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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Departamento de Cincia dos Alimentos Bacharelado em Qumica de Alimentos Disciplina de Seminrios em Alimentos

Biofilmes microbianos na indstria de alimentos

Jlia Casalini

Pelotas, 2008.

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JLIA CASALINI

BIOFILMES MICROBIANOS NA INDSTRIA DE ALIMENTOS

Trabalho acadmico apresentado ao Curso de Bacharelado em Qumica de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas como requisito parcial da Disciplina de Seminrios em Alimentos.

Orientadora: Carla Mendona

Pelotas, 2008

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Resumo

CASALINI, Jlia. Biofilmes microbianos na indstria de alimentos. 2008. 46f. Trabalho Acadmico (Bacharelado em Qumica de Alimentos), Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

Muitas contaminaes ou recontaminaes ocorrem em indstrias de diferentes tipos de alimentos. Grande parte destas contaminaes est diretamente relacionada formao de biofilmes dentro da linha de processamento, onde muitos microrganismos esto relacionados a este problema. Biofilme microbiano definido como uma associao de clulas bacterianas e/ou fungos, fixada superfcies, biticas ou abiticas, inclusas em uma complexa matriz extracelular de substncias polimricas, juntamente com os nutrientes capturados para a formao da matriz. Os biofilmes so constitudos por microrganismos, material polimrico extracelular (polissacardeos, protenas, lipdeos) e resduos do ambiente colonizado, embebidos em uma matriz polimrica e aderidos a uma superfcie slida, formando uma estrutura porosa e altamente hidratada contendo exopolissacardeos e pequenos canais, abertos por entre as microcolnias. As suas atividades podem ser classificadas em duas categorias: as benficas, conduzindo a transformaes de valor positivo, e as prejudiciais, responsveis por processos que devem ser evitados devido a suas conseqncias negativas. Quanto aos efeitos prejudiciais, sabe-se que o biofilme aderido superfcie de equipamentos utilizados para o processamento de alimentos resulta em graves problemas, uma vez que o biofilme microbiano tem o potencial de atuar como fonte crnica de contaminao por patgenos, o que pode comprometer a qualidade do alimento e representar graves riscos sade do consumidor. Alm disso, pode ocasionar prejuzos financeiros indstria, em virtude da diminuio da vida-de-prateleira dos produtos alimentcios. Dentre os benefcios proporcionados pelos biofilmes na indstria de alimentos, podese citar a produo de fermentados, o tratamento de efluentes e de gua potvel, assim como a produo de biopolmeros para usos diversos. Palavras-chave: Biofilmes Microbianos. Microrganismos. Indstria de alimentos. Biocidas.

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Lista de Figuras

Figura 1 Estrutura 3D de um biofilme multi-espcie..................................................14 Figura 2 Etapas de formao dos biofilmes...............................................................16 Figura 3 Ciclo de desenvolvimento de um biofilme....................................................17 Figura 4 Desenvolvimento de um biofilme multiespcies. (a) Colonizao primria de um substrato; (b) crescimento, diviso celular e produo do exopolissacardeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolnias; (c) coadeso de clulas individuais, de clulas coagregadas e grupos de clulas idnticas, originando um biofilme jovem, de mltiplas espcies; (d) maturao e formao de mosaicos clonais no biofilme maduro.........................................................................................18 Figura 5 Molculas sinalizadoras do quorum sensing mais importantes encontradas em microrganismos....................................................................................................22

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Lista de Tabelas

Tabela 1 Composio da matriz do biofilme..............................................................12 Tabela 2 Mtodos de limpeza fsicos.........................................................................38

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Sumrio

Resumo.......................................................................................................................2 Lista de Figuras..........................................................................................................3 Lista de Tabelas..........................................................................................................4 1. Introduo...............................................................................................................7 2. Histrico..................................................................................................................9 3. Estrutura e composio do biofilme..................................................................11 4. Formao do biofilme..........................................................................................16 5. Elementos importantes no processo de adeso do biofilme..........................20 5.1 Fase aquosa........................................................................................................20 5.2 O microrganismo................................................................................................20 5.2.1 Pili.....................................................................................................................21 5.2.2 Flagelo..............................................................................................................21 5.2.3 Sistema quorum sensing................................................................................22 5.3 Interao clula-substrato.................................................................................23 6. Superfcies envolvidas na formao do biofilme..............................................25 7. Fatores que influenciam no desenvolvimento do biofilme..............................26 7.1pH.........................................................................................................................26 7.2 Efeitos de velocidade e de turbulncia do fluido............................................26 7.3 Influncia das partculas inorgnicas na formao do biofilme....................27 7.4 Temperatura........................................................................................................27 7.5 Concentrao de nutrientes..............................................................................28 7.6 Tipo de superfcie..............................................................................................28 8. Microrganismos envolvidos na formao do biofilme.....................................30 8.1 Mecanismo de resistncia das bactrias.........................................................31 9. Mtodos de avaliao dos biofilmes..................................................................33 10.Benefcios e malefcios causados pelos biofilmes na indstria alimentcia.35 10.1 Biofilmes benficos..........................................................................................35 10.2 Biofilmes malficos..........................................................................................36

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11. Estratgias de controle e modos de erradicao do biofilme.......................38 11.1 Medidas de carter processual.......................................................................38 11.2 Mtodos fsicos................................................................................................39 11.3 Mtodos qumicos e fsico-qumicos..............................................................39 11.3.1 Biocidas..........................................................................................................40 12 Concluso............................................................................................................42 Referncias...............................................................................................................43

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1 Introduo

Muitas contaminaes ou recontaminaes ocorrem em indstrias de diferentes tipos de alimentos. Grande parte destas contaminaes est diretamente relacionada formao de biofilmes dentro da linha de processamento, onde muitos microrganismos esto relacionados a este problema (HAUN, 2004). Todo alimento possui suas caractersticas prprias de sabor, cor, odor, e aparncia. Os microrganismos em geral utilizam os alimentos como fonte de nutrientes para seu crescimento e podem desta forma promover alteraes significativas nestas caractersticas. Dependendo da alterao causada, o alimento pode ser rejeitado pelo consumidor devido s mudanas ocorridas, somando-se ainda, a possibilidade de causar intoxicaes (FRAZIER; WESTHOFF, 1993; PAULI, 2001apud KECHICHIAN, 2007). Muitas bactrias, em seu habitat, vivem em comunidades de distintos graus de complexidade, associadas a vrios tipos de superfcies biticas e/ou abiticas, compondo dessa forma o biofilme, que pode ser formado por populaes a partir de uma nica ou de mltiplas espcies (CAIXETA, 2008). Esses biofilmes so constitudos, por microrganismos, material polimrico extracelular (polissacardeos, protenas, lipdeos) e resduos do ambiente

colonizado, embebidos numa matriz polimrica e aderidos a uma superfcie slida, formando uma estrutura porosa e altamente hidratada contendo exopolissacardeos e pequenos canais, abertos por entre as microcolnias (CAPELLETTI, 2006; LAWRENCE et al., 1991). A formao do biofilme ocorre por uma srie de processos sucessivos, onde a adeso inicial de bactrias planctnicas superfcie seguida por proliferao e acmulo de camadas de clulas e, finalmente, pela formao da comunidade microbiana, embebida em matriz de exopolissacardeo produzida por si mesma. A adeso e a formao do biofilme so limitadas por caractersticas do microrganismo, tais como expresso dos fatores de virulncia e produo da cpsula exopolimrica, do material aderente e do meio envolvendo o microrganismo,

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como pH, temperatura, tempo de agitao e uma variedade de outros fatores (CAIXETA, 2008; FLACH; KARNOPP; CORO, 2005). As suas atividades podem ser classificadas em duas grandes categorias: as benficas, conduzindo a transformaes de valor positivo, e as prejudiciais, responsveis por processos que devem ser evitados devido a suas conseqncias negativas (CAPELLETTI, 2006). Quanto aos efeitos prejudiciais, segundo Caixeta (2008) na indstria alimentcia, a adeso de microrganismos superfcie de equipamentos utilizados para o processamento de alimentos resulta em graves problemas, uma vez que o biofilme microbiano tem o potencial de atuar como fonte crnica de contaminao por patgenos que pode comprometer a qualidade do alimento e representar graves riscos sade do consumidor. Alm disso, pode ocasionar prejuzos financeiros indstria, em virtude da diminuio da vida-de-prateleira dos produtos alimentcios (FLACH; KARNOPP; CORO, 2005). E dentre os benefcios proporcionados pelos biofilmes na indstria de alimentos, citam-se a utilidade para a produo de fermentados, no tratamento de efluentes e de gua potvel, assim como na produo de biopolmeros para usos diversos (ARCURI, 2000). Porm, os imprescindvel conhecer os mecanismos envolvidos na formao de biofilmes, para control-los ou erradic-los, sendo que, para esse fim a utilizao de biocidas freqentemente considerada (CAPELLETTI, 2006). A utilizao de eficientes e adequados sanificantes (fsicos ou qumicos) em equipamentos, pode evitar a formao de biofilmes e/ou reduzir os ndices de contaminao microbiana para a manuteno de um alimento com qualidade. Entretanto, como a eliminao de biofilmes em superfcies um processo exigente e difcil, a forma de higienizao deve ser analisada como um todo, otimizando os resultados e minimizando os custos (CAIXETA, 2008). Diante do exposto, conduziu-se este trabalho com o objetivo de estudar a formao de biofilmes na indstria de alimentos, suas caractersticas, benefcios e prejuzos que possam vir a causar, assim como sua possvel remoo para obter um produto alimentcio com qualidade e segurana.

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2 Histrico O conceito de biofilme tem emergido gradualmente de estudos cientficos durante longo perodo de tempo, porm, nas ltimas duas dcadas, essa concepo tem avanado consideravelmente (CAIXETA, 2008). A microbiologia tradicional caracterizou durante anos as clulas encontradas em suspenses como planctnicas. Estas clulas foram exaustivamente avaliadas, isoladas e identificadas. Algumas das bactrias planctnicas estudadas tm a capacidade de aderir em vrias superfcies, formando biofilmes (LUCCHESI, 2006). Inicialmente, as observaes de biofilmes foram realizadas por Antonie van Leuwenhoek que, estudando amostras de dente, em seu microscpio, notou mais fragmentos de clulas agregadas do que planctnicas. A capacidade das bactrias de formar comunidades complexas e viver preferencialmente em agregados foi estudada desde os tempos de Robert Koch (PIZZOLITTO et al., 2001; COSTERTON & WILSON, 2004 apud CAIXETA, 2008). Porm, a primeira publicao detalhada que descreve biofilmes foi descrita por Zobell em 1943, onde o autor iniciou estudos sobre a adeso de bactrias marinhas em cascos de navios principalmente e em diferentes tipos de superfcie que incluam vidro, metal e plstico que estavam submersas (LUCCHESI, 2006; CAIXETA, 2008). Tcnicas de microscopia mais sofisticadas e efetivas foram empregadas por Costerton em 1978, o qual verificou que a maioria dos microrganismos nos ambientes naturais se encontrava fixo a suportes, e no na forma dispersa em suspenso. Aos microrganismos aderidos foi atribudo o nome de biofilme, composto por clulas microbianas de fisiologia distinta, chamadas ssseis. Os microrganismos precursores da formao de biofilmes, denominados planctnicos, so encontrados em suspenso, o que os torna mais sensveis a agresses ambientais que em sua forma sssil. Apesar disto, os microrganismos planctnicos foram, durante muitos anos, referncia para a seleo de agentes antimicrobianos (CAPELLETTI, 2006). A partir de ento, o conceito de biofilme avanou e pesquisas vm sendo realizadas em muitas reas relacionadas com a ecologia microbiana. A microbiologia

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moderna, portanto, se preocupa em estudar os mecanismos fisiolgicos e de controle entre as formas microbianas planctnica (livre) e sssil (biofilme) (CAPELLETI, 2006), principalmente devido grande importncia nas atividades humanas, qual pode trazer tanto benefcios quanto malefcios (CAIXETA, 2008).

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3 Estrutura e composio do biofilme

Biofilme microbiano definido como uma associao de clulas bacterianas e de fungos, fixadas as superfcies, biticas ou abiticas, inclusas em uma complexa matriz extracelular de substncias polimricas (LUCCHESI, 2006), juntamente com os nutrientes capturados para a formao da matriz (HAUN, 2004). As clulas aderidas so designadas de ssseis, enquanto aquelas livres e dispersas na fase aquosa so denominadas de planctnicas (BOARI, 2008). Quando fixos a um suporte os microrganismos se agregam em biofilmes, que lhes conferem a capacidade de se estabelecer em variados locais e em inspitas condies nutricionais, alm de facilitar a comunicao intercelular atravs de molculas sinalizadoras (VIEIRA, 1995). Na dcada de 1980, houve a suposio de que os biofilmes fossem representados por simples estrutura plana, principalmente 2D, com espessura relativamente constante. Entretanto, um estudo multidisciplinar originou a descrio de vrios tipos de estruturas de biofilmes e a formulao de modelos conceituais (CAIXETA, 2008). Depois de vrias investigaes, foi possvel afirmar que existem, no mnimo, trs estruturas diferentes de biofilme. A primeira a tradicional, plana, viso homognea da estrutura do biofilme. A segunda, denominada de Modelo do Mosaico Heterogneo, foi descoberta utilizando-se microscopia de contraste de interferncia diferencial (DIC), para examinar amostras crescidas em superfcies internas de sistema de distribuio de gua. Desta forma os pesquisadores, perceberam montes constitudos de microcolnias de bactrias ligadas umas s outras por substncia polimrica extracelular e apresentando colunas envolvidas por fase lquida em que protozorios podiam ser notados. O terceiro tipo de biofilme representa o modelo na forma de cogumelo ou tulipa, com estrutura porosa e canais capilares de gua, por onde ocorre a distribuio de nutrientes e gua (POULSEN, 1999 apud CAIXETA, 2008).

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Os biofilmes so tipicamente constitudos por gua, microrganismos, substncias polimricas extracelulares (EPS, Extracellular Polymeric Substances), partculas retidas e substncias dissolvidas e adsorvidas (PEREIRA, 2001). A gua a parte mais significativa da massa total do biofilme, variando entre 70 a 97%, ou mais, da massa total (tab. 1) (SUTHERLAND, 2001). J os microrganismos representam somente uma pequena parte da massa e do volume de um biofilme (menos de 10%), embora excretem as substncias polimricas que representam a frao dominante da matria orgnica seca do biofilme (PEREIRA, 2001).

Tabela 1 Composio da matriz do biofilme Componente gua Clulas microbianas (muitas espcies) Polissacardeos (homo e heteropolissacardeos) Protenas (incluindo enzimas) DNA e RNA ons Fonte: SUTHERLAND, 2001. < 1-2% < 1-2% Livre 1-2% % na matriz at 97% 2-5%

A estrutura unificadora e protetora dos biofilmes denominada matriz extracelular ou EPS, a qual formada em parte pelas prprias clulas e em parte por componentes do ambiente, como protenas, detritos e matria inorgnica, portanto de composio heterognea e complexa. Embora, sejam os polissacardeos a prevalecer, a EPS pode tambm ser constituda por protenas, cidos nuclicos, glicoprotenas e fosfolipdios (CAPELLETI, 2006; LUCCHESI, 2006; SUTHERLAND, 2001). A matriz extracelular possui composio variada entre diferentes espcies bacterianas ou at mesmo, dentro da mesma espcie, sob diferentes condies ambientais. Apesar da heterogeneidade, o exopolissacardeo considerado componente essencial da matriz, assim como algumas protenas de superfcie que,

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por sua vez, tem sido relacionadas principalmente adeso inicial das clulas de microrganismos superfcie (LASA & PENADS, 2006 apud CAIXETA, 2008). Os exopolissacardeos produzidos pelos genomas de uma grande variedade de microrganismos, com destaque para o alginato (BOARI, 2008), so gomas hidrossolveis que possuem propriedades qumicas, fsicas e estruturais diferentes. A estrutura de muitos polissacardeos de bactrias gram-negativas relativamente simples, sendo formados de homopolissacardeos ou heteropolissacardeos. Este ltimo normalmente composto de unidades repetidas e alinhadas de diferentes dissacardeos at octassacardeos, compostos de dois a quatro tipos de monossacardeos diferentes e muitos contm grupos acetila e piruvato (SOUZA & GARCIA-CRUZ, 2004). Alguns exopolissacardeos so sintetizados durante todo o crescimento bacteriano, enquanto que outros so produzidos somente durante a fase logartmica ou estacionria. Portanto, sua sntese ocorre intracelularmente utilizando acares nucleotdeos difosfatados. Comumente, sua produo induzida pela limitao de um nutriente essencial, que no seja fonte de carbono ou outra fonte de energia (SOUZA & GARCIA-CRUZ, 2004). Exopolissacardeos so considerados componentes importantes que

determinam a estrutura e a integridade funcional do biofilme microbiano, agregado pela formao tridimensional como representado na Fig. 1, com aspecto de gel, alta hidratao e canais localizados na matriz do biofilme, em que os microrganismos so imobilizados. Alm do mais, age como adesivo e barreira defensiva, protegendo as clulas para que no sejam arrastadas pelo fluxo de substncias, auxiliando a clula a resistir a condies de estresse mltiplo, tais como a diminuio e a exausto de nutrientes e gua, a presena de biocidas e outros agentes antimicrobianos e condies ambientais (CAIXETA, 2008). Em alguns casos, o EPS capaz de seqestrar ctions, metais e toxinas, conferindo, tambm, proteo contra radiaes UV, alteraes de pH, choques osmticos e dessecao (BOARI, 2008).

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Figura 1- Estrutura 3D de um biofilme multi-espcie. Fonte: XAVIER et al., 2008.

Na estrutura do biofilme, destacam-se as seguintes caractersticas segundo Boari (2008): 1) so estruturas viscoelsticas e hidratadas, em que o grau de elasticidade se relaciona interao de exopolissacardeos e ou protenas com a superfcie a ser utilizada. Assim como sua elasticidade, seu formato, sua espessura, seu alongamento, sua densidade e sua rigidez dependem das caractersticas fsicoqumicas do ambiente e da presena ou ausncia fluxo. Biofilmes formados em fluxo, geralmente, tendem a ser mais alongados e rgidos, como resposta ao atrito mecnico; 2) sua matriz, que basicamente se constitui por EPS, confere a proteo ao biofilme como j foi descrito anteriormente; 3) possuem uma quantidade varivel de microcolnias independentemente mveis e ancoradas superfcie; 4) so compostos por microcanais internos, teis na distribuio de nutrientes e gua, transportados por difuso passiva ou com o auxlio de gua que ocorre atravs de capilaridade especial; no escoamento de metablitos, alguns potencialmente patognicos ao homem; nas enzimas, como a alginatoliase e as proteases, necessrias ao destacamento de clulas do biofilme e na distribuio de molculas sinalizadoras do quorum sensing. Acredita-se, ainda, que os microcanais de gua participem no transporte de oxignio no interior do biofilme, portanto, a limitao da difuso e o consumo de oxignio por microrganismos resultam no baixo contedo de oxignio no interior do biofilme, demonstrando com isso, que

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microrganismos aerbios e anaerbios podem viver juntos no biofilme (BOARI, 2008; CAIXETA, 2008; SUTHERLAND, 2001).

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4 Formao do Biofilme

Uma das primeiras teorias foi descrita por Marshall em 1971, o qual sugeriu que a formao do biofilme um processo que acontece em duas fases. A primeira, quando o processo ainda reversvel, em virtude da adeso do microrganismo na superfcie, que ocorre por foras de Van der Waals, atrao eletrosttica e interaes hidrofbicas. Nesse estgio, a bactria apresenta movimento browniano, podendo simplesmente, ser removida por rinsagem. Na segunda fase, por meio de interaes dipolo-dipolo, ligaes inicas e covalentes, pontes de hidrognio e interaes hidrofbicas, ocorre a interao fsica da clula com a superfcie, com a sntese de material extracelular da natureza polissacardica ou protica, produzida pela bactria, que chamada matriz de glicoclix. Nesse momento, as fmbrias polimricas ligam clula bacteriana ao substrato, dificultando a remoo do biofilme, sendo necessrio adotar foras mecnicas, como raspagens ou lavagem (CAIXETA, 2008). Os biofilmes so formados segundo Christensen e Characklis (1990 apud CAPELLETTI, 2006) a partir de uma seqncia de eventos, de acordo com as etapas de adeso e de adaptao dos microrganismos ao suporte, conforme ilustrado esquematicamente na Fig. 2. Na primeira etapa de formao de um biofilme, a adeso dos

microrganismos primrios, essencialmente controlada por interaes inicas negativas e, ou, positivas entre a parede celular dos microrganismos e as macromolculas do filme condicionador, o qual se forma a partir de resduos do prprio ambiente. Apndices celulares externos, como flagelos, fmbrias e pli tambm desempenham papel fundamental na adeso celular inicial, alm de formarem pontes entre a superfcie e as clulas (CAPELLETTI, 2006). A adeso irreversvel quase sempre realizada pelos polmeros extracelulares. Depois do contato com a superfcie e a instalao microbiana, as fases de crescimento e diviso celular acontecem. Com isso, se d a formao de material extracelular (biofilme) fortalecendo as ligaes entre as clulas e a superfcie.

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A partir da, dentro de algum tempo (dias a meses), a adeso de outros microrganismos facilitada, e ocorre a liberao de novos colonizadores que se desprendem do biofilme maduro. Os microrganismos liberados formaro biofilmes novos, caracterizando assim, um ciclo de contaminaes (CHRISTENSEN E CHARACKLIS, 1990 apud CAPELLETTI, 2006).

Figura 2. Etapas de formao do biofilme Fonte: CAPELLETTI, 2006.

Um modelo comum para a formao de biofilme descreve um processo que ocorre em cinco estgios (Fig. 3). 1) eventos pr-adeso: os microrganismos, na sua forma de vida planctnica, recebem algum estmulo que os leva a aderir em alguma superfcie. Alguns fatores podem influenciar esse processo, como o pH, concentrao e biodisponibilidade de nutrientes, autoindutores do quorum sensing, presena de compostos orgnicos, inorgnicos e temperatura. Geralmente, a superfcie slida condicionada, ou seja, pode ser modificada por adsoro de vrios nutrientes dos alimentos e ter suas propriedades alteradas (FORSYTHE, 2002); 2) adeso reversvel: ocorre a interao clula-superfcie e sua colonizao inicial. O processo de adeso bem sucedido depende de alguns fatores, como o aparato celular do microrganismo e as caractersticas da superfcie da bactria e do substrato. Ainda no so percebidas alteraes fenotpicas, assim como na transio de genes, embora os genes para a produo de exopolissacardeos sejam ativados aps 15 minutos de contato entre clula e superfcie. Esta adeso considerada reversvel, pois possvel observar o retorno de clulas aderidas ao

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seu estado planctnico. As principais foras deste evento so as pontes de hidrognio, Van der Waals, cido-base de Lewis e hidrofobicidade (BOARI, 2008; FORSYTHE, 2002); 3) adeso irreversvel: ocorre, aproximadamente duas horas aps a adeso inicial e se caracteriza pela presena de microcolnias, que correspondem a um amontoado de clulas aderidas entre si e a uma superfcie. Neste instante, a motilidade cessa e genes envolvidos na comunicao clula-clula (quorum sensing) e na produo de exopolissacardeos (EPS) estejam totalmente ativos. A principal fora de ligao clula-superfcie conferida pela matriz tridimensional e insolvel de EPS (BOARI, 2008); 4) maturao: garante uma maior estabilidade, e correspondente maturao da estrutura que j vem sendo formada. Ocorre de trs a seis dias aps a adeso inicial, podendo chegar a 10 dias. A maturidade acontece, por meio do aumento da densidade populacional e, tambm, pela pronunciada produo e deposio de EPS, aumentando com isso a espessura do biofilme e a estabilidade da colnia contra flutuaes do ambiente. O aumento da populao de um biofilme acontece tanto pela diviso celular, quanto pela redistribuio de clulas entre as microcolnias e pela a adeso de novas clulas planctnicas (FORSYTHE, 2002); 5) destacamento de clulas: acontece entre 9 a 12 dias depois dos processos iniciais. As clulas se apresentam mveis e assemelham-se s clulas planctnicas, podendo contaminar o alimento ou formar um novo biofilme na linha de produo (FORSYTHE, 2002).

Figura 3. Ciclo de desenvolvimento de um biofilme. Fonte: CAIXETA, 2008.

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Um biofilme pode ser monoespcie quando formado por apenas um tipo de microrganismo, ou multiespcie, quando encontrada mais de uma espcie na comunidade microbiana (BOARI, 2008). Os biofilmes monoespcies ocorrem mais em tecidos orgnicos, como vlvulas cardacas, em conseqncia de processos infecciosos. J os biofilmes multiespcies ocorrem em organizaes do ramo alimentcio, onde se utilizam outras superfcies (Fig. 4) (OTOOLE et al., 2000 apud BOARI, 2008).

Figura 4. Desenvolvimento de um biofilme multiespcies. (a) Colonizao primria de um substrato; (b) crescimento, diviso celular e produo do exopolissacardeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolnias; (c) coadeso de clulas individuais, de clulas coagregadas e grupos de clulas idnticas, originando um biofilme jovem, de mltiplas espcies; (d) maturao e formao de mosaicos clonais no biofilme maduro. Fonte: BOARI, 2008.

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5 Elementos importantes no processo de adeso e formao do biofilme

O processo de adeso e formao de biofilme compreende trs elementos principais: a fase aquosa, a clula e a interao clula-substrato.

5.1 A fase aquosa Alguns parmetros tm importante influncia nos processos de adeso, constituio e maturao da comunidade microbiana com relao ao meio aquoso, como: viscosidade, temperatura, pH, presena de nutrientes, presena de molculas orgnicas e inorgnicas, fora inica e potencial osmtico. Estas condies ambientais so notadas pelos microrganismos como sinais, de estimulao ou no, a sua adeso. E ainda, os constituintes da fase, quando depositados sobre o substrato, podem formar o filme condicionante (BOARI, 2008). Enquanto fase aquosa, o leite pode beneficiar o processo de adeso e de formao de biofilmes, devida a sua rica constituio em carboidratos, protenas, lipdeos, vitaminas e minerais, bem como devido a sua alta atividade de gua e pH tendendo ao neutro (LUCCHESI, 2006).

5.2 O microrganismo A capacidade de um microrganismo isolado em aderir ou no a uma superfcie e, logo aps, formar e manter um biofilme se relaciona estreitamente a seu fentipo e gentipo. Quando presentes alguns aparatos celulares, como pili, flagelos e fmbrias, algumas protenas da superfcie, assim como sistemas quorum sensing, nota-se um incontestvel diferencial bactria, em nvel de aderncia e formao do biofilme (STOODLEY et al., 2002 apud BOARI, 2008). Alm desses aspectos, so consideradas tambm de extrema importncia as propriedades fsicoqumicas da superfcie microbiana, com destaque na sua hidrofobicidade e carga eltrica, sendo que todo ciclo vai depender da interao inicial entre a bactria e o substrato (BOARI, 2008).

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5.2.1 Pili O pili um componente competitivo muito importante no processo de adeso inicial e colonizao da superfcie, essencialmente para microrganismos gram-negativos (BOARI, 2008). O Pili tipo IV constitudo por molculas de pilina, helicoidalmente organizadas, com 145 a 160 aminocidos, e localiza-se em uma das extremidades da clula. O tipo de motilidade que ele confere, permite ao microrganismo se mover em superfcies do tipo semi-slidas, como gares e slidas, como o ao inoxidvel. Seu movimento permite a uma microcolnia a expanso radial mdia de aproximadamente 1 milmetro por hora (BOARI, 2008). O Pili tipo IV pode se ligar a uma grande variedade de superfcies sejam elas abiticas (ao inoxidvel), bem como biticas (superfcie de outros microrganismos), onde se tem adeso clula-clula. vlido ressaltar que a colonizao de superfcies e o deslocamento de microcolnias, onde o Pili tipo IV est presente, um movimento social, ou seja, envolve o contato clula-clula, orientando-se este por nutrientes e sinalizadores, o que chamamos por quimiotaxia (MATTICK, 2006 apud BOARI, 2008).

5.2.2 Flagelos Os flagelos so de destacada relevncia na adeso e colonizao de superfcies por microrganismos gram-negativos. Estas organelas, utilizadas para locomoo do microrganismo, so constitudas por unidades de flagelina e emergem por uma extenso da membrana externa, sendo a sua fora motora garantida pela diferena de potencial osmtico de sdio transmembrana e pela degradao de grupos fosfato (GAVN et al., 2002 apud BOARI, 2008). Alguns microrganismos apresentam um flagelo polar em meios aquosos. Sem dvida alguma, este elemento de muita importncia para o processo de adeso inicial. Porm, aps a adeso inicial, inicia-se uma diferenciada expresso gnica, sendo o flagelo polar substitudo por um flagelo lateral, o qual confere clula capacidade maior de se locomover em superfcies slidas e semi-slidas (BOARI, 2008).

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5.2.3 Sistema quorum sensing O quorum sensing (QS) um sistema de comunicao entre clula-clula de bactrias que depende da densidade populacional. As bactrias, nesse sistema, sintetizam compostos sinalizadores de baixo peso molecular, os autoindutores (AIs) bacterianos, que so excretados no ambiente. Quando se atinge uma quantidade crtica desses compostos, as bactrias detectam a presena de um nmero suficiente ou qurum de bactrias e respondem por meio da ativao ou represso de certos genes (VIANA, 2006). As etapas do ciclo de um biofilme requerem um sistema adequado de comunicao clula-clula. A sua fundamental importncia consiste na distribuio, na ordenao e na sincronizao das atividades dos genomas procariontes, obtidas para a manuteno da relativa homeostase da comunidade microbiana (JOHNSON, 2007 apud BOARI, 2008). Desse modo, favorece o acesso a nutrientes ou a nichos ambientais mais favorveis, permite que as bactrias organizem respostas defensivas contra hospedeiros eucariticos, alm de otimizar a capacidade das bactrias de se diferenciarem em formas mais bem adaptadas a sobreviverem em ambientes hostis (VIANA, 2006). Nos microrganismos gram-negativos, as molculas sinalizadoras, so derivadas da N-acil homoserina lactona (AHL) e sua regulao se d por meio das protenas homlogas LuxI e LuxR. A primeira protena atua como uma enzima (AHL sintetase) e a segunda, quando se ligar a AHL, forma o complexo AHL-LuxR, o qual responsvel pela ativao e expresso de inmeros genes. Em bactrias grampositivas, diferentemente de gram-negativas, a comunicao clula-clula ocorre por meio da secreo de pequenos peptdeos (BOARI, 2008). No caso de gram-negativos, h um amplo espectro de homoserinas lactonas (Fig. 5). Os microrganismos produzem constantemente estas molculas

sinalizadoras. Em baixas densidades populacionais, h, proporcionalmente, baixas concentraes destes autoindutores e, por esta razo, talvez no haja seu impacto sobre a expresso gentica. Entretanto, quando a densidade populacional de microrganismos se eleva, o mesmo acontece com a concentrao de AIs no meio, havendo, assim, influncia sobre a regulao gnica (KONG et al., 2006 apud BOARI, 2008).

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Figura 5 - Molculas sinalizadoras do quorum sensing mais importantes encontradas em microrganismos. Fonte: OLIVEIRA, 2005.

Os microrganismos alteram a transcrio gentica como resposta aos AIs, variando-se, desse modo, a produo de exopolissacardeos, a motilidade, a produo de enzimas, como proteases, lpases e alginases e, tambm, a produo de compostos bactericidas e ou bacteriostticos. Este processo coordenativo influncia na prpria sobrevivncia do microrganismo em condies desfavorveis do biofilme, principalmente no estgio maduro, no qual h limitao na disponibilidade de oxignio, nutrientes, componentes orgnicos e inorgnicos, como o ferro, sendo considervel, at mesmo, a restrio quanto ao espao fsico (VIANA, 2006). A importncia do QS na organizao a na distribuio de atividades entre os indivduos de um biofilme, relaciona-se ao fato destes no depositam o EPS de forma a promover o desenvolvimento do biofilme, quando comparado a microrganismos selvagens, tornando-se a estrutura bastante irregular e frgil (BOARI, 2008).

5.3 Interao clula-substrato As caractersticas do substrato so consideradas importantssimas, pois em funo delas, que o processo de adeso e a formao de um biofilme sero favorecidos ou no (BOARI, 2008).

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O contato entre a superfcie microbiana e o substrato corresponde adeso inicial, e regido por interaes fsico-qumicas. Dentre estas interaes, o destaque tem sido dado a hidrofobicidade. A hidrofobicidade representada pelo grau de capacidade de molhadura da superfcie em meio aquoso, sendo a adeso favorecida pelas superfcies hidrofbicas, as quais possam entrar em contato pela compresso da camada de gua e das mesmas (SOUSA, 2005). Os diferentes graus de hidrofobicidade de uma clula so conferidos por fatores de virulncia associados adeso, como pili, fmbrias e flagelos, bem como pela membrana externa em gram-negativos e os diferentes graus de

eletronegatividade conferidos pela presena de grupos funcionais polares, como fosfatos, carboxilas, hidroxilas e cido teicico (FLACH; KARNOPP; CORO, 2005). Quanto maior a hidrofobicidade da clula, maior a facilidade de adeso inicial de um microrganismo, sendo o ao inoxidvel uma superfcie hidrofbica (BOARI, 2008). Segundo Costa (1999) as clulas de bactrias possuem pH em torno de trs e carga negativa. Nas gram-positivas, a carga negativa originria dos cidos teicicos e teicurnicos da parede e dos polipeptdeos do glicoclix, e, nas gramnegativas, aparecem devido aos lipopolissacardeos e protenas da membrana externa juntamente aos polmeros do glicoclix. A topografia da superfcie tem uma reduzida participao. As micro-ranhuras e microfendas seriam interessantes ao biofilme maduro, pois alguma poro da comunidade poderia ser protegida contra atritos mecnicos e, no caso de danos mecnicos, a poro remanescente poderia regenerar a estrutura (WIRTANEN et al., 2005 apud BOARI, 2008).

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6 Superfcies envolvidas na formao do biofilme

Uma grande variedade de microrganismos capaz de aderir e formar biofilme em superfcies biticas e abiticas, incluindo lentes de contato, cascos de navios, encanamento em indstrias de alimentos e petrleo, pedras em cursos dgua e slica, ao inoxidvel, vidro, alumnio, teflon, materiais de nilon e borracha encontrados em ambientes utilizados para processar alimentos e em uma variedade de implantes e aparelhos transcutneos (RESENDE, 2005). As caractersticas macroscpicas e, particularmente, as microscpicas das superfcies so determinantes para maior ou menor adeso microbiana, com reflexos na contaminao dos alimentos por microrganismos alteradores ou patognicos (ANDRADE, 2004). A microtopografia da superfcie pode dificultar os procedimentos de limpeza, quando fendas e outras imperfeies criam condies para abrigar as clulas (CAIXETA, 2008). A boa qualidade e polmero da superfcie so muito importantes para prevenir a formao de biofilmes (HAUN, 2004). O material mais comumente usado na indstria de alimentos o ao inoxidvel AISI 304, cuja composio qumica C 255 ppm; Si 0,44; Mn 1,13; Cr 18,23; Ni 8,91; Cu 0,23; N 474, valores dados em % de peso, podendo ser de fcil tratamento mecanicamente ou eletrostaticamente para tornar-se liso evitando a formao de biofilme (HAUN, 2004). Assim como o vidro, quando comparado a polmeros, borracha ou alumnio, o ao inoxidvel apresenta resistncia maior a agentes oxidantes e outros sanificantes, como cido peractico, hipocloritos e iodforos. No entanto, ele vulnervel corroso localizada, por ons clorados e componentes sulfurosos reduzidos, enquanto superfcies emborrachadas so propcias deteriorao e podem desenvolver rachaduras onde as bactrias podem se acumular (ISMAIL et al., 1999 apud CAIXETA, 2008).

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7 Fatores que influenciam no desenvolvimento do biofilme

7.1 pH A grande parte dos biofilmes naturais forma-se em valores de pH prximo a neutralidade. Desvios de pH para valores inferiores ou superiores a 7 iro certamente influenciar o desenvolvimento e atividade da comunidade microbiana, pois o pH tem um efeito preponderante no metabolismo dos microrganismos (PEREIRA, 2001). De outro modo, o pH tambm afeta as propriedades eltricas superficiais dos microrganismos e das superfcies slidas, podendo com isso aumentar ou diminuir a repulso eletrosttica entre as duas entidades e, desta maneira, interferir no processo de adeso dos microrganismos s superfcies (PEREIRA, 2001; CHAVES, 2004; MACHADO, 2005). Estudos de biofilmes em sistemas de distribuio de gua potvel, por exemplo, devem levar em considerao a turbulncia do fluido, que pode conduzir a uma diminuio dos valores de pH, devido ao CO2 se misturar com a gua e formar HCO3. A reduo dos valores de pH tambm pode ocorrer, devido a libertao para o meio de substncias cidas sintetizadas pelos microrganismos que se desenvolvem nas paredes (CHAVES, 2004).

7.2 Efeitos de velocidade e de turbulncia do fluido Os efeitos de velocidade, mais especificamente, os efeitos de turbulncia no seio do fluido, tm um papel significativo no desenvolvimento e estabilidade dos biofilmes (MACHADO, 2005). A turbulncia e velocidade do escoamento de gua que entra em contato com as superfcies slidas interferem nos processos de adeso, transporte de nutrientes e de desprendimento dos microrganismos (PEREIRA, 2001). A velocidade do fluido tem influncia nas taxas de transferncia de massa do lquido para o biofilme, assim como na taxa de desprendimento de pores de biofilme. Em baixas velocidades do fluido, a resistncia transferncia de massa, ou seja, nutrientes e oxignio, do meio lquido para os microrganismos do biofilme

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mais elevada, desse modo o crescimento do filme biolgico prejudicado (PEREIRA, 2001). E quando se aumenta a velocidade esta vai interferir, por um lado, aumentando a transferncia de massa, o que beneficiar o crescimento do biofilme e, por outro lado, quanto maior a velocidade maior ser a eroso e desprendimento de partes de biofilme, diminuindo a biomassa que est aderida ao suporte slido. A reduo em biomassa origina biofilmes menos espessos, fato que favorece o transporte dos nutrientes no interior do biofilme (MACHADO, 2005). A variao da velocidade pode tambm influenciar no modo de colonizao das superfcies. A baixas velocidades formam-se colnias isoladas aderidas s superfcies. A elevadas velocidades ocorre uma adeso de grandes grupos de clulas e s muito poucas de forma isolada. (CHAVES, 2004).

7.3 Influncia de partculas inorgnicas na formao de biofilmes A concentrao de partculas slidas suspensas em corrente lquida mais um fator que possui influncia na formao do biofilme. Determinadas partculas slidas podem contribuir para a limpeza dos sistemas industriais em funo do seu carter erosivo. Porm, algumas partculas provenientes da corrente lquida tambm podem ser incorporadas no prprio biofilme e alterar a sua estrutura, sendo, consequentemente, responsveis por algumas implicaes na sua estabilidade. O biofilme poder ser mais ou menos resistente s condies agressivas do meio circundante. O resultado ser ou o aumento do crescimento e estabilidade do biofilme, ou exatamente o seu inverso (PEREIRA, 2001).

7.4 Temperatura A temperatura fator determinante no desenvolvimento microbiano, e como tal, pode afetar a formao e a atividade de qualquer biofilme, bem como o tipo de microrganismo que o compe. Para valores elevados de temperatura ocorre a desnaturao das protenas que compe os microrganismos, o que manifestado por uma diminuio adrupta da taxa de crescimento. O valor da temperatura em que esses efeitos destrutivos so preponderantes designa-se por limite mximo de temperatura. A temperatura para a qual se registra um valor mximo da taxa de crescimento designa-se por temperatura tima. Por outro lado, com a reduo da temperatura ocorre uma

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reduo na taxa de crescimento dos microrganismos at um dado valor em que o crescimento cessa, e este valor da temperatura correspondendo ao limite mnimo de temperatura. Cada microrganismo tem valores precisos para os limites mnimo e mximo e temperatura tima (STANIER et al., 1995 apud CHAVES, 2004).

7.5 Concentrao de nutrientes Os microrganismos requererem quantidades mnimas de nutrientes para que ocorra o seu crescimento. Quanto maior for a quantidade de nutrientes disponveis, maior ser o crescimento microbiano e maior ser a diversidade de organismos que podem ser mantidos (BUCKMAN, 1997 apud CHAVES, 2004). Nutrientes disponveis sob a forma de carbono orgnico so facilmente assimilvel pelos microrganismos e bastante usados. O ferro tambm um dos nutrientes necessrios para o desenvolvimento celular bacteriano, apresentando-se mesmo como um nutriente limitante para o crescimento. As tubulaes de ferro que ainda compem uma boa parte das redes de distribuio e abastecimento de gua potvel, por exemplo, oferecem substrato de ferro que uma fonte nutritiva para as bactrias e funcionam como ambientes timos para o desenvolvimento de certos microrganismos (CHAVES, 2004).

7.6 Tipo de superfcie A superfcie inerte em que se formam os biofilmes desempenha um papel importante na forma e desenvolvimento do biofilme. O estado de conservao da superfcie pode, muitas vezes, ser um fator importante na formao do biofilme. Os depsitos porosos e irregulares que se encontram freqentemente s superfcies so zonas preferenciais para o crescimento bacteriano (CHAVES, 2004). Em estudos realizados foi possvel concluir que a rugosidade e porosidade do suporte condicionam a adeso celular. A rugosidade de uma superfcie pode aumentar a reteno de microrganismos, pois proporciona locais de abrigo que so menos afetados pelas foras do fluido. O efeito da rugosidade da superfcie considerado quando ocorre a adeso da primeira camada de microrganismos tendo menor influncia quando uma superfcie de adeso j tem biofilme formado (MACHADO, 2005). O tipo de material da superfcie pode tambm influenciar no

desenvolvimento de biofilme. Superfcies de natureza ferrosa so habitats propcios

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para o desenvolvimento microbiano, sabendo-se que o ferro um nutriente necessrio para o desenvolvimento de certas espcies bacterianas, como j foi mencionado anteriormente (CHAVES, 2004)

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8 Microrganismos envolvidos na formao do biofilme

O biofilme pode ser formado por populaes constitudas a partir de uma nica ou de mltiplas espcies, ou seja, quando o biofilme composto por espcies diferentes, os produtos metabolizados por uma das espcies podem servir de suporte para o crescimento de outras, enquanto a adeso de algumas espcies pode fornecer ligantes que promovem a ligao de outras. Em contra partida, a competio por nutrientes e o acmulo de produtos txicos produzidos pelos microrganismos primrios podem limitar a diversidade de espcies no interior do biofilme (CAIXETA, 2008). Entre todos os microrganismos, so as bactrias que, mais comumente produzem biofilme em condies favorveis, mesmo que algumas apresentem, naturalmente, uma maior aptido que outras. Seus tamanhos reduzidos, elevadas taxas de reproduo, grande capacidade de adaptao e de produo de substncias e estruturas extracelulares que as protegem do meio so as principais caractersticas que as tornam excelentes organismos capazes de colonizar qualquer superfcie, at mesmo em condies extremas (CHRISTENSEN e CHARACKLIS, 1990 apud CAPELLETTI, 2006). A maioria dos estudos descreve as bactrias gram-negativas como as principais formadoras de biofilme, porm, sabe-se que as bactrias gram-positivas tambm esto presentes na composio do biofilme, sendo em alguns casos as responsveis pelo problema. Em indstrias sucroalcooleiras mostram que os principais problemas so causados por bactrias gram-positivas produtoras de gomas, como por exemplo, a dextrana. (LUCCHESI, 2006). Dentre os microrganismos que podem participar de processos de adeso e gerar problemas de sade pblica ou de ordem econmica, podem-se ressaltar: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens,

Micrococcus sp. e Enterococcus faecium, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Salmonella thyphimurium, Escherichia coli O157:H7,

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Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Alcaligenes e Flavobacterium (CAIXETA, 2008; CAPELLETTI, 2006; LUCCHESI, 2006). Boari (2008) cita Aeromonas hydrophila tambm como uma importante produtora de biofilme.

8.1 Mecanismos de resistncia de bactrias As bactrias podem sobreviver em ambientes nos quais h rpida mudana, assim como adequar-se s mudanas repentinas na disponibilidade de nutrientes e nas defesas imunes primrias e secundrias do hospedeiro. Essa resistncia pode ser adquirida por mutao, aquisio de novas informaes genticas, expresso de genes silenciosos que frequentemente manifestada fisiologicamente e

estruturalmente, mudanas na hidrofobicidade da superfcie celular e em componentes da membrana externa das bactrias envolvidos na aderncia, tais como pili e lipopolissacardeos, crescimento em biofilme e outras alteraes fenotpicas (CAIXETA, 2008). A composio da membrana externa da parede celular das bactrias, principalmente das bactrias gram-negativas, tem tambm um papel importante na resistncia penetrao das substncias ativas dos biocidas (PEREIRA, 2001). Para Mittelman (1998 apud CAIXETA, 2008) a formao do biofilme est ligada proteo contra tais mudanas, pois bactrias associadas aos biofilmes so mais resistentes a tratamentos com antibiticos do que clulas planctnicas. Alm de que, as clulas ssseis tm a defesa coletiva contra fatores antagnicos e o aumento da sobrevivncia da colnia pela diferenciao em tipos diferentes de clulas. Dentre as possveis explicaes para a resistncia elevada de biofilmes bacterianos incluem-se: a difuso limitada de agentes antimicrobianos por meio da matriz do biofilme, interaes de agentes antimicrobianos com a matriz (clulas e polmeros), resistncia mediada por enzimas, nveis de atividade metablica dentro do biofilme, adaptao gentica e outras estruturas da membrana, ou seja, a resistncia ocorre em funo de inmeros fatores inter-relacionados, incluindo atividade metablica diferencial, barreiras de difuso e ultra-estrutura da parede celular (CAIXETA, 208). Os microrganismos quando em forma de biofilme apresentam resistncia aos biocidas, e tal resistncia , em parte, atribuda matriz polimrica, pois esta

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parece funcionar como uma barreira protetora contra fatores agressivos externos dos quais os biocidas so exemplos (PEREIRA, 2001). Outros estudos referem tambm que a menor sensibilidade dos biofilmes aos biocidas em funo destes poderem reagir com constituintes inorgnicos dos biofilmes a uma velocidade superior velocidade de difuso do biocida no interior dos biofilmes. Isso acarretaria, por conseqncia, uma reduo considervel da quantidade de biocida disponvel efetivamente para os microrganismos (PEREIRA, 2001).

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9 Mtodos de avaliao dos biofilmes

O uso recente de tcnicas moleculares vem possibilitando o monitoramento dos biofilmes bacterianos. Nesses mtodos moleculares so inseridos a hibridizao in situ de fluorescncia (FISH), a microautoradiografia combinada com FISH (MARFISH), microsensores combinados com FISH e a reao em cadeia de polimerase (PCR), dentre inmeras outras tcnicas combinadas com FISH (CAIXETA, 2008). Alm do uso de tcnicas moleculares, tm-se utilizado vrios outros mtodos para amostragem e enumerao do biofilme, os quais podem ser divididos em dois grupos, os mtodos visuais e mtodos no visuais (MACEDO, 2008). Como mtodos visuais os mais importantes so a microscopia de luz, de contraste de fase, de epifluorescncia e a microscopia eletrnica de varredura (MEV) e de transmisso (MET). J, os mtodos no visuais incluem a remoo de microrganismos da superfcie, contagem por mtodos convencionais microbiolgicos (swab, rinsagem, raspagem, contagem padro em placas, etc.) e medidas de bioluminescncia e impedncia (CAIXETA, 2008; MACEDO, 2008) A microscopia eletrnica mais indicada para a avaliao da interao microbiana na matriz do biofilme. A fixao das amostras efetuada com a utilizao de agentes qumicos, como glutaraldedo, em que a amostra congelada rapidamente para evitar danos s clulas devido aos cristais de gelo (COSTA, 1999). A microscopia confocal utilizada para observar a estrutura dos biofilmes. Ela permite fazer seccionamento ptico do biofilme no seu estado hidratado de maneira no destrutiva, permitindo obter informaes 3D da estrutura. Essa tcnica tambm permite, obter imagens em canais mltiplos, o que pode ser utilizado para observao simultnea de vrias sondas fluorescentes, de modo a obter informao espacial da diversidade funcional do biofilme (PALMER, 1999 apud CAIXETA, 2008;

SUTHERLAND, 2001).A microscopia de contraste recomendada para acompanhar o desenvolvimento do biofilme em tempo real, em uma superfcie transparente. A microscopia de epifluorescncia (EPF) uma alternativa tima na quantificao de

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clulas aderidas s superfcies. Para visualizar a adeso bacteriana, se utilizam substncias fluorescentes, para colorao direta das clulas, ou anticorpos fluorescentes que podem se ligar s clulas, permitindo sua observao (COSTA, 1999). A medida de impedncia fundamentada no princpio de que, quando se metabolizam os componentes presentes no meio de cultura, os microrganismos transformam molculas grandes em pequenas, que possuem cargas eltricas, o que muda a resistncia ou impedncia do meio. A mudana da condutividade pode ser medida e o nmero de microrganismos aderidos superfcie est relacionado com o valor obtido para a condutividade (CAIXETA, 2008; MACEDO, 2008). A tcnica da bioluminescncia baseada no contedo de trifosfato de adenosina (ATP), e este gerado pela oxidao de molculas alimentares, tais como glicose, cidos graxos e aminocidos (MACEDO, 2008). A quantidade de ATP em uma amostra medida por uma reao de bioluminescncia entre a luciferina e a enzima luciferase, enquanto a quantidade de luz emitida pode ser medida por luminmetro, fluormetro ou espectrofotmetro de cintilao lquida (FRANCO e LANDGRAF, 1996 apud MACEDO, 2008).

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10 Benefcios e malefcios causados pelos biofilmes na indstria alimentcia

Os biofilmes microbianos atraem cada vez mais a ateno de cientistas em muitas reas, tais como nos ramos da medicina, ambiente aqutico, indstria farmacutica e, principalmente, indstria de processamento de alimentos (CAIXETA, 2008). Por ser uma acumulao natural de microrganismos numa superfcie slida, o biofilme pressupe a sua existncia desde sempre, mesmo que o seu reconhecimento e registro sejam ainda mais contemporneos. So diversos os exemplos de biofilmes naturais, isto , aqueles que se formam espontaneamente em quase todas as superfcies imersa em meio aquoso, apresentando assim, uma alta capacidade de se adaptar s mais distintas situaes (PEREIRA, 2001). Os biofilmes possuem um papel importante na natureza e em processos tecnolgicos. Partindo do interesse do homem, podem ser benficos ou prejudiciais, sendo que no ltimo caso, os biofilmes passam a ser considerados industrialmente como sujamento biolgico, sendo o termo biofouling o mais usado para relatar estas situaes. Assim sendo, preciso o seu estudo para poder desenvolver estratgias com o propsito de melhorar as suas caractersticas, caso ele seja benfico, ou para eliminar ou inibir a sua formao, quando considerado prejudicial (CHAVES, 2004; PEREIRA, 2001).

10.1 Biofilmes benficos Ainda que sejam prejudiciais em diversos processos e locais, os biofilmes so necessrios para a realizao de outros processos, como por exemplo, na produo de alimentos fermentados como o vinagre, onde as espcies Acetobacter e Gluconobacter de microrganismos so utilizadas, na produo de sherry e de cido ctrico na indstria alimentar, e tambm na rea ambiental como o caso da descontaminao e limpeza de guas que possuam resduos antes que estas sejam lanadas novamente em crregos e rios. Como tambm os biofilmes vm recebendo considervel ateno do ponto de vista da biorremediao de vrios efluentes

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industriais, com o papel de retirar poluentes orgnicos e inorgnicos de guas contaminadas (CHAVES, 2004; HAUN, 2004; PEREIRA, 2001). A aplicao biotecnolgica ambiental de biofilmes surgiu aps o homem ter reconhecido que os biofilmes acumulados nos leitos dos rios e/ou nas partculas suspensas dos rios e lagos, assim como em ambientes marinhos, que contribuam para a remoo de contaminantes da gua. Os filtros de areia, aplicados purificao de gua, constituem, por isso, uma das mais antigas aplicaes de biofilmes na biotecnologia ambiental (PEREIRA, 2001).

10.2 Biofilmes malficos Infelizmente, nem sempre os biofilmes constituem vantagens para o homem. Na maioria das situaes, a adeso de microrganismos a superfcies slidas indesejvel, pois, de um modo geral, est associada contaminao de produtos alimentcios, deteriorao das superfcies e ambiente circundante (CHAVES, 2004; VIANA, 2006). Os biofilmes prejudiciais, conhecidos como sujamento biolgico ou biofouling, afetam uma grande diversidade de habitats microbianos, tais como lentes de contato, dentes, prteses e implantes no corpo humano, sistemas de distribuio de gua potvel, materiais de construo de edifcios e monumentos, processos industriais dependentes de gua, como permutadores de calor, membranas de osmose inversa e ultrafiltrao (PEREIRA, 2001). Segundo Pereira (2001) na maioria dos sistemas industriais, o sujamento biolgico surge mais comumente ligado com outros tipos de sujamento (fouling) originados da deposio de partculas inorgnicas, precipitados cristalinos e/ou produtos de corroso. Quando se torna complicado determinar a composio do material aderido em uma superfcie, este geralmente passa a ser chamado como depsito. Alm de originar problemas de higiene na indstria, a acumulao de biofilmes pode provocar perdas de eficincia em permutadores de calor como j mencionado, perda de carga nas tubulaes e acelerao da deteriorao dos materiais (CHARACKLIS e COOKSEY, 1983; MATILLA-SHANDHOM e WIRTANEN, 1992 apud CHAVES, 2004). A formao de biofilme, e principalmente o seu desprendimento nos sistemas de distribuio de gua potvel, constituem um fator importante (CHAVES,

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2004). Nestes sistemas 95% da biomassa se localiza nas paredes das tubulaes e menos de 5% nas fases da gua. Desse modo, a formao de biofilme pode produzir muitos problemas operacionais, como corroso das tubulaes, perda de qualidade da gua e uma srie de outros eventos indesejveis (HU et al., 2005 apud CAIXETA, 2008). Na indstria de alimentos, a colonizao das superfcies onde se processam os alimentos pode ocasionar vrios problemas, tanto de ordem econmica como de sade pblica. No ponto de vista econmico, as bactrias deteriorantes podem contaminar produtos alimentcios, alterando suas caractersticas e levando a perdas econmicas, entretanto, o risco sade pblica considerado um problema mais grave, pois o biofilme pode ser fonte de contaminao crnica e veicular microrganismos patognicos (CAIXETA, 2008). Alguns microrganismos podem ser submetidos a condies de ausncia de oxignio, nutriente ou espaos para multiplicar-se dependendo do local de adeso. A ausncia de oxignio pode levar formao de uma zona, em que condies anaerbicas prevalecem e bactrias fermentativas so ativadas. Os microrganismos anaerbios formam cidos orgnicos de baixo peso molecular e cidos graxos, bem como dixido de carbono e hidrognio, que estimulam o crescimento de bactrias redutoras de sulfato, as quais podem conduzir a problemas de corroso de metais (POULSEN, 1999 apud CAIXETA, 2008). Na indstria de laticnios a colonizao em tanques de armazenamento do leite, adeso nos trocadores de calor e adeso de esporos na superfcie de embalagens so alguns exemplos de problemas que tambm esto ligados aos biofilmes sobre superfcies, constituindo um ponto crtico na indstria (HAUN, 2004).

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11 Estratgias de controle e modos de erradicao do biofilme

Para prevenir a adeso bacteriana, retardar a formao dos biofilmes e eliminar ou pelo menos reduzir a sua acumulao, muitas estratgias ou combinao de estratgias podem ser utilizadas. Num sistema industrial, qualquer processo de controle deve incluir, primeiramente, o controle efetivo dos microrganismos presentes nos circuitos de gua, retardando o mximo a sua deposio nas superfcies (MACHADO, 2004; PEREIRA, 2001). A higienizao utilizada com o objetivo de preservar a qualidade microbiolgica dos alimentos, atravs do controle e da preveno da formao de biofilmes, auxiliando na obteno de um produto que, alm de possuir qualidades nutricionais e sensoriais, tenha boa condio higinico-sanitria, no oferecendo assim risco sade do consumidor (CAIXETA, 2008; FORSYTHE, 2002). As estratgias podem englobar mtodos fsicos, qumicos e processuais.

11.1 Medidas de carter processual Algumas regras tcnicas a aplicar nos processos industriais, de carter mais preventivo, devem ser incorporadas no sentido de retardar ou mesmo evitar a acumulao de biofilme nos circuitos industriais como: reduo da concentrao de substncias orgnicas na corrente lquida; limpeza mecnica freqente; projeto adequado dos equipamentos; implementao de tcnicas efetivas de monitorizao de biofilmes, inspeo visual constante da acumulao de biofilme e de sinais de corroso; e implementao de tcnicas de tratamento colateral (MACHADO, 2004). Embora todas as precaues que se devem ter, ocorrem momentos onde o desenvolvimento de biofilmes inevitvel. Isso faz emergir a necessidade de implementar outros mtodos de controle de biofilmes com o intuito de impedir o estabelecimento dos mesmos, atuando em qualquer uma das fases do seu desenvolvimento (PEREIRA, 2001).

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11.2 Mtodos fsicos Estes mtodos envolvem tcnicas de remoo fsica de biofilmes podendo ser aplicados on-line ou off-line conforme Bott (1995 apud Pereira, 2001). A limpeza on-line no necessita a interrupo dos processos industriais e pode processar-se de forma contnua ou intermitente requerendo equipamento adicional. A limpeza off-line exige a paragem das operaes do sistema, sendo por vezes, necessrio o desmanche dos equipamentos para se aceder ao seu interior, para que a limpeza seja efetiva. Vrias tcnicas de limpeza fsica so usadas como mostra a tab. 1.

Tabela 2- Mtodos de limpeza fsicos Tcnicas on-line Circulao de bolas de borracha Oscilao de escovas Injeo de ar ou gs Uso de campos eltricos Aplicao de ultra-sons Radiao ultravioleta, radiao gama Tcnicas off-line Limpeza manual Umedecimento com vapor (soaking) Choque trmico Choque osmtico Limpeza apoiada em produtos qumicos Circulao de gua a temperatura elevada e/ou vapor de gua Fonte: PEREIRA, 2001.

Embora sejam considerados mtodos mais eficientes, a implementao de mtodos fsicos na remoo de biofilmes dificultada, sendo s vezes impossvel, em funo da dificuldade de ordem tcnica e econmica, que se prendem, na estrutura e desenho dos equipamentos e na necessidade de equipamento suplementar (PEREIRA, 2001). Entretanto os mtodos fsicos tm um impacto ambiental reduzido, apesar da sua implementao causar acrescidos gastos energticos, que iro agravar os custos (MACHADO, 2004).

11.3 Mtodos qumicos e fsico-qumicos Nestes mtodos aplicam-se substncias qumicas com propriedades antimicrobianas, propriedades tensoativas e propriedades dispersantes, cujo

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mecanismo de ao pela fragilizao da matriz polimrica dos biofilmes e pelo enfraquecimento das interaes biofilme (MACHADO, 2004). Todas as substncias que possuem uma ou mais zonas ativas capazes de estabelecer interaes adversas com componentes celulares em stios-alvo especficos das clulas microbianas so considerados agentes antimicrobianos. Comumente, a concentrao da substncia qumica antimicrobiana que determina o modo da ao: se a concentrao baixa para as caractersticas do sistema onde aplicado, ento o efeito de carter bioesttico; se a concentrao elevada o bastante o agente atuar numa estrutura vital das clulas e a sua ao classifica-se como biocida (PEREIRA, 2001). De todos os agentes qumicos referidos, os biocidas so as medidas mais usadas em sistemas industriais, ainda que mtodos alternativos a sua utilizao sejam continuamente alvo de investigao (CAIXETA, 2008; PEREIRA, 2001).

11.3.1 Biocidas Biocida pode ser definido como qualquer substncia que possua um ou mais agentes ativos, o qual capaz de prevenir, inibir, diminuir ou eliminar a ao de organismos vivos patognicos e no patognicos (CAPELLETTI, 2006). Para exercerem a sua ao os biocidas atacam os componentes celulares funcionais, colocando os microrganismos em estresse (PEREIRA, 2001). Os principais componentes celulares funcionais em que os biocidas agem so, a parede celular, os componentes da membrana citoplasmtica e o citoplasma. O acesso a estes alvos determinado pela composio qumica e propriedades fsico-qumicas que possui cada biocida, bem como pelas interaes com o material extracelular, pela composio qumica e morfologia das clulas (CAPELLETTI, 2006). Os biocidas podem ser classificados em dois grandes grupos, de acordo com seu carter qumico: oxidantes, como por exemplo, o oznio, perxido de hidrognio, compostos de cloro; e no-oxidantes, como compostos sulfurados, estanho, isotiazolinonas, sais de cobre, aldedos, sais quaternrio de amnio, dentre outros (CAPELLETTI, 2006; PEREIRA, 2001). Embora apresentem diferenas qumicas importantes, o modo primrio de ao dos biocidas oxidantes consiste em oxidar compostos constituintes das clulas microbianas, sendo conseqentemente efetivos contra quase todos os tipos de microrganismos. Os biocidas oxidantes so os mais usados na indstria de

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alimentos. J os biocidas no-oxidantes tm sua atividade antimicrobiana expressada sobre os microrganismos pela interferncia no seu metabolismo ou pela desintegrao da parede celular (CAIXETA, 2008; CAPELLETTI, 2006; PEREIRA, 2001). O modo de aplicao do biocida to importante quanto a sua seleo, pois a simples adio do produto poder reduzir pouco, ou at mesmo no reduzir, as contaminaes microbiolgicas, podendo com isso agravar os problemas

(CAPELLETTI, 2006). Os fatores a considerar quando se aplica um biocida, incluem a quantidade a usar, a concentrao residual que necessria, o modo de aplicao, a freqncia da adio e o ponto de adio (CHAVES, 2004).

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12 Concluso

O modo de avaliao dos biofilmes merecem um estudo detalhado no ramo alimentcio. Obter um produto com qualidade e segurana o que mais se preza na indstria de alimentos e as estratgias para a erradicao dos biofilmes devem ser consideradas. Para isso os biocidas so excelentes mtodos a ser aplicados na remoo de biofilme, j que estes esto diretamente ligados as contaminaes que ocorrem em produtos alimentares, comprometendo a sade do consumidor, bem como acarretando prejuzos econmicos para a indstria. tambm de grande valia conhecer as propriedades benficas dos microrganismos formadores de biofilme, os quais podem atuar em diferentes situaes, como tratamento de efluentes e produo de fermentados, contribuindo desse modo com uma melhor produo na indstria.

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