1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS E NATURAIS

PROGRAMA DE PS GRADUAO EM QUMICA

Samantha Leite da Trindade

DETERMINAO E DISTRIBUIO DE ELEMENTOS-TRAO

EM FRUTAS REGIONAIS

BELM

2010

Livros Grtis

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Milhares de livros grtis para download.

2

Samantha Leite da Trindade

DETERMINAO E DISTRIBUIO DE ELEMENTOS - TRAO

EM FRUTAS REGIONAIS

Belm

2010

Dissertao de Mestrado apresentada para a obteno de grau de mestre em Qumica. Programa de Ps-Graduao em Qumica. Instituto de Cincias Exatas e Naturais. Universidade Federal do Par. rea de concentrao Analtica. Orientadora Prof. Dr. Kelly das Graas Fernandes Dantas

3

4

Samantha Leite da Trindade

DETERMINAO E DISTRIBUIO DE ELEMENTOS - TRAO

EM FRUTAS REGIONAIS

Data da aprovao: Belm PA. 29 - 04 - 2010

Banca examinadora

Prof. Dr. Kelly das Graas Fernandes Dantas

Faculdade de Qumica UFPA Orientadora

Prof. Dr. Regina Celi Sarkis Mller

Faculdade de Qumica UFPA Membro

Prof. Dr. Dulcidia da Conceio Palheta

Instituto de Sade e Produo Animal UFRA- Membro

Dissertao apresentada para a obteno de grau de mestre em Qumica. Programa de Ps-Graduao em Qumica. Instituto de Cincias Exatas e Naturais. Universidade Federal do Par.

5

Dedico esta dissertao aos meus exemplos

de vida, Edson Vasconcelos , Eliana Maria e

Raimundo Pimentel que sempre me estimularam a

dar este grande passo. Estas trs pessoas, com

muita sabedoria, discernimento, bom senso e

dedicao estiveram ao meu lado me encorajando

nas horas difceis e me aplaudindo nos momentos

de glria. Obrigada Sr.Edson e D.Eliana por serem

meus pais e Raimundo Pimentel por ser meu fiel

companheiro. Obrigada por serem profissionais

corretos e competentes, fonte de inspirao, apoio e

ensino dirio.

6

Agradecimentos

Deus por iluminar meu caminho e me dar fora para seguir sempre em

frente.

Aos meus familiares que sempre me deram amor e fora, valorizando meus

potenciais.

s minhas irms (Eliane, Penlope e Rebeca), e sobrinhos (Ana Carolina e

Samuel Henrique) que amo tanto.

A minha orientadora Prof. Dra. Kelly das Graas Fernandes Dantas, por sua

dedicao, pacincia, sensibilidade, apoio e, acima de tudo, exigncia durante

esta jornada.

UFRA, em especial professora Dra. Dulcidia Palheta por ceder os

equipamentos para as anlises.

professora Dra. Regina Celi Sarkis Mller por ceder o seu laboratrio para a

digesto das amostras.

Ao professor Dr. Alberdan Silva, pelas anlises realizadas em seu laboratrio.

minha querida amiga e irmzinha do corao Samara Mescouto pelo seu

apoio, incentivo e pacincia.

Aos meus grandes amigos Aline, Diomar, Emanuelle, Larissa, Lcia Marcela,

Kelly, Rosngela, Vanessa, Marcelo, Fbio Mota, D.Francisca, Raimundinho,

D. Hero, Kiara, Natlia, Flvio, Antnio, Silvana, minha querida Dorazilma, que

sempre me incentivaram e proporcionaram momentos de laser, imprescindveis

ao bom andamento deste estudo.

7

todo grupo de Espectrometria Analtica Aplicada pelo agradvel convvio e

pelo verdadeiro esprito de grupo e em especial Patrcia Nunes e Jnior

Batista pela grande fora que me deram nas frias para o encerramento do

trabalho experimental.

banca pelas valiosas sugestes e trabalho dedico avaliao do presente

trabalho.

Ao rgo financiador FAPESPA pela ajuda financeira para a execuo do

presente trabalho.

E a todos aqueles que de alguma forma contriburam para esta dissertao

torna-se realidade, o meu MUITO OBRIGADA.

8

Algo s impossvel at que algum duvide e prove o contrrio

(Albert Einstein)

9

RESUMO

No presente trabalho foram realizados estudos envolvendo a determinao e

distribuio de elementos-trao em amostras de aa (Euterpe oleracea

Mart.), bacur (Platonia insignis Mart.), castanha-do-par (Bertholletia

excelsa), cupuau (Theobroma Grandiflorum) e pupunha (Bactris gasipaes

H.B.K) por espectrometria de absoro atmica com chama (FAAS). Nos

resultados obtidos para Cu, Fe, Mn e Zn nos digeridos das amostras por FAAS,

o ferro foi encontrado em maior teor (23,4 a 46,2 g g-1) seguido do zinco (6,3 a

46,6 g g-1) e cobre (2,9 a 47,5 g g-1). Baixos nveis de mangans foram

encontrados nas frutas estudadas. O bacuri apresentou um elevado nivel de Fe

(46,2 g g-1) enquanto a castanha-do-par e pupunha mostraram elevados

nveis de zinco (46, 1 e 46,6 g g-1).O fracionamento de Cu, Fe e Zn nas

fraes lipdicas, proticas e nos resduos foi realizado usando extrao slido-

lquido combinada com FAAS. Os valores encontrados mostraram um teor

considervel desses elementos nas fraes lipdicas e proticas de bacuri e

pupunha. Os maiores nveis de cobre, ferro e zinco na amostra de aa foram

obtidos no resduo. A cromatografia de excluso por tamanho (SEC) com

deteco UV e espectrometria de absoro atmica em forno de grafite

(GFAAS) foram usados para investigar a associao de cobre as protenas

presentes na polpa de aa. A concentrao de cobre nos digeridos e no

extrato de protenas foram 10,5 e 0,81 g g-1, respectivamente. Cobre foi

encontrado associado s fraes de protenas correspondentes 0,45, 3,8 e

64,5 kDa. Os nveis de Cu nessas fraes variaram de 0,46 a 17,69 g L-1.Os

resultados obtidos na polpa de aa por cromatografia de excluso por tamanho

com off-line deteco GFAAS mostraram que cobre est associado s

protenas de alta massa molecular, baixa massa molecular e compostos no

proticos.

Palavras-chave: elementos-trao, frutas regionais, especiao, SEC, GFAAS.

10

ABSTRACT

In this present work, studies involving the determination and distribution of trace

elements in aa (Euterpe oleracea Mart.) Bacuri (Platonia insignis Mart.)

Brazil-nut (Bertholletia excelsa), cupuassu (Theobroma grandiflorum) and

pupunha (Bactris gasipaes HBK) samples by flame atomic absorption

spectrometry (FAAS). In the results obtained for Cu, Fe, Mn and Zn in digests

samples, the iron was found in highest content (23.4 to 46.2 g g-1) followed by

zinc (6.3 to 46.6 g g-1) and copper (2.9 to 47.5 g g-1). Low levels of

manganese were found in the fruits studied. Bacuri showed a high level of Fe

(46.2 g g-1) while Brazil-nut and pupunha showed high levels of zinc (46, 1 and

46.6 g g-1). The Fractionation of Cu, Fe and Zn in lipidic and protein fractions

and residues was carried out using solid-liquid extraction combined with FAAS.

The values found showed a considerable content of these elements in lipidic

and protein fractions of bacuri and pupunha. Higher levels of copper, iron and

zinc were obtained in the residue of the aa sample. Size exclusion

chromatography (SEC) with UV detection and furnace graphite atomic

absorption spectrometry (GFAAS) were used to investigate the association of

copper with the proteins present in aa pulp. The concentration of Cu in

digests and extract of proteins obtained were 10.5 and 0.81 g g-1, respectively.

Protein fractions obtained by SEC-UV were collected and Cu was determined

by GFAAS. Copper was found bound in protein fractions corresponding to 0.45,

3.8 and 64.5 kDa. The levels of copper in those fractions varied from 0.46 to

17.69 g L-1. Results obtained for aa pulp by size exclusion chromatography

with off-line GFAAS detection showed that copper is associated to proteins of

high molecular weight (HMW), low molecular weight (LMW) and non-proteic

compounds.

Keywords: Trace elements, regional fruits, speciation, SEC, GFAAS.

11

LISTA DE TABELAS p.

Tabela 1 - Constante de estabilidade de alguns quelatos comuns (relao 1:1

de Ligante e on metal H2O a 20C)....................................................................

15

Tabela 2 - Parmetros instrumentais usados na determinao de Fe, Mn, Cu

e Zn nas amostras de frutas por FAAS..............................................................

33

Tabela 3 - Condies operacionais para SEC usando gradiente isocrtico....... 41

Tabela 4 - Programa de aquecimento do forno de grafite.................................. 43

Tabela 5 - Concentraes de Cu, Fe, Mn e Zn, em g g-1, nas amostras de

aa, bacur, castanha-do-par, cupuau e pupunha e seus respectivos

desvios - padro (n = 3).....................................................................................

44

Tabela 6 - Concentraes de Cu, Fe, Mn e Zn em mg/100 g..........................

Tabela 7 - Tabela Brasileira de composio de alimentos em mg / 100g de

parte comestvel TACO Verso 2 (NEPA / UNICAMP 2006).............................

45

46

Tabela 8 - Tabela Brasileira de composio de alimentos em mg / 100g de

parte comestvel TACO Verso 1(NEPA / UNICAMP 2004)............................

47

Tabela 9 - Contribuio das frutas analisadas como fonte de Cu, Fe, Mn e Zn

para a dieta diria (%VD)* de um adulto.............................................................

48

Tabela 10 - Limites de deteco (mg L-1) e quantificao (mg L-1) para Cu,

Fe, Mn e Zn por FAAS........................................................................................

48

Tabela 11 - Concentrao total de protenas, em mg g-1, nas fraes

proticas de aa, bacur e pupunha e seus respectivos desvios-padro (n =

2).........................................................................................................................

Tabela 12 - Concentraes de Cu, Fe e Zn e a somatria das fraes das

amostras de aa, bacur e pupunha com seus respectivos desvios-padro (n

= 3)......................................................................................................................

49

52

12

LISTA DE ABREVIATURAS

SDS Dodecil sulfato de sdio

HPLC Cromatografia de Lquida de Alta Eficincia

SEC UV Cromatografia de Excluso por Tamanho com deteco no

Ultravioleta- Visvel

GFAAS Espectrometria de Absoro Atmica em Forno de Grafite

FAAS Espectrometria de Absoro Atmica com Chama

rpm Rotao por minuto

HMW High Molecular Weight

LMW Low Molecular Weight

LOD Limite de deteco

LOQ Limite de quantificao

TACO Tabela de Composio de Alimentos

13

LISTA DE FIGURAS p.

Figura 1 - Minerais ligados em diferentes tipos de protenas............................... 12

Figura 2 - Biodisponibilidade relativa de fontes de zinco e mangans................. 19

Figura 3 - Aa (Euterpe oleracea Mart.)............................................................... 20

Figura 4 - Bacur (Platonia insignis Mart.)............................................................. 21

Figura 5 - Castanha-do-par (Bertholletia excelsa).............................................. 22

Figura 6 - Cupuau (Theobroma Grandiflorum).................................................... 23

Figura 7 - Pupunha (Bactris gasipaes Kunth)....................................................... 24

Figura 8 - Diagrama de blocos de um espectrmetro de absoro atmica........ 30

Figura 9 - Espectrofotmetro de feixe simples...................................................... 31

Figura 10 - Esquema de um espectrofotmetro de feixe nico............................ 32

Figura 11 - Determinao dos totais de Cu, Fe,Mn e Zn nos digeridos de aa,

bacur, castanha do par, cupuau e pupunha por FAAS................................

36

Figura 12 - Extrao das fraes lipdicas............................................................ 37

Figura 13 - Extrao da frao protica................................................................. 38

Figura 14 - Concentrao de protena total........................................................... 39

Figura 15 - Distribuio de Cu na frao protica do aa por SEC UV e SEC -

GFAAS.....................................................................................................................

41

Figura 16 - Esquema do sistema SEC-UV.............................................................. 42

Figura 17 - Esquema do sistema off-line SEC-GFAAS........................................ 42

Figura 18 - Porcentagem de Cu, Fe e Zn nas fraes: aa (a), bacur (b) e

pupunha (c)..............................................................................................................

53

14

Figura 19 - Estrutura fosfolipdio (A) e do sulfolipdio (B)....................................... 57

Figura 20 - Perfis cromatogrficos dos padres de protenas ferritina, albumina,

mioglobina e seleno-metionina por SEC-UV a 295 nm...........................................

Figura 21 - Perfil cromatogrfico das protenas presentes no aa por SEC-UV a

295 nm........................................................................................................................................

Figura 22 - Nveis de cobre associados s protenas presentes no aa..................

59

60

61

15

SUMRIO

1 INTRODUO.................................................................................... 1

2 OBJETIVOS........................................................................................ 3

2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................... 3

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS............................................................ 3

3 REVISO DA LITERATURA.............................................................. 4

3.1- IMPORTNCIAS BIOLGICAS DO COBRE, FERRO, MANGANS

E ZINCO NO ORGANISMO HUMANO......................................................

4

3.2 - BIODISPONIBILIDADE DOS MINERAIS.......................................... 7

3.2.1 - Biodisponibilidade do Zinco........................................................... 8

3.2.2 Biodisponibilidade do Ferro........................................................... 8

3.2.3 - Biodisponibilidade de Mangans.................................................... 9

3.2.4 Biodisponibilidade do Cobre.......................................................... 10

3.3 FATORES QUE INTERFEREM NA BIODISPONIBILIDADE DE

ALGUNS MINERAIS..................................................................................

10

3.4 MINERAIS QUELATADOS............................................................... 11

3.4.1 Formao dos minerais quelatados............................................... 14

3.4.2 Absoro dos quelatos.................................................................. 16

3.4.3 Biodisponibilidade dos quelatos.................................................... 17

3.5 FRUTAS DA REGIO AMAZNICA................................................ 19

3.5.1 Aa................................................................................................ 19

3.5.2 Bacur............................................................................................ 21

3.5.3 Castanha do par.................................................................... 22

3.5.4 Cupuau........................................................................................ 23

3.5.5 Pupunha........................................................................................ 24

3.6 CONSIDERAES SOBRE AS PROTENAS................................. 25

3.7 ESPECIAO QUMICA.................................................................. 26

3.8 TCNICAS ANALTICAS.................................................................. 29

16

3.8.1 Espectrometria de Absoro Atmica com Chama FAAS)........... 29

3.8.2 - Espectrofotometria UV Visvel..................................................... 30

4 METODOLOGIA.................................................................................. 32

4.1 INSTRUMENTAO......................................................................... 32

4.2 REAGENTES E MATERIAIS............................................................. 34

4.3 PROCEDIMENTO ANALTICO......................................................... 35

4.3.1 Preparo de amostras..................................................................... 35

4.3.2 Digesto das amostras.................................................................. 35

4.3.3 Remoo da frao lipdica........................................................... 36

4.3.4 Extrao seqencial...................................................................... 37

4.3.5 Protena total................................................................................. 39

4.3.6 Determinao dos teores totais de Cu, Fe, Mn e Zn por

espectrometria de absoro atmica com chama (FAAS).........................

40

4.3.7 Teste da adio e recuperao...................................................... 40

4.3.8 Otimizao da separao cromatogrfica dos padres de

protenas...................................................................................................

40

4.3.9 Deteco de Cu associado s protenas presentes no aa por

SEC UV...................................................................................................

41

4.3.10 Deteco das espcies de Cu associadas s protenas do aa

por SEC GFAAS......................................................................................

42

5 RESULTADOS E DISCUSSO........................................................... 43

5.1 CONCENTRAO DOS ELEMENTOS NAS AMOSTRAS.............. 43

5.2 TEOR DE PROTENA TOTAL.......................................................... 48

5.3 TEOR DE Cu, Fe E Zn NA FRAO LIPDICA................................ 50

5.4 DETERMINAO DE Cu, Fe E Zn NAS FRAES PROTICAS

DE AA, BACUR E PUPUNHA................................................................

51

5.5 SEPARAO CROMATOGRFICA DAS PROTENAS PADRO

E PROTENAS PRESENTES NO AA POR SEC UV...........................

59

17

6 CONCLUSO...................................................................................... 63

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................... 64

1

1. INTRODUO

A qualidade de produtos alimentcios tem recebido especial ateno devido

a sua importncia na nutrio e sade humana1. Nos ltimos anos, tem

crescido o interesse na avaliao de macro e microelementos em uma

variedade de amostras de alimentos 2. Os alimentos so uma das principais

fontes de metais para o corpo humano. A maior parte dos ons metlicos

presentes na alimentao esto vinculados a determinadas protenas ou

enzimas e exercem os seus efeitos estruturais como stios ativos ou centros de

comando em processos como catalisadores, substrato e de ativao,

transporte e armazenamento 3.

Para a obteno de uma alimentao saudvel a partir das cadeias

agroalimentares, destacam-se os alimentos funcionais, assim denominados por

conterem substncias capazes de promover efeitos benficos sade,

associados preveno de doenas, entre estas as cardiovasculares, cncer,

diabetes e osteoporose. Dentre os grupos de alimentos que se enquadram

nessa categoria encontram-se as frutas por conterem substncias muito

importantes para a sade, tais como: antocianinas presentes no aa; taninos

no caju; carotenides na manga; cido ascrbico (precursor da vitamina C) no

camu-camu; ferro no aa, banana e puru, alm de outros 4.

A determinao do teor total do metal ingerido pelo organismo no

possibilita traar um perfil da eficincia de sua absoro. Existe a necessidade

de saber a biodisponibilidade do metal, ou seja, a proporo do nutriente que

absorvida e utilizada pelo organismo. Tcnicas de especiao qumica, como a

extrao de elementos-trao usando diferentes meios extratores, podem

auxiliar na avaliao da biodisponibilidade destes minerais possibilitando a

obteno de novos dados para prever sua absoro 5. Neste sentido, a

determinao de elementos-trao em alimentos tem se transformado em um

importante campo na anlise de alimentos 1.

2

A regio amaznica apresenta uma vasta disponibilidade de frutas com

elevado teor nutricional, entre elas destacam-se a pupunha (Bactris gasipaes

H.B.K), que uma fruta tropical da famlia das palmceas e outras frutas

conhecidas da regio norte como a castanha-do-par (Bertholletia excelsa), o

aa (Euterpe oleracea Mart), o bacur (Platonia insignis Mart) e o cupuau

(Theobroma grandiflorum Schum).

Nutricionalmente, o aa rico em antocianinas, entretanto, no que se refere

aos elementos minerais, particularmente o ferro, h muito que se estudar, uma

vez que a literatura escassa e os dados so pouco confiveis em funo da

compilao, quantidade de amostras utilizadas, metodologias e variao

edafoclimtico 6.

A pupunha potencialmente nutritiva apresenta na sua composio alguns

minerais, tais como fsforo, clcio, magnsio, zinco, entre outros. rica em

protenas e vitaminas A, B1 e C. J as castanhas-do-par so ricas em selnio,

embora a quantidade de selnio varie consideravelmente 7. So tambm uma

boa fonte de magnsio e tiamina. Algumas pesquisas indicaram que o

consumo de selnio est relacionado com uma reduo no risco de cncer de

prstata 8. Isto levou alguns analistas a recomendarem o consumo de

castanhas-do-par como uma medida preventiva 9. Estudos subsequentes

sobre o efeito do selnio no cncer de prstata foram inconclusivos10.

O desenvolvimento de procedimentos analticos que visam aperfeioamento

do preparo de amostras para determinao de elementos-trao em amostras

de frutas regionais, possibilita uma maior confiabilidade e melhores limites de

deteco. Com esse estudo pode-se obter mais informaes sobre as formas

qumicas desses elementos-trao nas amostras de alimentos regionais e

proporcionar um maior valor agregado s frutas regionais.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Sel%C3%AAniohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Sel%C3%AAniohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Magn%C3%A9siohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Tiaminahttp://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2ncer_de_pr%C3%B3statahttp://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2ncer_de_pr%C3%B3statahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Castanha-do-par%C3%A1#cite_note-8#cite_note-8

3

2 - OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Determinao e distribuio de elementos-trao em frutas regionais.

2.2 Objetivos especficos

Determinao de Cu, Fe, Mn e Zn em amostras de aa, bacur,

castanha-do-par, cupuau e pupunha;

Distribuio de Cu, Fe e Zn em aa, bacur e pupunha por FAAS;

Distribuio de Cu em aa por SEC-UV e SEC-GFAAS.

4

3. Reviso da literatura

3.1 Importncias biolgicas do cobre, ferro, mangans e zinco no organismo

humano

Diversos minerais desempenham diferentes papis essenciais no nosso

organismo, podendo estes estar livres ou associados a outras espcies que

desempenham funes fisiolgicas para o bom funcionamento do organismo 11.

Essenciais na nutrio humana, os minerais encontrados em maiores

concentraes no corpo humano, so denominados de macrominerais, no qual

esto presentes o clcio, cloro, fsforo, potssio e o sdio.

Os elementos-trao ou microminerais so minerais que correspondem a

quantidades menores que 0,01% da composio corporal. Dos elementos-

trao, nove so considerados essenciais, como cobalto, cobre, cromo, iodo,

ferro, mangans, molibdnio, selnio e zinco12. Existem especulaes sobre

outros minerais, denominados de novos microminerais, descobertos desde

1990, como o alumnio, arsnio, boro, bromo, cdmio, chumbo, estanho, flor,

germnio, ltio, nquel, rubdio, silcio e vandio, que so considerados

essenciais para algumas espcies 13.

Um aspecto fundamental que deve ser ressaltado relaciona-se aos valores

de ingesto dirios de referncias de minerais essenciais na nutrio humana,

tais como, Cu, Fe, Mn e Zn. Segundo a Food and Drug Admistration (FDA) a

quantidade recomendada para Cu, Fe, Mn e Zn corresponde a 2, 18, 2 e 15

mg/Kg de massa corprea, respectivamente14.

O mangans um constituinte essencial do corpo humano, uma vez que

est envolvido na ativao de enzimas e na formao de ossos e cartilagens.

Este mineral absorvido no intestino delgado e para ser transportado deve

estar ligado a uma macroglobulina e transferrina. A deficincia deste mineral

em seres humanos bem estabelecida, tendo como os principais sintomas a

perda de peso, dermatite temporria e, ocasionalmente, nusea e vmito, uma

5

alterao na cor do cabelo e crescimento lento de cabelo e plos15. De acordo

com Hendler16, as melhores fontes de mangans na alimentao so os gros

integrais, nozes, frutas e hortalias frescas. Porm, no caso de elevados

ndices de mangans, do ponto de vista toxicolgico 17, 18, deve-se suspeitar de

exposio ocupacional (metalurgia e minerao), caracterizando seu potencial

txico, resultando em anorexia, fraqueza, apatia, loucura mangnica, manias,

comportamento violento, tremores simulando Parkinson e depresso 19.

O zinco largamente encontrado na natureza. Dietas com altas

concentraes em protenas so ricas em zinco. Por outro lado, alimentos ricos

em carboidratos normalmente apresentam baixa concentrao desse elemento

20. Este elemento essencial para mais de 300 enzimas em muitas espcies.

As enzimas dependentes de zinco participam no metabolismo de carboidratos,

lipdeos, protenas e cidos nuclicos21.

A importncia do zinco na nutrio humana tem sido reportada desde 1934

22, o qual considerado um elemento-trao essencial para o homem, pois est

associado produo de insulina, componente de mais de 90 enzimas

relacionadas com catlise cido-base e est relacionado com a sntese do DNA

e RNA. A deficincia deste metal no organismo pode provocar retardo no

crescimento das crianas, falta de apetite, leses de pele, alopecia,

dificuldades de cicatrizao, etc. A ingesto de grandes quantidades deste

metal resulta em febre, nuseas, vmitos e diarria.

O ferro um metal de transio, considerado um micronutriente essencial

para os humanos desde 1860. A extenso da sua utilidade biolgica est na

capacidade de existir em diferentes estados de oxidao e de formar muitos

compostos na forma de complexos 23. Constituinte da hemoglobina, o ferro

requerido para o transporte de oxignio e dixido de carbono, estando assim,

ligado diretamente no processo de respirao celular 24, 25. Os compostos de

ferro presentes no organismo humano podem ser agrupados em duas

categorias: os que exercem funes metablicas ou enzimticas (hemoglobina,

mioglobina e enzimas) e os associados com o ferro de reserva. O ferro catalisa

6

a produo de radicais livres atravs da reao de Fenton, induzindo a

peroxidao lipdica. Para exercer sua ao cataltica, o on frrico precisa ser

liberado da protena que o carrega e reduzido para Fe2+, a forma ferrosa. O

ferro corporal encontrado em maior proporo na hemoglobina, e em menor

na mioglobina, na transferrina e na ferritina. Radical superxido (O2) capaz de

reduzir o Fe3+, ligado ferritina, a Fe2+, que ento liberado e se torna

disponvel para catalisar uma reao de oxidao autopropagativa 26, 27.

Estudos de Salonen et al 28 forneceram as primeiras evidncias em humanos

de que a sobrecarga de ferro, medida como concentraes elevadas de

ferritina, fator de risco para doena coronariana isqumica. Hirano et al. 29

verificaram que a incubao de homocistena com ons frricos resulta em

peroxidao lipdica semelhante causada por homocistena e ons cpricos.

Aproximadamente 67% do ferro total presente no organismo se encontra na

hemoglobina, que constituda por quatro subunidades, sendo que cada

subunidade est associado a um grupo heme. Essa molcula tem somente

quatro tomos de ferro, considerados essenciais, pois quando combinados com

o oxignio em nvel dos pulmes, estes so liberados nos tecidos 30,31. O ferro

atua tambm em processos metablicos, como na sntese de purinas

(compostos estruturais do DNA e RNA), carnitina, colgenos e

neurotransmissores (dopanina, serotonina e norepinefrina) 31.

As funes do cobre esto ligadas a utilizao do ferro na sntese de

hemoglobina, absoro de ferro do intestino delgado e mobilizao do ferro nos

tecidos. A oxidao do ferro permite que ele se ligue a protena que o

transporta. O cobre essencial para sntese da camada de mielina que recobre

o sistema nervoso central. Uma amino-oxidase que contm cobre (lisil oxidase)

est envolvida nas ligaes cruzadas de cadeias polipeptdicas na elastina e

colgeno. Enzimas contendo cobre so necessrias na converso de tirosina e

requerem cobre para ter atividade biolgica. O cobre est envolvido na

formao de tecido sseo e reproduo 32. No se deve ter nveis de

molibdnio superior a 3 mg/L da dieta total, pois esse mineral reduz a absoro

7

do cobre, pela formao do tiomolibidato de cobre 33. A deficincia manifesta-

se com os seguintes sintomas: ataxia, incoordenao muscular, paralisia

parcial, anemia, reduo no crescimento, despigmentao, fragilidade ssea,

diarria e perdas reprodutivas 33.

3.2 Biodisponibilidade dos minerais

Um dos fatores que interferem na biodisponibilidade dos minerais diz

respeito s interaes que ocorrem entre os mesmos 34. De acordo com Couzi

et al.34, as interaes podem ser diretas ou indiretas. As diretas so geralmente

fenmenos competitivos que ocorrem durante a absoro intestinal ou

utilizao tecidual, enquanto que as indiretas ocorrem quando um mineral est

inibindo o metabolismo do outro, de maneira que a deficincia de um acarreta

em prejuzo da funo do outro 34.

Algumas interaes parecem estar bem estabelecidas e, sob algumas

circunstncias, podem ter implicaes profundas na sade humana 34. Com

tudo deve-se considerar que uma simples presena de um mineral na frmula

ou dieta no garante a sua absoro pelo organismo, pois estes possuem

vrias interaes entre si. A biodisponibilidade deles, ou seja, a proporo de

nutrientes que realmente utilizada pelo organismo, depende de vrios fatores,

tais como, a forma qumica que eles se encontram, a quantidade na dieta e a

matriz que ele est incorporado como, fitatos, oxalatos, entre outros 35.

O metabolismo dos minerais no pode ser considerado separadamente,

pois fatores fisiolgicos e nutricionais podem interferir na absoro, no

transporte e no armazenamento. Dessa forma, pode ocorrer tanto deficincia,

por m absoro, quanto toxicidade, devido ao acmulo do produto no

organismo 36.

8

3.2.1 Biodisponibilidade do Zinco Existem muitos fatores que podem modificar a absoro de zinco, sendo

que estes podem ser considerados como ativadores ou inibidores deste

processo de absoro.

Entre os ativadores da absoro do zinco esto o citrato e aminocidos

como glicina, histidina, lisina e metionina. Encontram-se tambm o cido

picolnico, secretado pelo pncreas e a vitamina B6 que aumenta a secreo de

cido picolnico. Entre os inibidores da absoro do zinco esto os cidos

oxlico e ftico, taninos, fibra, selnio, ferro e clcio. A eficincia do processo de

absoro deste mineral est entre 15 a 40%, portanto, o zinco pouco

absorvido, sendo excretado em grandes propores pelas fezes. Por outro

lado, na forma orgnica, o zinco est protegido do cido clordrico e passa para

o duodeno, onde eficientemente absorvido pelas clulas da mucosa,

carregadas negativamente. Os complexos orgnicos so prontamente

absorvidos para a corrente sangunea, tornando-os altamente biodisponveis s

necessidades orgnicas e funcionais.

Os resultados da biodisponibilidade de zinco utilizando fontes orgnicas e

inorgnicas so variados. Pimentel et al.37 no observaram diferena na

biodisponibilidade de zinco, na forma de zinco metionina, quando comparado

com a forma inorgnica de zinco. Entretanto Wedekind et al. 38 realizando

estudo sobre a biodisponibilidade de diversas fontes de zinco, observou uma

biodisponibilidade do metal de 117%, na forma de zinco metionina, em uma

dieta purificada, 177% em uma dieta com soja isolada e 206% em uma dieta

composta por milho e soja, comparada com 100% de biodisponibilidade do

zinco para o sulfato de zinco.

3.2.2 Biodisponibilidade do Ferro

Segundo Underwood 39, a absoro de ferro afetada pela idade, nveis de

ferro no organismo, condies do trato intestinal (stios de absoro),

9

quantidade e forma qumica do ferro ingerido e quantidade e proporo de

outros minerais e compostos na dieta, os quais podem interagir com o ferro. Os

metais bivalentes que afetam a absoro de ferro na dieta so o cobre,

mangans, cobalto, cdmio, os quais podem competir pelo stio de absoro do

ferro. Poucos estudos foram conduzidos para determinar a biodisponibilidade

de fontes orgnicas de ferro. Spears et al.40 comparando fontes de ferro

metionina com fontes inorgnicas concluram por meio da concentrao de

hemoglobina que a biodisponibilidade do ferro orgnico foi de 180% quando

comparado s formas inorgnicas consideradas como 100%. Geralmente, os

resultados so pobres quando se utilizam fontes inorgnicas. Por outro lado, a

utilizao de ferro na forma de quelatos tem melhorado o nvel de ferro

heptico, formao de hemoglobina e o crescimento dos recm-nascidos 41.

Uma possvel explicao para estes resultados que o ferro na forma de

quelato passa melhor pelas barreiras placentrias e mamrias.

3.2.3 Biodisponibilidade de Mangans Com base na deposio ssea, Baker e Halpin 42 no observaram diferena

na biodisponibilidade de fontes organometlicas e inorgnicas de mangans.

Entretanto, Henry et al.43 observaram que a biodisponibilidade da fonte

orgnica de mangans foi significativamente maior do que as fontes

inorgnicas (xido e sulfato de mangans). Comparando a biodisponibilidade

do quelato de mangans ao xido de mangans, em dieta composta por milho

e farelo de soja, Fly et al.44 verificaram que a forma orgnica apresentou

biodisponibilidade de 147% comparada a forma de xido (100%). Compilando

dados sobre a biodisponibilidade de fontes de mangans, Ammerman et al. 45

concluram que a biodisponibilidade relativa para o mangans- metionina (Mn-

metionina) e mangans proteinado foram de 120 e 110%, respectivamente,

quando comparadas ao sulfato de mangans (100%).

10

3.2.4 Biodisponibilidade do cobre

Um aumento na biodisponibilidade do cobre de fontes orgnicas,

comparadas s fontes inorgnicas foi observado por Baker et al. 46 por meio de

comparaes da quantidade de cobre acumulado no fgado. Aoyagi e Baker 47

tambm demonstraram uma melhor biodisponibilidade do cobre na forma

orgnica, principalmente devido molcula do quelato proteger o mineral

contra interaes com outras substncias como a L-cistena e glutationa

redutase, que so capazes de reduzir a absoro de cobre no intestino. Em

outro estudo, Aoyagi e Baker 47 concluram que a biodisponibilidade aparente

do quelato de cobre foi de 120% quando comparada forma inorgnica de

sulfato de cobre (100%). Guo et al.48 verificaram uma biodisponibilidade de

111% e 109% para cobre lisina e cobre proteinato, respectivamente, quando

comparados com o sulfato de cobre (100%).

3.3 Fatores que interferem na biodisponibilidade de alguns minerais

O tanino, um adstringente encontrado em certos vegetais, possui a

capacidade de ligao s protenas inibindo enzimas digestivas e reduzindo a

biodisponibilidade do ferro e da vitamina B12. Em altas doses pode lesar a

pele, principalmente o epitlio, e o fgado. D colorao amarronzada em

muitos vegetais quando so cortados. Est presente em altas doses no ch, no

caf, no chocolate, nas bananas, no espinafre, na chicria, na ma, no

ruibarbo, na cebola, na uva, no milho e na cenoura 49.

Outros inibidores da absoro e da biodisponibilidade do ferro so as

substncias fenlicas como os polifenis, os fitatos dos cereais (os mais

importantes inibidores) e fibras como a celulose, hemicelulose e lignina, a

albumina da clara (a retirada da clara pode aumentar em mais de 10% a

absoro do ferro) do ovo, a fosfitina da gema do ovo, as protenas das

leguminosas e elementos inorgnicos como clcio, mangans, cdmio, cobre e

11

cobalto. Um dos mais importantes captulos dos fatores antinutricionais so os

inibidores das enzimas (substncias, que so capazes de modificar a

velocidade de uma reao qumica, servindo como catalisadores biolgicos).

A casena, protena do leite, inibe a absoro do zinco, o mesmo ocorrendo

com o fitato.

Dois outros antagonistas dos minerais encontrados em muitas plantas o

cido oxlico, cido orgnico dicarboxlico, que se liga firmemente ao clcio e

outros minerais-traos no deixando que sejam aproveitados pelo organismo.

encontrado em maiores quantidades em chs, no ruibarbo, no espinafre e em

menores teores na beterraba, nos morangos, no nabo, ervilha, alface e na

beterraba.

O cido ftico derivado do cido fosfrico abundantemente encontrado nos

cereais, legumes e sementes de oleaginosas. um forte quelante, substncias

qumicas que se ligam firmemente os metais como ferro, clcio e zinco

formando complexos inaproveitveis para os seres humanos. Os quelantes

tambm atuam para remover substncias txicas do organismo e so usados

em muitos medicamentos como o ferro quelato. O cido ftico encontrado em

legumes, gros de cereais, tanto no germe como no farelo, noz e, em menor

quantidade, nos feijes verdes, cenoura, brcolis, batatas, batatas doces e

morangos.

O EDTA, um aditivo alimentar, tambm apresenta sua funo inibidora de

alguns minerais. Alm disso, existe alguns minerais que influenciam na m

absoro de outros minerais 50.

3.4 Minerais Quelatados

Os microminerais possuem baixa biodisponibilidade, o que segundo Mabe 51

pode estar relacionado com a formao de complexos com outras substncias

no trato digestivo diminuindo a solubilidade desses elementos, o que justifica o

12

interesse em explorar fatores que aumentem a absoro ou metabolizao de

elementos-trao.

Neste sentido, fontes quelatadas ou orgnicas de minerais tm sido

utilizadas devido apresentarem maior biodisponibilidade. Os minerais

quelatados ou orgnicos so assim denominados por serem constitudos por

ons metlicos ligados a substncias orgnicas.

So denominados quelatos, os compostos constitudos por ons metlicos

que se ligam com substncias orgnicas como aminocidos, peptdeos ou

complexos polissacardeos que proporcionam a esses ons alta disponibilidade

biolgica, alta estabilidade e solubilidade 52.

Os quelatos so o resultado do compartilhamento de eltrons entre um

metal e um ligante. Ligante a substncia orgnica que est ligada ao metal 53.

O ligante geralmente um nion ou uma molcula que tenha um tomo com

um par de eltrons com valncias disponveis. Os ligantes comuns contm

nitrognio, oxignio, enxofre, halognios ou uma combinao deles devido s

suas estruturas eletrnicas. Os ligantes so no- metlicos, portanto, orgnicos

54. Na Figura 1 so apresentadas estruturas, representando minerais

quelatados.

Protena ligada a diversos

stios ativos

Molcula da ferritina

L - Selenometionina

Figura 1 Minerais ligados a diferentes tipos de protenas

13

Segundo Kratzer e Vohra 55, o quelato um complexo metlico, onde o

metal apresenta mais ligaes do que sua valncia e este ligado a um ligante

doador. O complexo possui um tomo de um elemento no centro da molcula e

um ligante ao seu redor. Quando o ligante possui mais de um tomo doador o

complexo se torna um anel heterocclico chamado de anel quelato.

Os minerais quelatados so definidos por Leeson e Summers 56 como

sendo uma mistura de elementos que so ligados a algum tipo de carreador o

qual pode ser um aminocido ou polissacardeo que possuem a capacidade de

se ligar a metal por ligaes covalentes atravs de grupamentos amino ou

oxignio, formando assim uma estrutura cclica.

Por sua vez, Ensminger e Oldfield 57 definem que esses quelantes tm o

papel de aumentar a absoro e a disponibilidade desse mineral no organismo,

alm de aumentar a sua estabilidade fsica reduzindo assim a tendncia do

micronutriente de se separar do alimento.

Segundo Leeson e Summers 53, existem trs grupos de quelatos que so

reconhecidos pelo sistema biolgico:

Grupo I: Quelatos que servem de transportadores e de armazenamento

para ons metlicos. Com este tipo de quelato o metal requer um ligante

com propriedades qumicas e fsicas que o quelato capaz de ser

absorvido, transportado no sangue e passar pela membrana celular,

enquanto o on metlico utilizado no local em que exigido.

Ex: aminocidos, especialmente a cistena e a histidina;

etilenodiaminotetractico (EDTA).

Grupo II: Quelatos que so essenciais no metabolismo. H um nmero

de quelatos no organismo com estrutura na qual o on metlico est

presente na forma quelatada, a qual necessria para desempenhar

funes metablicas. A hemoglobina um exemplo deste grupo de

quelatos.

14

Grupo III: Interferem na utilizao de ctions essenciais e no possuem

nenhum valor biolgico. Dentre este o cido ftico (quelato de zinco) que

pode interferir com o metabolismo normal por tornar esse mineral

essencial indisponvel para as funes metablicas.

3.4.1 Formao dos Minerais Quelatados

Para a formao dos quelatos pode-se lanar mo de numerosas molculas

como ligantes que tm funo especfica no metabolismo. Elas so de baixo

peso molecular e a capacidade oxidativa ou "ligante" depende do tamanho da

molcula e da presena de radicais carboxlicos. As principais so os cidos

aminado, ascrbico, ctrico, glucnico e EDTA. Normalmente, um mineral pode

fazer a ligao com uma, duas ou vrias dessas molculas para formar um

"composto mineral organicamente ligado" ou quelato, podendo assim ser

vendido como fonte de mineral. A afinidade de um quelato com o on metlico

pode ser expressa quantitativamente como sendo uma constante de

estabilidade. Na Tabela 1 so apresentadas relaes de constantes de

estabilidade de alguns ligantes. Observa-se que os quelatos formados com o

cobre possuem a maior constante de estabilidade e que para cada ligante a

estabilidade dos quelatos varia em ordem decrescente para o cobre, nquel,

cobalto, ferro, mangans e magnsio, respectivamente.

15

TABELA 1: Constante de estabilidade de alguns quelatos comuns (relao 1:1 de

Ligante e on metal H2O a 20C)

Ligante Cu2+ Ni2+ Zn2+ Co2+ Fe2+ Mn2+ Mg2+

Glicina 8,5 6 5 5 4 3 2

Cistena - 10 10 - 6 4 4

Histidina 10,5 9 7 7 5 4 4

Histamina 10 7 5 5 4 - -

EDTA 19 18 16 16 14 13,5 9

Guanosina 6 4 4,5 3 4 3 -

cido oxlico 6 5,5 5 4,5 4,5 4 3

cido saliclico 11 7 7 7 6 6 -

Tetraciclina 8 6 5 5 5 4 4

Fonte: Leeson e Summers (2001)

A "Association of American Feed Control Officials" AAFCO 58 define esses

produtos minerais orgnicos da seguinte forma:

Quelato metal-aminocido resultante da reao de um sal metlico

solvel com aminocidos na proporo molar, isto , um mol do metal

para um a trs moles (preferencialmente dois) de aminocidos na forma

de ligao covalente coordenada. O peso molecular mdio dos

aminocidos hidrolisados pode ser, aproximadamente, de 150 dltons e

o peso molecular resultante do quelato no deve exceder a 800 dltons;

Complexo aminocido-metal resultante da complexao de um sal

metlico solvel com aminocido(s);

Metal (Complexo aminocido especfico-metal) resultante da

complexao de um sal metlico solvel com um aminocido especfico;

Metal proteinado resultante da quelao de um sal solvel com uma

protena parcialmente hidrolisada;

Complexo metal-polissacardeo resultante da complexao de um

sal solvel com polissacardeo.

16

3.4.2 Absoro dos quelatos

As fontes minerais, mais comumente utilizadas na nutrio so as

inorgnicas como sulfatos, fosfatos, carbonatos, cloretos e xidos. Quando

estas fontes chegam ao estmago, ocorre uma dissociao das molculas,

liberando os ons metlicos como Zn2+, Mn2+ e entre outros 59.

No intestino, o transporte dos ons para o interior das clulas d-se pela

difuso passiva ou pelo transporte ativo, ou seja, para que esses ons sejam

absorvidos, e atinjam a corrente sangnea, rgos e tecidos, eles necessitam

estar atrelados a um agente ligante ou molcula transportadora, que permita a

passagem atravs da parede intestinal. Muitas vezes estes ons no encontram

o agente ligante e acabam sendo excretados. Nessas condies podem ocorrer

perdas pela reao com compostos, como colides insolveis ou no processo

de competio pelos stios de absoro entre os elementos minerais, com

interaes antagnicas que inibem a absoro 60.

Existe tambm um efeito de inibio da absoro de minerais por outras

substncias ou nutrientes quando apresentadas nas formas inorgnicas, dentre

elas o cido oxlico e ftico, taninos, fibras e entre outras. Por sua vez, os

minerais quelatados apresentam absoro superior aos inorgnicos, pois

geralmente, usam as vias de absoro das molculas orgnicas que se ligam a

eles, o que faz com que no tenham problemas de interaes com outros

minerais.

A absoro dos minerais quelatados pode ocorrer sob duas formas: o

mineral pode ser ligado borda em escova sendo absorvido pela clula

epitelial ou como ocorre na maioria das vezes onde o agente quelante

absorvido levando junto consigo o metal 55.

Segundo Kratzer e Vohra 55, o mecanismo pelo qual o agente quelante

melhora a atuao do mineral, depende da capacidade do ligante em

seqestrar o mineral, ou de sua habilidade em competir com outros ligantes,

formando complexos solveis com o mineral.

17

Para Clydesdale 61, um ligante forma um composto solvel com o mineral

sendo com isso melhor absorvido pela mucosa intestinal. Conforme Spears 62,

o ligante pode formar um complexo estvel no trato intestinal, evitando com

isso que o mineral forme complexos insolveis, dificultando a sua absoro. No

caso dos aminocidos quelatados, o elemento mineral metlico na molcula

quimicamente inerte por causa da forma de ligao. Esta ligao estvel, no

sofrendo dissociao das molculas quando atingem o estmago.

No jejuno, o aminocido do mineral quelatado, age como agente

transportador, permitindo a passagem do mineral atravs da parede intestinal

para a corrente sangunea (diretamente para o plasma). A separao do

aminocido quelante d-se no local onde o elemento mineral metlico ser

utilizado 63.

3.4.3 Biodisponibilidade dos quelatos

A biodisponibilidade tambm pode ser definida como a frao do mineral

que realmente absorvida e utilizada pelo organismo 59.

Existem muitos fatores que influenciam a biodisponibilidade dos minerais,

especialmente dos minerais - trao, tais como: nvel de consumo do mineral,

forma qumica, digestibilidade da dieta, tamanho da partcula, interaes com

outros minerais e nutrientes, agentes quelantes, inibidores, qualidade da gua,

condies de processamento e idade 64.

A partir da observao dos resultados de estudos nos ltimos 20 a 30 anos

torna-se claro a superioridade de biodisponibilidade dos quelatos quando

comparados aos sais. Entretanto, qualquer avaliao que queira realar a

biodisponibilidade como caracterstica de importncia dos quelatos deve ter

fontes mais solveis; como os sulfatos, como parmetro de comparao, uma

vez que a disponibilidade de cobre e zinco a partir de xidos mnima para

aves e sunos 46, 66, 67.

18

Alm disso, as respostas aos minerais quelatados so mais aparentes

quando os nveis de fitatos das dietas so elevados 38.

Desta forma, a vantagem dos minerais quelatados sobre as fontes

inorgnicas pode no ser to evidente em todas as situaes, o que pode

confundir a interpretao dos resultados. Da mesma forma, quando oferecidos

na forma inorgnica, os minerais passam a ter forte interferncia entre si. Em

geral a biodisponibilidade dos minerais na forma quelatada dependente de

trs condies bsicas na estrutura do composto:

a) Da forma de ligao com o metal - Nos quelatos formados com dois ou

trs aminocidos, o on metlico fica inerte na molcula, entrando com

facilidade nas vias metablicas, pois assume a caracterstica da

molcula orgnica;

b) Do peso molecular do quelato - O baixo peso molecular a chave

para a absoro como molcula intacta. Se o peso molecular de um

quelato for maior do que 800 dltons, certamente sofrer prvia hidrlise

na luz do trato digestivo e a absoro pela mucosa no ser garantida

58;

c) Da constante de estabilidade do quelato - Deve ser constitudo de

dois ou trs anis de aminocidos quelantes para serem estveis. Se a

constante de estabilizao dos aminocidos grande, estes iro resistir

ao de peptidases que quebram as ligaes peptdicas internas,

liberando o tomo de metal na molcula 63. Alm disso, a

biodisponibilidade dos minerais tambm varia de acordo com o tipo de

fonte mineral (Figura 2).

19

3.5 Frutas da regio amaznica

Algumas frutas de origem amaznica, como a castanha-do-par (Bertholletia

excelsa), cupuau (Theobroma Grandiflorum) e aa (Euterpe oleracea Mart)

so hoje amplamente comercializados em todo o mundo, e algumas delas

ainda so produzidos em diferentes continentes longe da Amrica do Sul. No

entanto, muitos outros frutos so consumidos apenas a nvel local ou regional e

sua composio qumica ainda desconhecida. O interesse em frutas

regionais tem aumentado bastante nos ltimos anos, por causa da incessante

busca de novos produtos e sabores exticos e, por outro lado, devido a sua

produo e comercializao que so considerados uma boa maneira de

aumentar a renda do pequeno produtor. Neste contexto, dados da composio

mineral so necessrios como uma primeira indicao do valor nutritivo das

frutas amaznicas 1, 2.

3.5.1 Aa

O aaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) nativo da Amaznia brasileira e o

Estado do Par o principal centro de disperso natural dessa palmcea.

FIGURA 2: Biodisponibilidade relativa de fontes de zinco e mangans. Adaptado de Polli (2002).

20

Populaes espontneas tambm so encontradas nos Estados do Amap,

Maranho, Mato Grosso, Tocantins e em pases da Amrica do Sul

(Venezuela, Colmbia, Equador, Suriname e Guiana) e da Amrica Central

(Panam) 67, 68.

Figura 3 Aa (Euterpe oleracea Mart.)

O aaizeiro se destaca, entre os diversos recursos vegetais, pela sua

abundncia e por produzir, importante alimento para as populaes locais,

alm de ser a principal fonte de matria-prima para a agroindstria de palmito

no Brasil 69, 70.

Tambm ocorre em reas de terra firme, principalmente quando localizadas

prximas s vrzeas e igaps.

Dos frutos do aaizeiro extrado o vinho, polpa ou simplesmente aa,

como conhecido na regio. Com ele so fabricados sorvetes, licores, doces,

nctares e gelias, podendo ser aproveitado, tambm, para a extrao de

corantes e antocianina 71.

O caroo, do qual a borra utilizada na produo de cosmticos, as fibras

em mveis, placas acsticas, compensados, indstria automobilstica, entre

outros. A polpa representa 15% e aproveitada, de forma tradicional, no

consumo alimentar, sorvetes e outros produtos derivados 72.

21

O aa considerado um alimento de elevado valor calrico, com alto

percentual de lipdeos, e nutricional, pois rico em protenas e minerais 73.

3.5.2 Bacur

O bacurizeiro (Platonia insignis Mart.) uma espcie arbrea nativa da

Amaznia Oriental Brasileira 75, 76, 73. Os frutos dessa Clusiaceae ocupam

posio de destaque na preferncia dos consumidores dos Estados do Par,

Piau e Maranho, onde se encontram densas e diversificadas populaes

naturais 77. Sendo o bacurizeiro uma rvore de usos mltiplos (fruto, madeira,

ltex) e com alto valor econmico, deve ser mantido em seu ambiente natural,

bem como ser plantado ou manejado em reas degradadas.

Existe pouca informao sobre a composio qumica de P. insignis, sendo

que os estudos existentes referem-se composio da polpa do bacuri e

sementes 77, 78.

Figura 4 Bacuri (Platonia insignis Mart.)

O seu desenvolvimento ideal em reas litorneas, no exigindo grandes

cuidados operacionais e possibilitando o cultivo de baixo custo em virtude do

aproveitamento de solos desgastados por culturas anuais. Sua propagao

ocorre pelas sementes ou por brotaes que surgem, espontaneamente, nas

22

razes das plantas adultas 80, 79, 73. Alguns tipos, de ocorrncia rara, apresentam

frutos desprovidos de sementes 77, os quais tm despertado pouco interesse,

pois apresentam tamanho diminuto e baixo teor de slidos solveis totais na

polpa 81. A polpa do bacuri muito utilizada na alimentao para a produo de

sucos, sorvetes, musses, dentre outras formas.

3.5.3 Castanha-do-par

A castanha-do-par ou castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) a

semente da castanheira, uma rvore da famlia botnica Lecythidaceae, nativa

da Floresta Amaznica que chega a atingir entre 30 a 45 metros de altura. Ela

ocorre em rvores espalhadas s margens do Rio Amazonas, Rio Negro, Rio

Orinoco, Rio Araguaia e Rio Tocantins.

Figura 5 Castanha-do-par (Bertholletia excelsa)

As sementes ou castanhas so de forma angulosa, tendo no seu interior a

amndoa, de alto valor econmico e nutricional. O ourio permanece na

rvore por 15 meses, quando chega a pesar cerca de 1,5 Kg 82.

Seu valor biolgico grande para fins alimentcios, pois contm em torno de

17% de protena cerca de cinco vezes o contedo protico do leite bovino in

natura. Seu teor de gordura extremamente elevado, em torno de 67%, com

23

somente 7% de carboidrato (fibras), alm das vitaminas A, C, B1, B2 e B5. Rica

em fsforo e clcio o alimento do planeta mais rico em selnio.

Alguns estudos mostraram que essa oleaginosa ajuda a prevenir cncer,

esclerose mltipla e mal de Alzheimer. Sua frao oleosa rica em cido graxo

monoinsaturado (48%) sendo indicados na preveno de doenas

cardiovasculares, controles glicmicos e de peso. Fonte riqussima de selnio,

a castanha-do-par cuida da fora do sistema imunolgico, ou seja, na

preveno do cncer, ajuda no equilbrio do hormnio ativo da tireide e age

como antioxidante, protegendo o organismo contra os danos provocados pelos

radicais livres 83.

3.5.4 Cupuau

A fruta Theobroma Grandiflorum, mais conhecida como cupuau, nativa

da Amaznia Oriental, sendo consumida em larga escala em toda a regio

norte do Brasil 84. O cupuauzeiro uma rvore do bosque tropical mido

atingindo at 18 metros de altura, sendo cultivado desde o estado de So

Paulo, no Sudeste, at Roraima, no extremo norte do Pas. Mas outros pases

como Equador, Guiana, Martinica, Costa Rica, So Tom, Trinidad e Tobago,

Gana, Venezuela e Colmbia tambm cultivam o cupuau. Polpa e sementes

so as partes mais utilizveis do fruto 85.

Figura 6 Cupuau (Theobroma Grandiflorum)

24

Da polpa, so produzidos sucos, cremes, doces, compotas, sorvetes,

biscoito e iogurtes, alm de licores deliciosos. Das sementes o mundo pde

conhecer o "cupulate", um subproduto que tem caractersticas nutritivas, sabor

e aroma parecidos ao chocolate. Ele pode ser produzido tanto em p como em

tabletes 86. Em termos nutricionais, a polpa do cupuau pobre em protenas e

gorduras, mas apresenta uma grande quantidade de fsforo, clcio e vitamina

C. J as sementes so ricas em protenas, gorduras, carboidratos e fibras 87.

3.5.5 Pupunha

A pupunha (Bactris gasipaes Kunth) uma planta perene, nativa da

Amaznia, que possui grande importncia econmica para a regio, sendo

cultivada para produo de frutos e palmito, tanto em monocultivo como em

sistemas agroflorestais.

A pupunha, da famlia das Palmceas, foi cultivada pelos amerndios pr-

colombianos na regio neotropical mida. Atualmente, essa espcie encontra-

se distribuda desde Honduras at a Bolvia.

Figura 7 Pupunha (Bactris gasipaes Kunth)

Seus frutos, de sabor muito apreciado, esto integrados nos hbitos

alimentares da rea que cobre os estados do Acre, Amap, Amazonas, Par,

25

Maranho, Mato Grosso, Rondnia e Roraima. Na regio ainda predomina o

consumo do fruto, mas a produo de palmito a partir do cultivo da pupunheira

comea a aumentar, com plantios em escalas considerveis no Par, Acre,

Rondnia e Mato Grosso.

A inflorescncia aparece nas axilas das folhas senescentes. Aps a

polinizao, os cachos podem conter entre 50 e 1000 frutos. Diversos fatores,

tais como nutrio ou polinizao deficiente, estiagem, competio, e ataque

de insetos e doenas podem causar o aborto e contribuir para o baixo peso

mdio do cacho.

Floresce quase o ano inteiro, porm com maior intensidade durante os

meses de agosto a dezembro. A maturao de seus frutos ocorre

principalmente nos meses de dezembro a julho. Atualmente, sua importncia

como alimento e o seu potencial tecnolgico tm sido incentivados atravs de

pesquisas realizadas no Brasil, Colmbia, Peru e Costa Rica 88.

3.6 Consideraes sobre as protenas

As protenas so as molculas orgnicas mais abundantes e importantes

nas clulas e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. So encontradas em

todas as partes de todas as clulas, uma vez que so fundamentais sob todos

os aspectos da estrutura e funo celulares 89. Existem muitas espcies

diferentes de protenas, cada uma especializada para uma funo biolgica

diversa. Alm disso, a maior parte da informao gentica expressa pelas

protenas.

Todas contm carbono, hidrognio, nitrognio e oxignio, e quase todas

contm enxofre. Algumas contm elementos adicionais, particularmente

fsforo, ferro, zinco e cobre. Seu peso molecular extremamente elevado 90.

A protena um macronutriente com muitas funes. Fornecem

aminocidos, que so os elementos que compem as protenas e so usados

para a formao de msculos e outros componentes do corpo que contm

26

protenas, incluindo imunoglobulinas, albumina, enzimas e hormnios. O

organismo sintetiza aminocidos no essenciais, enquanto outros que so

essenciais precisam ser fornecidos por fontes alimentares. As protenas e

outros compostos contendo nitrognio so constantemente degradados e

reconstrudos. Todas essas perdas devem ser repostas por um suprimento

contnuo de aminocidos fornecidos pela dieta 91.

As protenas so responsveis pela formao e manuteno dos tecidos

celulares e pela sntese dos anticorpos contra infeces. Produzem ainda

energia e ajudam na formao da hemoglobina do sangue e de variadas

enzimas. Em casos de carncia, a falta de protenas causa debilidade, edemas,

insuficincia heptica, apatia e at baixa das defesas do organismo. Em caso

de excesso, existe o risco de acidificao sangunea, gota e doenas renais e

reumticas 92.

Nem todas as protenas vegetais so iguais e as protenas de soja so as

nicas protenas de base vegetal que tm uma qualidade protica igual da

carne, leite e ovos. Essa protena de alta qualidade vem em trs formas

principais para mxima flexibilidade nas aplicaes alimentares: farinhas de

soja, protena concentrada de soja e protena isolada de soja 93.

3.7 Especiao Qumica

Recentemente, grandes esforos no campo da biologia e cincias

ambientais tm sido centrados na rea de especiao qumica. Cada vez mais,

se tem confirmado que a mobilidade, disponibilidade e distribuio das

espcies qumicas, no dependem somente de suas concentraes, mas

principalmente das associaes qumicas e fsicas que ocorrem no ambiente.

Mudana no ambiente quer seja de origem antropognica ou natural, pode

influenciar o comportamento tanto de elementos essenciais, como de

elementos txicos atravs da alterao das formas com que estes se

apresentam no meio 94.

http://www.solae.com.br/soyessentials/soyprotein.html#qualidadeprot%E9ica#qualidadeprot%E9icahttp://www.solae.com.br/soyessentials/soyprotein.html#formas#formashttp://www.solae.com.br/soyessentials/soyprotein.html#formas#formas

27

Nas recomendaes da IUPAC 2000, o termo espcie qumica definido

como uma forma especfica de um elemento definido com relao

composio isotpica, estado de oxidao ou eletrnico, e/ou estrutura

molecular ou complexada. Foi estabelecida anlise de especiao como a

atividade analtica de identificao e/ou quantidade medida de uma ou mais

espcie qumica individual, assim concluindo que especiao envolve a

distribuio entre espcies qumicas definidas em um sistema 94, 95. Nas ltimas

dcadas, um grande nmero de metodologias analticas tem sido publicado

para separao e determinao de diferentes espcies qumicas de selnio 96,

cromo 97, mercrio 98, arsnio 99, entre outros, presentes em diferentes tipos de

amostras.

Segundo, Takcs e colaboradores 100 , a complexao do cobre pela matria

orgnica dissolvida pode alterar sua especiao e solubilidade. McGeer e

colaboradores 101 evidenciaram que a complexao por substncias hmicas

aquticas atenuou a biodisponibilidade do cobre para peixes submetidos

exposio crnica com o metal. No caso do cobre, sua disponibilidade biota

governada pela presena do on livre em soluo 102, 103. Howarth e Sprague

104, por exemplo, observaram que a toxicidade do cobre para peixes est

fortemente relacionada com a concentrao do on livre. Pagenkopf e

colaboradores 105 e Sunda e Guillard 106 demonstraram que a toxicidade do

cobre est relacionada concentrao do on livre em soluo e no a sua

concentrao total. Mais recentemente, entretanto, Meylan e colaboradores 107

avaliaram a acumulao de cobre por algas em resposta a mudanas na

especiao do metal em guas superficiais e concluram que a concentrao

intracelular de cobre variou em funo da forma trocvel do metal, ou seja, a

somatria entre as concentraes do on livre e de complexos inorgnicos

fracos. Todos estes estudos evidenciam que a especiao de metais ,

portanto, uma questo da maior relevncia uma vez que seu conhecimento

pode ter implicaes diretas sobre aspectos ecotoxicolgicos.

28

bem sabido que elementos como Fe, Cu e Zn, apresentam afinidade com

enxofre e por tanto tendem a formar complexos com aminocidos,

oligopeptdeos e polipeptdeos 108.

A funo de muitas biomolculas e, em particular, metaloprotenas,

criticamente depende de sua interao com os elementos, principalmente com

metais de transio 109. Algumas protenas (por exemplo, metalotionenas) so

produzidas sob estresse de metais pesados durante a poluio

como por exemplo a albumina e a transferrina, que so transportadores de ons

de nutrientes essenciais, e atuam como ativadores de enzimas 109.

A especiao de metais trao, em amostras ambientais, biolgicas,

industriais, requer o emprego de mtodos de determinao com elevada

sensibilidade e seletividade. Por isso mtodos como espectrometria de

absoro atmica com chama (FAAS) 110, espectrometria de absoro atmica

com atomizao eletrotrmica (ETAAS) 111, espectrometria de massa com

plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) 112, e espectrometria de emisso

ptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) 113, tm sido

preferencialmente usados. Dependendo do analito de interesse, da matriz da

amostra e da tcnica utilizada, esses elementos podem ser quantificados em

concentraes na ordem de ng L-1.

Tcnicas cromatogrficas baseiam-se na separao de componentes de

uma determinada amostra presente em um solvente (fase mvel) devido as

diferentes interaes com a coluna, fase estacionria. A cromatografia de

excluso por tamanho fornece a separao em funo do peso molecular dos

compostos, sendo que no ocorre interao entre esses e a coluna. O

mecanismo de separao mecnico. Existem dois diferentes procedimentos

de separaes de excluso por tamanho, a permeao e a filtrao em gel. Na

filtrao em gel os componentes e a fase mvel so polares, enquanto na

permeao deseja-se separar espcies apolares. O tamanho do poro da coluna

responsvel pela separao dos compostos de uma amostra. As espcies de

baixo peso molecular penetraro nesses poros, tornando a eluio mais

29

demorada, tendo assim um maior tempo de eluio. O contrrio ocorre com

espcies de maior peso molecular 114, 115, 116.

3.8 Tcnicas analticas

3.8.1 Espectrometria de Absoro Atmica com Chama (FAAS)

A constante busca por mtodos analticos capazes de proporcionarem, ao

mesmo tempo, alta taxa de amostragem com baixo custo operacional,

repetibilidade e reprodutibilidade apropriadas, limites de deteco da ordem de

g L-1 ou melhores, alm de produzirem resultados com confiabilidade

metrolgica sem prejuzos ao ambiente e sem gerao de resduos (qumica

limpa), representa elevado interesse para as indstrias de equipamentos, para

os pesquisadores da rea de qumica analtica (em especial), para os

laboratrios de controle de qualidade e para as instituies responsveis pelo

monitoramento ambiental ou de outra natureza 117. A espectrometria de

absoro atmica com chama rene quase todas estas caractersticas, mas os

limites de deteco so inapropriados para a determinao de muitos analitos.

Neste sentido, procedimentos automatizados, empregando-se injeo em fluxo

para separao e/ou pr-concentrao dos analitos em espectrometria de

absoro atmica por chama (FAAS), tem sido apresentados como alternativas

de sucesso, podendo ser aplicado para uma extensa variedade de amostras.

O mtodo baseia-se na absoro de radiao eletromagntica,

normalmente na regio do visvel e ultravioleta, por tomos neutros no estado

gasoso 118.

O espectrmetro de absoro atmica um equipamento que permite a

anlise quantitativa de elementos metlicos em solues lquidas, gasosas e

slidas 119. Os componentes bsicos de um espectrmetro incluem a fonte de

radiao, sistema de atomizao, conjunto monocromador, detector e

processador (Figura 8).

30

I0 It

Figura 8 Diagrama de blocos de um espectrmetro de absoro atmica

A atomizao pode ser feita em chama, em tubo aquecido acoplado a

gerador de hidretos, atravs da gerao de vapor frio e eletrotermicamente em

forno de grafite, ou em outros sistemas alternativos.

3.8.2 Espectrofotometria UV - Visvel

A Espectrofotometria um dos mtodos instrumentais de anlise de

espcies qumicas. o mtodo de anlise ptica mais usada nas investigaes

fsico qumicas.

O espectrofotmetro (Figura 9) um instrumento que permite comparar a

radiao absorvida por uma soluo que contm uma concentrao

desconhecida do analito, selecionar o comprimento de onda da radiao

adequada anlise de um determinado componente do analito, medir a

intensidade I do feixe emergente que corresponde a um determinado feixe

incidente I0, convertendo o sinal recebido no detector em medida de

absorbncia para o comprimento de onda da anlise e por fim determinar a

concentrao de vrias solues a partir do grfico da variao de absorbncia

em funo da concentrao de vrias solues padro 120.

Fonte de radiao

hv

Sistema de atomizao

M + hv M*

Conjunto

monocromador

Detector

(Transdutor)

Amostra com teor

C do analito M

31

Figura 9: Espectrofotmetro de feixe simples.

A espectroscopia de absoro molecular baseada na medida da

transmitncia T ou absorbncia A de solues contidas em clulas

transparentes tendo um caminho ptico de b, dado em cm. A concentrao c

de um analito absorvente est relacionada linearmente com a absorbncia,

conforme representado na equao.

A = - log T = log P0 / P = . b. c

A Lei de Beer se aplica a um meio contendo mais de uma espcie de

substncia absorventes. Esta lei bem sucedida ao descrever o

comportamento da absoro de meios contendo concentraes de analito

relativamente baixas, neste sentido a Lei de Beer limitada 121.

Os componentes do instrumento so fonte, seletores de comprimentos de

onda, recipientes para amostra, transdutores de radiao e processadores de

sinal e dispositivos de leitura 122.

O esquema abaixo mostra claramente o funcionamento de um

Espectrofotmetro de feixe simples (Figura 10).

32

Figura 10: Esquema de um espectrofotmetro de feixe nico.

4. METODOLOGIA

4.1. Instrumentao

A determinao dos teores totais dos metais e nas protenas de cada frao

utilizando reagentes extratores foi realizada no Laboratrio de Anlises de

Minerais da UFRA e foram conduzidas em um espectrmetro de absoro

atmica com chama (SpectrAA 220, Varian) e sistema de aquisio de dados em

plataforma Windows. Lmpadas de catodo oco (HCL) de Cu, Fe, Mn e Zn foram

usadas como fontes de radiao.

Os parmetros instrumentais usados para a determinao de Fe, Cu, Mn e

Zn por FAAS so apresentados na Tabela 2.

33

Tabela 2. Parmetros instrumentais usados na determinao de Fe, Mn, Cu e Zn nas

amostras de frutas por FAAS

Parmetros Fe Mn Cu Zn

Comprimento de onda (nm) 248,3 279,5 324,8 213,9

Corrente da lmpada (mA) 10,0 5,0 7,0 5,0

Resoluo espectral (nm) 0,5 0,2 0,5 0,5

Na digesto das amostras foi utilizado um bloco digestor Tecnal (Modelo TE-

040/25-1).

Um espectrofotmetro de feixe simples com caminho tico de 1 cm foi

utilizado na determinao de protenas totais nas amostras de amndoas da

castanha-do-par e polpas de aa, bacur, cupuau e pupunha.

Na determinao do pH foi utilizado um peagmetro (marca WTW, Modelo

pH 330i).

Um agitador por efeito vrtex foi utilizado no procedimento de extrao

seqencial.

Uma centrfuga (Centribio, modelo 80 2B) foi utilizada na separao das

fraes proticas.

Um cromatgrafo lquido de alta resoluo (Varian) equipado com vlvula de

injeo Rheodyne (Modelo 7125, Cotati, CA, EUA) e uma coluna cromatogrfica

de excluso por tamanho foi utilizado na separao cromatogrficas das

protenas presentes no extrato de aa.

Um espectrmetro de absoro atmica com atomizao eletrotrmica em

forno de grafite (SpectrAA 220, Varian) equipado com amostrador automtico

(GTA 110), com corretor de fundo de lmpada de deutrio, tubo de grafite com

aquecimento longitudinal (HGA Varian) e sistema de aquisio de dados em

plataforma Windows foi usado na determinao de cobre. Lmpada de catodo

oco (HCL) de cobre foi usada como fonte de radiao. O gs argnio foi utilizado

como gs de purga em uma vazo de 3 L min-1 de argnio. Todas as medidas

34

foram obtidas por absorbncia integrada (integrao do sinal transiente de

absorbncia em funo do tempo).

4.2 Reagentes e Materiais

Todos os reagentes utilizados foram de grau analtico. Empregou-se gua

destilada - desionizada em sistema de purificao ELGA (resistividade 18,2

M .cm), permitindo-se assim obter gua com elevado grau de pureza. O cido

ntrico (Quimex, So Paulo, Brasil) utilizado na preparao das solues

analticas e na digesto cida, foi purificado em subdestiladores de quartzo

(Marconi, modelo MA 075). Na digesto das amostras tambm foi utilizado

H2O2 (Quimex, So Paulo, Brasil). Os padres dos elementos Fe, Cu, Mn e Zn

foram preparados em meio HNO3 7,8 % (m/v). Ar e acetileno foram utilizados

como gs oxidante (3,5 L/min) e combustvel (1,5 L/min) na determinao de

Cu, Fe, Mn e Zn, respectivamente.

Os materiais plsticos de polietileno, vidrarias e as ponteiras das

micropipetas aps usados foram lavados com gua, depois com gua

desionizada e, em seguida, foram imersos em um banho de soluo de 10%

(v/v) de HNO3 por 24 h. Posteriormente, esses materiais foram lavados

abundantemente com gua desionizada e secos.

Todas as amostras foram armazenadas sob refrigerao em frascos de

polietileno.

No procedimento de extrao seqencial foram utilizados CHCl3 (Quimex,

So Paulo, Brasil), CH3OH (Quimex, So Paulo, Brasil), NaOH (Synth,So

Paulo, Brasil), HCl (Synth, So Paulo, Brasil), Tris-HCl (Sigma Aldrich) em pH =

8,0, SDS em Tris-HCl em pH = 8,0 (Sigma Aldrich). Acetona 80% (v/v) foi

utilizada na precipitao das protenas.

As amostras das frutas utilizadas neste trabalho foram coletadas no

Mercado do Vr-o-Peso, na cidade de Belm (PA).

35

4.3 Procedimento analtico 4.3.1 Preparo de amostras As amostras (amndoa da castanha-do-par e polpas de aa, bacur,

cupuau e pupunha) foram inicialmente secas em estufa a uma temperatura de

aproximadamente 35 C durante 3 dias, at peso constante. Em seguida, foram

pulverizadas com o auxlio de um processador de alimentos. Aps essa etapa,

uma parte da amostra foi armazenada em frasco de polietileno, em temperatura

ambiente no dessecador.

4.3.2 Digesto das amostras

A digesto das polpas e amndoas foram realizadas em triplicatas (n=

3). Sub-amostras de cerca de 0,4 gramas foram pesadas e transferidas para

tubos de digesto, sendo em seguida adicionados 1,0 mL HNO3 concentrado

(14,0 mol L-1). A mistura foi mantida em overnight. Antes de ser colocado os

tubos com a mistura no bloco digestor foram adicionados 2,0 mL HNO3

concentrado (14,0 mol L-1) e 1,0 mL de H2O2 30% (m/m) e em seguida as

amostras foram colocadas no bloco digestor a temperatura de 130 C.

Transcorrido 3 horas do incio do processo de digesto, a temperatura foi

elevada 150 C. Verificado a diminuio da formao de gases aps 2 horas

nesta temperatura e finalmente para garantir que toda gordura presente nas

amostras fosse digerida, a temperatura foi elevada para 180 C e mantida

durante 1 h. Os tubos de digesto foram retirados do bloco e resfriados a

temperatura ambiente. Aps o resfriamento, os digeridos obtidos foram

transferidos para frascos volumtricos e os volumes ajustados para 25 mL com

gua desionizada. O branco analtico foi preparado pelo mesmo procedimento

sem a adio da amostra. A acidez final foi de 7,8% (v/v). A figura abaixo ilustra

o procedimento para a determinao total de Cu, Fe, Mn e Zn nos digeridos de

aa, bacur, castanha do par, cupuau e pupunha por FAAS.

36

Figura 11: Esquema referente ao procedimento de preparo de amostra para a

determinao total de Cu, Fe, Mn e Zn nos digeridos de aa, bacur, castanha do

par, cupuau e pupunha por FAAS

4.3.3 Remoo da frao lipdica

A frao lipdica foi obtida pesando em frascos volumtricos uma massa de

aproximadamente 5,0 g de cada amostra previamente pulverizada. Em seguida

foram adicionados 40 mL da soluo extratora de clorofrmio (CHCl3) e

metanol (CH3OH) (2:1 v/v). O frasco contendo a soluo extratora e a amostra

foram submetidos a agitao por efeito vrtex durante 10 minutos. Este

procedimento foi feito em triplicata (n= 3). A separao dos sobrenadantes foi

feita atravs de uma filtrao simples. O slido final foi seco em estufa a uma

temperatura de 30 C por 20 minutos. O sobrenadante rico em lipdeos foi

submetido a evaporao temperatura ambiente.. A frao lipdica obtida foi

submetida a uma digesto cida em bloco digestor como realizado para

determinao total dos elementos estudados. Aps a digesto, as solues

obtidas foram analisadas por FAAS. O procedimento de extrao dos lipdeos

mostrado na Figura 12.

37

Figura 12: Extrao das fraes lipdicas.

4.3.4 Extrao seqencial

Aproximadamente 1,0 g das amostras pulverizadas sem lipdeos foram

pesadas em frascos de polietileno e 20 mL de soluo extratora foram

adicionadas. As solues de NaOH 0,05 mol/L, HCl 0,05 mol/L, soluo

tampo de Tris-HCl (pH= 8,0) 0,05 mol/L, soluo tampo de Tris-HCl (pH=

8,0) 0,05 mol/L em 1% (m/v) SDS e gua 60 C foram empregadas como

agentes extratores no procedimento de extrao seqencial.

Para a extrao de protenas de alta massa molecular (HMW: high

molecular weight) e baixa massa molecular (LMW: low molecular weight) foi

utilizada uma soluo de NaOH 0,05 mol/L. As protenas de baixa massa

molecular foram extradas usando uma soluo de HCl 0,05 mol/L. A soluo

tampo de Tris HCl (pH = 8,0) e gua desionizada 60 C foi usada na

extrao das protenas solveis. Com a adio de um surfactante aninico

38

soluo de Tris HCl (pH = 8,0), como o SDS (Dodecil sulfato de sdio), foram

extradas as protenas insolveis.

O resduo da extrao de NaOH foi submetido a extrao com HCl e assim

sucessivamente. Em seguida foram agitadas em vrtex por 30 minutos e

posteriormente centrifugadas por 10 minutos a 3500 rpm. Os sobrenadantes

obtidos foram filtrados em filtros de nylon com poros de 0,45 m.

Para a ltima extrao foram adicionados 20 mL de gua desionizada no

resduo e levados a banho Maria 60 C por 30 minutos e posteriormente

centrifugados por 10 minutos a 3500 rpm.

Para a purificao das fraes durante a extrao seqencial, as protenas

foram precipitadas com 80% (v/v) de acetona a -14 C durante 30 minutos. Os

precipitados obtidos foram centrifugados durante 10 minutos a 3500 rpm. O

sobrenadante foi eliminado e os resduos foram submetidos a uma digesto

cida conforme apresentado no item 4.2.2. O procedimento de extrao

seqencial apresentado na Figura 13.

1,0g da amostra s/

lipdios

Agentes

extratores

3x

30 min.10 min

sobrenadante

acetona

80% da

sol.final

30 min, -14C

metaloprotenas

Acetona (3x)

FAAS

Digesto cidacentrifugao

Figura 13: Extrao das fraes proticas

39

4.3.5 Protena total Para a quantificao de protenas nas diferentes fraes proticas obtidas

durante a extrao seqencial das amostras de aa, bacur, castanha-do-par,

cupuau e pupunha foi utilizado o mtodo de Bradford.

As amostras foram inicialmente submetidas leitura de pH e posteriormente

foi adicionado 0,5 mL da soluo de NaOH 0,1 mol/L em 0,5 mL de cada

amostra para obter um pH na faixa de 10,0 a 11,0. Aps adio da soluo de

NaOH 0,1 mol/L, foi retirada uma alquota de 200 L da amostra e

acrescentado 2mL do reagente de Bradford. As amostras foram deixadas para

reagir por um perodo de 5 minutos. Aps este tempo a protena foi

quantificada atravs de um espectrofotmetro no comprimento de onda igual a

595 nm (Figura 14).

O mtodo de Bradford consiste em um mtodo analtico simples, preciso e

rpido sendo indicado para quantificao de protenas. O principal componente

do reagente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 que em soluo cida,

ao ligar-se com protenas apresenta absorbncia alterada de 465 nm para 595

nm. A faixa de linearidade do mtodo de 2 a 20 g /mL de protena.

Figura 14: Determinao de protena total

40

4.3.6 Determinao dos teores totais de Cu, Fe, Mn e Zn por espectrometria de

absoro atmica com chama (FAAS)

Para a determinao dos teores totais dos metais nos digeridos da

amndoa da castanha-do-par e nas polpas do cupuau, bacur, pupunha e

aa por FAAS, foram construdas curvas analticas de 5 a 15 mg/L Fe, 1,0 a

4,0 mg/L Mn e 0,5 a 1,5 mg/L Zn e 1 a 4 mg/L Cu em meio HNO3 7,8% (v/v).

4.3.7 Teste da adio e recuperao O teste de adio e recuperao foram realizados nos digeridos das

amostras e nas fraes obtidas na extrao seqencial. Nos digeridos e nas

fraes foram adicionados de 2,0 mg L-1 Cu, 5,0 mg L-1 Fe e 1,0 mg L-1 Zn.

4.3.8 Otimizao da separao cromatogrfica dos padres de protenas

As solues das protenas foram preparadas atravs da dissoluo de 2 mg

mL-1 ferritina, 2 mg mL-1 albumina, 2 mg mL-1 mioglobina e 2 mg mL-1 seleno-

metionina em 0,0025 mol L-1 Tris-HCl (pH 7,4) contendo SDS (0,5% m/v). A fase

mvel foi sonicada durante 20 min a fim de remover completamente o oxignio

dissolvido antes de iniciar os experimentos.

As condies cromatogrficas usadas para a separao das protenas padro

por cromatografia de excluso por tamanhos (SEC) so apresentadas na Tabela

3. A separao foi realizada usando um gradiente isocrtico de SDS (0,5% m/v)

em 0,0025 mol L-1 Tris-HCl (pH 7,4). O pH foi ajustado com 50% (v v-1) cido

clordrico. O eluente da coluna de excluso por tamanhos foi passado por um

detector UV e o comprimento de onda de 295 nm foi selecionado para

monitoramento das protenas. O cromatograma obtido foi registrado.

41

Tabela 3 - Condies operacionais para SEC usando gradiente isocrtico.

Coluna Biosep - SEC - S 3000 (300 mm x 7.8 mm)

Ala de amostra

( L)

20

Vazo do eluente (mL min-1)

0,6

Eluente 0,0025 mol L-1 Tris-HCl (pH 7,4) em SDS (0,5% m/v).

Deteco das protenas

UV a 295 nm

4.3.9 Deteco de Cu associado s protenas presentes no aa por SEC-UV

O extrato obtido no item 4.2.4 em meio NaOH para amostra de aa foi

injetada no sistema SEC-UV (Figura 15).

1,0g da amostra

s/ lipdios

10 mL NaOH

0,05M

3x

15 min. 10 min.sobrenadante

acetona

80% da

sol.final

30 min, -14C

metaloprotenas

Acetona (3x)Solubilizao

0,05 mol/L Tris-HCl em

pH = 8,0 em 5% (m/v) de SDS

Diluio 10x

em pH = 7,4

20L da amostraSEC-HPLC

Liofilizada GFAAS

HNO3 0,028 mol/L

Figura 15: Esquema do procedimento para deteco de Cu na frao protica do aa por SEC UV e SEC GFAAS

42

Fase mvel

Espectrofotmetro

UV

HPLC

Coluna

20 L

amostra

Fase mvel

Espectrofotmetro

UV

HPLC

Coluna

20 L

amostra

Espectrofotmetro

UV

HPLC

Coluna

20 L

amostra

Liofilizao das

fraes por 24 h

HPLCColuna

Coleta das fraesFase mvel

Amostrador

automtico

GFAAS

200 L HNO30,028 mol L-1

Liofilizao das

fraes por 24 h

HPLCColuna

Coleta das fraesFase mvel Liofilizao das

fraes por 24 h

HPLCColuna

Coleta das fraesFase mvel

Amostrador

automtico

GFAAS

200 L HNO30,028 mol L-1

As condies usadas para a separao das protenas so as mesmas detalhadas

na Tabela 3. O esquema referente ao sistema SEC on-line UV mostrado na

Figura 16. O perfil cromatogrfico obtido foi registrado.

Figura 16 - Esquema do sistema SEC on-line UV.

4.3.10 Deteco das espcies de Cu associadas s protenas do aa por SEC-

GFAAS

O extrato obtido no item 4.2.4 em meio NaOH para amostra de aa foi

injetada no sistema SEC-UV e as fraes foram coletadas de 1,0 em 1,0 min

em copos do amostrador automtico do forno de grafite (Figura 17).

.

Figura 17 - Esquema do sistema off-line SEC-GFAAS

43

As condies usadas para a separao das protenas so as mesmas

detalhadas na Tabela 3. As fraes coletadas foram liofilizadas. Aps a

liofilizao, as fraes foram solubilizadas em 0,028 mol L-1 de HNO3. Em

seguida, cobre foi determinado nas fraes por GFAAS. As condies

instrumentais para determinao de Cu por GFAAS so apresentadas na

Tabela 4.

Tabela 4 - Programa de aquecimento do forno de grafite

Etapa Temperatura (C)

Tempo (s)

(rampa, patamar)

gs purga

(L min-1)

Leitura

1 95 5, 40 3,0 No

2 120 10, 30 3,0 No

3 1000 (Tp) 5,20 3,0 No

4 2300 (Ta) 2, 0 0 Sim

5 2400 1,3 3,0 No

Tp: Temperatura de pirlise; Ta: Temperatura de atomizao.

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1.Concentrao dos elementos nas amostras A presena de carbono residual nas solues das amostras digeridas

crtica para vrias tcnicas analticas, porm o uso de solues de cido ntrico

mais concentrado pode acarretar em melhor oxidao da matria orgnica 123.

44

A possibilidade de se diminuir a quantidade de reagentes atrativa por

diversos fatores, tais como reduo dos resduos gerados, custo, contaminao

e da intensidade do branco analtico. Alm disso, a gerao de solues com

menor teor de cidos interessante devido a no necess