INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

FRANCISCO ACÁCIO ALVES

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE FERRAMENTAS MOLECULARES PARA ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE DE PRIMATAS AOTUS E SAIMIRI

Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências – área de concentração: Imunologia

Orientadores: Prof. Dr. Leonardo José de Moura Carvalho Prof. Dr. Cláudio Tadeu Daniel-Ribeiro

RIO DE JANEIRO

2009

Alves, Francisco Acácio

Desenvolvimento e validação de ferramentas moleculares para análise da resposta imune de primatas Aotus e Saimiri/Francisco Acácio Alves – Rio de Janeiro: 2009. 111 p.

Tese (Doutorado) – Instituto Oswaldo Cruz, Biologia Celular e Molecular, 2009.

1. Malária 2. Plasmodium falciparum 3. Citocinas 4. PCR-TRq 5. Saimiri sciureus 6. Aotus infulatus

I. Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz

INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

FRANCISCO ACÁCIO ALVES

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE FERRAMENTAS MOLECULARES PARA ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE DE PRIMATAS AOTUS E SAIMIRI

ORIENTADORES: Prof. Dr. Leonardo José de Moura Carvalho Prof. Dr. Cláudio Tadeu Daniel-Ribeiro Aprovada em: 06/04/2009 EXAMINADORES: Prof. Dr. Gabriel Grimaldi Filho - Presidente Profa. Dra. Maria de Fátima Ferreira da Cruz Prof. Dr. Stenio Perdigão Fragoso Profa. Dra. Dalma Maria Banic Prof. Dr. Renato Porrozzi de Almeida Rio de Janeiro, 6 de Abril de 2009

Este trabalho foi desenvolvido no Centro Nacional de Primatas, SVS/MS, Ananindeua – PA, no Laboratório de Polimorfismo de DNA, UFPA, Belém – PA, nas seções de Parasitologia e Virologia do Instituto Evandro Chagas, SVS/MS, Ananindeua – PA, no Instituto de Biologia Molecular do Paraná, Fiocruz, Curitiba – PR, na Primatologia da Fiocruz/RJ e no Laboratório de Pesquisas em Malária do Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro – RJ

Agências financiadoras: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico/CNPq, PDTIS/IOC e Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz

Dedicatória

A meus pais A meus irmãos e família

A minha esposa Ayla Aos meus filhos Laís e Lucas

Agradecimentos

A Deus que nunca desistiu de mim!;

Aos meus pais Francisco Ribeiro Alves e Maria José Acácio Alves pela educação e exemplo

de vida;

Aos meus sogros José Arteiro de Oliveira e Maria José Melo Lopes pelo apoio;

A minha esposa e companheira de todas as horas, mãe dedicada e mulher de fibra, Ayla de

Oliveira Alves, se não fosse por sua ajuda eu jamais teria conseguido terminar essa fase

acadêmica de nossas vidas!;

Ao Dr. Cláudio Tadeu Daniel-Ribeiro pela amizade, orientação, exemplo profissional e de

liderança. Muito obrigado!;

Ao Dr. Leonardo José de Moura Carvalho pela amizade, orientação, dedicação e pelas

oportunidades valiosas ofertadas a mim. Você é um pesquisador sensacional e um amigo

valioso!;

À Dra. Graziela Maria Zanini pela amizade, apoio, guarita e momentos agradáveis no Rio de

Janeiro;

Ao Instituto Oswaldo Cruz pela oportunidade de fazer uma de suas prestigiosas pós-

graduações;

Ao Centro Nacional de Primatas pela parceria ofertada neste trabalho;

Ao médico veterinário e amigo Dr. José Augusto Pereira Carneiro Muniz, pelo

companheirismo e incentivo;

Ao Instituto Evandro Chagas (IEC) pela oportunidade de desenvolver a parte prática do meu

doutorado em suas instalações;

À Dra. Maria de Fátima Ferreira da Cruz pelos conselhos, correções relativas à tese e por

aceitar julgar este trabalho;

Ao Dr. Gabriel Grimaldi Filho por aceitar julgar este trabalho;

Ao Dr. Renato Porrozzi de Almeida por aceitar julgar este trabalho;

À Dra. Dalma Maria Banic por aceitar julgar este trabalho;

À Senhora Cláudia Castro pela amizade, competência e presteza. Aliás, competência é uma

palavra que representa muito bem o seu estilo profissional;

À senhorita Mariana Teixeira de Souza pela amizade e bom convívio profissional durante os

quatro anos de doutorado;

Ao doutorando Paulo Renato Totino pela amizade e ajuda durante os ensaios laboratoriais;

Aos colegas do Laboratório de Pesquisas em Malaria do IOC/Fiocruz pela amizade e

companheirismo;

À Dra. Marinete Marins Póvoa pela oportunidade de realizar parte da minha tese no

Laboratório de Malaria do IEC;

À Dra. Salma Gomes de Oliveira pela presteza, consideração e amizade;

À Dra. Elisabeth Conceição de Oliveira Santos pela oportunidade de parceria oferecida pelo

IEC;

À Dra. Lourdes Garcez pela amizade, consideração e por permitir o uso das instalações do

Laboratório de Imunologia/IEC;

Aos colegas, técnicos e estudantes, do Laboratório de Imunologia/IEC pela ajuda fornecida

durante minha permanência nesse laboratório;

Ao Dr. Sebastião Aldo da Silva Valente pela oportunidade de circulação pelos laboratórios da

seção de parasitologia do IEC;

Aos técnicos do Laboratório de Malaria do IEC, Sr. José Maria Nascimento e Sr. José Mário,

pela presteza e amizade;

Ao Dr. Alexandre da Costa Linhares por permitir minha permanência na seção de Virologia

do IEC;

Ao Dr. Ronaldo Freitas pela amizade e pela oportunidade em realizar meus experimentos de

PCR-TRq nas instalações da seção de Virologia/IEC;

À Sra. Rute Freitas pela amizade e confiança;

Ao diretor do Centro Nacional de Primatas, Dr. Carlos da Costa Faro, pela parceria concedida

para a realização deste trabalho;

Ao Dr. Paulo Henrique Castro pelo auxílio na condução prática deste trabalho;

Ao Dr. Washington Luiz Assunção Pereira pelo auxílio na análise das lâminas histológicas;

Aos técnicos em laboratório do Cenp Sr. Miguel Alfredo Sá da Costa, Sr. José Hermenegildo

Viana, Sr. Osvaldo dos Santos Filho e Sr. Sebastião pelo auxílio laboratorial;

Aos demais funcionários do Cenp que de alguma maneira ajudaram na realização deste

trabalho;

Ao Dr. Antônio Mota pelo auxílio e presteza durante os trabalhos realizados no IOC/Fiocruz,

Rio de Janeiro;

À Dra. Márcia Andrade pela amizade e, pelo auxílio e presteza durante os trabalhos

realizados no IOC/Fiocruz, Rio de Janeiro;

Aos funcionários do CECAL, Fiocruz – RJ, que de alguma maneira ajudaram na realização

deste trabalho;

Ao Dr. Samuel Goldenberg por me receber no Instituto de Biologia Molecular do Paraná,

Curitiba – PR;

Ao Dr. Marco Aurélio Krieger por me receber no Instituto de Biologia Molecular do Paraná,

Curitiba – PR;

Ao Dr. Stenio Perdigão Fragoso pela amizade, exemplo de simpatia e competência, e por

aceitar julgar esta tese;

Ao Dr. Christian Macognan Probst pela amizade e pelas aulas sobre análise de seqüências;

À Dra. Daniela Parada Pavoni pela paciência e orientação durante meu treinamento realizado

no IBMP;

A todos os colegas do IBMP que de alguma maneira contribuíram para a realização desta

tese;

À Dra. Paula Schneider pela oportunidade em circular pelo excelente LPDNA/UFPa;

Ao Dr. Evonnildo Costa Gonçalves pela orientação dada durante minha estadia no

LPDNA/UFPa;

Ao Dr. Arthur Silva/LPDNA pela orientação dada durante minha estadia no LPDNA/UFPa;

À bióloga Silvanira Barbosa pela amizade e pelo treinamento dado durante minha estadia no

LPDNA/UFPa;

A todos os colegas do LPDNA que de alguma maneira contribuíram para a realização desta

tese;

Ao Dr. Henrique Lenzi pelas aulas sobre análise das estruturas de órgãos linfóides;

Ao Dr. Washington Assunção pelo auxílio dado para a realização das fotos histológicas;

Aos amigos Dr. Rodrigo Del Rio do Valle e Dra. Cristiane Macedo Del Rio do Valle pela

amizade, apoio, guarita e momentos agradáveis em São Paulo;

Aos amigos Dr. Ricardo Ehlers e Dra. Samira Chahad Ehlers pela amizade, pelos momentos

agradáveis passados em Curitiba, bem como pela guarita dada a mim, em um momento que

estava tão longe de casa, longe da minha família;

Ao colega de pós-graduação Leonardo Rocha pela amizade, convívio e guarita durante

minhas estadias no Rio de Janeiro;

À administradora da Vila Residencial Casa Amarela/Fiocruz, dona Vera Pedrosa, pela

confiança e amizade, a todos os demais funcionários desse ambiente familiar, e aos colegas

que fiz durante minhas estadias no Rio de janeiro, meu muito obrigado!;

A todos que não foram citados aqui, mas que de alguma forma tiveram participação efetiva

neste trabalho, o meu muito obrigado e, que Deus abençoe a todos!

ÍNDICE

RESUMO i

ABSTRACT ii

SIGLAS E ABREVIATURAS iii

INTRODUÇÃO 1

Fenômenos imunológicos que orientaram a seleção de alvos para desenho dos

iniciadores de PCR-TRq

11

Papel das citocinas e dos receptores alvos de nosso estudo 12

JUSTIFICATIVA 17

OBJETIVOS 18

ESTRATÉGIAS 18

MATERIAL E MÉTODOS 19

Desenho experimental 19

Animais 21

Extração de DNA por Fenol-Clorofórmio 21

Escolha dos genes e desenho dos iniciadores 22

PCR, sequenciamento, alinhamento, edição de sequências e desenho dos iniciadores

específicos para estudo de expressão gênica

24

Estudo de Expressão Gênica 26

Obtenção de células mononucleadas do sangue periférico 26

Contagem de células (PBMCs) 26

Cultivo celular 27

Extração de RNA (kit RNeasy®, Qiagen) 27

Síntese de cDNA (kit high-capacity®, Applied Biosystems) 28

PCR em tempo real quantitativo (PCR-TRq ou qRT-PCR) 30

Experimento de Infecção 32

Critérios para escolha dos animais 32

Desenho experimental 32

Cirurgia de retirada de baço (Esplenectomia) 33

Exame Histológico 33

Manutenção in vitro de Plasmodium falciparum 33

Experimento de estimulação de esplenócitos, extração de mRNA e síntese de cDNA 34

RESULTADOS 35

Desenho de iniciadores e amplificação 35

Graus de Identidade 38

Análise de seqüências 42

Desenho e validação de iniciadores baseados nas sequências de Saimiri e Aotus para

estudos de expressão gênica usando como ferramenta a qRT-PCR

68

PCR em tempo real quantitativo (PCR-TRq ou qRT-PCR) 68

Experimento de Infecção 72

Investigação da expressão gênica de citocinas (IFNγ, IL2, IL6, IL10, IL12, LTA e

TNF) em células do baço de S. sciureus infectados por P. falciparum

74

Análise da arquitetura esplênica de S. sciureus infectados e não-infectados 84

DISCUSSÃO 87

CONCLUSÕES 98

PERSPECTIVAS 99

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 100

i

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE FERRAMENTAS MOLECULARES PARA ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE DE MACACOS AOTUS E SAIMIRI

RESUMO TESE DE DOUTORADO Francisco Acácio Alves Os primatas neotropicais Aotus e Saimiri são os modelos recomendados pela OMS para estudos experimentais usando parasitas da malária humana. No entanto, existe uma carência de ferramentas específicas para estudar a resposta imune desses primatas durante o curso de infecção. A PCR quantitativa em tempo real (PCR-TRq) permite avaliar a expressão gênica nesses modelos e, assim, auxiliar no entendimento dos mecanismos imunológicos e geradores de patogenia nessa endemia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenhar, amplificar, sequenciar e analisar fragmentos de genes relacionados à resposta imune de A. infulatus e S. sciureus, para desenhar iniciadores moleculares para PCR-TRq visando à avaliação da expressão desses genes durante imunizações e infecção por P. falciparum. Para esse fim, sequências de DNA humano de 31 moléculas foram obtidas do GenBank para servir como molde para o desenho dos iniciadores usados na PCR convencional e na PCR-TRq e para o sequenciamento de DNA genômico de Aotus e Saimiri. As sequências foram analisadas no aplicativo BioEdit e usadas como molde para desenhar iniciadores específicos para o estudo de expressão gênica por PCR-TRq. Uma cinética de expressão gênica foi realizada estimulando-se células mononucleares do sangue periférico de Saimiri e Aotus com mitógenos por 2, 4, 6, 8, 12 e 18 horas. Depois, os iniciadores específicos foram usados na avaliação de resposta imune em células de baço de macacos Saimiri infectados por P. falciparum cultivadas sob diferentes condições antigênicas. Desse modo, 17 (IFNγ, TNF, LTA, IL2, IL6, IL10, IL12, IL3, IL4, IL5, IL13, TGFβ2, CD40, CSF2, CCR5, CCR8, e BAX) dos 31 genes analisados foram amplificados, purificados e sequenciados. Graus de identidade, que variaram de 87% a 100%, foram observados entre as sequências nucleotídicas de Aotus, Saimiri, outros primatas e do homem. As sete moléculas (IFNγ, IL2, IL6, IL10, IL12, LTA e TNF) analisadas nas reações de PCR-TRq mostraram pico de expressão que variou entre seis e 12 horas; constatamos que as hemácias parasitadas corresponderam ao melhor estímulo antigênico. A análise da expressão dessas moléculas em esplenócitos de Saimiri infectados evidenciou uma forte reação inflamatória com sete dias de infecção, quando já se observava uma desestruturação da arquitetura normal nesse órgão. Com 28 dias de infecção, notou-se uma diminuição da expressão desses genes que coincidiu com uma reestruturação da arquitetura do baço, que se apresentava ainda com regiões de congestão da microcirculação e forte deposição de hemozoína. Concluímos que variações de sequência existentes entre espécies correlatas, mesmo que pequenas, podem interferir no reconhecimento de transcritos durante os ensaios de expressão gênica, reforçando a necessidade de se desenvolver ferramentas moleculares específicas para Aotus e Saimiri para avaliação de resposta imune. Finalmente, nossos dados de expressão gênica de citocinas corroboraram aqueles obtidos em estudos com humanos, nos quais uma forte reação inflamatória durante os estágios iniciais de infecção foi seguida por uma inibição tardia dessa resposta, o que corresponde ao padrão de resposta imune importante para o controle do crescimento do parasita e consequente redução das complicações associadas à imunopatogenia.

ii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF MOLECULAR TOOLS TO ANALYSE THE IMMUNE RESPONSE IN THE AOTUS AND SAIMIRI NEOTROPICAL

PRIMATES MONKEYS ABSTRACT TESE DE DOUTORADO Francisco Acácio Alves The neotropical primates Aotus and Saimiri are the models recommended by the WHO for experimental studies with human malaria parasites, particularly to assess immune responses and to conduct pre-clinical trials of potential vaccines. However, there is a lack of availability of specific tools to study the immune responses in these models. The quantitative real time PCR (qRT-PCR) can be used to assess the gene expression in these models and better understand the immune mechanisms underlying immunopathogenesis in malaria. In this context, the objective of this work was to sequence immune system-related gene fragments of A. infulatus and S. sciureus to design qRT-PCR primers aiming at the evaluation of gene expression during P. falciparum infection or immunizations. For this purpose, DNA sequences of 31 human immune molecules obtained from GenBank were used as templates to design forward and reverse primers to be used in conventional PCR and sequencing of the Aotus and Saimiri genomic DNA. The DNA sequences obtained were analyzed with the BioEdit software and used as templates to design qRT-PCR primers to study gene expression patterns during P. falciparum blood stage experimental infections of the Aotus and/or Saimiri monkeys. Gene expression kinetics were set when PBMCs were cultured by 2, 4, 6, 8, 12 and 18h under mitogenic stimulation. The primers were then used to evaluate cytokine gene expression in cultured splenocytes of P. falciparum-infected Saimiri. Seventeen (IFNγ, TNF, LTA, IL2, IL6, IL10, IL12, IL3, IL4, IL5, IL13, TGFβ2, CD40, CSF2, CCR5, CCR8, e BAX) out of 31 genes were amplified, purified and sequenced; different degrees of identity (87 to 100%) were observed when compared with homolog sequences of other Aotus and Saimiri species as well as with other nonhuman primates and human DNA sequences. Seven molecules (IFNγ, IL2, IL6, IL10, IL12, LTA e TNF) analyzed in qRT-PCR showed highest gene expression in mitogen-stimulated Saimiri and Aotus splenocytes at 6 and 12 hours. The gene expression in P. falciparum-infected Saimiri splenocytes showed an early inflammatory reaction after blood infection, when spleen showed a destruction of normal architecture in that organ. At later stages of infection, downregulation in inflammatory gene expression and restructuring of the spleen architecture presenting congestion of microvasculature and intense hemozoin deposition in parenchyma were observed. In conclusion our data showed that small sequence variations between human and Aotus/Saimiri sequences interfered in transcript recognition (qRT-PCR) clearly showing the need for developing specific molecular tools for these experimental models. Finally, our gene expression findings corroborate those found in human infection, showing an early inflammatory response during malaria infection followed by its downregulation, corresponding to an immune response pattern necessary to control malaria parasite growth and disease complications.

iii

Siglas e Abreviaturas

aa Aminoácido AID Deaminase cistidina induzida por ativação BAX Proteína X associada a BCL2 BCL2 B-cell CLL/linfoma 2 CCL1 Ligante 1 de quimiocina (C-C motif) CCL11 Ligante 11 de quimiocina (C-C motif) ou eotaxina CCL2 Ligante 2 de quimiocina (C-C motif) CCR3 Receptor 3 de quimiocina (C-C motif) CCR4 Receptor 4 de quimiocina (C-C motif) CCR5 Receptor 5 de quimiocina (C-C motif) CCR6 Receptor 6 de quimiocina (C-C motif) CCR8 Receptor 8 de quimiocina (C-C motif) CD Grupos de distribuição CD23 Antígeno CD23ou fragmento Fc de IgE, baixa afinidade CD4+ Molécula CD4 CD40 Molécula CD40 ou TNF receptor superfamília membro 5 CD8+ Molécula CD8 CD95 Antígeno CD95 ou Fas ou TNF receptor superfamília , member 6 cDNA DNA complementar CENP Centro Nacional de Primatas CSF2 Fator 2 estimulante de colônia (granulócito e macrófago) CSP Proteína Circumesporozoita Ct Valor limiar de posistivadader (threshold) DEPC Dietil pirocarbonato DNA Ácido desoxirribonucléico DNAc Ácido desoxirribonucléico complementar DNase Deoxiribonuclease ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EPO Eritropoietina FAS Antígeno Fas ou receptor do fator de necrose tumoral, superfamília

membro 6 FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz GenBank Banco de dados de sequências nucleotídicas mantido pelo US National

Center for Biology Information GLURP Glutamate-rich protein gp130 Glicoproteina 130 ou Interleucina 6 signal transducer GPI Glicosil fosfatidil inositol ICAM-1 Molécula 1 de adesão intercelular IEC Instituto Evandro Chagas IFNγ Interferon gamma Ig Imunoglobulina IgE Imunoglobulina E IgG Imunoglobulina G IL1β interleucina 1 beta IL2 Interleucina 2

iv

IL3 Interleucina 3 IL4 Interleucina 4 IL5 Interleucina 5 IL6 Interleucina 6 IL7 Interleucina 7 IL8 Interleucina 8 IL9 Interleucina 9 IL10 Interleucina 10 IL11 Interleucina 11 IL12A Interleucina 12p35 IL12B Interleucina 12p40 IL13 Interleucina 13 IL17 Interleucina 17 IL18 Interleucina 18 IL27 Interleucina 27 iNOS Oxido nítrico sintetase induzível IOC Instituto Oswaldo Cruz JAK Janus kinase Kb Kilobases kDa Kilodaltons LTA Linfotoxina alfa ou TNFβ M Molar MC Malária cerebral Mg Miligrama MIF Fator inibitório de migração macrofágica mL Mililitros MS Ministério da Saúde MSP3 Proteína 3 de superfície do merozoita NCBI National Center for Biotechnology Information NF-KAPPA Polipeptideo do Fator nuclear Kappa de cadeia leve NK Células matadoras naturais NKT Células T matadoras naturais NO Oxido nítrico OMS Organização Mundial de Saúde Pb Pares de bases PBMC Célula mononucleares do sangue periférico PCR Reação em cadeia da polimerase pH potencial hidrogeniônico PCR-TRq PCR quantitativa em tempo real RNA Acido ribonucléico RNase Ribonuclease RPMI Roswell Park Memorial Institute médium RT-PCR PCR transcriptase reversa SBF Soro Bovino Fetal SPf66 Vacina peptídica sintética STAT4 Signal transducer and activator of transcription 4 SVS Secretaria de Vigilância em Saúde TGFα Transforming growth factor, alpha

v

TGFβ Transforming growth factor, beta Th1 Células T auxiliares do tipo 1 Th2 Células T auxiliares do tipo 2 TNF Fator de necrose tumoral TNFRSF1A Superfamília de receptores do fator de necrose tumoral, membro 1A TNFRSF1B Superfamília de receptores do fator de necrose tumoral, membro 1B µL Microlitro WHO World Health Organization, Organização Mundial de Saúde (OMS)

1

Introdução

A malária ainda permanece como uma das endemias de maior prevalência em todo o

mundo, causando pelo menos um milhão de mortes, principalmente em crianças abaixo de

cinco anos de idade, nos países tropicais (WHO Malaria Reports, 2008).

A doença é causada por protozoários de vida intracelular do gênero Plasmodium,

transmitido ao homem através de picada da fêmea de algumas espécies de mosquito

Anopheles. Existem cinco espécies de Plasmodium que infectam o homem: i) P. ovale que

causa uma forma relativamente benigna da doença; ii) P. malariae que também causa uma

forma benigna da doença, mas com relatos de glomerulonefropatia associada a

imunocomplexos em infecções crônicas; iii) P. vivax que, comumente, causa acessos febris e

anemia, especialmente, na Ásia, América do Sul e Oceania embora, em casos raros, possa

levar a complicações fatais; iv) P. falciparum que causa, indiscutivelmente, a forma mais

grave da doença chegando a milhões de óbitos anuais nos países da região sub-saariana da

África e na maioria dos países da zona equatorial do globo (Malaguarnera & Musumeci,

2002; Reed, 2002; Torre, Speranza & Martegani, 2002; Schofield & Grau, 2005; Ashley et

al., 2006) e; v) P. knowlesi que, recentemente, foi demonstrado ser o responsável por mais da

metade dos casos clínicos de malária no sudeste asiático, antes diagnosticados como tendo

sido originados pelo P. malariae (Singh et al., 2004).

Em áreas de alta transmissão de malária, como é o caso da África sub-saariana,

crianças maiores de seis meses e menores de cinco anos de idade são as grandes vítimas de

formas graves potencialmente letais. As crianças que nascem de mães imunes são protegidas

contra a doença durante os primeiros seis meses de vida por anticorpos maternos. Essa

imunidade passiva é seguida por um ou dois anos de aumento da suscetibilidade antes que se

comece a gerar uma imunidade ativa que protege do desenvolvimento da doença. Em geral,

aquisição dessa imunidade é lenta e requer repetidas exposições para sua manutenção (Baird

et al., 2002; Perlmann & Troye-Blomberg, 2002). As complicações mais frequentes da

malária nas crianças menores de cinco anos, compreendem a anemia grave, a malária cerebral

(MC) e a acidose metabólica, que leva a problemas respiratórios graves, havendo elevada

morbi-letalidade por malária nessa faixa etária. Entre os cinco anos de idade e a puberdade,

complicações letais são raramente observadas, mas os indivíduos continuam suscetíveis à

doença, apresentando manifestações clínicas como febre, dores de cabeça, náuseas, etc. Na

pós-puberdade e durante toda a idade adulta, indivíduos podem apresentar parasitas no sangue

em baixas densidades, mas, raramente, apresentam qualquer tipo de manifestação clínica, em

2

função de um estado de imunidade clínica adquirida denominada premunição (Baird et al.,

1996; Druilhe & Pérignon, 1999; Struik & Riley, 2004). Em áreas de baixa transmissão, como

é o caso da maior parte das áreas endêmicas de malária no Brasil, imunidade desse tipo parece

ser de mais difícil aquisição em função da baixa exposição ao parasita. Assim, mesmo

adultos, geralmente primoinfectados, podem desenvolver formas graves potencialmente letais

tais como MC, edema pulmonar, problemas renais e choque. Cabe lembrar, entretanto, que

casos de infecção plasmodial assintomática têm sido registrados na Amazônia Brasileira e

são, hoje se sabe, devido ao estado de imunidade clínica em adultos migrantes mesmo

vivendo há relativamente pouco tempo na região endêmica (da Silva-Nunes et al., 2008). A

dinâmica da transmissão e a idade da pessoa infectada são, portanto, importantes

determinantes da doença, além das características genéticas do hospedeiro e do parasita e o

tipo de resposta imunológica desencadeada (Schofield & Grau, 2005; Clark et al., 2006;

Riley, Wahl & Schofield, 2006).

A resposta imune na malária é extremamente complexa e de grande importância não

apenas na aquisição de imunidade, mas também na indução de patologia. É fundamental levar

em consideração essa dicotomia, por exemplo, no desenho de potenciais vacinas

antimaláricas. No caso de proteção contra a fase hepática, as respostas celulares envolvendo

linfócitos CD4+ e, principalmente CD8+, assim como células NK e a produção de citocinas -

como IFNγ e IL12 - e mediadores como o óxido nítrico, perforinas e granzimas, têm sido

demonstradas como essenciais na imunidade protetora induzida por esporozoítas irradiados

(Doolan & Hoffman, 2000; Frevert & Nardin, 2008).

Na fase eritrocítica, as manifestações patogênicas são decorrentes da liberação maciça

de citocinas pró-inflamatórias secretadas por células T e por macrófagos em resposta ao

parasita e seus derivados, incluindo o glicosilfosfatidilinositol (GPI) e pigmento malárico

(Malaguarnera & Musumeci, 2002; Torre, Speranza & Martegani, 2002; Stevenson & Riley,

2004; Clark et al., 2006). A resposta inflamatória, necessária para remoção do parasita, pode

levar também a dano tecidual considerável, e os altos níveis de citocinas inflamatórias podem

causar efeitos sistêmicos danosos com sérias consequências, como a anemia grave e a MC

(Malaguarnera & Musumeci, 2002; Torre, Speranza & Martegani, 2002; Perlmann & Troye-

Blomberg, 2002; Schofield & Grau, 2005; Clark et al., 2006; Riley et al., 2006).

As citocinas pró-inflamatórias secretadas por células mononucleares do sangue

periférico – PBMCs - tais como IFNγ, IL1 e IL6, podem proteger o hospedeiro por induzir a

morte do parasita através de monócitos, macrófagos, neutrófilos, células T e NK, que atuarão

contra as formas hepáticas e sanguíneas (Whicher & Evans, 1990; Troye-Blomberg et

3

al.,1994; Malaguarnera & Musumeci, 2002; Pouniotis et al., 2004; Whalter et al., 2006;

Couper et al., 2007; Schofield, 2007; Frevert & Nardin, 2008). IL12 produzida por células

dendríticas, fagócitos mononucleares e outras células contribui para proteção contra as fases

pré-eritrocítica e eritrocítica em camundongos e em macacos por iniciar uma resposta do tipo

Th1 (Wykes et al., 2007). Ao contrário, citocinas antiinflamatórias tais como IL10 atuam

inibindo os possíveis efeitos citopáticos exercidos pelas citocinas pró-inflamatórias. Estudos

recentes em humanos infectados por P. falciparum enfatizam a importância do equilíbrio

entre as citocinas pró- e antiinflamatórias. Por exemplo, a elevada razão entre IL6/IL10 no

plasma devido a uma possível deficiência em IL10 pode encaminhar a doença para

consequências sérias como as observadas na malária grave (Perlmann & Troye-Blomberg,

2002). De maneira semelhante, a elevada razão entre os níveis de TNF e de IL10 está

associada com a anemia grave e a relação inversa, favorecendo IL10, estaria relacionada com

proteção contra essa complicação (Kurtzhals et al., 1998; Othoro et al., 1999). Estudos

genéticos também incriminaram o TNF como importante na suscetibilidade à MC. De fato,

indivíduos com determinados polimorfismos na região promotora do gene dessa citocina

apresentavam maior vulnerabilidade à evolução para MC (Hananantachai et al., 2007).

Uma resposta imune rápida baseada na liberação de citocinas pró-inflamatórias parece

mediar uma imunidade protetora, sendo que respostas tardias contribuem para patologia. No

entanto, vale lembrar, em alguns casos, citocinas pró-inflamatórias que causam patologia são

os mesmos mediadores que, em concentrações mais baixas, podem ser responsáveis pelo

controle do crescimento do parasita. Isso sugere que deve existir um equilíbrio crucial durante

a resposta inflamatória na infecção malárica, para que esta seja efetiva e não gere patologia.

Esse tipo de resposta pode ser equilibrado por citocinas antiinflamatórias, que incluem a IL4,

IL-10 e o TGFβ (Riley et al., 2006). A relação entre células imunes efetoras e seus

mediadores solúveis, a modulação exercida pelo Plasmodium sobre o sistema imunitário e, os

mecanismos lentos de aquisição de imunidade e geradores de patogenia devem ter foco

central em estudos conduzidos em malária, principalmente naqueles relacionados à busca por

uma vacina eficaz contra o parasita e suas complicações (Schofield & Grau, 2005).

De fato, em determinados modelos experimentais murinos, os animais que fazem uma

resposta predominantemente tipo Th1 na fase inicial da infecção, com uma virada para uma

resposta tipo Th2 em fase mais tardia, conseguem controlar bem a infecção (Troye-Blomberg,

Berzins & Perlmann, 1994). Considera-se que essa virada para Th2 teria um efeito

regulatório, evitando que uma resposta Th1 se exacerbe levando à patologia.

4

No modelo murino de MC, com a utilização de camundongos de linhagens como

C57Bl/6 ou CBA infectados pela cepa ANKA de P. berghei, é evidente que os danos

neurológicos que provocam 60-90% de letalidade não são consequência direta da ação do

parasita, e sim de uma resposta inflamatória exacerbada induzida pelo parasita. Esse modelo

tem sido muito bem caracterizado em relação ao papel de vários mediadores do sistema imune

na patologia. Foi demonstrado, por exemplo, que células T CD4+ e também CD8+, agindo em

diferentes momentos, são essenciais para o desenvolvimento de MC (Grau et al., 1986; Yanez

et al., 1996; Lou, Lucas & Grau, 2001; Belnoue et al., 2002). Da mesma maneira, citocinas

como TNF (Grau et al., 1987), IFNγ (Grau et al., 1989) e linfotoxinas (LTA ou TNFβ)

(Engwerda et al., 2002), IL3, CSF2 (GM-CSF) (Grau et al., 1988) são mediadores

fundamentais. Outros tipos celulares, como macrófagos, células NK e NKT, neutrófilos,

plaquetas, e outros mediadores como IL18, moléculas de adesão, óxido nítrico,

hemeoxigenase, entre outros, também exercem papéis centrais na patogenia dessa

complicação nesse modelo experimental (Schofield, 2007; Gramaglia et al., 2006; Pamplona

et al., 2007; Carvalho et al., 2000).

Trabalhos do Laboratório de Pesquisas em Malária do Instituto Oswaldo Cruz /

Fiocruz no modelo P. berghei ANKA/CBA demonstraram que esse parasita provoca intensas

e extensas alterações em órgãos linfóides primários (timo) e secundários (baço, linfonodos,

placas de Peyer) (Carvalho et al., 2006; 2007). Ocorre intensa atrofia tímica e, paralelamente,

profunda desorganização estrutural de centros germinativos no baço e linfonodos, com

intensa ativação e apoptose principalmente de células B, e deficiência de diferenciação. Esses

autores postulam que tal desestruturação tenha importante papel na memória imunológica

defectiva em infecções maláricas.

Todos esses dados mostram, claramente, que o tipo de resposta imune induzida pela

malária em diferentes contextos (espécies e cepas de parasitas, background genético do

hospedeiro, imunidade prévia, etc) pode resultar em situações muito diferentes, desde

proteção até uma resposta deletéria e potencialmente letal. Assim, a compreensão dos

mecanismos pelos quais diferentes tipos ou diferentes intensidades de resposta imune são

gerados é importante para o desenho de qualquer tipo de intervenção, profilática ou

terapêutica, que vise à modulação dessas respostas. Como citado, a dicotomia

proteção/patologia deve ser considerada no desenvolvimento de vacinas, pois a resposta

gerada por imunizações pode ser deletéria ao invés de benéfica.

Ainda não se dispõe de uma vacina eficaz contra a malária, apesar de considerável

esforço nesse sentido por vários grupos de pesquisa no mundo (revisto por Carvalho et al.,

5

2002; Herrera, 2005; Reed, Friede & Kieny, 2006). Vários alvos têm sido pesquisados como

antígenos candidatos a compor uma vacina antimalárica, havendo basicamente seis diferentes

abordagens estratégicas envolvendo o bloqueio: 1) da penetração do esporozoíta nos

hepatócitos; 2) do desenvolvimento da forma hepática; 3) da penetração do merozoíta nos

eritrócitos; 4) do desenvolvimento das formas intra-eritrocíticas ou da adesão de hemácias

parasitadas ao endotélio; 5) de toxinas e; 6) da fertilização de gametas no mosquito,

impedindo a transmissão. Mais de 30 antígenos derivados das diferentes fases do ciclo do

parasita foram identificados e muitos deles submetidos à extensiva caracterização de sua

capacidade de induzir proteção, tanto em modelos experimentais quanto, em alguns casos, em

voluntários humanos. Antígenos como a Proteína Circumesporozoíta (CSP) e a SPf66

(combinação de quatro diferentes antígenos das fases hepática e sanguínea) já foram

avaliados inclusive em ensaios clínicos de fase III. Entretanto, mesmo os resultados mais

promissores não asseguraram mais que proteção clínica parcial e, em geral, de curta duração

(Carvalho et al., 2002).

Esses achados ilustram que, para o desenvolvimento racional de uma vacina eficaz,

será necessário um conhecimento bem mais aprofundado da resposta imune na malária, e dos

mecanismos de aquisição de imunidade. Assim, é de consenso que a utilização de modelos

experimentais, como já citado acima, é crucial, uma vez que os estudos passíveis de serem

realizados em humanos são muito limitados (Legrand, Weijer & Spits, 2006).

Estudos in vivo em malária podem ser realizados em uma variedade de modelos

experimentais. Em camundongos, quatro espécies plasmodiais, P. chabaudi, P. berghei, P.

yoelii e P. vinckei, além de subespécies ou cepas, são disponíveis em laboratórios de

experimentação e se prestam a diferentes abordagens, incluindo estudos básicos de resposta

imune e aquisição de imunidade, patogenia de formas graves, desenvolvimento de drogas e

vacinas, e genética da suscetibilidade ou resistência à infecção (Rudin et al., 1997; Li et al.,

2001; De Souza & Riley, 2002). Outros modelos usam parasitas que naturalmente infectam

macacos, tais como P. knowlesi e P. cynomolgi, que também têm trazido contribuições

importantes nessas áreas (Schofield & Grau, 2005). Entretanto, os modelos recomendados

pela OMS para estudos com os plasmódios causadores da malária humana são os primatas

neotropicais pertencentes aos gêneros Aotus e Saimiri (WHO, 1988), pois: i) além do

chimpanzé, são os únicos animais capazes de serem infectados com os plasmódios que

infectam humanos; ii) sendo primatas, são filogeneticamente mais próximos ao homem; iii)

são abundantes na natureza, não ameaçados de extinção; iv) apresentam maior facilidade de

manejo e menor agressividade e; v) a manutenção de colônias numerosas pode ser feita com

6

um custo bem menor do que para os grandes primatas não-humanos (Stowers & Miller, 2001;

Herrera et al., 2002).

O Laboratório de Pesquisas em Malária vem realizando há anos testes pré-clínicos

vacinais com proteínas de estágio sanguíneo de P. falciparum na Fiocruz e no Centro

Nacional de Primatas (Cenp)/MS utilizando S. sciureus (Carvalho et al., 2004; 2005). No

total, 18 combinações antígeno-adjuvante contendo diferentes construções das proteínas

MSP3 e/ou GLURP de P. falciparum foram avaliadas, permitindo a definição da

imunogenicidade, inocuidade e eficácia protetora dessas formulações, evidenciando que, de

fato, o tipo de formulação tem forte impacto sobre esses fatores, e permitindo uma triagem de

construções imunogênicas e de adjuvantes mais potentes conquanto seguros. Em particular,

proteínas recombinantes em associação com os adjuvantes AS02 (Glaxo-Smith-Kline) e

Montanide ISA720 (SEPPIC) mostraram-se mais promissores, enquanto peptídeos sintéticos

e adjuvantes como alum e Ribi apresentaram-se pouco imunogênicos e pouco eficazes.

Realizamos também estudos que mostraram a suscetibilidade de A. infulatus ao P. falciparum

e sua vulnerabilidade à anemia malárica grave (Carvalho et al., 2000; 2003). O modelo foi

caracterizado e verificou-se que a anemia grave se estabelecia nos animais

independentemente de esplenectomia prévia ou do nível de parasitemia. Essa caracterização

do modelo permitiu definir protocolos precisos para desafio, acompanhamento e tratamento

dos animais em experimentos de avaliação pré-clínica de candidatos à vacina antimalárica

(Alves, 2003).

Entretanto, experimentos utilizando Aotus e Saimiri apresentam um fato dificultador

importante, que é a carência de reagentes comerciais específicos, o que dificulta, por

exemplo, a avaliação da resposta imune em ensaios pré-clínicos de vacinas e no estudo de

patogenia da malária. Avaliações dos níveis de algumas citocinas, por exemplo, têm sido

feitas em alguns trabalhos com a utilização de kits humanos, mas apesar de funcionarem em

alguns casos as diferenças de sensibilidade em relação à detecção das citocinas humanas

correspondentes faz com que seja difícil mensurar com precisão os níveis das citocinas nesses

macacos. Por exemplo, Herrera e colaboradores (1992) utilizaram anticorpos monoclonais

contra IFNγ humano para dosar por ELISA essa citocina no soro de A. trivirgatus imunizados

com antígenos de forma sanguínea de P. falciparum, mas foi necessária a criação de uma

unidade arbitrária para comparar os níveis de IFNγ entre os diferentes animais, tomando

apenas como referência a concentração (em picogramas) do padrão humano. A grande

maioria dos trabalhos de ensaios vacinais utilizando Saimiri e Aotus concentram suas análises

na resposta humoral, refletindo não apenas o consenso sobre a importância da resposta por

7

anticorpos na imunidade contra a malária, particularmente na fase sanguínea, mas também a

dificuldade de uma avaliação fidedigna da resposta celular nesses modelos (Carvalho, 2000;

Baruch et al., 2002; Egan et al., 2002; Jones et al. 2002; Lyon et al., 2008).

O efeito de pequenas diferenças de sequência no reconhecimento diferenciado de

moléculas entre diferentes espécies é, de fato, bem exemplificado por trabalhos que mostram

que a injeção de citocinas recombinantes humanas em primatas não-humanos, mesmo aqueles

filogeneticamente mais próximos ao homem, induzem potente resposta de anticorpos

neutralizantes contra essas citocinas, mesmo quando as homologias nas sequências tanto

peptídicas quanto nucleotídicas são superiores a 95% (Villinger et al., 2001). As diferenças de

sequência e, potencialmente, de conformação que podem ocorrer em consequência podem

explicar também os resultados obtidos por Contamin e colaboradores (2005), que utilizaram

um painel de 67 anticorpos monoclonais contra marcadores CD humanos, de diferentes

fabricantes, para definir as respectivas reatividades contra marcadores CD em células

mononucleares de Saimiri. Em alguns casos foram obtidas boas marcações, com variação da

intensidade da marcação dependendo do clone utilizado e do fabricante, e em muitos casos

não houve reatividade. Da mesma maneira, em trabalho semelhante, Daubenberger e

colaboradores (2007) testaram 204 anticorpos monoclonais contra diversos marcadores CD de

humanos em esplenócitos de Aotus e apenas 54 (28%) reagiram. Desses 54, apenas 22 (ou

seja, 11% do total) foram capazes de reagir também com celulas de macacos Rhesus e

Cynomolgus.

Nos nossos trabalhos citados acima, foram feitas tentativas de se utilizar reagentes

comerciais humanos disponíveis para avaliação de resposta celular como, por exemplo, kits

comerciais de ELISA, para detecção de citocinas em Saimiri e Aotus imunizados e/ou

desafiados, sem sucesso. Com isso, a avaliação de resposta celular pós-imunização e pós-

infecção foram prejudicadas, e nos concentramos na avaliação da resposta humoral. Mesmo

para a análise apropriada da resposta humoral foi necessário desenvolver reagentes

específicos. Inicialmente, para os ensaios de ELISA e imunofluorescência com plasmas de

Saimiri e Aotus foram utilizados reagentes humanos, a saber, anti-IgGs humanas comerciais,

de diferentes fabricantes, conjugadas à peroxidase ou à fluoresceína. Apesar de funcionarem,

eram pouco sensíveis. Por isso, partimos para a produção de nosso próprio reagente.

Purificamos IgG de Saimiri a partir de um pool de soros de animais normais, através de

cromatografia de afinidade utilizando proteína G. Essa IgG de Saimiri purificada foi utilizada

em associação com adjuvante de Freund para imunizar coelhos. Após as imunizações, o

sangue dos coelhos foi coletado e a IgG purificada. Essa IgG total de coelho contendo alta

8

concentração de anticorpos anti-IgG de Saimiri mostrou ter alta sensibilidade para detecção

de IgG de Saimiri e também de Aotus, aumentando enormemente a sensibilidade dos ensaios

de ELISA e de imunofluorescência indireta com soro ou plasma desses animais.

Em vista do sucesso da abordagem de produção de reagentes específicos para análise

da resposta humoral, decidiu-se que abordagem semelhante poderia ser aplicada ao

desenvolvimento de reagentes para análise de resposta celular nesses modelos, uma vez que

isso permitiria uma avaliação mais refinada das respostas imunes nesses animais. O propósito

fundamental é o de utilizar tais ferramentas na avaliação de resposta imune celular pós-

imunização e pós-desafio, em ensaios pré-clínicos ou estudos de patogenia da infecção.

Diversas estratégias podem ser empregadas com essa finalidade. Uma delas, bastante

pragmática, consiste no desenvolvimento de iniciadores e sondas moleculares com o objetivo

de analisar a expressão de genes envolvidos na resposta imune, como os de citocinas,

quimiocinas, marcadores de ativação, diferenciação e morte celular. Essa estratégia tem sido

utilizada por alguns grupos que também trabalham com esses modelos experimentais, visando

o desenvolvimento de ferramentas para avaliação de um número restrito de genes

correspondentes essencialmente a citocinas, principalmente em trabalhos com Aotus.

Dessa maneira, Duque e colaboradores (1998) analisaram a expressão

semiquantitativa de 10 moléculas (IL12B, IFNγ, LTA, IL4, IL6, IL10, IL1b, TNF, ICAM-1 e

iNOS) em células mononucleares do sangue periférico de macacos Aotus imunizados com

peptídeos de antigenos múltiplos (MAP) da proteína circumesporozoita de P. vivax e com

construções de MSP-1 de P. falciparum, através da utilização de iniciadores derivados das

sequências humanas. A utilização desses iniciadores incorpora, entretanto, o risco de que

pequenas diferenças entre essas sequências e aquelas de Saimiri e de Aotus possam levar a

não detecção, ou a uma detecção sub-ótima, dos cDNA-alvos. Por conseguinte, a abordagem

de se sequenciar genes selecionados de citocinas e outras moléculas do sistema imune dessas

espécies e somente a partir dessas sequências desenharem iniciadores tem sido adotada. Bost

e colaboradores (1997) desenharam múltiplos pares de iniciadores para cada um dos genes

das citocinas IL2, IL4, IL13 e IFNγ, e os selecionados foram utilizados para detectar por RT-

PCR a expressão dessas citocinas em células de A. trivirgatus estimuladas in vitro. Já Heraud

e colaboradores (2002) clonaram e sequenciaram cDNAs correspondentes ao RNA

mensageiro de sete citocinas de Saimiri sciureus: IL1β, IL2, IL5, IL6, IL10, TNF e IFNγ e

adaptaram um sistema de transcrição reversa para fazer análise semi-quantitativa da expressão

desses genes. Hernandez e colaboradores (2002) fizeram um trabalho semelhante

9

sequenciando os genes das citocinas IL2, IL4, IL6, IL10, TNF e IFNγ neste caso, de quatro

diferentes espécies de Aotus.

Esses trabalhos que descrevem o sequenciamento de um número reduzido de citocinas

de macacos Aotus e Saimiri e os trabalhos de expressão gênica que se basearam nessas

sequências representaram um passo importante na obtenção de ferramentas moleculares

específicas para esses modelos primatas. O emprego dessas ferramentas específicas em

estudos de resposta imune e de aquisição de imunidade, e em ensaios pré-clínicos vacinais é

aliado valioso na elucidação dos mecanismos geradores de imunidade e patogenia na malária

humana, uma vez que esses modelos são sabidamente suscetíveis a infecções experimentais

pelos plasmódios humanos, particularmente o P. falciparum. No entanto, esses autores

usaram métodos semi-quantitativos que podem não expressar de maneira fidedigna o

desenvolvimento de resposta imune nos experimentos com Aotus e Saimiri.

Sequências de outros genes de moléculas do sistema imune de Aotus e (ou) Saimiri

também foram obtidas, como por exemplo, as IL16 de Saimiri (Bannert et al., 1998), Fas-Fas

ligante (Villinger et al., 2001), TNF (Merien et al., 2003), TLR-9 (Spirig et al., 2005) e as de

MHC (Nino-Vasquez et al., 2000; Diaz et al., 2002; Suarez et al., 2006).

Entre os trabalhos relacionados a estudos de avaliação de resposta imune nos modelos

de primatas não-humanos, somente Coaña e colaboradores (2004) empregaram um método

mais acurado para quantificação da expressão de citocinas. Com efeito, embora esses autores

tivessem desenhado sondas para PCR em tempo real específicas para as citocinas IL4, IL10,

LTA (TNFβ) e IFNγ de A. nancymaae, não obtiveram sucesso na detecção de todas as quatro

citocinas ensaiadas limitando, dessa forma, a avaliação do padrão de resposta imune no

decurso da infecção experimental.

Todos esses trabalhos exemplificam a dificuldade de se trabalhar com essas espécies

de macacos pela necessidade do desenvolvimento de ferramentas específicas de análise da

resposta imune, de modo a aperfeiçoar a utilização desses modelos simianos para que os

experimentos realizados possam trazer informações mais precisas e potencialmente aplicáveis

a seres humanos.

O Laboratório de Pesquisas em Malária tem interesse na exploração dos modelos

Saimiri e Aotus para avaliação pré-clínica de antígenos candidatos à vacina antimalárica, e

também para estudos de mecanismos de aquisição de imunidade e de fisiopatogenia da

malária. Para isso, é imprescindível contar com ferramentas que permitam acessar os

10

fenômenos em estudo. Nos últimos anos, a disponibilização das metodologias de análise

multifatorial, como os microarranjos e PCR em tempo real quantitativo (PCR-TRq)

multigênicos, tem permitido avanços consideráveis na maneira de analisar fenômenos

biológicos, permitindo uma compreensão mais integrada e menos reducionista dos mesmos

(Benveniste, 1996; Livak & Schmittgen, 2001; User Belletin, 2001; Ginzinger, 2002; Marino,

2003). Essas duas premissas – o interesse no estudo dos mecanismos de imunidade e de

fisiopatogenia da malária e a utilização de ferramentas de análise multifatorial específicas

para nosso modelo de estudo, os macacos Saimiri e Aotus – orientaram a concepção e a

condução do presente trabalho.

Fundamentalmente, nos propomos aqui a desenvolver ferramentas moleculares

(iniciadores e sondas) baseadas nas sequências de Saimiri e Aotus e utilizá-las para acessar

determinados elementos, tais como citocinas, envolvidos na resposta imune durante

imunizações e infecções maláricas. Sendo a metodologia de PCR-TRq, atualmente uma

tecnologia acessível na pesquisa biomédica capaz de trazer informações qualitativas e

quantitativas na avaliação da expressão gênica, nosso foco foi o de desenvolver iniciadores

para PCR-TRq baseados nas sequências de Saimiri e Aotus. Um primeiro passo nesse

processo foi sequenciar genes pré-selecionados dessas duas espécies, produzindo assim a base

para o desenho de iniciadores e sondas de PCR-TRq. Procurou-se, na medida do possível, ter

como filosofia o desenho de sondas que identificassem regiões idênticas nos respectivos

genes (ou cDNAs) de S. sciureus e A. infulatus, espécies com as quais trabalhamos, de modo

a dispor de ferramentas específicas conquanto bivalentes. Uma vez desenhadas, testadas e

validadas, essas sondas se prestarão à meta fundamental, que é a de serem as ferramentas de

uso para se estudar os mecanismos imunológicos e fisiopatogênicos da malária nos modelos

mais próximos da patologia humana disponíveis.

11

Fenômenos imunológicos que orientaram a seleção de alvos para desenho dos

iniciadores de PCR-TRq

Em vista da enormidade do repertório de moléculas envolvidas na resposta imune e,

particularmente, na resposta imune na malária, torna-se uma tarefa árdua priorizar algumas

para serem alvos de nosso estudo. Assim, devido aos limites desse trabalho, fez-se uma

seleção prévia de moléculas que consideramos importantes nos fenômenos listados a seguir,

considerando:

- tipo de resposta de células T e outras células do sistema imune que modulam a resposta

imune frente a imunizações e/ou desafios. Neste caso, citocinas que pelo perfil pró- ou

antiinflamatório, ou ainda regulatório possam conduzir à proteção, ou à ineficácia da resposta,

ou mesmo à imunopatologia como IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12,

IL13, IL17, IL18, IL27, TNF, IFNγ, TGFβ, LTA, MIF e CSF2, e alguns de seus receptores,

como o TNFR e o IL2R foram considerados importantes;

- migração celular: a migração de diferentes tipos celulares influencia fortemente na resposta

imune e também na patologia. Uma vez que a migração de células para determinados sítios ou

órgãos é grandemente influenciada por quimiocinas e receptores de quimiocinas as moléculas

CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CCL1, CCL2 e CCL11 foram incluídas neste trabalho;

- ativação, diferenciação e morte celular: como esses eventos são cruciais tanto para o

desenvolvimento de uma resposta protetora quanto para imunopatologia (Carvalho et al.,

2007) as moléculas-chave CD40, STAT4, AID, CD95-Fas e BAX foram selecionadas com

base nesse racional e;

- hematopoiese: selecionamos para esse estudo a eritropoietina (EPO), porque a inibição da

hematopoiese está ligada a manifestações importantes da infecção malárica, como a anemia

grave - complicação para qual o A. infulatus é o modelo mais adequado de estudo (Carvalho

et al., 2000; 2003).

12

Papel das citocinas e dos receptores alvos de nosso estudo

IFNγ ou interferon do tipo II é uma citocina crítica para as imunidades inata e

adaptativa, contra infecções virais e bacterianas intracelulares, e no controle tumoral. A

expressão exacerbada de IFNγ está associada com um número de doenças inflamatórias e

autoimunes. A importância de IFNγ na estrutura do sistema imune está relacionada em parte

por sua capacidade de inibir diretamente a replicação viral e, principalmente, deriva de seus

efeitos imunoestimulatório e imunomodulatório. IFNγ é sintetizado principalmente por

células NK como parte da resposta imune inata, e por linfócitos T CD4+, e citotóxicos CD8+

efetores (Schoenborn & Wilson, 2007; D’Ombrain et al., 2008).

TNF codifica uma citocina pró-inflamatória multifuncional que pertence à

superfamília dos fatores de necrose celular. Ela liga através de seus receptores

TNFRSF1A/TNFR1 e TNFRSF1B/TNFBR. Esta citocina está envolvida na regulação de um

amplo espectro de processos biológicos, incluindo: proliferação celular, diferenciação,

apoptose, metabolismo de lipídios e coagulação. Esta citocina está implicada em uma

variedade de doenças, tais como, doenças autoimunes, resistência à insulina e câncer

(Carswell, 1975; Pober, 1988; McGuire et al., 1994).

IL2 é uma citocina secretada muito importante para a proliferação de linfócitos T e B.

O receptor desta citocina é um complexo protéico heterodimérico que compartilha sua cadeia

gama com IL4 e IL7. A expressão deste gene em timócitos maduros é monoalélica, o que

representa uma forma de regulação não muito comum para o controle preciso de expressão de

um único gene. A ativação de um gene similar em camundongos desencadeia uma doença

semelhante à colite ulcerativa, que sugere um papel essencial deste gene na resposta imune a

estímulos antigênicos (Miyazaki et al., 1985; Hatakeyama et al., 1989).

Interleucina 6 (IL6) é uma citocina imunorregulatória que ativa uma cadeia de

sinalização na superfície celular que é compartilhada pelo receptor gp130 (Kishimoto et al.,

1995).

IL10 é uma citocina produzida primariamente por monócitos e, posteriormente, por

linfócitos. Esta citocina tem efeito pleiotrópico na imunorregulação e inflamação. Ela inibe a

regulação da expressão de citocinas do tipo Th1, antígenos do MHC classe II, e moléculas co-

estimulatórias em macrófagos. Ela também eleva a sobrevida de células B, proliferação e

produção de anticorpos. Esta citocina pode bloquear a atividade de NF-kappa B e está

envolvida na regulação da via de sinalização JAK-STAT. Estudos com camundongos

13

“knockout” sugerem uma função imunorregulatória essencial no trato intestinal (Moore et al.,

2001; Mocellin et al., 2003; R&D Systems, 2003; Grimbaldeston et al., 2007).

IL12, citocina que atua em células T e NK, é um heterodímero composto por um

receptor de 40 kDa codificada por IL12B e uma subunidade de 35 kDa codificada por IL12A.

Esta citocina é expressa por macrófagos ativados que servem como indutores essenciais do

desenvolvimento e sustentação de células efetoras e de memória do tipo Th1. Super-expressão

deste gene foi observada no sistema nervoso central de pacientes com esclerose múltipla,

sugerindo ação dessa citocina na patogênese da doença. O polimorfismo do promotor deste

gene tem sido implicado com a gravidade das asmas atópicas e não-atópicas em crianças

(Watford et al., 2003).

LTA, TNFβ ou TNFSF1 um membro da família de fatores de necrose celulares, é uma

citocina produzida por linfócitos. LTA é uma molécula homotrimétrica altamente induzível e

secretada. LTA forma heterotrímeros com linfotoxina beta que serve para ancorar a LTA na

superfície celular, e medeia uma ampla variedade de respostas inflamatórias,

imunoestimulatórias e de resposta antiviral. LTA também está envolvida na formação de

órgãos linfóides secundários durante o desenvolvimento e tem influência nos processos

apoptóticos (Körner & Sedgwick, 1997).

CSF2 ou GM-CSF é uma citocina que controla a produção, diferenciação e função de

granulócitos e macrófagos. A forma ativa dessa proteína é achada como um homodímero

extracelular. Esse gene está localizado na região do cromossomo 5q31, juntamente com os

genes das interleucinas 4, 5 e 13 (Hamilton & Anderson, 2005).

IL3 é uma potente citocina que promove crescimento celular. Esta citocina é capaz de

apoiar a proliferação de uma grande variedade de células hematopoiéticas. Ela está envolvida

em variadas atividades celulares, tais como: crescimento, diferenciação e apoptose, atividade

neurotrófica, e pode estar associada com algumas patologias neurológicas (Martinez-

Moczygemba & Huston, 2003).

IL4 é uma citocina pleiotrófica sintetizada por linfócitos T ativados. Esta citocina é

um ligante para o receptor de IL4. O receptor de IL4 também liga a IL13, o que pode

contribuir para certa sobreposição de funções entre essas duas citocinas. STAT6, um

transdutor de sinal e ativador de transcrição, mostrou ter um papel relevante na mediação de

sinal regulatório de IL4. IL4, IL3, IL5, IL13 e CSF2, que formam um grupo de genes de

citocinas no cromossomo 5q, com estreita relação entre IL4 e IL13. Interleucina 4, IL13 e IL5

são coordenadamente regulados por vários elementos regulatórios com mais de 120 kilobases

no cromossomo (Lorentz & Bischoff, 2002).

14

IL5 é uma citocina que atua como um fator de crescimento e diferenciação para

células B e eosinófilos. Esta citocina é o principal regulador da eosinopoiese e da ativação e

maturação de eosinófilos. A elevada produção desta citocina parece estar relacionada a relatos

de asma ou síndromes hipereosinofílicas. O receptor desta citocina é um heterodímero, que

tem sua subunidade beta compartilhada com os receptores de IL3 e CSF2. Este gene,

juntamente com IL4, IL13 e CSF2, forma um grupo de genes de citocinas no cromossomo 5

(Hamelmann & Gelfand, 2001).

IL13 é uma citocina imunorregulatória produzida primariamente por células Th2

ativadas. Esta citocina está envolvida em vários estágios da maturação e diferenciação de

células B. Ela eleva a expressão de moléculas do MHC classe II e de CD23, promove

mudança do isotipo de imunoglobulinas para IgE em células B. Esta citocina inibe a atividade

de macrófagos, reduzindo a produção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias. IL13 é

crítica para a patogênese de asma alérgica, mas atua por mecanismos que independem de IgE

e eosinófilos (Wynn, 2003).

TGFβ é um peptídeo multifuncional que controla, principalmente, a proliferação e a

diferenciação de muitos tipos celulares. TGFβ atua sinergicamente com TGFα induzindo

transformação celular. Ele atua também negativamente como um fator de crescimento

autócrino. A desregulação da ativação e da sinalização de TGFβ pode resultar em apoptose

(Berse et al., 1999; Becker, Fantini & Neurath, 2006).

CCR5 é um membro da família de receptores de quimiocinas; quimiocinas e seus

receptores são importantes para a migração de vários tipos celulares para os sítios de

inflamação. Essa proteína é expressa por células T e macrófagos, e é sabido ser um

importante co-receptor para vírus que possuem tropismo por macrófagos. Alelos alterados

têm sido associados com resistência viral. A expressão desse gene também foi detectada em

células de linhagem pró-mieloblástica, sugerindo um papel central desta proteína na

proliferação e diferenciação da linhagem granulocítica (Fernandez & Lolis, 2002).

CCR8 é um membro da família de receptores para quimiocinas. Esse receptor é

preferencialmente expresso no timo. Estudos sobre esse receptor e seus ligantes sugerem seu

papel na regulação de quimiotaxia de monócitos e apoptose em timócitos. Mais

especificamente, esse receptor pode contribuir para o posicionamento de células T ativadas

dentro dos sítios de infecção e em áreas especializadas dos tecidos linfóides (Fernandez &

Lolis, 2002).

CD40 ou TNFR é o membro 5 da superfamília de receptores de TNF. Esse receptor é

essencial na mediação de uma variedade de respostas imunes e inflamatórias, incluindo troca

15

de classes de imunoglobulinas dependente de células T, desenvolvimento de células B de

memória e formação de centro germinativo (Park et al., 2007).

BAX forma um heterodímero com BCL2, funcionando como um ativador pró-

apoptótico. Essa proteína está incriminada na abertura dos canais de ânions, o que leva a

perda do potencial de membrana com consequente liberação de citocromo C (Lalier et al.,

2007).

IL8 é uma proteína codificada por um gene que pertence à família de quimiocinas

CXC. Essa quimiocina é importante mediador da resposta inflamatória. IL8 é secretada por

vários tipos celulares e tem por funções ser um potente quimioatraente e também um forte

fator angiogênico (Fernandez & Lolis, 2002).

IL17 é citocina pró-inflamatória produzida por células T ativadas. Essa citocina pode

estimular a expressão de IL6 e elevar a produção de óxido nítrico (NO). Níveis elevados

dessa citocina estão associados com várias doenças inflamatórias como artrite reumatóide e

esclerose múltipla (Moseley, 2003).

IL18 é uma citocina pró-inflamatória que induz a produção de IFNγ por células T. A

combinação de IL18 com IL12 inibe a produção IL4 dependente de IgE e IgG1, e eleva a

produção de IgG2a por plasmócitos (R&D Systems, 2003).

IL27 está relacionada com a IL12A. Ela interage com um gene do vírus Epstein-Barr,

que é similar a IL12B, e forma um complexo que direciona a expansão de células imaturas,

mas sem formação de células CD4+ de memória. O complexo de IL27 também sinergiza

fortemente com IL12 para ativar a produção de IFNγ por células CD4+ imaturas (Carl, Jr &

Bai, 2008).

CCL1 é uma citocina secretada por células T ativadas e mostra uma atividade

quimiotática para monócitos, mas não para neutrófilos. Ela liga ao receptor da quimiocina

CCR8 (Fernandez & Lolis, 2002).

CCL2 é uma citocina que possui atividade quimiotática para monócitos e basófilos,

mas não para neutrófilos e eosinófilos. Ela tem sido implicada na patogênese de doenças

caracterizadas por infiltrados de monócitos como a psoríase, artrite reumatóide e

aterosclerose. Ela liga aos receptores de CCR2 e CCR4. Esses receptores são altamente

expressos em eosinófilos, basófilos, células Th1 e Th2, e também em pneumócitos. Esses

receptores podem contribuir para a acumulação e ativação de eosinófilos e outras células

inflamatórias no trato respiratório (Fernandez & Lolis, 2002).

16

FAS (TNFRSF6) é uma proteína transmembrana crítica para a ativação de apoptose

em alguns tipos celulares como os linfócitos. Defeitos no gene de FAS podem estar

relacionados a casos de lupus eritematoso sistêmico (Anderson et al., 1997).

STAT4 é um fator de transcrição que responde a citocinas e fatores de crescimento.

Essa proteína é essencial na mediação de resposta inflamatória ativada por IL12 em linfócitos,

e regulam a diferenciação de células T auxiliadoras (Di Stefano et al., 2004).

MIF é uma citocina envolvida na imunidade mediada por células e na resposta

inflamatória. Ela regula a função de macrófagos na resposta do hospedeiro através da

supressão dos efeitos antiinflamatórios dos glicocorticóides (Calandra & Roger, 2003).

EPO é uma citocina encontrada no plasma e regula a produção de eritrócitos por

promover a diferenciação da linhagem eritróide e iniciação da síntese de hemoglobina. Essa

proteína também tem uma atividade neuroprotetora e função anti-apoptótica em vários tipos

de tecidos (Marti, 2004).

TNFRSF1A é o principal receptor para TNF. Esse receptor pode mediar apoptose e

funciona como regulador da inflamação (Siebert et al., 2005).

AID é uma proteína secretada por linfócitos B necessária na hipermutação somática

(Martin et al., 2002).

Entre as moléculas selecionadas, em alguns casos um número extenso de relatos está

disponível, como é o caso de TNF, IFNγ, IL10 e IL12, por exemplo. Em outros casos, existem

informações mais restritas, como é o caso de IL18, citocina pró-inflamatória importante tanto

na resposta protetora quanto na imunopatologia, especialmente nos danos hepáticos, ou

mesmo, como é o caso de IL17 e IL27, nenhum artigo disponível pelo Medline foi

encontrado.

Como o demonstrado, um painel de citocinas é muito importante para uma

caracterização adequada de respostas imunes em ensaios pré-clínicos de vacinas antimaláricas

a serem conduzidos por nosso grupo utilizando Saimiri e Aotus. Dessa maneira, genes

codificantes de moléculas relacionadas com eventos primordias como ativação, morte e

migração celular, com papel já conhecido ou não na malária, foram selecionados.

17

Justificativa

O Laboratório de Pesquisas em Malária vem realizando ensaios pré-clínicos vacinais

utilizando S. sciureus há alguns anos e realizou trabalhos que demostraram que o A. infulatus

é suscetível a infecção sanguínea por P. falciparum e vulnerável a uma das principais

complicações da malária, a anemia grave. Porém, a análise de resposta imune em ensaios pré-

clínicos vacinais e em estudos de aquisição de imunidade utilizando esses dois modelos fica

restrita a análise de resposta humoral, pois existe uma carência de ferramentas específicas

para estudos de resposta celular quando se utiliza Saimiri/Aotus em estudos em malária.

Apesar dos esforços empreendidos por alguns grupos no sentido de ofertar tais ferramentas,

ainda existe lacuna significativa no que se refere à existência de ferramentas específicas e

multifuncionais para Saimiri/Aotus que permitam uma análise multifatorial e quantitativa do

desenvolvimento de resposta imune durante infecções experimentais e em estudos vacinais. A

possibilidade de se estudar a expressão diferencial desses marcadores também será muito útil

em experimentos futuros nos quais o baço possa ser analisado, uma vez que a infecção

malárica provoca distúrbios de ativação, diferenciação, morte e migração celular, como

demonstrado em trabalhos de nosso próprio grupo, e cujos mecanismos são obscuros.

Por isso, nos propomos a desenvolver iniciadores baseados nas sequências de ambas

as espécies para analisar a expressão gênica de células sanguíneas e tissulares de

Saimiri/Aotus sadios ou infectados por P. falciparum, de maneira a determinar o perfil de

resposta imune celular utilizando como ferramenta a PCR-TRq.

18

Objetivos

Selecionar, sequenciar e analisar fragmentos de genes que codificam moléculas da

resposta imune em A. infulatus e S. sciureus, para desenhar iniciadores moleculares a

serem utlizados na PCR-TRq, visando avaliar a expressão desses genes durante a

infecção por P. falciparum ou em ensaios pré-clínicos vacinais.

Estratégias

Identificar e sequenciar fragmentos de genes relacionados à resposta imune de A.

infulatus e S. sciureus;

Desenhar iniciadores de amplificação de DNA de Aotus e Saimiri de genes que

codificam moléculas chave da resposta imune e (ou) envolvidos na imunopatologia e

validá-los em ensaios de PCR-TRq e;

Utilizar essas ferramentas moleculares para avaliar a expressão de genes codificantes

de moléculas da resposta imune em células de macacos Aotus e Saimiri em

experimentos de imunização com antígenos plasmodiais e desafio através de infecção

por P. falciparum.

19

Material e Métodos

Desenho Experimental

Inicialmente, foi feito um levantamento da literatura pertinente para se identificar

moléculas do sistema imune potencialmente envolvidas nas respostas inata e adquirida contra

a malária. Depois, utilizando ferramentas de bioinformática, foram identificadas as sequências

alvo nucleotídicas humanas e de espécies de macacos sulamericanos entre as moléculas que

estavam depositadas no banco de dados do National Center for Biotechnology Information

(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Para cada molécula selecionada, fez-se um alinhamento de

sequências humanas com as não humanas empregando-se o aplicativo BioEdit®

(www.mbio.ncsu.edu/BioEdit). Através desse alinhamento inicial foram selecionadas as

regiões amplificáveis de cada gene, que foram usadas como molde para o desenho dos

iniciadores diretos e reversos usados na amplificação e sequenciamento dos fragmentos

nucleotídicos. Após a escolha dessa região, usou-se o aplicativo PerlPrimer®

(http://PerlPrimer.sourceforge.net/) para desenhar os iniciadores diretos e reversos

empregados nas reações de amplificação e no sequenciamento dos fragmentos nucleotídicos.

Paralelamente, foram extraídas amostras de DNA genômico humano e de A. infulatus e S.

sciureus. Em posse dessas amostras de DNA genômico e dos iniciadores, foram feitos ensaios

de PCR convenional, purificação dos produtos amplificados e reações de sequenciamento. As

sequências obtidas de macacos Saimiri e Aotus foram analisadas no BioEdit® e usadas como

molde para o desenho de iniciadores baseados nas sequências desses modelos para estudos de

expressão gênica através de PCR-TRq.

Em um segundo momento foram purificadas e cultivadas PBMC de Aotus e Saimiri,

para avaliação de cinética de expressão gênica sob estimulação mitogênica (entre duas e 18

horas), fez-se extração de RNA e síntese de cDNA. Com a obtenção de cDNA de Aotus e

Saimiri, foram feitas reações de PCR-TRq no equipamento SDS7500 (Applied Biosystems)

utilizando-se os iniciadores baseados nas sequências dessas espécies de macacos. Após a

escolha do melhor tempo de expressão (seis horas), partiu-se para o experimento de infecção

de macacos Saimiri, no qual se analisou a expressão de citocinas em esplenócitos de macacos

primo-infectados sob diferentes estímulos antigênicos (Figura 1).

20

Figura 1. Desenho experimental do estudo.

21

Animais

Os primatas neotropicais A. infulatus e S. sciureus pertencem às colônias do Centro

Nacional de Primatas/SVS/MS (Ananindeua, Pará) e ao Departamento de Primatologia da

Fiocruz do Rio de Janeiro. Os animais são mantidos de acordo com as recomendações do

“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (Institute of Laboratory Animal

Resources, National Research Council, National Academy of Science Press, Washington

D.C., 1996).

Extração de DNA por Fenol-Clorofórmio (Sambrook et al., 1989)

Brevemente, 2 mL de sangue de doze indivíduos (seis Saimiri e seis Aotus) foram

coletados por punção da veia femoral em anticoagulante (EDTA). Com auxílio de pipetas

Pasteur descartáveis e estéreis, as amostras foram transferidas para tubos Falcon de 15 mL.

Adicionou-se 250 µL de SDS a 10% (pH 7,2), 50µl de ribonuclease (10 mg/mL) e completou-

se até 5 mL com solução tampão de lise. Incubaram-se as amostras a uma temperatura de

37°C em contínua agitação por uma hora. Adicionaram-se 50µl de Proteinase K (10 mg/mL) e

deixou-se incubando overnight a 56°C em contínua agitação. Levaram-se os tubos a

temperatura ambiente e adicionou-se 5 mL de fenol-clorofórmio-álcool isoamil (25:24:1).

Homogeneizou-se gentilmente com pipetas Pasteur descartáveis por 10 minutos. Centrifugou-

se a 5000 xg por 30 minutos. Transferiu-se o sobrenadante, cuidadosamente com auxílio de

pipetas Pasteur descartáveis, para tubos Falcon de 15 mL, sem mover a camada de proteínas.

Adicionaram-se cinco ml de clorofórmio-álcool isoamil (24:1) e mantiveram-se os tubos sob

agitação constante por 10 minutos. Centrifugaram-se os tubos a 5000 xg por 30 minutos. Com

auxílio de pipetas Pasteur descartáveis, transferiu-se cuidadosamente o sobrenadante para um

tubo limpo. Precipitou-se o DNA adicionando-se 500 µL de acetato de sódio 3M pH 4,8 e 5

mL de álcool isopropílico. Agitaram-se manualmente os tubos até a formação da “nuvem” de

DNA. Com auxílio de pipetas Pasteur descartáveis, aspirou-se a nuvem de DNA que foi

transferida para tubos Eppendorf de 1,5 mL. Centrifugou-se a 28.000 xg por dois minutos

para formação de pellet. Desprezou-se o sobrenadante por inversão dos tubos e adicionou-se

500 µL de etanol a 70%. Centrifugou-se a 28.000 xg por dois minutos. Desprezou-se o álcool

por inversão dos tubos e secou-se o precipitado de DNA em estufa a 37°C por sete minutos.

Adicionou-se de 200µL de tampão TE. Deixaram-se as amostras a 37°C para total diluição do

DNA na solução de TE. Foram feitas alíquotas que permaneceram congeladas a -20°C até o

momento do uso.

22

Escolha dos genes e desenho dos iniciadores

Um painel de 31 moléculas humanas (citocinas, quimiocinas, marcadores de ativação

celular e de apoptose) foi inicialmente selecionado: IFNγ, TNF, LTA, IL2, IL6, IL10, IL12,

IL3, IL4, IL5, IL8, IL13, IL17, IL18, IL27, CCL1, CCL2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR8,

CSF2, CD40, FAS, STAT4, MIF, EPO, TGFβ, TNFRSF1A, BCL2 BAX e AID.

Uma vez feita a seleção inicial de moléculas, as sequências humanas e de alguns

macacos dos respectivos genes, obtidas através do banco de dados do GenBank®

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez), foram usadas como molde para o desenho dos

iniciadores para PCR (Figura 2) usando-se o aplicativo PerlPrimer®

(http://PerlPrimer.sourceforge.net/). Os critérios usados para desenhar os iniciadores para

amplificação e sequenciamento foram os seguintes: i) iniciadores entre 18 e 25 bases (b) de

tamanho; ii) temperatura de anelamento dos iniciadores variando entre 50ºC a 70ºC; iii)

variação entre as temperaturas de anelamento dos iniciadores direto e reverso não excedendo

2ºC, iv) tamanho do amplificado não excedendo 1000 pares de bases (pb) e, v) de preferência,

iniciadores com regiões de amplificação compreendendo duas porções codificantes (éxons)

intercaladas por uma pequena área não-codificante (íntron).

23

Figura 2. Layout da ferramenta PerlPrimer® utilizada para desenhar os iniciadores diretos e reversos usados na amplificação e sequenciamento do painel de 31 genes inicialmente selecionados nesse estudo. Os principais critérios usados para o desenho dos iniciadores foram: i) temperatura de anelamento entre 50º e 70ºC com diferença de temperatura entre a temperatura dos iniciadores diretos e reversos não ultrapassando 2ºC (Primer Tm); ii) tamanho dos iniciadores entre 18 e 25 bases (Primer Length) e; iii) produto amplificado de no máximo 1000pb (Amplified range). A parte escrita “Sequence” é o local onde se insere a sequência alvo. Em “Results” aparecem lado-a-lado as sequências dos iniciadores diretos (forward primer) e reversos (reverse primer) com posição do iniciador, tamanho e temperatura de anelamento (Tm).

24

PCR, sequenciamento, alinhamento, edição de sequências e desenho dos iniciadores

baseados nas sequências de Saimiri e Aotus para estudo de expressão gênica

Os fragmentos dos genes selecionados foram amplificados através dos pares de

iniciadores observados na tabela abaixo.

Tabela 1. Iniciadores desenhados a partir de sequências humanas utilizados para amplificar e sequenciar fragmentos nucleotídicos de Aotus e Saimiri. Gene Iniciadores IFNγ Direto 5’-CAGGTCATTCAGATGTAGC-3’

Reverso 5’-CACCGAATAATTAGTCAGC-3’ TNF Direto 5’-GACAGCAGAGGACCAGCTAAGAG-3’

Reverso 5’-GGCCGATCACTCCAAAGTGCAG-3’ LTA Direto 5’-ATGACACCACCTGAACGTCT-3’

Reverso 5’-CGAAGGCTCCAAAGAAGACA-3’ IL2 Direto 5’-TGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3’

Reverso 5’-CTTAAATGTGAGCATCCTGGTGAG-3’ IL6 Direto 5’-GAACCTTCCAAAGATGGC-3’

Reverso 5’-CAAATCTGTTCTGGAGGT-3’ IL10 Direto 5’-CAGCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACT-3’

Reverso 5’-ACAGCGCCGTAGCCTCAGCCTGAGGGTCTTC-3’ IL12 Direto 5’-CCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTT-3’

Reverso 5’-CCTGCATCAGCTCATCAATAACTGCC-3’ IL3 Direto 5’-CTTCGAAGGCCAACCCTG-3’

Reverso 5’-AAGGTGAAATGCTTCTGGTC-3’ IL4 Direto 5’-AGCTTCTCCTGATAAACTAATTGCC-3’

Reverso 5’-CAGCAAAGATGTCTGTTACGG-3’ IL5 Direto 5’-ACTGAAGAAATCTTTCAGGG-3’

Reverso 5’-TCGGTGTTCATTACACCA-3’ IL13 Direto 5’-TGCAATGGCAGCATGGTATGG-3’

Reverso 5’-ACCTTGTGCGGGCAGAATCC-3’ CFS2 Direto 5’-AGAGAAAGGCTAAAGTTCTCTG-3’

Reverso 5’-CCTGGAGGTCAAACATTTCTG-3’ TGFβ Direto 5’-CCAAAGATTTAACATCTCCAACCCA-3’

Reverso 5’-GCAAATCTTGCTTCTAGTTCTTCAC-3’ CD40 Direto 5’-GTTCACTGAAACGGAATGCCT-3’

Reverso 5’-TGCAGGACACAGCTCTCAC-3’ CCR5 Direto 5’-ACTCACTGGTGTTCATCTTTGG-3’

Reverso 5’-ACAGCATTTGCAGAAGCGT-3’ CCR8 Direto 5’-TACCCTGATATCTTCTCAAGCC-3’

Reverso 5’-CAATGACCACAATGAGCAC-3’ BAX Direto 5’-CCAGCTCTGAGCAGATCATGAAGAC-3’

Reverso 5’-CCTCTGCAGCTCCATGTTACTGTCC-3’ IL8 Direto 5’-GAGTGCTAAAGAACTTAGATGTCAG-3’

Reverso 5’-AAACTTCTCCACAACCCTC-3’ IL17 Direto 5’-CCGCAATGAGGACCCTGAGAG-3’

Reverso 5’-GAAAATGGTTACGATGTGAAA-3’ IL18 Direto 5’-AAAACCTGGAATCAGATTACT-3’

Reverso 5’-CTCTACAGTCAGAATCAGTCA-3’ IL27 Direto 5’-TTGGAGCTCGTCTTATCT-3’

25

Reverso 5’-TAGCTGGCGAGGACCAGA-3’ CCL1 Direto 5’-GATGTTGCTTCTCATTTGCGG-3’

Reverso 5’-GTGCAACAACATAGCTTATCAAGAC-3’ CCL2 Direto 5’-ACCTGCTGTTATAACTTCACCA-3’

Reverso 5’-GGGTTTGCTTGTCCAGGT-3’ CCR3 Direto 5’-TGATGGCCCAGTTTGTGC-3’

Reverso 5’-GGGATGTATCTGCCCAGGT-3’ CCR4 Direto 5’-CCCACTGTATTCCTTGGT-3’

Reverso 5’-CCCACAGTATTGGCAGAG-3’ FAZ Direto 5’-GTGAACATGGAATCATCAAGG-3’

Reverso 5’-CCAAACAATTAGTGGAATTGGC-3’ STAT4 Direto 5’-GCCAGAACTAAACTATCAGG-3’

Reverso 5’-TGTCGAAATTCTACTGAGAG-3’ MIF Direto 5’-TTCCTCGCAGTACATCGC-3’

Reverso 5’-GTCTCTAAACCGTTTATTTCTCCC-3’ EPO Direto 5’-CTTCTCCTGTCCCTGCTGTC -3’

Reverso 5’-CTCCATCCTCTTCCAGGCA-3’ TNFRSF1A Direto 5’-TGTACAATGACTGTCCAGGCCC-3’

Reverso 5’-AGGTGCACGGTCCCATTGAG-3’ AID Direto 5’-AAGAACTTTCAAAGCCTGGGA-3’

Reverso 5’-GCGTCTCGTAAGTCATCAACC-3’

As reações de PCR foram feitas na seguinte ordem: primeiramente PCR (enzima Taq

da Invitrogen) com gradiente para determinação da melhor temperatura de anelamento dos

iniciadores e, após a escolha da melhor temperatura de anelamento, reações de PCR

convencional com amostras de DNA de A. infulatus, S. sciureus e humano. Para os ensaios de

PCR com gradiente, foram utilizados os seguintes ciclos: desnaturação do DNA genômico a

94ºC por 5 min seguido por 30 ciclos de 50º a 60ºC por 1 min (temperatura de anelamento,

Tm), 72ºC por 5 min (extensão do amplificado), e um ciclo adicional final de 72ºC por 1 min.

Os produtos amplificados foram então submetidos a uma corrida eletroforética em gel de

agarose a 1%, corados com brometo de etídio e visualizados através de um transluminador.

Com a escolha das melhores temperaturas de anelamento foram feitas PCRs para os genes de

cada molécula alvo deste estudo, com os iniciadores (Tm ideal), amostras de DNA de

macacos Aotus e Saimiri e amostra de DNA humano. Os produtos de PCR foram purificados

usando-se o kit GFX® (Amersham) seguindo-se as recomendações do fabricante e enviados

para a plataforma de sequenciamento da Fiocruz. Os iniciadores usados no sequenciamento

foram os mesmos iniciadores usados na amplificação de fragmentos genômicos (Tabela 1). O

alinhamento e a edição das sequências foram feitos usando-se o aplicativo BioEdit®

(www.mbio.ncsu.edu/BioEdit). Em posse das sequências dos macacos Aotus e Saimiri

26

utilizou-se o aplicativo Primer Express® (Applied Biosystems) para desenhar os iniciadores

diretos e reversos para estudos de expressão gênica usando a PCR-TRq como ferramenta.

Estudo de Expressão Gênica

Obtenção de células mononucleadas do sangue periférico

Com o animal contido fisicamente, e após assepsia com etanol 70%, coletou-se sangue

pela veia femoral com heparina. Após a colheita de sangue, pressionou-se o local da punção

por aproximadamente cinco minutos com algodão seco para proceder à completa hemostasia.

O sangue foi acondicionado a 4ºC até começar a etapa seguinte.

Em capela de fluxo laminar, transferiu-se o sangue para tubos tipo falcon estéreis de

15 mL, procedeu-se com a centrifugação das amostras a 2000 rpm por 15 minutos com

temperatura de 25ºC para separação do plasma. O volume inicial do sangue total foi restituído

à papa de hemácias com RPMI incompleto (sem soro bovino fetal), e homogeneizou-se

cuidadosamente com auxílio de pipeta Pasteur descartável estéril. Colocou-se o sangue

diluído em RPMI sobre o Ficoll, centrifugou-se a 1500 rpm por 30 minutos, a temperatura de

25ºC, sem usar o freio da centrífuga.

Ao final dos 30 minutos de centrifugação, aspirou-se com cuidado o anel de células

mononucleadas com auxílio de uma pipeta Pasteur descartável, e transferiu-se para os tubos

de 15 mL contendo 2 mL de RPMI incompleto (meio de lavar). Centrifugou-se a 1500 rpm

por 10 minutos a 25ºC, sem usar o freio da centrífuga. Repetiu-se o procedimento de lavagem

das células mais duas vezes e ressuspendeu-se o “pellet” para um volume final de 1mL em

meio RPMI contendo 20% de SBF.

Contagem de células (PBMCs)

Para contagem das células, retirou-se 10 µL da suspensão de células (PBMCs)

homogeneizada e diluiu-se essa suspensão a 1:10 em meio RPMI puro (ou PBS) contendo

azul de tripano a 0,2%. Aguardou-se, novamente, 1 minuto e, então, a suspensão de células

diluídas foi colocada em câmara de Neubauer. Após a sedimentação das células no

hemocitômetro procedeu-se, imediatamente, a contagem das mesmas em microscópio óptico

(objetiva 40X). A contagem foi feita em quadrantes opostos externos do hemocitômetro

(4x4). Contou-se o número de leucócitos em cada quadrante, anotando o número de células

totais e contabilizando o número de células coradas e não coradas pelo azul de tripano.

27

Ao final da contagem, fez-se a média do número de células (PBMCs) obtidas nos

quadrantes. Para a contagem ser considerada como válida, a diferença entre os dois

quadrantes não poderia ser superior a 20%. Definiu-se o número total de células (PBMCs) e o

número de células viáveis (não coradas pelo azul de tripano). Para a definição da

concentração de células, consideraram-se somente as células viáveis.

O valor obtido (número de células viáveis) foi então multiplicado por 10.000 (fator da

câmara) e pela diluição utilizada (1:10). Obteve-se assim a concentração celular (número de

células por mL). Como a suspensão original teve 1 mL, esse valor correspondeu também ao

número total de células.

Cultivo celular

O cultivo in vitro de células foi feito em placas de 24 poços, nas quais cada poço

recebeu 2x106 células/mL, soro bovino fetal a 10% (Sigma), ionomicina a 500 ng/mL

(Sigma), forbol- miristato-acetato a 50 ng/mL (Sigma). Para cada animal fez-se um poço

contendo somente RPMI mais SBF a 10% (controle negativo). As placas foram então

colocadas para incubar a 37ºC e 5% CO2, em câmara úmida, por 2, 4, 6, 8, 12 e 18 horas.

Extração de RNA (kit RNeasy®, Qiagen)

Antes de iniciar a extração propriamente dita foi necessária a preparação de alguns

reagentes imprescindíveis ao protocolo, que são: i) solução de lise celular – 10 µL β-

mercaptoetanol (Sigma) por 1 mL buffer RLT do kit (em capela química); ii) solução de

DNase – 10 µL de DNase em 70 µL de tampão RDD (Qiagen); e iii) álcool a 70% com água

livre de nucleases (água tratada com DEPC, Serva). Para retirada do meio de cultura dos

poços, inclinou-se a placa e colocou-se a micropipeta P1000 na borda do poço. Procurou-se

aspirar o sobrenadante sem causar turbilhão ao cultivo. Acondicionou-se o sobrenadante em

microtubos de 2 mL a -20ºC. Adicionou-se 600 µL de tampão RLT/β-ME, e homogeneizou-

se com o auxílio de micropipeta P1000. Essa etapa teve a finalidade de lisar e homogeneizar

as amostras, e inativar RNases para assegurar a purificação de RNA intacto. Transferiu-se a

solução para microtubos devidamente identificados. Vedaram-se os tubos e homogeneizou-se

em vórtex por 1 minuto. Com auxílio de micropipeta P1000, adicionou-se 600 µL de etanol a

70%. A adição de etanol teve a finalidade de fornecer apropriada condição de ligação do

RNA à coluna de purificação. Homogeneizou-se com micropipeta P1000. Com auxílio de

micropipeta P1000, transferiu-se 700 µL para a coluna devidamente identificada (volume

máximo suportado pela coluna do RNeasy®) e os tubos foram vedados e centrifugados a

28

8000 xg por 15 segundos. Descartou-se o filtrado por inversão do tubo de coleta e transferiu-

se, com auxílio de micropipeta P1000, o restante da solução (lisado mais etanol a 70%) para a

coluna. Fechou-se a coluna e centrifugou-se a 8000 xg por 15 segundos e o filtrado foi

descartado por inversão do tubo de coleta. Aplicou-se sobre a coluna, com auxílio de

micropipeta P1000, 350 µL de tampão RW1 se evitando tocar a ponteira nas paredes dos

tubos e coluna e centrifugou-se a 8000 xg por 15 segundos. Descartou-se o filtrado por

inversão do tubo de coleta e aplicou-se, com auxílio de micropipeta P200, 80µl de DNase

sobre a coluna e incubou-se por 15 minutos a temperatura ambiente. Com auxílio de

micropipeta P1000, aplicou-se 350 µL de tampão RW1 sobre a coluna e fechou-se a tampa da

coluna, centrifugou-se a 10.000 x g por 15 segundos e o filtrado foi descartado por inversão

do tubo de coleta. Com auxílio de micropipeta P1000, aplicou-se 500 µL de RPE sobre a

coluna, fechou-se a tampa da coluna e centrifugou-se a 10.000 xg por 15 segundos. Com

auxílio de micropipeta P1000, aplicou-se 500 µl de RPE sobre a coluna. A coluna foi fechada,

centrifugou-se a 10.000 xg por 2 minutos e o filtrado foi descartado por inversão do tubo de

coleta da coluna. Secou-se a saída da membrana com auxílio de lenço de papel e transferiu-se

a coluna para um microtubo de 2 mL livre de RNase. Deixou-se evaporar com a tampa aberta

à temperatura ambiente por dois minutos. Com auxílio de uma micropipeta P200, aplicou-se

50 µL de água livre de RNases do kit. Incubou-se por 10 minutos em banho de gelo. Cortou-

se, com auxílio de uma tesoura limpa com álcool 70%, a tampa da coluna e acondicionaram-

se os microtubos na centrífuga de forma que suas tampas abertas ficassem voltadas para a

esquerda do operador do equipamento. Centrifugou-se a 10.000 xg por 1 minuto e congelou-

se imediatamente a -70ºC.

Síntese de cDNA (kit High-Capacity® da Applied Biosystems)

Com auxílio de micropipeta P200, colocou-se todo o volume a amostra de RNA (50

µL) na coluna de microcon YM-30® (Millipore) já devidamente montada e identificada.

Centrifugou-se a 8000 xg por oito minutos (Eppendorf 5415C). Descartou-se o tubo com

filtrado. Colocou-se a coluna invertida em um novo tubo e centrifugou-se a 10.000 xg por um

minuto. Ressuspendeu-se a amostra com auxílio de micropipeta P10 para 10 µL com água

tratada com DEPC. Preparou-se o mix 2X do kit High-Capacity® de acordo com a tabela

abaixo:

29

Tabela 2. Preparo do mix para o kit High-Capacity® (Applied Biosystems). Componente do kit Volume em µL dos componentes do kit

10X RT buffer 2,0

25X dNTP mix (100mM) 0,8

10X RT random primers 2,0

MultiscribeTM reverso transcriptase 1,0

Inibidor de RNase 1,0

Água livre de nucleases 3,2

Total da reação 10

Para a síntese da primeira fita de cDNA, adicionou-se os 10 µL da amostra a

microtubos de 0,2 mL contendo 10 µL de mix do High-Capacity® kit e homogeneizou-se

lentamente com micropipeta P20. Fecharam-se os tubos e deu-se uma breve centrifugação

para eliminar prováveis bolhas. Os tubos foram mantidos em banho de gelo (4°C), e levou-se

ao termociclador mastercycler gradiente (Eppendorf), seguindo-se as condições de

termocíclicas mostradas na tabela 3.

Tabela 3. Condições de termociclos utilizadas para a síntese de cDNA. Passo 1 Passo 2 Passo 3 Passo 4

Temperatura 25°C 37°C 85°C 4°C

Tempo 10 minutos 120 minutos 5 segundos ∞

nota importante: Essas condições são ótimas para o uso do High-Capacity® cDNA reverso transcription kit.

Ao final do tempo das etapas de termociclagem montaram-se e identificaram-se

colunas de microcon YM30 (Millipore). Transferiu-se a amostra de cDNA para a coluna de

microcon e adicionou-se 400 µL de água livre de nucleases. Centrifugou-se a 8000 xg por

oito minutos. Descartou-se o tubo coletor e colocou-se a coluna invertida em novo tubo.

Centrifugou-se a 10000 xg por três minutos. Reconstituiu-se com água RNase-free o

precipitado para 500 µL e aliquotou-se 17 µL por tubo. Os tubos contendo cDNA foram

congelados a -20°C até o momento do uso.

30

PCR em tempo real quantitativo (PCR-TRq)

Os critérios para o desenho dos iniciadores de macacos Aotus e Saimiri usados para

estudos de expressão gênica por PCR-TRq foram os mesmos empregados para o desenho dos

iniciadores usados para a amplificação e o sequenciamento, exceto pelo tamanho do

amplificado, que não deve ser maior que 150pb na PCR-TRq.

A PCR em tempo real foi realizada com volume final de 20 µL contendo: i) 4 µL de

água livre de nucleases; ii) 1 µL de iniciadores diretos e reversos (4pmol/µl); iii) 5 µL de

cDNA e; iv) 10 µL de máster mix SYBR Green (Applied Biosystems). A reação foi feita em

três estágios: i) primeiro estágio com um ciclo a 50°C por 2 min para ativar a enzima UNG

(Uracil-DNA N-glycosylase); ii) segundo estágio com um ciclo a 95°C por 10 min para ativar

a enzima TaqGold e; iii) terceiro estágio com 45 repetições a 95°C por 15 segundos, 60°C por

20 segundos e 72°C por 1 min. Os iniciadores diretos e reversos usados nos estudos de

expressão gênica são mostrados na tabela 4.

Tabela 4. Iniciadores diretos e reversos, usados na detecção de transcritos e desenhados a partir de sequências de macacos Aotus e Saimiri. Transcrito Iniciadores

IFNγ Direto 5’-TTTCTTAAACATTTTGAGGACTTGGA-3’

Reverso 5’-AAGGAGATAATCTGGCTCTGCATT-3’

TNF Direto 5’CTCTTCTGCCTGCTGCACTTC3’

Reverso 5’-AAGTCCCTGGAGGACTGCTCTT-3’

LTA Direto 5’-CGCAGCACCCTCAAACCT-3’

Reverso 5’-CTCCAGCGCAGTGATTTCTG-3’

IL2 Direto 5’-GTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGA-3’

Reverso 5’-CATCTGTAAGTCCAGCAGTAAATGC-3’

IL6 Direto 5’-TGGCAGAAAAAGATGGATGCT-3’

Reverso 5’-CTCCAAAAGACCAGTGGTGATTT-3’

IL10 Direto 5’-GCAGTGGCGCAGGTGAA-3’

Reverso 5’-GGCTTTGTAGACGCCTTTCTCTT-3’

IL12 Direto 5’-AGGTCTTAGGCTCTGGCAAAAA-3’

Reverso 5’-TGGCCAGCATCTCCAACTCT-3’

Nos experimentos de quantificação de expressão gênica por PCR em tempo real fez-se

inicialmente uma avaliação da eficiência de amplificação dos iniciadores através de “curva-

padrão”. Para esse tipo de reação, diluiu-se seriadamente (5X, 25X e 125X) uma amostra de

31

cDNA de células não estimuladas e pipetou-se a amostra e suas diluições (5µl) em triplicata

em placa de 96 poços mais o mix para PCR em tempo real (q.s.p. 20 µL). Dessa forma, na

primeira triplicata encontra-se cDNA de amostra na mesma concentração obtida durante a

extração de RNA, na segunda triplicata encontra-se cDNA da mesma amostra mas agora

diluída 5X, e assim sucessivamente. Essas diluições seriadas permitem ao software

disponibilizar gráficos nos quais podemos observar a eficiência de amplificação dos

iniciadores (deve estar sempre entre 90 e 110%). Essas diluições foram feitas para os sete

alvos testados mais o controle endógeno. Na mesma reação, adiciona-se um estágio

denominado de “Curva de Dissociação”, que é um controle de qualidade da amplificação dos

iniciadores. O gráfico gerado pela curva de dissociação deve sempre ter somente um pico, que

significa que os iniciadores testados amplificam somente um fragmento. Os transcritos de β-

actina foram usados como controle interno da reação.

A primeira etapa dos experimentos de PCR-TRq consistiu na avaliação do valor de

eficiência dos iniciadores utilizados. Para isso, foram feitas diluições seriadas de 5X da

amostra para realização da curva-padrão de quantificação. O experimento de curva-padrão foi

feito para o endógeno (β-actina) e os alvos (IFNγ, IL2, IL6, IL10, IL12, LTA e TNF), e

também para os alvos LTA, IFNγ e IL10 fornecidos pelo grupo do Dr. Patarroyo (dados não

mostrados). Os valores aceitáveis de eficiência para que os iniciadores sejam utilizados em

experimentos de quantificação relativa sem curva-padrão variam de 90% a 110% ou R2

próximo de 1 (Livak & Schmittgen, 2001; User Bulletin 2#, 2001).

Estabelecido os valores de eficiência do endógeno e dos alvos seguiu-se para a

realização de experimentos de quantificação relativa sem curva-padrão. Nesse tipo de

experimento, indicado para estudos de expressão gênica, os valores resultantes representam o

número de vezes que o alvo em estudo está mais ou menos expresso em uma situação (por

exemplo, tempo de cultivo com estímulo mitogênico) em relação a um momento inicial (por

exemplo, células não cultivdas e, portanto, não submetidas a estímulos mitogênicos). Os

resultados foram analisados através do software 7500-SDS (Applied Biosystems) para

quantificação relativa, usando as fórmulas relacionadas na tabela 5. As amostras utilizadas

como calibradoras foram os transcritos de Aotus e/ou Saimiri extraídos logo após a separação

das células sanguíneas pelo método de Ficoll histopaque (momento zero).

32

Tabela 5. Fórmulas usadas na quantificação relativa sem feitura de curva-padrão. Normalização Variação dos valores

Normalizados Quantidade Relativa

de Alvo ∆Ct = Ct (alvo) – Ct

(endógeno)

∆∆Ct = ∆Ct (amostra infectada) –

∆Ct (calibrador, amostra não

infectada)

2-∆∆Ct

foram calculados os valores normalizados, a variação dos valores normalizados e a quantidade relativa dos genes estudados (alvos), respectivamente. Para finalizar, foi feito o Log10 das quantidades relativas (valores plotados nos gráficos). Ct (threshold cycle) que indica o número fracional de ciclos no qual a quantidade de transcritos amplificados é significantemente detectada.

Experimento de Infecção

Critérios para escolha dos animais

Nessa etapa do trabalho foram utilizados nove animais da espécie S. sciureus por ser

essa espécie numerosa nas colônias estabelecidas tanto no Cenp quanto no Cecal. Todos os

animais usados eram machos adultos nascidos em cativeiro. Os animais foram mantidos em

gaiolas individuais durante todo o período do experimento.

Desenho experimental

Após testar os iniciadores específicos para os macacos (Saimiri e Aotus) num estudo

de avaliação de expressão gênica usando PBMC de animais que não tiveram contato prévio

com qualquer Plasmodia, realizamos experimento de avaliação de expressão gênica com

células de baço de animais infectados por P. falciparum. Para isso, utilizaram-se seis animais

adultos que foram inoculados intravenosamente com 5x107 hemácias parasitadas pela cepa

FUP de P. falciparum obtidas de um Saimiri doador previamente esplenectomizado e

infectado (descongelamento de cepa). A parasitemia foi avaliada através de exame de gota

espessa e distendido sanguíneos corados pelo Giemsa. Os dias determinados para realização

das esplenectomias foram 7, 14 e 28 dias após a infecção. Em cada ponto pré-determinado,

três animais foram esplenectomizados (dois animais infectados e um animal-controle não-

infectado). Animais que apresentaram parasitemia superior a 10% foram tratados com

antimalárico, independente do dia determinado para esplenectomia (ver próximo item). Em

todos os casos de tratamento, foram feitos e analisados distentidos sanguíneos por 20 dias

para confirmar a cura completa do animal.

33

Cirurgia de retirada de baço (Esplenectomia)

Os animais foram sedados pela associação de cloridrato de xilazina a 0,2% (Schering-

Plough Saúde Animal) e cloridrato de quetamina a 50mg/ml (Park Davis). Com o animal

sedado, fez-se tricotomia da região abdominal e antissepsia com álcool iodado. A cirurgia de

retirada do baço foi feita em sala cirúrgica (Cenp) por médico veterinário. Após a cirurgia, os

animais foram tratados com Enrofloxacino 10% injetável (Schering-Plough Saúde Animal)

pela posologia de 2,5 mg/kg uma vez ao dia durante cinco dias e Flunixin meglumine a

50mg/mL (Schering-Plough Saúde Animal) pela posologia de 2,2 mg/kg durante três dias. Os

animais que foram infectados experimentalmente pela cepa FUP de P. falciparum foram

tratados também com cloroquina (150 mg/kg) com 10 mg/kg no primeiro dia, 7,5 mg/kg no

segundo dia e 7,5 mg/kg no terceiro dia. Após a esplenectomia, os baços dos animais foram

colocados em tubos tipo falcon individualizados contendo 10 mL de solução salina a 0,9%

heparinizada. Em ambiente estéril (capela de fluxo laminar), cada baço foi colocado em placa

de Petri, e usaram-se lâminas de bisturi estéreis para fazer dois cortes transversais em cada

órgão. Com isso, foram produzidos três fragmentos de baço que foram destinados a: i)

separação de células (esplenócitos) por gradiente de Ficoll histopaque (Sigma), ii) confecção

de lâminas histopatológicas coradas pelas técnicas de Giemsa e Hematoxilina-Eosina e, iii)

criopreservação de esplenócitos. Os processos de separação de esplenócitos tanto para cultivo

celular quanto para criopreservação seguiram os mesmos passos realizados para separação de

PBMCs já descritos.

Exame Histológico

Os fragmentos de baço foram fixados em formalina tamponada a 10%, e embebidos

em parafina. Seções foram cortadas (5µm) em micrótomo, coradas por hematoxilina e eosina

e/ou Giemsa, e analisadas sob microscopia óptica (Leica DM LS2). As imagens foram

capturadas pelo aplicativo ZoomBrowser EX® (Canon).

Manutenção in vitro de Plasmodium falciparum

A cepa FUP de P. falciparum foi mantida em laboratório como descrito previamente

por Trager & Jensen (1976).

34

Experimento de estimulação de esplenócitos, extração de RNAm e síntese de cDNA

Esplenócitos isolados por gradiente de Ficoll histopaque (2x106 células/mL) foram

mantidos em placas de 24 poços (Corning) com RPMI 1640 tamponado com HEPES (Sigma)

suplementado com soro bovino fetal a 10% (Sigma) e estimulados ou não nas seguintes

condições: i) cultivo P. falciparum (20 hemácias parasitadas/esplenócito), ii) P. falciparum

livres (4x107 parasitas/poço), iii) antígenos brutos de P. falciparum (20 µg/mL), iv) hemácias

humanas (20 hemácias/célula), e v) poço sem estímulos nem antigênico nem mitogênico. As

placas foram incubadas a 37°C em atmosfera de CO2 a 5% por seis horas. O RNA total foi

isolado dos poços usando-se o kit de extração RNeasy® (Qiagen), segundo as recomendações

do fabricante. As amostras de RNA foram mantidas a -70ºC até o momento de fazer a síntese

de cDNA. As reações de transcriptase reversa (RT) foram feitas usando-se o kit High-

Capacity® (Applied Biosystems) conforme mencionado na seção “Síntese de cDNA”.

35

Resultados

Desenho de iniciadores e amplificação

Dos 31 pares de iniciadores desenhados e testados, 17 foram capazes de amplificar por

PCR convencional e sequênciar o fragmento gênico correspondente, a saber: IFNγ, TNF,

LTA, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12B, IL13, TGFβ2, CSF2, CCR5, CCR8, CD40 e

BAX. Mesmo nesses casos, em várias oportunidades o sucesso na amplificação não foi

imediato, sendo necessárias várias mudanças no protocolo original (temperaturas,

concentrações de reagentes, etc.) até ser possível a obtenção de bandas no gel de agarose

(Figuras 3 e 4).

Inicialmente foram feitas PCRs com gradiente para se estabelecer a melhor

temperatura de anelamento dos iniciadores. Na Figura 3 podem-se observar exemplos das

PCRs gradiente de alguns genes. Em alguns casos, como para IL13 e IL12 (Figura 3), houve

boa amplificação em uma ampla gama de temperaturas tanto para Saimiri quanto para Aotus,

de maneira semelhante a amplificação observada com DNA humano. Na maioria dos casos,

entretanto, a faixa de temperatura em que se obtiveram produtos amplificados com DNA de

Saimiri e de Aotus foi mais restrita, ocorrendo apenas em temperaturas mais baixas, enquanto

o DNA humano gerou amplificados também em temperaturas mais altas. Uma vez que em

temperaturas mais baixas o anelamento pode ocorrer com menor grau de especificidade, esses

dados sugerem que os iniciadores se anelaram com menor complementariedade no DNA de

Saimiri e de Aotus que no DNA humano, revelando a provável presença de pequenas

diferenças de sequência na região de anelamento. Na maioria dos casos, essas diferenças não

foram suficientes para impedir a amplificação, mas isso acabou ocorrendo, por exemplo, no

caso de CCR5 de Aotus (Figura 3) e pode também explicar o insucesso em gerar produtos de

amplificação para 14 dos 31 pares de iniciadores desenhados e testados. É interessante notar

que, de fato, na maioria dos casos, houve melhor amplificação nas amostras de Saimiri que

nas de Aotus (Figuras 3), sugerindo uma maior identidade com as sequências humanas. A

menor especificidade em temperaturas mais baixas foi também revelada pelo surgimento de

bandas inespecíficas em alguns casos, como para IL13 e CD40, por exemplo (Figura 3). Por

esse motivo, em todos os casos selecionamos como temperatura de anelamento para a PCR

aquela mais alta capaz de gerar um produto de amplificação.

Assim, após ocorrer à determinação da melhor temperatura de anelamento para cada

par de iniciadores, foram então realizadas as PCRs em seu formato convencional para

36

obtenção de amplificados. Na figura 4, podem-se observar as bandas específicas de alguns

genes que foram purificadas e depois sequenciadas. Note que IL2, IL4, TNF e IL10

apresentaram boa amplificação, com bandas fortes no gel de agarose e sem apresentar

amplificação inespecífica. Na figura 4, observou-se que os iniciadores humanos para IL6 e

CSF2 não apresentaram boa amplificação, com presença de bandas inespecíficas e fraca

amplificação mesmo depois de exaustivas tentativas para aperfeiçoar as PCRs desses

fragmentos. Para alguns desses genes, foi mesmo necessário testar diferentes pares de

iniciadores para se conseguir a amplificação. Por exemplo, para IL10, foi feito um desenho

inicial de iniciadores cobrindo a região dos éxons 1 e 2, que não funcionou, e, somente com o

segundo par de iniciadores desenhado, cobrindo a região dos éxons 3 e 4, é que se obteve

sucesso.

Com os 14 dos 31 pares de iniciadores testados, não se obteve sucesso nem para

Saimiri nem para Aotus. Para IL18, IL27 e CD95-Fas, produtos de amplificação foram

obtidos, mas o sequenciamento mostrou que o produto não correspondia às sequências desses

genes. Para os demais, nem mesmo um produto de PCR foi obtido. Em todos os casos foram

testadas várias temperaturas de anelamento, e em alguns casos com outras mudanças no

protocolo original – como descrito acima – mas ainda assim sem atingir o resultado esperado.

É importante frisar que em todos os casos houve a obtenção de produtos de PCR ao se utilizar

amostras de DNA humanas, mostrando que os iniciadores funcionam e que de fato a não

amplificação de amostras de DNA de Saimiri e de Aotus provavelmente resultou de

problemas de alinhamento dos iniciadores. Essa dificuldade de amplificação para um número

considerável de genes que, de modo geral, são bem conservados entre espécies, especialmente

entre primatas, reforça o racional da necessidade de reagentes específicos para se trabalhar

com esses modelos, uma vez que diferenças mínimas de sequência podem de fato gerar

dificuldades ou mesmo impossibilitar o anelamento adequado, resultando em não obtenção de

produtos amplificados.

37

Figura 3. Géis de agarose a 1% das PCRs gradientes de temperatura de: IFNγ, CCR5, IL13, IL12, CD40 e IL3. As temperaturas variaram de 50oC a 60oC. As menores temperaturas se situam próximas ao padrão de peso molecular (esquerda).

38

Figura 4. Géis de agarose a 1% de seis moléculas amplificadas por PCR: IL2, IL6, IL4, CSF2, TNF e IL10 de amostras de DNA. PM: peso molecular; A: Aotus; S: Saimiri; H: humano.

Graus de Identidade

Os produtos amplificados dos 17 genes foram sequenciados e comparados com as

sequências humanas e de outros macacos já depositadas no GenBank®, através de

alinhamento usando o aplicativo BioEdit® (Figura 5). O alinhamento e a edição dessas

sequências mostraram que, comparando as sequências obtidas de Saimiri e de Aotus com as

humanas, em alguns casos observavam-se graus muito elevados de identidade (acima de

90%), enquanto que em outros, como IL3, evidenciava-se baixa identidade (Tabelas 6 e 7).

39

Esses dados confirmam que, apesar do considerável grau de identidade de sequências entre os

genes de Saimiri e Aotus e seus correspondentes no homem, existem diferenças suficientes

para restringir a utilização de ferramentas moleculares específicas de humanos para analisar

amostras dessas espécies neotropicais. Mesmo quando se compara as sequências dos animais

das colônias da Fiocruz e do Cenp com sequências previamente depositadas de outras

espécies ou variedades de Saimiri ou de Aotus, em muitos casos são observadas diferenças,

ainda que pequenas. Um caso interessante é o do TNF. O fragmento gênico amplificado em

nosso estudo apresentou maior grau de identidade com a sequência humana (11pb diferentes)

que com a própria sequência de Saimiri já depositada no GenBank® (2pb diferentes).

Obviamente o fragmento sequenciado corresponde a apenas uma pequena parte do gene

(171pb), mas de qualquer maneira este achado revela que pares de iniciadores desenhados

para uma espécie de uma determinada região geográfica podem não ser adequados para serem

utilizados em experimentos com animais de outras regiões.

Figura 5. Rosto do aplicativo BioEdit® usado para analisar as 17 sequências obtidas neste trabalho. A parte superior da figura mostra o local onde se inserem as sequências analisadas e o alinhamento que vai sendo formado entre as sequências de diferentes espécies e/ou amostras. O padrão de análise seguido aqui foi: sequências do homem, de Aotuu, de Saimiri e de outros primatas. Na parte inferior, observam-se os gráficos de sequenciamento das fitas direta e reversa de DNA genômico ou de Saimiri ou de Aotus. Neste trabalho, padronizou-se analisar as sequências seguindo a ordem: gráfico da esquerda para fita de DNA sequenciada pelo iniciador direto e gráfico da direita para fita de DNA sequenciada pelo iniciador reverso. Comparam-se os picos de sequenciamento para obtenção de uma única fita de sequência nucleotídica que é então submetida ao GenBank®. O retângulo negro mostra o exato local de análise visto nos cladogramas abaixo. A, adenina; T, timina; C, citosina; e G, guanosina.

40

Tabela 6. Graus de identidade (%) entre fragmentos dos genes que codificam IFNγ, TNF, LTA, IL2, IL6, IL10, IL12, IL3, IL4, IL5, IL13, CSF2, TGFβ, CD40, CCR5, CCR8 BAX de sequencias de A. infulatus, S. sciureus, outros primatas não-humanos e do homem. Gene Espécies* A. infulatus S. sciureus IFNγ Humano (AF506749) 93 92

M. mulatta (AY376145) 92 91,2 S. sciureus (AF414102) 98,4 99,2 A. lemurinus (AF097327) 99 98 A. nancymaae (AF014512) 97,2 96,4 A. nigriceps (AF097326) 99,2 98,4 A. vociferans (AF014507) 99 98

TNF Humano (AY066019) 93,6 90 M. mulatta (NM_001047149) 91,2 89 S. sciureus (AF294760) 95,2 99

LTA Humano (AY070490) 95 96 M. mulatta (NM_001047148) 96 97 A. nancymaae (AY373461) 100 99

IL2 Humano (AF359939) 97,9 97,4 M. mulatta (U19847) 97,9 97,4 S. sciureus (AF294755) 99,5 99 A. lemurinus (U88364) 100 99,5 A. nancymaae (U88361) 100 99,5 A. nigriceps (U88363) 100 99,5 A. vociferans (U88362) 100 99,5

IL6 Humano (AF372214) 95 94,1 M. mulatta (NM_001042733) 94,1 93,1 S. sciureus (AF294757) 98 99 A. lemurinus (AF097323) 95 94,1 A. nancymaae (AF014510) 95 94,1 A. nigriceps (AF097322) 99 98 A. vociferans (AF014505) 98 97

IL10 Humano (AF418271) 90 S. sciureus (AF294758) 98,1 M. mulatta ( 91,6 A. lemurinus (AF097325) 93,3 A. nancymaae (AF014511) 91,1 A. nigriceps (AF097324) 93,3 A. vociferans (AF014506) 93,3

IL12B Humano (AF512686) 93 95 M. mulatta (U19841) 92 94

IL3 Humano (AF365976) 87 87 M. mulatta (NM_001101734) 91 89

IL4 Humano (M23442) 87,4 92 M. mulatta (L26027) 85,2 87,4 A. lemurinus (AF097321) 90,1 93 A. nancymaae (AF014509) 91,4 92 A. nigriceps (AF097320) 91,4 92 A. vociferans (AF014504) 91,4 92

IL5 Humano (AF353265) 94 M. mulatta (XM_001099286) 92

41

S. sciureus (AF294756) 98,2 C. jacchus (DQ658152) 97,3

IL13 Humano (AF377331) 95 94 M. mulatta (NM_001032929) 96,1 95

CSF2 Humano (AF373868) 91,1 89 M. mulatta (NM_001032949) 91 88,1

TGFβ2 Humano (AY438979) 98 97,4 M. mulatta (LOC707540) 96 95,3

CD40 Humano (EF064754) 91 91,3 M. mulatta (XM_001104333) 87 87,4 C. jacchus (DQ189221) 97 96,1

CCR5 Humano (AY221093) 94 M. mulatta (DQ499968) 93,3 S. sciureus (AY278742) 98 A. trivirgatus (AF161947) 95,5

CCR8 Humano (U45983) 94 94,1 M. mulatta (AF100205) 94 94,1

BAX Humano (AY217036) 98 98,4 M. mulatta (DQ229087) 96,1 95,1

* Identificação das espécies e número de acesso das sequências obtidas no GenBank® que foram utilizadas para alinhar com as sequências de A. infulatus e S. sciureus obtidas nesse trabalho.

Tabela 7. Resumo de dados relacionados ao tamanho do fragmento sequenciado, posição do fragmento, grau de identidade e quantidade de alterações observadas nas sequências de Aotus e Saimiri obtidas neste trabalho em relação às sequências humanas depositadas no GenBank®. Gene Tamanho

do fragmento (pares de

bases)

Posição* Grau de identidade

(%)*

Quantidade de alterações

nucleotídeos

aminoácidos

IFNγ A. infulatus 251 53 a 303 93 18 10

S. sciureus 251 53 a 303 92 20 10

TNF A. infulatus 171 1 a 171 95 12 8

S. sciureus 171 1 a 171 99,4 18 11

LTA A. infulatus 526 50 a 575 95,2 25 12

S. sciureus 526 50 a 575 96 24 12

IL2 A. infulatus 189 1 a 189 97,9 5 2

S. sciureus 189 1 a 189 97,4 4 2

42

IL6 A. infulatus 100 284 a 384 95 5 3

S. sciureus 100 284 a 384 94,1 6 3

IL10 S. sciureus 109 269 a 378 90 11 6

IL12 A. infulatus 271 153 a 423 93 19 10

S. sciureus 240 153 a 392 95 11 9

IL3 A. infulatus 164 251 a 415 87 22 13

S. sciureus 152 251 a 403 87 20 12

IL4 A. infulatus 135 1 a 135 87,4 17 12

S. sciureus 174 1 a 175 92 14 7

IL5 S. sciureus 109 251 a 387 94 7 5

IL13 A. infulatus 165 105 a 270 95 4 2

S. sciureus 165 105 a 270 94 7 4

CSF2 A. infulatus 202 1 a 202 91,1 18 12

S. sciureus 202 1 a 202 89 23 13

TGFβ A. infulatus 233 520 a 752 98 5 1

S. sciureus 233 520 a 752 97,4 5 0

CD40 A. infulatus 206 159 a 365 91 19 10

S. sciureus 206 159 a 365 91,3 18 10

CCR5 S. sciureus 593 175 a 768 94 38 20

CCR8 A. infulatus 635 101 a 736 94 40 14

S. sciureus 635 101 a 736 94,1 37 16

BAX A. infulatus 191 43 a 234 98 4 2

S. sciureus 191 43 a 234 98,4 3 1

*: em relação ao transcrito humano

43

Análise de sequências

O fragmento de IFNγ sequenciado de Aotus (DQ989366) e Saimiri (DQ989367)

apresentou 250pb que correspondeu às posições 53 a 303pb do transcrito humano. O grau de

identidade observado entre as sequências de Aotus e humana foi de 93% e entre as sequências

de Saimiri e do homem foi de 92%. O grau de identidade observado entre as sequências de

Aotus e Saimiri obtidas aqui foi de 99,2%. A sequência de Saimiri apresentou 20 alterações

nucleotídicas e 10 de aminoácidos em relação à sequência humana, enquanto que a de Aotus

apresentou 18 alterações nucleotídicas e 10 de aminoácidos quando comparada à sequência

humana (Tabelas 6 e 7). As diferenças de sequência observadas entre Aotus/Saimiri e o

homem aparecem distribuídas uniformemente ao longo de todo o fragmento gênico

sequenciado. Isso pode prejudicar a utilização dos fragmentos humanos como molde para o

desenho de iniciadores específicos para PCR quantitativa em tempo real. O alinhamento e o

esquema de IFNγ podem ser observados nas Figuras 6 e 7.

60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IFNg TGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTT A G H S D V A D N G T L F L G I MacMul .......G..C..........A......................A...C. A G D P D V A D N G T L F L D I AotInf ...................A.....................AA..... G H S D V A D N G T L F L N I SaiSci ...................A.....................AA..... G H S D V A D N G T L F L N I Saimir .......G.............A.....................AA..... A G D S D V A D N G T L F L N I AotLem .......G...................................AA..... A G D S D V A D N G T L F L N I AotNan .............C.............................AA..... A G H S H V A D N G T L F L N I AotNig .......G.............A.....................AA..... A G D S D V A D N G T L F L N I AotVoc .......G...................................AA..... A G D S D V A D N G T L F L N I 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IFNg TGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATT L K N W K E E S D R K I M Q S Q I MacMul ...G.............................................. L R N W K E E S D R K I M Q S Q I AotInf ...G..C.....G.......G.........................G... L R T W R E E G D R K I M Q S Q I SaiSci ...G..C.....G.......G.........................G... L R T W R E E G D R K I M Q S Q I Saimir ...G..C.....G.......G.........................G... L R T W R E E G D R K I M Q S Q I AotLem ...G..C.....G.......G.........................G... L R T W R E E G D R K I M Q S Q I AotNan ...G..C.....G.....~~~~........................G... L R T W R E V T E K * C R A R L AotNig ...G..C.....G.......G.........................G... L R T W R E E G D R K I M Q S Q I AotVoc ...G..C.....G.......G.........................G... L R T W R E E G D R K I M Q S Q I 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IFNg GTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCAT V S F Y F K L F K N F K D D Q S I MacMul ................................C..............G.. V S F Y F K L F K N F K D D Q R I AotInf A.....................................CA.......... I S F Y F K L F K N F K D N Q S I SaiSci A.....................................CA.......... I S F Y F K L F K N F K D N Q S I Saimir A.....................................CA.......... I S F Y F K L F K N F K D N Q S I AotLem A.....................................CA.......... I S F Y F K L F K N F K D N Q S I AotNan A.....................................CA.......... S P F T S N F L K T L K T T R A AotNig A.....................................CA.......... I S F Y F K L F K N F K D N Q S I AotVoc A.....................................CA.......... I S F Y F K L F K N F K D N Q S I

44

210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IFNg CCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCA Q K S V E T I K E D M N V K F F MacMul .................................T................ Q K S V E T I K E D I N V K F F AotInf ..........A....................................... Q K S M E T I K E D M N V K F F SaiSci ..........A....................................... Q K S M E T I K E D M N V K F F Saimir ..........A....................................... Q K S M E T I K E D M N V K F F AotLem ..........A....................................... Q K S M E T I K E D M N V K F F AotNan ..........A....................................... S K R V W R P S R K T * M S S F S AotNig ..........A....................................... Q K S M E T I K E D M N V K F F AotVoc ..........A....................................... Q K S M E T I K E D M N V K F F 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IFNg ATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCG N S N K K K R D D F E K L T N Y S MacMul ...................G........T...........C......... N S N K K K R D D F E K L T N Y S AotInf ............G.....AG........T....G................ N S N K R K Q D D F E R L T N Y S SaiSci .C.....T....G.....AG........T....G................ N S N K R K Q D D F E R L T N Y S Saimir .C.....T....G.....AG........T....G................ N S N K R K Q D D F E R L T N Y S AotLem ............G.....AG........T....G................ N S N K R K Q D D F E R L T N Y S AotNan ............G.....AG........T....G................ I A T K G N R M T L K G * L I I R AotNig ............G.....AG........T....G................ N S N K R K Q D D F E R L T N Y S AotVoc ............G.....AG........T....G................ N S N K R K Q D D F E R L T N Y S 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IFNg GTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGT V T D L N V Q R K A I H E L I Q V MacMul ..........C...................G................... V T D S N V Q R K A V H E L I Q V AotInf ..G V SaiSci ..G V

Figura 6. Alinhamento de sequências de interferon gama com as obtidas de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) e com as sequências depositadas no GenBank® de S. sciureus (Saimir), A. lemurinus (AotLem), A. nancymaae (AotNan), A. nigriceps (AotNig), A. vociferans (AotVoc), M. mulatta (MacMul) e do homem (Human_IFNγ). Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 7. Esquema do gene que codifica o IFNγ.

45

O sequenciamento de TNF, TNF ou TNFSF2 de Aotus (DQ989364) e Saimiri

(DQ989365) gerou um fragmento de 171pb. O fragmento gênico sequenciado de S. sciureus

apresentou um número maior de alterações nucleotídicas do que o fragmento sequenciado de

Aotus em relação à sequência humana de TNF (Figura 8; Tabelas 6 e 7). O grau de identidade

obtido entre sequências de Aotus e Saimiri foi de 96%. O esquema do gene de TNF pode ser

observado na Figura 9.

10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_TNF ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCT M S T E S M I R D V E L A E E A L MacMul .................................................. M S T E S M I R D V E L A E E A L AotInf .............C........A........................... M S T E T M I Q D V E L A E E A L SaiSci .............C........A.........................T. M S T E T M I Q D V E L A E E A F Saimir ......................A.........................T. M S T E S M I Q D V E L A E E A F 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_TNF CCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCA P K K T G G P Q G S R R C L F L MacMul ...A.G........C..........................G........ P R K T A G P Q G S R R C W F L AotInf ........-CC.......-..................C............ P K X P G X P Q G S R R R L F L SaiSci .T......-CC......--..............A...C...G........ S K X P G X P Q G S R R R W F L Saimir .T......-CC......--..............A...C...G........ S K X P G X P Q G S R R R W F L 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_TNF GCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTG S L F S F L I V A G A T T L F C L MacMul .................C............................T... S L F S F L L V A G A T T L F C L AotInf .................C....A.....T......G.............. S L F S F L L V A G A T A L F C L SaiSci .................C....A.....T......G.C............ S L F S F L L V A G A T A L F C L Saimir .................C....A.....T......G.C............ S L F S F L L V A G A T A L F C L 160 170 ....|....|....|....|. Human_TNF CTGCACTTTGGAGTGATCGGC L H F G V I G MacMul ..................... L H F G V I G AotInf ..................... L H F G V I G SaiSci ..................... L H F G V I G Saimir ........C............ L H F G V I G

Figura 8. Alinhamento de sequências de TNF obtidas de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) com as de S. sciureus (SaiSci), M. mulatta (MacMul) e do homem (Human_TNF) depositadas no GenBank®. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequncias nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 9. Esquema do gene que codifica o TNF.

46

O fragmento gênico amplificado e sequenciado de LTA apresentou 526pb iniciando na

posição 50 e finalizando na posição 575 do transcrito humano. Após análise das sequências

foram achadas 25 alterações nucleotídicas e 12 de aminoácidos na sequência de Aotus

(FJ589020) e, 24 alterações nucleotídicas e 12 alterações peptídicas na sequência de Saimiri

(FJ589021) em relação à sequência humana (Figura 10). Os graus de identidade entre as

sequências analisadas são observados nas tabelas 6 e 7; um grau de identidade de 98,8% foi

observado entre as sequências de Aotus e Saimiri. Observe a figura esquemática de LTA na

Figura 11. 10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA ATGACACCACCTGAACGTCTCTTCCTCCCAAGGGTGTGTGGCACCACCCT M T P P E R L F L P R V C G T T L MacMul ...........................T........C........C.... M T P P E R L F L S R V R G T P L AotInf . SaiSci . AotNan ...........................T........CAG......C.... M T P P E R L F L S R V Q G T P L 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA ACACCTCCTCCTTCTGGGGCTGCTGCTGGTTCTGCTGCCTGGGGCCCAGG H L L L L G L L L V L L P G A Q MacMul ..............................C................... H L L L L G L L L V L L P G A Q AotInf .............................CC.....T............. H L L L L G L L L A L L P G A Q SaiSci .............................CC.....T............. H L L L L G L L L A L L P G A Q AotNan .............................CC.....T............. H L L L L G L L L A L L P G A Q 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA GGCTCCCTGGTGTTGGCCTCACACCTTCAGCTGCCCAGACTGCCCGTCAG G L P G V G L T P S A A Q T A R Q MacMul .................................................. G L P G V G L T P S A A Q T A R Q AotInf ...............................C.......T.......... G L P G V G L T P S A A Q I A R Q SaiSci .......................................T.......... G L P G V G L T P S A A Q I A R Q AotNan ...............................C.......T.......... G L P G V G L T P S A A Q I A R Q 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA CACCCCAAGATGCATCTTGCCCACAGCAACCTCAAACCTGCTGCTCACCT H P K M H L A H S N L K P A A H L MacMul ............................C..................... H P K M H L A H S T L K P A A H L AotInf ......................G.....C..................... H P K M H L A R S T L K P A A H L SaiSci ......................G.....C..................... H P K M H L A R S T L K P A A H L AotNan ......................G.....C..................... H P K M H L A R S T L K P A A H L 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA CATTGGAGACCCCAGCAAGCAGAACTCACTGCTCTGGAGAGCAAACACGG I G D P S K Q N S L L W R A N T MacMul ..........................................G....... I G D P S K Q N S L L W R A N T AotInf .G................C.....A.......G.........G....... V G D P S N Q K S L R W R A N T SaiSci .G................C.....A.......G.........G....... V G D P S N Q K S L R W R A N T AotNan .G................C.....A.......G.........G....... V G D P S N Q K S L R W R A N T 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA ACCGTGCCTTCCTCCAGGATGGTTTCTCCTTGAGCAACAATTCTCTCCTG D R A F L Q D G F S L S N N S L L MacMul .................................................. D R A F L Q D G F S L S N N S L L AotInf ......................C........................... D R A F L Q D G F S L S N N S L L SaiSci .................................................. D R A F L Q D G F S L S N N S L L AotNan ......................C........................... D R A F L Q D G F S L S N N S L L 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA GTCCCCACCAGTGGCATCTACTTCGTCTACTCCCAGGTGGTCTTCTCTGG V P T S G I Y F V Y S Q V V F S G MacMul .................................................. V P T S G I Y F V Y S Q V V F S G AotInf .......................T.......................... V P T S G I Y F V Y S Q V V F S G SaiSci .......................T.......................... V P T S G I Y F V Y S Q V V F S G

47

AotNan .......................T.......................... V P T S G I Y F V Y S Q V V F S G 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA GAAAGCCTACTCTCCCAAGGCCACCTCCTCCCCACTCTACCTGGCCCATG K A Y S P K A T S S P L Y L A H MacMul ...............T.........C..A..................... K A Y S P K A T P T P L Y L A H AotInf ......G.................GC..A....G................ K A Y S P K A T P T P L Y L A H SaiSci ........................GC..A....G................ K A Y S P K A T P T P L Y L A H AotNan ......G.................GC..A....G................ K A Y S P K A T P T P L Y L A H 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA AGGTCCAGCTCTTCTCCTCCCAGTACCCCTTCCATGTGCCTCTCCTCAGC E V Q L F S S Q Y P F H V P L L S MacMul ..................................C........T...... E V Q L F S S Q Y P F H V P L L S AotInf ..................................C...T........... E V Q L F S S Q Y P F H V S L L S SaiSci ..................................C...T........... E V Q L F S S Q Y P F H V S L L S AotNan ..................................C...T........... E V Q L F S S Q Y P F H V S L L S 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA TCCCAGAAGATGGTGTATCCAGGGCTGCAGGAACCCTGGCTGCACTCGAT S Q K M V Y P G L Q E P W L H S M MacMul .................................................. S Q K M V Y P G L Q E P W L H S M AotInf ..............A................................A.. S Q K M V Y P G L Q E P W L H S M SaiSci ..............A................................... S Q K M V Y P G L Q E P W L H S M AotNan ..............A................................A.. S Q K M V Y P G L Q E P W L H S M 510 520 530 540 550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA GTACCACGGGGCTGCGTTCCAGCTCACCCAGGGAGACCAGCTATCCACCC Y H G A A F Q L T Q G D Q L S T MacMul .................................................. Y H G A A F Q L T Q G D Q L S T AotInf ......T........................................... Y H G A A F Q L T Q G D Q L S T SaiSci ......T...................................C....... Y H G A A F Q L T Q G D Q L S T AotNan ......T........................................... Y H G A A F Q L T Q G D Q L S T 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_LTA ACACAGATGGCATCCCCCACCTAGTCCTCAGCCCTAGTACTGTCTTCTTT H T D G I P H L V L S P S T V F F MacMul .................................................. H T D G I P H L V L S P S T V F F AotInf ...............A......... H T D G I H H L X SaiSci ...............A......G.. H T D G I H H L X AotNan ...............A.................................. H T D G I H H L V L S P S T V F F

Figura 10. Alinhamento de sequências de linfotoxina Alfa obtidas de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) com as de S. sciureus (SaiSci), M. mulatta (MacMul) e do homem (Human_LTA) depositadas no GenBank®. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 4,500 5,000

LTA

LTA

Pares de Base - Pb

2583 - 3524

Região não transcrita do gene – NTRÉxonÍntronRegião amplificada do geneRegião amplificada do gene em PCR em tempo real

2840 - 3154

Figura 11. Esquema do gene que codifica a LTA.

O fragmento de IL2 apresentou 189pb e os graus de identidade entre as sequências

analisadas podem ser observadas nas tabelas 6 e 7. A análise do grau de identidade entre as

48

sequências de Aotus e Saimiri mostrou 99,5% de identidade. A sequência de Aotus

(DQ989368) apresentou quatro diferenças nucleotídicas e duas de aminoácidos e a sequência

de Saimiri (DQ989369) apresentou cinco alterações nucleotídicas e duas de aminoácidos em

relação à sequência humana. O alinhamento dessas sequências e o esquema do gene de IL2

podem ser vistos nas Figuras 12 e 13. 10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL2 ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGT M Y R M Q L L S C I A L S L A L V MacMul .................................................. M Y R M Q L L S C I A L S L A L V AotInf ...............................................CA. M Y R M Q L L S C I A L S L A L I SaiSci ...............................................CA. M Y R M Q L L S C I A L S L A L I Saimir ...............................................CA. M Y R M Q L L S C I A L S L A L I AotVoc ...............................................CA. M Y R M Q L L S C I A L S L A L I AotLem ...............................................CA. M Y R M Q L L S C I A L S L A L I AotNan ...............................................CA. M Y R M Q L L S C I A L S L A L I AotNig ...............................................CA. M Y R M Q L L S C I A L S L A L I 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL2 CACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAAC T N S A P T S S S T K K T Q L Q MacMul .................................................. T N S A P T S S S T K K T Q L Q AotInf .................................................. T N S A P T S S S T K K T Q L Q SaiSci ......T........................................... T N S A P T S S S T K K T Q L Q Saimir .................................................. T N S A P T S S S T K K T Q L Q AotVoc .................................................. T N S A P T S S S T K K T Q L Q AotLem .................................................. T N S A P T S S S T K K T Q L Q AotNan .................................................. T N S A P T S S S T K K T Q L Q AotNig .................................................. T N S A P T S S S T K K T Q L Q 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL2 TGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAAT L E H L L L D L Q M I L N G I N N MacMul .................................................. L E H L L L D L Q M I L N G I N N AotInf ...................C.........C.................... L E H L L L D L Q M L L N G I N N SaiSci ...................C.........C.................... L E H L L L D L Q M L L N G I N N Saimir ...................C.........C.................... L E H L L L D L Q M L L N G I N N AotVoc ...................C.........C.................... L E H L L L D L Q M L L N G I N N AotLem ...................C.........C.................... L E H L L L D L Q M L L N G I N N AotNan ...................C.........C.................... L E H L L L D L Q M L L N G I N N AotNig ...................C.........C.................... L E H L L L D L Q M L L N G I N N 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL2 TACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCC Y K N P K L T R M L T F K F Y M P MacMul .................................................. Y K N P K L T R M L T F K F Y M P AotInf ....................................... Y K N P K L T R M L T F K SaiSci ....................................... Y K N P K L T R M L T F K Saimir ................................C............C.... Y K N P K L T R M L T F K F Y L P AotVoc .................................................. Y K N P K L T R M L T F K F Y M P AotLem .................................................. Y K N P K L T R M L T F K F Y M P AotNan .................................................. Y K N P K L T R M L T F K F Y M P AotNig .................................................. Y K N P K L T R M L T F K F Y M P

Figura 12. Alinhamento de sequências de interleucina 2 obtidas de A. infulatus e S. sciureus com as depositadas no GenBank® de A. lemurinus (AotLem), A. nancymaae (AotNan), A. nigriceps (AotNig), A. vociferans (AotVoc), M. mulatta (MacMul) e humana (Human_IL2). Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

49

Figura 13. Esquema do gene que codifica a IL2.

O fragmento de IL6 sequenciado de Aotus (DQ985386) e Saimiri (DQ985387)

apresentou 100pb. O grau de identidade observada entre as sequências analisadas alcançou

99% entre as sequências de Aotus e Saimiri (Tabelas 6 e 7). Cinco alterações nas sequências

nucleotídicas e três nas de aminoácidos foram observadas na sequência de Aotus, e seis

alterações nas sequências nucleotídicas e três nas de aminoácidos foram achadas nas

sequências de Saimiri quando comparadas à sequência humana. O alinhamento dessas

sequências e o esquema do gene de IL6 podem ser vistos nas Figuras 14 e 15.

260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL6 CACTGGCAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGA A L A E N N L N L P K M A E K D G MacMul .................................................. A L A E N N L N L P K M A E K D G AotInf ....A............ A E K D G SaiSci ....A............ A E K D G Saimir .....................................A............ A L A E N N L N L P K M A E K D G AotLem .................................................. A L A E N N L N L P K M A E K D G AotNan .................................................. A L A E N N L N L P K M A E K D G AotNig .....................................A............ A L A E N N L N L P K M A E K D G AotVoc .....................................A............ A L A E N N L N L P K M A E K D G 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL6 TGCTTCCAATCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTGAAAATCATCAC C F Q S G F N E E T C L V K I I T MacMul ..........................C....................... C F Q S G F N E D T C L V K I I T AotInf ...................-................C.........C... C F Q S G F X E E T C L L K I T T SaiSci ...................-C...............C.........C... C F Q S G F X E E T C L L K I T T Saimir ....................C...............C.........C... C F Q S G F N E E T C L L K I T T AotLem .................................................. C F Q S G F N E E T C L V K I I T AotNan .................................................. C F Q S G F N E E T C L V K I I T AotNig ....................................C.........C... C F Q S G F N E E T C L L K I T T AotVoc ...........C........................C.........C... C F Q S G F N E E T C L L K I T T

50

360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL6 TGGTCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTG G L L E F E V Y L E Y L Q N R F MacMul .............................................G.... G L L E F E V Y L E Y L Q N R F AotInf ..................A............... G L L E F E V Y L E Y SaiSci ..................A............... G L L E F E V Y L E Y Saimir ..................A..........................G.... G L L E F E V Y L E Y L Q N R F AotLem .................................. G L L E F E V Y L E Y AotNan .................................. G L L E F E V Y L E Y AotNig ..................A............... G L L E F E V Y L E Y AotVoc ..................A............... G L L E F E V Y L E Y

Figura 14. Alinhamento de sequências de IL6 obtidas de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) com as depositadas no GenBank® para humana (Human_IL6), S. sciureus (Saimir) A. lemurinus (AotLem), A. nancymaae (AotNan), A. nigriceps (AotNig) e A. vociferans (AotVoc), M. mulatta (MacMul). Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 15. Esquema do gene que codifica a IL6.

Os iniciadores para IL10 desenhados baseados na sequência humana conseguiram

amplificar e sequenciar somente DNA de Saimiri (DQ989357). O fragmento amplificado foi

de 105pb. O grau de identidade observado entre a sequência Saimiri obtida aqui e a humana

foi de 90% e o mesmo parâmetro foi de 98,1% quando se comparou com sequência de Saimiri

depositada no GenBank® (Tabelas 6 e 7); 11 alterações na sequência de nucleotídeos e seis

nas de aminoácidos foram achadas na sequência de Saimiri quando comparada à do homem.

O alinhamento dessas sequências e o esquema do gene de IL10 podem ser vistos nas Figuras

16 e 17.

51

260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL10 CTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAAC S E M I Q F Y L E E V M P Q A E N MacMul .................................................. S E M I Q F Y L E E V M P Q A E N SaiSci ..N.................N........... X E E V M P X A E N Saimir .................................................. S E M I Q F Y L E E V M P Q A E N AotLem ............ Q A E N AotNan ............ Q A E N AotNig ............ Q A E N AotVoc ............ Q A E N 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL10 CAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAA Q D P D I K A H V N S L G E N L K MacMul ..C................A........................T..... H D P D I K E H V N S L G E N L K SaiSci N.T................A...C.................A..G..... X D P D I K E H V N S L G E K L K Saimir ..T................A...C.................A..G..... H D P D I K E H V N S L G E K L K AotLem .......................C.....T...........A..G..... Q D P D I K A H V N S L G E K L K AotNan .......................C.....T...........A........ Q D P D I K A H V N S L G E N L K AotNig .......................C.....T...........A..G..... Q D P D I K A H V N S L G E K L K AotVoc .......................C.....T...........A..G..... Q D P D I K A H V N S L G E K L K 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL10 GACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAA T L R L R L R R C H R F L P C E MacMul ..................G............................... T L R L R L R R C H R F L P C E SaiSci ...TT.............G..A...... T F R L R L R R C Saimir ...TT.............G..A...... T F R L R L R R C AotLem ....T.............G..A...... T F R L R L R R C AotNan ....T.............G.CA...... T F R L R L P R C AotNig ....T.............G..A...... T F R L R L R R C AotVoc ....T.............G..A...... T F R L R L R R C

Figura 16. Alinhamento de fragmento de IL10 de S. sciureus (SaiSci) com sequências de outros primatas não-humanos e a do homem (Human_IL10) depositadas no GenBank®. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 17. Esquema do gene que codifica a IL10.

52

O sequenciamento de IL-12B (IL12p40) gerou fragmentos de 270pb para Aotus

(DQ989359) e 239pb para Saimiri (DQ989358). Esses fragmentos sequenciados

corresponderam as porções dos éxons 2 e 3 de IL-12B humano. O grau de identidade

observado entre nossas sequências de Aotus e Saimiri foi de 96,2% e os graus de identidade

entre essas sequências e as depositadas no GenBank® podem ser vistos nas tabelas 6 e 7); 19

alterações nucleotídicas e 10 de aminoácidos foram achadas nos fragmentos de Aotus, e 11

alterações nucleotídicas e nove alterações de aminoácidos foram encontradas em DNA

genômico de Saimiri quando comparadas à sequência humana. O alinhamento de sequências e

o esquema do gene de IL12 podem ser vistos nas Figuras 18 e 19.

160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL12B GACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGA D T P E E D G I T W T L D Q S S E MacMul ............................................TG.... D T P E E D G I T W T L D Q S G E AotInf .....X.....T.........................G.......... T X E V D G I T W T L D E S S E SaiSci ...............................X.....G.......... T P E E D G I T W T X D E S S E 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL12B GGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAG V L G S G K T L T I Q V K E F G MacMul .................................................. V L G S G K T L T I Q V K E F G AotInf ....................A............................. V L G S G K N L T I Q V K E F G SaiSci ....................A.....T....................... V L G S G K N L I I Q V K E F G 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL12B ATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCG D A G Q Y T C H K G G E V L S H S MacMul ....................................C............A D A G Q Y T C H K G G E A L S H S AotInf .............T..................A.A.C...G.A....CT. D A G Q Y T C H K G G K A L N H L SaiSci ................................A...C...G.A.....T. D A G Q Y T C H K G G K A L N H L 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL12B CTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTT L L L L H K K E D G I W S T D I L MacMul .............................................G.... L L L L H K K E D G I W S T D V L AotInf ..T...........................G..........G........ L L L L H K K E D G V W S T D I L SaiSci ..T...........................G................... L L L L H K K E D G V W S T D I L 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL12B AAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCA K D Q K E P K N K T F L R C E A MacMul ..........................................T....... K D Q K E P K N K T F L R C E A AotInf ......T............C......................T......C K D Q K E P Q N K T F L R C E A SaiSci ...................C...................... K D Q K E P Q N K T F L R 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL12B AGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACT K N Y S G R F T C W W L T T I S T MacMul .A................................................ K N Y S G R F T C W W L T T I S T AotInf ...............C....... Q N Y S G P F T SaiSci

Figura 18. Alinhamento entre as sequências nucleotídicas de A. infulatus (AotInf), S. sciureus (SaiSci), M. mulatta (MacMul) e do homem (Human_IL12B) do gene de IL12. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

53

Figura 19. Esquema do gene que codifica a IL12.

O sequenciamento de IL3 gerou um fragmento de 164pb que corresponde aos éxons 3,

4 e 5 do gene humano. O alinhamento foi realizado entre sequências de A. infulatus

(DQ989362), S. sciureus (DQ989363), M. mulatta e do homem. O grau de identidade foi de

96% quando analisamos as sequências de Aotus e Saimiri. Os demais valores de identidade

podem ser vistos nas tabelas 6 e 7. Note que foram observadas 22 alterações nucleotídicas e

13 de aminoácidos nas sequências de Aotus, e 20 alterações nucleotídicas e 12 nas sequências

de aminoácidos de Saimiri em relação à sequência humana O alinhamento dessas sequências

e o esquema do gene de IL3 podem ser vistos nas Figuras 20 e 21.

260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL3 TCAAGAGTTTACAGAACGCATCAGCAATTGAGAGCATTCTTAAAAATCTC V K S L Q N A S A I E S I L K N L MacMul ............................C..............G...... V K S L Q N A S A I E S I L K N L AotInf ....................A.......C.......A......GG..... K S L Q N A T A I E S N L K D L SaiSci ....................A...............A......GG..... K S L Q N A T A I E S N L K D L 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL3 CTGCCATGTCTGCCCCTGGCCACGGCCGCACCCACGCGACATCCAATCCA L P C L P L A T A A P T R H P I H MacMul .CA.....C......A........................C........G P P C L P M A T A A P T R P P I R AotInf .CA.T...C......ACA.....A.AT..........A...........G P L C L P T A T D A P T Q H P I R SaiSci TCA.T...C......AC........AT.....A....A...........G S L C L P T A T D A P T Q H P I R 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL3 TATCAAGGACGGTGACTGGAATGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATC I K D G D W N E F R R K L T F Y MacMul .....C.A........C.......C................A........ I T N G D R N D F R R K L K F Y AotInf .......A................C.......T........A.......T I K N G D W N D F R M K L K F Y SaiSci ........................C.......T........A.......T I K D G D W N D F R M K L K F Y

54

410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL3 TGAAAACCCTTGAGAATGCGCAGGCTCAACAGACGACTTTGAGCCTCGCG L K T L E N A Q A Q Q T T L S L A MacMul ..................A..........T.. L K T L E N E Q A Q * AotInf ............... L K T L E SaiSci ... L ....|.... Human_IL3 ATCTTTTAG I F * MacMul AotInf SaiSci

Figura 20. Alinhamento de sequências de IL3 obtidas de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) com as de M. mulatta (MacMul) e do homem (Human_IL3) depositadas no GenBank®. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 21. Esquema do gene que codifica a IL3.

O sequenciamento de IL4 de Aotus (DQ985389) e Saimiri (DQ985388) gerou

fragmentos de 135pb e 175pb, respectivamente, que correspondeu aos éxons 1 e 2 do gene

humano. O grau de identidade foi de 91,1% quando analisamos as sequências de Aotus e

Saimiri. Os demais valores de graus de identidade podem ser vistos nas tabelas 6 e 7; 17

alterações nucleotídicas e 12 de aminoácidos foram achadas nas sequências de Aotus. Foram

observadas também 14 alterações de sequência nucleotídica e 12 de sequência de

aminoácidos de Saimiri em relação à sequência humana. O alinhamento dessas sequências e o

esquema do gene de IL4 podem ser vistos nas Figuras 22 e 23.

55

10 20 30 40 50

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL4 ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATG M G L T S Q L L P P L F F L L A C MacMul .................................................. M G L T S Q L L P P L F F L L A C SaiSci ...........................G..........T...T....... M G L T S Q L L P A L F F L L A C AotInf ............C...G..........G..............T....... M G L T P R L L P A L F F L L A C AotLem AotNan AotNig AotVoc 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL4 TGCCGGCAACTTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGA A G N F V H G H K C D I T L Q E MacMul ..............C............C...C.....G......GA.... A G N F A H G H N C H I A L R E SaiSci C.................T........C......G.TG.....G...... A G N F V H G H N C D V A L E E AotInf ..................T........C...A.....G.....G...... A G N F V H G H N C N I A L E E AotLem ..........A......................G.....G...... G N F D H G H K C D I A L E E AotNan .................................G.....G...... G N F V H G H K C D I A L E E AotNig ..........A......................G.....G...... G N F D H G H K C D I A L E E AotVoc ..........A......................G.....G...... G N F D H G H K C D I A L E E 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL4 TCATCAAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAG I I K T L N S L T E Q K T L C T E MacMul .....G.....C...................................A.. I I E T L N S L T E Q K T L C T K SaiSci ..................TTG..........A.................. I I K T L N I V T E Q K T L C T E AotInf ......G........G.GCTG.......C..A... I I R T L S A V T D Q K AotLem ......G...........TTG.......A..A.................. I I R T L N I V T E Q K T L C T E AotNan .T....G...........CTG.......A..A.................. I I R T L N T V T E Q K T L C T E AotNig ......G...........CTG.......A..A.................. I I R T L N T V T E Q K T L C T E AotVoc ......G...........CTG.......A..A.................. I I R T L N T V T E Q K T L C T E 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL4 TTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGA L T V T D I F A A S K N T T E K E MacMul ......A....G......C............................... L T I T D I L A A S K N T T E K E SaiSci ......................... L T V T D I F A AotInf AotLem ..........TG...................................... L T V M D I F A A S K N T T E K E AotNan ..........TG...................................... L T V M D I F A A S K N T T E K E AotNig ..........TG...................................... L T V M D I F A A S K N T T E K E AotVoc ..........TG........................G............. L T V M D I F A A S K N A T E K E

Figura 22. Alinhamento de sequências de IL4 obtidas de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) com as de outros primatas neotropicais, M. mulatta (MacMul) e a do homem (Human_IL4) depositadas no GenBank®. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

56

Figura 23. Esquema do gene que codifica a IL4.

O fragmento de IL5 só foi sequenciado para A. infulatus (DQ989356) e apresentou

109pb. Os iniciadores desenhados a partir de sequências humanas não conseguiram sequer

amplificar DNA genômico de S. sciureus. O grau de identidade entre nossa sequência e as

depositadas no GenBank® pode ser visto nas tabelas 6 e 7. Sete alterações nucleotídicas e

cinco de aminoácidos foram achadas na sequência de A. infulatus em comparação à sequência

humana. O alinhamento dessas sequências e o esquema do gene de IL5 podem ser vistos nas

Figuras 24 e 25.

260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL5 TGGAAAGACTATTCAAAAACTTGTCCTTAATAAAGAAATACATTGACGGC V E R L F K N L S L I K K Y I D G MacMul .............................................G.... V E R L F K N L S L I K K Y I G G Saimir ......AG......C..........T.........G..C........C.. V E K L F Q N L S L I K E H I D R CalJac ......A.......C..........T.........G..C........C.. V E K L F Q N L S L I K E H I D R AotInf ........G..C........C.. I K E H I D R 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL5 CAAAAAAAAAAGTGTGGAGAAGAAAGACGGAGAGTAAACCAATTCCTAGA Q K K K C G E E R R R V N Q F L D MacMul ..........................G....................... Q K K K C G E E R R R V N Q F L D Saimir ..................C..........A........G........... Q K K K C G Q E R R R V K Q F L D CalJac ..................C..........A........G........... Q K K K C G Q E R R R V K Q F L D AotInf ..................C..........A........G........... Q K K K C G Q E R R R V K Q F L D 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL5 CTACCTGCAAGAGTTTCTTGGTGTAATGAACACCGAGTGGATAATAGAAA Y L Q E F L G V M N T E W I I E MacMul .................................................. Y L Q E F L G V M N T E W I I E Saimir ...........................A...................... Y L Q E F L G V I N T E W I I E CalJac ...........................C.....A...........C.... Y L Q E F L G V I N T E W I I E AotInf ............A........................ Y L Q E F L G V M N T E

Figura 24. Alinhamento de sequências de IL-5 obtidas de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) com as de M. mulatta (MacMul) e a do homem (Human_IL5) depositadas no GenBank®. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas; letras em caixa-alta: nomes abreviados de aminoácidos.

57

Figura 25. Esquema do gene que codifica a IL5. O fragmento gerado de IL13 tanto para Aotus (FJ589022) quanto para Saimiri

(FJ589029) apresentou 141pb com início na posição 143 e término na posição 282 da

sequência humana. O grau de identidade entre as sequências analisadas pode ser observado

nas tabelas 6 e 7, e alcançou 97,1% entre as sequências de Aotus e Saimiri. Após o

alinhamento, foram achadas quatro alterações nucleotídicas e duas alterações de aminoácidos

nas sequências de Aotus. Foram observadas também sete alterações de nucleotídeos e quatro

de aminoácidos para os fragmentos de Saimiri quando comparadas à sequência humana. O

alinhamento dessas sequências e o esquema do gene de IL13 podem ser vistos nas Figuras 26

e 27. 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL13 AGGAGCTGGTCAACATCACCCAGAACCAGAAGGCTCCGCTCTGCAATGGC E E L V N I T Q N Q K A P L C N G MacMul ..................................C............... E E L V N I T Q N Q K A P L C N G AotInf .............................................. L V N I T Q N Q K A P L C N G SaiSci .............................................. L V N I T Q N Q K A P L C N G 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL13 AGCATGGTTTGGAGCATCAACCTGACAGCTGGCATGTACTGTGCAGCCCT S M V W S I N L T A G M Y C A A L MacMul ........G........................G................ S M V W S I N L T A G V Y C A A L AotInf .................................G................ S M V W S I N L T A G V Y C A A L SaiSci ........A............A...........G................ S M V W S I N M T A G V Y C A A L 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL13 GGAATCCCTGATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAAGACCCAGA E S L I N V S G C S A I E K T Q MacMul .................................................. E S L I N V S G C S A I E K T Q AotInf ........................G......................... E S L I N V S G C S A I E K T Q SaiSci ............T........CA.G......................... E S L I N V S R C S A I E K T Q 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_IL13 GGATGCTGGGCGGATTCTGCCCGCACAAGGTCTCAGCTGGGCAGTTTTCC R M L G G F C P H K V S A G Q F S MacMul ........AA........................................ R M L N G F C P H K V S A G Q F S AotInf ........A.T......... R M L S G F C SaiSci ........A........... R M L S G F C

Figura 26. Alinhamento de sequências de IL13 obtidas de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) com as sequências de M. mulatta (MacMul) e do homem (Human_IL13) depositadas no GenBank®. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

58

Figura 27. Esquema do gene que codifica a IL13.

Os fragmentos gênicos de CSF2 ou GM-CSF de Aotus (DQ989360) e Saimiri

(DQ989361) sequenciados nesse trabalho corresponderam aos 202pb iniciais da sequência

humana. O grau de identidade observado entre as sequências de Aotus e Saimiri foi de 96,5%.

As demais relações desse parâmetro podem ser vistas nas tabelas 6 e 7; 18 alterações de

sequências nucleotídicas e 12 nas de aminoácidos foram observadas nas sequências de Aotus,

e 23 alterações de sequências nucleotídicas e 13 nas de aminoácidos, no caso da sequência de

Saimiri quando comparada as sequência humana. O alinhamento dessas sequências e o

esquema do gene de CSF2 podem ser vistos nas Figuras 28 e 29. Note a ausência de três

nucleotídeos (GTA) nas posições 169, 170 e 171 na sequência de S. sciureus, que

correspondem ao aminoácido valina.

10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CSF2 ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTC M W L Q S L L L L G T V A C S I S MacMul ............G..................................... M W L Q G L L L L G T V A C S I S AotInf .............A.........................A.......... M W L Q N L L L L G T V A S S I S SaiSci .............A.........................G.......... M W L Q N L L L L G T V A G S I S 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CSF2 TGCACCCGGCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGA A P G R S P S P S T Q P W E H V MacMul ........C......A.........G........................ A P A R S P S P G T Q P W E H V AotInf ......TAC..A..T..........GA...A.......C.A......... A P T H L P S P D T Q P S K H V SaiSci ......TAC..AT.T..........GA...A.......T.A......... A P T H L P S P D T Q P L K H V 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CSF2 ATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCT N A I Q E A R R L L N L S R D T A MacMul .................................................. N A I Q E A R R L L N L S R D T A AotInf ..................A............................... N A I Q E A Q R L L N L S R D T A SaiSci ..................A............T.................. N A I Q E A Q R L L N L S R D T A 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CSF2 GCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCA A E M N E T V E V I S E M F D L Q MacMul ............A....C.........G...................... A E M N K T V E V V S E M F D L Q AotInf C......CA.................GG...................... P E T N E T V E V V S E M F D L Q SaiSci C......CA.........---.....GG...................... P E T N E T E V V S E M F D L Q

59

210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CSF2 GGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGC E P T C L Q T R L E L Y K Q G L MacMul ........G......................................... E P S C L Q T R L E L Y K Q G L AotInf .. SaiSci ..

Figura 28. Alinhamento entre as sequências de CSF2 de A. infulatus (AotInf), S. sciureus (SaiSci), M. mulatta (MacMul) e do homem (Human_CSF2). Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 29. Esquema do gene que codifica o CSF2.

O fragmento de TGFβ2 amplificado e sequenciado de Aotus (FJ589023) e Saimiri

(FJ589024) apresentou 232pb com início na posição 520 e fim na posição 752pb da sequência

humana. O grau de identidade foi de 98,7% entre as sequências de Aotus e Saimiri. Os demais

valores desse parâmetro podem ser vistos nas tabelas 6 e 7. O alinhamento mostrou cinco

alterações nucleotídicas e uma de aminoácido nas sequências de Aotus e cinco alterações

nucleotídicas nas sequencias de Saimiri quando comparadas à sequência humana. O

alinhamento dessas sequências e o esquema do gene de TGFβ2 podem ser vistos nas Figuras

30 e 31.

510 520 530 540 550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_TGFB2 GCTATATCAGATTCTCAAGTCCAAAGATTTAACATCTCCAACCCAGCGCT L Y Q I L K S K D L T S P T Q R MacMul ...G.......................C...................... L Y Q I L K S K D L T S P T Q R AotInf .............................. S K D L T S P T Q R SaiSci .............................. S K D L T S P T Q R 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_TGFB2 ACATCGACAGCAAAGTTGTGAAAACAAGAGCAGAAGGCGAATGGCTCTCC Y I D S K V V K T R A E G E W L S MacMul ....T.........................................T... Y I D S K V V K T R A E G E W L S AotInf .................................................T Y I D S K V V K T R A E G E W L S SaiSci .......T.........................................T Y I D S K V V K T R A E G E W L S

60

610 620 630 640 650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_TGFB2 TTCGATGTAACTGATGCTGTTCATGAATGGCTTCACCATAAAGACAGGAA F D V T D A V H E W L H H K D R N MacMul .................................................. F D V T D A V H E W L H H K D R N AotInf ..T............................................... F D V T D A V H E W L H H K D R N SaiSci ..T..C............................................ F D V T D A V H E W L H H K D R N 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_TGFB2 CCTGGGATTTAAAATAAGCTTACACTGTCCCTGCTGCACTTTTGTACCAT L G F K I S L H C P C C T F V P MacMul .................................................. L G F K I S L H C P C C T F V P AotInf .................................T..T......A...... L G F K I S L H C P C C T F I P SaiSci .................................T..T............. L G F K I S L H C P C C T F V P 710 720 730 740 750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_TGFB2 CTAATAATTACATCATCCCAAATAAAAGTGAAGAACTAGAAGCAAGATTT S N N Y I I P N K S E E L E A R F MacMul ............................C......T.............. S N N Y I I P N K S E E L E A R F AotInf .................................................. S N N Y I I P N K S E E L E A R F SaiSci .................................................. S N N Y I I P N K S E E L E A R F 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_TGFB2 GCAGGTATTGATGGCACCTCCACATATACCAGTGGTGATCAGAAAACTAT A G I D G T S T Y T S G D Q K T I MacMul .................................................. A G I D G T S T Y T S G D Q K T I AotInf .. X SaiSci .. X

Figura 30. Alinhamento de sequências de TGFβ2 obtidas de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) com as de M. mulatta (MacMul) e do homem (Human_ TGFβ2) depositadas no GenBank®. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 31. Esquema do gene que codifica o TGFβ.

O fragmento sequenciado de CD40 ou TNFRSF5 apresentou 206pb que corresponde

às posições de 159 a 365pb do transcrito humano. O grau de identidade foi de 97% quando

analisamos as sequências de Aotus (FJ589027) e Saimiri (FJ589028). Os demais valores desse

parâmetro podem ser vistos nas tabelas 6 e 7. Após o alinhamento, 19 alterações nas

sequências nucleotídicas e 10 nas peptídicas foram observadas entre as sequências humanas e

TGFb2

89501 - 89855

0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 90,000 100,000

Pares de Base - PbRegião não transcrita do gene – NTRÉ

Pares de Base - PbRegião não transcrita do gene – NTRÉxonÍntronRegião amplificada do geneRegião amplificada do gene em PCR em tempo real

61

as de macacos Aotus. A sequência de Saimiri apresentou 18 alterações nucleotídicas e 10

peptídicas quando se comparou as sequências de Saimiri e do homem. As alterações

observadas tanto em Aotus quanto em Saimiri estão distribuídas uniformemente ao longo das

sequências. O alinhamento dessas sequências e o esquema do gene de CD40 podem ser vistos

nas Figuras 32 e 33.

160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CD40 TGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAATT C T E F T E T E C L P C G E S E F MacMul ..............C.....A...............A............. C T E F T E T E C L P C S E S E F AotInf ..............................CA..G....... F T E T E C L P C G K G E F SaiSci ...........................T..CA..G....... F T E T E C L P C G K G E F CalJac .........G............................CA..G....... C T E V T E T E C L P C G K G E F 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CD40 CCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCG L D T W N R E T H C H Q H K Y C MacMul ...............T..........G....................... L D T W N R E T R C H Q H K Y C AotInf .........T..............G......................... L D T W N R E T H C H Q H K Y C SaiSci .........T........................................ L D T W N R E T H C H Q H K Y C CalJac .........T......................................T. L D T W N R E T H C H Q H K Y C 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CD40 ACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGAC D P N L G L R V Q Q K G T S E T D MacMul .................................................. D P N L G L R V Q Q K G T S E T D AotInf ..................A..........G.A.....T....T....... D P N L G L Q V Q Q E G T S V T D SaiSci .............................G.......T....T....... D P N L G L R V Q Q E G T S V T D CalJac .............................G.......T....T....... D P N L G L R V Q Q E G T S V T D 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CD40 ACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGA T I C T C E E G W H C T S E A C E MacMul ........................CT........T.......T....... T I C T C E E G L H C M S E S C E AotInf .A.......GT....A........C.A........A..CA.......... N I C V C K E G R H C T S K A C E SaiSci .A........T....A..C.....C.A........A..CA.T........ N I C I C K Q G R H C T S N A C E CalJac .A.......GT....A........C.A........A..CA.......C.. N I C V C K E G R H C T S K A C E 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CD40 GAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGA S C V L H R S C S P G F G V K Q MacMul ...........C..............T...T................... S C V P H R S C L P G F G V K Q AotInf ............... S C V L SaiSci ............... S C V L CalJac .............T. S C V L

Figura 32. Alinhamento de sequências de CD40 de A. infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) com as de M. mulatta (MacMul) e do homem (Human_ TGFβ2) depositadas no GenBank®. Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

62

Figura 33. Esquema do gene que codifica CD40.

O fragmento gênico amplificado e sequenciado de CCR5 gerado durante nosso

trabalho apresentou 593pb. O gene humano de CCR5, depositado no GenBank®, tem somente

uma grande região codificante. O grau de identidade foi elevado entre as sequências

estudadas (Tabelas 6 e 7). Os iniciadores baseados na sequência humana de CCR5

conseguiram amplificar e sequenciar somente DNA genômico de Saimiri (DQ993155), no

qual trinta e oito alterações nucleotídicas e 20 peptídicas foram encontradas em relação à

sequência humana. O alinhamento dessas sequências e o esquema do gene de CCR5 podem

ser vistos nas Figuras 34 e 35.

160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 GTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACAT V I L I L I N C K R L K S M T D I MacMul ...G...............................A.............. V V L I L I N C K R L K S M T D I SaiSci .............A............ K R L K N M T D I Saimir ...G.......T...................................... V V L I L I N C K R L K S M T D I AotTri ...G.......T...................................... V V L I L I N C K R L K S M T D I 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 CTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTTACTGTCC Y L L N L A I S D L F F L L T V MacMul ...............................C.................. Y L L N L A I S D L L F L L T V SaiSci .............T.................C........T....C.... Y L L N L A I S D L L F L F T V Saimir .............T.................C........T....CA... Y L L N L A I S D L L F L F T I AotTri ........................................T......... Y L L N L A I S D L F F L F T V 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 CCTTCTGGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAATACAATG P F W A H Y A A A Q W D F G N T M MacMul ......................T........................... P F W A H Y A A A Q W D F G N T M SaiSci ......................A.G......................... P F W A H Y A A G Q W D F G N T M Saimir ......................A.G......................... P F W A H Y A A G Q W D F G N T M AotTri ......................A.G............C............ P F W A H Y A A G Q W D F G N T M 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 TGTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTCTTCTCTGGAATCTT C Q L L T G L Y F I G F F S G I F MacMul .................................................. C Q L L T G L Y F I G F F S G I F SaiSci ......T.........CA................................ C Q F L T A L Y F I G F F S G I F Saimir ......T.........CA................................ C Q F L T A L Y F I G F F S G I F AotTri ......T........................................... C Q F L T G L Y F I G F F S G I F

63

360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 CTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTGGCTGTCGTCCATGCTG F I I L L T I D R Y L A V V H A MacMul .....................................A............ F I I L L T I D R Y L A I V H A SaiSci .......................T.TTT.........A............ F I I L L T I V F Y L A I V H A Saimir .....................................A............ F I I L L T I D R Y L A I V H A AotTri .....................................A............ F I I L L T I D R Y L A I V H A 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 TGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGGGTGGTGACAAGTGTG V F A L K A R T V T F G V V T S V MacMul ......................A........................... V F A L K A R T V T F G V V T S V SaiSci ............................G......C..C........... V F A L K A R T V T F G L L T S V Saimir ............................G..................... V F A L K A R T V T F G V V T S V AotTri .................................................. V F A L K A R T V T F G V V T S V 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 ATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTAC I T W V V A V F A S L P G I I F T MacMul ..........................C....................... I T W V V A V F A S L P G I I F T SaiSci ....................A..C..C....................C.. I T W V V A V F A S L P G I I F T Saimir ....................A.....C....................C.. I T W V V A V F A S L P G I I F T AotTri ....................AC....C....................... I T W V V A V L A S L P G I I F T 510 520 530 540 550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 CAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCAT R S Q K E G L H Y T C S S H F P MacMul .........G.G...................................... R S Q R E G L H Y T C S S H F P SaiSci ...G...............TA........G...T...C............ R S Q K E G Y H Y S C S P H F P Saimir ...G...............TA........G...T...C............ R S Q K E G Y H Y S C S P H F P AotTri ...G...............TA................C............ R S Q K E G Y H Y T C S P H F P 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 ACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACATTAAAGATAGTCATC Y S Q Y Q F W K N F Q T L K I V I MacMul ............................T..............G...... Y S Q Y Q F W K N F Q T L K M V I SaiSci C...........G................G.............G...... S S Q Y R F W K N F E T L K M V I Saimir T...........G................G.............G...... F S Q Y R F W K N F E T L K M V I AotTri T.G.........................TG.............G...... F G Q Y Q F W K N F E T L K M V I 610 620 630 640 650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 TTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAAT L G L V L P L L V M V I C Y S G I MacMul .................................................. L G L V L P L L V M V I C Y S G I SaiSci .......................C.......................... L G L V L P L L V M V I C Y S G I Saimir .......................C.......................... L G L V L P L L V M V I C Y S G I AotTri .......................CA........................C L G L V L P L L I M V I C Y S G T 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 CCTAAAAACTCTGCTTCGGTGTCGAAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTG L K T L L R C R N E K K R H R A MacMul ...G.......................C...................... L K T L L R C R N E K K R H R A SaiSci ...T.....C........................................ L K T L L R C R N E K K R H R A Saimir ...T.....C........................................ L K T L L R C R N E K K R H R A AotTri ...T.....C........................................ L K T L L R C R N E K K R H R A 710 720 730 740 750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 TGAGGCTTATCTTCACCATCATGATTGTTTATTTTCTCTTCTGGGCTCCC V R L I F T I M I V Y F L F W A P MacMul .................................................. V R L I F T I M I V Y F L F W A P SaiSci .......C...................C...................... V R L I F T I M I A Y F L F W A P Saimir .......C.......................................... V R L I F T I M I V Y F L F W A P AotTri .......C.......................................... V R L I F T I M I V Y F L F W A P

64

760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR5 TACAACATTGTCCTTCTCCTGAACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAA Y N I V L L L N T F Q E F F G L N MacMul .................................................. Y N I V L L L N T F Q E F F G L N SaiSci ...N.............. Y X I V L L Saimir ..................A.A.......A..C...T.........G.... Y N I V L L I N T Y P D F F G V N AotTri ............................A..................... Y N I V L L L N T Y Q E F F G L N

Figura 34. Alinhamento entre fragmentos de sequências do receptor 5 de quimiocina. A sequência obtida de S. sciureus (SaiSci) foi alinhada com as depositadas no banco de dados do GenBank® de S. sciureus (Saimir), A. trivirgatus (AotTri), M. mulatta (MacMul) e do homem (human_CCR5). Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 35. Esquema do gene que codifica CCR5.

Os fragmentos gênicos de CCR8 de A. infulatus (FJ589025) e S. sciureus (FJ589026)

apresentaram 635 pb. De forma semelhante ao gene de CCR5, o da quimiocina humana CCR8

também tem uma única grande região codificante; 40 alterações nucleotídicas e 14 de

aminoácidos foram achadas nas sequências de Aotus, e 37 alterações nucleotídicas e 16 de

aminoácidos foram detectadas nas sequências de Saimiri quando comparadas à sequência do

homem. Todas essas alterações aparecem distribuídas uniformemente ao longo das sequências

analisadas. Os graus de identidade entre as sequências de S. sciureus, A. infulatus e as de

outras espécies de macacos e a do homem depositadas no GenBank® podem ser observadas

nas tabelas 6 e 7. O alinhamento dessas sequências e o esquema do gene de CCR8 podem ser

vistos nas Figuras 36 e 37.

110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 GCAAGTTGCTCCTTGCTGTCTTTTATTGCCTCCTGTTTGTATTCAGTCTT G K L L L A V F Y C L L F V F S L MacMul A................................................. D K L L L A V F Y C L L F V F S L AotInf ......................................A.....T..... G K L L L A V F Y C L L F I F C L SaiSci ......................................A.....T..... G K L L L A V F Y C L L F I F C L

65

160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 CTGGGAAACAGCCTGGTCATCCTGGTCCTTGTGGTCTGCAAGAAGCTGAG L G N S L V I L V L V V C K K L R MacMul .................................................. L G N S L V I L V L V V C K K L R AotInf .................T...........C.....G.............. L G N S L V I L V L V V C K K L R SaiSci .................T...........C.....G.............. L G N S L V I L V L V V C K K L R 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 GAGCATCACAGATGTATACCTCTTGAACCTGGCCCTGTCTGACCTGCTTT S I T D V Y L L N L A L S D L L MacMul ..A.........CA.................................... N I T D I Y L L N L A L S D L L AotInf ...T...........G..T.....A......................... S I T D V Y L L N L A L S D L L SaiSci ........................A......................... S I T D V Y L L N L A L S D L L 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 TTGTCTTCTCCTTCCCCTTTCAGACCTACTATCTGCTGGACCAGTGGGTG F V F S F P F Q T Y Y L L D Q W V MacMul .................................A......T......... F V F S F P F Q T Y Y Q L D Q W V AotInf ............................T....A.....GTG........ F V F S F P F Q T Y Y Q L G E W V SaiSci ............................T....A.....GTG........ F V F S F P F Q T Y Y Q L G E W V 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 TTTGGGACTGTAATGTGCAAAGTGGTGTCTGGCTTTTATTACATTGGCTT F G T V M C K V V S G F Y Y I G F MacMul .................................................. F G T V M C K V V S G F Y Y I G F AotInf ...........................................C...... F G T V M C K V V S G F Y Y T G F SaiSci ....................G............................. F G T V M C K V V S G F Y Y I G F 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 CTACAGCAGCATGTTTTTCATCACCCTCATGAGTGTGGACAGGTACCTGG Y S S M F F I T L M S V D R Y L MacMul .................................................. Y S S M F F I T L M S V D R Y L AotInf ..T.......................................A....... F S S M F F I T L M S V D R Y L SaiSci ..T............................................... F S S M F F I T L M S V D R Y L 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 CTGTTGTCCATGCCGTGTATGCCCTAAAGGTGAGGACGATCAGGATGGGC A V V H A V Y A L K V R T I R M G MacMul .......................A....A..................... A V V H A V Y A I K V R T I R M G AotInf .C........C............A....A..................... A V V H A V Y A I K V R T I R M G SaiSci .CA.......C............A....A..................... A I V H A V Y A I K V R T I R M G 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 ACAACGCTGTGCCTGGCAGTATGGCTAACCGCCATTATGGCTACCATCCC T T L C L A V W L T A I M A T I P MacMul .....CACCCTGAGCCTGC..GTATGGCTAA..GCC..TATGG.T.C.AT T T T L S L L V W L T A I M A T I AotInf ...GTC...A....................T................... T V L S L A V W L T S I M A T I P SaiSci ...GTC...A....................T................... T V L S L A V W L T S I M A T I P 510 520 530 540 550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 ATTGCTAGTGTTTTACCAAGTGGCCTCTGAAGATGGTGTTCTACAGTGTT L L V F Y Q V A S E D G V L Q C MacMul CCCAT.GC.AG.G.TTT.CCAA.TGG.CTCT..A.A..G.G.T.TACAG. P L L V F Y Q V A S E D G V L Q AotInf .C..............................................CG L L V F Y Q V A S E D G V L Q C SaiSci .C....................A.........................CG L L V F Y Q V T S E D G V L Q C 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 ATTCATTTTACAATCAACAGACTTTGAAGTGGAAGATCTTCACCAACTTC Y S F Y N Q Q T L K W K I F T N F MacMul G..AT.CA.TTT.CA.T..ACAGACTTT.AA.TG..AGA..TT..C.AA. C Y S F Y N Q Q T L K W K I F T N AotInf ......C................C.........................T D S S Y N Q Q T L K W K I F T N F SaiSci ......C................C.........................T D S S Y N Q Q T L K W K I F T N F 610 620 630 640 650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 AAAATGAACATTTTAGGCTTGTTGATCCCATTCACCATCTTTATGTTCTG K M N I L G L L I P F T I F M F C MacMul TTTGAA.TG.ACA.TTTAGGC...T.GATCCCATT..C.A.CT.TA.G.T F E M N I L G L L I P F T I F M F AotInf G..........C..............A........TG............. E M N I L G L L I P F T V F M F C SaiSci G..........C...............................CA..... E M N I L G L L I P F T I F T F C

66

660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 CTACATTAAAATCCTGCACCAGCTGAAGAGGTGTCAAAACCACAACAAGA Y I K I L H Q L K R C Q N H N K MacMul ..G.TAC.TT.AAA.C.TG..C.A.CT..A.A.GTGTC.AA..C....C. C Y I K I L H Q L K R C Q N H N AotInf ............T..................................... Y I K I L H Q L K R C Q N H N K SaiSci ............T..................................... Y I K I L H Q L K R C Q N H N K 710 720 730 740 750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_CCR8 CCAAGGCCATCAGGTTGGTGCTCATTGTGGTCATTGCATCTTTACTTTTC T K A I R L V L I V V I A S L L F MacMul AG.CCAAGGC..TCAG.T..G.GC.CA.T..GG.CATTG.A.CTT.AC.T K T K A I R L V L I V V I A S L L AotInf .........C....C..................... T K A T R L V L I V V I SaiSci .........C....C..................... T K A T R L V L I V V I

Figura 36. Alinhamento entre sequências de CCR8 de A. infulatus (AotInf), S. sciureus (SaiSci), M. mulatta (MacMul) e a do homem (Human_CCR8). Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 37. Esquema do gene que codifica o CCR8.

O fragmento amplificado e sequenciado de BAX apresentou 191pb. Este fragmento

corresponde às posições compreendidas de 43pb a 234pb em relação à sequência humana de

RNA mensageiro do gene de BAX. Esse gene tem somente a sequência humana depositada no

banco de dados do GenBank®. O grau de identidade foi de 98% entre as sequências de Aotus

e Saimiri. Os demais valores desse parâmetro podem ser vistos nas tabelas 6 e 7. Na análise

do fragmento nucleotídico de BAX foram achadas quatro alterações nas sequências

nucleotídicas e duas nas de aminoácidos no caso do amplicon de Aotus (DQ989370). A

sequência de Saimiri (DQ989371) apresentou três alterações na sequência nucleotídica e uma

alteração na de aminoácidos quando comparadas à mesma sequência humana. O alinhamento

dessas sequências e o esquema do gene de BAX podem ser vistos nas Figuras 38 e 39.

10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_BAX ATGGACGGGTCCGGGGAGCAGCCCAGAGGCGGGGGGCCCACCAGCTCTGA M D G S G E Q P R G G G P T S S E MacMul AotInf ........ S S E SaiSci ........ S S E

67

60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_BAX GCAGATCATGAAGACAGGGGCCCTTTTGCTTCAGGGTTTCATCCAGGATC Q I M K T G A L L L Q G F I Q D MacMul AotInf .................................................. Q I M K T G A L L L Q G F I Q D SaiSci .................................................. Q I M K T G A L L L Q G F I Q D 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_BAX GAGCAGGGCGAATGGGGGGGGAGGCACCCGAGCTGGCCCTGGACCCGGTG R A G R M G G E A P E L A L D P V MacMul ...............A.......................... R M G G E T P E L A L D P V AotInf .............T.........A.......................... R A G R I G G E T P E L A L D P V SaiSci .............C.................................... R A G R I G G E A P E L A L D P V 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_BAX CCTCAGGATGCGTCCACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTCTCAAGCGCATCGG P Q D A S T K K L S E C L K R I G MacMul ......................G........................... P Q D A S T K R L S E C L K R I G AotInf ..C............................................... P Q D A S T K K L S E C L K R I G SaiSci ..C............................................... P Q D A S T K K L S E C L K R I G 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Human_BAX GGACGAACTGGACAGTAACATGGAGCTGCAGAGGATGATTGCCGCCGTGG D E L D S N M E L Q R M I A A V MacMul .......... D E L AotInf ......G........................... D E L D S N M E L Q R SaiSci A................................. D E L D S N M E L Q R

Figura 38. Alinhamento de fragmento de sequências do gene pró-apoptótico BAX (proteína X associada a BCL2). As sequências obtidas de macacos A, infulatus (AotInf) e S. sciureus (SaiSci) foram alinhadas com as de M. mulatta (MacMul) e do homem depositadas no GenBank® (Human_BAX). Em negrito: A, adenina; G, guanina; C, citosina; T, timina. Pontos (dots) significam semelhanças entre sequências nucleotídicas. As letras em caixa-alta significam os nomes abreviados de aminoácidos.

Figura 39. Esquema do gene que codifica a BAX.

68

Desenho e validação de iniciadores baseados nas sequências de Saimiri e Aotus para

estudos de expressão gênica usando como ferramenta a PCR-RTq

PCR em tempo real quantitativo (PCR-TRq ou qRT-PCR)

Com base nos dados de sequência obtidos na primeira fase do trabalho, partimos para

o desenho de pares de iniciadores para PCR-TRq. Inicialmente, foram desenhados pares de

iniciadores para sete das 17 sequências obtidas, a saber: IFNγ, IL12, TNF, IL2, IL6, IL10 e

LTA. Para verificar se os iniciadores amplificam somente um fragmento e determinar a

eficiência dos iniciadores para a amplificação de DNA alvo de Saimiri foram feitos ensaios de

PCR-RTq usando cDNA de PBMC não-estimuladas de Saimiri. Os dados obtidos dessas

reações foram essenciais para: i) mostrar que os iniciadores desenhados a partir de sequências

de Aotus e Saimiri amplificam transcritos de Aotus e Saimiri; as curvas referentes à

amplificação das amostras utilizadas como controle negativo não ultrapassaram o threshold

(linha verde horizontal do gráfico, figura 40); ii) mostrar que os iniciadores desenhados a

partir de regiões comuns nas sequências de Aotus e Saimiri amplificam somente transcritos

desejados para cada par testado, sem a ocorrência de amplificações inespecíficas, como o

evidenciado na figura 41, na qual somente um pico de amplificação para cada iniciadores é

exibido; iii) mostrar que os iniciadores baseados nas sequências de Aotus e Saimiri tem boa

eficiência de amplificação, dobrando o conteúdo de cDNA a cada ciclo de reação; valor de R2

sempre próximo de 1 (Figura 42).

69

Figura 40. Gráficos de amplificação importantes na verificação da funcionabilidade dos iniciadores testados durante a PCR-TRq. A linha horizontal verde representa o limite para que a amplificação de transcritos seja considerada significativa. As amostras que não amplificam porque não existe o transcrito desejado na amostra testada, não ultrapassam o threshold de forma semelhante ao controle sem cDNA.

70

Figura 41. Gráficos de curva de dissociação importantes como controle de qualidade de iniciadores usados em reações de PCR-TRq. Um único pico de amplificação significa a especificidade da reação.

71

Figura 42. Gráficos de curva padrão importantes na determinação da eficiência dos iniciadores testados durante a PCR-TRq. R2 deve ter valor o mais próximo possível de 1 para que a eficiência do par de iniciadores seja considerada próxima a 100% (duplicação da quantidade de material, cDNA ou DNA, a cada ciclo de PCR).

Para validar os iniciadores de PCR-TRq e testar o efeito da ativação celular sobre a

indução da transcrição desses genes foi utilizado um sistema de cultivo in vitro de PBMCs de

Saimiri estimuladas ou não por mitógenos (ionomicina/PMA). As células foram separadas por

gradiente de Ficoll histopaque (Sigma) e foram mantidas em cultivo in vitro por 2, 4, 6, 8, 12

e 18 horas sob estimulação dos mitógenos ionomicina e PMA. A figura 43 exemplifica os

resultados de três experimentos independentes. Com exceção de IL12, foi possível detectar

transcritos nas citocinas testadas – IFNγ, IL10, IL2 e TNF - em todos os tempos, inclusive

após duas horas e, para todas, o tempo de maior expressão gênica dessas citocinas foi após

seis horas de cultivo celular. Esse resultado nos guiou para a escolha do tempo de seis horas

72

para a estimulação com antígenos derivados de P. falciparum no experimento de infecção

(ver adiante). Independente do período analisados, ficou claro que o sistema de detecção por

PCR-TRq é um método rápido (duas horas de reação no nosso caso ou até mesmo 40 minutos,

no caso de um sistema mais sofisticado) e sensível para a quantificação de transcritos.

Figura 43. Cinética de expressão gênica de IFNγ, IL10, IL2, IL12 e TNF em PBMC de S. sciureus cultivadas por 2, 4, 6, 8, 12 e 18 horas sob estimulação dos mitógenos ionomicina/PMA. Os valores no eixo Y representam o aumento relativo da expressão de cada gene em relação ao valor 1 referente ao RNA extraído de PBMCs antes do cultivo celular.

Experimento de Infecção

De posse de pares de iniciadores funcionais em PCR-TRq, partimos para um

experimento de infecção de S. sciureus por P. falciparum. Esse experimento teve por

objetivo: 1) avaliar o funcionamento dos pares de iniciadores desenvolvidos para as sete

citocinas (IFNγ, IL2, IL6, IL10, IL12, LTA e TNF) e, consequentemente, o tipo de resposta

imune gerada durante a infecção plasmodial; 2) fazer tais avaliações em macacos Saimiri não-

esplenectomizados, confirmando a viabilidade desse modelo de infecção e gerando dados

originais e; 3) avaliar as alterações estruturais no baço e comparar com aquelas encontradas

na infecção humana e em modelos murinos de infecção malárica, de modo a avançar na

caracterização do modelo Saimiri e confirmar sua adequação para estudos em malária. Para

esse fim, e com uma disponibilidade restrita de animais, nosso desenho experimental

consistiu em infectar seis animais adultos, nascidos em cativeiro, não esplenectomizados, com

um inóculo elevado de hemácias parasitadas por P. falciparum nos dias 7, 14 e 28 pós-

0,1

1

10

100

1000

10000

2h 4h 6h 8h 12h 18h

valores de ex

press

ão gên

ica

IF Ng

IL10

IL2

IL12

TNF

73

inoculação, coletar o baço (dois animais infectados e um controle não infectado em cada

ponto) para análise histopatológica e de expressão gênica das citocinas. A figura 44 mostra

que o modelo não esplenectomizado é viável para indução de parasitemias consistentes, que

alcançaram cerca de 10% com nove a 13 dias de infecção. Uma vez que no dia 14 os baços de

quatro dos seis animais infectados já haviam sido coletados, e uma vez que os dois animais

remanescentes apresentaram hematócrito abaixo de 25% (Figura 45), decidimos por tratar

esses dois animais também no dia 14. O baço desses dois animais, como previsto, foi retirado

no dia 28 pós-inoculação. Os resultados de expressão gênica das citocinas foram disponíveis

para os esplenócitos obtidos nos dias 7 e 28; não foi possível obter os esplenócitos no dia 14

devido a intensa congestão do órgão e adesividade das células intensamente ativadas, que

geraram “grumos” e debris impossibilitando a separação celular.

0.01

0.1

1

10

100

d2 d6 d9 d13

dias após a   infecção

paras

item

ia % infectado 1

infectado 2

infectado 3

infectado 4

infectado 5

infectado 6

Figura 44. Cinética de parasitemia nos S. sciureus não-esplenectomizados após a infecção com 5x107 hemácias parasitadas/mL pela cepa FUP de P. falciparum. Infectados 1 e 2 foram esplenectomizados com sete dias de infecção, infectados 3 e 4 foram esplenectomizados com 14 dias de infecção e, infectados 5 e 6 foram esplenectomizados com 28 dias de infecção.

74

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

d0 d6 d9 d13 d16 d23

dias após a   infecção

hem

atócrito % infectado 1

infectado 2

infectado 3

infectado 4

infectado 5

infectado 6

Figura 45. Acompanhamento de hematócrito nos S. sciureus não-esplenectomizados após a infecção com 5x107 hemácias parasitadas/mL pela cepa FUP de P. falciparum. Infectados 1 e 2 foram esplenectomizados com sete dias de infecção, infectados 3 e 4 foram esplenectomizados com 14 dias de infecção e, infectados 5 e 6 foram esplenectomizados com 28 dias de infecção.

Investigação da expressão gênica de citocinas (IFNγ, IL2, IL6, IL10, IL12, LTA e TNF)

em células do baço de S. sciureus infectados por P. falciparum

As células do baço (2x106 células/mL) dos animais foram cultivadas in vitro sob

seguintes condições: i) cultivo de P. falciparum (hemácias infectadas); ii) parasitas livres de

P. falciparum ; iii) antígenos de P. falciparum e; iv) hemácias humanas. Após período de seis

horas de cultivo celular, fez-se a extração de RNA e síntese de cDNA. As reações de PCR-

TRq foram realizadas com iniciadores diretos e reversos para detecção de: interferon gama

(IFNγ), interleucina 2 (IL2), interleucina 6 (IL6), interleucina 10 (IL10), interleucina 12p40

(IL12B), linfotoxina A (LTA ou TNF-β) e fator de necrose tumoral (TNF). Os transcritos de

beta actina (β-actina) foram usados como controle-interno das reações (controle endógeno).

Com sete dias de infecção, a citocina induzida mais fortemente após estimulação in

vitro foi IFNγ que, em células estimuladas por hemácias parasitadas por P. falciparum,

atingiu níveis de expressão 100 vezes maior do que células de animais controles não-

estimuladas (Figura 46A). Parasitas livres tiveram efeito bem mais modesto e, uma vez que

estimularam níveis de expressão de IFNγ semelhantes em células de animais controles, é

possível que esse efeito tenha sido causado mais por um efeito mitogênico do que por

estimulação antigênica. Antígeno solúvel de P. falciparum estimulou fracamente a expressão

de IFNγ. Hemácias humanas não parasitadas utilizadas como controle não induziram a

expressão dessa citocina. É importante lembrar que as hemácias parasitadas, parasitas livres e

75

antígeno solúvel, todos tem a mesma origem (cultivo in vitro de P. falciparum). Isso

demonstra que o tipo de antígeno utilizado é fundamental na determinação das respostas de

células in vitro. É importante notar também que células de animais com sete dias de infecção

sem nenhuma estimulação antigênica expressam níveis aumentados de IFNγ.

Outras citocinas características de resposta do tipo Th1 como IL2 (Figura 47), TNF

(Figura 51) e LTA (Figura 52) apresentaram níveis modestos ou não alterados de expressão

em células de animais com sete dias de infecção, qualquer que tenha sido o estímulo utilizado.

Dessas três citocinas, apenas TNF apresentou um nível razoável de expressão nas células

estimuladas com hemácias parasitadas ou parasitas livres (Figura 51), mas é preciso levar em

consideração que esses antígenos estimularam também, embora em menor intensidade, a

expressão dessa citocina em células de animais controles. Outra citocina pró-inflamatória,

IL6, apresentou níveis de expressão bastante aumentados, em células estimuladas com

hemácias parasitadas ou parasitas livres (Figura 48). A expressão elevada de algumas

citocinas de perfil Th1 ou pró-inflamatórias parece consistente com uma expressão elevada

também de IL12 (Figura 50) em células estimuladas com hemácias parasitadas. IL12 é uma

citocina crucial na fase inata da resposta imune e reconhecida por direcionar a resposta imune

para o perfil inflamatório. Por outro lado, a expressão de IL10, citocina tipicamente

relacionada a respostas do tipo Th2, foi bastante modesta (Figura 49).

Com 28 dias de infecção, o perfil de expressão mudou radicalmente. Todas as

citocinas estudadas, com exceção de LTA que apresentou um pequeno aumento de expressão,

apresentaram níveis de expressão similares ou mais baixos em células de animais infectados

que em células de animais controles, quando estimuladas com os diferentes antígenos de P.

falciparum (Figuras 46 a 52). Assim, de maneira interessante, com exceção de IFNγ, todas as

citocinas apresentaram aumento de expressão em células não estimuladas de animais

parasitados.

Os ensaios de estimulação in vitro cujos resultados foram descritos acima foram

conduzidos com esplenócitos frescos, processados logo após a esplenectomia dos animais.

Parte das células foi também congelada em DMSO/SBF em N2 e os mesmos ensaios foram

realizados quatro meses depois se utilizando os mesmos protocolos. O objetivo era definir se

seria factível e adequado utilizar tais protocolos de congelamento para facilitar a manipulação

em experimentos futuros. Entretanto, podemos observar na Figura 53 que a utilização das

células recuperadas de congelamento não produziu resultados satisfatórios em relação aqueles

obtidos com células frescas.

76

Figura 46. Expressão de IFNγ em células do baço de seis animais infectados por P. falciparum estimuladas in vitro pela presença de hemácias parasitadas, parasitas livres ou hemácias humanas (média±DP), e de dois animais controles não infectados. Os valores de expressão gênica são relativos à quantificação da expressão gênica de IFNγ em PBMC dos animais controles não infectados esplenectomizados nos dias sete e 28 após a infecção (d7 e d28), e mantidos em cultivo in vitro pelo tempo de seis horas sem estímulos antigênico ou mitogênico. Com: presença de estímulo antigênico; Sem: ausência de estímulo antigênico no meio de cultivo.

esplenectomia em d7  esplenectomia em d28 

77

Figura 47. Expressão de IL2 em células do baço de seis animais infectados por P. falciparum estimuladas in vitro pela presença de hemácias parasitadas, parasitas livres ou hemácias humanas (média±DP), e nas PBMC de dois animais controles não infectados. Os valores de expressão gênica são relativos à quantificação da expressão gênica de IFNγ em PBMC dos animais controles não infectados esplenectomizados nos dias sete e 28 após a infecção (d7 e d28), e mantidos em cultivo in vitro pelo tempo de seis horas sem estímulos antigênico ou mitogênico. Com: presença de estímulo antigênico; Sem: ausência de estímulo antigênico no meio de cultivo.

esplenectomia em d7  esplenectomia em d28 

78

Figura 48. Expressão de IL6 em células do baço de seis animais infectados por P. falciparum estimuladas in vitro pela presença de hemácias parasitadas, parasitas livres ou hemácias humanas (média±DP), e nas PBMC de dois animais controles não infectados. Os valores de expressão gênica são relativos à quantificação da expressão gênica de IFNγ em PBMC dos animais controles não infectados esplenectomizados nos dias sete e 28 após a infecção (d7 e d28), e mantidos em cultivo in vitro pelo tempo de seis horas sem estímulos antigênico ou mitogênico. Com: presença de estímulo antigênico; Sem: ausência de estímulo antigênico no meio de cultivo.

esplenectomia em d7  esplenectomia em d28 

79

Figura 49. Expressão de IL10 em células do baço de seis animais infectados por P. falciparum estimuladas in vitro pela presença de hemácias parasitadas, parasitas livres ou hemácias humanas (média±DP), e nas PBMC de dois animais controles não infectados. Os valores de expressão gênica são relativos à quantificação da expressão gênica de IFNγ em PBMC dos animais controles não infectados esplenectomizados nos dias sete e 28 após a infecção (d7 e d28), e mantidos em cultivo in vitro pelo tempo de seis horas sem estímulos antigênico ou mitogênico. Com: presença de estímulo antigênico; Sem: ausência de estímulo antigênico no meio de cultivo.

esplenectomia em d7 esplenectomia em d28 

80

Figura 50. Expressão de IL12 em células do baço de seis animais infectados por P. falciparum estimuladas in vitro pela presença de hemácias parasitadas, parasitas livres ou hemácias humanas (média±DP), e nas PBMC de dois animais controles não infectados. Os valores de expressão gênica são relativos à quantificação da expressão gênica de IFNγ em PBMC dos animais controles não infectados esplenectomizados nos dias sete e 28 após a infecção (d7 e d28), e mantidos em cultivo in vitro pelo tempo de seis horas sem estímulos antigênico ou mitogênico. Com: presença de estímulo antigênico; Sem: ausência de estímulo antigênico no meio de cultivo.

esplenectomia em d7  esplenectomia em d28 

81

Figura 51. Expressão de TNF em células do baço de seis animais infectados por P. falciparum estimuladas in vitro pela presença de hemácias parasitadas, parasitas livres ou hemácias humanas (média±DP), e nas PBMC de dois animais controles não infectados. Os valores de expressão gênica são relativos à quantificação da expressão gênica de IFNγ em PBMC dos animais controles não infectados esplenectomizados nos dias sete e 28 após a infecção (d7 e d28), e mantidos em cultivo in vitro pelo tempo de seis horas sem estímulos antigênico ou mitogênico. Com: presença de estímulo antigênico; Sem: ausência de estímulo antigênico no meio de cultivo.

esplenectomia em d7  esplenectomia em d28 

82

Figura 52. Expressão de LTA em células de baço de seis animais infectados por P. falciparum e de animais-controle não-infectados, estimuladas in vitro pela presença de hemácias parasitadas, parasitas livres e hemácias humanas (média±DP). Os valores de expressão gênica são relativos à quantificação de expressão gênica de LTA em esplenócitos dos animais controle não infectados esplenectomizados com sete e 28 dias após a infecção (d7), e mantidos em cultivo in vitro pelo tempo de seis horas sem qualquer estímulo antigênico ou mitogênico. Com: significa presença de estímulo antigênico; Sem: significa ausência de estímulo antigênico no meio de cultivo.

esplenectomia em d7  esplenectomia em d28 

83

Figura 53. Expressão de IFNγ, IL2, IL6, IL10, IL12, LTA e TNF em células do baço de S.

sciureus. As células de animais esplenectomizados em d7, animais infectados e animal

controle, foram descongeladas e 2x106 células/mL foram cultivadas in vitro sob estimulação

antigênica (parasitas livres) e mitogênica (ionomicina e PMA).

84

Análise da arquitetura esplênica de S. sciureus infectados e não infectados

O baço dos animais controles não infectados mostrou as polpas branca e vermelha

com limites bem definidos (Figura 54A) com bainha linfóide periarteriolar (PALS) contendo

folículos de células B residentes (infiltrado de centroblastos ou germinoblastos, poucos

centrócitos ou germinócitos, algumas células dendríticas foliculares e células

polimorfonucleares), zona do manto (linfócitos B pequenos) e zona marginal (área de

macrófagos da zona marginal, macrófagos metalofílicos e linfócitos B), como ilustrado na

Figura 54B. A polpa vermelha apresentava aspecto normal e predominava em relação à polpa

branca.

No dia sete após a infecção (d7), o aspecto das polpas branca e vermelha ainda mostra

limites claros nas bordas. No entanto, pode-se observar uma deposição de manchas marrons

na polpa vermelha, o que é sugestivo da presença de hemozoína (Figura 54C). A polpa branca

apresenta muitos centroblastos, muitos pontos de ocorrência de mitoses, zona do manto bem

definida evidenciando centrócitos e centroblastos com forte aspecto basofílico (Figura 54D).

No dia 14 após a infecção, foi observado que a polpa branca ocupava ainda porção

significante do órgão. O parênquima do baço apresentou uma desestruturação da sua

arquitetura normal com perda do centro germinativo, zona do manto e zona marginal (Figura

54E). Foi observada uma extensiva congestão dos sinusóides, infiltração de eritrócitos dentro

da polpa branca e uma grande quantidade de depósitos sugestivos de hemozoína na polpa

vermelha (Figura 54F). A polpa branca estava povoada com centroblastos, células apoptóticas

e pequenos linfócitos que migram para dentro da polpa branca devido à perda da zona do

manto que circunda os centros germinativos (Figura 55A).

No dia 28 após a infecção, os animais já foram tratados (d14) e o parênquima do baço

apresentou uma ligeira recuperação da arquitetura normal desse órgão, mas com a polpa

branca ocupando quase que totalmente o estroma esplênico (Figuras 55B/D). Estavam

presentes alguns focos de plasmacitogênese, células apoptóticas, centroblastos, poucos

centrócitos e depósitos de hemozoína nos macrófagos (Figura 55C).

85

Figure 54. Análise histopatológica de baço de S. sciureus infectado com 5x107 hemácias parasitadas/µL pela cepa FUP de P. falciparum e do baço de animal controle não infectado. As esplenectomias foram realizadas nos dias 7, 14 e 28 após a infecção sanguínea. Seções foram cortadas (5µm), coradas com Giemsa, e analisadas ao microscópio óptico. (A) Arquitetura esplênica de animal controle não infectado mostrando polpa vermelha e polpa branca com aspectos normais (resolução x 100). (B) Organização da arquitetura da polpa branca do baço de animal controle não infectado mostrando folículo de células B, zona do manto e zona marginal (resolução x 400). (C) Baço de animal infectado esplenectomizado sete dias após a infecção sanguínea mostrando centro germinal aumentado de tamanho delimitado por uma zona do manto escura e uma delgada zona marginal Na polpa vermelha pode-se observar deposição grumos de cor marrom, sugestivos de hemozoína (resolução x 100). (D) No dia sete a polpa branca apresentou intensa ativação celular evidenciada por focos de ocorrência de mitoses dentro do centro germinal (resolução x 400). (E) No dia 14 foi observado aumento do tamanho da polpa branca com evidente perda dos limites com a zona do manto (resolução x 100). (F) No dia 14 foi observada também uma intensa área de congestão de eritrócitos (resolução x 100).

A B

C D

E F

86

Figure 55. Análise histológica de baços de S. sciureus infectado pela cepa FUP de P. falciparum (5x107 hemácias parasitadas/µL) e não infectado. As esplenectomias foram realizadas nos dias 14 e 28 após a infecção sanguínea. Seções foram cortadas (5µm), coradas com Giemsa, e analisadas ao microscópio óptico. (A) No dia 14 a zona do manto já não era mais evidenciada na polpa branca, ocorreu um aumento de focos de células em divisão celular com presença de muitos centroblastos, e não se pode mais evidenciar um centro germinativo (resolução x 400). (B) No dia 28 a polpa branca ocupou quase que a totalidade do estroma esplênico e ocorreu intensa deposição de grumos de coloração marrom na polpa vermelha, sugestivos de hemozoína (resolução x 100). (C) No dia 28 observou-se também um princípio de recuperação da arquitetura normal do baço, mas ainda com uma definição imprecisa entre as zonas da polpa branca: PALS, centro germinal, zona do manto e zona marginal (resolução x 400). (D) No dia 28 observou-se ainda congestão intensa da polpa esplênica vermelha com extensiva acumulação de pigmentos sugestivos de hemozoína (resolução x 100).

A B

C D

87

Discussão

A malária é reconhecida como grave problema de saúde pública, sendo a doença

parasitária mais importante nos países em desenvolvimento da região tropical do globo

(Riley, 2000; Rogers & Randolph, 2000; Carvalho, Daniel-Ribeiro & Goto, 2002). Uma

medida importante para diminuir o impacto da doença seria o desenvolvimento de uma vacina

eficaz contra o parasita e suas complicações, o que requer, entretanto, um conhecimento

aprofundado dos mecanismos de aquisição de imunidade, que são em grande parte

desconhecidos na malária humana (Greenwood, 1987; Holder, 1999; Anders & Saul, 2000;

Miller et al., 2002; Carvalho, Daniel-Ribeiro & Goto, 2002). Isso se deve em grande parte ao

fato de que estudos em humanos, além de altamente complexos, são restritos em função de

limitações éticas quanto às abordagens possíveis de serem conduzidas (Huang & Hadian,

2006; Legrand, Weijer & Spits, 2006). Abordagens epidemiológicas em estudos

populacionais são as mais utilizadas, mas devido ao grande número de variáveis de confusão

comumente presentes em tais estudos, torna-se difícil a identificação da natureza dos

mecanismos de imunidade ou patogenia envolvidos. Para contornar as limitações de

abordagens em humanos, lança-se mão de modelos experimentais, tais como os camundongos

(Lackner et al., 2008; Purcell et al., 2008). No entanto, estudos feitos em modelos

filogeneticamente mais próximos ao homem apresentam maior potencial de gerar resultados

extrapoláveis para humanos. Os modelos ideais seriam os chimpanzés, por sua estreita relação

filogenética com o homem. Porém, esses animais são muito agressivos, difíceis de criar em

cativeiro e estão intensamente ameaçados de extinção. Tais características são totalmente

antagonitas quando se fala em primatas neotropicais. Dessa forma, o uso dos primatas

neotropicais Aotus e Saimiri em pesquisas experimentais em malária é uma boa alternativa

para gerar dados informativos sobre o desenvolvimento da doença, respostas imunes e

geração de patogenia na malária (WHO 1988; Kennedy, Shearer & Hildebrand, 1997;

Kennedy et al., 1997; Herrera et.al., 2002).

Apesar de macacos Aotus e Saimiri ainda serem os modelos mais recomendados para

estudos experimentais com plasmódios responsáveis pelas malárias humanas, existe uma

carência de informação sobre estes modelos que podem ser fatores limitantes na sua utilização

em estudos de aquisição de imunidade e de mecanismos de patogenia na malária e em ensaios

pré-clínicos vacinais. Essa limitação inclui a carência de ferramentas imunológicas e

moleculares específicas para Aotus e Saimiri que permitam estudos fidedignos sobre a

88

resposta imune durante imunizações e infecções, o que restringe a utilização desses modelos

para a avaliação de eventos imunológicos para se melhor compreender os mecanismos de

aquisição de imunidade e de geração de patogenia.

O Laboratório de Pesquisas em Malária vem há vários anos trabalhando com os

modelos simianos Saimiri e Aotus em estudos vacinais e de patologia na malária, e percebeu a

dificuldade de acessar de maneira apropriada as respostas imunes geradas após imunizações

e/ou durante infecções experimentais por P. falciparum. Essa dificuldade é compartilhada por

outros grupos trabalhando com esses modelos e explica porque em muitos estudos vacinais,

por exemplo, as avaliações de imunogenicidade nesses modelos são limitadas essencialmente

à resposta humoral (Burghaus et al., 1996; Kocken et al., 1998; Moreno et al., 1999; Stowers

et al., 2001; Jones et al., 2002; Baruch et al., 2002; Hisaeda et al., 2002; Lyon et al., 2008).

Ainda assim, mesmo análises mais refinadas de resposta humoral, como a definição de

subclasses de anticorpos, não são possíveis devido à ausência de reagentes adequados.

Apesar da evidente necessidade de dispor de reagentes específicos para otimizar

nossos estudos, o desenvolvimento de reagentes imunológicos como anticorpos poli ou

monoclonais contra citocinas, por exemplo, exige pesado investimento financeiro e de

recursos humanos. O grupo do Instituto Pasteur de Cayenne, por exemplo, investiu vários

anos do desenvolvimento de anticorpos monoclonais para detecção de subclasses de IgG de

Saimiri, tendo obtido sucesso bastante parcial. Em vista de importantes avanços nos últimos

anos na área de biologia molecular, com o desenvolvimento de metodologias de alta

capacidade de geração e análise de dados, como sequenciamento de DNA, microarranjos e

PCR-TRq por exemplo, decidimos investir na abordagem molecular por considerá-la um

caminho mais rápido e com maiores chances de sucesso na obtenção de ferramentas

consistentes de análise imunológica. Entre as possibilidades existentes, o PCR-TRq surgiu

como a melhor opção para quantificação dos produtos de interesse, por permitir a detecção de

transcritos com sensibilidade, rapidez, de forma quantitativa e com custo razoável (Freeman,

Stephen & Vrana 1999; User Belletin #2 ABI Prism 7700 SDS, 2001; Livak & Schmittgen,

2001; Schouten et al., 2002; Vaerman, Saussoy & Ingargiola, 2004; Bustin et al., 2005;

Skern, Frost & Nilsen, 2005; Dussault & Pouliot, 2006; Hellemans et al., 2007).

A opção pelo desenvolvimento de reagentes moleculares tem sido seguida por

pesquisadores que trabalham com Saimiri e Aotus. Para isso, esses grupos fizeram o

sequenciamento de genes codificadores de moléculas envolvidas na resposta imune, tais como

citocinas, fator sanguíneo Duffy, receptores de células T, imunoglobulina e receptor toll,

encontrando graus de identidade que embora variassem eram sempre acima de 80%.

89

Como por exemplo, Heraud e colaboradores (2002) encontraram graus de identidade

de 91,4% a 98,1%, entre as sequências de IL1β, IL2, IL5, IL6, IL10, IFNγ e TNF de S.

sciureus e as de outros primatas não-humanos e do homem. Hernández et al. (2002)

estudaram algumas citocinas de A. nancymaae, A. vociferans, A. nigriceps e A. l.

griseimembra e também encontraram elevado grau de identidade de sequência (91% a 100%)

entre as mesmas espécies citadas anteriormente. Chaudhuri et al. (1995) encontraram 93% de

grau de identidade entre A. trivirgatus e humanos em relação a sequência codificante do gene

do fator sanguíneo Duffy. Favre et al. (1998) estudando a diversidade dos genes que

codificam os receptores de células T encontraram grau de identidade de 80% entre as

sequências homólogas de A. nancymaae e humana. Diaz et al. (2000) constataram grau de

identidade que variou de 83% a 92% entre A. nancymaae e o homem para as sequências do

gene que codifica a cadeia leve de imunoglobulinas. Montoya, Vernot & Patarroyo (2004)

observaram 90% a 92% de grau de identidade entre Aotus nancymaae, A. vociferans, A.

nigriceps e o homem para a sequência de CD45. Hernández et al. (2005) observaram 91% de

identidade para o gene que codifica a porção variável da cadeia pesada de imunoglobulinas

entre A. nancymaae e o homem. Spirig et al. (2005) verificaram 93% de identidade entre A.

nancymaae e o homem para a sequencia do receptor 9 de Toll.

Entretanto, já foram observadas graus de identidade relativamente baixos entre Aotus

nancymaae e o homem, quando se analisou a sequência e a expressão de moléculas como

MHC-DPB1 (Diaz et al., 2002), o gene que codifica o receptor para células T (Guerrero et al.,

2003; Moncada et al., 2005).

Em geral, dois pontos relevantes podem ser destacados nos trabalhos citados acima: i)

a utilização de sequências humanas como molde para o desenho de iniciadores diretos e

reversos para Saimiri e Aotus, mostrou-se adequada, pois conseguiram obter produtos de

amplificação e; ii) a estratégia utilizada por esses grupos para sequenciar os genes de Saimiri

e Aotus baseou-se na estimulação in vitro de PBMC com mitógenos para geração de

transcritos das citocinas utilizando iniciadores desenhados para genes humanos e obtenção de

cDNA para sequenciamento. Além do problema da complementariedade entre as sequências

humanas e as dos primatas não-humanos, essa estratégia envolve um risco que é a não

obtenção de transcritos por estimulação inadequada pelo mitógeno, como é comum para IL4

(North et al., 1996; Paul, 1997; Haddad, Bienvenu & Miossec, 1998; Nair et al., 2002; Au-

Yeung & Fowell, 2007). Assim, nossa abordagem para amplificação e sequenciamento

usando DNA genômico e não cDNA tem certa vantagem, pois não existe a necessidade de

estimulação prévia para obtenção de amplificados nas reações de PCR.

90

Nossa opção por desenvolver nossos próprios reagentes específicos para estudo de

expressão gênica, ao invés de utilizar reagentes humanos ou aqueles de Saimiri e Aotus já

desenvolvidos por outros grupos, foi baseada nos seguintes fatos:

- a utilização de pares de iniciadores humanos para detecção de transcritos de citocinas

de Saimiri ou Aotus por PCR-TRq incorre no risco de obtenção de resultados falsos negativos.

Esse risco parece justificar a existência do número reduzido de trabalhos feitos com pares de

iniciadores humanos para avaliar a resposta celular em experimentos com Saimiri e Aotus

(Diaz et al., 2002; Kazanji et al., 2006).

- os pares de iniciadores para detecção de citocinas Th1 e Th2 descritos na literatura

foram desenhados para espécies ou subespécies diferentes das utilizadas por nós (Heraud,

Lavergne & Kazanji, 2002, Hernandez et al., 2002; Coaña et al., 2004) e, em testes prévios

realizados em nosso Laboratório com os iniciadores desenvolvidos para A. nancymaae

descritos em um desses trabalhos (Coaña et al., 2004), não obtivemos sucesso na amplificação

de nenhuma das quatro citocinas estudadas.

- os trabalhos anteriores descreveram reagentes para um número limitado de citocinas.

Nossa abordagem previa o desenvolvimento de reagentes para uma gama mais ampla de

moléculas, cada qual capaz de detectar e quantificar transcritos tanto de Saimiri quanto de

Aotus.

- finalmente, tivemos em mente a utilização de um sistema de detecção que fosse

quantitativo, prático, rápido, simples e acessível. Escolhemos assim o sistema de detecção de

transcritos por PCR-TRq usando o método 2-∆∆Ct, específico para estudos de expressão gênica

(Livak & Schmittgen, 2001), por ser o que melhor preenchia esses critérios.

É preciso reconhecer que nossa abordagem inicial de produzir reagentes moleculares

específicos de Saimiri e Aotus para uma ampla gama de moléculas de interesse revelou-se

demasiado otimista e contraprodutiva. De 31 genes inicialmente selecionados para

amplificação e sequenciamento, obteve-se sucesso para 17 deles. Assim, um tempo

considerável foi consumido no desenho de iniciadores e tentativas infrutíferas de amplificação

sob diversas condições de PCR no seu formato convencional. Dos 17 casos em que se obteve

sucesso na PCR convencional, desenhamos e testamos 10 iniciadores na PCR-TRq, nos quais

tivemos bons resultados com sete desses pares de iniciadores.

Esses nossos dados mostram que existe a possibilidade de se desenvolver iniciadores

específicos e funcionais para cada uma das moléculas testadas, embora o montante de

investimento em tempo e recursos tenha sido subestimado, uma vez que é provável que, para

91

cada gene, exista a necessidade de se testar vários iniciadores diferentes, em uma ampla gama

de condições, para se determinar as condições ótimas para cada um.

É importante frisar que, ao se desenhar os iniciadores, foram selecionadas as

condições consideradas ótimas para amplificação, incluindo o tamanho das regiões a serem

amplificadas, evitando-se dessa forma íntrons demasiadamente grandes. Uma vez que nosso

desenho inicial requeria preferencialmente a amplificação de regiões pertencentes a dois

éxons diferentes, nos limitamos a trabalhar com éxons separados por íntrons de dimensões

limitadas (até 100pb). Consideramos dessa maneira que o insucesso na amplificação de 14

genes se deveu provavelmente a pequenas alterações de sequência existentes entre o gene

humano e os correspondentes de Saimiri e/ou Aotus, conduzindo a um anelamento imperfeito

do iniciador com a fita de DNA, resultando na não extensão do amplificado esperado. Esse

insucesso na verdade reforça o racional do presente trabalho da necessidade de se trabalhar

com reagentes específicos para obtenção de resultados confiáveis nesses modelos.

Essa constatação é reforçada ainda pelo fato de que, mesmo nas 17 sequências obtidas,

constatamos nas pequenas regiões amplificadas (100 a 200pb), diferenças de sequência que

chegaram a alguns casos, como na citocina IL3, a 13% de não homologia com a sequência

humana. Assim, embora a região escolhida para o anelamento dos iniciadores tenha sido

suficiente para a complementaridade das fitas de DNA, se regiões mais internas tivessem sido

utilizadas é provável que apresentassem diferenças excessivas capazes de inibir o anelamento,

a exemplo dos 14 iniciadores desenhados sem sucesso.

De qualquer maneira, a disponibilização das sequências de 17 genes de Saimiri e

Aotus, correspondentes a moléculas importantes do sistema imune, é um passo importante

para o desenho de iniciadores para PCR-TRq simples ou multiplex, ou de óligos para micro

ou macroarranjos otimizados para detecção da expressão dos respectivos genes em estudos

com essas espécies simianas.

No presente trabalho, chegamos ao desenho, validação e ensaio experimental com

iniciadores para PCR-TRq para sete dos 17 genes sequenciados, a saber: IL2, IL6, IL10, IL12,

IFNγ, TNF e LTA. Tais ferramentas já permitem uma avaliação mais aprofundada de resposta

imune em diferentes abordagens experimentais. Infelizmente, não tivemos sucesso no

desenvolvimento final de iniciadores funcionais para detecção de moléculas importantes

como IL4 e IL5, por exemplo. Esses genes que se mostraram mais complicados exigirão um

esforço maior para a definição dos iniciadores – por exemplo, pequenas modificações de

sequência, ou mesmo a utilização de outros éxons do gene – e das condições adequadas para

sua utilização.

92

É digno de nota que, nos casos em que obtivemos sucesso (IL2, IL6, IL10, IL12, IFNγ,

TNF e LTA), os iniciadores para PCR-TRq apresentaram os fatores cruciais para se atestar a

sua qualidade exemplificados através dos gráficos de formação de curvas de amplificação

(formação de zonas de crescimento exponencial e de platô) e de dissociação (apenas um pico

de amplificação) bastante definidas, e com boa eficiência de amplificação (coeficiente R2

próximo de 1).

Para a validação dos iniciadores, optamos pela detecção de transcritos em células

mononucleares de Saimiri ou de Aotus estimuladas com um potente mitógeno (ionomicina-

PMA), com o qual se tem a expectativa de induzir a expressão de diferentes citocinas,

particularmente, IFNγ e IL2 (Gil-Parrado et al., 2002; Abramov & Duchen, 2003). De fato,

nas condições testadas, os sete pares de iniciadores desenvolvidos foram capazes de detectar a

expressão do transcrito correspondente, em alguns casos – como para IFNγ e IL2 – com a

expressão aumentada dezenas ou centenas de vezes em relação às células não estimuladas, em

vários dos tempos de estimulação testados. Em outros casos, como IL10, IL12 e TNF, a

amplitude da amplificação foi bem menor. Isso se deve provavelmente ao fato de Ion-PMA

não ser um estimulador potente da expressão dessas citocinas. O tempo de seis horas foi o que

gerou amplificações em maior intensidade para a maioria dos iniciadores testados. De

maneira interessante, não tivemos sucesso ao utilizar pares de iniciadores para detecção de

IFNγ, IL10 e LTA por PCR-TRq desenhados com base nas sequências desenhadas para A.

nancymaae e disponibilizadas por Coaña et al (2004). Esse fato mostra o quão complicado é

trabalhar com reagentes desenvolvidos nas condições específicas de outros grupos e,

novamente, reforça a necessidade de condução do presente trabalho e, possivelmente, de sua

continuação para ampliar o leque de reagentes a se disponibilizar para Saimiri e Aotus.

Após demonstrar que os pares de iniciadores eram funcionais, utilizando células de

animais normais e mitógenos como fonte de estimulação, utilizamos pela primeira vez esses

reagentes para caracterizar a expressão dessas citocinas durante a infecção malárica

experimental por P. falciparum em S. sciureus. Esse experimento teve vários aspectos

importantes. Em primeiro lugar, demonstramos que o S. sciureus é susceptível à infecção por

P. falciparum sem a necessidade de esplenectomia prévia. Esse é um dado de enorme

importância, uma vez que até o momento a maioria esmagadora dos experimentos de desafio

por P. falciparum ou P. vivax nesse modelo é feita em animais esplenectomizados (Gysin,

Hommel & da Silva, 1980; Perrin et al., 1984; Fandeur et al. 1995; Perraut et al., 1997;

Kumar et al., 2000; Carvalho et al., 2003; 2004; 2005; Collins et al., 2006). A esplenectomia

tem por objetivo tornar o animal mais susceptível à infecção, gerando menor variabilidade

93

nos cursos de parasitemia e nós mesmos utilizamos esse procedimento em trabalhos anteriores

(Carvalho et al., 2004; 2005). Entretanto, o baço é um órgão fundamental na resposta imune

na malária e importante sítio de destruição do parasita por macrófagos (Barnwell, Howard &

Miller, 1983; David et al., 1983; Austin et al., 1988; Krucken et al., 2005; Urban et al., 2005;

Contini & Lewis, 2006; Sponaas et al. 2006; Carvalho et al., 2007). Deste modo, torna-se

contraproducente eliminar tal órgão justamente em experimentos cujo objetivo é gerar

respostas imunes protetoras, como no caso de ensaios vacinais. Além disso, a esplenectomia,

apesar de gerar cursos de parasitemia mais homogêneos entre os animais, acaba permitindo

um crescimento exagerado do parasita, uma vez que o organismo não consegue controlar sua

multiplicação – sem tratamento o animal acaba morrendo com parasitemias elevadas. Essa

facilidade de multiplicação do parasita torna o modelo mais distante das características da

infecção malárica humana, que em geral tem parasitemias mais baixas (McKenzie, Jeffery &

Collins, 2007), além de dificultar a avaliação do efeito protetor de vacinas, por exemplo.

Em nosso experimento, utilizando um inóculo elevado, os animais não

esplenectomizados desenvolveram curvas relativamente homogêneas de parasitemia,

chegando a cerca de 1% com seis dias, 10% com 10 dias e mantendo-se nesse nível ou

diminuindo nos dias subsequentes. Para os propósitos do presente trabalho, e por motivos de

precaução, decidimos tratar dois dos animais por apresentarem valores de hematócrito em

torno dos 25% no dia 13. Entretanto, em experimentos futuros, esse limiar pode e deve ser

flexibilizado, pois um hematócrito de 25%, na ausência de fatores complicadores, não oferece

risco de morte ao animal (anemia grave é considerada para hematócritos abaixo de 15% -

(Patel et al., 2003; Calis et al., 2008). Esta medida permitirá um acompanhamento mais

prolongado da infecção, o que é importante principalmente em ensaios vacinas, de modo a

permitir uma avaliação adequada do potencial efeito protetor de imunizações.

Outro aspecto importante do experimento de infecção foi à análise de resposta imune

utilizando células do baço, e a avaliação dos padrões histológicos de reatividade do órgão em

três momentos diferentes da infecção. Em buscas no Medline, não encontramos nenhum

trabalho na literatura que versasse sobre o tema. Isso é em grande parte explicado pelo fato de

que a maioria dos trabalhos tenha sido realizado com animais previamente

esplenectomizados. Em camundongos, o grupo do Laboratório de Pesquisas em Malária do

IOC demonstrou que infecção malárica por P. berghei ANKA desencadeia uma completa

desestruturação da arquitetura normal do baço que se apresenta aumentado de tamanho

(esplenomegalia), com muita ativação, proliferação e apoptose, mas pouca diferenciação de

centroblastos para centrócitos (Carvalho et al., 2007). Observações semelhantes foram feitas

94

em casos fatais de infecção malárica humana (Urban et al., 2005). Nossos achados em Saimiri

mostram o mesmo padrão de desorganização estrutural do órgão, particularmente dos centros

germinativos, mostrando ser essa reatividade esplênica comum na malária em diferentes

espécies, e reforçando a adequação do modelo Saimiri para estudos de resposta imune na

malária. É provável que a desestruturação dos centros germinativos seja um evento

importante para o sucesso do parasita, pois essa estrutura é fundamental para a geração de

respostas humorais maduras, com incremento da afinidade dos anticorpos e mudança no

isotipo das imunoglobulinas, em geral para IgG (Aribot et al., 1996; Tierens et al., 2000; Kim

et al., 2004). Sendo os anticorpos fundamentais na imunidade contra as formas sanguíneas

(Khusmith & Druille, 1983; Bouharoun-Tayoun et al., 1990; Bouharoun-Tayoun & Druille,

1992; Hogh et al., 1992; Oeuvray et al., 1994; Bouharoun-Tayoun et al., 1995; Druille &

Pérignon, 1999; Aucan et al. 2000), a capacidade do parasita de interferir com a qualidade e

eficiência da resposta humoral pode ser um dos motivos pelos quais é tão difícil a aquisição

de imunidade contra a malária (Carvalho et al., 2007).

Finalmente, esse experimento permitiu a utilização, pela primeira vez, dos reagentes

desenvolvidos no presente trabalho, o que permitiu definir os perfis de expressão dos genes

correspondentes em células de animais infectados. Em primeiro lugar, esse experimento

contribuiu para demonstrar a importância do tipo de estímulo utilizado para detectar de forma

adequada a reatividade de células imunes. De fato, de três preparações antigênicas derivadas

da mesma fonte (cultivo in vitro de P. falciparum), somente o estímulo com hemácias

parasitadas (o próprio cultivo, com parasitas viáveis) foi capaz de estimular de maneira

consistente a expressão de diversas citocinas, detectadas por PCR-TRq. Parasitas livres e

antígeno solúvel derivados do cultivo não tiveram o mesmo efeito sobre os esplenócitos de

Saimiris infectados por P. falciparum. Esses dados são semelhantes aos observados por

Artavanis-Tsakonas & Riley (2002) que detectaram o mesmo fenômeno em PBMCs de

doadores não-imunes de diferentes regiões geográficas. Esses autores estimularam PBMCs

por hemácias infectadas ou por antígenos solúveis de P. falciparum e, mostraram que cultivo

de P. falciparum induziu uma rápida (seis horas) e intensa expressão de IFNγ. De fato, as

hemácias parasitadas refletem de maneira mais próxima a maneira como o sistema imune do

animal entrou em contato com os antígenos parasitários. Embora não saibamos que

mecanismos possam mediar essas diferenças no potencial de estimulação, é possível sugerir

que exista uma relação com a eficiência e o tipo de apresentação de antígenos. Com hemácias

parasitadas, a captura do parasita pelas células apresentadoras de antígeno e,

consequentemente, o processamento e apresentação dos diversos antígenos ocorrerão de

95

forma semelhante à observada na infecção natural. Com parasitas livres, muitos antígenos

importantes na indução de citocinas podem não ser capturados, processados e apresentados de

maneira adequada. Por exemplo, os antígenos expressos na superfície das hemácias

parasitadas. Com antígeno solúvel, é provável que a eficiência de captura dos mesmos por

células apresentadoras de antígeno seja bastante prejudicada. Além disso, nos dois casos –

parasitas livres e antígenos solúveis – a preparação dos mesmos envolve múltiplos

procedimentos e tratamentos, que podem interferir nas propriedades antigênicas dos mesmos.

Dessa forma, a escolha do tipo de estímulo usado em experimentos in vitro é crucial para a

obtenção de resposta imune semelhante às condições naturais de infecção, cuja rápida indução

de citocinas, como IL12, IFNγ e TNF, habilita o hospedeiro humano a controlar efetivamente

o crescimento exponencial do Plasmodium até que uma resposta adaptativa efetiva se

estabeleça (Hensmann & Kwiatkowski, 2001; Artavanis-Tsakonas & Riley, 2002).

Com sete dias de infecção, foi observada uma expressão elevadíssima de IFNγ em

células estimuladas com hemácias parasitadas. Entre as demais citocinas que determinam o

perfil pró-inflamatório da resposta imune, houve detecção considerável de IL6, modesta de

TNF e pouca expressão de IL2 e LTA. A citocina que determina o viés Th1 de resposta

imune, IL12, apresentou expressão considerável. Já a citocina Th2 testada, IL10, apresentou

expressão muito baixa. Esses dados sugerem, de modo geral, que nesse momento precoce da

infecção existe uma resposta imune com forte expressão de citocinas do tipo Th1 e pró-

inflamatórias e, aparentemente, uma fraca resposta tipo Th2.

Os padrões de expressão observados em nosso trabalho se assemelham aqueles

observados em infecções de voluntários humanos por P. falciparum (Walther et al., 2006).

Esse grupo dividiu pacientes maláricos, de acordo com o padrão de resposta imune, em três

grupos distintos: i) um grupo que secreta níveis moderados de IFNγ e IL10, mas não expressa

IL12; ii) um outro que produz níveis detectáveis de IL12 e desenvolve elevada expressão de

IFNγ e IL10 e; iii) um terceiro que não apresenta perfil de resposta imune do tipo Th1, mas

mostra acentuados níveis de TGFβ. O perfil de resposta imune observada neste nosso

trabalho, em células de macacos Saimiri, parece gravitar entre os grupos i e ii de Whalter e

cols, o que mostra a estreita relação existente entre os modelos simianos avaliados aqui e o

homem e reforça a utilização de ferramentas específicas na análise de respostas imunes em

primatas neotropicais, para a obtenção de dados confiáveis, quantitativos e reprodutíveis.

Em camundongos, uma resposta precoce do tipo Th1 com virada mais tardia para uma

resposta predominante Th2 está associada com aquisição de imunidade, ao passo que a

persistência da resposta Th1 pode gerar imunopatologia (Perlmann et al., 1998). Em nosso

96

trabalho, não foi possível fazer tal tipo de avaliação, uma vez que devido ao desenho do

experimento os animais com tempo mais longo de acompanhamento foram tratados com

apenas 13 dias, em um momento em que a parasitemia estava ainda crescente ou em platô.

Com o tratamento não foi possível definir se os animais seriam capazes de controlar a

parasitemia (imunidade eficaz) ou se haveria o desenvolvimento de patologia. De qualquer

maneira, esses dados sugerem que a infecção por P. falciparum em Saimiri induz respostas

similares aquelas observadas em humanos e em modelos bem estabelecidos de camundongos.

A avaliação de respostas Th2 nesse trabalho foi limitada pela disponibilidade apenas

de iniciadores para IL10, será importante o desenvolvimento de iniciadores para IL4, IL13 e

TGF-β, por exemplo, e também de outras citocinas pró-inflamatórias e regulatórias como

IL17 e IL18, para uma melhor avaliação do quadro geral. Sabe-se que a expressão de

citocinas antiinflamatórias, como IL4 e IL10, é crítica no controle da anemia malárica grave

e, que a expressão dessas citocinas está relacionada com padrões bioquímicos de deficiência

de ferro em crianças infectadas (Nyakeriga et al., 2005). Nossos modelos são suscetíveis à

infecção pelos plasmódios humanos e vulneráveis a uma das mais graves complicações da

malária, a anemia grave (Carvalho et al., 2000; 2003; 2004; 2005). Devido à queda nos

valores de hematócrito e hemoglobina, os animais foram tratados precocemente durante o

curso de infecção o que dificultou a avaliação continuada da expressão de citocinas pró- e

antiinflamatórias no decurso dos 28 dias de infecção. Esse era o propósito do presente

trabalho que, infelizmente, não pode ser concluído em sua proposta original para esse

doutoramento. A ausência de uma resposta marcante de IL10 não quer dizer, entretanto, que a

resposta humoral não tenha sido induzida de forma relevante. Isso é confirmado pela análise

histológica do baço, que revelou intensa proliferação e ativação de células B, principalmente

com 13 dias de infecção. Entretanto, como observado em trabalhos anteriores em

camundongos (Carvalho et al., 2007) e em humanos (Urban et al., 2005), os Saimiris também

apresentam resposta desorganizada de células B com perda de estrutura dos centros

germinativos. Nesse sentido, deficiências de produção de citocinas do tipo Th2 podem sim ser

relevantes para a eficiência da resposta humoral (Scragg et al., 1999; Praba-Edge et al.,

2002). Será importante mesmo avançar nessa caracterização, pois vários trabalhos em malária

humana têm demonstrado que o equilibrio de respostas Th1 e Th2 podem ter importância

central na patologia (Fried et al., 1998; Luty et al., 2000; Hensmann & Kwiatkowski, 2001;

Artavanis-Tsakonas & Riley, 2002; Torre et al., 2002; Seoh et al., 2003; Mitchell et al.,

2005).

97

É interessante notar que os esplenócitos de Saimiris com 28 dias pós-infecção (e 15

dias pós-tratamento) não respondem ao estímulo de hemácias parasitadas, pelo menos através

da expressão das citocinas pesquisadas. Mas, ao mesmo tempo, são capazes de expressar

quase todas essas citocinas (com exceção de IFNγ), em níveis consideráveis, quando deixadas

em cultivo sem nenhum estímulo. Uma possível explicação para esse fenômeno é que essas

células foram intensamente estimuladas in vivo pela infecção, proliferaram, foram ativadas e

se diferenciaram até um estado no qual não é mais possível serem re-estimuladas. Tais células

já apresentam assim uma capacidade estabelecida de expressão e secreção de citocinas (e

continuam a fazê-lo quando colocadas in vitro), e estímulos adicionais realizados in vitro são,

assim, incapazes de promover a produção dessas citocinas o que se traduz pela diminuída

expressão gênica detectada em células de animais infectados estimuladas in vitro em nosso

trabalho. Tal fenômeno pode constituir um dos fatores envolvidos na gênese da

imunossupressão associadas às malárias humana e experimental (Millington et al., 2006;

Wykes & Good, 2008). Não pesquisamos o mecanismo de inibição, que pode ser, por

exemplo, por anergia (Martini et al., 2003) ou indução de apoptose (Dey et al., 2008; Wilson

et al., 2008). De fato, essas observações merecem trabalhos adicionais para melhor

compreensão dos fenômenos, uma vez que podem ter importância fundamental à

compreensão dos mecanismos de imunidade na malária e como manipular tais eventos para a

obtenção ou otimização de uma vacina.

Neste trabalho, foi escolhido inicialmente um painel de 31 moléculas nucleotídicas

relacionadas à resposta imune contra os plasmodia, no banco de dados do GenBank. Entre

essas moléculas, 17 fragmentos gênicos foram amplificados pela PCR convencional e os

DNAs genômicos correspondentes a essas moléculas de Aotus e Saimiri foram sequenciados.

Desses 17 genes, sete moléculas foram utilizadas para a avaliação de expressão gênica usando

a PCR-TRq como ferramenta. Os iniciadores para PCR-TRq desenhados com base nas

sequências de Saimiri e Aotus conseguiram amplificar cDNA desses macacos tanto de PBMC

quanto de células do baço, o que mostra a relevância da abordagem molecular na avaliação

dos mecanismos de aquisição de imunidade durante experimentos de imunização e infecção

plasmodial usando animais que podem ser infectados com os plasmódios humanos.

98

Conclusões

1. Inicialmente, as sequências humanas podem ser usadas como molde para o desenho de

iniciadores empregados na amplificação e sequenciamento de genes de macacos Saimiri e

Aotus.

2. Apesar da estreita relação filogenética existente entre Aotus, Saimiri, outros primatas não-

humanos e humanos, as diferenças genômicas existentes são suficientes para coibir ou mesmo

impedir o uso de iniciadores baseados em sequências humanas e justificam o esforço de

desenvolver ferramentas específicas para os primatas neotropicais.

3. Os iniciadores desenhados a partir de sequências de macacos Saimiri e Aotus são capazes

de detectar a expressão de transcritos desses modelos em células mononucleadas do sangue

periférico e em esplenócitos.

4. Infecção sanguínea por P. falciparum causa desestruturação da arquitetura normal do baço

de S. sciureus no qual se observa forte ativação e proliferação celulares com perda dos limites

dos centros germinativos durante o curso de infecção.

5. S. sciureus infectado por P. falciparum apresenta uma forte resposta inflamatória mediada

principalmente por INFγ numa fase inicial de infecção e uma inibição dessa resposta

inflamatória numa fase mais tardia.

6. Esplenócitos descongelados de S. sciureus primoinfectados apresentam um inibição da

expressão de citocinas do tipo Th1, exceto IL6

7. A resposta inflamatória é melhor desencadeada in vitro por hemácias infectadas intactas

que por antígenos solúveis ou parasitas livres.

99

Perspectivas

- Desenvolver iniciadores de PCR-TRq para os outros 10 genes para os quais já se dispõe das

sequências de Aotus e Saimiri disponíveis.

- Utilizar as ferramentas disponibilizadas para avaliar a resposta imune nesses modelos em

experimentos de imunização e desafio com P. falciparum/P. vivax.

- Usar o conhecimento adquirido para o desenvolvimento e utilização de iniciadores

específicos para outros genes que se definam importantes em abordagens futuras.

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