Desenvolvimento e caracterização de biofilmes ativos à ...repositorio.unicamp.br/jspui/bitstream/REPOSIP/...UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

Desenvolvimento e caracterização de biofilmes ativos à

base de polímeros de fontes renováveis e sua aplicação

no acondicionamento de pães de forma

Tese apresentada à Faculdade de

Engenharia de Alimentos, da Universidade

Estadual de Campinas para a obtenção do

título de Doutor em Tecnologia de

Alimentos.

Autora Larissa Canhadas Bertan

Orientadora: Prof. Dra. Fernanda Paula Collares Queiroz

Co-orientador: Prof. Dr. Theo Guenter Kieckbusch

Campinas/2008

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELABIBLIOTECA DA FEA – UNICAMP

Título em inglês: Development and characterization of active biofilms based on polymer from

renewed sources and their application to preserve pan breads Palavras-chave em inglês (Keywords): Gelatin, Gluten, Potassium sorbate, Active packaging Titulação: Doutorado em Tecnologia de Alimentos Banca examinadora: Fernanda Paula Collares Queiroz

Carlos Raimundo Ferreira Grosso Lucia Helena Innocentini Mei

Marta Hiromi Taniwaki Patrícia Sayuri Tanada Palmu

Programa de Pós Graduação: Programa em Tecnologia Alimentos

Bertan, Larissa CanhadasB461d Desenvolvimento e caracterização de biofilmes ativos à base de

polímeros de fontes renováveis e sua aplicação no acondicionamento de pães de forma / Larissa Canhadas Bertan. -- Campinas, SP: [s.n.], 2008.

Orientador: Fernanda Paula Collares QueirozCo-orientador: Theo Guenter KieckbuschTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas.Faculdade

de Engenharia de Alimentos

1. Gelatina. 2. Glúten. 3. Sorbato de Potássio. 4. Embalagem ativa . I. Queiroz, Fernanda Paula Collares. II. Kieckbusch, Theo Guenter. III. Universidade Estadual de Campinas.Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.

(cars/fea)

iii

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dra. Fernanda Paula Collares Queiroz

Faculdade de Engenharia de Química

UNICAMP

(orientador)

Prof. Dr. Carlos Raimundo Ferrreira Grosso

Faculdade de Engenharia de Alimentos

UNICAMP

(membro)

Profa. Dra. Lucia Helena Innocentini Mei

Faculdade de Engenharia Química

UNICAMP

(membro)

Dra. Marta Hiromi Taniwaki

Instituto de Tecnologia de Alimentos

ITAL

(membro)

Dra. Patrícia Sayuri Tanada Palmu

ROASTED POTATO

(membro)

Dra. Renata Maria dos Santos Celeghini

Faculdade de Engenharia de Alimentos

UNICAMP

(suplente)

Profa. Dra. Carmen Cecilia Tadini

Departamento de Engenharia de Química USP

(suplente)

Dra. Cristiana Maria Pedroso Yoshida

Faculdade de Engenharia de Química

UNICAMP

(suplente)

v

“É graça divina começar bem.

Graça maior persistir na caminhada certa.

Mas graça das graças é não desistir nunca.”

Dom Hélder Câmara

vii

Dedico, aos meus primeiros

educadores na vida, meus pais

Tereza e Levino e ao meu irmão

Helder.

Dedico, a Deus que torna tudo

possível.

ix

AGRADECIMENTO

À Deus, pelo dom da vida, pela presença constante, por seu amor incondicional,

por me mostrar uma força que eu mesma não sabia que possuía, por me segurar pelas

mãos e fazer meus passos bem mais firmes. Sem Ti nada seria possível!

À Nossa Senhora, que durante toda minha vida nunca desviaste de mim o Vosso

olhar, por toda força e coragem que me destes nos meus momentos de dificuldade,

ansiedade e insegurança, pelo amor que me impulsiona seguir em frente.

Ao meu Santo Anjo da Guarda, fiel protetor que me foste dado por Deus como

companheiro, por me ajudar a captar as mais suaves sugestões e apelos da graça

emanados do Coração amabilíssimo de nosso Senhor, ao iluminar minhas dúvidas e me

levantar nas quedas

À minha mãe, Tereza, por todo amor, carinho e atenção que recebi durante todos

os minutos da minha vida. Eu sou o que sou por sua causa. Só consegui chegar até aqui,

concluir mais essa etapa, porque você está junto de mim. Porque carrego tudo de bom

que você me deixou: as lições, as ações, os conselhos, as boas lembranças, um exemplo

de pessoa e de vida. E carrego, principalmente, o amor que você me deixou, tão grande

que poço sentir mesmo na sua ausência. Sinto saudades, mãe. Te amo muito, para

sempre!

Ao meu pai, Levino, um dos maiores presentes que Deus me deu. Meu referencial

de fé, bondade, força, coragem, ética e determinação. Meu êxito é fruto do seu esforço,

doação e renúncia, através de seu incentivo constante reuni forças para vencer todas as

dificuldades. Obrigada pela lição de amor e dignidade que me ensina por toda a vida. Te

amo!!!

Ao Helder, o irmão que Deus me deu e que se tivesse a chance de escolha, não

teria um melhor. Obrigada por todo amor, amizade, carinho, enfim, obrigada por fazer

parte da minha vida.... “Foi Deus quem te escolheu pra ser o melhor amigo que eu

pudesse ter”.

À minha cunhada, Andréa, por sua amizade, alegria, apoio, carinho, pelos papos

divertidos e por sempre torcer por mim.

xi

À minha sobrinha, Ana Sofia, a mais nova jóia dada por Deus para enriquecer e

alegrar o tesouro de nossa família. Amo você!!!

À Profa. Dra. Fernanda Paula Collares Queiroz, por sua orientação, amizade, pela

confiança, pela liberdade no desenvolvimento deste trabalho e pelo incentivo para que eu

me aprimorasse permitindo meu amadurecimento profissional.

Ao Prof. Dr. Theo Guenter Kieckbusch, pela co-orientação e pelo cuidado com

finalização deste trabalho.

Aos membros da banca, Prof. Dr. Carlos Raimundo Ferrreira Grosso, Profa. Dra.

Lucia Helena Innocentini Mei, Dra. Marta Hiromi Taniwaki, Dra. Patrícia Sayuri Tanada

Palmu e Dra. Renata Maria dos Santos Celeghini,pelas sugestões apresentadas para

redação final deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Carlos Raimundo Ferreira Grosso, por sua amizade, por no início do

doutorado ter aberto as portas de seu laboratório para que eu iniciasse minhas atividades,

pelo seu incentivo constante e por sempre ter uma palavra de apoio.

À Dra. Renata Maria dos Santos Celeghini, por sua amizade, delicadeza (obrigada

pela mensagem no fim do boneco), confiança, carinho, apoio e pelos ensinamentos com o

HPLC.

À Dra. Marta Hiromi Taniwaki (ITAL), por todo seu carinho, atenção e

disponibilidade. Por seu apoio durante os testes de difusão, principalmente pelo incentivo

quando as coisas não davam certo e por me ajudar crescer como profissional. Por ter

proporcionado a minha amizade com os fungos. Obrigada!!!

À Profa. Dra Maria Isabel Rodrigues, por sua ajuda com o planejamento

experimental.

À Leiner Davis Gelatin Brasil, pelo fornecimento da gelatina. À Cargill, pelo

fornecimento do amido de mandioca e o amido de mandioca modificado. À Corn Product,

pelo fornecimento do amido de milho ceroso e amido de milho ceroso modificado.

À todos do Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL), por todo carinho e ajuda

no desenvolvimento da tese.

xiii

Aos funcionários do DTA: Alice, Ana Lourdes, Renata, Beth, Ana Koon, Marlene,

Tânia, Karina, Jaime, Adauto, Ana Maria, Dona Denir, Diana e Zé Roberto, pela amizade

e colaboração, afinal “O êxito também depende de vocês”.

À todos da secretária de Pós-Graduação, em especial, ao Cosme pela paciência e

dedicação.

À todos da padaria da FEA, especialmente, ao seu Zé por ter me ajudado na

elaboração dos pães de forma.

À Renatinha e Noemi, pela amizade e por estarem sempre dispostas em ajudar.

À Andrea, uma irmã que ganhei durante esta trajetória, por seu carinho, bondade,

companheirismo, por estar ao meu lado em tudo e para tudo, por muitas vezes me

mostrar estradas onde eu via o fim... ”Amigo fiel, refúgio poderoso quem o encontrou

descobriu um tesouro”.

Aos meus grandes amigos Tom, Ruiva e Fabinho, que estiveram sempre ao meu

lado, pelo carinho, apoio, ouvido e alegrias, pois “quem caminha sozinho pode até chegar

mais rápido, mais aquele que vai acompanhado com certeza chegará mais longe...”.

Aos amigos do DTA, por tornar essa caminhada muito mais alegre.

À Pri Mamede, uma das pessoas mais doce que conheci, por sua amizade, apoio

incondicional, por sempre ter uma palavra amiga.......Gratidão eterna gratidão por sua

amizade!!

À Pri Vianna, por sua amizade e por todos os momentos que passamos juntas os

quais tornaram essa caminhada muito mais suave e alegre.

À todos do Laboratório de Cereais, especialmente a Paula, Leomar, Ricardo e

André, pela ajuda no decorrer da minha pesquisa, pela amizade e por tornar os dias de

trabalho muito mais agradáveis com suas conversas, conselhos, bom humor e almoços

divertidos.

À Fara, minha fiel companheira desde a época do mestrado, pela amizade, pela

força em todos momentos, por estar sempre presente, pelo carinho, pelos momentos de

descontração no Papai Salim e Akitcabes.

xv

À Lu, por estar sempre comigo, apoiando-me em todos os momentos e dando-me

força para vencer todos os obstáculos do dia a dia.

À Bia, uma grande amiga que tive a graça de ganhar durante essa trajetória, por

sua bondade, por dividir seus conhecimentos sem pedir nada em troca, pela força e

carinho em todos os momentos. Não tenho palavras para agradecer tudo que você fez.

À Marina, preciosa amiga que ganhei durante meu doutorado, por sua bondade,

incentivo e por estar sempre disposta em ajudar com sua alegria constante e mais ainda

por sempre me mostrar o lado positivo das coisas.

Ao Rodolfo, pela ajuda na realização das análises térmicas e pelas conversas

divertidas. Ao Rodrigo Nascimento, pela amizade, pelos momentos compartilhados, pelas

conversas e por sua gentileza em ter feito as correções de português da tese.

À todos da TOCA DE ASSIS, especialmente ao Irmão Carmelo, Irmã Antônia, Irmã

Bethânia, Irmão Dileto, Irmão Hesed, Fran, Gisa, André, Marcelo, Fernando, Anderson

(Pérola) e Naty pelo amor, carinho, apoio, orações e amizade. ”Se eu tentasse definir o

quão especial tu és pra mim, palavras não teriam fim. Precioso és para Deus e para mim”.

Amo vocês!!

Ao Padre Roberto José Lettieri e ao Padre João Batista Alves de Almeida Júnior,

obrigado por terem dito sim a Deus, pelos cuidados pastorais, por cada Santo Sacrifíco,

por me guiarem no caminho da salvação, por me ensinarem amar ainda mais Jesus...”Teu

sim nos inclina a adorar a Deus....Em Cristo és nosso bom pastor”. Amo vocês!

À FAPESP, pela concessão da bolsa de doutorado e reserva técnica (Proc.

04/07880-7) que permitiram a realização deste projeto.

“Agradecer é admitir que houve momento em que se precisou de

alguém, é reconhecer que o ser humano jamais poderá lograr para si o

dom de ser auto suficiente. Ninguém nasce e cresce sozinho, sempre

é preciso um olhar de apoio, uma palavra de incentivo, um gesto de

compreensão, uma atitude de amor.”

Muito obrigada!

Lara

xvii

SUMÁRIO

RESUMO.......................................................................................................................XLI

ABSTRACT .................................................................................................................XLIII

1.0 INTRODUÇÃO............................................................................................................. 1

2.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 5

2.1 FILMES E COBERTURAS COMESTÍVEIS E/OU BIODEGRADÁVEIS .................................................... 5

2.2 Características dos filmes ................................................................................................... 10

2.2.1 Espessura........................................................................................................................ 10

2.2.2 Aspecto visual.................................................................................................................. 11

2.2.3 Sabor e aroma ................................................................................................................. 11

2.2.4 Cor e opacidade............................................................................................................... 13

2.2.5 Propriedades dos filmes................................................................................................... 13

2.2.5.1 Permeabilidade ao vapor de água (PVA) ...................................................................... 13

2.2.5.2 Permeabilidade a gases (PO2) ...................................................................................... 15

2.2.5.3 Propriedades mecânicas............................................................................................... 17

2.2.5.4 Solubilidade em água.................................................................................................... 18

2.3 Filmes ativos....................................................................................................................... 19

2.4 Proteínas do trigo................................................................................................................ 22

2.5 Gelatina .............................................................................................................................. 25

2.6 AMIDO.................................................................................................................................. 28

3.0 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 31

3.1. Material.............................................................................................................................. 31

3.2. ELABORAÇÃO DOS FILMES .................................................................................................... 32

3.2.1. Filme à base de gelatina (GEL)....................................................................................... 32

3.2.2. Elaboração de filme à base de glúten (GLU)................................................................... 32

3.2.3 Filmes à base de amido de mandioca (AM) ou mandioca modificado (AMM) .................. 33

xix

3.2.4 Filmes à base de amido de milho ceroso (AMC) ou milho ceroso modificado (AMCM).... 33

3.2.5 Filmes compostos ............................................................................................................ 33

3.2.6 Filmes ativos.................................................................................................................... 33

3.3 METODOLOGIA DE CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES SIMPLES E COMPOSTOS ............................... 34

3.3.1 Caracterização dos filmes................................................................................................ 34

3.3.1.1 Aspecto visual............................................................................................................... 34

3.3.1.2 Espessura (e)................................................................................................................ 34


3.3.1.4 Solubilidade em água (SOL) ......................................................................................... 35


3.3.1.6 Permeabilidade ao oxigênio (PO2) ................................................................................ 37

3.3.1.7 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) .................................................................. 38

3.3.1.8 Análise dinâmico-mecânica (DMA) ............................................................................... 38

3.3.1.9 Determinação da efetividade antimicrobiana do filme pelo método de difusão em halo 39

3.3.1.9.1 Preparação do inóculo ............................................................................................... 39

3.3.1.9.2 Teste de difusão em halo........................................................................................... 39

3.4 Produção de pão de forma.................................................................................................. 40

3.4.1 Método de análise microbiológica para isolamento de fungos.......................................... 40

3.4.1.1 Análise microbiológica .................................................................................................. 41

3.4.1.1.1 Identificação das espécies fúngicas ........................................................................... 41

3.5 Aplicação do biofilme no acondicionamento de pão de forma............................................. 41

3.5.1 Análises dos pães de forma embalados........................................................................... 43

3.5.1.1 Perda de peso............................................................................................................... 43

3.5.1.2 Determinação Instrumental da textura........................................................................... 43

3.5.1.3 Determinação do conteúdo de umidade........................................................................ 45

3.5.1.4 Determinação de atividade de água.............................................................................. 45

3.5.1.5 Análise microbiológica .................................................................................................. 45

3.5.1.6 Extração e quantificação de sorbato de potássio .......................................................... 45

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................................... 46

4.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................... 47

4.1 FILMES SIMPLES À BASE DE GELATINA PLASTIFICADO COM GLICEROL........................................ 47

xxi

4.1.1 Caracterização dos filmes................................................................................................ 47

4.1.1.1 Aspecto visual............................................................................................................... 47

4.1.1.2 Espessura..................................................................................................................... 47


4.1.1.4 Solubilidade em água (SOL) ......................................................................................... 50


4.2 CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES À BASE DE GLÚTEN E GLICEROL................................................ 53

4.2.1 Permeabilidade ao vapor de água (PVA) ......................................................................... 57

4.2.2 Solubilidade em água (SOL) ............................................................................................ 63

4.2.3 Propriedades mecânicas.................................................................................................. 69

4.2.3.1 Resistência à tração (RT) ............................................................................................. 69

4.2.3.2 Elongação..................................................................................................................... 75

4.2.4 Otimização das características físicas ............................................................................. 81

4.3 FILMES SIMPLES À BASE DE AMIDO PLASTIFICADOS COM GLICEROL........................................... 83

4.4 Filmes compostos............................................................................................................... 87

4.4.1 Caracterizaçao de filme composto de glúten e gelatina, plastificados com glicerol. ......... 87

4.4.1.1 Aspecto visual............................................................................................................... 87

4.4.1.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água ........................................... 87

4.4.1.3 Propriedades Mecânicas............................................................................................... 89

4.4.2 Filmes compostos à base de amido e gelatina................................................................. 90

4.4.2.1 Caracterização dos filmes compostos de amido de mandioca nativo e modificado e gelatina, plastificados com glicerol............................................................................................ 91

4.4.2.1.1 Aspecto visual............................................................................................................ 91

4.4.2.1.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água ........................................ 91

4.4.2.1.3 Propriedades mecânicas............................................................................................ 94

4.4.2.2 Caracterização dos filmes composto de amido de milho ceroso nativo e modificado e gelatina, plastificados com glicerol............................................................................................ 97

4.4.2.2.1 Aspecto visual............................................................................................................ 97

4.4.2.2.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água ........................................ 97

4.4.2.2.3 Propriedades mecânicas.......................................................................................... 100

4.4.3 Filmes compostos à base de glúten e amido, plastificados com glicerol ........................ 102

xxiii

4.4.4 Caracterização dos filmes compostos de amido, gelatina e glúten, plastificados com glicerol .................................................................................................................................... 105

4.4.4.1 Aspecto visual............................................................................................................. 105

4.4.4.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água ......................................... 105

4.4.4.3 Propriedades mecânicas............................................................................................. 107

4.5 FILMES COMPOSTOS SELECIONADOS.................................................................................... 109

4.5.1 Permeabilidade ao vapor de água, solubilidade em água, resistência a tração e porcentagem de elongação..................................................................................................... 109

4.6 Caracterização dos filmes ativos incorporados de sorbato de potássio............................. 111

4.6.1 Aspecto visual................................................................................................................ 111

4.6.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água ............................................ 113

4.6.3 Propriedades mecânicas................................................................................................ 116

4.6.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA....................................................................... 119

4.6.6 Análise dinâmico mecânica............................................................................................ 131

4.6.7 Ensaio de difusão em halo............................................................................................. 146

4.6.7.1 Isolamento e identificação das espécies fúngicas ....................................................... 146

4.6.7.2 Determinação da efetividade antimicrobiana dos filmes compostos contendo sorbato de potássio .................................................................................................................................. 147

4.7 APLICAÇÃO DE BIOFILMES ATIVOS EM FATIAS DE PÃO-DE-FORMA............................................ 169

4.7.1 Perda de peso ............................................................................................................... 170

4.7.2 Textura dos pães ........................................................................................................... 171

4.7.3 Conteúdo de Umidade ................................................................................................... 172

4.7.4 Atividade de água .......................................................................................................... 174

4.7.5 Análise microbiológica ................................................................................................... 175

4.8.6 Extração e quantificação de sorbato de potássio ........................................................... 180

5.0 CONCLUSÕES........................................................................................................ 183

6.0 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS.......................................................... 187

7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 189

xxv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Desenho esquemático e foto, respectivamente, de: (A) cobertura (ASSIS e

LEONI, 2003) e (B) biofilme (SIQUEIRA, 2004). ................................................................ 5

Figura 2. 2. Desenho esquemático da formação de filmes de glúten (VICENTINI, 2003). 24

Figura 2. 3. Esquema de formação do filme de amido (VICENTINI, 2003)....................... 29

Figura 3.1. Foto das fatias de pão de forma intercaladas com os biofilmes ativos

(SOARES et al, 2002)...................................................................................................... 43

Figura 4.1. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da

permeabilidade ao vapor de água em função da concentração de glúten e etanol. ......... 61


permeabilidade ao vapor de água em função da concentração de glúten e pH. .............. 61


permeabilidade ao vapor de água em função da concentração de etanol e pH. .............. 61


solubilidade em água em função da concentração de glúten e etanol. ............................ 67


solubilidade em água em função da concentração de glúten e pH................................... 67


solubilidade em água em função da concentração de etanol e pH................................... 67

Figura 4.7 Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da

resistência à tração em função da concentração de glúten e etanol. ............................... 73


resistência à tração em função da concentração de glúten e pH. .................................... 73


resistência à tração em função da concentração de etanol e pH. .................................... 73

xxvii

Figura 4.10 Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da

porcentagem de elongação em função da concentração de glúten e etanol. ................... 79


porcentagem de elongação em função da concentração de glúten e pH. ........................ 79


porcentagem de elongação em função da concentração de etanol e pH. ........................ 79

Figura 4.13. Rachaduras no filme de amido após o processo de secagem...................... 85

Figura 4.14. Filmes compostos de amido e glúten após processo de secagem. ............ 103

Figura 4.15. Borda dos filmes compostos de amido e glúten após o processo de secagem.

...................................................................................................................................... 103

Figura 4.16. Aspecto visual do filme de AMM/GLU/GEL (1:1:1) adicionado de 4% de

sorbato de potássio. ...................................................................................................... 111

Figura 4.17. Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura para os filmes

compostos de GLU/GEL (1:4): (A) Controle-superfície (0% de sorbato); (B) Controle-

secção transversal (0% de sorbato); (C) adicionados com 2% sorbato de potássio-

superfície; (D) adicionados com 2% sorbato de potássio secção transversal; (E)

adicionados com 4% sorbato de potássio superfície; (F) adicionados com 4% sorbato de

potássio secção transversal. (Onde: e= estria de plastificante; f = fita de carbono e

m=mancha de sorbato de potássio). .............................................................................. 121

Figura 4.18. Micrografias obtidas por meio de microscopia eletrônica de varredura para os

filmes compostos de AMM/GEL (1:4): (A) controle-superfície (0% de sorbato); (B)

controle-secção transversal (0% de sorbato); (C) adicionados com 2% sorbato de

potássio-superfície; (D) adicionados com 2% sorbato de potássio-secção transversal; (E)

adicionados com 4% sorbato de potássio-superfície; (F) adicionados com 4% sorbato de

potássio-secção transversal. (Onde: e= estria de plastificante; f = fita de carbono) ....... 125


compostos de AMM/GLU/GEL (1:4): (A) controle-superfície (0% de sorbato); (B) controle-


superfície; (D) adicionados com 2% sorbato de potássio-secção transversal;

xxix

(E) adicionados com 4% sorbato de potássio-superfície; (F) adicionados com 4% sorbato

de potássio-secção transversal. (Onde: e= estria de plastificante; f = fita de carbono). . 129

Figura 4.20. Termogramas de análise dinâmico mecânica do biofilme composto de glúten

e gelatina 1:4. ................................................................................................................ 135

Figura 4.21. Termogramas de análise dinâmico mecânica do biofilme composto de 2% de

amido de mandioca modificado e gelatina 1:4. .............................................................. 135

Figura 4.22. Termogramas de DMA dos biofilmes compostos de 2% de amido de

mandioca modificado/gelatina e glúten 1:1:1. ................................................................ 137


e gelatina 1:4 com 2% de sorbato de potássio............................................................... 141


amido de mandioca modificado e gelatina 1:4 com 2% de sorbato de potássio. ............ 141

Figura 4.25. Fungos isolados para o teste de difusão do halo. (A) Eurotium chevalieri; (B)

Eurotium amstelodami; (C) Wallemia sebii, (D) Cladosporium sp e (E) Penicillium

raistrickii......................................................................................................................... 147

Figura 4.26. Avaliação da sensibilidade microbiana aos diferentes filmes ativos em

presença de Eurotium chevalieri, pela técnica da difusão em ágar. ............................... 151

Figura 4.27. Avaliação da sensibilidade microbiana ante os diferentes filmes ativos em

presença de Eurotium amstelodami, pela técnica da difusão em ágar........................... 155

Figura 4.28. Avaliação da sensibilidade microbiana frente aos diferentes filmes ativos em

presença de Wallemia sebii pela técnica da difusão em ágar. ....................................... 159


presença de Penicillium raistrickii pela técnica da difusão em ágar. .............................. 163


presença de Cladosporium sp. pela técnica da difusão em ágar. .................................. 167

Figura 4.31. Aspecto das fatias de pães de forma acondicionados, durante a vida de

prateleira........................................................................................................................ 177

xxxi

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 4.1. Permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos filmes de gelatina e glicerol

(25°C). ............................................................................................................................. 49

Tabela 4.2. Solubilidade em água (SOL) dos filmes de gelatina e glicerol. ...................... 50

Tabela 4.3. Propriedades mecânicas dos filmes de gelatina e glicerol (25°C). ................ 51

Tabela 4.4. Níveis das variáveis independentes do planejamento fatorial completo 23

usado para filmes de glúten plastificados com glicerol..................................................... 53

Tabela 4.5. Alíquotas utilizadas para cada formulação dos biofilmes de glúten e glicerol.54

Tabela 4.6. Delineamento experimental para a obtenção da elaboração de filmes à base

de glúten plastificados com glicerol.................................................................................. 56

Tabela 4.7. Estimativa dos efeitos das variáveis independentes sobre a permeabilidade ao

vapor de água dos filmes de glúten plastificados com glicerol. ........................................ 57

Tabela 4.8. Coeficiente de regressão do modelo quadrático multivariável para a

permeabilidade ao vapor de água em filmes de glúten e glicerol. .................................... 59

Tabela 4.9. ANOVA do ajuste do modelo obtido para a permeabilidade ao vapor de água

dos filmes de glúten plastificados com glicerol................................................................. 60

Tabela 4.10. Estimativa dos efeitos das variáveis independentes sobre a solubilidade em

água dos filmes de glúten plastificados com glicerol........................................................ 63


solubilidade em água. ...................................................................................................... 64

Tabela 4.12. ANOVA do ajuste do modelo obtido para a solubilidade em água dos filmes

de glúten plastificados com glicerol.................................................................................. 65

Tabela 4.13. Estimativa dos efeitos das variáveis independentes sobre a resistência à

tração dos filmes de glúten plastificados com glicerol. ..................................................... 69

Tabela 4.14. Coeficiente de regressão do modelo quadrático multivariável para RT. ...... 71

Tabela 4.15. ANOVA do ajuste do modelo obtido para resistência à tração dos filmes de

glúten plastificados com glicerol. ..................................................................................... 72

xxxiii

Tabela 4.16. Estimativa dos efeitos das variáveis independentes sobre a porcentagem de

elongação dos filmes de glúten plastificados com glicerol. .............................................. 75

Tabela 4.17. Coeficiente de regressão do modelo quadrático multivariável para

porcentagem de elongação.............................................................................................. 76

Tabela 4.18. ANOVA do ajuste do modelo obtido para a porcentagem de elongação dos

filmes de glúten plastificados com glicerol. ...................................................................... 77

Tabela 4.19. Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água dos filmes de

compostos glúten de trigo e gelatina, plastificados com glicerol (25°C). .......................... 88

Tabela 4.20. Propriedades mecânicas dos filmes compostos glúten de trigo e gelatina,

plastificados com glicerol (25°C)...................................................................................... 89

Tabela 4.21. Permeabilidade ao vapor de água e a solubilidade em água dos filmes de

compostos de amido de mandioca nativo e modificado e gelatina plastificados com glicerol

(25°C). ............................................................................................................................. 92

Tabela 4.22. Propriedades mecânicas dos filmes de compostos de amido de mandioca

nativo e modificada e gelatina, plastificados com glicerol (25°C) ..................................... 94

Tabela 4.23. Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água dos filmes de

compostos de amido de milho ceroso nativo ou modificado e gelatina plastificados com

glicerol (25°C).................................................................................................................. 98

Tabela 4.24. Propriedades mecânicas dos filmes compostos de amido de milho ceroso

nativo ou modificado e gelatina, plastificados com glicerol (25°C) ................................. 100

Tabela 4.25. Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água dos diferentes

tipos de filmes compostos à base de amido, gelatina e glúten (25°C)............................ 106

Tabela 4.26. Propriedades mecânicas dos filmes compostos à base de amido (milho

ceroso, milho ceroso modificado, mandioca e mandioca modificado), gelatina e glúten,

plastificados com glicerol (25°C).................................................................................... 108

Tabela 4.27. Permeabilidade ao vapor de água, solubilidade em água e propriedades

mecânicas de filmes simples e compostos selecionados............................................... 110

Tabela 4.28. Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água dos filmes

compostos ativos incorporados de sorbato de potássio (25°C)...................................... 114

xxxv

Tabela 4.29. Resistência à tração e porcentagem de elongação dos filmes compostos

ativos incorporados de sorbato de potássio (25°C)........................................................ 116

Tabela 4.30. Permeabilidade ao oxigênio dos filmes compostos sem e com sorbato de

potássio. ........................................................................................................................ 118

Tabela 4.31. Temperatura de transição vítrea média e umidade dos biofilmes compostos.

...................................................................................................................................... 132

Tabela 4.32. Temperatura média de transição vítrea e umidade dos biofilmes compostos

ativos. ............................................................................................................................ 140

Tabela 4.33 . Concentração da suspensão de esporos utilizada em ensaio de difusão em

halo................................................................................................................................ 149

Tabela 4.34. Perfil microbiológico da eficiência dos filmes ativos pelo teste de difusão em

placa para Eurotium chevalieri. ...................................................................................... 149


placa para Eurotium amstelodami.................................................................................. 153


placa para Wallemia sebii. ............................................................................................. 157


placa para Penicillium raistrickii. .................................................................................... 161


placa para Cladosporium sp. ......................................................................................... 165

Tabela 4.39. Perda de peso de fatias de pão-de-forma acondicionadas, durante o

armazenamento............................................................................................................. 170

Tabela 4.40. Firmeza das fatias de pães-de-forma acondicionadas, durante o

armazenamento............................................................................................................. 171

Tabela 4.41. Conteúdo de umidade das fatias de pães-de-forma acondicionadas, durante

o armazenamento.......................................................................................................... 172

Tabela 4.42. Valores de atividade de água das fatias de pães-de-forma acondicionadas,

durante o armazenamento............................................................................................. 174

xxxvii

Tabela 4.43. Contagem total de bolores e leveduras em fatias de pães-de-forma

acondicionadas, durante o armazenamento. ................................................................. 179

Tabela 4. 44. Extração e quantificação de sorbato de potássio em 45 g de pão de forma,

durante o armazenamento............................................................................................. 181

xxxix

NOMENCLATURA

AM - Amido de mandioca

AMC - Amido de milho ceroso

AMCM - Amido de milho ceroso modificado

AMM - Amido de mandioca modificado

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ASTM – American Society for Testing and Materials

aw – Atividade de água

DMA - Análise mecânico dinâmica

ELO - Elongação

GEL - Gelatina

GLU - Glúten

MEV - Microscopia eletrônica de varredura

p/v – Peso por volume

Pa – Pascal

pH - Potencial hidrogeniônico

PO2 - Permeabilidade ao oxigênio

PVA - Permeabilidade ao vapor de água

RT - Resistência à tração

SOL - Solubilidade em água

SORB - Sorbato de potássio

Tg – Temperatura de transição vítrea

UFC – Unidade formadora de colônias

UR – Umidade relativa

xli

RESUMO

Pesquisas sobre biofilmes à base de polímeros surgiram devido ao impacto ambiental aliado à necessidade de reduzir os resíduos sólidos. Atualmente, vários estudos estão voltados ao desenvolvimento de tecnologia que controle o crescimento indesejável de microorganismos, através de embalagens ativas. O objetivo deste trabalho foi obter asmelhores formulações para o desenvolvimento de biofilmes ativos e avaliar sua aplicação no acondicionamento de pães de forma. Filmes simples e compostos à base de gelatina, glúten e amido (mandioca, mandioca modificado, milho ceroso e milho ceroso modificado) foram desenvolvidos e caracterizados quanto à permeabilidade ao vapor de água (PVA),permeabilidade ao oxigênio (PO2), solubilidade em água (SOL) e propriedades mecânicas (resistência à tração - RT e porcentagem de elongação - ELO), variando a concentração da macromolécula e do plastificante (glicerol). Os filmes contendo 10 g de gelatina com 5% de glicerol (em relação à massa seca da proteína) e o filme com 5 g de glúten, 32,5 mL de etanol/100 mL de solução, pH 5 e 20% de glicerol (em relação à massa seca da proteína) foram selecionados para a elaboração dos filmes compostos. Filmes compostos de glúten/gelatina (GLU/GEL), amido de mandioca/gelatina (AM/GEL), amido de mandioca modificado/gelatina (AMM/GEL), amido de milho ceroso/gelatina (AMC/GEL), amido de milho ceroso modificado/gelatina (AMCM/GEL) em diversas proporções 1:1, 1:4 e 4:1 e amido/gelatina/glúten (AM/GLU/GEL; AMM/GLU/GEL, AMC/GLU/GEL e AMCM/GEL) na proporção 1:1:1, também foram confeccionados e caracterizados. Os filmes compostos apresentaram menor PVA e maior RT que os filmes simples de gelatina. Os filmes compostos AMM/GEL, GLU/GEL e AMM/GLU/GEL, nas proporções 4:1; 4:1 e 1:1:1, respectivamente, foram utilizados no desenvolvimento de filmes ativos. Os filmes compostos foram adicionados de sorbato de potássio (SP) na concentração de 2 e 4% (p/v). A adição de SP provocou aumento na PVA, na SOL e na ELO e redução na RT, em relação aos filmes sem sorbato. A superfície dos filmes compostos mostrou-se lisa e homogênea, com exceção do filme AMM/GLU/GEL com 4% de SP. Para os testes de difusão em halo, foram isolados 5 fungos: (i) Eurotium chevalieri; (ii) Eurotium amstelodami; (iii) Wallemia sebii; (iv) Penicillium raistrickii e (v) Cladosporium sp. Os filmes que apresentaram maior eficiência na redução do crescimento dos fungos e melhores propriedades de barreira e mecânicas foram: (i) AMM/GEL e (ii) GLU/GEL, ambos com 2% de SP. Os filmes ativos selecionados no teste de difusão em halo apresentaram duas tangentes de perda (tan ), indicando a existência de duas Tg. Os filmes de GLU/GEL, sem e com 2% SP, foram utilizados no acondicionamento de pão de forma, sendo que as fatias de pães justapostas foram intercaladas com os filmes ativos e colocadas em sacos de polietileno de baixa densidade. O uso de filmes entre as fatiasprovocou aumento da firmeza, diminuição da umidade e da atividade de água. A análise microbiológica não indicou diferença significativa entre a estocagem com filmes ativos e o controle. No 7° dia, os pães continham a quantidade máxima de SP permitida no produto pela legislação brasileira.

Palavras chaves: gelatina, glúten, amido de mandioca modificado, sorbato de potássio, embalagem ativa.

xliii

ABSTRACT

In recent years the research on polymer-based biofilms has seen considerable increase due to concern over environmental impact and the need to reduce solid residue generation. There are several studies concerning the control of microbial activity in prepared food using active packaging. The objective of this work was to develop the best formulation of active biofilms and to evaluate their performance in sliced bread packaging. Simple and composite films were developed, based on gelatin, gluten and diferent types of starch (cassava, modified cassava, waxy maize and modified waxy maize starches). Films were characterized for their permeability to water vapor (WVP), permeability to oxygen (PO2), solubility in water (SOL) and mechanical properties (tensile strengh -TS and elongation -ELO), using different concentrations of the macromolecules and plasticizer (glycerol). Films containing 10g of gelatin and 5% of glycerol (based on protein dry mass) and films with 5g of gluten, 32.5 mL of ethanol/mL of solution, at pH of 5 and 20% glycerol (based on protein dry mass) were selected for the manufacture of composite films.Composite films of gluten/gelatin (GLU/GEL), cassava starch/gelatin (CS/GEL), modified cassava starch/gelatin (MCS/GEL), waxy maize starch/gelatin (WMS/GEL), modified waxy maize starch/gelatin (MWMS/GEL), at 1:1, 1:4 and 4:1 ratios and starch/gelatin/gluten (S/GLU/GEL) at 1:1:1 ratio were manufactured and characterized. Composite films presented lower WVP and larger RT than simple gelatin film. Composite films based on MCS/GEL, GLU/GEL and MCS/GLU/GEL at 4:1, 4:1 and 1:1:1 ratios, respectively, were used for the development of active films usine, potassium sorbate (PS) at 2 and 4%, in volume concentrations. Addition of PS promoted increase in WVP, SOL and ELO as well as a decrease in TS, when compared to films with no added anti-microbial agent. Surface of the composite films were smooth and homogeneous except for the MCS/GLU/GEL with 4% PS. Five microorganisms were selected, for the diffusion halo assay: (i) Eurotium chevalieri; (ii) Eurotium amstelodami; (iii) Wallemia sebii; (iv) Penicillium raIstrickiI e (v) Cladosporium sp. Films that presented the best efficiency on reduction of microbial growth as well as best permeability and mechanical properties were: (i) MCS/GEL and (ii) GLU/GEL, both with 2% of added PS. The active films selected for the diffusion halo assay presented two loss tangent (tan) values, an indication of two Tgs. GLU/GEL films, with no sorbate and with 2% sorbate, were used in sliced bread packaging. Each slice was placed between two sheets of active film and the whole bread was stored inside a low density polyethylene bag. The active films promoted an increase in firmness and a decrease in both moisture content and water activity of the slices. The microbial analysis, storage with active films showed no significant difference from the control sample. By the seventh day of storage the accumulated amout of, potassium sorbate liberated by the film achieved the limit set by Brazilian legislation.

Key-words: gelatin, gluten, modified cassava starch, potassium sorbate, active package.

1

1.0 Introdução

Nos últimos anos, em virtude do impacto ambiental, tem crescido o

interesse em substituir os polímeros sintéticos, que hoje são muito utilizados como

material de embalagem, por materiais biodegradáveis e provenientes de fontes

renováveis. O consumidor tem buscado, cada vez mais, alimentos com maior

qualidade e com vida de prateleira prolongada, sem desconsiderar os danos do

produto ao meio ambiente.

Inúmeras são as técnicas utilizadas na conservação dos alimentos,

destacando-se dentre os processos químicos: o uso de aditivos químicos, a salga

e a defumação; e dentre os principais processos físicos: a pasteurização, a

refrigeração, entre outros. De modo geral, empregam-se métodos combinados,

sendo necessária uma proteção física por meio de uma embalagem adequada

(SOBRAL et al., 1997).

A utilização de embalagens rígidas, como latas metálicas ou recipientes de

vidro, é muito disseminada, pois possuem excelentes propriedades mecânicas e

de barreira ao vapor de água e gases, garantindo uma proteção estrutural

(mecânica). É comum, também, a utilização de filmes flexíveis, geralmente

sintéticos (plásticos). Apesar de garantirem uma proteção desejada para diversos

tipos de alimentos, essas embalagens acarretam sérios problemas ambientais

(SOBRAL et al., 1997).

O Brasil produz cerca de 240 mil toneladas de lixo por dia, valor inferior ao

produzido nos Estados Unidos (607.000 t/dia), mas bem superior ao de países

como a Alemanha (85.000 t/dia) e a Suécia (10.400 t/dia). Desse total, o destino

da maior parte é o lixão a céu aberto. Para o Instituto de Pesquisas Tecnológicas

(IPT), são poucas as prefeituras do país que possuem equipes e políticas públicas

específicas para o lixo. Quando não tratado, constitui-se em sério problema

sanitário. As possíveis soluções para a questão são: a criação de aterros

sanitários em locais apropriados, o programa de coleta seletiva de lixo e

Introdução

2

reciclagem, entre outras. A produção de materiais biodegradáveis oferece uma

solução mais viável para materiais plásticos (VILPOUX; AVEROUS, 2001).

Estudos visando a solução desses problemas vêm sendo realizados desde

a década de 1970, quando surgiram as primeiras pesquisas, misturando-se

substâncias biodegradáveis (como o amido) com polímeros sintéticos, tendo como

finalidade a elaboração de embalagens degradáveis. Apesar delas terem sido

declaradas “biodegradáveis”, o teor de amido era pequeno e este era o único

componente capaz de ser consumido pelos microorganismos. Na realidade, esses

materiais eram desintegráveis e não resolviam o problema, uma vez que os

fragmentos dos polímeros sintéticos continuavam a acumular-se no ambiente

(DAVIS; SONG, 2006 citado por SAKANAKA, 2007). Assim, a saída era buscar

outras fontes de polímeros que fossem 100% assimiláveis por microorganismos,

para serem considerados efetivamente biodegradáveis. Uma das alternativas tem

sido o desenvolvimento de filmes comestíveis e/ou biodegradáveis, que servem

como embalagem, ou diretamente sobre os produtos, como cobertura ou

recobrimento (KESTER; FENNEMA, 1986).

Em vários países, é possível encontrar produtos com essa tecnologia.

Todavia, no Brasil a técnica é inovadora e está começando a ser utilizada por

algumas empresas do setor. Em 2004, a APOTEK, tornou-se a primeira empresa

brasileira na fabricação desse tipo de embalagem, servindo o setor farmacêutico.

Segundo a empresa, o plástico comum é formado por cadeias moleculares

compostas por átomos de carbono e hidrogênio ligados fortemente entre si, o que

torna o material difícil de ser digerido pelos microorganismos presentes no

ambiente. Durante o processo de fabricação dos plásticos biodegradáveis, é

inserido um aditivo (PQDH) que não modifica as propriedades do material,

entretanto, faz com que fatores como luz, umidade, temperaturas elevadas e

stress do material fragilizem as ligações entre os átomos. Com as ligações entre

os átomos enfraquecidas, as moléculas do plástico começam a transformar-se em

fragmentos mais facilmente digeríveis por microorganismos. Após as ligações se

Introdução

3

quebrarem, átomos de carbono e hidrogênio são liberados no ambiente. Estes, ao

entrarem em contato com o oxigênio, formam novas moléculas de água e dióxido

de carbono, ou seja, o plástico biodegradável desaparece completamente sem

deixar resíduos nocivos (APOTEK, 2006).

As vantagens dos filmes ou coberturas comestíveis e/ou biodegradáveis

têm despertado interesse em função de suas possibilidades: controlar a migração

de vapor d’água, a permeabilidade ao oxigênio e dióxido de carbono e a migração

lipídica de um sistema alimentício. Além disso, podem ser introduzidos aditivos ao

filme, como: antioxidantes, aromas e agentes antimicrobianos, melhorando assim

a integridade do produto (KESTER; FENNEMA, 1986).

Atualmente, muitas pesquisas começam a enfocar o desenvolvimento de

tecnologias que controlam o crescimento indesejável de microorganismos, com

garantia de segurança por incorporação de substâncias inibitórias dentro do

material de embalagem, denominadas embalagens ativas. Esse conceito de

embalagem é inovador. É definida como um tipo que atua nas condições de

armazenamento estendendo a vida de prateleira e melhorando a segurança ou

propriedades sensoriais, ao mesmo tempo em que mantém a qualidade do

produto (SOARES et al., 2002). A adição de substâncias antimicrobianas, visto

que causa a redução da taxa de crescimento de microorganismos, permite

estender a fase “lag” do microorganismo alvo, prolongando a vida de prateleira do

produto.

Com o aumento do mercado por produtos minimamente processados, de

conveniência, que mantenham as características sensoriais mais próximas dos in

natura, torna-se necessário o desenvolvimento de novas embalagens com funções

especiais. Assim, nos últimos anos, vêm crescendo os estudos sobre embalagens

ativas, com o objetivo de estender a vida de prateleira e melhorar a segurança e

as características sensoriais, ao mesmo tempo em que mantém a qualidade do

produto por meio de uma interação desejável entre a embalagem e o alimento

(DEVLIEGHERE; VERMEIREN; DEBEVERE, 2004).

Introdução

4

Os filmes comestíveis têm recebido interesse na indústria de alimentos em

razão das vantagens que os diferenciam das embalagens não-comestíveis. A

biodegradabilidade inerente ao filme é uma de suas vantagens. Em razão de seus

aspectos ambientais, os filmes biodegradáveis apresentam-se como alternativas

para sistemas de embalagens, sem os prejuízos ambientais dos materiais

sintéticos não degradantes. Futuramente, substituirão total ou parcialmente grande

parte das embalagens sintéticas (KESTER; FENNEMA, 1986).

O objetivo deste trabalho foi determinar a melhor formulação para a

obtenção de biofilmes à base de gelatina, glúten e amido (milho ceroso, milho

ceroso modificado, mandioca ou mandioca modificado) isoladamente e em

combinação, em proporções diversas. À formulação selecionada foi adicionada o

agente antimicrobiano (sorbato de potássio) na concentração de 2 e 4% (p/v). O

melhor biofilme ativo desenvolvido foi aplicado no acondicionamento de pães de

forma.

5

2.0 Revisão Bibliográfica

2.1 Filmes e coberturas comestíveis e/ou biodegradáveis

Coberturas são finas camadas de material aplicadas e formadas diretamente

na superfície do produto (Figura 2.1A), enquanto que filmes são estruturas

fabricadas separadamente (Figura 2.1B) e então utilizadas no produto

(KROCHTA; DE MULDER-JOHNSTON, 1997). Eles podem ser classificados em

comestíveis e/ou biodegradáveis, dependendo dos constituintes utilizados para

sua produção e, também, da quantidade das substâncias empregadas (SHIN,

1996). A utilização destes tipos de filmes pode ser justificada com base nas suas

possibilidades funcionais (KESTER; FENNEMA, 1986): controlar a migração de

vapor d’água, a permeabilidade ao oxigênio e ao dióxido de carbono e a migração

lipídica em um sistema alimentício. Além disso, podem ser introduzidos aditivos ao

filme, tais como antioxidantes, aromas e agentes antimicrobianos, melhorando

com isso a integridade do produto.

A B

Figura 2.1. Desenho esquemático e foto, respectivamente, de: (A) cobertura (ASSIS e

LEONI, 2003) e (B) biofilme (SIQUEIRA, 2004).

A utilização de coberturas não é recente. Nos séculos XII e XIII, os chineses

aplicavam revestimentos à base de ceras em laranjas e limões com o intuito de

retardar a desidratação (HANDERBURG, 1967 citado por KESTER; FENNEMA,

1986). No século XVI, os europeus protegiam a carne da perda de umidade por

Revisão Bibliográfica

7

meio da aplicação de gordura animal (LABUZA; CONTRERAS, 1981).

Atualmente, filmes e coberturas são usados numa variedade de aplicações, como:

revestimento para lingüiça, coberturas de chocolate para nozes e frutas, e

coberturas de ceras para frutas e vegetais. Entretanto, as informações técnicas

envolvidas estão longe das adequadas, deixando os tecnologistas de alimentos

com a incumbência de desenvolver filmes e revestimentos específicos para cada

tipo de alimento (DONHOWE; FENNEMA, 1994).

Coberturas e filmes comestíveis não pretendem, e nem sempre têm a

capacidade para, substituir uma embalagem sintética não comestível com o intuito

de prolongar a estocagem dos alimentos. Sua utilização está relacionada à

capacidade de agir como um adjunto para promover maior qualidade, estendendo

a vida de prateleira, e possibilitar a economia com materiais de embalagem

(KESTER; FENNEMA, 1986).

Visto que atuam tanto como embalagens quanto como componentes do

alimento, as coberturas e filmes devem cumprir alguns requisitos específicos para

seu uso, como: boa qualidade sensorial; propriedades de barreiras e mecânicas

eficientes; estabilidade bioquímica, físico-química e microbiológica; inocuidade,

não poluente; e de processamento simples e de baixo custo (DEBEAUFORT;

QUEZADA-GALLO, VOILLEY, 1995).

A elaboração de biofilmes envolve a utilização de diversos componentes,

cada qual com sua finalidade específica. Essas formulações são constituídas de,

pelo menos, um agente formador de filme (macromoléculas), solvente (água,

etanol, água/etanol etc.), plastificante (glicerol, sorbitol, etc.), agente ajustador do

pH (ácido acético, NH4OH, etc) e aditivos (aromas, vitaminas, antimicrobianos,

etc).

Para a formação de filmes e coberturas, é necessária a utilização de, no

mínimo, um constituinte capaz de formar uma matriz contínua e de coesão

adequada, sendo esse uma macromolécula (GUILBERT; CUQ; GONTARD, 1997).

Os principais constituintes utilizados são: proteínas (caseína, proteínas do soro do


8

leite, proteína do milho-zeína, proteína do trigo-glúten, colágeno e gelatina),

polissacarídeos e seus derivados (derivados da celulose, quitosana, amido,

alginatos, pectinas e gomas) e lipídios (monoglicerídeos, ácidos graxos, ceras

naturais etc.) (GUILBERT, 1986).

Os filmes elaborados a partir de polissacarídeos ou proteínas possuem

excelentes propriedades mecânicas e ópticas, porém são sensíveis à umidade e

apresentam alto coeficiente de permeabilidade ao vapor d’água. Ao contrário, os

filmes compostos de lipídios apresentam boas propriedades de barreiras ao vapor

d’água, mas são opacos e pouco flexíveis (GUILBERT, 1986; GALLO et al., 2000).

Os solventes utilizados na elaboração de filmes comestíveis, normalmente,

são: a água, o etanol ou a combinação de ambos (KESTER; FENNEMA, 1986). A

macromolécula ao dissolver-se forma uma dispersão coloidal, isto é, um sistema

formado por moléculas dispersas que têm dimensões muito maiores que as

moléculas do solvente (XIONG, 1994). Portanto, a solubilização da macromolécula

está relacionada à sua capacidade de interagir com o solvente utilizado, sendo

este um aspecto determinante na formação de filmes, visto que a total solubilidade

é necessária para o processo de sua formação.

Os plastificantes são substâncias que, quando adicionados a outro material,

provocam mudanças nas suas propriedades físicas, químicas e mecânicas (DE

McHUGH; KROCHTA, 1994a). Além disso, em sua maioria, apresentam caráter

hidrofílico e, por serem normalmente moléculas pequenas, são facilmente

acoplados entre as cadeias poliméricas em virtude de sua habilidade de reduzir a

formação de pontes de hidrogênio entre as cadeias, causando um aumento do

volume livre ou da mobilidade molecular do polímero (BODMEIER; PAERATAKUL,

1997). A incorporação de plastificante em biopolímeros modifica a organização

molecular tridimensional da rede, diminui as forças de atração intermoleculares e

aumenta o volume livre do sistema, melhorando a flexibilidade e extensibilidade

dos filmes (CUQ et al., 1996a; SOTHORNVIT; KROCHTA, 2000).


9

Os efeitos do tipo de plastificante, bem como a escolha de sua

concentração é complexa, já que, com o aumento da mobilidade da cadeia, os

coeficientes de difusão também aumentam, resultando numa maior

permeabilidade aos gases e ao vapor de água (FAIRLEY et al., 1996). Entre os

plastificantes utilizados em biofilmes, podem ser encontrados mono-, di- e

oligossarídeos (glicose e sacarose), polióis (glicerol, sorbitol, derivados da

glicerina e gliceróis), lipídios (ácidos graxos saturados, monoglicerídeos e

derivados de éster, fosfolipídios e surfactantes) e triacetina (GUILBERT, 1986;

FAKHOURI; BATISTA; GROSSO, 2003; BERTAN et al., 2003).

Vários estudos confirmam o efeito do pH na solubilidade de diferentes

macromoléculas nos processos de formação de filme, sendo esse um aspecto

fundamental em suas propriedades. Por vezes, pode tornar-se necessário um

ajuste do pH da solução para que assim uma matriz homogênea possa vir a ser

constituída, ou seja, uma maior solubilidade da macromolécula seja atingida

(ARVANITOYANNIS; NAKAYAMA; AIBA, 1997). O pH da solução afeta a natureza

e a distribuição de cargas das proteínas, uma vez que os grupos polares são, na

maioria dos casos, encontrados na região externa das proteínas, enquanto os

apolares geralmente na região interna (WERTZ; SCHERAGA, 1978). Em geral, o

ponto isoelétrico (pI) da proteína — quando uma molécula apresenta igual número

de cargas positivas e negativas — constitui-se no pH de menor solubilidade

(SGARBIERI, 1996). Nesse ponto, a interação proteína-proteína aumenta em

razão de as forças eletrostáticas das moléculas serem mínimas, provocando

menor interação da água com as moléculas de proteína. Dessa forma, propicia

uma condição favorável para que as moléculas se aproximem e se agreguem

podendo ocorrer a precipitação (HALL, 1996). Em valores de pH acima ou abaixo

do pI, as moléculas de proteínas possuem cargas positivas ou negativas em

excesso, que interagem com as moléculas de água contribuindo para sua

solubilização (SGARBIERI, 1996).

O método de fabricação de filmes de materiais baseados em biopolímeros

pode ser de dois tipos: úmido ou seco. O processo úmido requer a dispersão da


10

macromolécula produzindo uma solução formadora de filme e tem sido

extensivamente estudada e aplicada para produzir filmes comestíveis,

biodegradáveis e coberturas (KESTER; FENNEMA, 1986). O processo de

produção dos filmes a partir de solução formadora de filme envolve uma primeira

etapa de solubilização da macromolécula (na água, no etanol, em solução de

ácido acético e entre outros), em cujo solvente podem ser incorporados diversos

aditivos (plastificantes, agentes reticulantes, etc.); na segunda etapa, essa solução

é espalhada sobre um suporte e, usualmente, submetida à secagem (CUQ et al.,

1995). O processo seco, por sua vez, baseia-se nas propriedades termoplásticas

de alguns biopolímeros (principalmente amido e proteínas) em condições de baixo

conteúdo de umidade e tem sido aplicada com sucesso por usar tecnologia

comum de processo de fusão, como a extrusão (FRITZ et al., 1994).

As características finais dos filmes comestíveis e/ou biodegradáveis são

resultantes de inúmeros parâmetros, tais como: natureza química e concentração

da macromolécula e demais constituintes (solvente, plastificante, etc.); pH;

condições de desnaturação (no caso de proteínas); tipo de suporte utilizado;

condições de secagem e condições ambientais (temperatura e umidade) para

aplicação (CARVALHO, 2002).

2.2 Características dos filmes

Na produção de biofilmes, diversas características, entre as quais se

destacam a espessura, textura, sabor, aroma, cor e opacidade, são importantes

para a escolha da aplicação e também aceitação do produto pelo consumidor.

2.2.1 Espessura

Segundo Gennadios et al. (1993), o controle da espessura dos filmes é

importante para sua uniformidade, repetibilidade das medidas e validade das

comparações entre as propriedades dos biofilmes. A espessura deve ser

estabelecida levando-se em conta a utilização final do filme, que dependerá do


11

alimento a ser embalado (SARMENTO, 1999). Esse controle é difícil, sobretudo

nos processos de produção do tipo casting. Quando se trabalha com alta

concentração de proteína na solução formadora de filme, tal solução se torna

muito viscosa, dificultando seu espalhamento e, conseqüentemente, o controle da

espessura, além de possibilitar a formação de bolhas na solução, em razão da

propriedade de formação de espuma presente nas proteínas. Quando se controla

a espessura, seja fixando-se a gramatura ou a alíquota da solução no suporte,

deve levar-se em consideração as características das formulações (SOBRAL,

1999).

Gennadios et al. (1996) desenvolveram biofilmes à base de ovoalbumina a

partir de soluções formadoras de filme com concentração variável de plastificante,

controlando o nível da solução no suporte. Os autores observaram que a

espessura variou de 0,098 a 0,103 mm. Cuq et al. (1996b) observaram que a força

na ruptura e a permeabilidade ao vapor de água aumentaram linearmente com a

espessura entre 0,010 e 0,055 mm nos biofilmes de proteínas miofibrilares de

sardinha do Atlântico.

2.2.2 Aspecto visual

De forma geral, está relacionada à aparência do filme e pode ser avaliada

por observações visuais e tácteis. O filme deve apresentar uma superfície

contínua e homogênea, ou seja, não deve apresentar fissuras após o processo de

secagem, nem partículas insolúveis ou poros abertos (CARVALHO, 1997).

2.2.3 Sabor e aroma

Uma vez que os filmes e/ou coberturas comestíveis estarão em contato

com os alimentos, é desejável que apresentem características sensoriais neutras,

de modo que não alterem as propriedades dos alimentos. Filmes à base de

hidrocolóides possuem geralmente características sensoriais mais neutras que os

formados de lipídios ou derivados, que podem apresentar sabor residual


12

(GONTARD; GUILBERT, 1996). Atualmente, existem estudos sobre filmes que

interagem de maneira desejável com o alimento, melhorando suas propriedades

sensoriais.

Pires et al. (2006) desenvolveram filmes de base celulósica, ao qual foi

adicionado aroma de morango em diversas concentrações (25, 50 e 75%). Esses

filmes, em suas diversas concentrações, foram colocados em contato com 1 litro

de leite pasteurizado. Os autores realizaram análises físico-químicas (gordura,

densidade, acidez titulável, pH, extrato seco total e desengordurado),

microbiológicas (contagem de mesófilos aeróbicos totais, coliformes totais,

coliformes termotolerantes e presença/ausência de Listeria sp) e análise sensorial,

nos tempos 0, 1, 2, 3 dias de armazenamento. Não houve diferença significativa

(p≤0,05) entre as amostras quanto às análises físico-químicas e microbiológicas

em nenhum dos tempos avaliados. Na análise sensorial, as amostras

aromatizadas não diferiram entre si (p≥ 0,05) para os atributos aroma e impressão

global, sendo estas mais aceitas que a amostra controle.

Gouveia et al. (2006) desenvolveram filmes ativos à base de acetato de

celulose incorporados com aroma de azeite, limão, pizza e bacon com o objetivo

de melhorar as propriedades sensoriais da ricota e torná-la um produto de maior

aceitação. Os autores avaliaram a aceitabilidade das amostras por 82 provadores

após 12 horas (1/2 dia) e 264 horas (11 dias). Os resultados mostraram que, após

12 horas de armazenamento, 95,1% dos provadores consideraram existir

diferença entre as amostras em relação à impressão global e 4,9% não

discriminaram as amostras em relação à aceitação, considerando-as semelhantes.

Na análise realizada após 264 horas, 97,6% diferiram as amostras entre si e

apenas 2,4% consideraram-nas semelhantes, sendo as amostras mais aceitas

aquelas aromatizadas com pizza e bacon, enquanto a ricota controle foi a menos

aceita. Os autores concluíram que os filmes aromatizados são inovadores e tem

grande potencial de aplicação na área de alimentos para criação de novos

produtos.


13

2.2.4 Cor e opacidade

Os filmes devem apresentar opacidade e coloração atrativas e não devem

sofrer alteração de cor com o tempo de armazenamento, a fim de que a aceitação

do produto acondicionado não seja prejudicada. A transparência e a opacidade do

polímero são conseqüências da morfologia ou estrutura química (CHEN, 1995).

Quando a transparência é essencial para a aplicação de cobertura na superfície

de um determinado produto, o uso de material lipídico, como cera de carnaúba ou

cera de abelha, deve ser limitado (GONTARD et al., 1994).

Akin e Hasirci (1995) observaram a mudança da coloração de amarelo

palha para laranja vivo nos primeiros minutos de reação entre o glutaraldeído e a

solução de gelatina. Butler et al. (1996) observaram que os filmes à base de

quitosana apresentam uma coloração amarelada, que é acentuada à medida que

a espessura aumenta. Cao, Fu e He (2007) desenvolveram filmes compostos de

isolado protéico de soja e gelatina (respectivamente) nas proporções 10:0; 8:2;

6:4; 4:6; 2:8 e 0:10. Os autores observaram que os compostos desenvolvidos com

maior proporção de isolado protéico de soja apresentaram-se mais opacos, em

virtude da presença de partículas insolúveis.

2.2.5 Propriedades dos filmes

Os filmes comestíveis podem apresentar diferentes características e

propriedades físico-químicas e mecânicas dependendo da formulação e do

processo de fabricação.

2.2.5.1 Permeabilidade ao vapor de água (PVA)

A proteção do alimento contra alterações provocadas pelo meio ambiente,

desde a sua obtenção até chegar ao consumidor, é uma das preocupações mais

importantes na atualidade (MARTIN-POLO et al., 1992). A migração de vapor de

água é um dos principais fatores de alteração da qualidade sensorial e da

estabilidade da estocagem (KAMPER; FENNEMA, 1984; GONTARD et al., 1994;


14

CHEN, 1995). A cinética enzimática ou reações químicas, propriedades de textura

e estabilidade microbiana e física de produtos alimentícios são fortemente

influenciadas pelo conteúdo de umidade e podem mudar drasticamente a

qualidade do alimento durante o processamento e estocagem. Assim, muitas

vezes, é necessário limitar a migração de umidade com substâncias capazes de

prevenir a transferência da molécula de água, com o intuito de maximizar a vida

útil do produto (MARTIN-POLO et al., 1992; GONTARD et al., 1996).

A transferência de água em materiais poliméricos ocorre por difusão

molecular. Esse processo envolve três etapas: (i) movimento do permeante para a

superfície da estrutura do filme e sua absorção na matriz polimérica; (ii) difusão

através de “espaços livres” formados pelo movimento da cadeia polimérica do

filme ou na própria fabricação e (iii) dessorção a partir da superfície do filme e sua

conseqüente dispersão no ar (KESTER; FENNEMA, 1986).

O processo de difusão em um sistema polímero/solvente depende do

tamanho, natureza química, configuração da molécula penetrante e do movimento

molecular da cadeia do polímero na matriz do filme (KESTER; FENNEMA, 1986).

Em geral, moléculas lineares difundem mais rapidamente que as ramificadas ou

cíclicas. Pequenas diferenças na forma causam mudanças importantes na

permeabilidade (TORRES, 1994).

Diversos fatores podem afetar a permeabilidade ao vapor de água em

biofilmes, incluindo-se a concentração de plastificante, a morfologia do biofilme, as

características das moléculas permeantes, as interações entre cadeias poliméricas

e o grau de reticulação (KESTER; FENNEMA, 1986).

Zactiti e Kieckbusch (2006) desenvolveram filmes à base de alginato, em

que foram adicionadas quantidades diferentes de cálcio (2, 3, 4, 5 e 7%). Os

autores observaram uma diminuição significativa na permeabilidade ao vapor de

água à medida que aumentava a concentração de cálcio de 2% (11,93

gmm/m2diakPa) para 3% (6,89 gmm/m2diakPa). Os autores explicaram que os

íons cálcio promovem uma reticulação na matriz, a mobilidade das cadeias de


15

alginato diminui, reduzindo dessa maneira a difusibilidade da água através do

filme, levando a uma diminuição da permeabilidade ao vapor de água. Rhim

(2004) estudou o efeito da reticulação de filmes de alginato por meio da imersão

em soluções de cloreto de cálcio em diversas concentrações (1, 2, 3 e 5% g

cálcio/mL de solução). Com exceção da primeira condição (1%), as demais

causaram uma diminuição da permeabilidade ao vapor de água. Talja et al. (2007)

estudaram o efeito da variação no teor de diferentes polióis (glicerol, xilitol e

sorbitol) nas propriedades físicas e mecânicas de filmes de amido de mandioca.

Os autores observaram que o aumento da concentração dos polióis causou

aumento na permeabilidade ao vapor de água. Eles explicaram que o aumento da

concentração de plastificante leva a uma elevação da permeabilidade ao vapor de

água em virtude do aumento da difusão da água através do filme, ocasionado por

sua maior hidrofilicidade. Os mesmos autores também observaram que a elevação

da umidade relativa (33, 54 e 76%) durante os testes, causou aumento na

permeabilidade ao vapor de água.

Talja et al. (2008) estudaram o efeito da incorporação de várias misturas

binárias (1:1) de polióis (glicerol, sorbitol e xilitol) na concentração de 20-50%, nas

propriedades físicas e mecânicas de filmes à base de amido de batata (50-80% de

sólidos), armazenado em ambientes com diferentes umidades relativas (33; 54 e

76%). Os autores observaram uma diminuição da resistência à tração e aumento

na porcentagem de elongação com o aumento da concentração da misturas dos

polióis nos filmes, sendo esse efeito intensificado com a elevação da umidade

relativa.

2.2.5.2 Permeabilidade a gases (PO2)

A transferência de oxigênio do meio ambiente para o alimento tem grande

importância na qualidade deste e em sua vida de prateleira. O oxigênio é

responsável por várias reações degradativas nos alimentos, modificando as

características sensoriais e nutricionais (SOTHORNVIT; KROCHTA, 2000), e pode

influenciar de forma significativa a sua estabilidade durante o armazenamento. A


16

deterioração em razão da permeabilidade ao oxigênio ocorre em muitos produtos

alimentícios, envolvendo a oxidação de lipídios, vitaminas, compostos de sabor e

pigmentos (KESTER; FENNEMA, 1986).

A deterioração dos alimentos promovida pela oxidação e respiração pode

ser controlada por meio do uso de filmes comestíveis e/ou biodegradáveis,

estando diretamente relacionada à permeabilidade ao oxigênio e ao gás

carbônico. Oxigênio e gás carbônico são dois gases que estão ligados à

conservação de frutas frescas e de vegetais, bem como alimentos contendo

lipídios (CHEN, 1995). O desenvolvimento de filmes e coberturas comestíveis com

permeabilidade seletiva à gases é potencialmente interessante no controle da

respiração causando um efeito de atmosfera modificada, promove um aumento na

preservação das frutas (GONTARD et al., 1996).

Dole et al. (2004) estudaram as propriedades de transferência de gases em

filmes à base de amido de batata. Os autores observaram que o aumento da

umidade relativa (0 para 50%) causou aumento na permeabilidade ao oxigênio

(0,04 para 5%) e ao gás carbônico (0,08 para 5,5%). Os autores justificaram esse

comportamento em virtude do efeito plastificante da água, que aumentou o

número de espaços livres e, conseqüentemente, propiciou aumento da difusão de

gases. Sothornvit e Pitak (2007) estudaram a permeabilidade ao oxigênio e

propriedades mecânicas de filmes de compostos de farinha de banana (4; 6 e 8%)

e pectina (0 e 1%) plastificados com glicerol (30 e 50%). Os autores observaram

que apesar de os filmes confeccionados com biopolímeros hidrofílicos

apresentarem boas barreiras ao oxigênio, o aumento na concentração de farinha

de banana provocou aumento na permeabilidade ao oxigênio. Os autores

explicaram que com o aumento do conteúdo de farinha de banana, há um

aumento do conteúdo de pectina e amido nos filmes, o que teoricamente por

apresentar um caráter hidrofílico, causaria diminuição na permeabilidade ao

oxigênio, fato que não ocorreu. Esse fato pode ter ocorrido pela presença de

açúcar na composição da farinha de banana, que funciona como plastificante e,

provavelmente, influenciou nas propriedades finais dos filmes.


17

2.2.5.3 Propriedades mecânicas

As principais propriedades mecânicas dos filmes são a resistência à tração

e a porcentagem de elongação. A primeira é expressa pela tração máxima

desenvolvida pelo filme no teste. A segunda é a habilidade do filme em se

estender. Os filmes obtidos devem ser resistentes à ruptura e à abrasão, fazendo

com que o alimento não perca sua integridade e proteção por manuseio e

transporte. Além disso, ele deve possuir flexibilidade suficiente para adaptar-se a

eventuais deformações no alimento sem dano mecânico (GONTARD et al., 1994).

Filmes comestíveis preparados à base de polissacarídeos e hidrocolóides

são resistentes, enquanto que os filmes de lipídios se caracterizam por apresentar

baixa resistência mecânica (KESTER; FENNEMA, 1986). As propriedades

mecânicas estão diretamente relacionadas à natureza do material formador de

filme utilizado e à coesão da estrutura da matriz polimérica, que está ligada à

distribuição e concentração inter e intramoleculares na estrutura formadora de

filme entre as cadeias (CUQ; GONTARD; GUILBERT, 1998).

Famá et al. (2005) desenvolveram filmes de amido de mandioca contendo

sorbato de potássio, plastificados com glicerol. Os autores concluíram que as

propriedades mecânicas desse tipo de filme foram afetadas pela adição do

sorbato, que causou desestruturação da rede. Talja et al. (2007), em pesquisa

com o mesmo tipo de filme, observaram que o aumento da concentração de

plastificante (20-50%) e da umidade relativa (33, 54 e 76%) causou diminuição da

resistência à tração. Zactiti e Kieckbusch (2006) desenvolveram filmes de alginato,

que foram submetidos ao tratamento com cálcio utilizando diversas concentrações

de íons na solução. A tensão na ruptura apresentou melhora significativa ao

aumentar a concentração de cálcio, sendo menor com 2% do íon (85.67 MPa) e

maior com 7% (160,26 MPa). A elevação da tensão na ruptura após o tratamento

com cálcio pode ser explicada pelo desenvolvimento de crosslinking entre os

grupos carboxílicos presentes no alginato e os íons cálcio. Os mesmo autores


18

observaram uma diminuição na porcentagem de elongação dos filmes tratados

com cálcio.

2.2.5.4 Solubilidade em água

A solubilidade em água é uma propriedade importante para os filmes

comestíveis no que se refere ao seu emprego, pois a maioria das aplicações

requer insolubilidade nesse solvente para manter a integridade do produto

(PEREZ-GAGO; KROCHTA, 2001). Porém, no caso de produtos desidratados que

devem sofrer uma hidratação prévia ao consumo (arroz semi-prontos, sopas

instantâneas, entre outros) a solubilidade em água é requerida (PEREZ-GAGO;

KROCHTA, 2001).

A solubilidade dos filmes depende dos componentes de sua estrutura.

Proteínas com alta massa molecular são geralmente insolúveis ou pouco solúveis

em água. Em virtude disso, essas moléculas são interessantes, uma vez que

podem formar filmes resistentes à água (CUQ et al., 1995). A solubilidade das

proteínas depende muito do número e do arranjo de cargas na molécula, que

dependerá da composição de aminoácidos (SGARBIERI, 1996).

Cuq et al. (1996b) estudaram a influência da umidade relativa e temperatura

sobre as propriedades de barreira, mecânica e de cor dos biofilmes de proteína

miofibrilar de sardinha plastificados com sacarose. Os autores não observaram

diferença significativa na solubilidade dos biofilmes em água. Zactiti e Kieckbusch

(2006) desenvolveram filmes de alginato tratados com diversas concentrações de

cálcio, não observando diferença significativa na solubilidade em água dos filmes

tratados. Vicentini (2003), em estudo com filmes de fécula de mandioca, observou

que o aumento na espessura dos filmes provocou redução da solubilidade em

água.


19

2.3 Filmes ativos

Atualmente, há no setor alimentício, uma busca crescente por métodos de

conservação que provoquem menos alterações nas qualidades físico-químicas e

sensoriais dos alimentos e que contenham uma quantidade mínima de aditivos. A

resposta da indústria tem sido investir em novas tecnologias que atendam a essa

demanda, principalmente com o desenvolvimento de novas embalagens. Há

poucos anos atrás, as embalagens nos alimentos exerciam somente a função de

marketing e de proteção passiva. Entretanto, esse conceito vem se modificando e

o papel da embalagem como fator ativo na conservação, na manutenção da

qualidade e na segurança dos alimentos vem aumentando nos últimos anos.

Exemplos disso são as embalagens antimicrobianas, que são aquelas capazes de

eliminar ou inibir microorganismos deteriorantes e/ou patogênicos, atuando como

mais uma barreira (VERMEIREN et al., 1999).

As embalagens ativas têm sido utilizadas em uma variedade de produtos,

como pães, biscoitos, bolos, pizzas, massas frescas, queijos, carnes, frutas, entre

outros. Cada um desses produtos tem mecanismos diferentes de deterioração,

sendo necessário seu conhecimento para que se possa selecionar a embalagem

ativa (VERMEIREN et al., 1999).

A embalagem antimicrobiana é uma forma promissora de embalagem

comestível ativa. Embora, a maioria dos produtos alimentícios perecíveis

embalados seja esterilizada por meio de processos térmicos ou possuam um

sistema de auto-proteção, a contaminação microbiana pode ocorrer na superfície

ou em área danificada por defeitos na embalagem ou durante o armazenamento

após sua abertura. A incorporação das substâncias antimicrobianas no material da

embalagem pode controlar a contaminação por meio da redução da taxa de

crescimento e do máximo crescimento populacional, permitindo, estender a fase

“lag” do microorganismo alvo, prolongando a vida de prateleira e mantendo a

segurança do produto (HAN, 2000). Desse modo, filmes e coberturas com agentes

antimicrobianos fornecem uma barreira ativa adicional como obstáculo ao


20

crescimento desse tipo de microorganismo (OZDEMIR; FLOROS, 2001). Essas

embalagens apresentam-se de várias formas: (i) adição de sachês no interior da

embalagem contendo antimicrobianos; (ii) adsorção de antimicrobianos na

superfície do polímero; (iii) imobilização do antimicrobiano nos polímeros por

ligações iônicas ou covalentes e (iv) uso de polímeros com atividade

antimicrobiana (APPENDINI; HOTCHKISS, 2002).

A liberação de aditivos por intermédio de embalagens ativas aumenta a

segurança do consumidor, pois esses compostos, em vez de serem diretamente

adicionados ao alimento, são liberados de forma controlada em menores

quantidades, e apenas onde sua presença é requerida (SOARES et al., 2002).

As substâncias químicas com atividade antimicrobiana geralmente

incorporadas no material de embalagem são: ácidos e sais orgânicos (sorbato de

potássio e cálcio, ácido propiônico, ácido acético, benzoato de sódio, etc); sulfitos;

nitritos e antibióticos. Os agentes antimicrobianos podem ser incorporados

inicialmente dentro do material de embalagem e migrar para o alimento por meio

de difusão, sendo, um aspecto importante, o controle da liberação e da migração

da quantidade de substância antimicrobiana (HAN, 2000).

Na escolha do antimicrobiano, deve-se considerar o tipo de alimento, método

de processamento, armazenamento e microorganismo envolvido, bem como

outras propriedades como constante de dissociação (pKa) e níveis tóxicos (JAY,

1992). Por razão de solubilidade, sabor e baixa toxicidade, os propionatos,

sorbatos e benzoatos são mais utilizados que os ácidos dos quais eles provêm

(ANTUNES; CANHOS, 1985).

Soares et al. (2002) desenvolveram filmes de acetato de celulose contendo

propionato de sódio em diversas concentrações (0, 2 e 4%) para embalar pães de

forma. Os autores observaram que os filmes ativos desenvolvidos causaram um

efeito inibitório no crescimento microbiano, sendo mais evidente na máxima

concentração, pois após 14 dias de estocagem, a fatia de pão em contato com o

filme contendo 4% de propionato de sódio mostrou 70% menos perda por


21

deterioração do produto quando comparada com as fatias em contato com filme

sem propionato de sódio. Siragusa e Dickinson (1993) também observaram que

coberturas de alginato contendo ácidos orgânicos foram efetivas na conservação

de carne, reduzindo os níveis de Listeria monocytogenes, Salmonella

thyphimurium e Escherichia coli. Ming et al. (1997) reportaram que coberturas

ativas de celulose com pediocina também inibiram o crescimento de Listeria

monocytogenes em carnes.

Fraga et al. (2005) desenvolveram embalagens ativas para a conservação do

queijo tipo gorgonzola e verificaram a migração da substância antimicrobiana

natamicina incorporada. Os queijos envolvidos com o filme apresentaram boa

inibição do crescimento superficial de fungos quando comparados ao filme sem

natamicina, durante todo período de maturação avaliado. Porém, os queijos

apresentaram um aspecto externo diferente do habitual, com uma coloração

esbranquiçada e sem a formação de casca. Pereira et al. (2005) desenvolveram

filmes laminados, incorporados de natamicina, e avaliaram sua eficiência

antimicrobiana no crescimento de fungos pelo método de formação de halo. Os

filmes incorporados de natamicina apresentaram efeito inibitório que aumentava

com a concentração do antimicrobiano no filme, em virtude da maior liberação do

antifúngico para o meio de cultura. O fungo Penicillium roqueforti apresentou maior

susceptibilidade à ação da natamicina que os fungos Aspergillus niger e

Penicillium sp, com halo de inibição maior em todas as concentrações estudadas.

Silveira et al. (2007) desenvolveram filmes de base celulósica com 25 e 70

μm de espessura, incorporados com 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 6% de ácido sórbico, que

foram produzidos e intercalados com massa de pastel sem conservante para

avaliar sua ação antimicrobiana. As massas com filmes de 25 μm de espessura,

contendo 6% de ácido sórbico apresentaram contagem de psicotróficos inferior a

massa controle (sem conservante). Ye et al. (2008) estudaram a eficácia de filmes

de Surlyn ® recobertos com quitosana e incorporados com nisina (500 UI/cm2);

lactato de sódio (0,01 g/cm2); diacetato de sódio (0,0025 g/cm2); sorbato de

potássio (0,003 g/cm2) ou benzoato de sódio (0,001 g/cm2) no controle de Listeria


22

monocytogenes em presunto, armazenados primeiramente em temperatura

ambiente por 10 dias. A cobertura contendo lactato de sódio foi mais eficiente no

controle de Listeria monocytogenes. Kristo et al. (2008) estudaram as

propriedades térmicas, mecânicas e de barreira ao vapor de água em filmes de

caseinato de sódio contendo sorbato de potássio, nisina e lactato de sódio e sua

ação contra Listeria monocytogenes. Os autores concluíram que os filmes

desenvolvidos atenderam ao objetivo de liberarem os compostos antimicrobianos,

que foi superior quando a nisina foi utilizada.

2.4 Proteínas do trigo

Glúten é o termo geral adotado para as proteínas da farinha de trigo

insolúveis em água. Ele é composto por uma mistura de moléculas polipeptídicas,

consideradas proteínas globulares. A coesividade e a elasticidade são

características do glúten que facilitam a formação de filme (POMMET et al., 2003).

Tratamentos físicos, químicos e enzimáticos têm sido aplicados na modificação

dos materiais formadores de filmes de glúten. Os sítios reativos da proteína do

glúten são susceptíveis a várias modificações que possibilitam a formação de uma

rede tridimensional com forte influência nas propriedades mecânicas e funcionais

(SUN; SONG; ZHENG, 2007).

O glúten pode ser separado em 2 frações de quantidades aproximadamente

iguais: gliadina e glutenina (KASARDA; NIMMO; KOHLER, 1971). A gliadina é

solúvel em etanol 70% e em outros álcoois como metílico, benzílico e ainda fenol.

Já, a glutenina é insolúvel em água e etanol, ligeiramente solúvel em etanol a

quente. Essa diferença de solubilidade traz problemas na obtenção de filmes,

tornando-os opacos e com partículas insolúveis (GONTARD; GUILBERT; CUQ,

1992). De acordo com Gennadios e Weller (1990), a massa molecular da gliadina

está na faixa de 20.000 a 40.000 Da e da glutenina entre 50.000 a 1.000.000 Da.

As moléculas de gluteninas apresentam-se como espirais longas, enquanto as da

gliadina são esferas pequenas.


23

A composição de aminoácidos do glúten determina suas propriedades

funcionais. Uma característica importante é seu alto conteúdo de ácido glutâmico

(cerca de 37%), existindo principalmente como glutamina. Os grupos amina

terminais da glutamina provocam extensivas pontes de hidrogênio entre as

cadeias polipeptídicas do glúten. A cistina, outro aminoácido presente, liga duas

cadeias polipeptídicas (ligação intermolecular) ou porções de uma mesma cadeia

polipeptídica (ligação intramolecular) com ligações dissulfeto (S-S) (KRULL;

WALL, 1969 citado por GENNADIOS; WELLER, 1990).

Os filmes de glúten são usualmente preparados pelo processo de casting,

em que vários fatores — incluindo tipo de glúten, plastificante (tipo e

concentração), pH, umidade relativa, solvente e concentração da proteína —

podem influenciar as propriedades finais do filme (SUN; SONG; ZHENG, 2007).

As ligações dissulfeto são importantes durante a formação de filmes de glúten.

Segundo Roy et al. (1999), o mecanismo de formação dos filmes comestíveis à

base de glúten corresponde à desnaturação da proteína por meio do aquecimento

das soluções protéicas, reduzindo as ligações dissulfídicas (S-S) existentes e

expondo grupos SH, que formam zonas de interação intramoleculares. Durante a

secagem, pela eliminação parcial do solvente, as proteínas interagem

intermolecularmente por pontes de hidrogênio, ligações hidrofóbicas e ligações

dissulfídicas que são formadas novamente por meio da oxidação pelo ar,

interligando as cadeias de proteínas e promovendo o aparecimento da matriz

filmogênica (Figura 2.2). Essa rede pouco hidratada forma então o filme, cujas

propriedades são, sobretudo, função do tipo, das atribuições e da intensidade das

ligações estabelecidas (GONTARD, 1991 citado por VICENTINI, 2003).


24

Figura 2.2. Desenho esquemático da formação de filmes de glúten (VICENTINI, 2003).

Diversos autores vêm realizando pesquisas envolvendo filmes simples e

compostos à base de glúten do trigo. Gennadios et al. (1993) estudaram o efeito

do pH em filmes de glúten e de isolado protéico de soja e sua influência em suas

propriedades. Os autores observaram que filmes de glúten preparados em pH de

1 a 3 e filmes de isolado protéico de soja em pH de 6 a 11 apresentaram maiores

valores de resistência à tração. Cherian et al. (1995) estudaram o efeito

plastificante da sacarose, glicerina e sorbitol nas propriedades termodinâmicas

dos filmes de glúten. Observaram melhor miscibilidade do sorbitol em relação aos

demais plastificantes utilizados. Pommet et al. (2003) propuseram a utilização de

diversos ácidos graxos para plastificar filmes de glúten. Esses autores perceberam

que, ao adicionar ácidos graxos com cadeia de carbono menor que 10, o efeito

lubrificante mostrou-se mais eficiente, enquanto a utilização de ácidos graxos com

cadeias maiores resultou em separação de fases e sua exsudação da matriz

protéica. Nos termogramas obtidos por análise dinâmico mecânica (DMA), os

mesmos autores verificaram que os filmes plastificados com ácido láurico,

mirístico e palmítico apresentaram um pico menor antes do maior pico referente à


25

temperatura de transição vítrea (Tg) do glúten, em razão da heterogeneidade do

material.

Hernández-Muñoz, Villalobos e Chiralt (2004) avaliaram o efeito do

tratamento térmico (40, 55, 70, 85, 95 e 115°C) nas propriedades funcionais de

filmes elaborados com frações de glúten de trigo (gliadina e glutenina) com e sem

glicerol. Os autores observaram que apenas os filmes desenvolvidos com gliadina

com e sem glicerol a 70, 85, 95 e 115°C não se desintegram totalmente em água.

Acima de 70 °C, há formação de ligações intermoleculares (S-S), levando à

criação de uma rede mais coesa pela formação de ligações cruzadas e

promovendo, assim, a integridade do filme em água. Paz et al. (2005) estudaram a

permeabilidade ao etileno em função da umidade relativa (25 a 75% UR) de filmes

de glúten de trigo. Os autores perceberam que a elevação da temperatura e da

umidade relativa promove um aumento da permeabilidade ao etileno. Esse

comportamento foi atribuído ao efeito plastificante da água ao aumentar a

umidade relativa do ensaio

Sun; Song e Zheng (2007) investigaram a utilização de L-cisteína,

formaldeído e glutaraldeído na termo-moldagem de filmes biodegradáveis de

glúten de trigo contendo glicerol como plastificante. Os autores observaram

aumento da resistência à tração e diminuição da porcentagem de elongação com

a utilização desses agentes.

2.5 Gelatina

Entre os hidrocoloídes disponíveis, a gelatina é o mais popular. É utilizada

largamente nas indústrias alimentícia e farmacêutica em razão de suas

propriedades funcionais, sendo produzida em grande escala e a preços

relativamente baixos (POPPE, 1987).

A gelatina é uma proteína animal, solúvel em água e resultante da hidrólise

ácida ou básica do colágeno (POPPE, 1987), cujas propriedades (distribuição de

massa molecular, estrutura e composição em sub-unidades) dependem do


26

processo de obtenção e da matéria-prima (BELL, 1989). Em sua composição

química, estão presentes todos os aminoácidos com exceção do triptofano e da

cisteína. O conteúdo e seqüência dos aminoácidos variam de uma fonte para

outra, no entanto, geralmente, glicina, prolina e hidroxiprolina, encontram-se em

maior quantidade (POPPE, 1987).

O processo de obtenção da gelatina comercial pode ser dividida em duas

etapas. Primeiramente, o colágeno é desnaturado a 40C e, posteriormente,

submetido à hidrólise (ácida ou básica) para quebra das ligações covalentes.

Basicamente, existem dois tipos de gelatinas: gelatina tipo A e gelatina tipo B, as

quais diferem quanto ao tipo de preparação. Gelatina tipo A recebe pré-tratamento

ácido antes da desnaturação térmica, obtendo um ponto isoelétrico (pI) entre 7 e

9; enquanto que a gelatina tipo B recebe pré-tratamento alcalino, obtendo um pI

entre 4,6 a 5,2 (GENNADIOS et al., 1994).

Em sua estrutura, a gelatina diferencia-se das demais proteínas pela

ausência de ordem interna e pela configuração aleatória das cadeias de

polipeptídios em solução aquosa (GENNADIOS et al., 1994). Do ponto de vista

prático, as características mais marcantes da gelatina são a solubilidade em água

e a capacidade de formar gel termo-reversível após ser aquecida, solubilizada e

resfriada. O mecanismo de formação envolve interligações iônicas entre grupos

amino e carboxil dos aminoácidos com a ajuda de pontes de hidrogênio (KESTER;

FENNEMA, 1986).

Comercialmente, a gelatina é encontrada na forma de cristais de coloração

amarelo-palha (BIGI et al., 1998). Ela possui muitos aminoácidos não polares, o

que a torna insolúvel em água fria, mas intumesce e tem capacidade de absorver

muitas vezes sua massa em água (LEINER DAVIS GELATIN, 1994). A gelatina

pode ser dissolvida indiretamente, mantendo suas partículas em água, em

repouso, até formar uma massa homogênea, sendo então levada ao aquecimento

(50-60C) até a sua dissolução completa. A dissolução direta é obtida com a

adição de água quente (60-80C) sob forte agitação. O método direto, em razão


27

da agitação, pode provocar a formação de espuma (JOHNSTON-BANKS, 1990), o

que se torna inconveniente na elaboração de filmes comestíveis.

A gelatina tem sido utilizada com sucesso na formação de filmes, servindo

como carreador de antimicrobianos e de antioxidante, assim como para diminuir a

absorção de óleo em alimentos para fritura (KROCHTA; DE MULDER-

JOHNSTON, 1997). Na literatura, existem vários trabalhos relatando propriedades

de filmes elaborados à base de gelatina. Carvalho (2002) avaliou as mudanças

provocadas nos filmes de gelatina modificados enzimática e quimicamente em

relação às suas propriedades funcionais, observando uma diminuição da

porcentagem de matéria solúvel em água e da permeabilidade ao vapor de água

dos filmes tratados em relação aos filmes sem tratamento. A mesma autora

observou aumento da resistência à ruptura, indicando maior grau de

intercruzamento da matriz polimérica, sendo mais evidente por meio da

modificação química.

Carvalho e Grosso (2006a) avaliaram o efeito da temperatura (40, 50, 60 e

70°C/15 minutos) na reação de modificação enzimática em relação às

propriedades funcionais dos filmes à base de gelatina. A temperatura de reação

não afetou fortemente a solubilidade ou as propriedades mecânicas dos filmes. Os

autores verificaram, entretanto, que os filmes produzidos com a reticulação

enzimática a 50°C apresentaram permeabilidade ao vapor de água

significativamente inferior aos produzidos nas demais temperaturas. Esse

resultado pode estar relacionado a uma melhor estruturação da matriz polimérica

após a reticulação enzimática. Carvalho e Grosso (2006b) verificaram o efeito da

modificação química (formaldeído e glioxal) nas propriedades dos filmes de

gelatina. Observaram que ambos os tratamentos causaram redução na


Cao; Fu e He (2007) estudaram as propriedades físicas de filmes compostos

de isolado protéico de soja e gelatina, em diversas proporções (10:0; 8:2; 6:4; 4:6;


28

2:8 e 0:10). Os autores observaram que o aumento da proporção de gelatina

provocou a elevação da resistência à tração e da transparência.

2.6 Amido

O amido é um polissacarídeo natural encontrado na forma de grânulos em

cereais, raízes e tubérculos. A maior parte desses grânulos é composto por duas

macromoléculas: a amilopectina, que é ramificada e de elevada massa molecular

(5000-30000 kg/mol), e a amilose, que é essencialmente linear e de menor massa

molecular (20-800 Kg/mol) (PERESSINI et al., 2003).

O amido é considerado a matéria-prima mais promissora na elaboração de

filmes biodegradáveis, graças a sua capacidade de formar uma matriz apropriada

(GARCIA; MARTINO; ZARITZKY, 2000a), além da grande produção mundial e do

baixo custo (DOANE, 1992). Os filmes de amido podem ser homogêneos e suas

propriedades mecânicas dependem da proporção de amilose e amilopectina que,

por sua vez, está relacionada à espécie vegetal (LOURDIN; DELLA-VALLE;

COLONNA, 1995). A amilose é considerada a responsável pela capacidade de

formação do filme de amido (GARCIA; MARTINO; ZARITZKY, 2000a), sendo suas

propriedades influenciadas pelas condições ambientais, principalmente umidade

relativa (PERESSINI et al., 2003).

Quando o grânulo de amido é aquecido em excesso de água (60%), as

ligações de hidrogênio presentes nas áreas amorfas são rompidas, permitindo o

intumescimento do grânulo, iniciando, dessa forma, o processo de gelatinização

(BILIADERIS, 1991). As ligações fortes possibilitam que o grânulo permaneça

intacto até que se rompam em algum ponto. Nessa condição, a expansão do

grânulo torna-se irreversível e a ordem estrutural desaparece (GARCIA et al.,

1997). Caso os grânulos continuem a expandir-se, a amilose é lixiviada para a

fase aquosa entre os grânulos (BILIADERIS, 1991). Após a gelatinização, as

moléculas de amilose, em virtude de sua linearidade, orientam-se paralelamente,

aproximando-se suficientemente para formar pontes de hidrogênio entre as


29

hidroxilas de polímeros adjacentes (fenômeno de retrogradação). Ocorre redução

do volume livre, diminuindo a afinidade do polímero pela água, podendo o amido

gelatinizado formar filmes estáveis e flexíveis conforme esquematizado na Figura

2.3 (WURZBURG, 1986).

Figura 2.3. Esquema de formação do filme de amido (VICENTINI, 2003).

Lourdin; Della-Valle e Colonna (1995) estudaram o efeito do conteúdo de

amilose nas propriedades dos filmes, observando que a resistência à tração se

eleva com o aumento do teor de amilose. Garcia; Martino e Zaritzky (2000a)

estudaram a adição de lipídios em filmes de amido e observaram que esses, com

alto teor de amilose, se mostraram menos permeáveis ao vapor de água e à

gases. Arvanitoyannis; Nakayama e Aiba (1997) estudaram filmes elaborados a

partir de uma mistura de gelatina e amido de batata e observaram que um elevado

conteúdo de gelatina (maior que 20% p/p) conduziu a um aumento na resistência

à tração dos filmes.

Flores et al. (2007) avaliaram a influência da adição de sorbato de potássio e

das condições de gelatinização e secagem nos filmes de amido de mandioca em

suas propriedades físicas. A presença de sorbato de potássio afetou as

propriedades de solubilidade em água, cor e propriedades mecânicas. Esses


30

autores também observaram que a técnica de gelatinização e secagem afetam as

características da rede, modificando as características dos filmes.

Bertuzzi, Armada e Gottifredi (2007) estudaram a caracterização físico-

química de filmes de amido de milho. Os autores observaram redução da

opacidade e solubilidade em água com a utilização de um pré-tratamento com

álcali no amido. Alves et al. (2007) estudaram a influência de uma solução rica em

amilose e glicerol, em diversas proporções, nas propriedades de barreira e

mecânicas de filmes de amido de mandioca. Os autores observaram que o

enriquecimento da solução formadora de filme com solução de amilose originou

filmes mais fortes e permeáveis. A adição de glicerol provocou aumento da


31

3.0 Material e Métodos

3.1. Material

As matérias-primas utilizadas na elaboração dos filmes foram:

(i) Glúten, fornecido pela Roquette (França);

(ii) Gelatina tipo A, fornecida pela Leiner Davis Gelatin (Cotia, Brasil);

(iii) Amido de mandioca (AMILOGILL 1500), fornecido pela Cargill (São

Paulo, Brasil);

(iv) Amido de mandioca modificado (AMIDOMAX 5500), fornecido pela

Cargill (São Paulo, Brasil);

(v) Amido milho ceroso (AMISOL 4000), fornecido pela Corn Products

(Jundiaí, Brasil);

(vi) Amido milho ceroso modificado quimicamente (FLUIDEX SS-22),

fornecido pela Corn Product (Jundiaí, Brasil);

(vii) Sorbato de potássio (Chemco, Brasil), como agente antimicrobiano;

(viii) Glicerol (Synth, Brasil), como plastificante;

(ix) Ácido acético glacial (Synth, Brasil), como ajustador de pH;

(x) Etanol (Stynth).

Os pães-de-fôrma foram obtidos a partir das seguintes matérias-primas:

(i) Farinha de trigo, fornecida pela Cargill (Tatuí, Brasil);

(ii) Margarina (Amélia, Brasil);

(iii) Açúcar (União, Brasil);

(iv) Leite em pó integral (Nestlé, Brasil);

(v) Sal (Cisne, Brasil);

(vi) Fermento biológico instantâneo seco (Fleischmann, Brasil);

(vii) Melhorador ZEA 500 (Emulzint, Brasil)

Material e Métodos

32

3.2. Elaboração dos filmes

3.2.1. Filme à base de gelatina (GEL)

A solução formadora de filme foi obtida hidratando-se 10 e 15 g de gelatina

em 100 mL de água destilada, por 1 hora/25°C. Posteriormente, a solução foi

solubilizada a 55°C, em banho termostático, por 10 e 15 minutos para os filmes de

10 e 15 g de gelatina, respectivamente. Após completa solubilização, adicionou-se

glicerol (5% e 10% em relação à massa seca de gelatina) sob agitação magnética,

sendo mantido o pH natural da solução. A solução (14 mL) foi aplicada sobre

placas de polipropileno (14 cm de diâmetro e 1,2 cm de altura) e seca à

temperatura ambiente por aproximadamente 24 horas.

3.2.2. Elaboração de filme à base de glúten (GLU)

A solução formadora de filme foi preparada utilizando-se glúten (2,5; 5,0;

7,5; 10,0 e 12,5 g /100 mL solução); etanol (20; 32,5; 45; 57,5 e 70 mL/100 mL de

solução); água destilada (30; 42,5; 55; 67,5 e 80 mL/100 mL de solução) e ácido

acético para ajustar o pH (2; 3; 4; 5 e 6). O glicerol foi adicionado na concentração

de 20% (em relação à massa seca de glúten). Todos os componentes foram

misturados sob agitação magnética até atingir a temperatura de 70°C,

permanecendo nessa temperatura por 5 minutos. A seguir, a solução formadora

de filme foi centrifugada a 5000 rpm por 20 minutos à temperatura ambiente. A

solução límpida resultante foi colocada em placas de polipropileno (14 cm de

diâmetro e 1,2 cm de altura) previamente aspergida com spray de silicone (LIM;

MINEY; TUNG, 1998) e seca à temperatura ambiente por, aproximadamente, 24-

48 horas (GONTARD; GUILBERT; CUQ, 1992).

Material e Métodos

33

3.2.3 Filmes à base de amido de mandioca (AM) ou mandioca modificado

(AMM)

A solução formadora de filme foi preparada utilizando amido (2 e 4% p/v),

água (100 mL) e glicerol (10% em relação à massa seca do amido), sob agitação

e aquecimento em banho-maria (75°C) por 15 minutos.

3.2.4 Filmes à base de amido de milho ceroso (AMC) ou milho ceroso

modificado (AMCM)

A solução formadora de filme foi preparada utilizando amido (2 e 4% p/v),

água (100 mL) e glicerol (10% em relação à massa seca do amido), sob agitação

e aquecimento em banho-maria (85°C) por 5 minutos.

3.2.5 Filmes compostos

Foram confeccionados os filmes compostos de GLU/GEL, AM(2 e 4%)/GEL,

AMM(2 e 4%)/GEL, AMC(2 e 4%)/GEL, AMCM(2 e 4%)/GEL em diversas

proporções (1:1; 1:4 e 4:1 v/v) (TANADA-PALMU; FAHKOURI; GROSSO, 2002) e

AM(2 e 4%)/GLU/GEL, AMM(2 e 4%)/GLU/GEL, AMC(2 e 4%)/GLU/GEL, AMCM(2 e

4%)/GLU/GEL (1:1:1 v/v/v). A solução foi aplicada sobre placas de polipropileno (14

cm de diâmetro e 1,2 cm de altura) e seca à temperatura ambiente por

aproximadamente 24 horas.

3.2.6 Filmes ativos

À solução formadora de filme de GLU/GEL e AMM(2%)/GEL, nas proporções

1:4 v/v (TANADA-PALMU; FAHKOURI; GROSSO, 2002) e AMM(2%)/GLU/GEL

(1:1:1 v/v/v), foi adicionado o agente antimicrobiano sorbato de potássio nas

concentrações de 2 e 4% (p/v) para confecção dos filmes ativos.

Material e Métodos

34

3.3 Metodologia de caracterização dos filmes simples e compostos

Antes das análises de caracterização, todos os filmes secos foram

acondicionados em dessecadores a 25°C e 52% UR, durante 48 horas. Os

biofilmes simples e compostos foram caracterizados quanto ao aspecto visual,

propriedades de barreira ao vapor de água, solubilidade em água e propriedades

mecânicas. Os filmes compostos selecionados adicionados ou não de sorbato de

potássio (2 e 4%) foram também caracterizados quanto à permeabilidade ao

oxigênio, microscopia eletrônica de varredura, análise dinâmico-mecânica e

determinação da efetividade antimicrobiana pelo método de halo.

3.3.1 Caracterização dos filmes

3.3.1.1 Aspecto visual

Para cada tipo de filme produzido, foram realizadas análises visuais e

táteis, com o intuito de utilizar apenas os filmes que fossem homogêneos

(avaliação quanto à presença de partículas insolúveis e coloração uniforme),

apresentassem continuidade (sem a presença de rupturas ou zonas quebradiças)

e possibilitassem o manuseio (facilidade em retirar os filmes do suporte). Os filmes

que não apresentaram tais características foram descartados.

3.3.1.2 Espessura (e)

A espessura dos filmes foi determinada utilizando-se um micrômetro digital

(resolução 0,001 mm), MITUTOYO (MDC-25M, Kanagawa, Japan). Ela foi

calculada como a média aritmética de cinco medidas aleatórias sobre a área do

filme. Essa medida foi obtida depois do período de acondicionamento dos filmes.


A permeabilidade ao vapor de água dos filmes foi determinada

gravimetricamente a 25°C, de acordo com o método padrão E-96-95 da ASTM

(ASTM, 1995). O filme em forma de disco de 9,0 cm de diâmetro foi selado com

Material e Métodos

35

parafina em células de permeação feitas de alumínio, contendo cloreto de cálcio

em seu fundo. A selagem foi realizada para garantir que toda a transferência de

umidade ocorresse através do filme. As células de permeação foram então

acondicionadas em dessecadores com temperatura (25°C) e umidade relativa

controlada (por meio de uma solução de NaCl saturada, com umidade relativa

correspondendo a 75%). O vapor de água transferido através do filme foi

determinado pelo ganho de massa do cloreto de cálcio, medido a cada 24 horas

por 7 dias. Os testes foram realizados em triplicata. A taxa de permeação ao vapor

de água (PVA) foi calculada por intermédio da seguinte equação:

xpA

ePVA (3.1)

Onde:

PVA é a permeabilidade ao vapor de água (gmm/m2diakPa);

e é a espessura (mm);

A é a área da superfície exposta do filme (m2);

p é a diferença de pressão parcial do vapor de água através do filme (kPa);

é a taxa de umidade absorvida (g)/ tempo (dia).

3.3.1.4 Solubilidade em água (SOL)

A solubilidade em água dos filmes foi determinada segundo o método

proposto por Gontard et al. (1994). As amostras foram preparadas em triplicata,

sendo recortadas em discos de 2 cm de diâmetro. A massa seca inicial dos filmes

foi obtida após secagem em estufa de circulação de ar à temperatura de 105°C

por 24 horas. Posteriormente, as amostras secas foram imersas em um recipiente

contendo 50 mL de água destilada, e o sistema foi mantido sob lenta agitação

mecânica por um período de 24 horas, à temperatura ambiente. Após esse

período, as amostras solubilizadas foram submetidas novamente à secagem a

Material e Métodos

36

105°C por mais 24 horas, para a obtenção da massa seca final. A solubilidade foi

expressa de acordo com a equação:

100x

M

MMSOL

i

fi (3.2)

Onde:

SOL é a massa solubilizada em função da massa seca inicial (%);

Mi é a massa seca inicial (g);

Mf é a massa seca final, após solubilização (g).


A resistência à tração (RT) e a elongação na ruptura (ELO) foram

determinadas utilizando-se o texturômetro TA.XT2 (Stable Micro System,

Hasleme, Inglaterra) operado de acordo com o método padrão ASTM D 882-83

(ASTM, 1995D). As medidas foram conduzidas em temperatura ambiente (25°C).

A separação inicial das garras e a velocidade do probe foram de 50 mm e 1 mm/s,

respectivamente. As amostras foram cortadas em tiras apresentando 100 mm de

comprimento e 25 mm de largura. Foram realizadas doze replicatas. A resistência

à tração (RT) e a porcentagem de elongação (E) foram calculadas pelas equações

(3.3) e (3.4), respectivamente:

mFRT

A (3.3)

Onde:

RT corresponde à resistência à tração (MPa);

Fm é a força máxima no momento da ruptura do filme (N);

A é a área da secção transversal do filme (m2);

Material e Métodos

37

100xd

ddELO

inicial

inicialr (3.4)

Onde:

ELO é a elongação (%);

dr é a distância no momento da ruptura (cm), que corresponde à diferença

entre a distância de separação no momento da ruptura e a distância inicial

(5 cm);

dinicial é a distância inicial de separação (5 cm).

3.3.1.6 Permeabilidade ao oxigênio (PO2)

A taxa de transmissão de oxigênio (TTO) foi determinada utilizando-se uma

modificação do método padrão ASTM D 3985-81 com o aparelho OX-TRAN 2/20

(Mocon, Inc) a 25°C (ASTM, 1990). A permeabilidade ao oxigênio (PO2) foi

calculada por meio da seguinte equação:

p

eTTOPO

2 (3.5)

Onde:

PO2 é a permeabilidade ao oxigênio (cm3m/m 2 diakPa);

TTO é a taxa de transmissão de oxigênio (cm3/m2dia);

e corresponde à espessura (μm);

p é a diferença de pressão parcial de oxigênio entre os dois lados do filme

(kPa).

A diferença de pressão de oxigênio através do filme corresponde à pressão

atmosférica (101,3 kPa), sendo as amostras sujeitas a gás oxigênio puro (100%)

de um lado e de um gás de arraste contendo 98% de nitrogênio e 2% de

hidrogênio do outro lado. Os ensaios foram realizados em duplicata nos filmes

Material e Métodos

38

acondicionados à temperatura de 25°C, 52 2% de umidade relativa, durante 48

horas. Para facilitar a fixação do filme, foi utilizada uma máscara de alumínio (área

exposta fixa = 8 cm2).

3.3.1.7 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

A microestrutura da superfície e da seção transversal dos filmes foi avaliada

utilizando-se microscopia eletrônica de varredura (LEO 440i -Cambridge) a 5 kV.

Os filmes foram mantidos em dessecadores contendo sílica gel (25°C) por um

período de 7 dias, depois dos quais foram fraturados. As amostras de filme

fraturadas foram fixadas em suportes (stubs) de alumínio, com fita adesiva de

carbono. Para conferir condutividade aos filmes, foram recobertas com uma

camada de ouro de espessura de 92 Å a uma taxa de recobrimento de 0,5

Å/segundo em metalizador à vácuo (Polaron SC 7620), por 180 segundos, a 3 mA.

As amostras foram observadas com aumento de 1000X.

3.3.1.8 Análise dinâmico-mecânica (DMA)

A temperatura de transição vítrea (Tg) dos filmes foi determinada utilizando-

se o equipamento DMA (Dynamic Mechanical Analysis DMA 2980, TA

Instruments, New Castle, DE). Os filmes foram acondicionados a 25°C e 52% de

umidade relativa por um período de 72 horas. As amostras foram cortadas em

tiras e fixadas em um suporte apropriado. Foi aplicado um módulo de tensão sobre

elas de modo simultâneo ao aquecimento. As medidas foram conduzidas

utilizando-se a freqüência de 1 Hz, amplitude de 20 m, força de 1 N e corrida na

faixa de –120 a 100°C, com taxa de aquecimento de 2C/min. As medidas de

módulo de armazenamento (E’), módulo de perda (E”) e ângulo de perda (tan )

foram registradas e representadas na forma de gráficos em função da temperatura

para a análise de transição térmica. A Tg foi determinada no ponto de inflexão da

curva do parâmetro ângulo de perda (tan ) em função da temperatura (CHERIAN

et al., 1995).

Material e Métodos

39

3.3.1.9 Determinação da efetividade antimicrobiana do filme pelo método de

difusão em halo

3.3.1.9.1 Preparação do inóculo

O preparo do inóculo constituiu na inoculação das espécies fúngicas em

ágar CY20S ou CYA e incubação a 25ºC por 5 dias. Em seguida, fez-se uma

raspagem das colônias presentes na placa com auxílio de uma alça, as quais

foram transferidas para um frasco contendo 50 mL de água peptonada 0,1% com

0,1% de Tween 80. A suspensão foi agitada por 1 min e filtrada com auxílio de

gaze estéril. A partir desse inóculo inicial, foram realizadas diluições decimais e

escolhida a suspensão para o teste de difusão de acordo com as características

de crescimento de cada espécie.

3.3.1.9.2 Teste de difusão em halo

Os filmes ativos foram colocados na superfície dos meios de cultura CY20S

(Ágar Czapek Extrato de levedura 20% de sacarose) e CYA (Ágar Czapek Extrato

de levedura), já solidificados e com 0,1 mL de suspensão de esporos preparada

(item 3.3.1.9.1): (i) Eurotium chevalieri (CY20S); (ii) Eurotium amstelodami

(CY20S), (iii) Wallemia sebi (CY20S); (iv) Penicillium raistrickii (CYA) e (v)

Cladosprium sp (CYA). Cortes circulares dos filmes ativos (2,5 cm de diâmetro)

foram colocados assepticamente sobre a superfície do meio solidificado e com o

microorganismo teste. As placas foram incubadas a 25C por 120 horas. A

eficiência do agente antimicrobiano foi avaliada pela formação de halo ao redor

dos filmes (PEREIRA et al., 2005) e pela quantificação da unidade formadora de

colônia (UFC/mL). Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Como

controle foi utilizado filme sem o agente antimicrobiano

Material e Métodos

40

3.4 Produção de pão de forma

Os pães-de-fôrma foram produzidos segundo a formulação apresentada na

Tabela 3.1.

Tabela 3. 1. Formulação padrão do pão de forma.

Ingredientes Quantidade

(% em relação à massa de farinha)

- farinha de trigo 100

- água 58*

- sal 2

- açúcar 6

- fermento biológico instantâneo seco 1,3

- melhorador de farinha (ZEA 500) 0,3

- margarina 8

- leite em pó integral 4* depende da característica de absorção de água da farinha de trigo.

Os ingredientes foram misturados em amasseira (Hypo,modelo HAE 10) por

5 minutos em velocidade lenta (900 rpm) e 8 minutos em velocidade rápida (1800

rpm). A massa foi, então, separada em pedaços de 530 g, deixada descansar por

10 minutos, modelada e, a seguir, mantida em câmara de fermentação

(Thermopão Maquip, Klimaquip, modelo 20B) a 30°C, com umidade relativa de

80%, por 2 horas. Após a fermentação, os pães foram levados ao forno (Hypo,

modelo HF 4B) para serem assados a 180°C, por 35 minutos e depois, resfriados

por 24 horas, fatiados e embalados em sacos de polietileno.

3.4.1 Método de análise microbiológica para isolamento de fungos

Os pães de forma foram produzidos e armazenados em temperatura

ambiente até crescimento visível de fungos, para posterior identificação e

determinação da efetividade antimicrobiana do filme pelo método de halo.

Material e Métodos

41

3.4.1.1 Análise microbiológica

Para a análise microbiológica, uma amostra de 25 g de pão de forma foi

homogeneizada com 225 mL de água peptonada 0,1% em stomacher por 2

minutos. Em seguida, procedeu-se as diluições decimais seriadas e o

plaqueamento por superfície (0,1 mL) em meio Dicloran 18% glicerol Agar (DG18).

As placas foram incubadas a 25C por 5 dias. Os resultados foram expressos em

Unidades Formadoras de Colônias por grama (UFC/g) (DOWNES; ITO, 2001).

3.4.1.1.1 Identificação das espécies fúngicas

Todos os fungos foram inicialmente isolados e purificados em ágar de

extrato de malte (MEA) e incubados a 25°C por 7 dias. Espécies de Penicillium

foram inoculadas em Agar Czapek extrato de levedura (CYA) incubados em três

temperaturas (5, 25 e 35°C) por 7 dias e identificados conforme chave de

identificação de Pitt (1988). Os demais fungos foram identificados de acordo com

Pitt e Hocking (1999), Samson et al. (1996) e outras chaves de identificação.

3.5 Aplicação do biofilme no acondicionamento de pão de forma

Os filmes com e sem sorbato foram usados para embalar os pães de forma,

sendo utilizadas três fatias de pães para cada tratamento selecionado. As fatias

justapostas foram intercaladas com os filmes ativos selecionados (três fatias e

dois filmes) e colocadas em sacos de polietileno de baixa densidade (PEBD)

(Figura 3.1) (SOARES et al., 2002) e selados. Ao mesmo tempo foram embaladas

e seladas três fatias apenas com PEBD, sem filmes em seu interior. Os pães

foram estocados a temperatura controlada (25C) durante 7 dias. As avaliações

foram feitas de três em três dias (1; 4 e 7 dia).

Material e Métodos

43

Figura 3.1. Foto das fatias de pão de forma intercaladas com os biofilmes ativos

(SOARES et al., 2002).

3.5.1 Análises dos pães de forma embalados

3.5.1.1 Perda de peso

A perda de peso foi medida anotando-se o peso inicial do pão, pesando-se

o produto junto com o filme em balança semi-analitica (Toledo PB 3002, Suíça).

As pesagens foram feitas em quintuplicatas.

3.5.1.2 Determinação Instrumental da textura

A medida instrumental de textura dos pães (força máxima aplicada para

pressionar duas fatias de pão de forma) foi determinada pelo analisador de textura

TA.XT2, segundo método no 74/09 da AACC (1995a). Os resultados foram

expressos em gf (grama-força). As condições empregadas nesse teste foram as

seguintes: Sonda: P/35R – cilindro de acrílico; modo: força em compressão;

velocidade de teste = 1,7 mm/s; medida na situação de 40% de compressão da

amostra; velocidade de pré-teste = 1,0 mm/s e velocidade de pós-teste = 10,0

mm/s. As análises foram feitas em nove replicatas.

Material e Métodos

45

3.5.1.3 Determinação do conteúdo de umidade

A determinação do conteúdo de umidade dos pães de forma foi efetuada,

em triplicata, por dessecação no ambiente por 24 horas, seguida de secagem em

estufa a 130°C, até peso constante conforme o método da AACC 44-15A (1995b).

As análises foram feitas em triplicata.

3.5.1.4 Determinação de atividade de água

A determinação da atividade de água foi realizada utilizando-se o aparelho

modelo AquaLab Cx 2T, marca Decagon Devices Inc. (USA), operando-se à

temperatura de 25°C. As amostras eram fatias de 3 mm de espessura colocadas

em cápsulas. As análises foram feitas em triplicata.

3.5.1.5 Análise microbiológica

Para a análise microbiológica, uma amostra de 25 g de pão de forma foi

homogeneizada com 225 mL de água peptonada 0,1% em stomacher por 2

minutos. Em seguida, procedeu-se as diluições decimais seriadas e o

plaqueamento por superfície (0,1 mL) em meio Dicloran 18% glicerol Agar (DG18)

para determinação de bolores e leveduras. As placas foram incubadas a 25C por

5 dias. Os resultados foram expressos em Unidades Formadoras de Colônias por

grama (UFC/g). (DOWNES; ITO, 2001). As análises foram feitas em triplicatas.

3.5.1.6 Extração e quantificação de sorbato de potássio

A extração de sorbato de potássio dos pães de forma foi realizada de

acordo com a metodologia de SILVEIRA (2005), com algumas modificações. Dois

gramas de pão de forma previamente triturado foram adicionados a 40 mL de

etanol e, após 3 horas de agitação a 90 rpm, o volume foi completado para 100

mL com água pura (18,2 ohm). Após 15 minutos de agitação, o sobrenadante foi

filtrado em membrana de 0,22 μm (SILVEIRA, 2005).

Material e Métodos

46

Alíquotas de 20 μL foram utilizadas para quantificação de sorbato de

potássio em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A análise foi

conduzida em cromatografo SHIMADZU (modelo 10 AVP), coluna X-Terra

(Wartes) RP18 (4,6 X 150 mm X 5 μm) e sistema de detecção UV. A fase móvel

constituiu de 60% de acetonitrila; 39% de água e 1% de acido fosfórico 0,1%, com

fluxo de 1 mL/min, sendo a detecção realizada em 260 mm (SILVEIRA, 2005).

3.6 Análise Estatística

A análise estatística de variância (ANOVA) foi realizada utilizando-se o

programa Statistica® 5.0 (Stasoft; USA). As diferenças significativas entre as

médias foram identificadas por meio do teste de Tukey (p≤0,05).

Para a avaliação estatística dos resultados obtidos com os biofilmes de

glúten, utilizou-se o programa computacional Statistica® 5.0 realizando a análise

do planejamento experimental completo, ajuste dos pontos experimentais a

modelos matemáticos, tratamentos estatísticos e construção das superfícies de

resposta. O ajuste dos modelos testados e sua significância foram analisados por

intermédio dos coeficientes de correlação e do Teste F.

47

4.0 Resultados e Discussão

4.1 Filmes simples à base de gelatina plastificado com glicerol

4.1.1 Caracterização dos filmes


De modo geral, os filmes elaborados com gelatina e glicerol, em todas as

concentrações, apresentaram-se transparentes e homogêneos. Aspecto

semelhante foi obtido por Fakhouri; Batista e Grosso (2003) e Bertan et al. (2005)

em filmes de gelatina e triacetina. Sobral (1999) elaborou filmes com gelatina de

couro bovina e suína, que também se mostraram manuseáveis, transparentes e

visualmente homogêneos. Os elaborados com menor quantidade de gelatina (10

g) mostraram-se mais maleáveis em ambas as concentrações de plastificante

utilizadas, enquanto o aumento na concentração do teor de gelatina (de 10 para

15 g) resultou em filmes mais rígidos.

4.1.1.2 Espessura

As espessuras dos filmes desenvolvidos variaram entre 0,075 mm (gelatina

10 g/glicerol 5%) e 0,128 mm (gelatina 15 g/glicerol 10%). Essa diferença

relaciona-se ao aumento na quantidade de matéria seca. Resultado semelhante

foi encontrado por Ayranci e Çetin (1995). Os autores adicionaram concentrações

crescentes de proteína de pistache em soluções com concentração constante de

celulose, e observaram espessuras variando de 0,014 a 0,045 mm. Bertan et al.

(2005) observaram que a adição de substâncias hidrofóbicas promoveu aumento

na espessura dos biofilmes, sendo necessário utilizar alíquotas diferentes (10 a 16

mL) para cada formulação com o objetivo de controlar as espessuras para a

repetibilidade das medidas e validade das comparações entre as propriedades

analisadas. Fakhouri; Batista e Grosso (2003) observaram que a adição de ácido

graxo aos filmes de gelatina e triacetina causou aumento na espessura (0,019

Resultados e Discussão

48

para 0,068 mm). Sobral (1999) ao estudar o efeito da espessura nas propriedades

funcionais de biofilmes de gelatina de couro bovino e suíno contendo sorbitol,

observou que, ao elevar a concentração da proteína, houve um aumento linear da

espessura dos biofilmes.


Os valores de permeabilidade ao vapor de água encontrados para as

diferentes formulações dos biofilmes estão apresentados na Tabela 4.1. Pode-se

observar que houve um aumento significativo (p≤0,05) nos valores de

permeabilidade ao vapor de água com a elevação da concentração gelatina (10

para 15 g), provavelmente em função do aumento da espessura dos filmes.

Segundo Park e Chinnan (1995), a permeabilidade ao vapor de água pode variar

com a espessura dos filmes em virtude de mudanças estruturais causadas pelo

inchamento da matriz, o que afeta a estrutura dos filmes e provoca tensões

internas que podem influenciar a permeação. Resultados semelhantes foram

encontrados por Sobral (1999), que correlacionou essa permeabilidade dos filmes

de gelatina bovina e suína plastificados com sorbitol linearmente com a espessura.

Fakhouri; Batista e Grosso (2003) também notaram que o aumento da espessura

causou elevação na permeabilidade ao vapor de água dos filmes de gelatina

plastificados com triacetina. Estes encontraram valores menores de

permeabilidade ao vapor de água (3,49 e 4,38 gmm/m2diakPa) para os filmes de

gelatina (10 g) e triacetina (5 e 10%, respectivamente) que os desenvolvidos no

presente estudo, possivelmente em decorrência da utilização de filmes menos

espessos (0,018 e 0,035 mm) ou em razão do tipo de plastificante utilizado.


49

Tabela 4.1. Permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos filmes de gelatina e

glicerol (25°C).

Filmes Espessura

(mm)

PVA

(gmm/m2diakPa)*

GEL (10g)/GLI 5% 0,075 ± 0,009 5,38 ± 0,54b

GEL (10g)/GLI 10% 0,078 ± 0,030 5,49 ± 0,10b

GEL (15g)/GLI 5% 0,115 ± 0,048 8,34 ± 0,01a

GEL (15g)/GLI 10% 0,128 ± 0,022 8,45 ± 0,47a

Média e erro padrão das replicatas. * Letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLI= glicerol e PVA = permeabilidade ao vapor de água

Não foi possível observar diferença significativa (p0,05) nos valores de

permeabilidade ao vapor de água ao elevar a concentração de glicerol (5 para

10%), tanto para os filmes de 10% quanto para os de 15% de gelatina. Resultados

semelhantes foram encontrados por Fakhouri; Batista e Grosso (2003), em que o

aumento da concentração de triacetina (10 para 15%) não causou diferença

significativa na permeabilidade ao vapor de água dos filmes de gelatina em ambas

as alíquotas estudadas (8 e 14 mL). Contrariamente, Sobral (1999) verificou que o

aumento na concentração de plastificante, de 30 a 50% de glicerol, elevou a

permeabilidade ao vapor de água de 8,64x10-8 para 12,24x10–8 gmm/m2diakPa.

Gontard; Guilbert e Cuq (1993) também notaram aumento na permeabilidade ao

vapor de água de filmes de glúten paralelamente à elevação da concentração de

glicerol. Os autores atribuíram esse fato às modificações estruturais da rede

protéica, que pode ter se tornado menos densa, e, sobretudo, à hidrofilicidade da

molécula de glicerol. Vicentini (2003) verificou o crescimento da permeabilidade ao

vapor de água de 7,44x10-3 para 11,28x10-3 gmm/m2diakPa nos filmes de glúten,

em razão do aumento da concentração de glicerol de 12 para 20%.

Muitos estudos enfocam a influência do aumento da concentração de

plastificante nas propriedades funcionais dos filmes, como na permeabilidade ao

vapor de água. É bem conhecido que essa permeabilidade tende a elevar-se com

o aumento do teor de plastificante hidrofílico (SOBRAL, 2000). Possivelmente,

esse comportamento não foi elucidado nesse estudo em virtude da baixa


50

concentração do plastificante nos filmes de gelatina. Segundo Banker (1966), as

propriedades de barreira dos filmes podem ser influenciadas pela seleção e

concentração de plastificante.

4.1.1.4 Solubilidade em água (SOL)

A solubilidade em água (Tabela 4.2) variou de 30,34 a 33,50%. Não foi

observada diferença significativa (p≤0,05) com relação à elevação da

concentração de gelatina (10 para 15 g), mas o aumento da concentração de

glicerol (5 para 10%) provocou elevação na solubilidade em água para os filmes

com 10% de gelatina, variando de 30,34% (5% de glicerol) para 33,50% (10% de

glicerol).

Tabela 4.2. Solubilidade em água (SOL) dos filmes de gelatina e glicerol.

Filmes SOL (%)*

GEL (10g)/GLI 5% 30,34 ± 0,58 c

GEL (10g)/GLI 10% 33,50 ± 0,27 a

GEL (15g)/GLI 5% 30.93 ± 0,24 bc

GEL (15g)/GLI 10% 32,56 ± 0,45 ab

Média e erro padrão das replicatas. * Letras diferentes representam diferença significativa (p≤ 0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLI= glicerol e SOL= solubilidade em água.

Sarmento (1999) verificou que a solubilidade do biofilme de gelatina

reticulada cresceu de 40 para 50% com o aumento da concentração de glicerol

(de 55 g a 85 g de plastificante por 100 g de gelatina). O autor atribuiu esse

comportamento à migração do sorbitol para a água, em virtude do caráter

hidrofílico e pelo fato de o sorbitol não estar ligado quimicamente à gelatina,

podendo, então, deslocar-se com relativa facilidade da rede protéica.


Os valores de resistência à tração e porcentagem de elongação dos filmes

de gelatina (10 e 15 g)/glicerol (5 e 10%) são apresentados na Tabela 4.3.


51

Tabela 4.3. Propriedades mecânicas dos filmes de gelatina e glicerol (25°C).

Filmes Espessura

(mm)

RT

(MPa)*

ELO

(%) *

GEL (10g)/GLI 5% 0,076 ± 0,009 90,73 ± 0,89 ab 6,85 ± 2,32 a

GEL (10g)/GLI 10% 0,080 ± 0,026 80,98 ± 1,57 c 7,17 ± 0,19 a

GEL (15g)/GLI 5% 0,112 ± 0,021 93,50 ± 1,82 a 5,30 ± 0,27 a

GEL (15g)/GLI 10% 0,118 ± 0,012 85,41 ± 2,43 bc 5,54 ± 2,43 a

Média e erro padrão das replicatas. * Letras diferentes representam diferença significativa (p≤ 0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLI= glicerol; RT= resistência a tração e ELO= elongação.

Observa-se que o aumento da concentração de plastificante (5 para 10%),

diminuiu significativamente (p≤0,05) a resistência à tração dos filmes.

Provavelmente, isto ocorreu pelas alterações causadas na rede protéica com a

incorporação do plastificante. A incorporação de plastificante em biopolímeros

modifica a organização molecular tridimensional da rede protéica, diminuindo as

forças de atração intermoleculares e eleva o volume livre do sistema.

Consequentemente, a rede torna-se menos densa (SOTHORNVIT; KROCHTA,

2000). A força na ruptura é influenciada pela interação entre as proteínas na

matriz filmogênica, em diversos sítios ativos das cadeias protéicas e os

plastificantes reduzem o número dessas ligações por meio da solvatação de sítios

ativos polares (LIM; MINEY; TUNG, 1998).

A resistência dos filmes plastificados com 5% de glicerol mostrou-se maior

que os plastificados com 10%, sendo maior no filme GEL (15g)/GLI 5% (93,50

MPa). Comportamento semelhante foi observado por Sobral (2000) em estudo

sobre as propriedades funcionais de biofilmes de proteína de origem animal em

função do plastificante. O autor verificou que o aumento da concentração de

sorbitol numa faixa de 15 a 65% gerou uma queda da força de ruptura de 16,0

para 8,2 N e de 16,2 para 9,0 N, no caso dos filmes de gelatina de couro bovina

(GCB) e gelatina de pele suína (GPS), respectivamente. Cuq et al. (1997), ao

trabalharem com biofilmes de proteína miofibrilar, observaram diminuição da força

na ruptura de 5,1 para 2,6 N, com o aumento da concentração de glicerol.

Monterrey-Quintero (1998) elucidou a diminuição da força de ruptura de 6,67 para


52

2,94 N ao aumentar a concentração de glicerol de 30 para 70% (g de plastificante

por g de proteína) nos filmes à base de proteína miofibrilar de carne bovina.

Apesar de o aumento da concentração de gelatina (10 para 15g) não ter

alterado de maneira significativa (p≤0,05) a resistência à tração dos filmes

plastificados tanto com 5 quanto com 10% de glicerol, os de maior concentração

de gelatina mostraram valores de resistência à tração maiores. Provavelmente, o

aumento na concentração de gelatina provocou uma elevação das interações

moleculares entre as cadeias adjacentes, elevando as interações entre as

macromoléculas, consequentemente elevando a resistência à atração dos filmes.

Yoshida (2002) observou que a resistência à tração foi maior para altas

concentrações de proteína do soro do leite, que relaciona-se com o aumento do

número de ligações covalentes S-S na matriz filmogênica, em virtude da maior

quantidade de grupos sulfidrílicos na superfície protéica.

Os valores de porcentagem de elongação (Tabela 4.3) não apresentaram

diferença significativa (p≤0,05) tanto na variação da concentração de gelatina,

quanto no plastificante. Ela variou de 5,30% para o filme de gelatina (15 g)/glicerol

5% a 7,17% para o de gelatina (10 g)/glicerol 10%. A incorporação de plastificante

torna a rede menos densa com o decréscimo das forças, melhorando a

flexibilidade e extensibilidade (SOTHORNVIT; KROCHTA, 2000). Provavelmente,

nesse estudo, a concentração de plastificante utilizada não foi suficiente para

alterar a elongação dos filmes.

Fakhouri, Batista e Grosso (2003) não observaram diferença significativa na

porcentagem de elongação em função da espessura e da concentração de

triacetina. Sobral (1999) verificou que a elevação da concentração de plastificante

de 30 para 100%, provocou aumento de 1,8 para 8,5% na porcentagem de

elongação dos filmes de gelatina. Yoshida (2002) notou efeito semelhante em

relação aos filmes de proteína de soro de leite bovino.

A melhor formulação de filmes de gelatina, determinada neste caso,

visando manter boas propriedades de barreira ao vapor de água e resistência

mecânica, foi a elaborada com 10% de gelatina e 5% de glicerol. Essa formulação


53

foi selecionada para ser utilizada na elaboração e caracterização dos filmes

compostos.

4.2 Caracterização dos filmes à base de glúten e glicerol

Um delineamento experimental composto central rotacional foi realizado

contendo 8 pontos fatoriais, 6 pontos axiais e 3 repetições no ponto central,

perfazendo um total de 17 ensaios. Os valores correspondentes aos diferentes

níveis das variáveis são apresentados na Tabela 4.4.

As variáveis independentes analisadas foram: (i) concentração de glúten

(2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 12,5 g/100mL de solução); (ii) concentração de etanol (20;

32,5; 45; 57,5 e 70 mL/100mL de solução); (iii) pH (2; 3; 4; 5 e 6) (GONTARD;

GUILBERT; CUQ, 1992). As variáveis dependentes, isto é, as respostas

analisadas, foram: (i) permeabilidade ao vapor de água; (ii) solubilidade em água;

(iii) resistência à tração e (iv) porcentagem de elongação.

Tabela 4.4. Níveis das variáveis independentes do planejamento fatorial completo

23 usado para filmes de glúten plastificados com glicerol.

-2 -1 0 +1 +2

Glúten (g/100Lde solução) 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5

Etanol (mL/100mL de solução) 20 32,5 45 57,5 70

pH 2 3 4 5 6

* O valor de α utilizado foi igual a 2,segundo Gontard, Guilbert; Cuq (1992).

Para essa caracterização, utilizaram-se diferentes alíquotas de solução

formadora de filme para cada formulação (de 1 a 15, Tabela 4.5). Esse

procedimento foi realizado com o intuito de controlar as espessuras para a

repetibilidade das medidas e efeito das variáveis (concentração de glúten, etanol e

pH) estudadas nas propriedades analisadas.

Para a escolha da alíquota utilizada em cada formulação, foram

consideradas as concentrações de glúten. O aumento dessa concentração de 5

para 10% gerou a necessidade de utilizar alíquotas menores para padronizar a


54

espessura final dos filmes. Para a maior concentração de glúten (12,5%), a

alíquota utilizada foi de 25 mL e para menor (2,5%) foi de 40 mL. As soluções

formadoras de filmes secaram em média de 24 a 48 horas, esse tempo se

relaciona às alíquotas utilizadas, sendo que ao se utilizarem maiores valores (40

mL) o tempo elevou-se, sendo maior ao utilizar menor concentração de glúten (2,5

g glúten/ 100 mL).

Tabela 4.5. Alíquotas utilizadas para cada formulação dos biofilmes de glúten e

glicerol.

Formulação Glúten

(g/100 mL)

Etanol

(mL/ 100 mL de solução)

pH Alíquota

(mL)

1 5 32,5 3 35

2 10 32,5 3 40

3 5 57,5 3 30

4 10 57,5 3 35

5 5 32,5 5 30

6 10 32,5 5 35

7 5 57,5 5 35

8 10 57,5 5 40

9 2,5 45 4 40

10 12,5 45 4 25

11 7,5 20 4 40

12 7,5 70 4 45

13 7,5 45 2 35

14 7,5 45 6 35

15 7,5 45 4 35

Os valores reais e codificados das 3 variáveis independentes (concentração

de glúten, etanol e pH), bem como os resultados obtidos (permeabilidade ao vapor

de água, solubilidade em água, resistência à tração e porcentagem de elongação)

encontram-se na Tabela 4.6.


55

De uma maneira geral, os filmes elaborados com glúten e glicerol, em todas

as variáveis estudadas (concentração de glúten, etanol e pH) apresentaram-se

visualmente levemente amarelados e extensíveis.


56

Tabela 4.6. Delineamento experimental para a obtenção da elaboração de filmes à base de glúten plastificados com

glicerol.

Variáveis Independentes Variáveis Dependentes

Glúten

(g/100 mL) *

Etanol

(mL/100mL) *

pH * PVA

(gmm/m2diakPa)*

SOL

(%)*

RT

(MPa)*

ELO

(%)*

1 5 (-1) 32,5 (-1) 3 (-1) 6,08 ± 0,26 23,83 ± 0,43 0,66 ± 0,17 150,55 ± 1,05

2 10 (+1) 32,5 (-1) 3 (-1) 12,72 ± 0,21 19,55 ± 0,13 0,90 ± 0,20 165,67 ± 1,00

3 5 (-1) 57,5 (+1) 3 (-1) 6,49 ± 0,24 23,79 ± 0,49 0,78 ± 0,26 167,72 ± 0,47

4 10 (+1) 57,5 (+1) 3 (-1) 9,11 ± 0,49 20,19 ± 0,42 1,20 ± 0,85 188,55 ± 0,33

5 5 (-1) 32,5(-1) 5 (+1) 6,28 ± 0,31 23,8 ± 0,22 0,45 ± 0,22 150,08 ± 0,81

6 10 (+1) 32,5 (-1) 5 (+1) 9,31 ± 0,55 20,55 ± 0,31 1,11 ± 0,34 164,36 ± 0,51

7 5 (-1) 57,5 (+1) 5 (+1) 8,19 ± 0,05 24,92 ± 0,54 0,77 ± 0,37 159,43 ± 0,30

8 10 (+1) 57,5 (+1) 5 (+1) 9,34 ± 0,26 21,46 ± 0,37 1,15 ± 0,58 171,23 ± 0,41

9 2,5 (-2) 45 (0) 4 (0) 5,44 ± 0,56 24,68 ± 0,41 0,36 ± 0,03 145,89 ± 0,62

10 12,5 (+2) 45 (0) 4 (0) 12,61 ± 0,03 18,86 ± 0,37 1,35 ± 0,45 190,83 ± 0,75

11 7,5 (0) 20 (-2) 4 (0) 9,61 ± 0,16 23,28 ± 0,54 0,82 ± 0,29 131,81 ± 0,26

12 7,5 (0) 70 (+2) 4 (0) 9,85 ± 0,38 20,27 ± 0,65 0,89 ± 0,47 159,11 ± 0,45

13 7,5 (0) 45 (0) 2 (-2) 10,14 ± 0,50 19,54 ± 0,24 1,27 ± 0,26 181,91 ± 0,25

14 7,5 (0) 45 (0) 6 (2) 9,81 ± 0,30 22,38 ± 0,42 1,09 ± 0,33 166,66 ± 0,70

15 7,5 (0) 45 (0) 4 (0) 8,81 ± 0,42 21,29 ± 0,22 0,75 ± 0,02 178,11 ± 0,93

16 7,5 (0) 45 (0) 4 (0) 8,26 ± 0,36 22,18 ± 0,24 0,81 ± 0,31 177,01 ± 0,50

17 7,5 (0) 45 (0) 4 (0) 8,68 ± 0,21 21,22 ± 0,49 0,84 ± 0,32 179,62 ± 0,62

Os valores entre parêntesis são os códigos dos níveis das variáveis independentes. * Média e erro padrão das replicatas. Onde: PVA é a permeabilidade ao vapor de água; SOL é a solubilidade em água; RT é a resistência à tração e ELO é a porcentagem de elongação.


57

4.2.1 Permeabilidade ao vapor de água (PVA)

Na Tabela 4.7, estão apresentados os efeitos dos parâmetros estudados

(concentração de glúten, etanol e pH) sobre a permeabilidade ao vapor de água.

Verifica-se que a variável concentração de glúten , interação entre glúten e etanol,

glúten e pH e etanol e pH influenciaram estaticamente a permeabilidade ao vapor

de água a 95% de confiança. Verifica-se que o efeito concentração de glúten é

positivo, ou seja, ao elevar a concentração de glúten de 5 para 10 g/100mL, o

biofilme sofreu um aumento na permeabilidade ao vapor de água de 3,47

gmm/m2diakPa, em média. Apesar da variável concentração de glúten apresentar

um efeito positivo, a sua combinação com etanol ou pH apresentou um efeito

negativo, gerando diminuição na permeabilidade ao vapor de água, em média, de

1,47 e 1,27 gmm/m2diakPa, respectivamente. Enquanto a combinação entre

concentração de etanol e pH apresentou efeito positivo, aumentando a

permeabilidade ao vapor de água em 1,28 gmm/m2diakPa.

Tabela 4.7. Estimativa dos efeitos das variáveis independentes sobre a

permeabilidade ao vapor de água dos filmes de glúten plastificados com glicerol.

Fator Efeito Erro padrão p-valor

Média 8,2743* 0,4321 0,0000

Glúten (L) 3,4725* 0,3916 0,0000

Glúten (Q) 0,1435 0,3559 0,6987

Etanol (L) -0,9750 0,3916 0,8105

Etanol (Q) 0,4960 0,3559 0,2060

pH (L) -0,2425 0,3916 0,5554

pH (Q) 0,6185 0,3559 0,1258

Glúten x Etanol -1,4750* 0,5539 0,0323

Glúten x pH -1,2700* 0,5539 0,0555

Etanol x pH 1,2850* 0,5539 0,05340

* Efeitos estatisticamente significativos a p≤0,05


58

Realizando a comparação entre os efeitos dos fatores e suas interações

(Tabela 4.7), observa-se que a concentração de glúten apresentou maior efeito

sobre a permeabilidade ao vapor de água. Gontard; Guilbert e Cuq (1992)

estudaram os efeitos da concentração de glúten, concentração de etanol e pH da

solução formadora de filme em diversas propriedades, utilizando metodologia de

superfície de resposta. Os autores perceberam que a elevação da concentração

de etanol, em pH>4, causou aumento da permeabilidade ao vapor de água, o que

ocorreu em virtude da maior heterogeneidade dos filmes nas baixas

concentrações de etanol. Em altas concentrações de etanol, baixo pH é requerido

para obter-se uma estrutura homogênea dos filmes, pois, caso contrário, ocorre a

exposição dos resíduos hidrofílicos da superfície das proteínas, o que melhora a

afinidade de moléculas de vapor de água com as proteínas do glúten, que gera o

aumento da permeabilidade ao vapor de água. Tanada-Palmu e Grosso (2002)

estudaram o efeito da concentração de glúten, glicerol, etanol e pH em diversas

propriedades dos biofilmes de glúten. Os autores verificaram aumento da

permeabilidade proporcionalmente à elevação da concentração de etanol e

glicerol.

A permeabilidade ao vapor de água dos filmes desenvolvidos variou de 5,44

a 12,72 gmm/m2diakPa. Resultados semelhantes foram encontrados por Tanada-

Palmu e Grosso (2002), que obtiveram resultados variando de 5,72 a 14,91

gmm/m2diakPa. Tanada-Palmu e Grosso (2003) desenvolveram filmes à base de

glúten proveniente de quatro tipos de farinhas de trigo brasileira (2 “fortes” e 2

“fracas”) e compararam suas propriedades mecânicas e de barreira ao vapor de

água com filmes de glúten vital (comercial). A permeabilidade ao vapor de água

variou de 5,72 a 14,65 gmm/m2diakPa, sendo menor para os filmes desenvolvidos

com glúten vital e maior para os filmes das farinhas “fracas”.

Após análise dos efeitos principais e das interações, obteve-se os

coeficientes de regressão do modelo de 2a ordem para a permeabilidade ao vapor

de água (Tabela 4.8).


59


permeabilidade ao vapor de água em filmes de glúten e glicerol.

Fator Coeficiente de

regressão

Erro padrão p-valor

Média 8,2743* 0,4321 0,0000

Glúten (L) 1,7336* 0,1958 0,0000

Glúten (Q) 0,0717 0,1779 0,6987

Etanol (L) -0,0487 0,1958 0,8105

Etanol (Q) 0,2480 0,1779 0,2060

pH (L) -0,1212 0,1958 0,5554

pH (Q) 0,3092 0,1779 0,1258

Glúten x Etanol -0,7375* 0,2769 0,0323

Glúten x pH -0,6350* 0,2769 0,0555

Etanol x pH 0,6425* 0,2769 0,0534

*Coeficientes estatisticamente significativos a p≤0,05.

Utilizando-se os valores contidos na Tabela 4.8, obteve-se o modelo

estatístico adotado (Equação 4.1) que relaciona a permeabilidade ao vapor de

água às variáveis estudadas que apresentaram coeficiente de regressão

estatisticamente significativo (p≤0,05).

PVA = 8,2743 + 1,7362*glúten – 0,7375 glúten*etanol – 0,6350 glúten*pH

+ 0,6425 etanol*glúten [4.1]

A análise de variância (ANOVA) obtida pelo ajuste dos dados ao modelo da

Equação 4.1 é mostrada na Tabela 4.9. Pode-se observar que o modelo

alcançado apresentou um coeficiente de correlação (R2) igual a 0,89.

Comparando-se o F calculado (25,48) com o F tabelado (3,26), verificou-se que o

primeiro é 7,81 vezes maior que o segundo, sendo o modelo, portanto,

estatisticamente significativo, com o qual pode se obter as superfícies de resposta.


60

Tabela 4.9. ANOVA do ajuste do modelo obtido para a permeabilidade ao vapor

de água dos filmes de glúten plastificados com glicerol.

Fonte de

variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Media

Quadrática

F

calculado

F tabelado R2

Regressão 59,12 4 14,78 25,48 3,26 0,89

Resíduo 6,96 12 0,58

Falta de

ajuste

6,80 10

Erro Puro 0,16 2

Total 66,08 16

As superfícies de respostas e curvas de contorno, obtidas a partir do

modelo estatístico, estão apresentada nas Figuras 4.1 a 4.3. Na Figura 4.1,

verificou-se que, com a diminuição da concentração de proteína (de 10,0 para

5,0%) e a diminuição da concentração de etanol (de 70 para 32,5 mL), a

permeabilidade ao vapor de água se reduziu. O mesmo pode ser observado

(Figura 4.2) com a diminuição do pH (de 6 para 3) e da concentração de glúten (de

10,0 para 5,0%). Analisando a Figura 4.3, conclui-se que, para obter-se menores

valores de permeabilidade ao vapor de água, deve-se utilizar pH entre 4 e 6 e

concentrações de etanol acima de 45 mL.


61

Figura 4.1. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da permeabilidade ao vapor de água em função da concentração de glúten e etanol.

Figura 4.2. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da permeabilidade ao vapor de água em função da concentração de glúten e pH.

Figura 4.3. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da permeabilidade ao vapor de água em função da concentração de etanol e pH.


63

4.2.2 Solubilidade em água (SOL)

Na Tabela 4.10, estão estimados os efeitos das variáveis independentes

(concentração de glúten, concentração de etanol e pH) e suas interações sobre a

resposta solubilidade em água. Pode-se observar que a única variável significativa

(p≤0,05) foi a concentração de glúten, causando um efeito negativo, ou seja, com

o aumento da concentração ocorreu a diminuição na solubilidade em água dos

filmes, da ordem de 3,27%.


solubilidade em água dos filmes de glúten plastificados com glicerol.


Média 21,8221* 0,6092 0,0000

Glúten (L) -3,2787* 0,5521 0,0005

Glúten (Q) 0,1680 0,5018 0,7475

Etanol (L) -0,4237 0,5521 0,4679

Etanol (Q) 0,1705 0,5018 0,7439

pH (L) 1,1312 0,5521 0,0796

pH (Q) -0,2369 0,5018 0,6511

Glúten x Etanol 0,1175 0,7808 0,8846

Glúten x pH 0,2925 0,7808 0,7190

Etanol x pH 0,3575 0,7808 0,6609

* Efeitos estatisticamente significativos a p≤0,05.

Gontard, Guilbert e Cuq (1992), em estudos com filmes de glúten, relataram

que ao utilizar maiores concentrações de etanol (70%) obtiveram maiores valores

de solubilidade em água. Este efeito foi mais pronunciado ao trabalhar na faixa de

pH entre 5 e 6. Os autores relataram que a alta concentração de etanol induz à

formação de filmes heterogêneos, que podem ser desintegrados completamente e

rapidamente ao serem dispersos em água. Tanada-Palmu e Grosso (2002) não

observaram influência significativa (p≤0,05) em nenhuma das variáveis estudadas

(concentração de glúten, de etanol, de glicerol e pH) na solubilidade em água.


64

A diminuição na solubilidade em água do filme protéico está associada a

uma estrutura mais compacta e resistente, indicando um maior número de

ligações entre cadeias, ou seja, uma matriz tridimensional mais resistente. Quanto

maior o número de grupos SH, mais ligações dissulfídicas são formadas durante a

secagem do filme, dificultando, dessa forma, o acesso das moléculas de água aos

grupos hidrofílicos das cadeias, reduzindo a solubilidade (HANDA et al., 1999).

Os coeficientes de regressão obtidos, utilizando-se o programa Statistica

5.0, estão apresentados na Tabela 4.11. São significativos a 95% de confiança

(p≤0,05) e foram considerados para a obtenção do modelo estatístico para a

solubilidade em água (Equação 4.2).


solubilidade em água.


regressão


Média 21,8221* 0,6029 0,0000

Glúten (L) -1,6393* 0,2760 0,0005

Glúten (Q) 0,0840 0,2509 0,7475

Etanol (L) -0,2118 0,2760 0,4679

Etanol (Q) 0,0852 0,2509 0,7439

pH (L) 0,5656 0,2760 0,0796

pH (Q) -0,1184 0,2509 0,6511

Glúten x Etanol 0,0587 0,3904 0,8846

Glúten x pH 0,1462 0,3904 0,7190

Etanol x pH 0,1787 0,3904 0,6609

* Coeficientes estatisticamente significativos a p≤0,05.

SOL = 21,8221 – 1,6393*glúten [4.2]

A análise de variância (ANOVA) obtida pelo ajuste dos dados ao modelo da

Equação 4.2 é apresentada na Tabela 4.12. Verifica-se um coeficiente de

correlação (R2) de 0,73, e por meio do teste F, conferiu-se a significância


65

estatística (p≤0,05) do modelo à solubilidade em água. Comparando-se o F

calculado (41,34) com o F tabelado (4,54), notou-se que o primeiro é 9,10 vezes

que maior que o segundo. A partir do modelo obtido, pode-se gerar as superfícies

de respostas em função das variáveis significativas, tal como apresentado nas

Figuras 4.4 a 4.6.

Tabela 4.12. ANOVA do ajuste do modelo obtido para a solubilidade em água dos

filmes de glúten plastificados com glicerol.

Fonte de

variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática

F

calculado

F tabelado R2

Regressão 43,00 1 43,00 41,34 4,54 0,73

Resíduo 15,71 15 1,04

Falta de

ajuste

15,14 13

Erro Puro 0,57 2

Total 58,71 16

A relação entre a concentração de glúten e a de etanol pode ser observada

na Figura 4.4. A região de valores de concentração de proteína, entre 10 e 12,5, e

de etanol, em toda faixa estudada (20 a 70 mL/100 mL de solução), apresentou

menor solubilidade. Na Figura 4.5, verifica-se que, na região entre os valores da

concentração de glúten de 10 a 12,5% e valores de pH 2 a 3, os filmes também

apresentaram menor solubilidade em água. Com relação à concentração de etanol

e pH, pode ser observado (Figura 4.6) que a região entre valores de etanol de 45

a 70 mL/100 mL de solução e pH 2 definiu menores valores de solubilidade dos

filmes.


67

Figura 4.4. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da solubilidade em água em função da concentração de glúten e etanol.

Figura 4.5. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da solubilidade em água em função da concentração de glúten e pH.

Figura 4.6. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da solubilidade em água em função da concentração de etanol e pH.


69

4.2.3 Propriedades mecânicas

4.2.3.1 Resistência à tração (RT)

Os valores dos efeitos: (i) concentração de glúten, (ii) concentração de

etanol e (iii) pH na resistência à tração estão apresentados na Tabela 4.13. Os

efeitos dessas variáveis são estatisticamente significativos a 95% de confiança.


resistência à tração dos filmes de glúten plastificados com glicerol.

Fator Efeito Erro padrão p- valor

Média 0,7843* 0,0571 0,0000

Glúten (L) 0,4600* 0,0518 0,0000

Glúten (Q) 0,0235 0,0471 0,6319

Etanol (L) 0,1150* 0,0518 0,0620

Etanol (Q) 0,0235 0,0471 0,6319

pH (L) -0,0525 0,0518 0,3448

pH (Q) 0,1860* 0,0471 0,0055

Glúten x Etanol -0,0250 0,0733 0,7430

Glúten x pH 0,0950 0,0733 0,2360

Etanol x pH -0,0150 0,0733 0,8436


Ao elevar a concentração de glúten de 5,0 para 10,0%, e de etanol de 32,5

para 57,5%, a resistência à tração sofreu um aumento, em média, de 0,4600 e

0,1150 MPa, respectivamente. Por outro lado, ao aumentar o pH de 2 para 6,

houve um aumento na RT de 0,1860 MPa, em média.

Gontard, Guilbert e Cuq (1992) verificaram a influência da concentração de

glúten nas propriedades mecânicas dos filmes, concluindo que o aumento na

quantidade de glúten eleva a resistência à tração. Os autores afirmam que,

durante a secagem dos filmes, o ácido acético e o etanol evaporam, permitindo a

formação de ligações cruzadas entre as cadeias, sendo que essa formação é


70

facilitada pela proximidade das cadeias em maiores concentrações de glúten.

Observaram também que a diminuição do pH (menor que 4) acarretou um

decréscimo nas propriedades mecânicas dos filmes em virtude da perda da

coesividade da estrutura.

Tanada-Palmu e Grosso (2002) também verificaram que, ao aumentar a

concentração de glúten de 6,0 para 9,0%, ocorreu uma elevação da resistência à

tração do biofilme. Yoshida (2002) observou que um aumento na concentração de

proteína 5,50 para 7,50% gerou elevação na tensão na ruptura da ordem de

0,4493 MPa.

A resistência à tração dos filmes de glúten desenvolvidos variou de 0,45 a

1,27 MPa. Resultados similares foram obtidos por Micard et al. (2000) em estudo

da influência da agitação e vários tratamentos químicos e físicos em filmes de

glúten. Os autores obtiveram filmes de glúten com resistência à tração, variando

de 1,2 a 6,3 MPa, e elongação de 170 a 501%. Kayserilioglu et al. (2003)

estudaram o efeito da temperatura de secagem dos filmes (20, 50 e 80°C) e da

umidade relativa de secagem (35 e 70%) nas propriedades mecânicas dos filmes

de glúten e observaram que, ao aumentar a temperatura, ocorreu elevação da

resistência à tração (4,5 MPa/20°C, 6,3 MPa/50°C, 8,2 MPa/80°C), sendo maior

em menor teor de umidade (35%). Esse comportamento explica-se pela formação

de ligações cruzadas (ligações covalentes) durante a secagem em altas

temperaturas (80°C). Kayserilioglu et al. (2001), em estudo da caracterização

mecânica e bioquímica de filmes de glúten em função do pH, desenvolveram

filmes de glúten com resistência à tração de 1,7 a 5,2 MPa, sendo maior a pH 11.

Gennadios et al. (1993) investigaram o efeito do pH nas propriedades de

barreira e mecânicas dos filmes de glúten. Observaram variação da resistência à

tração de 0,7 a 4,4 MPa. Os filmes de glúten de trigo se formaram a pH 2-4 e 9-13,

sendo que essa formação foi inibida pela fraca dispersão protéica ao redor do

ponto isoelétrico da proteína (pI igual a 7,6). Os filmes de glúten preparados em

condições alcalinas apresentam resistência à tração maior que os filmes

processados em condições ácidas. Tanada-Palmu e Grosso (2002)


71

desenvolveram filmes de glúten plastificado com glicerol em condições alcalinas,

que apresentaram resistência à tração de 0,42 a 5,38 MPa.

Os coeficientes de regressão obtidos por meio do programa Statitica 5.0

estão apresentados na Tabela 4.14. São estatisticamente significativos a 95% de

confiança (p≤0,05) e foram considerados para a obtenção do modelo final.


RT.


regressão


Media 0,7843* 0,0571 0,0000

Glúten (L) 0,2300* 0,0259 0,0000

Glúten (Q) 0,0117 0,0235 0,6319

Etanol (L) 0,0575* 0,0259 0,6200

Etanol (Q) 0,0117 0,0235 0,6319

pH (L) -0,0265 0,0259 0,3448

pH (Q) 0,0930* 0,0235 0,0055

Glúten x Etanol -0,0125 0,0366 0,7430

Gluten x pH 0,0475 0,0366 0,2360

Etanol x pH -0,0075 0,0366 0,8436

* Coeficientes estatisticamente significativos a p≤0,05.

RT = 0,7843 + 0,2300*glúten + 0,0575* etanol + 0,0930* pH2 [4.3]

A análise de variância (ANOVA), obtida pelo ajuste dos dados ao modelo da

Equação 4.3, está apresentada na Tabela 4.15. Verifica-se um coeficiente de

correlação (R2) de 0,90. Por meio do teste de F, conferiu-se a significância do

modelo, pois o F calculado (45,25) foi 13,26 vezes maior que o F tabelado (3,41).

A partir do modelo obtido, pode-se gerar as superfícies de resposta e suas

respectivas curvas de contorno em função das variáveis estudadas.


72

Tabela 4.15. ANOVA do ajuste do modelo obtido para resistência à tração dos

filmes de glúten plastificados com glicerol.

Fonte de

variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática

F

calculado

F

tabelado

R2

Regressão 1,086 3 0,362 45,25 3,41 0,90

Resíduo 0,109 13 0,008

Falta de

ajuste

0,105 11

Erro Puro 0,004 2

Total 1,195 16

A influência da concentração de glúten, de etanol e pH na resistência à

tração dos filmes de glúten pode ser analisada nas Figuras 4.7 a 4.9. Pode-se

observar que a resistência à tração foi maior utilizando altas concentrações de

glúten (acima de 10%), em todas as faixas de etanol (20 a 70 mL) e pH (2 a 6)

(Figuras 4.7 e 4.8). Verifica-se, na Figura 4.9, que os filmes de glúten

apresentaram maior resistência à tração na região entre valores de etanol

superiores a 57,5 mL e pH 2 e 6.


73

Figura 4.7 Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da resistência à tração em função da concentração de glúten e etanol.

Figura 4.8. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da resistência à tração em função da concentração de glúten e pH.

Figura 4.9. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da resistência à tração em função da concentração de etanol e pH.


75

4.2.3.2 Elongação

Os valores dos efeitos das variáveis independentes estudadas sobre a

porcentagem de elongação (ELO) são apresentados na Tabela 4.16. Verifica-se,

com 95% de confiança, que a concentração de glúten linear e quadrática,

concentração de etanol linear e quadrática, pH linear e a interação entre etanol e

pH apresentaram um efeito estatisticamente significativo sobre a porcentagem de

elongação. As concentrações de glúten e de etanol apresentaram um efeito

positivo, ou seja, ao elevar-se de 5% para 10,0% (glúten) e de 32,5 para 57,2 mL

(etanol), a ELO elevou-se, em média, de 19 e 14%, respectivamente. Entretanto,

ao aumentar o pH de 3 para 5, a porcentagem de elongação diminuiu em média

7,2%. O efeito da interação entre concentração de etanol e pH reduziu a

porcentagem de elongação em média 6%, em média.


porcentagem de elongação dos filmes de glúten plastificados com glicerol.


Média 177,589* 0,7228 0,0000

Glúten (L) 18,9888* 0,6551 0,0011

Glúten (Q) -5,1076* 0,5954 0,0133

Etanol (L) 13,8588* 0,6551 0,0022

Etanol (Q) -16,5576* 0,5954 0,0012

pH (L) -7,2363* 0,6551 0,0080

pH (Q) -2,1451 0,5954 0,0691

Glúten x Etanol 0,8075 0,9265 0,4753

Glúten x pH -2,4675 0,9265 0,1168

Etanol x pH -5,9575* 0,9265 0,0234


Yoshida (2002), em estudo com filmes de proteína do soro do leite, verificou

que a elevação da concentração de proteína de 5,50 para 7,50% causou um

aumento na porcentagem de elongação de 5,89%. O mesmo comportamento foi


76

observado variando-se o pH de 5,90 para 7,90 e a concentração de glicerol de

2,50 para 4,50%, que aumentaram a porcentagem de elongação em 26,9% e

16,4%, respectivamente. A autora explicou que para altas concentrações de

proteínas uma maior quantidade de grupos SH são adicionados, promovendo mais

ligações covalentes S-S, formando filmes mais estáveis e com maior capacidade

de alongar-se.

Gontard, Guilbert e Cuq (1992) notaram que, ao utilizar alta concentração

de glúten (12,5g/100mL) e pH 6, os filmes de glúten obtidos eram muito elásticos.

Tanada-Palmu e Grosso (2002), trabalhando com filmes de glúten com glicerol,

alcançaram valores de porcentagem de elongação semelhantes aos deste estudo.

Eles observaram que a porcentagem de elongação aumenta com a elevação da

concentração de glúten (6 para 9%), ao se utilizar 32,5 mL de etanol.

Os coeficientes de regressão obtidos pelo programa Statistica 5.0 estão

apresentados na Tabela 4.17. São estatisticamente significativos a 95% de

confiança (p≤0,05) e foram considerados para a obtenção do modelo final.


porcentagem de elongação.


regressão

Erro padrão p- valor

Média 177,5896* 0,7228 0,0000

Glúten (L) 9,4944* 0,3275 0,0011

Glúten (Q) -2,5538* 0,2977 0,0133

Etanol (L) 6,9294* 0,3275 0,0222

Etanol (Q) -8,2788* 0,2977 0,0012

pH (L) -3,6181* 0,3275 0,0080

pH (Q) -1,0726 0,2977 0,0691

Glúten x Etanol 0,4038 0,4632 0,4753

Glúten x pH -1,2338 0,4632 0,1168

Etanol x pH -2,9788* 0,4632 0,0233

* Coeficientes estaticamente significativos a p≤0,05.


77

ELO = 177,5896 + 9,4944*glúten – 2,5538*gluten2 + 6,9294*etanol –

8,2788*Etanol2 – 3,6181*pH - 2,9788*etanol*pH [4.4]

A Tabela 4.18 apresenta a análise de variância (ANOVA) da Equação 4.4.

Pode-se observar que o modelo obtido apresentou um bom coeficiente de

correlação (R2=0,97). Comparando-se o F calculado (58,29) com o F tabelado

(3,22), verificou-se que o primeiro é cerca de 18,10 vezes maior que o segundo,

sendo o modelo, portanto, estatisticamente preditivo e significativo, com o qual

pode-se obter as superfícies de resposta (Figuras 4.10 a 4.12).

Tabela 4.18. ANOVA do ajuste do modelo obtido para a porcentagem de

elongação dos filmes de glúten plastificados com glicerol.

Fonte de

variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática

F

calculado

F

tabelado

R2

Regressão 3907,00 6 651,16 58,29 3,21 0,97

Resíduo 111,72 10 11,17

Falta de

ajuste

108,29 8

Erro Puro 3,43 2

Total 4018,72 16

A análise da superfície de resposta e curvas de nível permitiu uma melhor

visualização do efeito das variáveis na porcentagem de elongação, nas condições

e intervalos utilizados neste estudo. Na Figura 4.10, verifica-se o efeito provocado

pela concentração de glúten e de etanol. A porcentagem de elongação é maior na

faixa de concentração de proteína entre 7,5 e 12,5% e etanol de 32,5 e 57,5 mL. O

efeito da concentração de proteína e pH na porcentagem de elongação pode ser

analisado pela Figura 4.11. Ao trabalhar com concentrações de glúten superiores

a 7,5%, pode-se utilizar valores de pH em toda faixa estudada para obter-se filmes

com altos valores de porcentagem de elongação. O mesmo pode ser observado

entre a concentração de etanol e o pH e, na faixa de 45 a 57,5 mL de etanol,

pode-se utilizar toda faixa de pH estudada (Figura 4.12).


79

Figura 4.10 Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da porcentagem de elongação em função da concentração de glúten e etanol.

Figura 4.11. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da porcentagem de elongação em função da concentração de glúten e pH.

Figura 4.12. Superfície de resposta e respectiva curva de contorno da variação da porcentagem de elongação em função da concentração de etanol e pH.


81

4.2.4 Otimização das características físicas

O planejamento fatorial permitiu selecionar a melhor formulação de filme de

glúten plastificado com glicerol, com a finalidade de obter um filme com baixa

permeabilidade ao vapor de água e alta resistência à tração.

Gontard, Guilbert e Cuq (1992) afirmaram que em vez de determinar um

ponto ótimo para as superfícies de respostas, é melhor escolher combinações de

formulação baseada nas características desejadas para seu uso específico. Por

exemplo, se o filme for utilizado em coberturas superficiais para manusear o

produto, as propriedades principais para otimizar são as mecânicas e a aparência.

Porém, se for usado como barreira ao vapor de água entre dois componentes de

produtos alimentícios heterogêneos, é necessário um filme com a mais baixa


Em virtude do exposto, optou-se por combinar formulações com o intuito de

obter-se filmes com menores valores de permeabilidade ao vapor de água e

maiores de resistência à tração. Por meio do planejamento fatorial, foi possível

verificar que, para as propriedades desejadas, as variáveis se comportaram de

maneira oposta. As variáveis significativas para a permeabilidade ao vapor de

água foram: (i) concentração de glúten (efeito positivo), (ii) interação entre

concentração de glúten e de etanol (efeito negativo), (iii) interação entre

concentração de glúten e pH (efeito negativo) e (iv) interação entre concentração

de etanol e pH (efeito positivo). As variáveis expressivas para resistência à tração

foram: (i) concentração de glúten (efeito positivo), (ii) concentração de etanol

(efeito positivo) e (iii) pH (efeito positivo).

Os filmes de glúten desenvolvidos, de uma maneira geral, tiveram baixos

valores de resistência à tração, sendo o maior valor de 1,27 MPa e, portanto, esta

propriedade foi excluída como parâmetro de definição da melhor formulação,

baseando-se a escolha somente na permeabilidade ao vapor de água.


82

A melhor formulação determinada, nesse caso, visando manter baixos

valores de permeabilidade ao vapor de água, foi a concentração de glúten de 2,5 e

5 g/100 mL, concentração de etanol 20-32,5 ou 57,5-70 mL/100 mL e pH 2-3 e 5-

6. Como para ajustar o pH da solução formadora de filme utiliza-se ácido acético,

que exala um aroma muito forte durante o processo de secagem, optou-se por

utilizar pH mais elevados (5-6), em razão da menor quantidade adicionada de

ácido acético para o ajuste da solução.

Sendo assim, trabalhou-se com a seguinte formulação: glúten 2,5 e 5 g/100

mL, etanol 20 e 32,5 mL/100 mL e pH 5 e 6. As soluções formadoras de filme

produzidas com 20 mL de etanol apresentaram pH próximo de 6, sendo

necessário adicionar uma pequena quantidade de ácido acético para ajustar o pH

para 6, quando a concentração de glúten era de 5 g, e nenhuma quantidade de

ácido acético foi necessária quando a quantidade era igual a 2,5 g de glúten, pois

o pH da solução era 6. As soluções nas quais o pH não foi ajustado não formaram

filme. Isso ocorreu provavelmente em função da insolubilização da glutenina, que

é insolúvel em etanol, ligeiramente em etanol à quente e solúvel em soluções

alcalinas (KASARDA; NIMMO; KOHLER, 1971). As soluções com 5 g de glúten,

às quais se adicionou maior quantidade de ácido acético formaram filmes

extremamente frágeis que eram rompidos ao serem retirados do suporte, mesmo

utilizando altas alíquotas (acima de 50 mL). Assim sendo, optou-se por fixar o pH

em 5.

Portanto, foram elaborados filmes com 2,5 e 5 g de glúten/100 mL,

concentração de etanol de 20 e 32,5 mL/100 mL e pH 5. Nas formulações

desenvolvidas com 2,5g de glúten, foi utilizada a alíquota anteriormente estudada

de 40 mL, mas os filmes obtidos se apresentaram frágeis. Dessa forma, testou-se

alíquotas superiores (50 a 60 mL), o que provocou a formação de filmes

extensíveis que sofriam deformações ao serem retirados do suporte. Além do

inconveniente na retirada dos filmes do suporte, eles necessitavam, no mínimo, de

72 horas para secarem, principalmente ao utilizar a menor concentração de etanol

(20 mL). Assim, foi descartada a concentração de glúten de 2,5 g.


83

Fixada a concentração de glúten, foram elaboradas duas formulações, com

5 g de glúten/100 mL de solução e variando o teor de etanol de 20 e 32,5 mL/100

mL, o pH constante e igual a 5. O filme desenvolvido com menor concentração de

etanol demorou a secar e a alíquota precisou ser alterada, enquanto a outra

formulação (idêntica à Formulação 5 do planejamento, Tabela 3.6) manteve-se

nas mesmas condições, ou seja, alíquota de 30 mL e tempo de secagem de 24

horas.

A Formulação 5, que corresponde ao filme produzido com 5% de glúten,

32,5/100mL etanol, pH 5 e glicerol 20% (em relação à quantidade de proteína), em

virtude da sua facilidade de obtenção (alíquota utilizada e tempo de secagem) e as

suas propriedades, foi escolhida para a elaboração e caracterização de todos os

filmes compostos.

4.3 Filmes simples à base de amido plastificados com glicerol

Os filmes simples à base de amido (mandioca, mandioca modificado, milho

ceroso ou milho ceroso modificado) foram confeccionados a partir de solução

formadora nas concentrações de 2 e 4%, plastificados com glicerol (5 e 10% em

relação a massa seca de amido), e preparados com alíquotas variando de 20 a 35

mL. O plastificante foi incorporado à suspensão aquosa de amido antes de sua

gelatinização em banho-maria, pois, com esse procedimento, observou-se

(aparentemente) uma melhor incorporação do plastificante à matriz filmogênica.

Larotonda et al. (2004), em biofilmes à base de fécula de mandioca, e Mali et al.

(2002 e 2004), em biofilmes à base de amido de inhame, também adicionaram o

plastificante antes do tratamento térmico da solução formadora de filme.

Os filmes de amidos, em todas as alíquotas estudadas, se mostraram

levemente opacos, em alguns casos quebradiços (Figura 4.13) em outros

extremamente aderidos às placas de acrílico, sobre as quais foram submetidos à

secagem, não sendo possível a sua retirada.


85

Figura 4.13. Rachaduras no filme de amido após o processo de secagem.

Com a finalidade de facilitar o desprendimento dos filmes das placas de

acrílico, foram avaliados: (i) o uso de spray de silicone e (ii) o aumento da alíquota

da solução formadora de filme (40 a 80 mL). O silicone foi aplicado apenas nas

bordas das placas, retirando-se seu excesso com papel absorvente. Mesmo

assim, os filmes rachavam na tentativa de sua retirada do suporte. Os biofilmes

resultantes mostraram-se muito desuniformes, como se o silicone aplicado tivesse

interagido com a solução formadora, com conseqüente surgimento de bolhas

muito grandes, chegando, muitas vezes, a transformar-se em perfurações. O

aumento da alíquota não causou efeito no desenvolvimento dos filmes simples de

amidos.

Em razão desses problemas detectados durante o desenvolvimento da

pesquisa, não foi possível elaborar e caracterizar os filmes simples de amido de

mandioca, de mandioca modificado, de milho ceroso e de milho ceroso

modificado, plastificados com glicerol.


87

4.4 Filmes compostos

Os filmes simples que obtiveram melhores resultados, quanto às

propriedades de permeabilidade ao vapor de água e resistência à tração, foram

utilizados na confecção de filmes compostos. A solução formadora de filme de

gelatina foi preparada com 10% de gelatina plastificada com 5% de glicerol, e a

solução formadora de filme de glúten foi elaborada com 5% de glúten e 32,5 mL

de etanol à pH 5, plastificada a 20% de glicerol. Como a caracterização dos filmes

simples de amidos não foi possível, optou-se pela avaliação do efeito dos

diferentes amidos diretamente nas propriedades dos filmes compostos.

Foram utilizadas alíquotas fixas de 20 mL para a confecção de todos os

filmes compostos, a fim de se avaliar a influência da mistura das soluções

formadoras nas diversas proporções estudadas (1:1, 1:4, 4:1 e 1:1:1) nas

propriedades dos filmes. Essa alíquota foi selecionada por ser o menor volume

necessário para formação dos filmes compostos.

4.4.1 Caracterizaçao de filme composto de glúten e gelatina, plastificados

com glicerol.


De um modo geral, os filmes elaborados com glúten e gelatina

apresentaram-se manuseáveis e visualmente homogêneos.

4.4.1.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água

Os valores de permeabilidade ao vapor de água dos filmes compostos de

glúten e gelatina (Tabela 4.19) foram iguais a 3,91, 4,46 e 4,81 gmm/m2diakPa,

para proporção de 1:1, 1:4 e 4:1, respectivamente. Não se observou diferença

significativa (p≤0,05) entre os filmes. Os valores obtidos de permeabilidade ao

vapor de água dos filmes compostos foram inferiores aos alcançados nos filmes


88

de gelatina pura (5,38 gmm/m2diakPa) e glúten puro (6,28 gmm/m2diakPa), ou

seja, a combinação das duas proteínas propiciou uma melhora na permeabilidade

ao vapor de água dos filmes. Baldwin et al. (1997) comentam que cada grupo dos

materiais utilizados na formulação dos filmes tem suas vantagens e desvantagens,

e muitas coberturas e filmes, atualmente, são produzidos por meio da sua

combinação.


de compostos glúten de trigo e gelatina, plastificados com glicerol (25°C).

Filmes Proporções Espessura

(mm)

PVA

(gmm/m2diakPa)*

SOL

(%)*

GLU/GEL 1:1 0,062 ± 0,009 3,91 ± 0,19a 33,58 ± 0,29a

GLU/GEL 1:4 0,058 ± 0,009 4,46 ± 0,28a 30,20 ± 0,11a

GLU/GEL 4:1 0,051 ± 0,008 4,81 ± 0,22a 30,34 ± 0,17a

*Média e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, PVA= permeabilidade ao vapor de água e SOL= solubilidade em água.

A solubilidade em água dos filmes variou de 30,20 a 33,58%, não sendo

observada também diferença significativa (p≤0,05) entre os filmes. A solubilidade

em água dos filmes compostos manteve-se na mesma ordem de grandeza dos

simples de gelatina (30,34%) e maiores que os simples de glúten (23,80%).

Tanada-Palmu, Fakhouri e Grosso (2002) desenvolveram filmes compostos

de gelatina e glúten e verificaram a influência da mistura nas propriedades. A

permeabilidade ao vapor de água variou de 4,35 a 6,86 g.mm/m2diakPa, sendo

menor no filme GLU/GEL na proporção 1:4. Os autores observaram que a

permeabilidade ao vapor de água de todos os filmes compostos da mistura de

gelatina e glúten diminuiu em relação aos filmes simples de glúten. Os resultados

deste estudo foram semelhantes aos obtidos pelos autores.


89

4.4.1.3 Propriedades Mecânicas

Os valores de resistência à tração e a porcentagem de elongação

encontrados para filmes compostos de gelatina e glúten encontram-se na Tabela

4.20.

Tabela 4.20. Propriedades mecânicas dos filmes compostos glúten de trigo e

gelatina, plastificados com glicerol (25°C).


(mm)

RT

(MPa)*

ELO

(%)*

GLU/GEL 1:1 0,055 ± 0,006 22,43 ± 1,65b 4,99 ± 0,24b

GLU/GEL 1:4 0,051 ± 0,020 34,11 ± 1,53a 4,89 ± 0,14b

GLU/GEL 4:1 0,062 ± 0,031 12,60 ± 0,70c 26,51 ± 1,60a

*Média e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, RT= resistência à tração e ELO= elongação.

A resistência à tração dos filmes de glúten e gelatina 1:4 (34,11 MPa)

mostrou-se maior que os valores obtidos para os demais. Estes foram menores

que os obtidos para o filmes simples de gelatina (90,73 MPa) e maiores que para

os simples de glúten (0,45 MPa). Resultados semelhantes foram encontrados por

Tanada-Palmu, Fakhouri e Grossol (2002). Estes autores relataram que a adição

de gelatina nas misturas aumentou sensivelmente a resistência à tração em

relação aos filmes simples de glúten, no entanto, a porcentagem de elongação

sofreu um decréscimo. Os valores de resistência à tração dos filmes compostos

(33,93 a 69,94 MPa) obtidos por aqueles autores foram superiores ao deste

estudo.

A maior porcentagem de elongação foi alcançada para o filme de maior

concentração de glúten (Tabela 4.20). As proteínas do glúten apresentam a

característica de formação de uma matriz viscoelástica, resultando em filmes

flexíveis e elásticos. Vicentini (2003) verificou que a adição de glúten ao filme de

fécula de mandioca alterou as curvas de força versus deformação, que passaram


90

de uma curva típica de materiais rígidos e quebradiços para outra típica de

matérias flexíveis.

Com base nos resultados obtidos, é possível concluir que o filme GLU/GEL

1:4 foi o composto com essas misturas que obteve melhores resultados de

permeabilidade ao vapor de água e resistência à tração.

4.4.2 Filmes compostos à base de amido e gelatina

Em virtude da impossibilidade de caracterização dos filmes simples de

amido (mandioca, mandioca modificada, milho ceroso e milho ceroso modificado)

nas concentrações formadas a partir de uma solução contendo 2 e 4%, a

influência da adição de amido foi verificada diretamente na confecção dos filmes

compostos. Foram desenvolvidos filmes compostos com a solução formadora de

gelatina previamente definida (gelatina 10% e glicerol 5%) e dos amidos (2 e 4%

de amido de mandioca, de mandioca modificada, de milho ceroso ou de milho

ceroso modificado) plastificados com 5 e 10% de glicerol (em relação à massa

seca de amido).

Os filmes produzidos com essa formulação foram caracterizados em

relação a suas propriedades físicas. Na determinação da permeabilidade ao vapor

de água, os filmes que continham a concentração de plastificantes igual a 5% (em

relação à massa de amido) na solução formadora de filme de amido, romperam-se

no processo de selagem das células com a parafina, indicando que essa

concentração de plastificante era insuficiente para tornar o filme manuseável. O

mesmo ocorreu no ensaio de propriedades mecânicas, em que, ao fixar o filme ao

probe, ele se rompia, impossibilitando a análise. O tipo e a concentração de

plastificante interefem diretamente nas características do filme a ser obtido

(FAIRLEY et al., 1996). Dessa forma, conclui-se que a concentração de glicerol

(5%) utilizada na suspensão de amido era insuficiente para o desenvolvimento dos

filmes compostos com gelatina, independente do tipo de amido utilizado.


91

Como conseqüência, não foi efetuada a caracterização dos filmes

compostos confeccionados com a solução de amido contendo 5% de glicerol (em

relação à massa seca), mas apenas aqueles obtidos com a concentração de 10%

na solução.

4.4.2.1 Caracterização dos filmes compostos de amido de mandioca nativo e

modificado e gelatina, plastificados com glicerol.

A composição dos filmes compostos de amido de mandioca nativo ou

modificado (2 e 4%) e gelatina elaborados e sua respectiva caracterização estão

apresentados na Tabela 4.21 e 4.22.

4.4.2.1.1 Aspecto visual

Visualmente, todos os filmes obtidos se apresentaram íntegros,

homogêneos, opacos, com ausência de partículas insolúveis e fáceis de

manusear. Os com maiores proporções de solução formadora de filme de amido

de mandioca nativo ou modificado se mostraram mais flexíveis, finos e mais

opacos. Vicentini (2003) também obteve filmes de fécula de mandioca opacos, em

razão da influência da espessura e da concentração de amido na solução

formadora de filme.

4.4.2.1.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água

Os valores de permeabilidade ao vapor de água e a solubilidade em água

dos filmes compostos elaborados encontram-se na Tabela 4.21.


92

Tabela 4.21. Permeabilidade ao vapor de água e a solubilidade em água dos

filmes de compostos de amido de mandioca nativo e modificado e gelatina

plastificados com glicerol (25°C).


(mm)

PVA

(gmm/m2diakPa)*

SOL

(%)*

AM 2%/GEL 1:1 0,058 ± 0,006 5,13 ± 0,12abc 23,92 ± 0,33ef

AM 2%/ GEL 1:4 0,066 ± 0,014 6,42 ± 0,04a 26,21± 0,33de

AM 2%/ GEL 4:1 0,046 ± 0,008 4,51 ± 0,32de 28,80 ± 0,01cd

AM 4%/ GEL 1:1 0,057 ± 0,015 5,37 ± 0,06bc 20,61 ± 0,28g

AM 4%/ GEL 1:4 0,065 ± 0,013 6,15 ± 0,19ab 26,21 ± 0,13de

AM 4%/ GEL 4:1 0,055 ± 0,007 4,35 ± 0,28cde 27,32 ± 0,26cd

AMM 2%/ GEL 1:1 0,052 ± 0,035 4,20 ± 0,09de 32,68 ± 0,29b

AMM 2%/ GEL 1:4 0,064 ± 0,050 4,98 ± 0,06abc 38,63 ± 0,24a

AMM 2%/ GEL 4:1 0,044 ± 0,010 3,11 ± 0,27de 23,51± 0,03ef

AMM 4%/ GEL 1:1 0,052 ± 0,021 2,86 ± 0,16e 29,48 ± 0,20c

AMM 4%/ GEL 1:4 0,069 ± 0,056 4,56 ± 0,25abcd 29,75 ± 0,06c

AMM 4%/ GEL 4:1 0,046 ± 0,024 3,87 ± 0,11cde 18,35 ± 0,22g

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. AM= amido de mandioca nativo; AMM= amido de mandioca modificado; GEL= gelatina, PVA= permeabilidade ao vapor de água e SOL= solubilidade em água.

A permeabilidade ao vapor de água variou de 2,86 a 6,42 gmm/m2diakPa.

Pode-se observar que os filmes compostos com maior proporção de amido de

mandioca (proporção 4:1) obtiveram menores valores de permeabilidade ao vapor

de água, em ambas as concentrações avaliadas (2 e 4%). Esse fato pode ocorrer

em virtude de sua menor espessura, ou seja, a adição de amido produz filmes

mais finos. Vários autores observaram o aumento linear da PVA em função da

espessura (PARK; CHINNAN, 1995; SOBRAL 1999; FAKHOURI; BATISTA;

GROSSO, 2003).

Mali et al. (2004), entretanto, observaram que a elevação da concentração

de amido de cará nos filmes simples causou aumento da permeabilidade ao vapor

de água. Os autores justificaram esse comportamento em razão do aumento dos


93

grupos hidroxil, favorecendo a ligação com a água, e, conseqüentemente, o

aumento da permeabilidade ao vapor de água graças à maior higroscopicidade.

Pode-se observar (Tabela 4.21) que a maioria dos filmes desenvolvidos

com amido de mandioca modificado e gelatina mostraram se menos permeáveis

ao vapor de água que os filmes compostos confeccionados com amido de

mandioca nativo. Isso se deve, provavelmente, à formação de uma rede mais

densa e coesa com a utilização desse tipo de amido.

A utilização de maior proporção de gelatina nos filmes compostos com

amido de mandioca nativo e modificado, tanto com 2 quanto com 4% provocou

aumento da permeabilidade ao vapor de água. Isso resulta, possivelmente, do

caráter hidrofílico da gelatina, que induz a interação com a água, ou ao fato de os

filmes possuírem maiores valores de espessura.

Os valores de permeabilidade ao vapor de água dos filmes compostos de

amido mandioca modificado (2 e 4%) e gelatina, em todas as proporções

estudadas, foram menores que os filmes de gelatina pura (5,38 gmm/m2diakPa).

Assim visto, a adição de amido de mandioca modificado propiciou melhora nessas

propriedades. Em contrapartida, pode-se observar que os filmes compostos de

amido de mandioca nativo, 2 e 4%, com gelatina, 1:4, obtiveram resultados

superiores ao filme simples de gelatina, sendo iguais a 6,42 e 6,15

gmm/m2diakPa, respectivamente. Os valores alcançados também foram menores

que os obtidos por Vicentini (2003) para filmes de fécula de mandioca (11,76

gmm/m2diakPa).

A elevação da concentração (2 para 4%) de amido mandioca nativo e

modificado não causaram diferença significativa (p≤0,05) em nenhuma das

proporções estudadas.

A solubilidade em água variou de 18,35 a 38,63%. Valores semelhantes

foram obtidos por Mali et al. (2002) ao desenvolver filmes com 4% de amido de

cará plastificado com glicerol, que apresentaram solubilidade em água de 26,37%.

Vicentini (2003) encontrou valores de solubilidade em água de 0 a 40% em função


94

da espessura para os filmes de fécula de mandioca. O aumento na concentração

de amido de mandioca modificado (2 para 4%), em todas as proporções, causou

um diminuição estatisticamente significativa (p≤0,05) na solubilidade em água. O

mesmo comportamento foi observado ao utilizar amido de mandioca nativo, na

proporção 1:1.

4.4.2.1.3 Propriedades mecânicas

Os valores de resistência à tração e a porcentagem de elongação dos

filmes compostos de amido de mandioca nativo e modificado com gelatina estão

lançados na Tabela 4.22.

Tabela 4.22. Propriedades mecânicas dos filmes de compostos de amido de

mandioca nativo e modificada e gelatina, plastificados com glicerol (25°C).

Filmes Proporção Espessura

(mm)

RT

(MPa)*

ELO

(%)*

AM 2%/GEL 1:1 0,051 ± 0,006 96,08 ± 1,02e 3,95 ± 0,19bcd

AM 2%/GEL 1:4 0,068 ± 0,014 104,98 ± 1,70de 5,17 ± 0,28abc

AM 2%/GEL 4:1 0,040 ± 0,008 73,94 ± 2,04g 2,73 ± 0,20d

AM 4%/GEL 1:1 0,053 ± 0,015 82,71 ± 2,40fg 3,52 ± 0,23cd

AM 4%/GEL 1:4 0,061 ± 0,013 110,5 ± 1,94d 4,76 ± 0,17abc

AM 4%/GEL 4:1 0,049 ± 0,007 74,21 ± 2,00g 3,07 ± 0,17d

AMM 2%/GEL 1:1 0,050 ± 0,061 126,32 ± 3,02c 6,27 ± 0,17a

AMM 2%/GEL 1:4 0,069 ± 0,050 158,62 ± 1,20a 5,75 ± 0,23ab

AMM 2%/GEL 4:1 0,041 ± 0,010 81,84 ± 2,52g 2,13 ± 0,24d

AMM 4%/GEL 1:1 0,050 ± 0,021 102,65 ± 1,68de 5,47 ± 0,31ab

AMM 4%/GEL 1:4 0,071 ± 0,056 143,78 ± 1,24b 5,78 ± 0,37a

AMM 4%/GEL 4:1 0,042 ± 0,024 85,15 ± 2,83f 4,79 ± 0,67abc

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. AM=amido de mandioca nativo; AMM=amido de mandioca modificado; GEL=gelatina; RT= resistência à tração e ELO= elongação.

A resistência à tração variou de 73,94 a 158,62 MPa. Os filmes compostos

de amido de mandioca nativo ou modificado e gelatina, em todas as


95

concentrações estudadas, tiveram comportamento similar, ou seja, a resistência à

tração foi maior para os filmes na proporção de 1:4 e menor para 4:1.

A adição de gelatina na mistura aumentou sensivelmente a resistência à

tração dos filmes compostos, não sendo estaticamente significativo (p≤0,05)

apenas para o filme com 2% de amido de mandioca nativo. Esse efeito foi maior

nos fabricados com 2% de amido de mandioca modificado. Segundo Cuq et al.

(1996a), a força na ruptura pode aumentar com o aumento da quantidade de

matéria seca na superfície, que propicia o incremento superfícial do número de

cadeias de proteínas, que conduz ao aumento do número potencial de interações

intermoleculares. A espessura é outro fator que pode ter contribuído para

aumentar a resistência à tração. Park et al. (1993) observaram que a tensão e a

deformação na ruptura aumentaram com a espessura de filmes de hidroxipropil-

celulose.

Os filmes compostos desenvolvidos com amido de mandioca modificado

mostraram-se mais resistentes que os com amido de mandioca nativo, isso pode

confirmar os resultados alcançados para a permeabilidade ao vapor de água, que

possivelmente ocorreu em virtude da formação de uma rede mais densa e coesa

com a utilização desse amido.

A elevação da concentração de amido de mandioca modificado (2 para 4%)

causou uma diminuição estatisticamente significativa (p≤0,05) na resistência à

tração dos filmes compostos. No caso dos de amido de mandioca, esse

comportamento apenas ocorreu nos filmes com proporção 1:1; nos demais não

houve diferença significativa.

Mali et al. (2004), em estudo das propriedades de barreira mecânica e

óptica em filmes de amido de cará, obtiveram filmes com resistência à tração

variando de 6,03 a 15,96 N e elongação de 3,44 a 4,78%. Os autores observaram

que a resistência à tração melhora com a elevação da concentração de amido.

Durante a secagem da solução formadora, a água é evaporada, permitindo o

surgimento de uma rede de amido e, durante esse estágio, a aproximação das


96

cadeias do amido é favorecida pela sua alta concentração, facilitando a formação

de uma matriz mais densa. Xu et al. (2005) desenvolveram e caracterizaram filmes

compostos de quitosana e amido. Verificaram que a proporção 1:1 apresentou

maior valor de resistência à tração (40,25 MPa). Os autores atribuíram esse

comportamento à formação de ligações de pontes de hidrogênio intermoleculares

entre NH3+ da quitosana com OH- do amido. O grupo amino (NH2) da quitosana é

protonado para NH3+ no solvente ácido láctico, enquanto a ordem cristalina da

molécula de amido é destruída com a gelatinização, resultando a exposição de

grupos OH e formação de ligações cruzadas com NH3+ da quitosana. Observaram,

também, que essa é uma proporção crítica, pois a elevação da concentração de

amido acima deste valor nos filmes compostos causa uma redução na resistência

à tração. Eles argumentaram que essa diminuição possivelmente ocorreria porque

as pontes de hidrogênio intramoleculares são formadas antes das

intermoleculares, gerando a separação de fase entre os dois componentes.

Chang, Cheah e Seow (2000) desenvolveram filmes de fécula de mandioca com

resistência à tração de 20 MPa.

A porcentagem de elongação dos filmes compostos variou de 2,13 a 6,27%,

sendo menor para o filme composto de amido de mandioca modificado 2% e

gelatina (4:1) e maior para o mesmo, porém na proporção de 1:4.

A elevação da concentração de amido de mandioca modificado (2 para 4%)

causou um aumento estatisticamente significativo (p≤0,05) na porcentagem de

elongação do filme na proporção 4:1; nos demais não foi observado. Os filmes

compostos desenvolvidos mostraram menor porcentagem de elongação que o

filme simples de gelatina (6,85 ± 0,42%).

Xu et al. (2005) observaram que a adição de amido (>1,5 g) causa perda da

flexibilidade dos filmes compostos de quitosana e amido. Romero-Batista et al.

(2005) estudaram a caracterização físico-química e microestrutural dos filmes

preparados por gelatinização à quente e à frio de fontes não convencionais de

amido (Okenia, banana e manga). Verificaram que, quando os filmes de amido

foram preparados por método de gelatinização térmica, o módulo de elasticidade


97

foi maior, independentemente da fonte utilizada. Petersson e Standing (2005)

estudaram as propriedades mecânicas de filmes compostos de amido de batata e

monoglicerídeo, observando filmes com porcentagem de elongação variando de

2,2 a 10,3%.

Com base nos resultados obtidos é possível concluir que o filme de amido

de mandioca modificado 2% e gelatina (1:4) foi o filme composto que obteve

melhores resultados de permeabilidade ao vapor de água e porcentagem de

elongação.

4.4.2.2 Caracterização dos filmes composto de amido de milho ceroso nativo

ou modificado e gelatina, plastificados com glicerol.

A composição, permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água de

filmes compostos de amido de milho ceroso nativo ou modificado (2 e 4%) e

gelatina em suas diversas proporções estão apresentados na Tabela 4.23 e 4.24.

4.4.2.2.1 Aspecto visual

Os filmes obtidos se apresentaram com coloração levemente opaca,

íntegros, homogêneos, com ausência de partículas insolúveis e fáceis de

manusear. Os com menores proporções de solução formadora de gelatina se

mostraram mais flexíveis.

4.4.2.2.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água

Os valores de permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água dos

filmes compostos desenvolvidos encontram-se na Tabela 4.23.


98


de compostos de amido de milho ceroso nativo ou modificado e gelatina

plastificados com glicerol (25°C).


(mm)

PVA

(gmm/m2diakPa)*

SOL

(%)*

AMC 2%/GEL 1:1 0,069 ± 0,014 3,64 ± 0,12c 34,80 ± 0,50e

AMC 2%/GEL 1:4 0,074 ± 0,021 4,30 ± 0,42bc 31,96 ± 0,44e

AMC 2%/GEL 4:1 0,052 ± 0,038 2,23 ± 0,34d 32,27 ± 0,10e

AMC 4%/GEL 1:1 0,051 ± 0,013 3,81 ± 0,38c 28,42 ± 0,15f

AMC 4%/GEL 1:4 0,066 ± 0,002 5,67 ± 0,39ab 27,42 ± 0,10f

AMC 4%/GEL 4:1 0,044 ± 0,015 4,66 ± 0,16bc 23,70 ± 0,58g

AMCM 2%/GEL 1:1 0,076 ± 0,021 4,32 ± 0,16bc 46,86 ± 0,58c

AMCM 2%/GEL 1:4 0,083 ± 0,003 6,31 ± 0,11a 50,35± 0,56b

AMCM 2%/GEL 4:1 0,062 ± 0,005 4,03 ± 0,28c 45,41 ± 0,50c

AMCM 4%/GEL 1:1 0,075 ± 0,008 4,57 ± 0,12bc 51,82 ± 0,53b

AMCM 4%/GEL 1:4 0,088 ± 0,011 6,29 ± 0,03a 57,02 ± 0,67a

AMCM 4%/GEL 4:1 0,061 ± 0,003 4,43 ± 0,06bc 38,01 ± 0,30d

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. AMC=amido de milho ceroso; AMCM=amido de milho ceroso modificado; GEL=gelatina; PVA= permeabilidade ao vapor de água e SOL= solubilidade em água.

A permeabilidade ao vapor de água variou de 2,23 a 6,31 gmm/m2diakPa,

sendo menor nos filmes de 2% amido de milho ceroso e gelatina (4:1) e maior nos

filmes de amido de milho ceroso modificado 2% e gelatina 1:4.

Garcia, Martino e Zaritzky (2000a) estudaram o efeito da adição de lipídios

(óleo de girassol) nas propriedades de barreira de filmes de amido de milho

plastificado com glicerol ou sorbitol. Obtiveram filmes com permeabilidade ao

vapor de água variando de 1,22 a 3,68 1010 gm-1sec-1.Pa-1, sendo os valores mais

baixos obtidos com a adição de lipídios. Isso ocorreu em virtude do aumento da

hidrofobicidade do biofilmes.

O aumento da proporção de gelatina nos filmes compostos elevou a

permeabilidade ao vapor de água em toda faixa estudada, bem como nos tipos de


99

amidos utilizados. Isso resulta da adição de proteína que aumenta a espessura, o

que é afirmado por Chen (1995), quando verificou que a permeabilidade ao vapor

de água de biofilmes varia com a espessura. Park e Chinnann (1995) estudaram o

efeito da espessura nos biofilmes à base de zeína, glúten e derivados de celulose

sobre a permeabilidade ao vapor de água, e observaram comportamento

proporcional linear entre essa propriedade e a espessura.

A substituição do amido de milho ceroso nativo por amido de milho ceroso

modificado nas misturas causou aumento estatisticamente significativo (p≤0,05)

nos filmes com concentração de 2%, nas proporções 1:4 e 4:1.

Os resultados de permeabilidade ao vapor de água alcançados para o filme

simples de gelatina (5,38 ± 0,09 gmm/m2diakPa) foram maiores que a maioria dos

filmes compostos desenvolvidos, com exceção dos com 4% de amido de milho

ceroso e gelatina e amido de milho ceroso modificado (2 e 4%) e gelatina, ambos

nas proporções 1:4. Com isso, a mistura das soluções formadoras de filmes

melhorou as propriedades de barreira ao vapor de água dos filmes simples de

gelatina. A elevação da concentração de amido (2 para 4%) causou um aumento

estatisticamente significativo (p≤0,05) na permeabilidade ao vapor de água dos

filmes compostos de amido de milho ceroso e gelatina e amido de milho ceroso

modificado e gelatina, na proporção 4:1.

A solubilidade em água, dos filmes compostos desenvolvidos, variou de

23,70 a 57,02%. O aumento da concentração de amido de milho ceroso (de 2 para

4%) diminuiu de maneira estatisticamente significativa (p≤0,05) a solubilidade em

água dos filmes compostos, em todas as proporções estudadas. O mesmo

ocorreu para o filme com 4% de amido de milho ceroso modificado e gelatina

(4:1). Ao contrário, nos filmes compostos de amido de milho ceroso modificado (2

e 4%) e gelatina nas proporções 1:1 e 1:4 não foi observada diferença estatística

(p≤0,05) para a solubilidade em água.

Kim e Lee (2002) perceberam que o aumento da concentração de

plastificante provocou diminuição da solubilidade em água em biofilmes de amido


100

altamente carboximetilado. O valor mínimo obtido foi de 59,08%, utilizando glicerol

como plastificante. Tapia-Blácido, Sobral e Menegalli (2005) desenvolveram

biofilmes de amido de amaranto com solubilidade em água de 39,80 a 62,70%.

Os valores obtidos de permeabilidade ao vapor de água se mostraram

semelhantes aos obtidos com a utilização de amido de mandioca nativo ou

modificado, porém a solubilidade em água mostrou-se superior.

4.4.2.2.3 Propriedades mecânicas

Na Tabela 4.24, são apresentados os valores de resistência à tração e a

porcentagem de elongação dos filmes compostos de amido de milho ceroso nativo

ou modificado (2 e 4%) e gelatina, nas proporções de 1:1, 1:4 e 4:1.

Tabela 4.24. Propriedades mecânicas dos filmes compostos de amido de milho

ceroso nativo ou modificado e gelatina, plastificados com glicerol (25°C).


(mm)

RT

(MPa)*

ELO

(%)*

AMC 2%/GEL 1:1 0,065 ± 0,055 65,45 ± 2,41ef 2,71 ± 0,66bc

AMC 2%/GEL 1:4 0,079 ± 0,032 87,88 ± 2,42ab 4,19 ± 0,31ab

AMC 2%/GEL 4:1 0,050 ± 0,041 47,55 ± 2,48g 3,46 ± 0,26abc

AMC 4%/GEL 1:1 0,059 ± 0,010 69,62 ± 1,58de 4,96 ± 0,25a

AMC 4%/GEL 1:4 0,071 ± 0,011 79,73 ± 1,78bcd 2,01 ±0,23c

AMC 4%/GEL 4:1 0,049 ± 0,003 31,75 ± 3,04h 4,68 ± 0,39a

AMCM 2%/GEL 1:1 0,062 ± 0,006 82,33 ± 2,12abc 4,15 ± 0,26ab

AMCM 2%/GEL 1:4 0,078 ± 0,033 98,43 ± 2,22a 4,36 ± 0,20ab

AMCM 2%/GEL 4:1 0,051 ± 0,026 54,05 ± 2,02fg 3,18 ± 0,33abc

AMCM 4%/GEL 1:1 0,070 ± 0,001 73,81 ± 2,13de 3,23 ± 0,38abc

AMCM 4%/GEL 1:4 0,078 ± 0,013 82,64 ± 2,00bc 3,80 ±0,38abc

AMCM 4%/GEL 4:1 0,057 ± 0,009 49,93 ± 2,35g 2,82 ± 0,22bc

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. AMC=amido de milho ceroso; AMCM=amido de milho ceroso modificado; GEL=gelatina, RT= resistência à tração e ELO= elongação.


101

A resistência à tração dos filmes compostos elaborados variaram de 31,75

a 98,43 MPa e a porcentagem de elongação de 2,01 a 4,96%. Os filmes

compostos de amido de milho ceroso nativo ou modificado e gelatina

desenvolvidos na proporção 1:4 mostraram maiores valores de resistência à

tração, seguido pelas proporções 1:1 e 4:1. Portanto, como ocorrido nos filmes

compostos de gelatina e glúten, amido de mandioca e gelatina e amido de

mandioca modificado e gelatina, a adição de gelatina propiciou o aumento da

resistência à tração dos filmes.

Arvanitoyannis, Nakayama e Aiba (1997) estudaram filmes elaborados a

partir de uma mistura de gelatina e amido de batata. Observaram que um elevado

conteúdo de gelatina (>20% p/p) conduziu a um aumento na resistência à tração e

na porcentagem de elongação dos filmes. Arvanitoyannis, Psomiadou e

Nakayama (1996), em estudo com filmes à base de amido de milho, observaram

aumento no módulo de elasticidade de 23,8 para 29,5 MPa com a elevação da

concentração de caseinato de sódio de 0 a 40%. No mesmo trabalho, quando os

autores fixaram a proporção de amido de milho e gelatina (1:1) e variaram a

concentração de glicerol de 0 para 26%, verificaram redução no módulo de

elasticidade de 37,5 para 18,3 MPa.

O aumento da concentração de amido milho ceroso nativo ou modificado

(de 2 para 4%) diminuiu a resistência à tração dos filmes compostos de amido de

milho ceroso e gelatina, na proporção de 4:1, e amido de milho ceroso modificado

e gelatina, nas proporção de 1:1 e 1:4. A substituição do amido de milho ceroso

por amido de milho ceroso modificado causou um aumento estatisticamente

significativo (p≤0,05) na resistência à tração dos filmes compostos na

concentração de 2% e proporção 1:1 e nos filmes a 4% e proporção de 4:1.

Os filmes compostos desenvolvidos com amido de milho ceroso nativo ou

modificado mostraram-se menos resistentes que os produzidos com amido de

mandioca nativo ou modificado. Isso pode ser explicado, provavelmente, pelo fato

de o primeiro tipo possuir maior concentração de amilopectina. Lourdin; Della-

Valle e Colonna (1995) produziram biofilmes de amilopectina, amilose e amido e


102

observaram que uma maior concentração de amilose aumentou a resistência à

tração e a porcentagem de elongação, atingindo, para biofilmes de amilose pura,

valores de 60 MPa e 6%, respectivamente.

Não foi possível observar diferença estatisticamente significativa (p≤0,05)

na porcentagem de elongação com a substituição dos amidos. A variação nas

proporções dos dois polímeros só foi estatisticamente significativa (p≤0,05) para

os filmes elaborados com AMC 4%/GEL 1:4

Com base nos resultados obtidos pela Tabela 24 e 25, conclui-se que o

filme composto que apresentou melhores valores de permeabilidade ao vapor de

água e a resistência à tração foi o com 2% de amido de milho ceroso e gelatina,

na proporção 1:4.

4.4.3 Filmes compostos à base de glúten e amido, plastificados com glicerol

Não foi possível o desenvolvimento dos filmes compostos de glúten e

amido, pois, após sua secagem, permaneceram muito aderidos às placas de

acrílico, impossibilitando sua retirada. Além disso, os filmes apresentaram a borda

quebradiça e rachavam com facilidade. Esse comportamento ocorreu com todos

os amidos e em todas as proporções estudadas. O aspecto desses filmes, após o

período de secagem, pode ser observado nas Figuras 4.14 e 4.15.

Na impossibilidade do desmolde dos filmes, tentou-se um recobrimento por

pulverização de silicone no suporte, utilizando o mesmo procedimento realizado

para os filmes simples de amido. O silicone foi aplicado na superfície das placas

de acrílico, sendo, posteriormente, retirado seu excesso com papel absorvente.

Porém, após a secagem, constatou-se um efeito semelhante ao observado para

os filmes simples de amido, ou seja, houve formação de bolhas e orifícios. É

provável que esse fato tenha ocorrido por alguma reação em virtude da presença

do amido e não do glúten, uma vez que os filmes simples de glúten não

apresentaram esta reação na presença do silicone.


103

Figura 4.14. Filmes compostos de amido e glúten após processo de secagem.

Figura 4.15. Borda dos filmes compostos de amido e glúten após o processo de

secagem.

Desta forma, em razão dos problemas detectados durante o

desenvolvimento desse filme, não foi possível sua obtenção e caracterização.


105

4.4.4 Caracterização dos filmes compostos de amido, gelatina e glúten,

plastificados com glicerol

As proporções dos polímeros formadores de filmes: (i) amido de milho

ceroso (2 e 4%), gelatina e glúten; (ii) amido de milho ceroso modificado (2 e 4%),

gelatina e glúten; (iii) amido de mandioca (2 e 4%), gelatina e glúten; e (iv) amido

de mandioca modificado (2 e 4%), gelatina e glúten, na proporção 1:1:1

plastificados com glicerol, estão apresentados na Tabela 4.25 e 4.26.


Os filmes compostos desenvolvidos apresentaram-se manuseáveis,

visualmente homogêneos e com coloração levemente esbranquiçada, em função

da presença de amido.

4.4.4.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água

Os valores de permeabilidade ao vapor de água e a solubilidade em água

dos filmes compostos encontram-se na Tabela 4.25.


106

Tabela 4.25. Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água dos

diferentes tipos de filmes compostos à base de amido, gelatina e glúten (25°C).


(mm)

PVA

(gmm/m2diakPa)*

SOL

(%)*

AMC 2%/GEL/GLU 1:1:1 0,058 ± 0,008 3,27 ± 0,37ab 27,90 ± 0,08cd

AMC 4%/GEL/GLU 1:1:1 0,059 ± 0,011 4,07 ± 0,48ab 31,02 ± 0,37ab

AMCM 2%/GEL/GLU 1:1:1 0,056 ± 0,003 4,03 ± 0,05ab 21,54 ± 0,31e

AMCM 4%/GEL/GLU 1:1:1 0,054 ± 0,004 3,83 ± 0,10ab 35, 42 ± 0,23a

AM 2%/GEL/GLU 1:1:1 0,037 ± 0,004 3,22 ± 0,13ab 32,35 ± 0,24a

AM 4%/GEL/GLU 1:1:1 0,044 ± 0,035 4,48 ± 0,11a 27,21 ± 0,45d

AMM 2%/GEL/GLU 1:1:1 0,053 ± 0,006 3,09 ± 0,40b 29,97 ± 0,24bc

AMM 4%/GEL/GLU 1:1:1 0,051 ± 0,002 3,73 ± 0,17ab 30,11 ± 0,43b

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. AMC= amido de milho ceroso; AMCM= amido de milho ceroso modificado; AM= amido de mandioca nativo; AMM= amido de mandioca modificado; GEL= gelatina, GLU= glúten; PVA= permeabilidade ao vapor d eágua e SOL= solubilidade em água.


Apenas entre os filmes compostos de 4% amido de mandioca, gelatina e glúten e

os de 2% amido de mandioca modificado, gelatina e glúten foi observada

diferença estatisticamente significativa (p≤0,05) na permeabilidade ao vapor de

água.

A substituição de amido de mandioca por amido de mandioca modificado

diminuiu a permeabilidade ao vapor de água. A elevação da concentração de

amido (2 para 4%) causou aumento na permeabilidade ao vapor de água, com

exceção dos filmes compostos de amido de milho ceroso modificado, gelatina e

glúten. A adição de glúten diminuiu a permeabilidade ao vapor de água dos filmes

compostos com exceção do 4% de amido de milho ceroso e gelatina (1:1). Os

filmes compostos desenvolvidos apresentaram menor permeabilidade ao vapor de

água que os filmes simples de gelatina (5,38 gmm/m2diakPa) e os filmes simples

de glúten (6,28 gmm/m2diakPa). Pode-se verificar, então, que a mistura dos três

biopolímeros resultou em filmes com boas propriedades de barreira ao vapor de

água.


107

Os filmes elaborados com 2% de amido de mandioca, gelatina e glúten e os

preparados com 4% amido de mandioca, gelatina e glúten apresentaram

espessuras de 0,037 e 0,044 mm, respectivamente, sendo menores que as dos

demais. Apesar de esses filmes apresentarem as menores espessuras, elas não

influenciaram na permeabilidade ao vapor de água.

A solubilidade em água (Tabela 4.25) variou de 21,54 a 35,42%. A elevação

da concentração de amido (2 para 4%) causou aumento na solubilidade em água

dos filmes compostos de amido de milho ceroso e ceroso modificado. Os filmes

compostos desenvolvidos com amido de mandioca nativo ou modificados

mostraram maior SOL que os produzidos com amido de milho ceroso nativo ou

modificados. A adição de glúten na mistura de gelatina e amido causou aumento

na solubilidade em água dos filmes de 4% de amido de milho ceroso e gelatina;

2% de amido de mandioca e gelatina; 4% de amido de mandioca e gelatina e 4%

de amido de mandioca modificado e gelatina, todos nas proporções 1:1.


A Tabela 4.26 apresenta os valores de resistência à tração e a

porcentagem de elongação dos filmes compostos de amido (milho ceroso; milho

ceroso modificado; mandioca e mandioca modificado), gelatina e glúten,

plastificados com glicerol.


108

Tabela 4.26. Propriedades mecânicas dos filmes compostos à base de amido

(milho ceroso, milho ceroso modificado, mandioca e mandioca modificado),

gelatina e glúten, plastificados com glicerol (25°C).


(mm)

RT

(MPa)*

ELO

(%)*

AMC 2%/GEL/GLU 1:1: 1 0,062 ± 0,058 65,74 ± 1,89b 3,38 ± 0,41a

AMC 4%/GEL/GLU 1:1: 1 0,055 ± 0,029 66,50 ± 0,98b 3,37 ± 0,36a

AMCM 2%/GEL/GLU 1:1: 1 0,059 ± 0,033 54,81 ± 0,45c 4,17 ± 0,22a

AMCM 4%/GEL/GLU 1:1: 1 0,049 ± 0,021 49,29 ± 0,46c 4,33 ± 0,11a

AM 2%/GEL/GLU 1:1: 1 0,041 ± 0,021 73,64 ± 1,37a 4,46 ± 0,45a

AM 4%/GEL/GLU 1:1: 1 0,046 ± 0,022 75,92 ± 2,24a 3,79 ± 0,34a

AMM 2%/GEL/GLU 1:1: 1 0,050 ± 0,019 76,35 ± 2,14a 4,26 ± 0,29a

AMM 4%/GEL/GLU 1:1: 1 0,056 ± 0,013 75,75 ± 2,00a 4,00 ± 0,75a

*Média e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. AMC= amido de milho ceroso; AMCM= amido de milho ceroso modificado; AM= amido de mandioca nativo; AMM= amido de mandioca modificado; GEL= gelatina, GLU= glúten, RT= resistência à tração e ELO= elongação.

A resistência à tração variou de 49,29 a 76,35 MPa. A substituição de

amido de milho ceroso por modificado, em ambas as concentrações (2 e 4%) na

mistura de glúten e gelatina, causou uma diminuição estatisticamente significativa

(p≤0,05) na resistência à tração. A substituição de amido de mandioca por

modificado não causou diferença significativa (p≤0,05) no mesmo quesito dos

filmes compostos desenvolvidos. O aumento da concentração de amido (de 2 para

4%) não alterou a resistência à tração, em todos os filmes estudados.

A mistura dos três biopolímeros causou diminuição na resistência à tração

dos filmes simples de gelatina (90,73 MPa), assim como dos filmes compostos de

amido de mandioca ou amido de mandioca modificado ou amido de milho ceroso

modificado (2 e 4%) e gelatina, na proporção 1:1.

A porcentagem de elongação variou de 3,37 a 4,46%. Os valores de

porcentagem de elongação (Tabela 4.26) não apresentaram diferença significativa

(p≤0,05).


109

Com base nos resultados apresentados nas Tabelas 4.25 e 4.26, o filme

composto com os três biopolímeros que apresentou melhor propriedade de

barreira ao vapor de água e resistência à tração foi o de amido de mandioca

modificado (2%), gelatina e glúten.

4.5 Filmes compostos selecionados

Com base nos resultados obtidos, foram selecionados filmes compostos

para serem utilizados na elaboração dos filmes ativos, sendo eles: (i) GLU/GEL,

(ii) 2% de AMM/GEL, na proporção de 1:4 e (iii) 2% de AMM/GEL/GLU na

proporção 1:1:1.

Esses filmes foram escolhidos em função das suas características. O filme

composto de GLU/GEL (1:4) em função de possuir baixos valores de

permeabilidade ao vapor de água (4,46 gmm/m2diakPa) e das características de

sua própria formulação, sendo um dos solventes utilizado o etanol e o pH ser 5.

Essas condições são recomendadas para produção dos filmes ativos, contendo

sorbato de potássio, pois esse agente antimicrobiano é mais ativo em pH abaixo

de 5. O filme de AMM/GEL (1:4), por apresentar os maiores valores de resistência

à tração (158,62 MPa) e baixos valores de permeabilidade ao vapor de água (4,98

gmm/m2diakPa). E, por fim, o filme composto de 2% de AMM/GEL/GLU (1:1:1),

em função de estudos com três tipos de biopolímeros serem pouco conhecidos,

além desse filme apresentar os menores valores de permeabilidade ao vapor de

água (3,09 gmm/m2diakPa).

4.5.1 Permeabilidade ao vapor de água, solubilidade em água, resistência à

tração e porcentagem de elongação

A Tabela 4.27 representa os valores de permeabilidade ao vapor de água,

solubilidade em água, resistência à tração e porcentagem de elongação obtidos na

determinação com os três biofilmes selecionados.


110

Tabela 4.27. Permeabilidade ao vapor de água, solubilidade em água e

propriedades mecânicas de filmes simples e compostos selecionados.

Filmes PVA

(gmm/m2diakPa) *

SOL

(%) *

RT

(MPa) *

ELO

(%) *

GLU/ GEL 1:4 4,46 ± 0,28a 30,20 ± 0,11b 34,11 ± 1,53c 4,89 ± 0,14a

AMM 2%/ GEL 1:4 4,98 ± 0,06a 38,63 ± 0,24a 158,62 ± 1,20a 5,75 ± 0,23a

AMM 2%/GEL/GLU

1:1:1

3,09 ± 0,40b 29,97 ± 0,24b 76,35 ± 2,14b 4,26 ± 0,29b

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= gluten, AMM= amido de mandioca modificado, PVA= permeabilidade ao vapor de água; SOL= solubilidade em água; RT= resistência à tração e ELO= elongação.


Não foi observada diferença significativa (p≤0,05) nos filmes compostos de

GLU/GEL (1:4) e AMM/GEL (1:4). O filme de AMM/GEL/GLU (1:1:1) apresentou o

menor valor de permeabilidade ao vapor de água, diferindo estatisticamente dos

demais.

A solubilidade em água (Tabela 4.27) variou de 29,97 a 38,63%, sendo

maior para o filme composto AMM/GEL (1:4). Não se verificou diferença

significativa (p≤0,05) quanto à solubilidade em água para os filmes compostos de

GEL/GLU (1:4) e de AMM/GLU/GEL (1:1:1).

A resistência à tração variou de 34,11 a 158,62 MPa e a porcentagem de

elongação de 4,26 a 5,75%. Notou-se diferença significativa (p≤0,05) em relação à

resistência à tração entre todos os filmes compostos selecionados. A maior

resistência à tração foi a do filme composto de AMM/GEL (1:4) e a menor a do de

GLU/GEL (1:4). O filme de AMM/GLU/GEL (1:1:1) apresentou valor inferior de

porcentagem de elongação, diferindo (p≤0,05) dos demais filmes.


111

4.6 Caracterização dos filmes ativos incorporados de sorbato de potássio

4.6.1 Aspecto visual

Os filmes ativos elaborados com 2 e 4% (p/v) de sorbato de potássio na

solução formadora de filme mostraram-se manuseáveis e visualmente

homogêneos. A adição de sorbato gerou uma coloração amarelada e um sensível

incremento da plasticidade nos filmes, que era maior com o aumento da

concentração do agente antimicrobiano de 2 para 4%. O filme de GLU/GEL

adicionado com 4% de sorbato apresentou, em sua superfície, algumas manchas,

provavelmente oriundas da segregação do agente antimicrobiano.

A incorporação de 4% sorbato de potássio à solução formadora de filme

com os três biopolímeros (amido de mandioca, gelatina e glúten) promoveu a

precipitação do sorbato (Figura 4.16), deixando-os esbranquiçados, opacos e

difíceis de serem retirados inteiros da placa de acrílico. Esse aspecto não foi

observado nos filmes com maior proporção de gelatina, que provavelmente

contribui para a dissolução do sorbato. A pequena concentração de gelatina no

filme elaborado com os três biopolímeros, possivelmente, não consegue evitar a

formação de cristais na estrutura.

Figura 4.16. Aspecto visual do filme de AMM/GLU/GEL (1:1:1) adicionado de 4% de

sorbato de potássio.


113

Silveira (2005) observou que a incorporação de ácido sórbico acima de 9%

na matriz celulósica deixou os filmes quebradiços e opacos, o que foi atribuído à

formação de cristais na estrutura do filme em razão da precipitação do ácido.

Zactiti e Kieckbusch (2006) desenvolveram filmes de alginato com sorbato de

potássio. Observaram que uma das limitações observadas durante a confecção

dos filmes ativos foi a quantidade máxima de sorbato que poderia ser adicionada à

solução formadora de filme. Quando eram superiores a 2000 mg/L, os filmes

apresentavam-se opacos e com coloração esbranquiçadas, sendo possível

verificar que parte do sorbato de potássio encontrava-se na sua superfície. Han e

Floros (1997) observaram que a adição de sorbato de potássio provocou uma

perda da transparência dos filmes de polietileno de baixa densidade.

4.6.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água

A permeabilidade ao vapor de água dos filmes sem e com sorbato de

potássio (2 e 4%) variou de 3,09 a 11,46 gmm/m2diakPa (Tabela 4.28). A adição

de sorbato de potássio gerou um aumento estatisticamente significativo (p≤0,05)

na permeabilidade ao vapor de água de todos os filmes, quando comparados com

os filmes sem sorbato, sendo maior naquele composto de AMM/GLU/GEL (1:1:1).


114


compostos ativos incorporados de sorbato de potássio (25°C).

Filmes Espessura

(mm)

PVA

(gmm/m2diakPa)

SOL

(%)

AMM/GEL (1:4) 0,069 ± 0,028 4,98 ± 0,10d 38,63 ± 0,29d

AMM/GEL (1:4) + 2% SORB 0,067 ± 0,023 7,78 ± 0,43bc 40,49 ± 0,13c

AMM GEL (1:4) + 4% SORB 0,066 ± 0,021 8,87 ± 0,17b 50,81 ± 0,37a

GLU/GEL (1:4) 0,051 ± 0,028 4,46 ± 0,24d 30,20 ± 0,10f

GLU/GEL (1:4) + 2% SORB 0,052 ± 0,025 7,07 ± 0,16c 40,73 ± 0,08c

GLU/GEL (1:4) + 4% SORB 0,051 ± 0,011 11,02 ± 0,17a 48,11 ± 0,42b

AMM/GLU/GEL (1:1:1) 0,056 ± 0,013 3,09 ± 0,32e 29,97 ± 0,24f

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 2% SORB 0,055 ± 0,022 11,46 ± 0,23a 35,75 ± 0,08e

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado, SORB= sorbato de potássio, PVA= permeabilidade ao vapor de água e SOL= solubilidade em água.

A adição de 2% de sorbato gerou um aumento de 56; 58 e 270% na

permeabilidade ao vapor de água dos filmes compostos de amido de AMM/GEL

(1:4); GLU/GEL (1:4) e AMM/GLU/GEL (1:1:1), respectivamente. A elevação na

concentração de 2 para 4%, de sorbato nos filmes não causou diferença

estatisticamente significativa (p≤0,05) nos filmes com AMM/GEL (1:4), porém,

proporcionou um aumento estatisticamente significativo nos de GLU/GEL glúten e

gelatina (1:4). Os filmes de AMM/GLU/GEL (1:1:1) com 4% de sorbato, como

comentado anteriormente, não foram caracterizados pela impossibilidade de

formação de uma matriz contínua com tamanho apropriado para ser avaliada.

Zactiti e Kieckbusch (2006) desenvolveram filmes de alginato (2%) com

sorbato de potássio (150, 450; 750 e 1050 mg/L). Verificaram que a elevação da

concentração de sorbato de potássio nesses filmes ocasionou aumento na

permeabilidade ao vapor de água. Eles relataram que um dos fatores que

influencia a permeação do agente ativo é a estrutura do filme de alginato, que

segundo Skjak-Braek et al. (1980) citado por Zactiti e Kieckbusch (2006), é


115

governada não somente pela concentração e estrutura química, mas também por

sua cinética de formação, dependendo da concentração de cátions, das condições

de armazenamento, da força iônica e do pH.

Kristo; Koutsoumanis e Biliaderis (2008) observaram que o aumento da

concentração de sorbato de potássio e de lactato de sódio nos filmes de

caseinado de sódio provocaram aumento na permeabilidade ao vapor de água. Os

autores atribuíram esse comportamento à habilidade que ambos os agentes

possuem em absorver moléculas de água, particularmente em altas umidades

relativas (maior que 75%), aumentando, assim, a constante de difusão de vapor

de água e, portanto, a permeabilidade ao vapor de água. Além disso, o sorbato e o

lactato, em razão da presença de grupamento OH, poderiam competir mais

fortemente pela água na rede do polímero, contribuindo para maior absorção de

água que, por sua vez, causa um aumento do volume livre e, conseqüentemente,

da permeabilidade ao vapor de água.

Por meio dos resultados alcançados no presente estudo, constatou-se que,

possivelmente, a adição de sorbato de potássio funcionou como plastificante.

Estes são, normalmente, moléculas pequenas, facilmente acopladas entre as

cadeias poliméricas, podendo, quando adicionadas à matriz polimérica, gerar

mudanças nas propriedades físicas, químicas e mecânicas (DE McHUGH;

KROCHTA, 1994b). A incorporação de plastificante em biopolímeros modifica a

organização molecular tridimensional da rede protéica, diminuindo as forças de

atração intermoleculares e aumentando o volume livre do sistema (SOTHORNVIT;

KROCHTA, 2000).

A solubilidade em água (Tabela 4.28) variou de 29,97 a 50,81%. A adição

de sorbato de potássio provocou um aumento estatisticamente significativo

(p≤0,05) na solubilidade em água em todos os filmes estudados. Isso ocorreu,

provavelmente, pela própria dissolução do sorbato em água, solvente no qual ele

é solúvel. Resultados semelhantes foram obtidos por Flores et al. (2007) que

estudaram a influência da adição do sorbato de potássio nas propriedades físicas

dos filmes de amido de mandioca.


116

Além disso, os filmes elaborados com sorbato de potássio, ao serem

colocados em água, intumesciam consideravelmente. A presença do agente

antimicrobiano, atuando como um plastificante adicional aumenta o volume livre

na rede polimérica, deixando-a mais vunerável e o filme, em contato com a água,

a absorve facilmente ou facilita a liberação do sorbato. Esse mesmo mecanismo

se reflete na permeabilidade ao vapor de água, aumentando consideravelmente

seu valor.

4.6.3 Propriedades mecânicas

A Tabela 4.29 apresenta os valores de resistência à tração e a

porcentagem de elongação dos filmes compostos ativos incorporados de sorbato

de potássio, nas concentrações de 2 e 4% no filme final. A resistência à tração

variou de 1,83 a 158,62 MPa e a porcentagem de elongação de 4,26 a 169,27%.

Tabela 4.29. Resistência à tração e porcentagem de elongação dos filmes

compostos ativos incorporados de sorbato de potássio (25°C).

Filmes Espessura

(mm)

RT

(MPa)*

ELO

(%)*

AMM/GEL (1:4) 0,068 ± 0,017 158,62 ± 1,20ª 5,75 ± 0,23e

AMM/GEL (1:4) + 2% SORB 0,070 ± 0,030 104,68 ± 3,09b 58,11 ± 3,05c

AMM/GEL (1:4) + 4% SORB 0,069 ± 0,021 38,09 ± 2,59d 169,27 ± 1,85ª

GLU/GEL (1:4) 0,050 ± 0,009 34,11 ± 1,88d 4,89 ± 0,17e

GLU/GEL (1:4) + 2% SORB 0,050 ± 0,037 14,76 ± 0,62e 45,18 ± 2,24d

GLU/GEL (1:4) + 4% SORB 0,050 ± 0,011 1,83 ± 0,25f 102,06 ± 2,14b

AMM/GLU/GEL (1:1:1) 0,055 ± 0,028 76,35 ± 2,14c 4,26 ± 0,29e

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 2% SORB 0,055 ± 0,035 15,85 ± 0,49e 101,55 ± 2,28b

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado, SORB= sorbato de potássio, RT= resistência à tração e ELO= elongação.

A incorporação de sorbato de potássio causou um decréscimo

estatisticamente significativo (p≤0,05) na resistência à tração dos filmes


117

compostos em relação ao controle, sendo maior com o aumento da quantidade de

sorbato adicionada de 2% para 4%. O acréscimo de 2% de sorbato causou a

diminuição aproximadamente de 34; 56 e 79% na resistência à tração dos filmes

com AMM/GEL (1:4); GLU/GEL (1:4) e AMM/GLU/GEL (1:1:1), respectivamente. A

elevação da concentração (de 2 para 4%) reduziu, aproximadamente, em 64 e

88% a resistência à tração dos filmes com amido de mandioca e gelatina (1:4) e

glúten de trigo e gelatina (1:4), respectivamente.

Esses resultados estão de acordo com os observados em literatura.

Pranoto; Rakshit e Salokhe (2005) estudaram o efeito da incorporação de nisina e

sorbato de potássio na atividade antimicrobiana de filmes de quitosana.

Observaram que a adição de 150 mg/g de sorbato de potássio reduziu, de 37,03

para 13,97 MPa, a resistência à tração dos filmes de quitosana. Fáma et al. (2005)

estudaram as propriedades mecânicas dos filmes à base de amido de mandioca

contendo sorbato de potássio. Eles também observaram uma redução no mesmo

quesito. Han e Floros (1997) não verificaram alterações significativas nas

propriedades de resistência à tração em filmes de polietileno incorporados com

sorbato de potássio. Limjaroen et al. (2003) observaram a redução dessa

propriedade à medida que se aumentou a concentração de sorbato de potássio

nos filmes de cloreto de polivinilideno.

Kristo; Koutsoumanis e Biliaderis (2008) estudaram as propriedades

mecânicas de filme de caseinato de sódio contendo sorbato de potássio.

Observaram diminuição na resistência à tração com a adição do sorbato de

potássio e atribuíram esse resultado ao efeito plastificante da água e do sorbato.

A incorporação de sorbato de potássio gerou um aumento estatisticamente

significativo (p≤0,05) na porcentagem de elongação de todos os filmes (Tabela

4.29). O aumento na concentração de sorbato de potássio (de 2 para 4%)

intensificou esse aumento, sendo maior para o filme de AMM/GEL (1:4) com 4%

de sorbato. Esse comportamento pode ter sido ocasionado pelo efeito plastificante

do sorbato.


118

Pranoto; Rakshit e Salokhe (2005) verificaram uma elevação na

porcentagem de elongação dos filmes de quitosana ao ser adicionado 100-150

mg/g de sorbato de potássio. Han e Floros (1997) não observaram diferença

significativa nessa propriedade com a adição crescente, em filmes de polietileno,

de sorbato de potássio, assim como Limjaroen et al. (2003) com filmes de cloreto

de polivinilideno incorporados de 2 e 3% de sorbato de potássio.

As melhores formulações de filmes compostos ativos foram AMM/GEL e

GLU/GEL, ambas com 2% de sorbato de potássio.

4.6.4 Permeabilidade ao oxigênio

A permeabilidade ao oxigênio dos filmes compostos com e sem a adição de

sorbato está apresentada na Tabela 4.30. Essa propriedade variou de 16,30 a

28,21 cm3m/m2diakPa, sendo menor para o filme de GLU/GEL 1:4 e maior para

AMM/GEL 1:4.

Tabela 4.30. Permeabilidade ao oxigênio dos filmes compostos sem e com

sorbato de potássio.

Filmes PO2

(cm3m/m2dkPa)

AMM/GEL (1:4) 28,21 ± 2,50a

AMM/GEL (1:4) + 2% SORB 27,50 ± 1,56a

AMM/GEL (1:4) + 4% SORB 28,05 ± 3,85a

GLU/GEL (1:4) 16,30 ± 3,67a

GLU/GEL (1:4) + 2% SORB 17,78 ± 0,04a

GLU/GEL (1:4) + 4% SORB 19,51 ± 0,36a

AMM/GLU/GEL (1:1:1) 25,47 ± 2,21a

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 2% SORB 28,17 ± 2,95a

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado, SORB= sorbato de potássio, PO2= permeabilidade ao oxigênio.


119

A adição de sorbato de potássio, independentemente da concentração

adicionada (2 e 4%) e da formulação utilizada, não causou diferença

estatisticamente significativa (p≤0,05) na propriedade em questão.

Limjaroen et al. (2003) desenvolveram filmes de cloreto de polivinilideno

incorporados com diversas concentrações de ácido sórbico, sorbato de potássio

ou nisina. Eles observaram que o aumento da concentração (de 2 para 3%) de

ácido sórbico e sorbato de potássio causou elevação na permeabilidade ao

oxigênio. Segundo os autores, os resultados demonstraram que os filmes

contendo agentes antimicrobianos tiveram aumento dessa propriedade quando

comparados ao filme controle, exceto nos que contém sorbato de potássio (2%) e

ácido sorbico (1,5%).

4.6.5 Microscopia eletrônica de varredura

As micrografias dos biofilmes elaborados, neste estudo, sem e com sorbato

de potássio, obtidas por microscopia eletrônica de varredura, são apresentadas

nas Figuras de 4.17 a 4.19, sendo possível visualizar tanto a superfície quanto a

secção transversal após fratura. Esta última foi promovida para evitar

compactação da matriz com a utilização de instrumentos cortantes. Em algumas

micrografias (Figura 4.17B; 4.18B e 4.19F), observa-se o aparecimento, na parte

inferior, da fita de carbono que dá condução ao filme para sua visualização

(representadas nas figuras pela letra “f”). Para observar-se a secção transversal

dos filmes, foi necessária a inclinação do suporte em que estavam os stubs e, com

isso, foi possível visualizar, em alguns casos, além da estrutura da espessura dos

filmes, também a fita de carbono, na qual os filmes eram aderidos para posterior

aplicação da camada de ouro e visualização ao microscópio.

A morfologia da superfície e secção transversal dos filmes compostos de

GLU/GEL (1:4) sem e com a adição de sorbato de potássio (2 e 4% p/v) estão

representadas nas Figuras 4.17A-F.


120

As superfícies do filme controle (Figura 4.17A) e do adicionado de 2% de

sorbato de potássio (Figura 4.17C) apresentaram-se lisas e contínuas. Ao elevar a

concentração do agente antimicrobiano, foi possível visualizar manchas na

superfície do filme, provavelmente em virtude da precipitação do sorbato de

potássio (representada pela letra “m”).

A secção transversal (Figura 4.17B, 4.17D e 4.17F) apresentou-se

compacta, com pequenas estrias (representada pela letra “e”) de coloração branca

inseridas na matriz polimérica. O mesmo comportamento foi observado por

Carvalho e Grosso (2004) nos filmes de gelatina nativa. Esses autores verificaram

que o aparecimento dessas estrias pode estar relacionado com a separação de

fases do plastificante (glicerol) na matriz. As mesmas manchas observadas na

superfície dos filmes com 4% de sorbato também foram verificadas na secção

transversal (Figura 4.17F). Essas manchas observadas microscopicamente na

superfície do filme também foram macroscopicamente visualizadas após a

secagem dos filmes. Resultado semelhante foi verificado por Silveira (2005), em

que a autora notou que a incorporação de ácido sórbico acima de 9% na matriz

celulósica deixou os filmes quebradiços e opacos, sendo esse comportamento

atribuído à formação de cristais na estrutura do filme em razão da precipitação do

ácido sórbico, confirmado por microscopia. De modo geral, os filmes compostos

de GLU/GEL (1:4) apresentaram uma secção transversal (Figura 4.17B, 4.17D e

4.17F) com estrutura fibrilar em função da formação de um emaranhado,

possivelmente causado pela presença da gelatina. O arranjo da gelatina em tripla

hélice parece favorecer a formação de superfície com uma estrutura mais contínua

da matriz filmogênica, bem como uma secção transversal com estas

características (CARVALHO; GROSSO, 2004).


121


compostos de GLU/GEL (1:4): (A) Controle-superfície (0% de sorbato); (B) Controle-


superfície; (D) adicionados com 2% sorbato de potássio secção transversal; (E)

adicionados com 4% sorbato de potássio superfície; (F) adicionados com 4% sorbato de

potássio secção transversal. (Onde: e= estria de plastificante; f = fita de carbono e

m=mancha de sorbato de potássio).

B

C

E

D

F

A

e

f

e

emm


123

A morfologia da superfície e secção transversal dos filmes compostos de

2% de AMM/GEL (1:4), sem e com a adição de sorbato de potássio (2 e 4% p/v),

estão representadas nas Figuras 4.18 A-F. A superfície dos filmes controle (Figura

4.18A) e com sorbato em ambas as concentrações estudadas (2 e 4%) mostrou-

se (Figura 4.18C e 4.18E) lisa, contínua e homogênea. A utilização de sorbato de

potássio na máxima concentração (4%) não provocou as manchas observadas

nos filmes de GLU/GEL (Figura 4.18F).

A secção transversal (Figura 4.18B, 4.18D e 4.18F) dos filmes de

AMM/GEL 1:4 apresentou aspecto semelhante ao dos filmes de GLU/GEL, sendo

compacta, com a presença de pequenas estrias de coloração branca inseridas na

matriz polimérica, estrutura fibrilar e emaranhada e sem poros. A estrutura interna

dos filmes de AMM/GEL com 2% de sorbato apresentou um aspecto mais regular

(Figura 4.18D) que o das demais.


125

C

A B

D

E F

e

f

e

Figura 4.18. Micrografias obtidas por meio de microscopia eletrônica de varredura para os

filmes compostos de AMM/GEL (1:4): (A) controle-superfície (0% de sorbato); (B) controle-


superfície; (D) adicionados com 2% sorbato de potássio-secção transversal; (E)


potássio-secção transversal. (Onde: e= estria de plastificante; f = fita de carbono)


127

Nas Figuras 4.19A e 4.19B, são apresentadas as imagens de superfície e

espessura dos filmes compostos de AMM/GLU/GEL (1:1:1) sem adição de

sorbato. Observa-se que a mistura dos três biopolímeros não causou diferença na

superfície dos filmes em relação aos demais filmes compostos com apenas dois

biopolímeros, que se manteve lisa. Na Figura 4.19B, verificou-se também

pequenas estrias com coloração branca inseridas na matriz polimérica,

provavelmente provocadas pela separação de fase do plastificante. A adição de

2% de sorbato não causou alteração na superfície (Figura 4.19C) do filme,

mantendo-a lisa, contínua e homogênea, porém o aumento da concentração de

sorbato para 4% gerou irregularidades na superfície, com a presença de pequenos

precipitados (Figura 4.19E). Esses precipitados também foram observados

macroscopicamente, sendo que a superfície dos filmes se apresentou opaca e

esbranquiçada (Figura 4.16). A secção transversal (Figura 4.19D) dos filmes com

2% de sorbato apresentou-se compacta e irregular e não foi possível visualizar as

estrias observadas nos filmes controle. A elevação da concentração de sorbato de

potássio (4%) causou aumento da irregularidade da estrutura interna do filme, em

que é possível verificar menor orientação e o aparecimento de pequenos pontos

brancos, que podem ser oriundos de partículas de sorbato insolúveis, pela

saturação do sistema.


129

FE

B

C D

A

e

e

f


compostos de AMM/GLU/GEL (1:4): (A) controle-superfície (0% de sorbato); (B) controle-


superfície; (D) adicionados com 2% sorbato de potássio-secção transversal; (E)


potássio-secção transversal. (Onde: e= estria de plastificante; f = fita de carbono).


131

4.6.6 Análise dinâmico mecânica

A análise dinâmico mecânica (DMA) é capaz de fornecer informações sobre

o comportamento viscoelástico dos materiais. As propriedades mecânicas mais

importantes em polímeros, como tensão-deformação, resistência, tensão-

relaxamento, entre outras, decorrem de processos onde existem grandes

relaxações moleculares e são dependentes da temperatura, habilidade de

desenvolver deformações reversíveis e da íntima correlação entre os processos

mecânicos e químicos (MOTHÉ; AZEVEDO, 2002).

Através da análise dinâmico mecânica, foi possível obter o módulo de perda

(E’’) e o módulo de armazenamento (E’) e, por conseguinte, a razão entre estes

dois parâmetros que é denominada tangente de perda (tan ). A diminuição do

módulo de armazenamento e o aumento do pico da tangente de perda (tan )

correspondem à transição típica de um material rígido (vítreo) para um estado

borrachoso, ou seja, a transição vítrea (GALLIETTA et al., 1998).

Os critérios para a seleção dos dados de análise dinâmico mecânica são

geralmente as curvas do módulo de perda (E’’) ou da tangente de perda (tan ).

Os métodos dinâmicos mecânicos são muito sensíveis a transformações ou

movimentos que ocorrem em nível molecular, sendo capazes de detectar não

somente movimentos significativos, como o caso da temperatura de transição

vítrea (Tg), mas também movimentos mais discretos, conhecidos como relaxações

secundárias (LUCAS, SOARES; MONTEIRO, 2001; MOTHÉ; AZEVEDO, 2002;).

Inicialmente, foram realizadas análises dinâmico mecânica nos filmes

compostos selecionados na primeira etapa (sem adição de sorbato de potássio),

ou seja, GLU/GEL (1:4); 2% de AMM/GEL (1:4) e 2% de AMM/GEL/GLU (1:1:1).

Posteriormente, os filmes ativos selecionados no teste de caracterização:

GLU/GEL (1:4) e 2% de AMM/GEL (1:4), ambos com 2% de sorbato, foram

caracterizados quanto às análises dinâmicos mecânicas.

Os gráficos típicos de análise dinâmico mecânica dos filmes compostos de

GLU/GEL (1:4); 2% de AMM/GEL (1:4); 2% de AMM/GEL/GLU (1:1:1), GLU/GEL


132

(1:4) com 2% de sorbato e 2% de AMM/GEL (1:4) com 2% de sorbato, mostrando

a tangente de perda (tan ), o módulo de armazenamento (E’) e o módulo de

perda (E’’) em função da temperatura, estão representados nas Tabelas 4.31 e

4.32 e nas Figuras 4.20 a 4.24.

Os termogramas da análise dinâmica mecânica dos filmes compostos

elaborados sem sorbato de potássio (Tabela 4.31 e Figuras 4.20 a 4.22)

mostraram a presença de duas temperaturas de transição vítrea para todos os

filmes.

Tabela 4.31. Temperatura de transição vítrea média e umidade dos biofilmes

compostos.

Filmes Umidade Tangente Delta (tan ),

Tg1 Tg2

GLU/GEL 1:4 9,11 ± 0,01 -67,57 ± 3,13a 16,92 ± 0,07a

2% AMM/GEL 1:4 11,45 ± 0,25 -66,46 ± 3,16a 8,22 ± 0,26a

2%AMM/GEL/GLU 1:1:1 9,44 ± 0,75 -59,90 ± 2,51a 15,85 ± 3,56a

Nota: letras diferentes, representam diferenças significativas (p≤ 0,05) entre as médias obtidas pelo teste de Tukey. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado, Tg= Temperatura de transição vítrea.

Para o filme de GLU/GEL (1:4), 2% de AMM/GEL (1:4) e 2% de

AMM/GEL/GLU 1:1:1, a primeira transição foi observada na faixa de -67,67; -66,46

e -59,90°C e a segunda na faixa de 16,92; 8,22 e 15,85°C, respectivamente. As

temperaturas de transição negativas observadas na primeira transição,

possivelmente, estão relacionadas com a fração rica em plastificante indicando

separação de fase entre a macromolécula e o plastificante (glicerol). Cherian et al.

(1995) encontraram valor em torno de -62°C para o glicerol puro. Vanin et al.

(2005) observaram valores de transição vítrea para o glicerol em torno de -54°C.

Dessa forma, é possível concluir que a temperatura (-67,57; -66,46 e -59,90C)

das primeiras transições esteja mesmo relacionada à fração rica em plastificante,

ou seja, o glicerol.


133

Pode-se observar, por intermédio da tangente de perda (Figuras 4.20 a

4.22), que a primeira transição se encontra com menor intensidade tendendo à

linearidade e com o pico bem alargado (variando aproximadamente em uma faixa

de -120 a -20°C), isso se deve principalmente à divisão entre o módulo de perda

(E’’), que se encontra em uma escala que varia de 8000 a 12000 MPa, pelo

módulo de armazenamento (E’), que está em uma escala que varia de 400 a 600

MPa, para se obter o valor da tangente de perda e, conseqüentemente, a

temperatura de transição vítrea.

A segunda transição observada está relacionada com a temperatura de

transição da fase rica da mistura das macromoléculas. Apesar dos biofilmes

compostos serem elaborados com mais de uma macromolécula, os mesmos

apresentaram apenas uma transição. Provavelmente, isso ocorreu pela

miscibilidade entre os componentes utilizados: glúten/gelatina, amido de mandioca

modificado/gelatina e amido de mandioca modificado/gelatina/glúten.

Segundo Lucas, Soares e Monteiro (2001), sistemas miscíveis apresentam

uma única Tg, intermediária aos valores de Tg´s dos componentes puros. A

utilização do DMA para estudos de miscibilidade é baseada na observação de que

sistemas miscíveis apresentam apenas um pico combinado, cuja localização é

dependente da composição (LUCAS; SOARES; MONTEIRO, 2001).


135


e gelatina 1:4.


amido de mandioca modificado e gelatina 1:4.


137

Figura 4.22. Termogramas de DMA dos biofilmes compostos de 2% de amido de

mandioca modificado/gelatina e glúten 1:1:1.

Bertan et al. (2005) observaram por análise dinâmico mecânica que filmes de

gelatina apresentaram uma temperatura de transição vítrea de 32,34C e para os

filmes de gelatina plastificados com triacetina duas temperaturas de transição

vítrea (-61,01C e 28,45C), a primeira resultante do plastificante e a segunda

referente à fase rica em gelatina. Sobral e Menegalli (2002) verificaram transição

vítrea de 50,8C para filmes de gelatina de couro bovino obtidos por DSC

(Differencial scanning calorimetry). Tanada-Palmu (2003) constatou uma

temperatura de transição vítrea dos filmes de glúten plastificados com glicerol de

29,07C. Vicentini (2003) observou duas temperaturas de transição vítrea para os

filmes de fécula de mandioca plastificados com glicerol ou sorbitol, variando de -

73,32 a 53,88C. O autor percebeu, ainda, que esse comportamento só ocorreu

quando a concentração de plastificante utilizada variou de 15 a 25%. Mali et al.

(2006) observaram apenas um Tg nos filmes de amido de mandioca plastificados

com glicerol, sendo a mesma 29,96C.


139

Essa separação de fase, observada em todos os biofilmes compostos

desenvolvidos sem sorbato, pode ser confirmada por microscopia eletrônica de

varredura dos mesmos (Figura 4.17B; 4.18B e 4.19B), em que se verificou a

presença de pequenas estrias de coloração branca inseridas na matriz polimérica,

sendo que essas podem estar relacionadas com a separação de fases do

plastificante (glicerol) na matriz.

A separação de fase entre a macromolécula e o plastificante também foi

observada nos filmes de gelatina plastificados com glicerol (CARVALHO, 2002),

em filmes de metilcelulose plastificado com polietileno glicol 400

(DEBEAURFORT; VOILLEY, 1997) e glúten com glicerol (CHERIAN et al., 1995).

Arvanitoyannis; Nakayama e Aiba (1997) não observaram separação de fases em

filmes de uma mistura de gelatina e amido, plastificados com glicerol ou sorbitol,

porém os termogramas apresentados começaram em 0C, acima da Tg dos

plastificantes. Tanada-Palmu (2003) verificou apenas uma temperatura de

transição vítrea (29,07°C) em filmes de glúten plastificados com glicerol, porém os

termogramas começaram a -20°C.

Segundo a teoria clássica dos polímeros polares, a água atua como

plastificante diminuindo a Tg dos polímeros completamente amorfos e

parcialmente cristalinos. A água forma pontes de hidrogênio com as hidroxilas dos

polímeros naturais polares, inserindo-se entre as cadeias e aumentando o volume

livre. A plastificação, a nível molecular, acarreta um aumento do espaço

intermolecular ou volume livre, diminuindo a viscosidade local, e,

concomitantemente, elevando a mobilidade (FERRY, 1980).

Pelo fato de o biofilme de AMM/GEL (1:4) apresentar maior umidade

(11,45) (Tabela 4.31) e, consequentemente, maior quantidade de água, a mesma

pode ter contribuído para o filme apresentar menor valor de Tg. Segundo Biliaderis

(1992) citado por Tapia-Blácido; Sobral e Menegalli (2005), um aumento no

conteúdo de água do polímero produz uma diminuição do valor de Tg de forma

notória.


140

Os termogramas da análise dinâmica mecânica dos filmes de AMM/GEL

(1:4) com 2% de sorbato de potássio e GLU/GEL (1:4) com 2% de sorbato são

apresentados nas Figuras 4.23 e 4.24 e Tabela 4.32.

Tabela 4.32. Temperatura média de transição vítrea e umidade dos biofilmes

compostos ativos.

Filmes Umidade Tangente Delta (tan ),

Tg1 Tg2

GLU/GEL 1:4 9,11 ± 0,01 - 67,57 ± 3,13ª 16,92 ± 0,07ª

GLU/GEL 1:4 + 2% SORB 10,44 ± 0,44 -81,70 ± 0,79b 13,65 ± 0,33b

AMM2% /GEL 1:4 11,45 ± 0,25 -66,46 ± 3,16ª 8,22 ± 0,26d

AMM2% /GEL 1:4 + 2% SORB 13,51 ± 0,11 -74,46 ± 2,35ab 12,50 ± 0,05c

Nota: letras diferentes, representam diferenças significativas (p≤ 0,05) entre as médias obtidas pelo teste de Tukey. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado e Tg= temperatura de transição vítrea.

É possível observar a presença de duas temperaturas de transição vítrea nos

termogramas dos filmes compostos de GLU/GEL (1:4) e AMM 2% /GEL (1:4),

ambos adicionados de sorbato de potássio a 2% (Figuras 4.23 e 4.24). Para o

filme de GLU/GEL (1:4) com 2% de sorbato e amido de mandioca 2% /gelatina

(1:4) com 2% de sorbato a primeira transição foi observada na faixa de -81,70 e -

74,46 e a segunda transição na faixa de 13,65 e 12,50, respectivamente. As

temperaturas de transição negativas como nos filmes sem sorbato, possivelmente,

estão relacionadas com a fase rica em plastificante (glicerol).


141


e gelatina 1:4 com 2% de sorbato de potássio.


amido de mandioca modificado e gelatina 1:4 com 2% de sorbato de potássio.


143

O uso de sorbato de potássio (2%) provocou um deslocamento na primeira

temperatura de -67,57 para -81,70 e de -66,46 para -74,46 para os filmes de

GLU/GEL (1:4) e 2% AMM/GEL (1:4), respectivamente. Provavelmente, esse

deslocamento ocorreu em virtude do efeito plastificante adicional provocado pela

adição do sorbato, que enfraqueceu as forças intermoleculares entre as cadeias

poliméricas adjacentes, influenciando, dessa forma, no aumento da

permeabilidade ao vapor de água (Tabela 4.28) e redução na resistência à tração

(Tabela 4.29), como também na diminuição da temperatura de transição vítrea.

Aliado ao efeito plastificante do sorbato, que pode ter provocado o deslocamento

da primeira temperatura de transição vítrea, está o conteúdo de água. A adição de

sorbato nos filmes compostos provocou aumento no conteúdo de umidade para os

filmes GLU/GEL (1:4) com 2% de sorbato (de 9,11 para 10,44%) e AMM 2%/GEL

(1:4) com 2% de sorbato (de 11,45 para 13,51%).

A segunda temperatura de transição vítrea está relacionada com a

temperatura de transição da fase rica da misturas dos biopolímeros utilizados:

glúten/gelatina e amido de mandioca modificado/gelatina. Mesmo com a adição de

sorbato de potássio (2%) no sistema, há o aparecimento de apenas uma

transição, indicando miscibilidade entre os componentes.

A adição de sorbato de potássio provocou uma redução de 16,92 para 13,65

na segunda temperatura de transição para o filme de GLU/GEL. O mesmo

comportamento não foi observado para os filmes de AMM/GEL (1:4), onde a

adição de sorbato provocou um aumento nesta propriedade de 8,22 para 12,50

(Tabela 4.32).

No caso do filme de GLU/GEL 1:4, provavelmente, esse comportamento foi

causado pela maior facilidade de incorporação (miscibilidade) do sorbato e glicerol

na matriz deste filme, acarretando maior plastificação do filme, fato evidenciado

pela presença de picos mais largos e integrados, tendendo a ser um único pico no

termograma desse filme (Figura 4.23). A maior facilidade de plastificação dos

filmes de GLU/GEL (1:4) pode ter sido a causa da redução da segunda

temperatura de transição vítrea, observada com a adição de sorbato de potássio.


144

A adição de sorbato causou um aumento na Tg2 de 8,22 para 12,50 (Tabela

4.32) nos filmes de AMM/GEL (1:4). Esse comportamento ocorreu, provavelmente,

pelo fato de o sorbato de potássio, nesse filme, não estar totalmente miscível com

AMM, fazendo com que o mesmo ocupasse lugar ou ficasse “solto” na matriz do

biopolímero, provocando, dessa maneira, o impedimento da movimentação

molecular. Com isso, houve um deslocamento da temperatura de transição vítrea

para valores mais altos.

Comparando-se os termogramas dos filmes de GLU/GEL (1:4) e AMM/GEL

(1:4), ambos sem sorbato (Figura 4.20 e 4.21) com os mesmos filmes adicionados

de sorbato de potássio (Figura 4.23 e 4.24), observa-se que a adição do agente

antimicrobiano provocou alargamento do pico relativo à transição.

Segundo Lucas, Soares e Monteiro (2001), a largura do pico que ocorre na

transição vítrea relaciona-se com a homogeneidade da fase que está sofrendo o

processo. Em sistemas parcialmente miscíveis, é comum ocorrer solubilidade das

cadeias de uma fase na outra, o que pode ser acompanhado pelo alargamento do

pico relativo à transição vítrea da fase na qual cadeias da outra fase estão

solubilizadas. Arvanitoyannis, Nakayama e Aiba. (1997) discutem a questão de ser

muito difícil detectar transições de sistemas complexos, como

gelatina/amido/polióis/água, em particular em baixo conteúdo de umidade. O efeito

do sinergismo entre os componentes pode resultar em um alargamento da

transição.

Famá et al. (2006) estudaram o efeito da concentração de sorbato de

potássio (0; 1000; 2000 e 3000 µg/g) e pH (5 ou 6,7), na cor, umidade,

cristalinidade e propriedades dinâmicos mecânicas de biofilmes de amido de

mandioca. Os autores observaram duas temperaturas de transição vítrea nos

filmes, sendo elas -62°C e outra entre -30 e 10°C. A primeira foi atribuída à fração

rica em plastificante (glicerol) e a segunda, mais larga e em menor intensidade, foi

dependente do nível de acidez e concentração de sorbato de potássio. Os autores

observaram, ainda, que o aumento na concentração do antimicrobiano produziu


145

um deslocamento para baixo nas temperaturas de transição vítrea dos filmes de

amido de mandioca a pH 5 e 6,7.

Kristo et al. (2008) estudaram as propriedades térmicas, mecânicas e

barreira ao vapor de água dos filmes de caseinato de sódio contendo agentes

antimicrobianos (lactato de sódio e sorbato de potássio). Os autores observaram

que o aumento da concentração de lactato de sódio (0; 10 e 20%) e sorbato de

potássio (0; 10 e 25%) nos filmes de caseinato de sódio, provocou deslocamento

da temperatura de transição vítrea para temperaturas mais altas, sendo esse

comportamento mais pronunciado com o uso do lactato de sódio.

Observou-se, em todos os termogramas (Figura 4.20 a 4.24), a presença de

uma fase anômala em torno de 75C, que ocorreu pelo aquecimento e rompimento

do filme durante a análise, impedindo que a faixa de temperatura fosse

completada até o valor desejado.

Uma das características necessárias do plastificante é que seja compatível e

solúvel no biopolímero. A separação de fase nos biofilmes indica a não ocorrência

de 100% de mistura entre o plastificante e biopolímero (GONTARD; RING, 1996).

Por outro lado, como os filmes são materiais de baixa umidade, os plastificantes

encontram-se relativamente concentrados, podendo causar problemas (SOBRAL,

2000). Desse modo, a separação de fases deveria implicar na perda da

flexibilidade do filme, porém, segundo Debeaurfort e Voilley (1997), os

plastificantes podem atuar, também, como lubrificantes das cadeias dos

biopolímeros, facilitando a flexibilidade do filme.

Assim sendo, com base nos dados obtidos, é possível verificar que,

independente dos tipos de filmes compostos elaborados, sem e com sorbato, não

houve uma mistura homogênea dos componentes utilizados, informação essa

ratificada pela análise de microscopia eletrônica de varredura (item 4.6.5). A

presença de duas temperaturas de transição vítrea, assim como de pequenas

estrias resultantes da adição de plastificante, podem ter sido provocadas por

saturação do sistema causada pela concentração utilizada de glicerol.


146

Acima da Tg, a estrutura polimérica é pouco ordenada e viscosa, assim

como abaixo da Tg, a conformação polimérica é mais rígida. A taxa de

permeabilidade ao vapor de água do filme no estado borrachoso (acima de Tg) é

muito maior que a permeação da mesma barreira no estado vítreo (KOELSH;

LAMBUZA, 1992). Em virtude desse fato, aconselha-se a estocagem dos filmes a

temperaturas abaixo da Tg, para que não haja movimentação molecular,

impedindo a reorganização das moléculas e conseqüente alteração nas

propriedades dos filmes, como, por exemplo, aumento na permeabilidade ao vapor

de água e diminuição da resistência à tração.

4.6.7 Ensaio de difusão em halo

4.6.7.1 Isolamento e identificação das espécies fúngicas

Os pães produzidos foram armazenados à temperatura ambiente em sacos

de polietileno. Após 7 dias, foi observada a presença de microorganismos e

efetuada a análise para enumeração e classificação dos fungos isolados. Foi

observado um crescimento de 2,6 x 10 6 UFC/g. Os fungos identificados foram

(Figura 4.25): (A) Eurotium chevalieri; (B) Eurotium amstelodami; (C) Wallemia

sebii, (D) Cladosporium sp e (E). Penicillium raistrickii


147

A B C

D E

Figura 4.25. Fungos isolados para o teste de difusão do halo. (A) Eurotium chevalieri; (B)

Eurotium amstelodami; (C) Wallemia sebii, (D) Cladosporium sp e (E) Penicillium

raistrickii.

4.6.7.2 Determinação da efetividade antimicrobiana dos filmes compostos

contendo sorbato de potássio

O ensaio de difusão em halo para determinação da efetividade

antimicrobiana foi realizado com todos os filmes compostos selecionados

adicionados com 2 e 4% de sorbato de potássio (p/v) em solução.

A concentração da suspensão estão apresentadas na Tabela 4.33. Os

resultados obtidos estão demonstrados nas Tabelas 4.34 a 4.38.


149

Tabela 4.33 . Concentração da suspensão de esporos utilizada em ensaio de

difusão em halo.

Espécie fúngica Concentração da suspensão (esporos/mL)

Eurotium chevalieri 3,1 x 102

Eurotium amstelodami 1,8 x 102

Wallemia sebii 3,7 x 103

Penicillium raestrickii 5,4 x 102

Cladosporium sp. 2,1 x 103

A Tabela 4.34 apresenta o perfil microbiológico dos filmes sem e com

sorbato de potássio (2 e 4%) sobre o fungo Eurotium chevalieri. A adição de

sorbato de potássio (2 e 4%) aos filmes de AMM/GEL (1:4); GLU/GEL (1:4) e

AMM/GLU/GEL (1:1:1) não causou diferença significativa (p≤0,05) na redução do

número de unidades formadoras de colônia.

Tabela 4.34. Perfil microbiológico da eficiência dos filmes ativos pelo teste de

difusão em placa para Eurotium chevalieri.

Filmes UFC/ mL * Diâmetro da zona de inibição (mm)**

AMM/GEL (1:4) 3,10 x 102 a 0 b

AMM/GEL (1:4) + 2% SORB 2,20 x 102 a 0,66 ± 0,18 ab

AMM/GEL (1:4) + 4% SORB 1,90 x 102 a 3,33 ± 0,57 ab

GLU/GEL (1:4) 3,10 x 102 a 0 b

GLU/GEL (1:4) + 2% SORB 1,90 x 102 a 1,66 ± 0,38 ab

GLU/GEL (1:4) + 4% SORB 2,00 x 102 a 3,66 ± 0,58 a

AMM/GLU/GEL (1:1:1) 3,30 x 102 a 0 b

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 2% SORB 2,30 x 102 a 0 b

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 4% SORB 2,60 x 102 a 0 b

UFC: Unidade formadora de colônia. *Média aritmética das replicatas. ** Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas através do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado, SORB= sorbato de potássio.


150

Juntamente com a contagem das unidades formadoras de colônia (UFC)

por placa, foi realizada a medida do halo de inibição formado ao redor do filme.

Pelo fato desse halo não ter sido formado de maneira homogênea, foi medido

como a menor distância entre o filme e a UFC mais próxima. Pode-se observar

(Tabela 4.34) que o halo variou de 0 a 3,66 mm. Não foi observada diferença

significativa (p≤0,05) entre o filme controle (sem sorbato de potássio) e os

adicionados de sorbato (2 e 4%) para os filmes AMM/GEL e AMM/GEL/GLU

quanto o diâmetro do halo. A adição de 4% de sorbato no filme GLU/GEL

promoveu um aumento significativo no diâmetro do halo em relação ao filme

controle, porém não em relação ao adicionado de 2% do agente antimicrobiano.

Pela Figura 4.26, pode-se visualizar o efeito inibitório promovido pela adição

de sorbato de potássio nos filmes, principalmente em GLU/GEL e AMM/GEL e em

menor intensidade para o AMM/GEL/GLU. Há crescimento de fungos sobre a

superfície dos filmes controles em todos os casos, não sendo este efeito

observado nos filmes com sorbato. É possível visualizar nitidamente a redução do

crescimento do fungo Eurotium chevalieri com a adição de sorbato por meio da

formação do halo


151

Figura 4.26. Avaliação da sensibilidade microbiana aos diferentes filmes ativos em

presença de Eurotium chevalieri, pela técnica da difusão em ágar.

A Tabela 4.35 apresenta o perfil microbiológico da eficiência dos filmes

ativos em relação ao fungo Eurotium amstelodami. Pode-se observar que não

houve diferença significativa (p≤0,05) quanto o número de unidades formadoras

de colônias (UFC) com a adição de sorbato de potássio em nenhuma

concentração, assim como no tipo de filme utilizado.


153


difusão em placa para Eurotium amstelodami.

Filmes UFC/ mL* Diâmetro da zona de inibição (mm)**

AMM/GEL (1:4) 1,80 x 102 a 0c

AMM/GEL (1:4) + 2% SORB 1,20 x 102 a 1,33 ± 0,18 c

AMM/GEL (1:4) + 4% SORB 1,20 x 102 a 8,33 ± 0,83 a

GLU/GEL (1:4) 1,50 x 102 a 0 c

GLU/GEL (1:4) + 2% SORB 1,50 x 102 a 1,33 ± 0,17 c

GLU/GEL (1:4) + 4% SORB 1,30 x 102 a 7,00 ± 1,25 ab

AMM/GLU/GEL (1:1:1) 1,60 x 102 a 0 c

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 2% SORB 1,40 x 102 a 2,33 ± 0,44 bc

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 4% SORB 1,30 x 102 a 3,33 ± 0,44 abc

UFC: Unidade formadora de colônia. *Média aritmética das replicatas. ** Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado, SORB= sorbato de potássio.

Por outro lado, a adição de sorbato de potássio provocou um aumento

significativo (p≤0,05) no halo de inibição formado. Tanto para o filme de AMM/GEL

como para GLU/GEL, esse aumento (de 2 para 4%) causou uma elevação

significativa (p≤0,05) no halo de inibição. No caso do filme com os três

biopolímeros (AMM/GLU/GEL), não promoveu diferença significativa (p≤0,05) no

tamanho do halo. A adição de 2% de sorbato não causou diferença significativa

em relação ao controle para todos os filmes estudados.

Na Figura 4.27, é possível visualizar o aumento do halo de inibição com a

adição crescente de sorbato de potássio em todos os filmes estudados. No filme

controle (sem agente antimicrobiano), observa-se crescimento do fungo por toda

extensão da placa e por toda superfície dos filmes. Os filmes de AMM/GEL e

GLU/GEL, ambos com 4% de sorbato, apresentaram maior halo de inibição.


155


presença de Eurotium amstelodami, pela técnica da difusão em ágar.

A Tabela 4.36 indica o efeito dos filmes ativos desenvolvidos sobre o

crescimento de Wallemia sebii. A adição de 2% de sorbato de potássio promoveu

uma redução significativa (p≤0,05) no crescimento de Wallemia sebii para o filme

de AMM/GEL e AMM/GLU/GEL em relação ao controle, porém o aumento da

concentração de 2 para 4% nesse filmes não causou diferença na inibição do

crescimento do fungo quanto as unidades formadoras de colônia. A incorporação

de sorbato de potássio diminuiu o número de unidades formadoras de colônia de

Wallemia sebii para o filme de GLU/GEL, sendo essa inibição potencializada com

a elevação da concentração de sorbato de 2 para 4%.


157


difusão em placa para Wallemia sebii.

Filmes UFC/mL* Diâmetro da zona de inibição (mm)**

AMM/GEL (1:4) 3,72 x 103 a 0 c

AMM/GEL (1:4) + 2% SORB 2,82 x 103 b 1,33 ± 0,19 bc

AMM/GEL (1:4) + 4% SORB 2,93 x 103 bc 3,67 ± 0,51 abc

GLU/GEL (1:4) 3,76 x 103 a 0 c

GLU/GEL (1:4) + 2% SORB 2,52 x 103 d 4,67 ± 0,83 ab

GLU/GEL (1:4) + 4% SORB 2,10 x 103 e 5,67 ± 1,01 a

AMM/GLU/GEL (1:1:1) 3,74 x 103 a 0 c

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 2% SORB 2,59 x 103 cd 1,33 ± 0,19 bc

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 4% SORB 2,55 x 103 d 1,66 ± 0,19 abc

UFC: Unidade formadora de colônia. *Média aritmética das replicatas. ** Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas pelo teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado, SORB= sorbato de potássio.

O halo de inibição formado variou de 0 a 5,67 mm, sendo maior para o filme

de GLU/GEL (1:4) contendo 4% de sorbato, o qual também apresentou menos

unidades formadoras de colônia (2,1 x 106 UFC/mL). A adição de sorbato em

ambas as concentrações não causou diferença significativa (p≤0,05) nos filmes de

AMM/GEL e AMM/GLU/GEL com relação ao controle. Foi observada diferença

significativa (p≤0,05) no diâmetro do halo de inibição com a adição de sorbato de

potássio para os filmes de GLU/GEL, porém a elevação da concentração de

sorbato de 2 para 4% não interferiu no tamanho do halo.

Pela fotografia da Figura 4.28, é possível visualizar o crescimento de

Wallemia sebii por toda a extensão da placa, inclusive sobre a superfície do filme

controle. A adição de sorbato de potássio provocou a formação de um halo de

inibição na placa, sendo maior na maior concentração utilizada (4%). O filme de

GLU/GEL com 4% de sorbato de potássio apresentou maior halo de inibição.


159

Figura 4.28. Avaliação da sensibilidade microbiana frente aos diferentes filmes ativos em

presença de Wallemia sebii pela técnica da difusão em ágar.

A Tabela 4.37 apresenta o efeito dos filmes ativos sobre o fungo Penicillium

raistrickii. A adição de sorbato de potássio em ambas as concentrações (2 e 4%)

não provocou diferença significativa nos filmes de AMM/GLU/GEL. Nos de

AMM/GEL (1:4), a adição provocou uma redução significativa (p≤0,05) no número

de unidades formadoras de colônias, porém o aumento de 2 para 4% não causou

diferença nessa redução. Comportamento semelhante ocorreu com o filme de

GLU/GEL, no qual a elevação da concentração de sorbato de 2 para 4% não

interferiu na redução do crescimento do fungo.


161


difusão em placa para Penicillium raistrickii.


AMM/GEL (1:4) 5,40 x 102 ab 0 b

AMM/GEL (1:4) + 2% SORB 3,70 x 102 c 0 b

AMM/GEL (1:4) + 4% SORB 3,30 x 102 c 2,33 ± 0,18a

GLU/GEL (1:4) 5,50 x 102 a 0 b

GLU/GEL (1:4) + 2% SORB 4,50 x 102 abc 0 b

GLU/GEL (1:4) + 4% SORB 4,10 x 102 bc 2,66 ± 0,51 a

AMM/GLU/GEL (1:1:1) 5,40 x 102 ab 0 b

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 2% SORB 5,10 x 102 ab 0 b

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 4% SORB 5,30 x 102 ab 0 b

UFC: Unidade formadora de colônia. *Média aritmética das replicatas. ** Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas pelo teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado, SORB= sorbato de potássio.

O halo de inibição formado variou de 0 a 2,66 mm. Os únicos filmes ativos

que apresentaram a formação de halo de inibição foram AMM/GEL e GLU/GEL,

ambos com 4% de sorbato de potássio. Não foi observada diferença significativa

entre o tamanho dos halos dos dois filmes.

A Figura 4.29 apresenta a formação do halo de inibição, principalmente

para os filmes de GLU/GEL e AMM/GEL, ambos com 4% de sorbato. Os filmes

controles (sem a adição de sorbato) apresentaram crescimento em toda extensão

da placa, independentemente do tipo de filme. A adição de 2% não induziu à

formação do halo de inibição, porém diminuiu o crescimento sobre a superfície.


163


presença de Penicillium raistrickii pela técnica da difusão em ágar.

A Tabela 4.38 apresenta resultados do efeito dos filmes ativos

desenvolvidos sobre o crescimento de Cladosporium sp. A adição de sorbato de

potássio gerou redução significativa (p≤0,05) no crescimento de Cladosporium sp

para todos os filmes, sendo maior para o de GLU/GEL. A elevação da

concentração de sorbato de potássio de 2 para 4%, gerou uma redução

significativa (p≤0,05) no crescimento de Cladosporium sp para o filme de

AMM/GLU/GEL. O mesmo comportamento não foi observado para os demais

filmes (AMM/GEL e GLU/GEL), em que o aumento da concentração do agente

antimicrobino (2 para 4%) não causou redução no crescimento.


165


difusão em placa para Cladosporium sp.


AMM/GEL (1:4) 2,15 x 103 a 0 c

AMM/GEL (1:4) + 2% SORB 1,52 x 103 b 8,33 ± 0,39 a

AMM/GEL (1:4) + 4% SORB 1,49 x 103 bc 9,33 ± 0,14 a

GLU/GEL (1:4) 2,10 x 103 a 0 c

GLU/GEL (1:4) + 2% SORB 1,05 x 103 e 4,33 ± 0,54 b

GLU/GEL (1:4) + 4% SORB 1,02 x 103 e 8,67 ± 0,39 a

AMM/GLU/GEL (1:1:1) 2,10 x 103 a 0 c

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 2% SORB 1,41 x 103 c 2,33 ± 0,14 bc

AMM/GLU/GEL (1:1:1) + 4% SORB 1,20 x 103 d 1,66 ± 0,14 bc

UFC: Unidade formadora de colônia. *Média aritmética das replicatas. ** Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, AMM= amido de mandioca modificado, SORB= sorbato de potássio.

O halo de inibição formado variou de 0 a 9,33 mm, sendo maior para o filme

de AMM/GEL contendo 4% de sorbato. A adição de sorbato em ambas as

concentrações (2 e 4%) não causou diferença significativa (p≤0,05) nos filmes de

AMM/GLU/GEL, quanto ao tamanho do halo. A adição de 2% de sorbato provocou

um aumento significativo (p≤0,05) nos filmes de AMM/GEL quanto ao tamanho do

halo, porém o aumento na concentração do agente antimicrobino (2 para 4%) não

alterou de maneira significativa o tamanho do halo. O mesmo comportamento não

foi observado para o filme de GLU/GEL, o qual o aumento da concentração de

sorbato provocou um aumento significativo (p≤0,05) no tamanho do halo.

Na Figura 4.30, é possível visualizar o crescimento de Cladosporium sp por

toda a extensão da placa, inclusive sobre a superfície do filme controle. A adição

de sorbato de potássio provocou a formação de um halo de inibição na placa,

sendo maior na maior concentração de sorbato utilizada (4%), principalmente para

o filme de GLU/GEL.


167


presença de Cladosporium sp. pela técnica da difusão em ágar.

Vários autores avaliaram a eficiência de filmes ativos contra

microorganismos por meio do teste de difusão em halo. Pranoto; Rakshit e

Salokhe (2005) estudaram a atividade antimicrobiana de filmes de quitosana

incorporados de nisina e sorbato de potássio contra Escherichia coli;

Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium; L. monocytogenes e Bacillus

cereus. Os autores observaram a formação de halo apenas nos testes com

Staphylococcus aureus; L. monocytogenes e Bacillus cereus. Somente o filme

confeccionado com nisina apresentou diferença significativa no tamanho do halo

com o aumento de concentração do agente antibactericida. Chen, Yeh e Chiang

(1996) avaliaram a atividade de filmes de metilcelulose e quitosana contendo

benzoato de sódio ou sorbato de potássio, onde observaram em todos os filmes

desenvolvidos a formação de zonas de inibição representativas.


169

Em estudo realizado por Pereira et al. (2006), filmes antimicrobianos

laminados, incorporados com natamicina, foram avaliados quanto à eficiência

antimicrobiana. Os autores observaram a formação de halos de inibição em

presença de Penicillium roqueforti, Aspergillus niger e Penicillium sp, mostrando

que existiu eficiência antimicrobiana dos filmes testados. A elevação da

concentração de natamicina proporcionou aumento da atividade antimicrobiana do

filme, provocando maior liberação do antifúngico para o meio de cultura. O

Penicillium roqueforti apresentou maior susceptibilidade à ação da natamicina que

os Aspergillus niger e Penicillium sp. Limjaroen et al. (2003) desenvolveram filmes

de cloreto de polivinilideno incorporados de diversos agentes antimicrobianos

(lactoferrina, diacetato de sódio, nisina, sorbato de potássio e ácido sórbico) e

verificaram sua atividade pelo teste de difusão em halo contra L. monocytogenes.

Os autores não observaram atividade antimicrobiana para os filmes contendo

lactoferrina e diacetato de sódio, que não apresentaram halo de inibição. A

elevação da concentração de nisina (2 para 2,5p/v) e ácido sórbico (1,5 para 2%

p/v) no filme aumentou o diâmetro do halo de inibição. Os filmes contendo sorbato

de potássio (1; 2 e 3%) apresentaram zona de inibição, porém não diferiram entre

si.

O teste de difusão em halo tem como objetivo verificar a eficiência dos

filmes ativos ante um microorganismo alvo, neste caso, cinco espécies de fungos.

Com base nos resultados obtidos por meio desse teste, o filme com maior

eficiência antimicrobiana foi o GLU/GEL com 2% de sorbato.

4.7 Aplicação de biofilmes ativos em fatias de pão-de-forma

Com base nos resultados de caracterização física e do perfil microbiológico,

os filmes de GLU/GEL 1:4, sem e com 2% de sorbato foram selecionados para

avaliar seu potencial de uso como embalagem ativa no acondicionamento de pão

de forma.


170

As fatias de pão de forma, justapostas, foram intercaladas com os filmes

(fatia/filme/fatia/filme/fatia) (Figura 3.1), colocadas em sacos de polietileno de

baixa densidade (PEBD) e seladas. A amostra controle consistiu no mesmo

conteúdo, mas sem o biofilme entre as fatias. Foram realizadas as seguintes

determinações: perda de peso; textura; umidade, atividade de água, análise

microbiológica e extração e quantificação de sorbato de potássio. As análises

foram realizadas no 1°; 4° e 7° dia de armazenamento a 25°C e umidade relativa

de 63%.

4.7.1 Perda de peso

A Tabela 4.39 apresenta a perda de peso das fatias para os três

tratamentos estudados.

Tabela 4.39. Perda de peso de fatias de pão-de-forma acondicionadas, durante o

armazenamento.

DIAS PEBD GLU/GEL 1:4 GLU/GEL 1:4 + 2% SORB

Perda de Peso (g)*

1° 45,94 ± 0,25aB 49,45 ± 0,30aA 50,63 ±0,41aA

4° 45,70 ± 0,24aB 49,16 ± 0,31aA 50,35 ± 0,42aA

7° 45,50 ± 0,25aB 48,76 ± 0,29aA 50,14 ± 0,42aA

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes na mesma linha representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas na mesma amostra, enquanto letras diferentes na mesma coluna representam diferença significativa (p≤0,05) entre médias obtidas de diferentes amostras, por meio do teste de TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, SORB= sorbato de potássio, PEBD= polietileno de baixa densidade.

Não foi observada diferença significativa (p≤ 0,05) quanto à perda de peso

entre os tratamentos isolados durante o tempo de armazenamento (7 dias). Em

contrapartida, foi observada diferença significativa (p≤ 0,05) entre as amostras, ou

seja, as fatias embaladas com filmes em seu interior apresentaram maiores pesos

em sua embalagem final quando comparadas às fatias embaladas apenas com o

saco de polietileno. Esta diferença, provavelmente, foi causada pelo acréscimo


171

promovido pela inclusão de filmes no interior da embalagem e não propriamente

dito pela alteração do peso das fatias durante o armazenamento.

4.7.2 Textura dos pães

Conforme pode ser observado na Tabela 4.40, os valores de força de

compressão dos pães variaram de 220,10 a 225,91 gf (no 1° dia); 433,58 a 480,27

gf (no 4° dia) e 626,80 a 726,97 gf (no 7° dia). Durante o decorrer do tempo de

vida de prateleira (1° para 7° dia), houve um aumento na força de compressão (gf)

de 285; 315 e 321% para os tratamentos, PEBD, GEL/GLU 1:4 e GLU/GEL 1:4 + 2

SORB, respectivamente. Esse aumento na força de compressão dos pães durante

o armazenamento ocorreu devido ao processo de retrogradação do amido, que faz

com que as moléculas de amido comecem a perder para o meio ambiente a água

que haviam absorvido durante a formação da massa. Segundo Bobbio e Bobbio

(2001), o aumento de firmeza de pães durante o armazenamento é atribuído,

quase que exclusivamente, à retrogradação do amido.

Tabela 4.40. Firmeza das fatias de pães-de-forma acondicionadas, durante o

armazenamento.

DIAS PEBD GLU/GEL 1:4 GLU/GEL 1:4 + 2% SORB

Firmeza (gf)*

1° 220,10 ± 1,85cB 228,88 ± 1,35cA 225,91 ± 1,26cAB

4° 433,58 ± 1,95bC 461,45 ± 1,14bB 480,27 ± 1,89bA

7° 626,80 ± 1,65aC 719,32 ± 1,61aB 726,97 ± 2,36aA


No 4° e 7° dia de análise, a alteração no tipo de tratamento (fatias

embaladas sem ou com filmes, bem como o tipo de filme utilizado) gerou uma


172

diferença significativa (p≤0,05) no perfil de textura das fatias. De modo geral, os

tratamentos nos quais foi observada maior força de compressão das fatias foram

GLU/GEL 1:4 + 2 SORB; GEL/GLU 1:4 e PEBD, respectivamente. Os filmes que

foram adicionados entre as fatias são elaborados com substâncias de natureza

hidrofílica, ou seja, possuem alta afinidade pela água. Assim, provavelmente, esse

aumento ocorreu em virtude da perda de umidade das fatias para o filme e para o

meio ambiente, potencializando o aumento de sua rigidez. Isso é confirmado pela

variação das características físicas dos filmes que se apresentavam mais

plastificados e pegajosos chegando a aderir e envolver as fatias.

4.7.3 Conteúdo de umidade

O conteúdo de umidade das fatias de pão de forma durante o

armazenamento está apresentado na Tabela 4.41. É possível observar que os

valores de umidade variaram de 28,74 a 33,60% durante o armazenamento. Os

resultados de umidade observados, neste estudo, estão de acordo com valores

informados na literatura, e que se situam próximos a 30% (ESTELLER; LANNES,

2005).

Tabela 4.41. Conteúdo de umidade das fatias de pães-de-forma acondicionadas,

durante o armazenamento.

DIAS PEBD GLU/GEL 1:4 GLU/GEL 1:4 + 2%SORB

Umidade (%)*

1° 33,60 ± 0,50ªA 32,54 ± 0,37aAB 30,60 ± 0,47aB

4° 32,55 ± 0,41ªA 30,59 ± 0,45bAB 29,07 ± 0,51aB

7° 32,28 ± 0,17ªA 30,27 ± 0,32bB 28,74 ± 0,51aB



173

Para as fatias embaladas em sacos de polietileno sem filmes e para as

embaladas com filme de GLU/GEL 1:4 contendo 2% de sorbato, não foi observada

diferença estatisticamente significativa (p≤0,05), durante o período de

armagenagem. O único ensaio que registrou redução significativa, do 1° para o 4°

dia, foi o com GLU/GEL 1:4. Essa tendência de perda de umidade provoca o

endurecimento das fatias e explica os resultados observados na análise de textura

(item 4.7.2). Segundo Labuza e Hyman (1998), a migração de umidade, em um

alimento, vai ocorrer continuamente, de uma região para outra, como forma de

equilíbrio dinâmico entre os componentes e o meio.

Comparando-se o efeito do tipo de armazenamento na umidade, é possível

observar que as fatias em que não se usaram os filmes intercalados apresentaram

maior teor de umidade quando comparados às fatias com filmes. No primeiro e

quarto dia (Tabela 4.41), houve uma redução significativa no teor de umidade das

fatias sem filmes quando comparadas à dos filmes de GLU/GEL 1:4 com 2% de

sorbato. No sétimo dia, essa diferença se estendeu também para o

armazenamento com o filme sem sorbato.

Segundo Esteller e Yoshimoto (2004), o envelhecimento do pão não está

relacionado à perda de umidade da massa. Um pão analisado após 5 dias

(armazenado em “condições apropriadas”) possuiria a mesma umidade que um

pão “fresco”, embora apresentasse ao paladar a sensação de estar mais seco,

detectado em análise de textura.

Soares et al. (2002) desenvolveram filmes ativos de acetato de celulose que

foram submetidos a ensaios iguais aos usados neste trabalho. Observaram que,

durante o período de estocagem (14 dias), o conteúdo de umidade inicial de

32,5% atingiu 36% no último dia. Os autores justificaram esse comportamento em

função da permeabilidade ao vapor de água da embalagem.


174

4.7.4 Atividade de água

A Tabela 4.42 apresenta a variação do valor da atividade de água das fatias

de pães de forma durante o período de armazenamento. Os valores obtidos estão

de acordo com os observados na literatura (SOARES et al., 2002).

Tabela 4.42. Valores de atividade de água das fatias de pães-de-forma

acondicionadas, durante o armazenamento.


Atividade de água (aw)*

1° 0,97 ± 0,00aA 0,95 ± 0,01aB 0,94 ± 0,00aC

4° 0,96 ± 0,00bA 0,94 ± 0,01bA 0,94 ± 0,00aA

7° 0,94 ± 0,00bA 0,94 ± 0,00bA 0,92 ± 0,00bB

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes na mesma linha representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas na mesma amostra, enquanto letras diferentes na mesma coluna representam diferença significativa (p≤0,05) entre médias obtidas de diferentes amostras, por meio do teste TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, SORB= sorbato de potássio, PEBD= polietileno de baixa densidade.

O uso de filmes de GLU/GEL 1:4, assim como apenas a embalagem de

polietileno, provocou uma redução significativa (p≤0,05) na atividade de água das

fatias durante o período de armazenamento, principalmente do 1° para o 4°dia,

não apresentando diferença do 4° para o 7° dia. Essa diferença (do 4° para o 7°

dia) só foi observada para as fatias embaladas com filme ativo (GLU/GEL 1:4 + 2%

SORB).

A alteração no tipo de embalagem utilizada provocou uma diferença

significativa (p≤0,05) na atividade de água no 1° e 7° dia. No primeiro dia, foi mais

intensa, sendo observada atividade de água de 0,97; 0,95 e 0,94 para os

tratamentos de PEBD, GLU/GEL 1:4 e GLU/GEL 1:4 + 2% SORB,

respectivamente. Já, no 7° dia foi observada diferença apenas entre os

tratamentos de PEBD e GLU/GEL + 2% SORB e GLU/GEL e GLU/GEL + 2%

SORB. A redução na atividade de água das fatias ocorreu em razão da migração


175

de água das fatias para os filmes, como também para o ambiente de estocagem.

Soares et al. (2002), no estudo já mencionado anteriormente, observaram o

mesmo fenômeno de redução de 0,95 para 0,92.

Mesmo com a redução da atividade de água durante o período de 7 dias,

esse índice ainda permaneceu alto, independentemente do tipo de tratamento

utilizado, propiciando o crescimento de microorganismos. Segundo Taniwaki e

Silva (2001), a atividade de água é um fator dominante no controle da deterioração

dos alimentos, pois o crescimento dos microorganismos é absolutamente

dependente da disponibilidade de água livre. Assim, quanto menor for a atividade

de água, menor será o número de grupos microbianos capazes de crescer nesse

produto e menor será sua velocidade de multiplicação, retardando a deterioração.

Adambounou et al. (1983) relata que o valor ótimo de atividade de água para o

crescimento de microrganismos encontra-se entre 0,92 e 0,99.

4.7.5 Análise microbiológica

Um dos fatores limitantes na vida de prateleira de muitos produtos é o

crescimento microbiano. Pela Figura 4.31, é possível visualizar as fatias de pães

de forma acondicionadas em três tipos embalagem (PEBD; GLU/GEL (1:4) e

GLU/GEL (1:4) + 2 SORB) no 1°; 4°; 7° e 9° dia de armazenamento. Ao atingir o

9° dia, observou-se o aparecimento visível de fungos em todos os tratamentos,

sendo então, encerrado o experimento.


177

Figura 4.31. Aspecto das fatias de pães de forma acondicionados, durante a vida de

prateleira.


179

Segunda a legislação vigelente RDC 12 (ANVISA, 2001), atualmente, não

existe limite para contagem de bolor e levedura em pão. Entretanto, baseada na

legislação anterior a Portaria 451 (ANVISA, 1997), o limite de tolerância para pães

é 5 x 103 UFC/g de bolores e leveduras. Os resultados das análises

microbiológicas (Tabela 4.43), obtidos no tempo inicial (1°dia) para todos os

tratamentos e no 4° dia para o tratamento PEBD e GLU/GEL 1:4 + 2% SORB,

apresentam-se dentro dos padrões da legislação vigente. No 7° dia, para todos os

tratamentos, a contagem obtida de bolores e leveduras foi superior ao limite de

tolerância permitido.

Tabela 4.43. Contagem total de bolores e leveduras em fatias de pães-de-forma

acondicionadas, durante o armazenamento.


Contagem de bolores e leveduras (UFC/g)*

1° 1 x 10 cA 1 x 10 cA 1 x 10 bA

4° 4,57 x 102 bA 9,33 x 103 bA 1,54 x 102 bB

7° 5,24 x 105 aA 6,02 x 105 aA 9,12 x 104 aA

*Média aritmética das replicatas. Nota: letras diferentes na mesma linha representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas na mesma amostra, enquanto letras diferentes na mesma coluna representam diferença significativa (p≤0,05) entre médias obtidas de diferentes amostras, por meio do teste TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, SORB= sorbato de potássio, PEBD= polietileno de baixa densidade.

Durante os sete dias de monitoramento, foi observado (Tabela 4.43) um

aumento significativo (p≤0,05) no número de unidades formadoras de colônias

(UFC/g), para os tratamentos de PEBD e GLU/GEL 1:4. Para o tratamento

GLU/GEL 1:4 + 2% SORB, não foi observada diferença significativa (p≤0,05) entre

o 1 e 4° dia.

O aumento do tempo de armazenamento provocou uma elevação na

contagem de bolores e leveduras dos pães, sendo maior no último dia de análise

(7° dia), porém não diferindo (p≤0,05) entre si com relação ao tipo de tratamento

utilizado. O único dia em que foi observada diferença significativa foi no 4° dia,


180

quando o tratamento GLU/GEL 1:4 + 2% SORB apresentou uma redução no

número de bolores e leveduras quando comparado aos demais.

Soares et al. (2002) estudaram o efeito do sorbato de potássio em filmes de

acetato de celulose em retardar o crescimento microbiano de pães. Os autores

observaram crescimento inicial de 4 log UFC/g e, ao final de 14 dias, um

crescimento em torno de 7 log UFC/g. Os filmes elaborados com 4% de sorbato

de potássio tiveram um desempenho um pouco melhor que os demais. Não foi

possível verificar se o resultado observado no uso de filmes com 4% de sorbato foi

significativamente melhor que os demais, pois os autores não fizeram análise

estatística dos dados. Porém, pelo aspecto visual foi possível observar uma

inibição do crescimento de bolores com o uso dos filmes ativos.

Apesar do filme de GLU/GEL + 2% SORB ter se mostrado eficiente no

ensaio de difusão em halo, ao ser usado no acondicionamento de pães de forma

não apresentou o mesmo desempenho. Isso provavelmente ocorreu em virtude

das variáveis adicionais envolvidas na etapa de acondicionamento, as quais não

estavam presentes no teste de difusão em halo, tais como: manipulação do

padeiro, contaminação das matérias-primas utilizadas e do próprio ambiente de

preparo e acondicionamento, variação de temperatura durante a vida de prateleira,

diversidade de microbiota presente no pão, etc.

4.7.6 Extração e quantificação de sorbato de potássio

Na Tabela 4.44, é possível observar a quantidade de sorbato de potássio

liberada em 45 g de pão de forma. Segundo a resolução n°4 (ANVISA, 1988), a

quantidade de sorbato permitida em produtos de panificação é de 0,1%

(sorbato/100g), ou seja, é permitido 0,045 g de sorbato de potássio em 45 g de

pão.


181

Tabela 4. 44. Quantificação de sorbato de potássio em 45 g de pão de forma,

durante o armazenamento.

DIAS GLU/GEL 1:4 + 2% SORB

Gramas de sorbato de potássio/45g de pão de forma

1° 0,000585 ± 0,000001 c

4° 0,004027 ± 0,000005 b

7° 0,045225 ± 0,00010 a

*Média aritmética e erro padrão das replicatas. Nota: letras diferentes representam diferença significativa (p≤0,05) entre as médias obtidas na mesma amostra, por meio do teste TUKEY. GEL= gelatina; GLU= glúten, SORB= sorbato de potássio.

A quantidade de sorbato de potássio presente na embalagem (45 g)

apresentou um aumento estatisticamente significativo (p≤0,05) durante a vida de

prateleira, variando de 0,000585; 0,004027 e 0,045225, no 1°, 4° e 7° dia de

armazenamento, respectivamente. Assim, a quantidade de sorbato liberada no 7°

dia chegou ao limite permitido pela legislação.

Com base nos resultados obtidos, é possível concluir que, apesar dos

filmes ativos terem apresentado um bom desempenho no teste de difusão, ao

serem aplicados no produto, mesmo liberando a máxima concentração permitida

na legislação, não propiciaram extensão na vida de prateleira.

Conclusões

183

5.0 Conclusões

A metodologia desenvolvida neste trabalho de pesquisa permitiu a

elaboração e a caracterização de filmes compostos ativos, bem como sua

aplicação no acondicionamento de pães-de-fôrma.

A seguir, são apresentadas as principais conclusões envolvendo essas

características.

1. Entre os biofilmes simples de gelatina desenvolvidos, o elaborado com 10 g de

gelatina e 5% de glicerol apresentou menores valores de permeabilidade ao vapor

de água (5,38 gmm/m2diakPa) e maior de resistência à tração (90,73 MPa).

2. Utilizando a metodologia de superfície de resposta, foi possível selecionar a

formulação formadora de filme simples à base de glúten elaborada com 5 g desse

biopolímero, 32,5 mL de etanol/100mL de solução, pH 5 e 20% glicerol, para as

etapas posteriores, que apresentou facilidade de elaboração e melhores

propriedades de barreiras que as demais.

3. Os filmes compostos selecionados em relação à permeabilidade ao vapor de

água e resistência à tração foram: (i) GLU/GEL 1:4 (4,46 gmm/m2diakPa e 34,11

MPa); (ii) AMM/GEL 1:4 (4,98 gmm/m2diakPa e 158,62 MPa); (iii) AMC/GEL 1:4

(4,30 gmm/m2diakPa e 87,88 MPa) e (iv) AMM/GEL/GLU 1:1:1 (3,09

gmm/m2diakPa e 76,35 MPa).

4. Os fungos isolados e identificados no pão de forma foram: (i) Eurotium

chevalieri; (ii) Eurotium amstelodami; (iii) Wallemia sebii, (iv) Penicillium raistrickii e

(v) Cladosporium sp.

Conclusões

185

5. Os filmes ativos elaborados com 2 e 4% (p/v) de sorbato de potássio em

solução mostraram-se manuseáveis e visivelmente homogêneos. A adição de

sorbato de potássio provocou aumento na permeabilidade ao vapor de água, na

solubilidade em água e na porcentagem de elongação e uma redução na

resistência à tração de todos os filmes compostos. A adição de sorbato de

potássio não provocou alteração na permeabilidade ao oxigênio dos filmes.

6. As superfícies dos filmes compostos ativos desenvolvidos mostraram-se lisas e

homogêneas, com exceção dos filmes de GLU/GEL e AMM/GLU/GEL, ambos com

4% de sorbato de potássio. A secção transversal apresentou-se compacta, com a

presença de estrias. O filme de AMM/GLU/GEL com 4% de sorbato revelou uma

secção transversal irregular e descontínua.

7. O filme que apresentou maior eficiência na redução do crescimento dos fungos

isolados foi: GLU/GEL com 2% de sorbato.

8. A aplicação do filme GLU/GEL 1:4 sem e com 2% de sorbato — intercalados

entre as fatias de pão justapostas e colocadas em sacos de polietileno de baixa

densidade (PEBD) — provocou um aumento da dureza (gf); diminuição da

umidade e atividade de água, quando comparado ao controle (apenas PEBD). No

último dia de verificação (7° dia), a análise microbiológica (contagem total de

bolores e leveduras) extrapolou o limite máximo permitido para todas as

aplicações. Portanto, estes filmes não foram eficientes na extensão da vida útil do

produto.

187

6.0 Sugestões para trabalhos futuros

- Avaliar outros agentes antimicrobianos.

- Testar outros tipos de materiais poliméricos para avaliar a difusão do agente

antimicrobiano.

- Estudar a aplicação dos filmes ativos em outros alimentos.

Referências Bibliográficas

189

7.0 Referências Bibliográficas

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