação e da

união destas (PRADO et al., 2015).

Prado et al. (2015) evidenciaram que a composição microbiológica do Kefir

é influenciada pela origem do grão, tempo e condição de fermentação, temperatura,

tipo do leite, concentração de grãos inoculados, entre outros fatores. No presente

estudo, as bebidas elaboradas variaram apenas quanto aos tratamentos térmicos

dos leites utilizados, o que não demonstrou diferença significativa na concentração

de leveduras nos produtos finais. Em contrapartida, foi suficiente para diferir

significativamente quanto a concentração celular de bactérias, com maior

predominância na bebida com leite pasteurizado (KA).

Os resultados encontrados evidenciam que o leite submetido à

pasteurização, tratamento térmico brando, propiciou um ambiente mais favorável

para o desenvolvimento bacteriano quando comparado ao leite tratado em

temperatura ultra elevada (UHT). Pestana et al. (2015) avaliaram o efeito da

pasteurização e do processamento UHT na composição físico-química e no perfil

de ácido graxos em leite bovino, cujos resultados não evidenciaram alteração

substancial na composição físico-química e no perfil de ácidos graxos dos leites.

Sabe-se, que o tratamento térmico em temperaturas mais elevadas provoca

desnaturação de proteínas, acúmulo de reação não-enzimática (reações de

Maillard) e inicia processos oxidativos que deterioram a qualidade dos produtos

UHT durante o armazenamento, podendo resultar em redução da qualidade

(JANSSON et al., 2014; JIANG et al., 2017). O leite UHT demonstrou ser menos

favorável para o desenvolvimento de bactérias, o que corrobora com a diferença da

concentração celular encontrada nas duas bebidas desenvolvidas (Tabela 4).

Além disso, a contagem celular de bactérias em meio sólido M17 foi

consideravelmente mais elevada do que em meio sólido MRS, com diferença

significativa de 2 ciclos logarítmicos nas duas amostras. A composição dos dois

meios utilizados (Anexo A) para contagem de bactérias apresenta particularidades

que influenciaram na taxa de crescimento bacteriano.

As fontes de nitrogênio, vitaminas do complexo B e íons essenciais para o

crescimento de micro-organismos não apresentam grandes diferenças, uma vez

que os dois meios são compostos por caseína hidrolisada, extratos de carne e

leveduras e magnésio. As diferenças entre os dois meios de culturas estão na fonte

de carbono. O MRS contém citrato, acetato e Tween 80, que não são encontrados

no M17. O Tween 80 não configura como uma fonte primordial que implicaria em

uma deficiência do M17, uma vez que este só passa a ser consumido após a

utilização de outros fatores de crescimento, sobretudo quando o meio é rico em

proteínas (AL-NASERI et al., 2013), como é o caso do M17 que além da caseína,

dispõe de peptona de carne e de soja não encontradas no MRS.

Ademais, os dois meios contêm sais que disponibilizam fosfato para os

micro-organismos, sendo que o sal β-glicerofosfato dissódico pentahidratado do

M17 aumenta a estabilidade do meio sendo compatível com o cálcio, exercendo

importante papel na adsorção de íons metálicos e impede a cristalização de sais,

desta forma oferece maior flexibilidade em atender as necessidades de fosfato sem

alterar o uso de outros eletrólitos (DING et al., 2015).

A maior fonte de carboidrato do MRS é a glicose que já se encontra na

composição do próprio meio e sofre ação do calor na autoclavagem,

desencadeando a reação química, não-enzimática, conhecida como reação de

Maillard (JIANG et al., 2017), evidenciada pelo escurecimento do meio após

esterilização. Em contrapartida, a fonte de carbono do M17 é a lactose adicionada

após autoclavagem o que minimiza perdas e reações indesejadas no aquecimento

durante a esterilização. Portanto, os nutrientes que compõem o M17 encontram-se

mais biodisponíveis no meio pronto o que propicia uma maior taxa de crescimento

de micro-organismos quando comparado ao MRS.

3.4 Isolamento de bactérias

As duas bebidas apresentaram diversidade bacteriana semelhante,

diferindo, apenas, em um tipo de Lactobacillus spp que não foi isolado na bebida

KB. Todos os isolados se encontravam em maior concentração em KA, com

exceção do gênero Acetobacter spp que apresentou maior contagem em KB, o que

pode ser justificado pela menor concentração e diversidade celular em KB e

consequente menor competição por nutrientes (Tabela 5)

Tabela 5 – Bactérias isoladas de Kefir elaborado com leite pasteurizado (KA) e UHT (KB).

abc Médias seguidas de letras iguais na horizontal , no mesmo meio de cultura e microrganismo não diferem significativamente (p>0,05) pelo teste “t” de Student; ABC Médias seguidas de letras iguais na vertical no mesmo microorganismos entre os meios de cultura não diferem significativamente (p>0,05) pelo “t” de Student. *Sugestivo de Lactobacillus spp.; **Sugestivo de Bifidobacterium spp.; ***Meios de cultura com adição de 0,002% de azul de bromofenol.

Houve diferença significativa (p<0,05) na contagem dos isolados por tipo de

meio de cultura, com valores maiores no meio M17, com exceção do sugestivo de

Identificação Meios de cultura***

Bebidas

KA KB

(Log UFC/g) (Log UFC/g)

Enterococcus durans MRS 4,39±0,13Ba 4,24±0,34Ba M17 5,23±0,04Aa 5,06±0,03Ab

Bifidobacterium spp**

MRS 5,15±0,21Aa 4,54±0,34Ab M17 5,15±0,21Aa 4,15±0,21Ab

Lactobacillus spp *1 MRS 8,41±0,02Aa 6,65±0,02Ab M17 4,65±0,07Ba 4,54±0,08Ba

Acetobacter spp MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 7,77±0,01Ab 8,55±0,00Aa

Lactobacillus spp *2 MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 6,37±0,06Aa 6,30±0,07Aa

Lactobacillus spp *3 MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Aa

M17 6,00±0,03Aa 0,00±0,00Ab

Lactobacillus spp 1, cuja maior concentração foi evidenciada no MRS nas duas

bebidas. Os resultados evidenciam que os meios sólidos M17 e MRS não foram

seletivos, tendo em vista que em ambos foram isolados Enterococcus durans,

Bifidobacterium spp e Lactobacillus spp, com exceção do sugestivo de

Lactobacillus spp 3, isolado apenas na bebida KA e no meio M17, e Acetobacter

spp que não foi isolado no MRS, mas foi isolado no M17, mesmo este não sendo

um meio específico para este gênero, nos dois tipos de Kefir.

Acetobacter spp, por ser mais fastidioso, para crescer em placas junto com

outros micro-organismos, necessitou de uma exigência maior por nutrientes,

portanto, pelos fatores já discutidos anteriormente acerca do M17 quanto a

biodisponibilidade de nutrientes, o ambiente criado neste meio de cultura, foi mais

favorável para que o Acetobacter spp. encontrasse condições para se desenvolver.

Além disso, a presença de β-glicerofosfato dissódico pentahidratado no M17, por

este ser um derivado fosfórico do glicerol, constitui uma das melhores fontes de

carbono para Acetobacter spp. (SANTOS JÚNIOR, 2009), respaldando o

crescimento no M17 e o não crescimento no MRS. A confirmação da identificação

do Acetobacter spp., em meio específico, está ilustrada na figura 6.

Figura 6 – Crescimento de Acetobacter spp. em caldo GEY e GEY-Ágar

A: Caldo GEY sem inóculo (controle); B: Caldo GEY inoculado com Acetobacter spp.; C: Crescimento das colônias de Acetobacter spp. inoculado na superfície do meio sólido GEY e a presença de um halo em torno do inóculo.

O crescimento de Acetobacter spp. em caldo GEY foi caracterizado pelo

surgimento de uma película que gerou uma turbidez uniforme e um depósito celular

(6B) e, em meio GEY sólido adicionado de CaCo3, o Acetobacter spp. formou ácido

acético a partir de etanol, provocando a dissolução do carbonato de cálcio em torno

das colônias e consequente formação de uma zona clara (Figura 6C) ao redor

destas.

O gênero Enterococcus faz parte do grande grupo de bactérias do ácido

láctico, entretanto é pouco estudada para fins probióticos e seu isolamento em Kefir

não é comum. Garofalo et al. (2015), isolaram e identificaram Enterococcus durans

de grãos de Kefir de três regiões distintas da Itália. No presente estudo

Enterococcus durans foi identificado nas duas bebidas de Kefir desenvolvidas,

sendo confirmadas por automação com 99% de sensibilidade. Os potenciais efeitos

probióticos desta espécie foram estudas por Pieniz (2013) que ao analisar E.

durans verificou que este é resistente ao trato gastrointestinal, e possui capacidade

de exercer atividade antimicrobiana e antioxidante, apresentando-se como uma

estirpe probiótica promissora.

Bifidobacterium, juntamente com os Lactobacillus, formam os gêneros mais

estudados e empregados por seus efeitos probióticos. Porém o gênero

Bifidobacterium é nutricionalmente exigente, o que torna difícil o seu crescimento e

isolamento em Kefir, que apresenta uma composição microbiológica diversificada

gerando um ambiente de intensa competição por nutrientes. Leite et al. (2012) ao

analisarem o perfil microbiológico dos grãos de Kefir brasileiro isolaram o gênero

Bifidobacterium, enquanto em outro estudo desenvolvido por Kök-Taş et al. (2012)

Bifidobacterium bifidum foi isolado do grão de Kefir turco, entretanto a literatura não

relata o isolamento deste gênero na bebida. Salienta-se que o isolamento do

gênero Bifidibacterium spp. foi verificado duas formulações de Kefir desenvolvidas,

com maior concentração no Kefir fermentado em leite pasteurizado (Tabela 5).

O não isolamento do gênero Lactococcus, que é frequentemente encontrado

em Kefir, cujo meio de referência utilizado em sua identificação é o M17 (GEMELAS

et al., 2013) pode ter ocorrido devido a acentuada acidez das bebidas (Tabela 1) e

consequente aumento de ácido láctico, uma vez que este micro-organismo é

sensível a valores baixos de pH e consequente maior concentração de ácido láctico

na forma não dissociada (HANSEN et al., 2016).

De modo geral, as bebidas fermentadas apresentaram diferenças entre si,

tanto na composição físico-química quanto na microbiológica. O tratamento térmico

ao qual o leite foi submetido influenciou nesta composição, a ponto de propiciar o

favorecimento de uma maior atuação das enzimas e micro-organismos do Kefir, na

bebida desenvolvida em leite pasteurizado. Com isso, a bebida KA apresentou

menor teor de lactose, fruto da maior ação da β-galactosidase na degradação da

lactose em galactose e glicose. Esta última, ao sofrer ação das bactérias, presentes

em maior quantidade em KA, foi convertida em ácido láctico, o que justifica o maior

teor deste e consequente menor valor de pH na bebida KA em detrimento de KB.

Neste contexto, por apresentar maior concentração celular, otimização de

custo para produção em escala industrial e melhores parâmetros químicos,

inclusive menores valores de lactose, a bebida fermentada em leite pasteurizado

(KA) foi selecionada e submetida a liofilização.

3.5 Efeito dos crioprotetores na manutenção dos micro-organismos do Kefir

Na tabela 6 estão apresentadas as concentrações celulares de bactérias em

meio de cultura MRS e M17 e das leveduras em meio de cultura YGC de Kefir de

leite integral pasteurizado, submetido a secagem por liofilização, dos 07 ensaios

gerados pelo Planejamento Fatorial 22.

Os resultados evidenciaram que os ensaios KAL1 e KAL2 apresentaram

melhores respostas, não apresentando diferença significativa (p>0,05) na

concentração celular de bactérias no mesmo meio, porém houve diferença

significativa na contagem de leveduras, com melhor resultado obtido no ensaio

KAL2 com 10% de sacarose. O ensaio KAL3 com 8% de maltodextrina foi o que

apresentou resposta menos satisfatória na viabilidade celular de bactérias e

leveduras. Se compararmos os ensaios KAL1 com KAL3 e KAL2 com KAL4 verifica-

se que o percentual de maltodextrina foi constante e o de sacarose diminuiu

ocasionando uma queda significativa na contagem de bactérias e leveduras.

Tabela 6 – Contagens de bactérias nos meios sólidos MRS e M17 e de leveduras em meio sólido YGC de ensaios de Kefir de leite pasteurizado liofilizado gerados

por um planejamento fatorial 22.

Ensaios Maltodextrina (%)

Sacarose (%)

Bactérias em MRS

(log UFC/g)

Bactérias em M17 (log

UFC/g)

Leveduras em YGC

(log UFC/g)

KAL1 8 10 7,10±0,03Ab 9,20±0,01Aa 5,40±0,08B

KAL2 0 10 7,24±0,13Ab 9,17±0,03Aa 5,79±0,08A

KAL3 8 0 5,08±0,16Db 7,36±0,01Ca 4,69±0,06D

KAL4 0 0 5,83±0,03Cb 7,27±0,14Ca 4,33±0,08E

KAL5 4 5 6,31±0,01Bb 8,25±0,02Ba 5,05±0,03C

KAL6 4 5 6,36±0,13Bb 8,23±0,03Ba 5,07±0,06C

KAL7 4 5 6,33±0,16Bb 8,24±0,01Ba 5,04±0,03C

abc Médias seguidas de letras iguais na horizontal entre as culturas empregadas para bacterias não diferem (p>0,05) pelo teste “t” de Student; ABC Médias seguidas de letras iguais na vertical não diferem significativamente (p>0,05) pelo teste de Duncan; KAL1: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 1; KAL2: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 2; KAL3: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 3; KAL4: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 4; KAL5: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 5; KAL6: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 6; KAL7: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 7.

O teste de significância do modelo de regressão, os coeficientes do modelo

individual e a falta de ajuste foram realizados por ANOVA. Os resultados da ANOVA

e a falta de testes de ajuste são mostrados na Tabela 7. Os resultados mostraram

que os modelos desenvolvidos foram significativos e que não houve falta de ajuste

em nenhuma das equações (p > 0,05). Isso significa que os modelos são

adequados para representar a relação entre respostas e fatores.

95

Tabela 7 – Análise de variancia (ANOVA) para os resultados do planejamento fatorial 22 de Kefir de leite pasteurizado liofilizado.

Fontes de

variação

Grau de Liberdade

(GL)

Contagem de Bactérias em MRS

Contagem Bactérias em M17

Contagem de Leveduras em YGC

SQ MQ p SQ MQ p SQ MQ p

M (L) 1 0,198 0,198 0,003 0,004 0,004 0,027 0,0002 0,0002 0,430

S (L) 1 2,941 2,941 0,0002 3,497 3,497 0,00003 1,1772 1,1772 0,0002

M x S 1 0,093 0,093 0,007 0,001 0,001 0,095 0,1406 0,1406 0,0016

Falta de ajuste

1 0,0007 0,0007 0,392 0,0002 0,0002 0,321 0,000001 0,000001 0,950

Erro Puro 2 0,0013 0,00065 0,0002 0,0001 0,000467 0,000233

Total 6 3,234 3,5024 1,318468 M: Maltodextrina; S: Sacarose; L: Linear; SQ: Soma Quadrática; MQ: Media Quadrática

96

O uso de crioprotetores, é um parâmetro importante no processo de

secagem de micro-organismos para minimizar efeitos negativos como formação de

cristais de gelo no interior das células durante o congelamento e evitar lioinjúrias

irreversíveis (AGUIAR et al., 2012). Os crioprotetores avaliados no presente estudo

foram a maltodextrina (0-8%) e a sacarose (0-10%) isolados ou associados. Os

efeitos lineares da sacarose foram estatisticamente eficazes (p<0,05) na taxa de

sobrevivência celular de bactérias e leveduras, entretanto os efeitos lineares de

maltodextrina apresentaram-se eficazes somente na sobrevivência de bactérias.

Os efeitos lineares da sacarose associada a maltodextrina foram estatisticamente

eficazes para bactérias em MRS e leveduras em YGC, porém não mostrou eficácia

na sobrevivência de bactérias em M17 (Tabela 7).

Os dados do planejamento foram bem ajustados a equação linear proposta,

com coeficiente de determinação (R2) próximo de 1 (Tabela 8). Também é possível

observar que quanto maior o percentual de sacarose, maior a concentração celular

de bactérias e leveduras, enquanto que a associação da maltodextrina a sacarose

não influencia na concentração de bactérias, na mesma forma, o percentual de

maltodextrina isolada não tem representação significativa na concentração de

leveduras.

Tabela 8 – Efeito das variáveis independentes sobre as variáveis dependentes (contagem de bactérias nos meios sólidos MRS e M17 e contagem de leveduras em meio sólido YGC em log UFC/g) de Kefir de leite pasteurizado liofilizado

Bactérias em MRS

(log UFC/g) Bactérias em M17

(log UFC/g) Leveduras em

YGC (log UFC/g)

Média 6,32 8,25 5,05

1 -0,44 0,06 NS

2 1,71 1,87 1,08

1x2 0,30 NS -0,37

R2 0,999 0,999 0,999

1: Maltodextrina (%); 2: Sacarose (%); R2: coeficiente de determinação; NS: não significativo (p>0,05)

3.6 Taxa de sobrevivência de micro-organismos em Kefir liofilizado

3.6.1 Taxa de sobrevivência de bactérias em MRS

A contagem média total de bactérias em meio de cultura sólido MRS na

bebida Kefir in natura foi de 7,41 Log UFC/g (Tabela 4). Após a secagem a taxa de

97

sobrevivência máxima de bactérias em MRS foi de 7,24 Log UFC/g em ensaio

utilizando 10% de sacarose como crioprotetor (Tabela 6), o que representa uma

taxa de sobrevivência celular de 97,71%. As menores taxas evidenciadas nas

contagens em meio MRS foram nos ensaios KAL3 e KAL4 com valores de 68,56%

e 78,68%, respectivamente. A sobrevivência de bactérias em MRS não foi

significativamente (p<0,05) afetadas pelo efeito linear de maltodextrina, sacarose e

sua interação (Tabela 7; Figura 7A). A superfície de resposta indica que embora a

taxa de sobrevivência não tenha sido significativamente afetada pelos dois

crioprotetores, a sacarose exerceu maior influência nas condições testadas.

Em estudo, desenvolvido por Kok-Tas (2015) onde realizou a liofilização de

grãos de Kefir, sem crioprotetores, com temperatura de congelamento de -20ºC, os

resultados da contagem em placa com MRS mostraram valores médios mais

elevados (8,75 Log UFC/g).

3.6.2 Taxa de sobrevivência de bactérias em M17

A contagem média total de bactérias em meio de cultura sólido M17 no Kefir

in natura foi de 9,485 Log UFC/g (Tabela 4). A concentração celular máxima de

bactérias em M17 após a secagem foi observada como 9,20 Log UFC/g (Tabela 6)

em ensaio utilizando a associação de 8% de maltodextrina e 10% de sacarose,

representando 97,00% de sobrevivência celular, semelhante ao ensaio contendo

apenas 10% de sacarose que apresentou taxa de sobrevivência celular de 96,68%.

Enquanto que as menores taxas de sobrevivência celular foram evidenciadas nas

contagens em meio M17 nos ensaios KAL3 e KAL4 com valores de 77,60% e

76,65%, respectivamente. A sobrevivência de bactérias em M17 não foi afetada

estatisticamente (p<0,05) pelo efeito linear de maltodextrina e sacarose

isoladamente, entretanto, a interação linear entre os dois crioprotetores afetou

estatisticamente (p>0,05) a taxa de sobrevivência destas (Tabela 7; Figura 7B). A

superfície de resposta mostra os efeitos da maltodextrina e da sacarose na taxa de

sobrevivência de bactérias em M17, para esta variável dependente a sacarose

também mostrou maior influência na superfície de resposta.

Kok-Tas (2015) ao realizar contagem em placas com meio M17 em amostras

de grãos de Kefir liofilizados que obteve valor de 8,92 Log UFC/g. Em outro estudo,

desenvolvido por Atalar et al. (2015), com Kefir atomizado, foram realizadas

98

contagens celulares em M17 evidenciando valores bem inferiores do encontrado

no presente trabalho, com concentração média de 2,44 Log UFC/g para

Lactococcus spp., cuja confirmação do gênero foi baseada apenas pela contagem

em placa contendo M17, não tendo sido realizado nenhum teste posterior.

3.6.3 Taxa de sobrevivência celular de leveduras em YGC

A contagem média total de leveduras em meio de cultura sólido YGC no Kefir

in natura desenvolvido em leite pasteurizado foi de 6,46 Log UFC/g (Tabela 4).

Concentração celular máxima de leveduras em YGC após a secagem por

liofilização foi de 5,79 Log UFC/g em ensaio utilizando 10% de sacarose (Tabela

6), elucidando uma taxa de sobrevivência celular de levedura de 89,63%. Valores

inferiores foram encontrados por Kok-Tas (2015) em grãos de Kefir liofilizados sem

crioprotetores, 4,35 Log UFC/g para leveduras, semelhante ao ensaio

desenvolvido, neste estudo, também sem crioprotetor (KAL4) que apresentou

concentração de 4,33 Log UFC/g para leveduras. A sobrevivência celular de

leveduras em YGC não sofreu alteração significativa (p>0,05) pelo efeito linear de

sacarose sozinha e associada à maltodextrina, entretanto o efeito linear da

maltodetrina de forma isolada afetou estatisticamente (p<0,05) a taxa de

sobrevivência celular de leveduras em YGC (Tabela 7; Figura 7C). Observa-se na

superfície de resposta que a maior influência na concentração celular de leveduras

ocorreu pela ação da sacarose.

Atalar et al. (2015) ao promoverem secagem de Kefir por spray drying não

observaram sobrevivência de leveduras, demonstrando que a secagem por

atomização exerce efeito negativo na viabilidade destes micro-orgnismos de devido

a sua sensiblidade térmica. O resultado obtido no presente estudo demonstra que

a liofilização é um processo adequado para desidratação de produtos contendo

leveduras, sobretudo ao observar que as menores taxas de sobrevivência de

leveduras foram nos ensaios KAL3 e KAL4 (72,60% e 67,03%, respectivamente),

o que ainda evidencia uma alta representatividade celular.

99

Figura 7 – Superfície de resposta da concentração celular (Log UFC/g): bactérias em MRS (A); bactérias em M17 (B); leveduras em YGC (C) em função do

percentual de maltodextrina e sacarose de Kefir de leite pasteurizado liofilizado.

3.7 Bactérias isoladas de Kefir de leite integral pasteurizado após a secagem por liofilização

A concentração celular de micro-organismos isolados nas bebidas de Kefir

liofilizado está apresentada na tabela 9. Os resultados evidenciam que todos os

gêneros isolados na bebida sobreviveram ao processo de secagem, com exceção

do sugestivo de Lactobacillus spp. 3, provavelmente por ser uma cepa mais

sensível as agressões do congelamento e secagem quando comparada às demais.

100

O gênero Acetobacter spp. foi o que manteve a maior concentração celular, seguido

por sugestivo de Lactobacillus spp. 2, Enterococcus durans, Bifidobacterium spp. e

sugestivo de Lactobacillus spp. 1. As maiores contagens dos isolados, concordando

com os resultados do Kefir úmido, foram encontradas no meio M17, com exceção

do gênero Bifidobacterium spp. nas bebidas KAL1, KAL3, KAL4, KAL5 e KAL6 e do

gênero Enterococcus durans em KAL3, KAL4, KAL5, KAL6 e KAL7.

Os ensaios KAL1 e KAL2 apresentaram melhores respostas, com maiores

concentrações celulares. O ensaio KAL3 apresentou menores concentrações de

bactérias e menor variabilidade de gênero, resultado semelhante ao controle (sem

crioprotetor) KAL4. Os achados de isolados corroboram com os resultados da

contagem total de bactérias (Tabela 6) com atuação mais eficiente da sacarose

como crioprotetor em detrimento da maltodextrina.

101

Tabela 9 – Bactérias isoladas em Kefir de leite pasteurizado liofilizado (KAL)

abc Médias seguidas de letras iguais na horizontal no mesmo meio de cultura não diferem significativamente (p<0,05) pelo teste de Duncan; ABC Médias seguidas de letras iguais na vertical entre os meios de cultura no mesmo microrganismos não diferem entre si (p<0,05) pelo teste t de Student. KAL1: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 1; KAL2: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 2; KAL3: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 3; KAL4: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 4; KAL5: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 5; KAL6: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 6; KAL7: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 7. *Sugestivo de Lactobacillus spp; **Sugestivo de Bifidobacterium spp.;***Meios de culturas com adição de 0,002% de azul de bromofenol.

Identificação Meios de cultura***

Concentração celular (Log UFC/g) Kefir Liofilizado

KAL1 KAL2 KAL3 KAL4 KAL5 KAL6 KAL7

Enterococcus durans

MRS 5,00±0,00Ad 5,15±0,21Acd 4,58±0,01Ae 4,15±0,21Af 5,50±0,10Aab 5,60±0,01Aa 5,30±0,0Abc M17 4,92±0,03Aa 4,90 ±0,00Aa 0,00±0,00Bd 0,00±0,00Bd 4,50±0,14Bb 4,39±0,13Bbc 4,15±0,21Bc

Bifidobacterium spp**

MRS 5,00±0,00Aa 3,39±0,13Bd 3,39±0,13Ad 4,15±0,21Ab 4,50±0,01Ac 5,00±0,00Aa 4,00±0,00Bb M17 4,15±0,21Bbc 4,15±0,21Abc 0,00±0,00Bd 0,00±0,00Bd 4,00±0,00Bc 4,81±0,05Ba 4,45±0,21Ab

Lactobacillus spp *1

MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Aa 0,00±0,00Aa 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 3,30±0,01Ab 3,00±0,00Ac 0,00±0,00Ad 0,00±0,00Ad 3,48±0,01Aa 3,00±0,00Ac 3,00±0,00Ac

Acetobacter spp MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 7,62±0,03Aa 7,69±0,11Aa 5,81±0,05Ac 7,70±0,03Aa 7,71±0,06Aa 7,70±0,03Aa 7,44±0,05Ab

Lactobacillus spp *2

MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Aa 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 6,00±0,01Aa 6,00±0,01Aa 0,00±0,00Ae 5,78±0,01Ab 4,54±0,02Ac 4,15±0,03Ad 4,15±0,02Ad

Lactobacillus spp *3

MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba

102

3.7 Otimização

As condições de secagem por liofilização foram otimizadas para determinar

a taxa de sobrevivência de bactérias e leveduras em Kefir em pó. As condições

ótimas do processo foram determinadas pelas respostas com a função de

desejabilidade (maior sobrevivência celular). As melhores condições de secagem

de Kefir foram encontradas com o ensaio crioprotegido por sacarose a 10% (KAL2).

A maltodextrina como crioprotetor não mostrou efeito significativo sobre a taxa de

sobrevivência celular de micro-organismos em Kefir de leite liofilizado. As

concentrações celulares de bactérias em MRS, bactérias em M17 e leveduras em

YGC, expressos em Log UFC/g, na melhor condição obtida neste estudo foram

7,24, 9,17 e 5,79, respectivamente (Tabela 6). Atalar et al. (2015) em estudo com

grãos de Kefir liofilizados sem uso de crioprotetor e obtiveram taxas de

sobrevivência celular para Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc e Leveduras

de 2,40, 2,99, 2,56 e 2,54 Log UFC/g, respectivamente, sendo inferiores aos

encontrados no presente trabalho.

3.8 Composição físico-química de Kefir de leite pasteurizado liofilizado nas

condições de processamento da melhor resposta do planejamento fatorial

Os resultados da avaliação físico-química do Kefir de leite pasteurizado

liofilizado utilizando como crioprotetor 10% de sacarose estão apresentados na

tabela 10.

Um dos principais parâmetros analisados em alimentos secos é a atividade

de água e umidade que deve estar abaixo de 0,6 e inferior a 25%, respectivamente

(DE BRUIJN et al., 2016, STEVENSON et al., 2015). Portanto os valores obtidos

para Aw (0,291) e umidade (4,25%) permitem que o Kefir de leite liofilizado seja

classificado como um produto desidratado. Baixos valores de atividade de água são

importantes na preservação de alimentos, pois significa que o produto dispõe de

pouca água livre para a ocorrência de reações químicas e biológicas indesejáveis

(OLIVEIRA; BRANDÃO; SILVA, 2016).

103

Tabela 10 – Parâmetros físicos e químicos de Kefir de leite pasteurizado submetido a secagem por liofilização crioprotegido por sacarose a 10% (KAL2).

ANÁLISES RESULTADOS

Aw 0,291 ±0,006

pH 3,467 ±,006

Acidez (g.100g-1 de Ác. Láctico) 5,439±0,184

Lactose (g.100g-1) 12,193 ±0,095

Proteína (g.100g-1) 13,97 ±0,16

Lipídeo (g.100g-1) 10,10 ±0,02

Carboidrato (g.100g-1) 68,61±0,21

Umidade (%) 4,25 ±0,20

Cinzas (g.100g-1) 3,06 ±0,05

Cor

L* 89,76 ±0,18

a* -2,41 ±0,03

b* 12,27 ±0,05

ΔE* 4,18

O pH, de 3,46, se manteve próximo ao observado na amostra úmida, de 3,68

(Tabela 1). Os valores de cor também se mantiveram próximos aos da bebida antes

da liofilização (Tabela 1) com elevado valor de L* (89,76), cromaticidade a* negativa

(-2,41) e cromaticidade b* positiva (12,27). Estudos sobre os limites da diferença

de cor (ΔE*) ainda são escassos, os valores de tolerância devem ser definidos para

cada produto, no entanto, o valor obtido de 4,18 para o kefir liofilizado não indicou

diferença de cor perceptível a visão humana no produto analisado. Os demais

parâmetros analisados (acidez, lactose, proteína, lipídeos, carboidratos e cinzas)

apresentaram valores mais elevados do que a bebida in natura, sendo esperados

devido a retirada de água e consequente concentração dos constituintes do produto

durante a secagem, elucidando o potencial efeito de manutenção da qualidade de

alimentos submetidos a liofilização.

4 CONCLUSÃO

O leite pasteurizado apresenta ambiente favorável para a fermentação de

grãos de Kefir, evidenciado pela maior concentração celular obtida em KA.

104

O isolamento e identificação de Bifidobacterium spp. nas duas bebidas

desenvolvidas configura um achado importante, não só por todas as propriedades

deste gênero, que é um dos mais empregados como probióticos, mas pelo fato de

se encontrar poucas evidências de isolamento de Bifidobacterium em Kefir quando

todos se remetem ao isolamento em grãos.

A maltodextrina como crioprotetor no processo de liofilização do Kefir de leite

pasteurizado não apresenta eficácia na crioproteção dos micro-organismos nas

condições de ensaios avaliados.

A sacarose, na concentração de 10%, apresenta eficácia na crioproteção

dos micro-organismos do Kefir, propiciando um produto desidratado com boa

qualidade nutricional e viabilidade celular satisfatória com potencial efeito

probiótico.

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111

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Estudos acerca do desenvolvimento de Kefir em pó ainda são escassos na

literatura, sobretudo na utilização do processo de secagem por liofilização, o que

torna necessário que novos estudos sejam realizados com mais análises das

propriedades microbiológicas e físico-químicas do Kefir em pó, além da

determinação da vida de prateleira do produto.

112

APÊNDICE A Características das bactérias isoladas de bebidas fermentadas por grãos de Kefir de leite e de Kefir liofilizado por semeio em

superfície em meios de culturas modificados

Micro-organismo

Isolado Meio de Cultura

Modificado***

Característica macroscópica da

colônia Forma Gram Catalase Oxidase Esporo

Lactobacillus spp.* 1

1 MRS Redonda, pequena,

brilhante, ponto central branco, borda translúcida

Bacilo Longo + - - Não

esporulado

1 M17 Redonda, pequena,

brilhante, ponto central branco, borda translúcida

Bacilo Longo + - - Não

esporulado

Lactobacillus spp.* 2

2 M17 Redonda, média,

brilhante, ponto central azul, borda branca

Cocobacilo + - - Não

esporulado

Lactobacillus spp.* 3

3 M17 Redonda, média,

brilhante, azul escura Bacilo Curto + - -

Não esporulado

Enterococcus durans

4 MRS Redonda, pequena,

brilhante, branca Cocos em

cadeia + - NR

Não esporulado

4 M17 Redonda, pequena,

brilhante, azul escura, borda fina transparente

Cocos em cadeia

+ - NR Não

esporulado

Bifidobacterium spp.**

5 MRS Redonda, pequena,

brilhante, azul escura

Bacilo em forma de

bastonetes bifurcado

+ - NR Não

esporulado

5 M17 Redonda, pequena,

brilhante, azul escura

Bacilo em forma de

bastonetes bifurcado

+ - NR Não

esporulado

Acetobacter spp.

6 M17 Redonda, pequena,

brilhante, branca Pleomórfica Variável + NR

Não esporulado

NR: Não recomendado; *Sugestivo de Lactobacillus spp; **Sugestivo de Bifidobacterium spp.;***Meios de culturas com adição de 0,002% de azul de bromofenol

113

APÊNDICE B

A: aspecto macroscópico do semeio em superfície em meio de cultura MRS modificado e B: aspecto microscópico (1000X) - Sugestivo de Lactobacillus spp. 1

114

APÊNDICE C

A: aspecto macroscópico do semeio em superfície em meio de cultura M17 modificado e B: aspecto microscópico (1000X) - Sugestivo de Lactobacillus spp. 2

115

APÊNDICE D

A: apecto macroscópico: semeio em superfície em meio de cultura M17 modificado (A) e B: aspecto microscópico (1000X) - Sugestivo de Lactobacillus

spp. 3

116

APÊNDICE E

Aspecto macroscópico: A) semeio em superfície em meios de culturas MRS, B) M17 modificados, C) aspecto microscópico (1000X) - Enterococcus durans

117

APÊNDICE F

Aspecto macroscópico: semeio em superfície em meio de cultura M17 modificado (A) e aspecto microscópico (1000X) - Acetobacter spp. (B)

118

APÊNDICE G

Aspecto macroscópico: A) semeio em superfície em meios de culturas MRS, B) M17 modificados e C) aspecto microscópico (1000X) - Sugestivo de

Bifidobacterium spp. 2

119

APÊNDICE H

A: aspecto macroscópico do semeio em superfície em meio de cultura YGC e B: aspecto microscópico (1000X) - Candida krusei (B)

120

ANEXO A

Composição dos meios sólidos MRS (Merck®) e M17 (Sigma®)

MRS M17

Nutrientes g/L Nutrientes g/L

Hidrogenofosfato dipotássico 2,0 β-glicerofosfato dissódico

pentahidratado 19,0

Extrato de carne 10,0 Extrato de carne 5,0

Extrato de levedura 4,0 Extrato de levedura 2,5

Digestão enzimática de

caseína 10,0 Peptona de caseína 2,5

Tween 80 1,08 Peptona de carne 2,5

Citrato de hidrogênio Di-

Amônia 2,0

Peptona de soja 5,0

Acetato de sódio 5,0

Sulfato de Magnésio

Heptahidratado 0,2

Sulfato de magnésio

hidratado 0,25

Sulfato de manganês

Monohidratado 0,04 Ácido ascórbico 0,5

Ágar 14,0 Ágar 12,75

D (+) – Glicose 20,0

Solução de Lactose

adicionada de forma

asséptica

10%

pH a 25ºC 5,6-5,9 pH a 25ºC 7,1 ± 0,2