Detecção simultânea de Coronavírus bovino e Rotavírus do ... · Aos demais professores do VPS. A Sibele Pinheiro de Souza , amiga e colaboradora, pela amizade e por toda a ajuda

KAREN MIYUKI ASANO

Detecção simultânea de Coronavírus bovino e Rotavírus do grupo

A em amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-

nested RT-PCR

São Paulo

2009

KAREN MIYUKI ASANO

Detecção simultânea de Coronavírus bovino e Rotavírus do grupo

A em amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-

nested RT-PCR

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Ciências

Departamento:

Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal

Área de concentração:

Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses

Orientador:

Prof. Dr. Paulo Eduardo Brandão

São Paulo

2009

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.2193 Asano, Karen Miyuki FMVZ Detecção simultânea de coronavírus bovino e rotavírus do grupo A em

amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-nested RT-PCR / Karen Miyuki Asano. – 2009.

87 f. : il. Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, São Paulo, 2009.

Programa de Pós-Graduação: Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses.

Área de concentração: Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Eduardo Brandão.

1. Coronavírus. 2. Rotavírus. 3. Diagnóstico. 4. PCR. 5. Bovinos. I. Título.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: ASANO, Karen Miyuki

Título: Detecção simultânea de Coronavírus bovino e Rotavírus do grupo A em amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-nested RT-PCR

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Ciências

Data: ___/__/__

Banca Examinadora

Prof. Dr. _____________________ Instituição: ______________________

Assinatura: ___________________ Julgamento: ______________________





DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Tuioshi Asano e Kazuyo Miyoshi Asano

Aos meus irmãos, Fábio Senishi Asano e Roberto Toshihiro Asano

A Batian, Setsu Kawamura Asano (in memoriam)

Ao meu amor, José Henrique de Hildebrand e Grisi Filho

“Algo só é impossível até que alguém duvide e acabe provando o contrário”

Albert Einstein

AGRADECIMENTOS

Prof. Dr. Paulo Eduardo Brandão, pela brilhante orientação, pela confiança em meu

trabalho e pelos conselhos.

Ao prof. Dr Silvio Arruda Vasconcellos e profa. Dra Solange Maria Gennari pela

dedicação com o programa de pós-graduação do VPS.

Ao prof. Dr. Rodrigo Martins Soares pelas conversas e pelas valiosas sugestões.

Ao prof. Leonardo José Richtzenhain, pela oportunidade e aprendizado, desde a graduação.

Ao prof José Antônio Jerez, pelas conversas e simpatia.

Aos professores Drs. Fernando Ferreira, José Soares, Evelise Telles e Ricardo Dias pelas

conversas e pelos bons momentos.

Aos demais professores do VPS.

A Sibele Pinheiro de Souza, amiga e colaboradora, pela amizade e por toda a ajuda neste

trabalho.

A Iracema Nunes de Barros, sempre prestativa e estudiosa, pelas suas piadinhas.

Ao Márcio Pinotti Guirao , companheiro desde a época de estágio, pela amizade e pela sua

simpatia.

A Thaísa Lucas Sandri pelas conversas e pela amizade.

A Giselle Ayres Razera, pela sua amizade e atenção.

Aos pós-graduandos Vanessa Salgado, Juliana Martins , Michele Klein, Estela Galluci,

Mikaela Renata Funada, Camila de Oliveira, Willian Fahl , Rafael Novaes, Ekaterina

Ono, Amane Paldês, Flávia Morato, Viviane Cambuí, Flávia Carolina, Marcelinho,

Bianca Canatto, Fernanda Ywasaki, Vanessinha, Rosely Bianca dos Santos, e aos demais

pós-graduandos do VPS pela agradável convivência.

Aos pós-doutorandos Enio Mori e Alessandra Marnie por todo apoio, sugestões e amizade.

A Sheila de Oliveira Souza Silva, pela sua dedicação, por toda sua ajuda neste trabalho e

pela amizade.

As queridas amigas de graduação e pós-graduação, Fernanda Ratolla Isobe, Laura Cristina

Henriques Sant’Anna, Camila Souza Torelli, Juliana Silva Nogueira, Marjorie Yumi

Hasegawa, Miriam Sayuri Sassaki e Mariel Neves Tavares, por todos os momentos, pela

amizade, incentivo e conselhos.

Aos funcionários do VPS, Sandra Sanches, Alexandre Sanches, Gisele de Oliveira,

Zenaide Moraes, Danival Moreira , Maria Cristina Paick , Ana Virgínia Prado, Tânia

Delonero, Pedrinho, Jucélia, Bispo e aos demais funcionários, pela convivência.

A todos os funcionários da Biblioteca Virginie Buff D’Ápice, em especial a Elena Aparecida

Tanganini, Maria de Fátima e Elza Faquim por toda dedicação e revisão da dissertação.

Aos amigos de Registro, Taís Cristina Canola, Carolina Galvanese, Bernadete Grein,

Flávio Rizi e Mamute pela amizade, pela paciência e por todos os bons momentos.

Aos amigos do ICA de São Paulo, Adriano Campbell, Daniela Birgel, Fábio Coelho,

Flávia Bigai, Gabriel Volpi , Nelson Ruggiero, Tatiana Marsola, Thiago Lisboa pelo

incentivo e momentos de risadas e descontração.

Aos diretores do ICA, Yuri Costa e Edson Fiorenzano pelo apoio e por concederem tempo

para o término deste trabalho.

As pesquisadoras do Instituto Biológico, Maria do Carmo Custódio de Souza Hunold

Lara , Elenice Maria Sequetin Cunha, Eliana Monteforte Cassaro Villalobos, Simone

Miyashiro e Alessandra Figueireido de Castro Nassar pelas oportunidades e por terem

contribuído na minha formação profissional.

A Moema de Oliveira Ramos, amiga de longa data, pela amizade e por me ouvir sempre,

mesmo estando muito longe.

A FAPESP, pela bolsa concedida (N° do processo: 2008/51517-5).

RESUMO

ASANO, K. M. Detecção simultânea de Coronavírus bovino e Rotavírus do grupo A em amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-nested RT-PCR. [Simultaneous detection of bovine coronavirus and group A rotavirus in bovine fecal samples by a multiplex semi-nested RT-PCR]. 2009. 87 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.

O coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus (RV) são importantes agentes da diarréia neonatal

bovina, causando grandes perdas econômicas. O BCoV é também responsável pela disenteria

de inverno em vacas adultas e por desordens respiratórias e o RV possui um aspecto

zoonótico de importância na saúde pública. Este estudo teve o objetivo de desenvolver uma

multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV do grupo A com a

utilização de um controle interno. Para tanto, foram desenhados três primers dirigidos ao gene

N de BCoV (306pb) e três primers dirigidos ao gene VP1 do RV do grupo A (228pb); para o

controle interno, foram utilizados dois primers dirigidos ao mRNA do gene mitocondrial

bovino ND5 (191pb). Foram utilizados como controles positivos a amostra Kakegawa de

BCoV (título HA de 256), a amostra 8209 de rotavírus do grupo A (título viral de

101.66TCID50%/200µL) e suspensão de células MDBK para o controle interno. A extração de

RNA foi realizada com o reagente comercial TRIzol, de acordo com as recomendações do

fabricante. Foram realizados gradientes de temperatura para a determinação da temperatura

ótima de hibridação para cada par de primers, resultando em 50ºC para PCR e 55ºC para a

hemi-nested. Doze protocolos com diferentes concentrações de Taq DNA polymerase, MgCl2,

primers e DNA-alvo foram testados. Para determinação do limiar de detecção, o protocolo

final foi utilizado em diluições dos dois vírus em suspensão de amostras fecais negativas para

BCoV e RV adicionadas de 10% de suspensão de células MDBK, obtendo o limiar de

detecção de 10-8 para os dois vírus e aplicado em amostras fecais de bezerros (53) e vacas

adultas (22). Todas as amostras foram previamente testadas para BCoV por uma nested RT-

PCR dirigida ao gene RdPd, sendo 15 positivas, e para rotavírus pela PAGE, sendo 3

positivas. Para a multiplex, 15 amostras foram positivas para BCoV e 6 para rotavírus. O

seqüenciamento de DNA das amostras positivas para multiplex demonstrou a especificidade

do teste. Uma concordância ótima foi encontrada para BCoV (0,833) e substancial para

rotavírus (0,648) calculada pela estatística kappa, comparando-se com os testes de referência.

Estes resultados demonstram que a padronização da multiplex foi eficiente para a detecção de

BCoV e RV, com elevadas sensibilidade e especificidade. Além disso, o diagnóstico

simultâneo dos dois agentes permite um diagnóstico rápido e a um menor custo devido à

utilização de reduzidas quantidades de reagentes e mão de obra, fornecendo uma importante

ferramenta para o diagnóstico e estudo da etiologia da diarréia em bovinos.

Palavras-chave: Coronavírus. Rotavírus. Diagnóstico. PCR. Bovinos.

ABSTRACT

ASANO, K. M. Simultaneous detection of bovine Coronavirus and group A Rotavirus in bovine fecal samples by a multiplex semi-nested RT-PCR. [Detecção simultânea de coronavírus bovino e rotavírus do grupo A em amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-nested RT-PCR]. 2009. 87 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.

Bovine coronavirus (BCoV) and rotavirus (RV) are important agents of neonatal diarrhea in

cattle, causing large economic losses. BCoV is also responsible for winter dysentery in adult

cattle and respiratory disorders and RV has a zoonotic aspect of importance in public health.

This study aimed to develop a multiplex hemi-nested RT-PCR for simultaneous detection of

BCoV and RV of group A with an internal control. For this purpose, three primers were

designed targeting the N gene of BCoV (306pb) and three primers targeting to the VP1 gene

of group A RV (228pb); for internal control, two primers targeting to the mRNA of ND5

bovine mitochondrial gene (191pb) were used. Positive controls were BCoV Kakegawa strain

(HA titer 256), group A bovine rotavirus strain 8209 (viral titer of 101.66TCID50%/200µL), and

MDBK cells suspension for internal control. The RNA extraction was performed with the

commercial reagent TRIzol. Temperature gradients were carried out for each primers pair for

the determination of the optimal hybridization temperatures, resulting in 50°C for PCR and

55°C for the hemi-nested. Twelve protocols were tested with different concentrations of Taq

DNA polymerase, MgCl2, primers and target DNA. The final protocol was used in 10-fold

dilutions of the two viruses in suspension of fecal sample negative for BCoV and RV added to

10% of MDBK cells suspension, obtaining the detection limit of 10-8 for the two viruses, and

applied to 75 fecal samples from calves (53) and cows (22). All samples were previously

tested for BCoV by a nested RT-PCR to RdPd gene, being 15 positive; and for rotavirus by

PAGE, being 3 positive. For multiplex, 15 samples were positive for BCoV and 6 for RV.

The DNA sequencing of multiplex-positive samples substantiates the specificity of the test. A

great agreement was found for BCoV (0.833) and substantial for RV (0.648) by calculating

the kappa statistic in comparison to the reference tests. These results demonstrate that the

multiplex standard was effective in the detection of BCoV and RV, with high sensitivity and

specificity. In addition, simultaneous diagnosis of both agents allows a faster and at lower

cost diagnosis due to use of smaller quantities of reagents and labor, providing an important

tool for the diagnosis and study on the etiology of diarrhea in cattle.

Keywords: Coronavirus. Rotavirus. PCR. Diagnosis. Bovine.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 15 2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 22 3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 23 3.1 AMOSTRAS......................................................................................................... 23 3.1.1 Amostras de referência....................................................................................... 23 3.1.2 Amostras de campo............................................................................................. 24 3.2 PREPARO DAS AMOSTRAS............................................................................. 26 3.3 EXTRAÇÃO DE RNA.......................................................................................... 26

3.4 PADRONIZAÇÃO INDIVIDUAL DAS HEMI-NESTED RT-PCR PARA BCoV, RV E RNA MENSAGEIRO DE DNA MITOCONDRIAL BOVINO..... 26

3.4.1 Primers................................................................................................................. 26 3.4.1.1 Coronavírus bovino............................................................................................... 27 3.4.1.2 Rotavírus do grupo A............................................................................................. 27 3.4.1.3 RNA mensageiro de DNA mitocondrial bovino..................................................... 28 3.4.1.4 Compatibilidade entre os primers......................................................................... 29 3.4.2 Determinação das temperaturas ótimas de hibridação dos primers.............. 29 3.4.2.1 Síntese de DNA complementar (cDNA)................................................................. 30 3.4.2.2 Primeira amplificação (PCR)................................................................................ 30 3.4.2.3 Segunda amplificação (Hemi-nested PCR)........................................................... 31 3.4.3 Determinação de sensibilidade analítica............................................................ 32 3.4.4 Determinação da identidade dos fragmentos amplificados............................. 33 3.4.5 Aplicação das RT-PCR em amostras fecais...................................................... 33 3.4.6 Comparação da utilização de controle interno endógeno e exógeno.............. 34 3.5 PADRONIZAÇÃO DA MULTIPLEX HEMI-NESTED RT-PCR...................... 35 3.5.1 Determinação da combinação de reagentes a ser utilizada na multiplex....... 35 3.5.1.1 Síntese de DNA complementar (cDNA)................................................................. 35 3.5.1.2 Primeira amplificação (PCR)................................................................................ 36 3.5.1.3 Segunda amplificação (Hemi-nested PCR)........................................................... 37

3.5.2 Determinação da sensibilidade analítica da multiplex hemi-nested RT-PCR...................................................................................................................... 37

3.5.3 Aplicação da multiplex hemi-nested RT-PCR em diferentes concentrações de cada vírus......................................................................................................... 38

3.5.4 Aplicação da multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV em amostras fecais de bovinos....................................................... 39

3.5.5 Determinação da identidade dos fragmentos amplificados............................. 39 3.6 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS..................................................... 39 4 RESULTADOS.................................................................................................... 41 4.1 PADRONIZAÇÃO DA HEMI-NESTED RT-PCR PARA BCoV...................... 41 4.1.1 Determinação das temperaturas ótimas de hibridação.................................... 41 4.1.2 Determinação da sensibilidade analítica........................................................... 43 4.1.3 Determinação da identidade dos fragmentos amplificados............................. 45 4.1.4 Aplicação da hemi-nested RT-PCR para detecção de BCoV.......................... 45

4.2 PADRONIZAÇÃO DA HEMI-NESTED RT-PCR PARA ROTAVÍRUS DO GRUPO A............................................................................................... 46

4.2.1 Determinação das temperaturas ótimas de hibridação.................................... 46 4.2.2 Determinação da sensibilidade analítica........................................................... 48 4.2.3 Determinação da identidade dos fragmentos amplificados............................. 49 4.2.4 Aplicação da hemi-nested RT-PCR para detecção de RV............................... 49

4.3 PADRONIZAÇÃO DA RT-PCR RNA MENSAGEIRO DE DNA MITOCONDRIAL BOVINO...................................................................... 50

4.3.1 Determinação da temperatura ótima de hibridação........................................ 50 4.3.2 Determinação da sensibilidade analítica........................................................... 51 4.3.3 Determinação da identidade dos fragmentos amplificados............................. 52 4.3.4 Aplicação em amostras de campo...................................................................... 52

4.4 PADRONIZAÇÃO DA MULTIPLEX HEMI-NESTED RT-PCR PARA DETECÇÃO SIMULTÂNEA DE BCoV E RV.................................................. 53

4.4.1 Compatibilidade entre os primers...................................................................... 53 4.4.2 Síntese de DNA complementar (cDNA)............................................................. 53 4.4.3 Avaliação das combinações de reagentes........................................................... 54

4.4.4 Determinação da sensibilidade analítica da multiplex hemi-nested RT-PCR...................................................................................................................... 54

4.4.5 Teste com diferentes proporções de BCoV e RV de referência....................... 57

4.4.6 Aplicação da multiplex hemi-nested RT-PCR em amostras fecais de bovinos................................................................................................................. 57

4.4.7 Determinação da identidade dos fragmentos amplificados............................. 59 4.5 ANÁLISE DOS RESULTADOS................................................................ 59

4.5.1 Comparação da multiplex hemi-nested RT-PCR com os testes de referência.............................................................................................................. 59

4.5.1.1 Comparação entre a multiplex hemi-nested RT-PCR e a nested RT-PCR para o gene RdPd para detecção de BCoV...................................................................... 59

4.5.1.2 Comparação entre a multiplex hemi-nested RT-PCR e a PAGE para detecção de rotavírus............................................................................................................ 60

4.5.2 Comparação da multiplex hemi-nested RT-PCR com as reações de RT-PCR individuais................................................................................................... 60

4.5.2.1 Comparação entre a multiplex hemi-nested RT-PCR e a reação individual para detecção de BCoV.................................................................................................. 61

4.5.2.2 Comparação entre a multiplex hemi-nested RT-PCR e a reação individual para rotavírus................................................................................................................. 61

5 DISCUSSÃO........................................................................................................ 63 6 CONCLUSÕES................................................................................................... 75 REFERÊNCIAS.................................................................................................. 76

15

1 INTRODUÇÃO

A diarréia neonatal dos bovinos, que afeta bezerros entre 3 e 4 semanas, ocorre

freqüentemente em associação com coronavírus bovino (BCoV), rotavírus (RV),

Cryptosporidium parvum, Escherichia coli enterotoxigênica e Salmonella sp (SNODGRASS

et al., 1986).

Entretanto, aos rotavírus e ao BCoV pode ser atribuída maior importância, visto

estarem estes presentes em aproximadamente 60% dos casos de diarréias de bezerros

neonatos (JEREZ, 1997).

Estes dois vírus são freqüentemente encontrados na diarréia neonatal dos bovinos no

Brasil, estando presentes tanto entre bovinos de corte quanto de leite (BUZINARO et al.,

2000; JEREZ et al., 2002; BUZINARO et al., 2003; LANGONI et al., 2004).

Além da diarréia neonatal, o BCoV também pode causar doenças respiratórias em

bovinos e está associado à disenteria de inverno em vacas adultas (SAIF, 1990; CLARK,

1993).

A presença de BCoV no trato respiratório foi demonstrada em bezerros e em vacas

adultas causando dispnéia severa, febre e diminuição da produção de leite podendo ou não

ocorrer em associação com a diarréia (DECARO et al., 2008a, DECARO et al., 2008c). Além

disso, está associada à febre do transporte (STORZ et al., 1996; STORZ et al., 2000).

Por sua vez, a disenteria de inverno é uma doença aguda de ocorrência epizoótica com

tendência sazonal e distribuição mundial, que acomete bovinos adultos, com maior

prevalência na população de bovinos leiteiros, causada pelo coronavírus bovino (BCoV), com

casos de associação com Salmonella sp, rotavírus, BVDV, Crysptosporidium parvum e

Eimeria bovis (DURHAM et al., 1989; PARK et al., 2006; BRANDÃO et al., 2007).

O coronavírus bovino pertence ao grupo 2 dos coronavírus, classificado na ordem

Nidovirales, família Coronaviridae, a qual compreende os gêneros Coronavirus, com seus

três grupos de espécies, e Torovirus (HOLMES; LAI, 1996; GONZÁLES et al., 2003).

O envelope viral do BCoV é formado por uma camada dupla de lipídios com cinco

proteínas estruturais (M, E, HE, S e I) dela se projetando, resultando no aspecto de uma coroa

(do latim corona) (MASTERS, 2006).

O genoma é constituído por um RNA de fita simples não segmentado de sentido

positivo com 32kb, originando um nucleocapsídeo de simetria helicoidal em associação com a

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nucleoproteína N, uma fosfoproteína de 50-60 kDa rica em aminoácidos básicos, cujo gene é

altamente conservado (HOLMES; LAI, 1996; MASTERS, 2006).

O primeiro isolamento do coronavírus bovino foi realizado na década de 70 por Mebus

et al. (1973) em cultura de células primárias de rim de bovino. Diversas células têm sido

utilizadas para o isolamento viral do BCoV, sendo que a linhagem HRT-18 (tumor retal

humano) é considerada a mais sensível para o primo-isolamento (BENFIELD; SAIF, 1990;

TSUNEMITSU et al., 1991).

Embora o isolamento viral seja uma técnica importante na contribuição do

entendimento das propriedades antigênicas do BCoV, esta é pouco utilizada devido à

dificuldade da propagação do BCoV em cultivo celular (JEREZ et al., 2005).

A microscopia eletrônica pode ser utilizada para o diagnóstico de BCoV (COLLINS et

al., 1987; BULGIN et al., 1989), porém apresenta alto custo e dificuldade de processamento

de grande quantidade de amostras (ARCANGELETTI et al., 2005). Além disso, pode

apresentar resultados falso-positivos devido à morfologia pleomórfica dos coronavírus,

podendo ser estes confundidos com organelas celulares ou outros vírus (SAIF, 1990;

ATHANASSIOUS et al., 1994), e falso-negativos em função da baixa sensibilidade analítica

desta técnica, uma vez que, para a sua detecção, são necessários mais do que 106

vírions/grama de fezes (FLEWETT, 1978), sendo necessária a utilização de uma técnica de

confirmação (ATHANASSIOUS et al., 1994).

Uma alternativa é a utilização da imunoeletromicroscopia eletrônica que permite uma

melhor acurácia, porém necessita da produção de um anti-soro altamente específico ou de

anticorpos monoclonais (ATHANASSIOUS et al., 1994).

Um método simples para o diagnóstico direto de coronavírus bovino, uma vez

disponíveis soros hiperimunes, é a hemaglutinação seguida da confirmação pela inibição da

hemaglutinação, que se utiliza da propriedade das proteínas S e HE de se ligarem a resíduos

de ácidos siálicos como, por exemplo, p ácido 9-O-acetil-neuramínico, presentes na superfície

da membrana de hemácias (SATO et al., 1977).

A técnica de hemaglutinação/inibição da hemaglutinação permite o diagnóstico de

coronavírus bovino por uma metodologia de baixo custo e de realização simples, mas requer a

utilização de animais de laboratório, havendo ainda, a possibilidade de geração de resultados

falso-positivos quando se utiliza soro hiperimune policlonal (BRANDÃO et al., 2005).

Métodos de ELISA com anticorpos policlonais e monoclonais, bem como

imunohistoquímica, podem, também, serem utilizados para o diagnóstico direto dos

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coronavírus bovinos (CLARK, 1993; ZHANG et al., 1997; SCHOENTHALER; KAPIL,

1999).

Uma grande série de métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) para

a detecção de BCoV pode ser encontrada na literatura pertinente (VERBEEK et al., 1990;

BRANDÃO et al., 2003; BRANDÃO et al., 2005; KHALILI et al., 2006; LOA et al., 2006;

TAKIUCHI et al., 2006), bem como variações baseadas em PCR quantitativa

(ESCUTENAIRE et al., 2007; DECARO et al., 2008b), mostrando uma elevada sensibilidade

e especificidade.

Por sua vez, a rotavirose é uma zoonose que possui distribuição mundial (ACHA,

2003) e constitui-se na maior causa de gastroenterite infecciosa em crianças e animais

neonatos (ESTES; KAPIKIAN, 2007). É apontado com uma zoonose devido à demonstração

da ocorrência de sorotipos tipicamente animais em humanos e, vice-versa (TANIGUSHI et

al., 1991; COOK et al., 2004; STEYER et al., 2008).

Os rotavírus, pertencentes ao gênero Rotavirus, são vírus não-envelopados, com um

capsídeo protéico em 3 camadas, apresentando, como os demais membros da família

Reoviridae, genoma constituído por RNA de fita dupla (dsRNA) segmentado de sentido

negativo, constituído por 11 segmentos no caso dos rotavírus, cada segmento codificando

para, pelo menos, uma das proteínas virais (ESTES; KAPIKIAN, 2007).

Os onze segmentos de dsRNA são alocados no interior do core (ou núcleo)

glicoprotéico, constituído pelas proteínas estruturais VP1 (RNA-polimerase RNA-

dependente, ligação ao RNA e formação de complexo com a VP3), VP2 (ligação ao RNA,

requerido para a atividade de replicase da VP1) e VP3 (guaniltransferase, metiltransferase,

ligação ao RNA e formação de complexo com a VP1); acima do core encontra-se um

capsídeo de camada dupla, também de natureza glicoprotéica, sendo que as glicoproteínas do

capsídeo interno (VP6) permitem a classificação em sorogrupos ou espécies virais, atualmente

em número de sete, classificados pelas letras de A a G, e as do externo (VP4 e VP7) em

sorotipos; tais sorotipos são classificados pela letra G (glicoproteína) quando a classificação é

feita considerando-se a VP7 ou pela letra P (protease-sensível), quando se considera a VP4

(ESTES; KAPIKIAN, 2007), sendo o sorogrupo A o mais comumente encontrado em

associação com diarréia neonatal em bovinos (KAPIKIAN, 1984).

A primeira descrição do isolamento do rotavírus em cultivo celular foi realizada por

Mebus et al. (1971), porém esta técnica é pouco utilizada, devido à dificuldade de propagação

desses vírus em cultivos celulares.

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Uma técnica que já foi largamente utilizada para a detecção de rotavírus é a

microscopia eletrônica, que apresenta uma elevada especificidade, pois os rotavírus são

facilmente identificados devido a sua morfologia característica (ATHANASSIOUS et al.,

1994. ESTES; KAPIKIAN, 2007). Entretanto a microscopia eletrônica tem a desvantagem de

ter baixa sensibilidade quando comparada com outros testes, como o ELISA e a RT-PCR

(DENNEHY et al., 1990; BUESA et al., 1996). Além disso, poucos laboratórios são

equipados para a realização da microscopia eletrônica.

Para o diagnóstico laboratorial de rotavírus, a técnica mais utilizada é a eletroforese

em gel de poliacrilamida (PAGE), na qual se busca evidenciar a presença dos 11 segmentos

de RNA dos rotavírus diretamente de extratos de RNA de amostras fecais (HERRING et al.,

1982), sendo esta uma técnica de alta especificidade analítica, mas trazendo a desvantagem de

demandar dois dias de trabalho para a geração de resultados e de ter baixa sensibilidade

analítica, uma vez que é necessária uma grande quantidade de rotavírus nas fezes para a

geração de sinal quando comparada, por exemplo, à PCR para detecção de rotavírus (XU et

al., 1990; ESTES; KAPIKIAN, 2007).

Além disso, devido a sua complexidade, a PAGE se torna uma técnica de difícil

execução em situações que exijam o processamento de um grande número de amostras

(JEREZ, 1997).

Com relação às reações sorológicas, a técnica de ELISA é a mais largamente utilizada,

em função de sua alta sensibilidade e da possibilidade de automação, permitindo o

processamento de um grande número de amostras simultaneamente (BELLAMY et al., 1983;

PEREIRA et al., 1985; YOUKEN; WILDE, 1994; GREGORI et al., 2000).

A aglutinação em látex, embora seja uma técnica rápida, simples e de alta

especificidade, tem a desvantagem de ter baixa sensibilidade dependendo do estágio da

doença (BRANDT et al., 1987).

Outras técnicas sorológicas, como a imunofluorescência, a imunomicroscopia

eletrônica (BRIDGER; WOODE, 1975), radioimunoensaio (CUCKOR et al., 1978) e

contraimunoeletroforese (CANDEIAS et al., 1978) podem ser utilizadas para detecção dos

rotavírus, mas também dependem da produção de imunorreagentes e, portanto, de isolamento

e produção de vírus em cultivos celulares.

A PCR tornou-se um método essencial no estudo dos rotavírus, não apenas para a

simples detecção de presença ou ausência do vírus, mas, principalmente, para a classificação

de genótipos de amostras positivas em ELISA ou PAGE, existindo um diverso e complexo,

conjunto de variações de combinações de primers (GOVEA et al., 1990; GENTSCH et al.,

19

1992; CHINSANGARAM et al., 1993; ELSCHNER et al., 2002; GREGORI, 2003; PANG et

al., 2004).

Além disso, a RT-PCR para detecção de rotavírus, tem demonstrado ser uma técnica

de elevada sensibilidade quando comparada com o ELISA (BUESA et al., 1996;

STOCKMAN et al., 2008), microscopia eletrônica (PANG et al., 2004) e PAGE (BUESA et

al., 1996).

Comparações entre as sensibilidades analíticas da RT-PCR e nested RT-PCR com a do

ELISA, por exemplo, demonstraram que as primeiras podem ser 100 e 1000 vezes superiores,

respectivamente (WILDE et al., 1990; HUSAIN et al., 1995; BUESA et al., 1996).

Comparando a sensibilidade analítica de uma nested RT-PCR com a RT-PCR em

tempo real com a utilização de um mesmo conjunto de primers para rotavírus, encontrou-se

um limiar detecção 100 vezes menor na real time (PANG et al., 2004), sugerindo-se que este

resultado tenha sido influenciado pela otimização das concentrações de primers e sondas de

modo que se permitisse uma maior eficiência na amplificação.

Uma variação da PCR, denominada de multiplex PCR, tem sido utilizada no

diagnóstico de diarréias virais em amostras fecais de suínos (KIM et al., 2000; SONG et al.,

2006; KIM et al., 2007; OGAWA et al., 2009), de aves (SELLERS et al., 2004; SPACKMAN

et al., 2005; LOA et al., 2006; DAY et al., 2007) e de humanos (O’NEILL et al., 2002;

ROHAYEM et al., 2004).

A multiplex PCR refere-se à utilização de diferentes pares de primers com o intuito de

amplificar simultaneamente múltiplas regiões de ácidos nucléicos presentes em uma mesma

amostra e suas principais vantagens são: reduzir o número de tubos nos quais alíquotas de

DNA devem ser adicionadas, diminuindo a possibilidade de contaminação, e economia dos

custos, de tempo e de amostras de volume limitado (EDWARDS; GIBBS, 1994;

ZANGENBERG; SAIK; REYNOLDS, 1999; ELNIFRO et al., 2000; MARKOULATOS;

SIAFAKAS; MONCANY, 2002; RATCLIFF et al., 2007).

A primeira descrição do uso da multiplex PCR foi realizada por Chamberlain et al.

(1988) para detecção simultânea de múltiplos loci no gene da distrofia muscular de Duchenne.

Desde então o uso desta técnica tem sido realizado com sucesso em diversas áreas de

diagnóstico molecular, como análise se deleção gênica, mutação e polimorfismos; estudos

forenses; análises quantitativas e detecção de RNA (EDWARDS; GIBBS, 1994;

HENEGARIU et al., 1997; ELNIFRO et al., 2000).

Entretanto, a reconhecida dificuldade em reproduzir testes publicados devido às

variações do desempenho de termocicladores, às diferentes eficiências de diferentes DNA

20

polimerases e à presença de inibidores nas amostras pode dificultar a implementação da PCR,

levando a desperdícios de recursos na adaptação dos testes publicados (HOORFAR et al.,

2004), logo, é necessário que estes testes tenham uma padronização detalhada e bem

elaborada.

Outra desvantagem são os resultados falso-negativos, principalmente em relação à

presença de substâncias inibitórias presente em amostras fecais (WILDE et al., 1990;

GOUVEA et al., 1991; MONTEIRO et al., 1997; OIKARINEN et al., 2009). Nestes casos a

co-amplificação de um controle interno aumenta a confiabilidade do teste e valida os

resultados negativos (HOFFMAN et al., 2009).

Em uma PCR sem controle interno, um resultado negativo pode significar ausência da

seqüência alvo, mas pode também significar que a reação foi inibida. Já com a utilização de

um controle interno, um sinal é sempre produzido até mesmo na ausência da seqüência alvo, o

que revela possíveis falhas da PCR (HOOFAR et al., 2004).

Até o momento, encontra-se em literatura o relato de apenas uma tentativa de

padronização de técnica para a detecção simultânea de BCoV e rotavírus, sob o formato de

ELISA baseado em anticorpos monoclonais (THORNS et al., 1992) a qual, apesar de bem

sucedida, traz a desvantagem da necessidade de obtenção de altos títulos virais em cultivo

celular para a produção de anticorpos monoclonais.

A conseqüência é que, ainda que haja métodos disponíveis para o diagnóstico de

rotavírus e BCoV em bovinos, tanto na forma de reações sorológicas quanto baseados em

biologia molecular do gene, há ainda a necessidade de que os mesmos sejam realizados em

separado, seguindo fluxogramas diferentes, o que traz incrementos não só de tempo de

realização do diagnóstico, mas também nos custos do mesmo.

Para o delineamento de medidas profiláticas para a diarréia neonatal bovina, é

essencial que se tenham técnicas laboratoriais acuradas para o diagnóstico diferencial de

agentes etiológicos em casos de animais doentes, principais fontes de infecção para novos

suscetíveis, bem como para levantamentos epidemiológicos em um dado rebanho com o

objetivo de se estudar a freqüência de ocorrência de tais agentes em animais doentes e sadios

e estimar a necessidade de uso de imunoprofilaxia, separação dos animais por faixas etárias

ou de métodos de controle de contaminação ambiental, como desinfecção e destino de

excretas.

Dadas as dificuldades em se produzir BCoV em altos títulos em cultivo celular para a

produção de imunorreagentes a serem empregados em reações sorológicas para o diagnóstico

de BCoV (JEREZ et al., 2005), métodos baseados em transcrição reversa seguida pela reação

21

em cadeia da polimerase (RT-PCR) tornam-se métodos de eleição permitindo um diagnóstico

rápido e acurado.

Além disso, ainda que os rotavírus sejam mais facilmente cultiváveis em células de

linhagem (RODRIGUEZ et al., 2004), tornando factível a produção de imunorreagentes, a

possibilidade de associar a detecção por RT-PCR deste vírus com a de BCoV para uma

mesma amostra permite que, em um único momento e com uso mínimo de volume de

amostras e de reagentes, seja realizado o diagnóstico em tempo hábil para atender

necessidades de pesquisa e prestação de serviços.

22

2 OBJETIVOS

A presente investigação teve os seguintes objetivos:

Padronizar uma reação de transcrição-reversa/ reação em cadeia da polimerase

hemi-nested para detecção de coronavírus bovino (BCoV), tendo como alvo o

gene codificador da proteína de nucleocapsídeo (N).


hemi-nested para detecção de rotavírus do grupo A, tendo como alvo o gene

codificador da VP1 (RNA-polimerase RNA-dependente).


hemi-nested (multiplex hemi-nested RT-PCR) para detecção simultânea de

coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus em amostras fecais de bezerros, a partir

das reações mencionadas anteriormente.

23

3 MATERIAL E MÉTODOS

Os materiais e a metodologia utilizados neste trabalho estão descritos nos itens a

seguir.

3.1 AMOSTRAS

Foram utilizadas as amostras de referência e de campo descritas a seguir.

3.1.1 Amostras de referência

Como amostra de referência de coronavírus bovino, foi utilizada a amostra Kakegawa

(AKASHI et al., 1980), mantida em cultura de células da linhagem HmLu (pulmão de

hamster), com título hemaglutinante (HA) de 256. Para rotavírus, foi utilizada a amostra 8209

de rotavírus bovino (RODRIGUEZ et al., 2004) mantida em células da linhagem MA-104

(rim fetal de macaco verde), com título viral de 101,66 TCID50%/200µL.

Como controle positivo para o controle endógeno de mRNA mitocondrial bovino,

foram utilizadas suspensões de células da linhagem MDBK (Madin Darby Bovine Kidney)

derivadas de monocamadas das mesmas cultivadas em frascos de 25cm2. As suspensões

foram preparadas descolando-se as células do frasco mecanicamente com o auxílio de um

raspador, centrifugando-as a 5.000g/15min/4ºC, ressuspendendo-as em 500µL de água-DEPC

(água ultra-pura tratada com 0,1% de dietil-pirocarbonato) e congeladas em nitrogênio

líquido.

24

3.1.2 Amostras de Campo

Foram utilizadas 53 amostras fecais de bezerros de fazendas leiteiras e 22 amostras de

vacas leiteiras já disponíveis no Laboratório de Biologia Molecular Aplicada e Sorologia do

Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, armazenadas ou -20°C e já testadas

previamente quanto à presença de coronavírus bovino por nested RT-PCR dirigida ao gene

codificador da RNA-polimerase RNA-dependente RdRp (BRANDÃO et al., 2005) e rotavírus

por PAGE, eletroforese em gel de poliacrilamida (HERRING et al., 1982) (Quadros 1 e 2).

número amostra Diarréia BCoV RV número amostra Diarréia BCoV RV

1 001 P N N 12 Estrela ? P N

2 729 ? P N 13 96 A P N

3 841 P P N 14 339 ? P N

4 923 P N N 15 9215 P P N

5 934 P N N 16 Fofa P N N

6 972 P P N 17 1005 P P N

7 1275 P P N 18 887 P P N

8 9224 P P N 19 299 A P N

9 978 A P N 20 Vaca 1 A N N

10 9146 P P N 21 40/00 P N N

11 Chita A N N 22 F-23 ? P N

P – positivo/ presente N – negativo A – ausente ? – desconhecido

Quadro 1 – Amostras fecais de vacas utilizadas no presente estudo e resultados prévios da nested RT-PCR para BCoV e PAGE para rotavírus

25

Número Amostra Diarréia BCoV RV Número Amostra Diarréia BCoV RV

1 37/00 A N N 28 84/01 P N N

2 38/00 A N N 29 85/01 P N N

3 39/00 A N N 30 27/02 ? N N

4 42/00 P N N 31 30/02 ? N N

5 44/00 P N P 32 31/02 A N N

6 47/00 P N P 33 32/02 A N N

7 48/00 P N N 34 33/02 A N N

8 49/00 A N N 35 34/02 A N N

9 51/00 P N N 36 35/02 A N N

10 52/00 A N N 37 36/02 A N N

11 31/01 A N N 38 37/02 A N N

12 32/01 A N N 39 38/02 A N N

13 33/01 A N N 40 39/02 A N N

14 34/01 A N N 41 41/02 A N N

15 35/01 A N N 42 42/02 A N N

16 47/01 P N N 43 43/02 P N N

17 73/01 A N N 44 44/02 A N N

18 74/01 P N N 45 45/02 A N N

19 75/01 P N N 46 46/02 A N N

20 76/01 A N N 47 47/02 A N N

21 77/01 A N N 48 49/02 A N P

22 78/01 A N N 49 51/02 ? N N

23 79/01 P N N 50 58/02 ? N N

24 80/01 A N N 51 61/02 ? N N

25 81/01 P N N 52 68/02 ? N N

26 82/01 A N N 53 75/02 ? N N

27 83/01 A N N

P – positivo/ presente N – negativo A – ausente ? – desconhecido Quadro 2 – Amostras fecais de bezerros utilizadas no presente estudo e resultados prévios de

nested RT-PCR para coronavírus bovino (BCoV) e PAGE para rotavírus (RV) e ocorrência de diarréia no momento da colheita

26

3.2 PREPARO DAS AMOSTRAS

As amostras fecais foram preparadas como suspensões a 50% (fezes líquidas), a 20%

(fezes pastosas) ou a 10% (fezes consistentes) em água-DEPC e clarificadas a 5.000 x

g/15min a 4°C, tomando-se o sobrenadante como amostra.

3.3 EXTRAÇÃO DE RNA

A extração de RNA total as amostras de referência de coronavírus bovino, rotavírus e

células MDBK, bem como das suspensões de amostras fecais, foi realizada com TRIzol

reagent (Invitrogen®), segundo as instruções do fabricante.

3.4 PADRONIZAÇÃO INDIVIDUAL DAS HEMI-NESTED RT-PCR PARA BCoV, RV E RNA MENSAGEIRO DE DNA MITOCONDRIAL BOVINO

Inicialmente, foram padronizadas as reações de hemi-nested RT-PCR em separado

para a detecção de BCoV e rotavírus e RT-PCR para RNA mensageiro do gene NADH-

desidrogenase (ND5) mitocondrial bovino.

3.4.1 Primers

Os primers utilizados para detecção de BCoV, RV do grupo A, desenhados

especificamente para o presente trabalho; e para utilização como controle interno estão

descritos nos itens a seguir.

27

3.4.1.1 Coronavírus Bovino

Para a detecção de BCoV, foi utilizado um conjunto de três primers dirigidos ao gene

codificador da proteína de nucleocapsídeo N do BCoV (Quadro 3). Tais primers foram

desenhados especificamente para o presente trabalho, utilizando-se o aplicativo

OligoPerfectTMDesigner1 a partir de uma seqüência consenso para o gene N obtida após o

alinhamento das seqüências de número de acesso GenBank AB354579, U00735, NC_003045,

EF424617, EF424616, EF424615, EF193074, EF193073, DQ811784, AF220295, AF391542,

AF391541 e M36656, utilizando-se o algoritmo CLUSTAL/W com o programa Bioedit

7.0.9.0 (HALL, 1999).

O gene N foi determinado como alvo para a detecção do BCoV por ser este altamente

conservado entre diferentes amostras deste vírus, o que permite alta sensibilidade diagnóstica,

ao mesmo tempo em que guarda distância em relação a outras espécies de coronavírus

(MASTERS, 2006), o que permite o desenho de primers de maior especificidade para BCoV.

Primer Seqüência (5’-3’) Região Tm Amplicon

BCOV1 (senso) AAGAGCTCAAYCCAAGCAAACTGY 123-146 60°C

BCOV2 (anti-senso) AGCAGACCTTCCTGAGCCTTCAAT 562-585 60°C

463pb

BCOV3 (anti-senso) TCAATRTCGGTGCCATACTGGTCT 405-428 59,9°C 306pb (com BCOV1)

Quadro 3 – Primers utilizados para a detecção do gene codificador da proteína de nucleocapsídeo N de

coronavírus bovino e suas regiões nucleotídicas de hibridação no gene N da amostra Mebus (U00735), temperaturas de fusão (Tm) e respectivos amplicons (em pares de bases)

3.4.1.2 Rotavírus do grupo A

As reações de RT-PCR para a detecção de rotavírus foram realizadas com o uso de

três primers, também desenhados especificamente para o presente trabalho, dirigidos ao gene

codificador da proteína viral VP1 (Quadro 4), a qual tem função de RNA-polimerase RNA

dependente nos rotavírus, sendo este um gene conservado entre os diversos genótipos de

1 No sítio www.invitrogen.com, acesso em 20/02/2008

28

rotavírus do grupo/ espécie A (ESTES; KAPIKIAN, 2007), o que permite inferir a existência

de marcadores moleculares estáveis para um diagnóstico de triagem sensível e específico.

Para tanto, foi obtida uma seqüência consenso a partir do alinhamento das seqüências

de número de acesso GenBank X55444.1, J04346.1, DQ494405.1 e DQ494406.1 utilizando-

se o algoritmo CLUSTAL/W com o programa Bioedit 7.0.9.0 (HALL, 1999), obtendo-se os

três primers com o aplicativo OligoPerfectTM Designer.


ROT1 (senso) CTCTGGCAAARCTGGTGTCA 737-753 59,7°C

ROT2 (anti-senso) CATTCGACGCTGATGACATY 1206-1225 59,7°C

492pb

ROT3 (anti-senso) ARCAATCRACCAACCASTCCTGTA 938-961 59,8°C 228pb (com ROT1)

Quadro 4 – Primers utilizados para a detecção de gene codificador da proteína viral VP1 de rotavírus do grupo A

e regiões nucleotídicas de hibridação em relação ao segmento genômico 1 da amostra KJ44 (DQ494405.1), temperaturas de fusão (Tm) e respectivos amplicons (em pares de bases)

3.4.1.3 RNA mensageiro de DNA mitocondrial bovino

Como controle interno da reação de multiplex hemi-nested RT-PCR, foi utilizado

como alvo o RNA mensageiro do gene mitocondrial codificador da NADH-desidrogenase 5,

com o intuito de aferir a efetividade das reações realizadas com cada amostra, uma vez tendo

sido padronizada a reação multiplex.

Para tanto, foram utilizados os primers já descritos por Caldwell et al. (2007),

apresentados no quadro 5.


BOV-S (senso) CAGCAGCCCTACAAGCAATGT 497-517 58,1°C

BOV-AS (anti-senso) GAGGCCAAATTGGGCGGATTAT 666-687 58°C

191pb

Quadro 5 – Primers utilizados para a detecção do gene mitocondrial bovino codificador da proteína NADH-desidrogenase e regiões nucleotídicas de hibridação em relação à seqüência de número de acesso GenBank NC_006853, temperaturas de fusão (Tm) e respectivo amplicon (em pares de bases), descritos por CALDWELL et al. (2007)

29

3.4.1.4 Compatibilidade entre os primers

Cada um dos oito primers apresentados nos quadros 3, 4 e 5 foi submetido ao

BLAST/n2 para busca por seqüências de maior identidade e hibridação não relacionados a

seus genes-alvo.

A seguir, cada primer foi analisado utilizando-se o aplicativo OligoAnalyser 3.03

quanto à formação de homo e heterodímeros, hairpins e temperaturas de fusão (Tm).

3.4.2 Determinação das temperaturas ótimas de hibridação dos primers

Inicialmente, foi pesquisada a temperatura ótima de hibridação para as reações de PCR

em separado (combinações de primers BCOV1 + BCOV2, ROT1 + ROT2, BOV-S+BOV-

AS, BCOV1 + BCOV3 e ROT1 + ROT3) e hemi-nested (combinações de primers

BCOV1+BCOV3 e ROT1+ROT3 após RT-PCR utilizando a temperatura ótima de hibridação

para esta primeira reação).

Utilizou-se o termociclador MasterCycler® (Eppendorf®) para o gradiente de

temperatura para os primers de BCoV e o DNA Engine Gradient Cycler® (BioRad®) para as

reações restantes, seguindo-se o protocolo abaixo descrito e elegendo-se como temperatura

ótima para cada conjunto de primers aquela cuja reação mostrasse, após eletroforese, a banda

do tamanho esperado (Quadros 3, 4 e 5) de maior intensidade e com menor número de bandas

inespecíficas.

2 Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST>. Acesso em: 20 fev. 2008. 3 Disponível em: <www.idtdna.com>. Acesso em: 20 fev. 2008.

30

3.4.2.1 Síntese de DNA complementar (cDNA)

Foram transferidos, em três tubos separados para PCR de 200µL, respectivamente

14µL do RNA extraído da amostra Kakegawa de BCoV, da amostra 8209 de rotavírus e das

células da linhagem MDBK para controle endógeno.

A seguir, cada tubo contendo RNA foi levado a 95°C durante 5 minutos para

desnaturação do RNA, sendo estes, a seguir, imersos em gelo e adicionados da combinação de

reagentes para a transcrição reversa contendo 1x First Strand Buffer® (Invitrogen®), 1mM de

cada dNTP, 10mM DTT, 1µM de cada primer (BCOV1+BCOV2 para BCoV, ROT1+ROT2

para rotavírus e BOV-S+BOV-AS para o gene mitocondrial ND5) e 400U de M-MLV

Reverse Transcriptase® (Invitrogen®) para um volume final de 40µL, realizando-se a

transcrição reversa a 42°C/60 minutos.

3.4.2.2 Primeira amplificação (PCR)

Após a obtenção do DNA complementar, foi realizada a reação de PCR em

termociclador de gradiente com 12 temperaturas de hibridação diferentes distribuídas ao redor

de uma temperatura central.

Para tanto, 2,5µL do respectivo cDNA foram adicionados na combinação de reagentes

para PCR contendo 1x PCR Buffer® (Invitrogen®), 0,2mM de cada dNTP, 0,25µM de cada

par de primers (BCOV1+BCOV2 e BCOV1+BCOV3 para BCoV, ROT1+ROT2 e

ROT1+ROT3 para rotavírus e BOV-S+BOVAS para o mRNA mitocondrial ND5), 1,5mM

MgCl2 e 0,5U de Platinum Taq DNA Polymerase® (Invitrogen®) para um volume final de

25µL completado com água-DEPC.

A seguir, os 12 tubos de cada uma das cinco combinações de primers foram levados ao

termociclador para desnaturação inicial de 94°C/4min, seguida de 35 ciclos de 94°C/30seg

(desnaturação), 55°C/30seg com gradiente de 5°C (hibridação) e 72°C/45seg (polimerização),

seguindo-se após o ciclo, 72°C/5min para extensão final.

Após a eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com 0,5µg/mL de brometo de

etídeo e observado sob a luz ultra-violeta, foi eleita como temperatura ótima de hibridação

31

aquela cuja reação mostrasse a banda do tamanho esperado (Quadros 3, 4 e 5) de maior

intensidade e com menor número de bandas inespecíficas.

Se em todas as temperaturas de hibridação testadas houvesse o aparecimento de bandas

inespecíficas, mais um gradiente seria realizado utilizando-se temperatura central de 60ºC

com gradiente de 5ºC.

3.4.2.3 Segunda amplificação (Hemi-nested PCR)

Para cada hemi-nested PCR para BCoV e rotavírus, foi realizada previamente uma

RT-PCR utilizando-se os primers BCOV1+BCOV2 para BCoV e ROT1+ROT2 para rotavírus

em volume final de 50µL para cada um dois vírus em separado, com o intuito de realizar 12

reações de hemi-nested a seguir, uma para cada temperatura no termociclador de gradiente,

utilizando-se as mesmas condições descritas (itens 3.4.2.1 e 3.4.2.2), mas utilizando-se para a

fase de PCR a temperatura de hibridação determinada como ótima para a mesma.

A partir desta PCR, para cada uma das 12 repetições de cada uma das 2 PCR (BCoV e

rotavírus), a fase de hemi-nested foi realizada adicionando-se 2,5µL do produto da primeira

amplificação à combinação de reagentes de PCR contendo 1x PCR Buffer® (Invitrogen®),

0,2mM de cada dNTP, 0,25µM de cada primer (BCOV1+BCOV3 para BCoV, ROT1+ROT3

para rotavírus), 1,5mM MgCl2 e 0,5U de Platinum Taq DNA Polymerase® (Invitrogen®) e

água ultra-pura esterilizada (para um volume final de 25µL), levando-se ao termociclador

para desnaturação inicial de 94°C/4min seguida de 25 ciclos de 94°C/30seg (desnaturação),

55°C/30seg com gradiente de 5°C (hibridação) e 72°C/45seg (polimerização), seguindo-se,

após o ciclo, 72°C/5min para extensão final.

Após eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com 0,5µg/mL de brometo de

etídeo e observado sob luz ultra-violeta, foi eleita como temperatura ótima de hibridação

aquela cuja reação mostrasse a banda do tamanho esperado (Quadros 3 e 4) de maior

intensidade e com menor número de bandas inespecíficas.

32

3.4.3 Determinação da sensibilidade analítica

Neste trabalho, utilizou-se o termo limiar de detecção como sendo a quantidade de

RNA-alvo mínima para a geração de bandas visíveis, ou seja, um menor limiar de detecção

significa uma menor sensibilidade analítica.

Para a avaliação da sensibilidade analítica individual de cada uma das reações em

separado, foram realizadas diluições em base 10 das amostras Kakegawa de BCoV e 8209 de

rotavírus, utilizando-se como diluentes água-DEPC e soro fetal bovino, utilizando as

condições de reação descritas e determinadas (itens 3.4.2.1, 3.4.2.2 e 3.4.2.3), sendo que as

temperaturas de hibridação para a PCR (primeira amplificação) e hemi-nested foram aquelas

determinadas como ótimas para cada uma destas fases.

Paralelamente, com o intuito de se avaliar o efeito de inibidores de transcrição reversa

ou de PCR presentes em amostras fecais, foi também usada como diluente uma suspensão de

um pool de cinco amostras fecais de bezerros negativas para a presença de BCoV e rotavírus,

cuja negatividade foi confirmada após teste pelas respectivas hemi-nested RT-PCR.

A sensibilidade analítica da reação para o mRNA do gene mitocondrial ND5 foi

realizada a partir de diluições na base 10 de suspensão de células MDBK em água-DEPC.

Não foram utilizados como diluentes o soro fetal bovino ou suspensão de fezes devido à

possibilidade destes diluentes interferirem no limiar de detecção, visto que naturalmente

podem conter o mRNA em questão.

Como controles negativos, foram utilizados os três diluentes desde o momento da

extração de RNA.

Os produtos das reações de PCR (primeira amplificação) e hemi-nested PCR foram

submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com 0,5µg/mL de brometo de

etídeo e observado sob luz ultra-violeta, determinando-se o limiar de detecção como a última

diluição na qual foi detectada a banda específica visível.

33

3.4.4 Determinação da identidade dos fragmentos amplificados

Os fragmentos amplificados em cada reação (apenas um fragmento representativo de

cada reação, da fase de determinação de temperaturas de hibridação – Quadros 3, 4 e 5) foram

submetidos à reação de seqüenciamento de DNA para a confirmação de sua especificidade.

Para tanto, os fragmentos foram purificados dos géis de agarose com o kit Ilustra (GE).

A reação de seqüenciamento consistiu em 2µL de BigDye 3 (Apllied BiosystemsTM),

4µL de 5x Sequencing Buffer (Apllied BiosystemsTM), 5pmol de cada primer senso e anti-

senso referente a cada gene em reações separadas e 3-10ng do DNA alvo para uma reação

final de 20µL, levando-se ao termociclador PTC-200 (MJ ResearchTM) para 35 ciclos de

96°C/30seg, 50°C/15seg e 60°C/4min, com rampa de 0,7°C /seg entre cada temperatura.

A seguir, o produto desta reação foi precipitado à temperatura ambiente com 80µL de

isopropanol a 75%, incubando-se durante 20 minutos, centrifigando-se a 12.000 x g/30min,

removendo-se o sobrenadante e adicionando-se 300µL de etanol a 70%, centrifugando-se a

12.000 x g/5min e secando-se o precipitado, levando-se as amostras ao seqüenciador

automático ABI-377 (Apllied BiosystemsTM).

Os cromatogramas gerados para cada umas das seqüências senso e anti-senso de cada

amostra foram submetidos ao aplicativo Phred online4 para avaliação da qualidade dos

mesmos. A seqüência consenso final de cada amostra foi obtida a partir das seqüências senso

e anti-senso de cada fragmento com o aplicativo CAP-Conting do programa Bioedit 7.0.9.0

(HALL, 1999), sendo a mesma submetida ao BLAST/n para a confirmação das identidades

dos fragmentos amplificados.

3.4.5 Aplicação das RT-PCR em amostras fecais

As 22 amostras de vacas (Quadro 1) e 53 de bezerros (Quadro 2) foram testadas pelos

dois métodos individuais de detecção de BCoV e RV.

Para tanto, as suspensões fecais foram preparadas em água-DEPC de acordo com a

consistência das fezes. Amostras fecais consistentes foram diluídas a na diluição de 1:10,

4 Disponível em: <http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph>. Acesso em: 05 out. 2009.

34

fezes de consistência pastosa, de 1:5 e fezes líquidas, de 1:2 (v/v); clarificadas a 5.000

g/15min a 4ºC, utilizando-se o sobrenadante para extração pelo método de extração TRIzol.

As amostras Kakegawa e 8209 foram utilizadas como controles positivos de BCoV e

rotavírus, respectivamente, e a água-DEPC como controle negativo.

A transcrição reversa, a PCR e a hemi-nested PCR foram realizadas de acordo com o

que foi descrito (itens 3.4.2.1, 3.4.2.2 e 3.4.2.3).

Durante todo o trabalho, cada etapa (extração de RNA, RT-PCR, hemi-nested,

eletroforese e reação de seqüenciamento de DNA) foi realizada em uma sala diferente com

materiais e reagentes exclusivos para cada etapa, com o intuito de se evitarem contaminações

por DNA amplificado.

Além disso, na etapa de hemi-nested, um tubo contendo água-DEPC foi adicionado a

cada três amostras ao mix e submetido ao termociclador com o intuito de monitorar

contaminação por DNA amplificado.

As comparações entre as hemi-nested RT-PCR padronizadas no presente trabalho e

suas técnicas padrão (nested RT-PCR para o gene RdPd para BCoV e PAGE para rotavírus)

foram realizadas aplicando-se o teste de concordância kappa de acordo com a função sugerida

por Thrusfield (2004), no programa Microsoft Excel (MICROSOFT CORPORATION, 2007).

3.4.6 Comparação da utilização de controle interno endógeno e exógeno

A RT-PCR para o mRNA do gene mitocondrial de bovino foi testada em sete amostras

de bezerros escolhidas aleatoriamente, dentre aquelas integrantes do quadro amostral com o

intuito de verificar a eficácia da reação nessas amostras (controle interno endógeno).

Também foi avaliado o desempenho desta RT-PCR como controle interno exógeno.

Para tanto, antes da extração, foi realizada a adição de cada uma das amostras de campo a

serem testadas com a suspensão de células MDBK na proporção de 1:26, seguindo-se então, o

mesmo protocolo descrito para o controle endógeno.

35

3.5 PADRONIZAÇÃO DA MULTIPLEX HEMI-NESTED RT-PCR

Após a padronização das reações individuais, procedeu-se a padronização da multiplex

hemi-nested RT-PCR utilizando-se as temperaturas de hibridação das reações individuais para

a primeira e segunda reação, sendo que a determinação do protocolo final, da sensibilidade e

especificidade analíticas foram realizadas de acordo com o descrito a seguir.

3.5.1 Determinação da combinação de reagentes a ser utilizada na multiplex

Inicialmente, foram extraídos os RNA da amostra Kakegawa de BCoV, 8209 de

rotavírus e suspensão de células MDBK separados e combinados em volumes iguais (1:1:1).

Também foram extraídos os RNA das diluições na base 10 (até 10-5) de cada um dos três

controles em água-DEPC e dos dois controles virais (BCoV e RV) e em suspensão de fezes

negativas para BCoV e RV a 10% adicionados de 10% de suspensão de células MDBK.

3.5.1.1 Síntese de DNA complementar (cDNA)

Foram desnaturados 3,5µL de RNA total extraído a 95°C durante 5 minutos, sendo

estes, a seguir, imersos em gelo e adicionados da combinação de reagentes para a transcrição

reversa contendo 1x First Strand Buffer® (Invitrogen®), 1mM de cada dNTP, 10mM DTT,

1µM de cada primer (BCOV1, BCOV2, ROT1, ROT2, BOV-S e BOV-AS, simultaneamente)

e 100U de M-MLV Reverse Transcriptase® (Invitrogen®) para um volume final de 10µL,

realizando-se a transcrição reversa a 42°C/60min.

Devido a grande quantidade de primers utilizados nesta reação, foi testada

paralelamente, uma combinação de reagentes utilizando primers randômicos, contendo 1x

First Strand Buffer® (Invitrogen®), 1mM de cada dNTP, 10mM DTT, 2,5 ng de primers

randômicos e 100U de M-MLV Reverse Transcriptase® (Invitrogen®) para um volume final

de 10µL, realizando-se a transcrição reversa a 42°C/60min.

36

Esses dois protocolos de transcrição reversa foram utilizados com os mixes 1 e 2

(Quadro 6) da PCR e hemi-nested. Os testes posteriores foram realizados utilizando-se a

transcrição reversa que se apresentou com maior eficiência quanto a sensibilidade e

especificidade com estes dois mixes de PCR.

3.5.1.2 Primeira amplificação (PCR)

Foram testadas diversas combinações de reagentes para PCR e hemi-nested com

diferentes concentrações de DNA polimerase, de cloreto de magnésio, de primers e de DNA,

como mostra o quadro 6.

Reagentes Mix

1

Mix

2

Mix

3

Mix

4

Mix

5

Mix

6

Mix

7

Mix

8

Mix

9

Mix

10

Mix

11

Mix

12

PCR Buffer

(Invitrogen)

1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X 1X

1X 1X 1,2X

dNTP (mM) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

MgCl2 (mM) 2,0 2,0 2,0 3,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

2,0 2,0 2,0

BCoV1

(µM)

0,5 0,4 0,4 0,4 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32

0,32 0,32 0,4

BCoV2

(µM)

0,5 0,4 0,4 0,4 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,4

BOVS (µM) 0,5 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,28

0,28 0,28 0,32

BOVAS

(µM)

0,5 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,28 0,28 0,28 0,32

ROT1 (µM) 0,5 0,4 0,4 0,4 0,48 0,48 0,48 0,48 0,4 0,4 0,4 0,48

ROT2 (µM) 0,5 0,4 0,4 0,4 0,48 0,48 0,48 0,48 0,4 0,4 0,4 0,48

Taq (U)

(Invitrogen)

1,0 1,0 1,5 2,0 1,0 1,5 1,0 1,5 1,0 1,5 1,5 1,25

DNA (µL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 5,0 5,0 5,0 5,0 2,5 2,5

Quadro 6 – Relação das concentrações de reagentes e DNA testadas para as reações multiplex hemi-nested RT-PCR para BCoV, RV e controle interno

37

As reações foram levadas ao termociclador para desnaturação inicial de 94°C/4min

seguida de 35 ciclos de 94°C/30seg (desnaturação), 30seg à temperatura ótima de hibridação

determinada segundo o item 3.4.2 e 72°C/45 seg (polimerização), seguindo-se, após o ciclo,

72°C/5min para extensão final.

Para os mixes 1 e 2 também foi testado um ciclo com maior tempo de extensão:

94°C/4min seguida de 35 ciclos de 94°C/30seg (desnaturação), 30seg à temperatura ótima de

hibridação e 72°C/60seg (polimerização), seguindo-se, após o ciclo, 72°C/10min para

extensão final.

3.5.1.3 Segunda amplificação (Hemi-nested PCR)

A combinação de reagentes da PCR foi repetida na reação de hemi-nested, exceto nos

mixes 7, 8 e 9 nas quais foram testadas também reações de hemi-nested com 5,0 e com 2,5µL

de DNA da primeira amplificação. As reações foram levadas ao termociclador para

desnaturação inicial de 94°C/4min seguida de 25 ciclos de 94°C/30seg (desnaturação), 30seg

à temperatura ótima de hibridação determinada segundo o item 3.4.2 e 72°C/45 seg

(polimerização), seguindo-se, após o ciclo, 72°C/5min para extensão final.

Para os mixes 1 e 2 foi testado também o ciclo com maior tempo de extensão,

semelhante ao da PCR (item 3.5.1.2), mas com 25 ciclos.

Após a eletroforese dos produtos de PCR e hemi-nested PCR, foi eleita a combinação

de reagentes que apresentasse o menor, ou seja, melhor limiar de detecção, com menor

utilização de reagentes e que não apresentasse produção de fragmentos inespecíficos.

3.5.2 Determinação da sensibilidade analítica da multiplex hemi-nested RT-PCR

Para a avaliação da sensibilidade analítica da multiplex, foram realizadas diluições na

base 10, até a diluição 10-10 nos três diluentes: água-DEPC, soro fetal bovino e suspensão de

fezes negativas para BCoV e RV a 10%.

38

Para a diluição em água-DEPC, os três controles positivos foram diluídos, enquanto

que para a diluição em soro fetal bovino e em suspensão de fezes o controle interno foi

adicionado na proporção de 10% antes da diluição dos dois vírus nestes diluentes.

Para a diluição em soro fetal bovino e em suspensão de fezes livres de BCoV e

rotavírus, os vírus combinados foram diluídos na base 10, sendo que a suspensão de MDBK

foi adicionada na proporção de 1:10, como controle interno, no diluente. Essas diluições

foram submetidas a extração de RNA pelo método de TRIzol (item 3.3), sendo os RNA

extraídos submetidos ao protocolo eleito para a avaliação de sua sensibilidade analítica.

Após a eletroforese dos produtos de PCR e hemi-nested PCR, foi determinado como

limiar de detecção para a multiplex RT-PCR a maior diluição da combinação

BCoV/Rotavírus na qual se observe cada uma das bandas esperadas em uma mesma reação

após eletroforese em gel de agarose.

3.5.3 Aplicação da multiplex hemi-nested RT-PCR com diferentes concentrações de cada vírus

Com o intuito de verificar se havia inibição quando existe uma grande quantidade em

uma das seqüências-alvo e pequena quantidade da outra seqüência alvo, foram testadas seis

combinações dos dois vírus padrão, como mostra o quadro 7, com diferentes concentrações de

cada vírus.

1 2 3 4 5 6

BCoV (µL) 247,5 225 200 50 25 2,5

RV (µL) 2,5 25 50 200 225 247,5

MDBK (µL) 10 10 10 10 10 10

Quadro 7 – Diferentes combinações de BCoV e RV testados pela multiplex hemi-nested RT-PCR, para verificação da interferência de diferentes proporções de RNA-alvo

39

3.5.4 Aplicação da multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV em amostras fecais de bovinos

A preparação das amostras, as etapas extração de RNA, transcrição reversa, primeira

amplificação (PCR) e hemi-nested PCR foram realizadas nas amostras conforme descrito e

determinado nos itens 3.2, 3.3 e 3.5.

Após eletroforese dos produtos da fase de hemi-nested em gel de agarose a 1,5%,

foram consideradas positivas as amostras que resultassem bandas de 306pb (BCoV) e/ou

228pb (rotavírus), sendo consideradas não válidas aquelas reações negativas para os dois vírus

e que não resultassem a banda de 191pb (controle interno).


Todas as amostras que foram positivas para BCoV ou rotavírus foram submetidas ao

seqüenciamento de DNA, conforme o item 3.4.4, para determinação da identidade dos

fragmentos amplificados.

3.6 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS

A especificidade analítica da multiplex hemi-nested RT-PCR foi determinada pela

identificação dos segmentos amplificados por meio de seqüenciamento de DNA, enquanto

que a sensibilidade analítica pelo limiar de detecção obtido após a diluição das amostras virais

de referência em água-DEPC, em soro fetal bovino e em suspensão de fezes livre de BCoV e

rotavírus, esta última com o intuito de se avaliar o efeito de inibidores de RT-PCR presentes

nas fezes, o que poderia diminuir a sensibilidade analítica.

A efetividade das etapas de extração de RNA, transcrição reversa e PCR (primeira e

segunda amplificações) foi avaliada pela amplificação, em todas as reações, do fragmento de

191pb referente ao gene mitocondrial bovino ND5.

40

A prova de multiplex hemi-nested RT-PCR proposta foi comparada com as provas

pelas quais as amostras já foram testadas (nested-RT-PCR para o gene RdRp para BCoV e

PAGE para rotavírus) e com as reações individuais padronizadas neste trabalho através da

aplicação do teste kappa, conforme já descrito no item 3.4.5.

41

4 RESULTADOS

Os resultados baseados na metodologia definida para este trabalho estão descritos nos

itens a seguir.

4.1 PADRONIZAÇÃO DA HEMI-NESTED RT-PCR PARA BCoV

Os resultados a seguir referem-se à padronização da hemi-nested RT-PCR para

detecção de BCoV.

4.1.1 Determinação das temperaturas ótimas de hibridação

Para os primers BCOV1 + BCOV2 todas as temperaturas de hibridação testadas (50º a

65ºC) foram eficientes em detectar a banda de 463pb, específica para coronavírus bovino;

porém, todas apresentaram duas bandas inespecíficas, de 850 e 200pb, aproximadamente

(Figuras 1 e 2).

As reações testadas em todas as temperaturas obtiveram um desempenho semelhante,

ou seja, todas apresentaram a banda específica e bandas inespecíficas com intensidade

semelhante; portanto, foi eleita como temperatura ótima de hibridação a menor, de 50ºC, com

o intuito de elevar a sensibilidade analítica na primeira amplificação.

No gradiente realizado para os primers BCOV1 e BCOV3, todas as temperaturas de

hibridação (50º a 60ºC) apresentaram a banda esperada de 306pb, com a mesma intensidade e

sem presença de bandas inespecíficas (Figura 3).

42

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5 de brometo de etídeo do primeiro gradiente de temperatura de hibridação para os primers BCOV1 + BCOV2. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb; 1 – 50ºC; 2 – 50,2ºC; 3 – 50,7ºC; 4 – 51,6ºC; 5 – 52,7ºC; 6 – 54ºC; 7 – 55,4ºC; 8 – 56,8ºC; 9 – 58,1ºC; 10 – 59,2ºC; 11 – 60ºC; 12 – 60,4ºC, mostrando as bandas de 463pb para a amostra Kakegawa de coronavírus bovino

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 2 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com 0,5% de brometo de etídeo do segundo gradiente de temperatura de hibridação para os primers BCOV1 + BCOV2. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb; 1 – 55ºC; 2 – 55,2ºC; 3 – 55,7ºC; 4 – 56,6º C; 5 – 57,8ºC; 6 – 59,1ºC; 7 – 60,5ºC; 8 – 61,8ºC; 9 – 63,1ºC; 10 – 64,2ºC; 11 – 65ºC; 12 – 65,5ºC, mostrando as bandas de 463pb para a amostra Kakegawa de coronavírus

Figura 3 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com 0,5% de brometo de etídeo do gradiente de temperatura de hibridação para os primers BCOV1 + BCOV3. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb; 1 – 50ºC; 2 – 50,2ºC; 3 – 50,7ºC; 4 – 51,6ºC; 5 – 52,7ºC; 6 – 54ºC; 7 – 55,4ºC; 8 – 56,8ºC; 9 – 58,1ºC; 10 – 59,2ºC; 11 – 60ºC; 12 – 60,4ºC, mostrando as bandas de 306pb para a amostra Kakegawa de coronavírus

Como mostra a figura 4, o gradiente para a hemi-nested (utilizando-se os primers

BCOV1 e BCOV3 após RT-PCR com temperatura de hibridação de 50ºC, com BCOV1 e

BCOV2), apresentou a banda esperada, de 306pb, em todas as temperaturas de hibridação

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

463pb

463pb

306pb

43

testadas (50º a 65ºC), porém apresentaram também um fragmento inespecífico na altura de

1000pb, além da banda da primeira reação (463pb).

Figura 4 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com 0,5% de brometo de etídeo do gradiente de temperatura de hibridação para os primers BCOV1 + BCOV3, após RT-PCR. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb; 1 – 50ºC; 2 – 50,2ºC; 3 – 50,7ºC; 4 – 51,6ºC; 5 – 52,7ºC; 6 – 54ºC; 7 – 55,4ºC; 8 – 56,8ºC; 9 – 58,1ºC; 10 – 59,2ºC; 11 – 60ºC; 12 – 60,4ºC, mostrando as bandas de 306pb para a amostra Kakegawa de coronavírus

Como todas as temperaturas de hibridação testadas apresentaram a banda esperada

com intensidades semelhantes, foi eleita para a reação de hemi-nested PCR uma temperatura

ótima de hibridação de 55ºC, um pouco mais elevada do que a temperatura de hibridação da

primeira reação com o intuito de elevar a especificidade analítica da reação.


A sensibilidade analítica da reação para BCoV foi de 10-3, quando o mesmo foi diluído

em água-DEPC (Figura 5); 10-3, em soro fetal bovino (Figura 6), 10-3 em suspensão fecal a

20% (Figura 7) e de 10-7 em suspensão fecal a 10% (Figura 8).

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

306pb

44

Figura 5 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da hemi-nested RT-PCR para coronavírus em água DEPC. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb, 1 – BCoV não diluído (100), 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – 10-7, 9 – 10-8, 10 – 10-9, 11 – 10-10, 12 – controle negativo (água DEPC), mostrando as bandas de 306pb para a amostra Kakegawa de coronavírus

Figura 6 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da hemi-nested RT-PCR para coronavírus em soro fetal bovino. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb, 1 – BCoV não diluído (100), 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – 10-7, 9 – 10-8, 10 – 10-9, 11 – 10-10, 12 – controle negativo (soro fetal bovino) , mostrando as bandas de 306pb para a amostra Kakegawa de coronavírus

Figura 7 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da hemi-nested RT-PCR para coronavírus em suspensão de fezes a 20%. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb, 1 – BCoV puro, 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – 10-7, 9 – 10-8, 10 – 10-9, 11 – 10-10, 12 – controle negativo (suspensão de fezes), mostrando as bandas de 306pb para a amostra Kakegawa de coronavírus

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

306pb

306pb

306pb

45

Figura 8 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo do limiar de detecção da hemi-nested RT-PCR para coronavírus em suspensão de fezes a 10%, mostrando as bandas de 306pb para a amostra Kakegawa de coronavírus. 1 – BCoV puro, 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – 10-7, 9 – 10-8, 10 – 10-9, 11 – 10-10, 12 – controle negativo (suspensão de fezes), L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb


O seqüenciamento de DNA dos fragmentos esperados de 463pb da RT-PCR e de 306pb

da hemi-nested RT-PCR para a amostra Kakegawa confirmou a homologia com o gene N do

BCoV. As seqüências foram depositadas no GenBank e registradas com os números de acesso

FJ218459 e FJ218460, respectivamente.

4.1.4 Aplicação da hemi-nested RT-PCR para detecção de BCoV

A hemi-nested RT-PCR para BCoV aqui descrita e padronizada resultou em 21

animais positivos, incluindo aqueles que foram positivos para o teste usado como referência,

como mostra a tabela 1.

A concordância global entre os testes resultou em um valor kappa de 0,783, indicando

uma concordância substancial entre a hemi-nested RT-PCR para o gene N e a nested RT-PCR

para o gene RdPd de referência.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 L

306pb

46

Tabela 1 – Comparação dos resultados dos testes de nested RT-PCR dirigidos ao gene RdPd e da hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene N para detecção de BCoV, após aplicação em 75 amostras fecais de bovinos

Nested RT-PCR (gene RdPd)

Positivo Negativo Total

Positivo 15 6 21

Negativo 0 54 54

Hemi-nested

RT-PCR

(gene N) Total 15 60 75

Os resultados aqui apresentados para a padronização da hemi-nested RT-PCR para

detecção de BCoV foram aceitos para publicação no periódico Pesquisa Veterinária

Brasileira, v. 29, n.11, 2009.

4.2 PADRONIZAÇÃO DA HEMI-NESTED RT-PCR PARA ROTAVÍRUS DO GRUPO A

Os resultados a seguir referem-se à padronização da hemi-nested RT-PCR para a

detecção de rotavírus do grupo A.

4.2.1 Determinação das temperaturas ótimas de hibridação

Todas as temperaturas de hibridação testadas para os primers ROT 1 + ROT2 (Figura

9), ROT1 + ROT3 (Figura 10) e ROT1 + ROT3 após a RT-PCR (Figura 11) foram

igualmente eficientes em demonstrar as bandas esperadas e não apresentaram bandas

inespecíficas. Portanto, foram mantidas as temperaturas de hibridação eleitas para a reação de

BCoV (50ºC para a primeira e 55ºC para a segunda reação), com o intuito de facilitar a

padronização da reação de multiplex.

47

Figura 9 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do

gradiente de temperatura de hibridação para os primers ROT1 + ROT2. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb; 1 – 50ºC; 2 – 50,2ºC; 3 – 50,7ºC; 4 – 51,6ºC; 5 – 52,7ºC; 6 – 54ºC; 7 – 55,4ºC; 8 – 56,8ºC; 9 – 58,1ºC; 10 – 59,2ºC; 11 – 60ºC; 12 – 60,4ºC, mostrando as bandas de 492pb para a amostra 8209 de rotavírus

Figura 10 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do gradiente de temperatura de hibridação para os primers ROT1 + ROT3. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb; 1 – 50ºC; 2 – 50,2ºC; 3 – 50,7ºC; 4 – 51,6ºC; 5 – 52,7ºC; 6 – 54ºC; 7 – 55,4ºC; 8 – 56,8ºC; 9 – 58,1ºC; 10 – 59,2ºC; 11 – 60ºC; 12 – 60,4ºC, mostrando a banda de 228pb para a amostra 8209 de rotavírus

Figura 11 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do

gradiente de temperatura de hibridação para os primers ROT1 + ROT3, após RT-PCR. L – marcador de tamanhos moleculars de 100pb; 1 – 50ºC; 2 – 50,2ºC; 3 – 50,7ºC; 4 – 51,6ºC; 5 – 52,7ºC; 6 – 54ºC; 7 – 55,4ºC; 8 – 56,8ºC; 9 – 58,1ºC; 10 – 59,2ºC; 11 – 60ºC; 12 – 60,4ºC, mostrando as bandas de 228pb para a amostra 8209 de rotavírus

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

228pb

228pb

492pb

48


O limiar de detecção para a amostra 8209 de rotavírus foi de 10-3 quando diluída em

água-DEPC, de 10-6 em soro fetal bovino e de 10-10 em suspensão de fezes a 10%, como

mostram as figuras 12, 13 e 14, respectivamente.

Figura 12 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da hemi-nested RT-PCR para rotavírus em água DEPC. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb, 1 – rotavírus não diluído (100), 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – 10-7, 9 – 10-8, 10 – 10-9, 11 – 10-10, 12 – controle negativo (suspensão de fezes), mostrando os fragmentos de 228pb para a amostra 8209 de rotavírus

Figura 13 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da hemi-nested RT-PCR para rotavírus em soro fetal bovino. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb, 1 – rotavírus não diluído (100), 2 – 10-1 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – 10-7, 9 – 10-8, 10 – 10-9, 11 – 10-10, 12 – controle negativo (suspensão de fezes), mostrando as bandas de 228pb para a amostra 8209 de rotavírus

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

228pb

228pb

49

Figura 14 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da hemi-nested RT-PCR para rotavírus em suspensão de fezes a 10%. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb, 1 – rotavírus não diluído (100), 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – 10-7, 9 – 10-8, 10 – 10-9, 11 – 10-10, 12 – controle negativo (suspensão de fezes), mostrando as bandas de 228 para a amostra 8209 de rotavírus


O seqüenciamento de DNA dos fragmentos esperados de 492pb da RT-PCR e de

228pb da hemi-nested RT-PCR para a amostra 8209 confirmou a homologia com o gene VP1

do rotavírus. As seqüências foram depositadas no GenBank e registradas com os números de

acesso FJ986468 e FJ986469, respectivamente.

4.2.4 Aplicação da hemi-nested RT-PCR para detecção de RV

A hemi-nested RT-PCR padronizada para detecção de rotavírus resultou em 11

animais positivos das 75 testadas (Quadros 1 e 2), incluindo aqueles que foram positivos para

o teste usado como referência, como mostra a tabela 2.


uma concordância fraca entre a hemi-nested RT-PCR padronizada e a PAGE, teste utilizado

como referência.

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

228pb

50

Tabela 2 – Comparação dos resultados da PAGE e da hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da VP1 para detecção de rotavírus, após aplicação nas 75 amostras fecais de bovinos

PAGE


Positivo 3 8 11

Negativo 0 64 64

Hemi-nested

RT-PCR

(gene VP1)

Total 3 72 75

4.3 PADRONIZAÇÃO DA RT-PCR RNA MENSAGEIRO DE DNA MITOCONDRIAL BOVINO

Os resultados a seguir se referem a padronização da RT-PCR para RNA mensageiro

de DNA mitocondrial bovino.

4.3.1 Determinação da temperatura ótima de hibridação

Todas as temperaturas testadas (50º a 60ºC) para os primers BOVS e BOVAS foram

eficientes na amplificação do produto esperado de 191pb, sem que houvesse o aparecimento

de bandas inespecíficas (Figura 15). Logo, foi escolhida como temperatura ótima de

hibridação a mesma temperatura utilizada nas reações de coronavírus bovino e rotavírus, ou

seja, 50ºC para a primeira reação e 55ºC para a segunda reação (reamplificação).

51

Figura 15 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do gradiente de temperatura de hibridação para os primers BOVS + BOVAS. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb; 1 – 50ºC; 2 – 50,2ºC; 3 – 50,7ºC; 4 – 51,6ºC; 5 – 52,7ºC; 6 – 54ºC; 7 – 55,4ºC; 8 – 56,8ºC; 9 – 58,1ºC; 10 – 59,2ºC; 11 – 60ºC; 12 – 60,4ºC, mostrando as bandas de 191pb para mRNA de células MDBK


O limiar de detecção para o controle interno diluído em água-DEPC foi de 10-2, como

mostra a figura 16.

Figura 16 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da RT-PCR para controle interno diluído em água-DEPC. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb, 1 – suspensão de MDBK não diluída, 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – controle negativo (água-DEPC), mostrando as bandas de 191pb para mRNA de células MDBK

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

L 1 2 3 4 5 6 7

191pb

191pb

52


O seqüenciamento do fragmento amplificado a partir do mRNA ND5 de células

MDBK confirmou sua homologia com RNA mensageiro de DNA mitocondrial bovino. A

seqüência foi depositada no GenBank com o número de acesso FJ976184.

4.3.4 Aplicação em amostras de campo

Das sete amostras fecais testadas, somente três foram positivas para o controle interno

endógeno, enquanto que as quatro amostras restantes não apresentaram nenhuma banda, como

mostra a figura 17.

Figura 17 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, da aplicação da RT-PCR para controle interno endógeno em amostras fecais. L – marcador de tamanhos moleculares de 100pb, 1 a 7 – amostras fecais de bezerros, 8 – controle positivo (MDBK), 9 –controle negativo (água-DEPC), mostrando as bandas de 191pb

Utilizando esta mesma reação, mas como controle interno exógeno, ou seja,

contaminando propositalmente cada uma das amostras (Quadros 1 e 2) a ser testada com

suspensão de MDBK, a detecção do mRNA foi eficiente. Portanto, ficou padronizada a

utilização deste controle como interno justificando seu uso na padronização da multiplex

hemi-nested RT-PCR.

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9

191pb

53

4.4 PADRONIZAÇÃO DA MULTIPLEX HEMI-NESTED RT-PCR PARA DETECÇÃO SIMULTÂNEA DE BCoV E RV

Os resultados a seguir se referem a padronização da multiplex hemi-nested RT-PCR

para detecção de BCoV e RV do grupo A com a utilização de um controle interno.

4.4.1 Compatibilidade entre os primers

Na análise dos primers (BCOV1, BCOV2, BCOV3, ROT1, ROT2, ROT3, BOVS e

BOVAS) através do BLAST/n não foram encontradas seqüências de escore significativo que

não aquelas relacionadas aos alvos específicos de cada primer.

Através da utilização do aplicativo OligoAnalizer 3.0 também não foram encontradas

incompatibilidades entre as diferentes Tms, bem como estruturas diméricas ou secundárias

que impedissem seu uso em conjunto em uma reação de multiplex.

4.4.2 Síntese de DNA complementar (cDNA)

Utilizando os seis primers (BCOV1, BCOV2, ROT1, ROT2, BOVS e BOVAS) na

reação de transcrição reversa, seguida de PCR e hemi-nested com os mixes 1 e 2 somente a

combinação 1:1:1 de cada controle positivo apresentou as três bandas esperadas (BCoV,

rotavírus e mRNA ND5) e as diluições realizadas na base 10 não apresentaram nenhuma das

bandas esperadas, após a primeira e segunda reação.

Com a utilização dos primers randômicos na fase de transcrição reversa, seguida de

PCR e hemi-nested com os mixes 1 e 2, além da combinação 1:1:1, as diluições 10-1 e 10-2 do

mesmo apresentaram as bandas desejadas, demonstrando que a utilização de todos os primers

na transcrição reversa é menos eficiente do que a utilização do primer randômico. Assim,

todos os testes posteriores foram realizados utilizando-se os primers randômicos.

54

4.4.3 Avaliação das combinações de reagentes

Não foram verificadas diferenças significativas nas diluições realizadas em água-

DEPC, portanto, para escolha da melhor combinação de reagentes foi levada em consideração

somente a diluição da combinação BCoV:RV (1:1) realizada em suspensão de fezes (Quadro

8).

Os mixes 1, 2, 3 e 4, com combinação de primers equimolares, apresentaram

sensibilidade analítica relativamente baixa, de no máximo 10-3.

Os melhores resultados dentre todos os mixes testados foram dos mixes 8, 10, 11 e 12,

pois apresentaram resultados positivos até a última diluição realizada, de 10-5.

O mix 12 foi eleito como ideal, pois se utilizou de menor quantidade de DNA

polimerase dentre os mixes com mesmo limiar de detecção e apresentou bandas bem

definidas, sem amplificações inespecíficas ou manchas ao longo das áreas de corrida

eletroforética devidas a excesso de DNA.

4.4.4 Determinação da sensibilidade analítica da multiplex hemi-nested RT-PCR

A sensibilidade analítica da multiplex hemi-nested RT-PCR, utilizando o mix 12, foi

de 10-2 em água DEPC (Figura 18), de 10-6 em soro fetal bovino (Figura 19) e de 10-7 (Figura

20) em suspensão de fezes livre de BCoV e rotavírus.

55

Mix Água-DEPC Suspensão de fezes

1 10-1 10-1

2 10-2 10-2

3 10-3 10-3

4 10-3 10-3

5 10-3 10-2

6 10-3 10-3

7 10-2 10-4

7* 10-2 10-4

8 10-2 10-5

8* 10-2 10-5

9 10-1 10-4

9* 10-1 10-4

10 10-1 10-5

11 10-2 10-5

12 10-2 10-5

*reação de hemi-nested com 2,5µL de DNA

Quadro 8 – Resultados dos testes das diferentes combinações de reagentes para a reação de multiplex hemi-nested RT-PCR

56

Figura 18 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção de BCoV e RV em água-DEPC. 1 – combinação de 1:1:1 (BCoV, RV e MDBK), 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – CN (água-DEPC), mostrando as bandas de 306pb para a amostra Kakegawa de coronavírus, de 228 para a amostra 8209 de rotavírus e 191pb para o mRNA ND5 de células MDBK

Figura 19 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção de BCoV e RV em soro fetal bovino adicionado de 10% de suspensão de células MDBK. 1 – combinação 1:1 (BCoV e RV), 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – 10-7, 9 – 10-8, 10 – 10-9, 11 – 10-10, 11 – CN (soro fetal bovino)

Figura 20 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do limiar de detecção da multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção de BCoV e RV em suspensão de fezes negativa para BCoV e RV adicionada de 10% de suspensão de células MDBK. 1 – combinação 1:1 (BCoV e RV), 2 – 10-1, 3 – 10-2, 4 – 10-3, 5 – 10-4, 6 – 10-5, 7 – 10-6, 8 – 10-7, 9 – 10-8, 10 – 10-9, 11 – 10-10, 11 – CN (suspensão fecal com 10% de células MDBK), 12 – CN (água-DEPC)

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

306pb

228pb

191pb

306pb

228pb

191pb

306pb

228pb

191pb

57

4.4.5 Teste com diferentes proporções de BCoV e RV de referência

Todas as seis combinações realizadas com as amostras de referência Kakegawa de

coronavírus e 8209 de rotavírus (Quadro 6) foram positivas para BCoV e rotavírus além de

apresentarem a banda para o controle interno exógeno na multiplex hemi-nested RT-PCR com

a utilização do mix 12, como mostra a figura 21.

Figura 21 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 0,5% de brometo de etídeo, do teste com diferentes combinações dos dois vírus pela multiplex hemi-nested RT-PCR, mostrando as bandas de 306pb para BCoV, de 228pb para RV e de 191pb para o controle interno

4.4.6 Aplicação da multiplex hemi-nested RT-PCR em amostras fecais de bovinos

Das 75 amostras testadas pela multiplex hemi-nested RT-PCR, 15 foram positivas para

BCoV e 6 para RV do grupo A.

Os resultados da detecção de BCoV e rotavírus do grupo A nas amostras fecais de

bovino estão resumidos na tabela 3.

A figura 22 mostra os resultados de algumas amostras testadas pela multiplex.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

306pb

228pb

191pb

58

Tabela 3 – Resultados dos das amostras de campo de bezerros e de vacas testadas para BCoV e/ou RV pela multiplex hemi-nested RT-PCR, pelas hemi-nested RT-PCR individuais, pela nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd e pela PAGE

Amostras Bezerros Amostras Vacas Total Teste

Positivas Negativas Positivas Negativas Positivas Negativas

Multiplex (BCoV) 0 53 15 7 15 60

Multiplex (RV) 6 47 0 22 6 69

Hemi-nested RT-PCR

gene N (BCoV) 3 50 18 4 21 54

Nested RT-PCR gene

RdPd (BCoV) 0 53 15 7 15 60

Hemi-nested RT-PCR

gene VP1 (RV) 11 42 0 22 11 64

PAGE (RV) 3 50 0 22 3 72

Figura 22 – Eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídeo a 0,5%, do resultado de amostras testadas para a multiplex hemi-nested RT-PCR para BCoV e RV, mostrando as bandas de 306pb para BCoV e de 228pb para RV. 1 e 11 – marcador de tamanhos moleculares de 100pb, 2 e 7 – amostras positivas para BCoV, 3 e 6 – amostras positivas para rotavírus, 4 e 8 – amostras negativas, 5 e 9 – controles negativos, 10 – controle positivo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

306pb

228pb

191pb

59


O seqüenciamento de 4 amostras positivas para RV e de 12 amostras positivas para

BCoV, confirmou a homologia com o gene VP1 de rotavírus e com o gene N do BCoV,

respectivamente.

4.5 ANÁLISE DOS RESULTADOS

As comparações dos resultados obtidos pela multiplex e pelos testes de referência e

pelas PCR individuais estão descritas nos itens a seguir.

4.5.1 Comparação da multiplex hemi-nested RT-PCR com os testes de referência

Os resultados das comparações da multiplex RT-PCR com a nested RT-PCR dirigida

ao gene RdPd para detecção de BCoV e com a PAGE para detecção de RV estão descritos a

seguir.

4.5.1.1 Comparação entre a multiplex hemi-nested RT-PCR e a nested RT-PCR para o gene

RdPd para detecção de BCoV


uma concordância ótima entre a multiplex hemi-nested RT-PCR padronizada e a nested RT-

PCR dirigida ao gene RdPd, utilizada como referência (Tabela 4).

60

Tabela 4 – Comparação dos resultados das amostras testadas pela multiplex hemi-nested RT-PCR e pela nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd para detecção de BCoV

Nested RT-PCR (gene RdPd)


Positivo 13 2 15

Negativo 2 58 60

Multiplex

hemi-nested

RT-PCR Total 15 60 75

4.5.1.2 Comparação entre a multiplex hemi-nested RT-PCR e a PAGE para detecção de rotavírus


uma concordância substancial entre a multiplex hemi-nested RT-PCR padronizada e a PAGE,

teste utilizado como referência (Tabela 5).

Tabela 5 – Comparação dos resultados das amostras testadas pela multiplex hemi-nested RT-PCR e da PAGE para detecção de rotavírus

PAGE


Positivo 3 3 6

Negativo 0 69 69

Multiplex

hemi-nested


4.5.2 Comparação da multiplex hemi-nested RT-PCR com as reações de RT-PCR individuais

Os resultados das comparações da multiplex RT-PCR com a nested RT-PCR dirigida

ao gene RdPd para detecção de BCoV e com a PAGE para detecção de RV estão descritos a

seguir.

61

4.5.2.1 Comparação entre a multiplex hemi-nested RT-PCR e a reação individual para

detecção de BCoV


uma concordância substancial entre a multiplex hemi-nested RT-PCR padronizada e a hemi-

nested RT-PCR para detecção de BCoV (Tabela 6).

Tabela 6 – Comparação dos resultados das amostras testadas pela multiplex hemi-nested RT-PCR e pela hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene N para detecção de BCoV Hemi-nested RT-PCR (gene N)


Positivo 15 0 15

Negativo 6 54 60

Multiplex

hemi-nested


4.5.2.2 Comparação entre a multiplex hemi-nested RT-PCR e a reação individual para

rotavírus


uma concordância substancial entre a multiplex hemi-nested RT-PCR padronizada e a hemi-

nested RT-PCR para detecção rotavírus (Tabela 7).

62

Tabela 7 – Comparação dos resultados das amostras testadas pela multiplex hemi-nested RT-PCR e pela hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene VP1 para detecção de rotavírus

Hemi-nested RT-PCR (gene VP1)


Positivo 6 0 6

Negativo 5 64 69

Multiplex

hemi-nested


63

5 DISCUSSÃO

Na presente investigação, foram padronizadas duas técnicas de hemi-nested RT-PCR

para a detecção individual de rotavírus do grupo A e coronavírus bovino, bem como uma

terceira reação em formato multiplex hemi-nested RT-PCR para a detecção simultânea destes

dois vírus, tendo sido as mesmas aplicadas a amostras fecais de bovinos.

Na fase inicial, os primers desenhados para a detecção do gene N de BCoV, VP1 de

rotavírus e mRNA para o gene mitocondrial bovino ND5 (este tomado da literatura), quando

submetidos a BLAST/n, demonstraram ausência de hibridações com seqüências não-

homólogas àquelas esperadas, o que permitiu inferir, até este momento, uma elevada

especificidade analítica teórica das reações a serem padronizadas, visto que não haveria

amplificações de fragmentos que não aqueles previstos.

Do mesmo modo, a ausência de dímeros e hairpins previstos para estes primers

demonstra que a dinâmica das reações não seria afetada por interações entre os primers, as

quais poderiam resultar no impedimento da hibridação dos primers em suas regiões-alvo ou

em uma competição pela amplificação entre dímeros de primers e as seqüências-alvo,

diminuindo a sensibilidade analítica das reações.

Para o início dos testes laboratoriais com cada um dos primers, seguiu-se a

determinação das temperaturas ótimas de hibridação para cada par de primers a ser utilizado,

realizada em termociclador com gradiente de temperaturas, tendo sido possível a eleição de

temperaturas de hibridação compatíveis com a utilização simultânea dos primers para a

detecção de BCoV, rotavírus e mRNA ND5 (controle interno), sobretudo em função das

temperaturas de fusão teóricas preditas para os primers (Quadros 3, 4 e 5), tendo sido

inclusive possível utilizar, na fase de hemi-nested, temperaturas de hibridação 5 graus

superiores em relação à primeira amplificação, o que permite o incremento da especificidade

das amplificações.

As figuras 1, 2 e 3 referentes ao gradiente de temperatura dos primers para detecção de

BCoV realizadas com a amostra de referência Kakegawa mostram que, além das bandas

esperadas, há o aparecimento de bandas inespecíficas, mesmo quando se utilizam

temperaturas de hibridação elevadas.

Essas bandas foram submetidas ao seqüenciamento de DNA e a análise de BLAST/n,

apresentando homologia com o gene N de coronavírus bovino. Como esses fragmentos não

64

prejudicam a leitura na eletroforese em gel de agarose para o diagnóstico do BCoV, os testes

com estes primers foram levados adiante.

É possível que o aparecimento dessas bandas inespecíficas seja conseqüência da

utilização de primers degenerados, que pode diminuir a especificidade dos primers. Outra

explicação reside no fato desses primers não possuírem o terminal 3’ composto de bases C ou

G, o que pode diminuir a especificidade destes em sua ligação com a seqüência-alvo

(SAMBROOK; RUSSEL, 2001).

Além disso, deve-se levar em conta a alta concentração de vírus no controle positivo,

pois no teste de sensibilidade analítica destes primers (Figuras 4, 5 e 6), nota-se que as bandas

inespecíficas desaparecem nas diluições mais elevadas do vírus de referência.

Quando da determinação dos limiares de detecção para cada um dos vírus utilizando-

se as amostras de referência Kakegawa e 8209, ainda em reações separadas e testando-se

como diluentes água-DEPC, soro fetal bovino e uma suspensão de fezes livre de BCoV e

rotavírus, notou-se que os limiares variaram de acordo com o diluente utilizado, tendo-se

obtido para os dois vírus limiares mais baixos para a diluição em suspensão de fezes (10-7

para BCoV e 10-10 para rotavírus), intermediários (para rotavírus, 10-6) ou elevados (de 10-3

para BCoV ) para soro fetal bovino e elevados para água-DEPC (10-3 para BCoV e rotavírus).

Uma possível explicação para tal resultado pode ser encontrado nas concentrações de

RNA total em cada diluente, teoricamente zero em água-DEPC e com tendência crescente

desta para soro fetal bovino e finalmente suspensão fecal, na qual a concentração de RNA

total é superior.

Deste fato pode-se inferir que, como o método de extração de RNA utilizado no

presente trabalho se destina a extrair o RNA total presente em uma dada amostra, quanto

maior a concentração de RNA total do diluente, seja este RNA viral ou do próprio hospedeiro,

no caso de soro fetal bovino e suspensão fecal, maior o efeito carreador, ou seja, uma

concentração mais elevada de RNA total em uma amostra ou diluente permite uma extração

mais eficiente do RNA, pois uma elevada quantidade de RNA auxilia a formação de pellets

durante a precipitação com propanol (SAMBROOK; RUSSEL, 2001; STǺHLBERG et al.,

2004).

Entretanto, deve ser salientado que os resultados de sensibilidade analítica para cada

tipo de diluente poderiam ser diferentes caso fosse utilizado outro tipo de extração, como por

exemplo, um protocolo de extração com sílica, que não depende da precipitação de RNA.

Como a sensibilidade analítica foi superior quando os vírus foram diluídos em

suspensão de fezes do que quando diluídos em água-DEPC ou soro fetal bovino, pode-se

65

inferir que substâncias inibitórias comumente presentes em amostras fecais não impedirão as

etapas de transcrição ou amplificação levando a resultados falso-negativos.

Especificamente em relação à influência de elementos inibitórios das reações de

transcrição reversa e PCR presentes em amostras fecais, encontrou-se que, para suspensões a

20%, a inibição é mais intensa, com um limiar de detecção de 10-3 para BCoV (Figura 7),

enquanto que, quando a amostra fecal, em condição normal de consistência, é diluída a 10%, a

interferência destes elementos inibitórios é minimizada, visto que se obtiveram, neste caso,

resultados positivos até a diluição 10-7 para BCoV (Figura 8) e, para rotavírus, até 10-10

(Figura 14).

Esta capacidade de elementos presentes em amostras fecais em inibir a detecção de

patógenos por técnicas baseadas em PCR é um fato já estabelecido (WILDE et al., 1990;

GOUVEA et al., 1991; MONTEIRO et al., 1997; OIKARINEN et al., 2009), podendo levar a

resultados falso-negativos, mas, como aqui demonstrado, a diluição das amostras fecais de

acordo com sua densidade para o preparo de suspensões e subseqüente extração de ácidos

nucléicos contribui para a minimização desta interferência.

A sensibilidade analítica para rotavírus não foi testada em suspensão fecal a 20%

devido ao fato de a inibição ser mais intensa como verificado no teste com o BCoV e por

apresentar elevada sensibilidade analítica com a utilização de suspensão a 10%.

Após a aplicação da hemi-nested RT-PCR para a detecção do gene N de BCoV aqui

padronizada e a nested RT-PCR para a detecção do gene RdRp deste vírus (teste de utilizado

como referência) em 75 amostra fecais de bovinos (Quadros 1 e 2), encontrou-se uma

concordância classificada como substancial por meio do teste kappa, o qual resultou em um

valor de 0,783, notando-se que seis amostras foram positivas pela primeira mas negativas pela

segunda reação, indicando uma maior sensibilidade diagnóstica para a reação padronizada no

presente trabalho.

Uma possível justificativa para a diferença de detecção entre essas técnicas seria o fato

da hemi-nested RT-PCR aqui apresentada ter tido uma padronização mais elaborada em

termos de testes com concentrações de reagentes quando comparada ao teste aqui utilizado

como de referência e descrito por Brandão et al. (2005).

Além disso, sabe-se que o mRNA para proteína N é mais abundante nas células

infectadas por coronavírus (HISCOX et al., 1995), o que oferece um maior número de cópias

de RNA para serem detectadas, elevando a sensibilidade analítica.

Especificamente, para o diagnóstico de BCoV é desejável que a técnica utilizada

possua uma elevada sensibilidade, especialmente quando utilizadas em amostras de bezerros

66

que se encontram no início ou no final do curso da doença ou após uma reinfecção, período

no qual devem apresentar baixos níveis de eliminação de BCoV (CHO et al., 2001).

Por sua vez, a aplicação da hemi-nested RT-PCR para a detecção de rotavírus do

grupo A, tendo como alvo o gene codificador da VP1, resultou, em relação à PAGE, tomada

como teste de referência, em um valor de kappa de 0,390, o que indica uma fraca

concordância entres os dois testes.

A PAGE é baseada na detecção de eletroferótipos de RNA genômico de rotavírus, sem

passos prévios de amplificação e, ainda que seja uma técnica de baixo custo que permite a

distinção entre grupos de rotavírus, é dependente de elevada concentração de partículas virais

para a geração de sinal, sendo que a RT-PCR pode detectar aproximadamente 2ng de RNA

viral, enquanto a PAGE necessita de, no mínimo, 10ng de RNA viral (HERRING, 1982;

GOUVEA et al., 1990).

Assim, uma vez que a hemi-nested RT-PCR aqui padronizada para a detecção de

rotavírus resultou em 11 amostras positivas, enquanto que a PAGE classificou apenas 3 destas

como positivas para rotavírus, fica claro que esta reação de hemi-nested RT-PCR apresenta

sensibilidade diagnóstica superior à da PAGE em função da conhecida capacidade de técnicas

baseadas em PCR em detectar quantidades inferiores de alvos gênicos (BUESA et al., 1996).

Para que as duas reações de hemi-nested RT-PCR individuais para a detecção de

BCoV (gene N) e rotavírus do grupo A (gene VP1) pudessem ser combinadas em uma única

reação multiplex, contando ainda com um controle interno (mRNA do gene ND5), iniciaram-

se os testes com quantidades equimolares de cada primer na fase de PCR, para que uma das

seqüências-alvo não tivesse sua amplificação favorecida em detrimento das outras duas,

aplicando-se os mixes 1, 2, 3 e 4 descritos no quadro 6.

Uma importante modificação realizada para as transcrições reversas a partir deste

momento foi a utilização de primers randômicos ao invés da combinação de primers

específicos (item 3.5.1.1) o que elevou a sensibilidade analítica, possivelmente em função da

capacidade destes primers em se hibridar em regiões de seqüências que apresentassem

polimorfismos em relação aos primers específicos (STǺHLBERG et al., 2004; NARDON et

al., 2009).

Verificou-se que mesmo com o aumento da concentração da enzima DNA polimerase

e do MgCl2 a sensibilidade analítica da reação teve um aumento pouco significativo, variando

de 10-1 a 10-3 para combinações 1:1 dos vírus de referência, demonstrando que, a partir das

concentrações de 1,5 U da enzima e 3mM de MgCl2, havia sido atingido, para estes dois

reagentes especificamente, o limite de eficiência, o que pode ser observado quando se

67

compara os mixes 3 e 4 que diferem somente na quantidade de DNA polimerase e MgCl2,

mas apresentam resultados iguais.

Cabe ressaltar que a enzima DNA polimerase utilizada (Platinum Taq DNA

polymerase - Invitrogen®) tem a característica de ser “hot start”, ou seja, só inicia a reação

em temperaturas elevadas, o que confere maior especificidade e sensibilidade à PCR, por não

estar ativa em temperaturas baixas (ZANGENBERG; SAIK; REYNOLDS, 1999;

SAMBROOK; RUSSEL, 2001).

Sendo assim, optou-se por variar a concentração de cada par de primers para obter

uma sensibilidade analítica superior, levando-se em conta que cada primer poderia ter uma

eficiência diferente em função de suas características bioquímicas e termodinâmicas

(HENEGARIU et al.; 1997; SAMBROOK; RUSSEL, 2001; MARKOULATOS; SIAFAKAS;

MONCANY, 2002).

Assim, do mix 5 ao 12 foram utilizados diferentes concentrações de primers para

seqüência-alvo, o que como pode ser observado, aumentou a sensibilidade analítica da

multiplex para resultados mais próximos das reações individuais.

Em relação a quantidade de DNA alvo, para os mixes 5 e 7, manteve-se as mesmas

concentrações para os reagentes (Quadro 6) mas com a diferença de que o volume de c-DNA

para a PCR e hemi-nested PCR foi de 2,5 µL no mix 5 e 5,0 µL no segundo mix 7.

A comparação dos resultados desses dois mixes mostra que a quantidade de c-DNA

aplicado à primeira reação de amplificação teve influência na sensibilidade analítica da

reação, já que a utilização de maior quantidade de DNA resultou em um limiar de detecção

100 vezes menor, porém favoreceu o aparecimento de bandas inespecíficas e manchas entre

as bandas, devido ao excesso de DNA, dificultando a interpretação dos resultados.

Os mixes 7, 8, 9, 10 foram testados tanto com 2,5 quanto com 5,0µL de DNA

aplicados à fase de hemi-nested PCR, tendo-se, entretanto, evidenciado que os resultados do

limiar da utilização desses mixes foram iguais para as reações com a utilização de maior ou

menor quantidade de DNA, mostrando que a quantidade de 2,5µL de DNA na hemi-nested é

suficiente para a acurácia do teste a ser padronizado.

Além disso, a utilização de uma concentração mais elevada de DNA na segunda

reação poderia diminuir a especificidade da técnica em função de amplificações não-

específicas, ou mesmo diminuir a sensibilidade analítica em casos de excesso de DNA.

Finalmente, após os testes de sensibilidade analítica aplicados a cada um dos 12 mixes

testados (Quadro 6), elegeu-se o mix 12 para a fase de aplicação da multiplex hemi-nested

RT-PCR, não apenas em função da elevada sensibilidade analítica em suspensão fecal na qual

68

se diluiu a combinação BCoV: rotavírus na proporção 1:1, a qual foi de 10-5, e que foi,

inclusive, a mesma para os mixes 8, 10 e 11, mas também pelo menor volume de enzima e de

c-DNA e DNA das reações de amplificação utilizados, novamente com o intuito de se

minimizarem amplificações inespecíficas e a inibição das reações por excesso de DNA.

Com isto, aplicando-se o mix 12 às diluições em base 10 da combinação de BCoV e

rotavírus de referência na proporção 1:1 em água-DEPC, soro fetal bovino e suspensão fecal

livre de BCoV e rotavírus, obteve-se a mesma tendência decrescente de limiares de detecção

de 10-2, 10-6 e 10-8, cabendo aqui a mesma explanação quanto à maior eficiência de extração

de RNA total na presença de amostras ou diluentes com maiores concentrações destas

moléculas como no caso de suspensões fecais por um efeito de carreamento durante a fase de

precipitação de RNA.

Comparando-se os limiares de detecção realizados com amostra Kakegawa de BCoV

para a multiplex e para a BCoV-específica hemi-nested RT-PCR aqui padronizadas, nota-se

que os mesmos foram próximos quando da utilização de suspensão fecal a 10% como diluente

(10-8 e 10-7, respectivamente).

Uma vez que em uma reação de multiplex PCR como aquela aqui proposta há primers

dirigidos a diferentes seqüências-alvo, seria esperado que o limiar de detecção para a mesma

fosse superior, ou seja, que houvesse uma menor sensibilidade analítica, para a reação de

multiplex, uma vez que diferentes seqüências-alvo e seus respectivos primers poderiam

acabar competindo pela eficiência da reação como um todo (SAMBROOK; RUSSEL, 2001).

Entretanto, como as concentrações de reagentes nos mixes utilizados para as PCR

simples para BCoV e multiplex são diferentes, sendo superiores em DNA polimerase e MgCl2

para esta última, possíveis ausências ou baixas eficiências de amplificação em função das

competições expostas anteriormente foram provavelmente minimizadas.

Deve-se considerar também que erros inerentes à execução laboratorial das reações,

como, por exemplo, falhas na manipulação de pipetas ou falta de adequada calibração das

mesmas, possam ter levada o que a sensibilidade analítica da multiplex tenha sido superior à

da reação individual para BCoV.

Finalmente, outra explicação para tal resultado seria a eficiência da purificação de

RNA no momento em que foram realizadas as extrações, devido a utilização de diferentes

alíquotas de reagentes como o etanol a 75%, ou devido à variações na temperatura ambiental,

uma vez que o protocolo recomendado pelo fabricante inclui incubações em temperatura

ambiente.

69

Por sua vez, a mesma comparação entre PCR simples e multiplex para a detecção de

rotavírus, utilizando-se a amostra 8209 diluída em suspensão fecal a 10%, obteve uma

sensibilidade analítica 100 vezes inferior para a última reação.

Entretanto, a sensibilidade analítica da reação multiplex ainda pode ser considerada

elevada, uma vez que o título viral da amostra de referência 8209 foi relativamente baixo, não

sendo impediente, portanto, de sua aplicação.

Aplicando-se a multiplex hemi-nested RT-PCR com o mix 12 nas 75 amostras fecais

de bovinos (Quadros 1 e 2), obtiveram-se 15 amostras positivas para BCoV e 6 para rotavírus

do grupo A, números inferiores àqueles obtidos para a aplicação de cada uma das hemi-nested

RT-PCR individuais para BCoV e rotavírus do grupo A, 21 e 11, respectivamente (Tabelas 6

e 7).

Considerando-se que as hipóteses para as diferenças entre as sensibilidades analíticas

entre os testes simples e multiplex baseadas nas diferenças entre mixes seja sustentada, como

exposto anteriormente, e que o efeito inibitório de elementos presentes nas suspensões fecais

das amostras de campo tenha sido similar àquele inferido para a suspensão fecal utilizada para

a diluição das amostras virais de referência nos testes de limiares de detecção, pode-se

especular que a ausência de concordância entre sensibilidades analítica e a comparação dos

resultados obtidos da aplicação em amostras entre as duas classes de hemi-nested RT-PCR

(simples e multiplex) seja devida à adição às suspensões de amostras de campo de células

MDBK previamente à extração (controle interno exógeno) e a adição de primers para a

detecção de mRNA para o gene ND5 das mesmas, visto que a adição de mais um par de

primers e de sua seqüência-alvo poderia consumir parte dos reagentes presentes no mix de

transcrição-reversa ou PCR, diminuindo a disponibilidade dos mesmos para as demais

reações.

Um argumento em favor desta hipótese é que o teste realizado com diferentes

proporções de BCoV Kakegawa e rotavírus 8209 (Quadro 7) utilizando-se o mix 12 não

demonstrou inibição de uma das seqüências-alvo por excesso de um ou de outro vírus,

indicando que, de fato, uma provável causa da diminuição da sensibilidade analítica tenha

sido o controle interno exógeno mas também que, mesmo em situações de infecções naturais

onde diferentes títulos de cada vírus sejam encontradas, não haveria impedimento à detecção

simultânea dos mesmos.

Com relação ao controle interno, inicialmente foi realizada a tentativa de se aplicar a

RT-PCR para a detecção de mRNA para o gene mitocondrial ND5 presente naturalmente nas

70

próprias amostras fecais, com o intuito de validar cada diagnóstico desde a fase de extração de

RNA até a detecção do produto amplificado.

Entretanto, como apresentado no item 4.3.4, apenas três de sete amostras fecais,

utilizadas na prospecção da aplicabilidade deste conceito a futuras amostras de campo, foram

positivas para a detecção deste mRNA.

Para ser um indicador confiável do desempenho da reação, o gene selecionado para

utilização como controle endógeno deve exibir níveis constantes (HOFFMAN et al., 2009).

Entretanto, considerando-se que as células presentes em amostras fecais são em sua

maioria originárias de descamação fisiológica ou patológica e, que, portanto, são células

mortas, a atividade de transcrição de mRNA para o gene ND5 é inexistente ou baixa, o que

tornaria sem aplicação a utilização de controle interno endógeno.

Além disso, esses primers foram desenhados com o intuito de detectar DNA

(CALDWELL, 2007), porém para serem utilizados como um controle interno eficiente de

uma RT-PCR devem ser utilizados desde o momento da extração do RNA, uma adaptação

realizada com eficiência no presente estudo.

Para tanto, fez-se a opção de adicionar a cada suspensão de amostra clínica, um

volume de 10 microlitros de suspensão de células MDBK, as quais, uma vez tendo sido

congeladas ainda em fase de elevada atividade metabólica (item 3.1.1) e, portanto, de

atividade de transcrição de mRNA, contêm uma inferida elevada quantidade de mRNA para o

gene ND5.

Com isto, para todas as 75 amostras fecais de bovinos utilizadas na fase de aplicação

da multiplex hemi-nested RT-PCR, foi possível detectar a banda de 191 pares de bases,

demonstrando que o conceito de controle interno exógeno permite que a probabilidade de

diagnósticos falso-negativos por falhas nas reações de extração de RNA, transcrição reversa e

amplificação seja minimizada, com a vantagem da presença de uma quantidade constante de

RNA-alvo para todas as amostras.

Outro teste baseado em RT-PCR para a detecção de coronavírus (TAKIUCHI et al.,

2006) já utilizou controle interno, mas apenas a partir da fase de amplificação pela PCR e não

da partir da extração de RNA seguida de transcrição reversa, o que não permite que estas

etapas, críticas na detecção de vírus RNA, sejam aferidas com segurança.

Como apresentado no item 4.3.2, a RT-PCR para o mRNA ND5 apresentou resultados

positivos até a diluição da suspensão de células MDBK de 10-2 relativamente baixa quando

comparada com as outras reações para a detecção de BCoV e rotavírus do grupo A aqui

detectadas; entretanto, uma vez que, para a aplicação em amostras clínicas, tal suspensão de

71

células foi adicionada em volume de 10 microlitros para 250 microlitros de suspensão de

amostras, ou seja, em uma diluição de 1:26, menor do que a diluição 1:100 referente ao limiar

de detecção da mesma de 10-2, esta baixa sensibilidade não compromete sua utilização para a

detecção do controle interno exógeno.

A sensibilidade analítica do controle interno não foi realizada em outros diluentes

(soro fetal bovino e suspensão de fezes) devido a possibilidade da existência natural de

mRNA ND5 nestes diluentes, o que poderia interferir no resultado do limiar de detecção.

Sendo assim, não foi possível a avaliação do efeito carreador para este par de primers.

Além disso, a padronização da reação utilizando-se um controle interno exógeno no

lugar do controle interno endógeno permite que essa técnica seja utilizada em amostras de

outras espécies de animais, como por exemplo, em amostras fecais de búfalos, que podem ser

acometidos tanto por BCoV, como por rotavírus (PISANELLI et al., 2005; DECARO et al.,

2008d), ou mesmo em outras reações de RT-PCR para a detecção de vírus outros que não

necessariamente BCoV e rotavírus do grupo A em outras espécies.

O seqüenciamento de DNA dos fragmentos amplificados nas reações de PCR e hemi-

nested referentes aos controles positivos de BCoV (amostra Kakegawa), rotavírus do grupo A

(amostra 8209) e controle interno (células MDBK), bem como para os respectivos fragmentos

para cada um dos dois vírus obtidos a partir de amostras de campo, demonstrou, após análise

por BLAST/n, a homologia com as seqüências-alvo esperada, demonstrando, assim, de um

modo prático a especificidade dos primers e das reações utilizadas.

Com isto, pode-se propor que, como protocolo final para realização da hemi-nested

RT-PCR para BCoV e rotavírus do grupo A seja o preparo de suspensões fecais conforme o

item 3.2, adicionando-se 10 microlitros de suspensão de células MDBK preparadas a 250

microlitros de cada suspensão fecal (item 3.4.6), extraindo-se o RNA total com o método do

TRIzol (Invitrogen), seguindo-se a transcrição reversa com o uso de primers randômicos (item

3.5.1.1) e primeira e segunda amplificações utilizando-se o mix 12 (Quadro 6).

As sensibilidade e especificidade diagnósticas dos testes padronizados neste trabalho

não foram realizadas, pois seria necessária a disponibilização de testes de referência que

fossem considerados como bons padrões-ouro, ou seja, testes que se aproximem o máximo

possível de resultados verdadeiros (BANOO et al., 2008), o que não é o caso dos testes

utilizados como referência neste trabalho.

Embora a PAGE já tenha sido utilizada como padrão-ouro para detecção de rotavírus

(PACINI et al., 1988; HAMMAMI; CASTRO; OSBUM, 1990; WINIARCZYK; GRADZIK,

72

1999), a sua utilização gera resultados falso-negativos, devido a sua baixa sensibilidade

analítica.

Das amostras testadas neste estudo, nenhuma apresentou co-positividade por BCoV e

rotavírus após a aplicação das hemi-nested RT-PCR individuais e multiplex, sendo estes

resultados concordantes com o já disponível para os testes de referência nested-RT-PCR para

o gene RdRp de BCoV e PAGE para rotavírus.

Co-infecções por BCoV e rotavírus do grupo A em bovinos, sobretudo em neonatos,

são achados comuns, principalmente em animais diarréicos ou disentéricos no momento de

colheita de amostras (JEREZ, 1997)

Assim sendo, pode-se supor, a partir destes resultados, que, de fato, nenhum dos

animais amostrados, quer fossem bovinos jovens ou adultos (Quadros 1 e 2), apresentasse co-

infecção quando as amostras fecais foram colhidas, o que pode ser devido a uma baixa

circulação viral, sobretudo de rotavírus, nos rebanhos amostrados.

Para a presente investigação, a condição clínica dos animais amostrados no momento

das colheitas de amostras em relação à presença ou ausência de sinais de enterites não foi

considerada para comparações entre os métodos de diagnóstico por não terem os animais sido

acompanhados após as colheitas para se verificar se os animais sadios se constituíam de fato

em portadores assintomáticos, animais ainda em período de incubação ou mesmo

convalescentes, não se constituindo, ainda, como objetivo desta Dissertação, o

estabelecimento de causalidade de doença.

Como apresentado em Materiais e Métodos, as amostras utilizadas foram colhidas

entre 2000 e 2002, tendo sido armazenadas a -20 ºC até o momento de sua utilização. Deve-se

considerar, portanto, que alguns resultados negativos obtidos nas RT-PCR possam ser devido

à degradação de ácidos nucléicos sob estas condições de armazenamento, levando a resultados

falso-negativos, principalmente em relação aos coronavírus, que além de apresentar um RNA

de simples fita, possui um envoltório menos resistente quando comparado aos rotavírus.

Foram utilizadas amostras fecais já disponíveis no laboratório por sua conveniência,

rapidez e economia; porém, existem alguns inconvenientes em relação à utilização de

amostras arquivadas: a qualidade das amostras pode ser afetada pelo tempo e eficiência do

armazenamento e as informações sobre o animal podem ser limitadas ou não disponíveis

(BANOO et al., 2008). Portanto, seria mais recomendada a utilização de amostras recém

coletadas.

Considerando-se a fase de aplicação da versão final da hemi-nested RT-PCR para a

detecção de BCoV e rotavírus do grupo A, a inclusão de uma maior e mais diversa população

73

de bovinos em relação à suas condições clínicas e de co-infecção por estes dois vírus ou

mesmo experimentos de infecção experimental pelos mesmos em bovinos poderia levar a um

melhor entendimento do comportamento desta reação em situações epidemiológicas mais

diversificadas.

Entretanto, foi possível demonstrar que, seguindo-se a metodologia utilizada, não

apenas a multiplex hemi-nested RT-PCR, mas também as reações individuais referentes a

cada um dos vírus se constituem em métodos de diagnóstico rápido, econômico e acurado

para as enterites em bovinos. Além disso, o fato dos primers desenhados para o presente

trabalho serem baseados em seqüências atuais de genes conservados de BCoV e RV, confere

maior acurácia no diagnóstico desses agentes.

Além das vantagens já expostas, a multiplex hemi-nested RT-PCR aqui padronizada,

ainda tem a vantagem de possuir um controle interno, que valida os resultados negativos,

apresentando uma maior confiabilidade ao diagnóstico desses vírus.

Para uma mais aprimorada padronização das reações de transcrição reversa e PCR

aqui expostas, uma grande série de experimentos poderia ser proposta fazendo-se titulações

em gradientes de concentração de cloreto de magnésio, enzimas (transcriptase-reversa e

DNA-polimerase), primers e tampões de reações, podendo-se inclusive, como já sugerido,

utilizar DMSO, glicerol ou albumina para o aumento da especificidade de amplificação

(HENEGARIU et al., 1997; MARKOULATOS; SIAFAS; MONCANY, 2002).

Entretanto, optou-se pela utilização do menor número de reagentes possível e daqueles

mais comumente disponíveis para a padronização no presente trabalho, com o intuito de

facilitar a reprodução dos métodos aqui descritos por qualquer laboratório com mínimas

condições para biologia molecular, utilizando-se resultados de passos prévios para o

aprimoramento dos passos a serem realizados a seguir.

Com isto, pode-se, em estudos futuros, aplicar tais técnicas para estudos

epidemiológicos destes processos mórbidos para entender sua epidemiologia e seu impacto

sobre a pecuária, podendo aprimoramentos futuros incluir a utilização dos primers aqui

desenhados para a realização de PCR em tempo real, permitindo não apenas a detecção, mas

também a quantificação de cada uma das espécies virais. Também seria interessante incluir

outros vírus causadores de diarréia na multiplex, como o torovírus e o calicivírus, tornando a

técnica ainda mais vantajosa.

Para que um controle eficaz seja instituído em uma propriedade, com o intuito de

impedir a disseminação dessas doenças, é necessário que o diagnóstico seja rápido e acessível.

74

Portanto, é de grande importância estudos acerca do desenvolvimento de técnicas que

busquem melhor acurácia, economia de custos, rapidez e simplicidade.

As técnicas moleculares para o diagnóstico de doenças infecciosas, em especial a PCR

e suas derivações, são testes que possuem elevadas sensibilidade e especificidade, são

relativamente rápidas e simples de serem executadas e, embora ainda possuam um custo

relativamente elevado, sua disseminação tem tornado estas técnicas mais acessíveis.

Especificamente em relação ao diagnóstico molecular dos vírus causadores de diarréia,

é de grande importância o estudo e desenvolvimento de novas técnicas, visto que novas

seqüências estão sendo registradas em bancos de genes com elevada freqüência, trazendo

muitas informações sobre possíveis alvos para sua detecção. Adiciona-se a isso o fato de que

os RNA vírus possuem a característica de terem elevadas taxas de mutação, sendo desejável o

desenvolvimento de técnicas baseadas em seqüências atuais.

75

6 CONCLUSÕES

A partir dos resultados e discussões anteriores, pode-se concluir que:

Padronizou-se uma reação de transcrição-reversa/ reação em cadeia da polimerase

hemi-nested para detecção de coronavírus bovino (BCoV) em amostras fecais de

bezerros e de bovinos adultos, tendo como alvo o gene codificador da proteína de

nucleocapsídeo (N), que quando comparada com a nested RT-PCR dirigida ao

gene RdPd apresentou uma concordância substancial.


hemi-nested para detecção de rotavírus do grupo A em amostras fecais de bezerros

e de bovinos adultos, tendo como alvo o gene codificador da VP1 (RNA-

polimerase RNA-dependente), que quando comparada com a PAGE apresentou

uma concordância fraca.


hemi-nested (multiplex hemi-nested RT-PCR) para detecção simultânea de

coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus em amostras fecais de bezerros, a partir

das reações mencionadas anteriormente, que quando comparada a nested RT-PCR

dirigida ao gene RdPd e a PAGE concordância ótima e substancial,

respectivamente; e quando comparada com as reações individuais para BCoV e

RV, apresentou concordância substancial.

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