UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS INSTITUTO DE …§ão... · identificados, utilizando CCD, CLAE-DAD-UV e espectrometria de massas, os flavonoides rutina e isoquercitrina nas espécies

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

ESTUDOS FITOQUMICOS DE ESPCIES DO GNERO Bauhinia

(FABACEAE) DA REGIO AMAZNICA

PRISCILA MORAES DOS SANTOS

MANAUS

2013

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA




Orientador: Prof. Dr. Valdir Florncio da Veiga Junior

MANAUS

2013

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao em Qumica da Universidade

Federal do Amazonas como parte dos requisitos

para obteno do ttulo de Mestre em Qumica,

com rea de concentrao em Qumica Orgnica.

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Ficha Catalogrfica

(Catalogao realizada pela Biblioteca Central da UFAM)

S237e

Santos, Priscila Moraes dos

Estudos fitoqumicos de espcies do gnero Bauhinia (Fabaceae)

da Regio Amaznica / Priscila Moraes dos Santos. - Manaus:

UFAM, 2013. 124 f.; il. color.

Dissertao (Mestrado em Qumica) Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2013.

Orientadora: Prof. Dr. Valdir Florncio da Veiga Junior

1. Bauhinia 2. Flavonides 3. Cromatografia 4. Fitoqumica 5. Farmacologia I. Veiga Junior, Valdir Florncio da (Orient.) II.

Universidade Federal do Amazonas III. Ttulo

CDU (2007): 852.736(811.3)(043.3)

iv




Aprovada em 10 de julho de 2013.

BANCA EXAMINADORA

Dissertao apresentada ao Programa de

Ps-graduao em Qumica da Universidade

Federal do Amazonas como parte dos

requisitos para obteno do ttulo de Mestre

em Qumica, com rea de concentrao em

Qumica orgnica.

v

Dedico este trabalho a toda minha

famlia, em especial minha av,

Maria Aparecida in memoriam, e aos

meus pais, Sandra e Paulo; aos meus

tesouros na terra, meus amigos; e a

todos que colaboraram para a

realizao deste projeto.

vi

AGRADECIMENTOS

Deus, por me conceder sabedoria e sade para conseguir mais esta vitria;

minha me Maria Sandra e meu pai Paulo Maurcio por todo o apoio, ajuda e

conselhos nos momentos em que mais precisei, e principalmente por seus

ensinamentos e educao que acolho com todo respeito e privilgio;

Aos meus avs paterno e materno, Manuel e Natal, por serem homens exemplares,

com coraes maravilhosos e sinceros, sempre exemplos de vida para mim. Amo-os

demais! E minhas avs j no mais presentes em carne, Maria Aparecida e Maria

Filomena, a falta de vocs algo que nunca ser preenchido, mas o amor, as lies e

as benos recebidas me confortam frente ausncia. Vocs fizeram jus ao nome e

foram, para mim, Maria. Amo sempre.

minha famlia, que a melhor e mais doida de todas, tios Loureno e Daniel, tias

Gorete, Rita, Ftima e Louise, primas Sahmara, Sahmira e Manuela, primos Joo

Vincius e Mateus, e minha querida irm Priscielly, obrigada por toda compreenso,

suporte e incentivo para a concretizao desta dissertao, amo vocs!

Ao meu orientador, prof. Dr. Valdir Veiga, por ser um pai cientfico e me oferecer

todo suporte necessrio, acompanhamento e disposio para a realizao deste

trabalho na nossa rica, admirada e bela regio amaznica. Alm de tambm oferecer

uma oportunidade nica de conhecer e ampliar novos horizontes durante a realizao

deste projeto. Obrigada por tudo!

prof. Dr. Lgia Valente e seus alunos do Laboratrio 627 do Departamento de

Qumica da UFRJ, Vincius, Bianca, Rodolfo, Adriana e Isabela que me acolheram to

bem e compartilharam conhecimento e experincia, os quais, sem sombra de dvida

vii

contriburam e muito para o enriquecimento deste trabalho e profissionalmente.

Eternamente grata a todos vocs pela pacincia e disposio em ajudar!

Aos meus amigos do Laboratrio de Qumica de Produtos Naturais, em especial a

todos do sempre B-09, s que me receberam e acolheram em todo momento: Lidiam,

Klenicy, Priscilla, Paula e Milena, que me orientaram desde o comecinho, l nas ICs

em 2008. Aos mais recentes, companheiros e aos que j defenderam e aos breves

doutores e mestres: Carol, Igor, Dayana, Andr, Iuri e Fabiano. Obrigada pelas dicas,

conselhos e todo o apoio no desenvolvimento da minha pesquisa!

Ao Victor Augusto por todo apoio e incentivo nesses anos; s grandes amigas desde a

faculdade, Aline, Allana, Vanessa e Oneide, meninas, vamos conquistar o mundo

como excelentes e belas qumicas! Aos amigos Rodrigo e Renyer, obrigada por toda

ajuda durante esses anos. Sem vocs no poderia ter realizado essa conquista!

Amigas desde o ensino mdio, Patrcia e Giselle, presentes em mais esta conquista,

tenho o prazer em cultivar a nossa amizade por todos esses anos.

Aos que vim conhecendo na estrada da vida, Ana Lcia, Jackieline, Lucianna e Filipe,

suas histrias de superao, garra e conquistas sempre me fascinaro e sero exemplos

para mim! E aps 15 anos, reencontrei este tesouro na terra, na mesma rea de atuao

e em instituies prximas: Lorena, querida, Deus devolveu esta amizade to boa no

momento mais certo de minha vida! Obrigada a todas vocs, meninas, mulheres, que

enfeitam o meu jardim com tanta alegria, sabedoria, companheirismo e no menos

importante, obrigada pelos ombros amigos nos momentos mais difceis de minha

jornada!

Ao Professor Emerson, por conceder seu laboratrio para realizao dos ensaios

biolgicos e pelas dicas oferecidas, aos seus alunos Patrcia Danielle, Rayanne e

Arleilson, obrigada por todo o auxlio, pacincia e explicaes, meus queridos!

viii

E a todos no citados, professores, colegas de outros laboratrios, mas que fazem parte

de minha vida, meu muito obrigado por tudo! Sou soma de tudo o que vivo e aprendo

com todos que passam em minha vida!

AGRADEO

ix

"Porque nada h encoberto que no

haja de ser manifesto; e nada se faz

para ficar oculto, mas para ser

descoberto." (Marcos 4:22)

x

Resumo

Espcies do gnero Bauhinia so utilizadas em diversas partes do mundo para tratamento de

diversas doenas, principalmente para o tratamento da diabetes, devido a atividade

hipoglicemiante j comprovada para a espcie Bauhinia forficata, a qual associada

presena do flavonoide kaempferitrina. Entretanto, outras espcies tambm apresentam o

mesmo efeito e a este associada a presena de outros flavonoides glicosilados. Neste

trabalho buscou-se elaborar o perfil fitoqumico de quatro espcies de Bauhinia da Regio

Amaznica a partir de seus extratos brutos, fraes flavonodicas e alcalodicas, a fim de

promover uma varredura inicial para projetos biotecnolgicos mais especficos. Alm disso,

Bauhinia coronata (Manaus-AM), B. purpurea (Manaus-AM), B. acreana (Manacapuru-

AM) e B. purpurea (S. Gabriel da Cachoeira) foram analisadas para determinao do

potencial antioxidante frente os radicais livres DPPH., ABTS

.+ e O2

-, assim como a inibio de

enzimas lipoxigenase, -amilase, lipase, -glicosidase e tirosinase. Dentre estes ensaios

antioxidantes e biolgicos como tirosinase e -glicosidase, destacaram-se as espcies B.

coronata e B. purpurea com os valores mais baixos para CI50 (CI50 do extrato bruto de folha

de B. coronata: 1,910,55 g/mL) . A toxicidade dos extratos brutos tambm foi testada

frente ao microcrustceo Artemia salina, com valores de DL50 superiores a 250 g/mL,

indicando a baixa toxicidade dos mesmos. Entretanto, na anlise do seu potencial citotxico e

antibacteriano nenhuma espcie foi ativa, o que contrrio aos relatos da literatura em que a

Bauhinia purpurea j foi mencionada com estes potenciais. No perfil de flavonoides foram

identificados, utilizando CCD, CLAE-DAD-UV e espectrometria de massas, os flavonoides

rutina e isoquercitrina nas espcies B. coronata e B. purpurea, sendo este ltimo flavonoide j

relacionado atividade hipoglicemiante de outras espcies de Bauhinia, alm de ao

antiinflamatria. O flavonoide kaempferitrina no foi encontrado em nenhuma espcie, como

nenhuma substncia relativa classe alcalodica. Os resultados obtidos a partir da atividade

antioxidante, baixa toxicidade e a presena de flavonoides com potencial fitoterpico

estimulam futuras pesquisas especficas para fins biotecnolgicos.

Palavras chave: Bauhinia, rutina, isoquercitrina, flavonoides, cromatografia.

xi

Abstract

Species of the genus Bauhinia are used in various parts of the world to treat various diseases,

especially for the treatment of diabetes due to hypoglycemic activity has proven to Bauhinia

forficata species, which is associated with the presence of the flavonoid kaempferitrina.

However, other species also have the same effect and this is associated with the presence of

other flavonoids glycosides. In this study we sought to prepare the phytochemical profile of

four species of Bauhinia Amazon region from their crude extracts, alkaloid and flavonoics

fractions in order to promote an initial scan for more specific biotechnology projects.

Furthermore, Bauhinia coronata (Manaus-AM), B. purpurea (Manaus-AM), B. acreana

(Manacapuru-AM) and B. purpurea (S. Gabriel da Cachoeira) were analyzed for antioxidant

activity front free radicals DPPH., ABTS

.+ and O2

-, as well as the inhibition of enzymes

lipoxygenase, -amylase, lypase, -glycosidase and tyrosinase. Among these assays as

biological antioxidants and tyrosinase and -glycosidase, stood the species B. coronata and B.

purpurea with lower values for IC50 (IC50 of B. coronata leafs crude extract: 1.91 0.55 g /

mL). The toxicity of crude extracts was also tested against Artemia salina, with LD50 values

of greater than 250 g/mL, indicating the low toxicity of them. However, the analysis of their

potential cytotoxic and antibacterial no species has been active, which is contrary to reports in

the literature that Bauhinia purpurea was mentioned with these potentials. The profile of

flavonoids were identified, using TLC, HPLC-DAD-UV and mass spectrometry, and the rutin

and isoquercitrin flavonoids in the species B. coronata and B. purpurea, the latter being

related to the flavonoid has hypoglycemic activity of other species of Bauhinia, and anti-

inflammatory action. The kaempferitrin flavonoid wasnt found in any species, as no

substance of the alkaloidal class. The results from the antioxidant activity, low toxicity and

the presence of flavonoids with potential herbal stimulate future research for specific

biotechnological purposes.

Keywords: Bauhinia, rutin, isoquercitrin, flavonoid, chromatography.

xii

LISTA DE FIGURAS E ILUSTRAES

Figura 1. Auguste de Saint-Hilaire e um manuscrito de seus trabalhos. Fonte:

e , ambos acessados em 18/10/12. ........... 27

Figura 2. Esquema representativo da estrutura geral dos flavonoides, caracterizada pela

presena de 2 anis aromticos (A e B), ligados por uma ponte de 3 tomos de carbono que

formam o anel heterocclico oxigenado (C) (PIMPO, 2009; ROSS, 2002). ........................ 30

Figura 3. Rota biossinttica dos flavonoides. (DEWICK, 2002) .......................................... 31

Figura 4. Principais classes majoritrios dos flavonoides (COOK E SAMMAN, 1996). ...... 32

Figura 5. Alguns flavonoides glicosilados: rutina e robinina. ............................................... 33

Figura 6. Imagem do galho e folhas de Bauhinia sp. ........................................................... 35

Figura 7. Alcaloides isolados do gnero Bauhinia. Da esquerda para direita: a partir de

Bauhinia candicans (trigonelina) e Bauhinia ungulata (harmano e eleagnina). ..................... 46

Figura 8. Estrutura qumica dos flavonoides kaempferitrina e miricetina. ............................ 48

Figura 9. Substncias com carter antioxidante usadas como padres para avaliao do

potencial antioxidante. ......................................................................................................... 53

Figura 10. Reao e esquema representativo da reduo do DPPH. (MOLYNEUX, 2004;

LEANDRO, 2010) ............................................................................................................... 54

Figura 11. Formao do ction 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), ABTS.+

(VASCONCELOS et al, 2007). ........................................................................................... 54

Figura 12. Estrutura do radical NBT+ (Nitro Blue Tetrazolium) (ALVES et al, 2010)......... 55

Figura 13. Esquema geral da metodologia empregada. ........................................................ 58

Figura 14. Placa para ensaio qualitativo da atividade antioxidante de DPPH.. ...................... 60

xiii

Figura 15. Placa cromatogrfica dos extratos brutos revelados com NP-PEG, em UV- 365

nm. 1) CBc; 2) FBp2; 3) FBa2; 4) FBa1; 5) kaempferitrina (padro); 6) FBp1; 7) FBc; 8)

GBa1; 9) GBa2; 10) GBp1. Eluente: AcOEt / AcOH / COOH / H2O (100:11:11:27). ........... 86

Figura 16. Placa cromatogrfica dos extratos brutos (1-9), padres (K e R) e respectivas

fraes flavonicas (1-F a 9-F) revelados com NP-PEG, em UV- 365 nm. 1) CBc; 2) FBc; 3)

FBp1; 4) GBp1; 5) FBa1; 6) GBa1; 7) GBa2; 8) FBa2; 9) FBp2; K) kaempferitrina; R) rutina;

1-F) CBc-F; 2-F) FBc-F; 3-F) FBp1-F; 4-F) GBp1-F; 5-F) FBa1-F; 8-F) FBa2-F; 9-F) FBp2-

F. Eluente: AcOEt / AcOH / COOH / H2O (100:11:11:27). .................................................. 88

Figura 17. Placa cromatogrfica das fraes flavonodicas: 1-F) CBc-F; 2-F) FBc-F; 3-F)

FBp1-F; 4-F) GBp1-F; 5-F) FBa1-F; 8-F) FBa2-F; 9-F) FBp2-F) e padro isoquercitrina (Iq).

Eluente: AcOEt / AcOH / COOH / H2O (100:11:11:27). ...................................................... 89

Figura 18. Placa cromatogrfica das amostras 1) CBc; 2) FBc; 3) FBp1; 4) GBp1; 5) FBa1;

6) kaempferitrina; 7) quercetina; 8) GBa1; 9) GBa2; 10) FBa2; 11) FBp2; 12) CBc-Fc.

Eluente: AcOEt / AcOH / COOH / H2O (100:11:11:27). ...................................................... 90

Figura 19. Placa cromatogrfica revelada com FeCl3 para verificao da presena do padro

catequina (P) na amostra GBp1-F (1). Eluente: AcOEt:MeOH:H2O (100:13,5:10) ............... 90

Figura 20. Placa cromatogrfica para identificao do alcaloide harmano na amostra CBc-A.

A) 1- presena de mancha azul caracterstica de alcaloide em CBc-A em UV-365 nm; B)

comparao da eluio do CBc-A (1) e padro harmano (2) em UV- 365 nm, onde

apresentaram Rfs diferentes; C) CBc-A (1) e padro harmano (2) revelados com Dragendorff,

apresentando caractersticas divergentes. Eluente: BuOH/C3H6O/H2O (4:1:5) ...................... 91

Figura 21. Cromatogramas comparativos das amostras CBc-SPE (A) e CBc-F (B) possibilita

a anlise somente com as amostras obtidas a partir do fracionamento em AcOEt.................. 92

xiv

Figura 22. Espectros UV-VIS dos padres rutina (Tr = 24,987 min) e kaempferitrina (Tr =

27,167 min), respectivamente, com absoro caracterstica em aproximadamente 280 e 350

nm. ...................................................................................................................................... 93

Figura 23. Espectros UV das amostras em intervalos caractersticos de grupos flavonicos: 1)

CBc-F (Tr= 24,447 min), 2) FBc-F (Tr= 35,578 min), 3) FBp1-F (Tr= 25,854 min), 4) GBp1-F

(Tr= 15,93 min), 5) GBa2-F (Tr= 29,924 min), 6) FBp2-F (Tr= 36,178 min). ........................ 94

Figura 24. Cromatogramas das amostras 1)CBc-F, 2) FBc-F, 3) FBp1-F, 4) GBp1-F, 5)

FBa1-F, 6) GBa1-SPE, 7) GBa2-SPE, 8) Rutina, 9) Kaempferitrina, 10) FBa2-F, 11) FBp2-F.

............................................................................................................................................ 96

Figura 25. Espectro das amostras FBp1-F (A), FBp2-F (B) e GBp1-F (C), respectivamente,

com a presena do pico m/z 609, relativo ao flavonoide rutina, e m/z 463, relativo ao

flavonoide isoquercitrina, identificados por CCD e/ou CLAE............................................... 98

Figura 26. Fragmentao dos ons m/z 609 e m/z 301 do padro rutina. .............................. 99

Figura 27. Respectivas fragmentaes do on m/z 609 (MS2) e do on m/z 301 (MS

3) das

fraes FBp1-F, FBp2-F e GBp1-F referentes rutina e proposta de fragmentao de acordo

com Dubber et al, (2005). .................................................................................................. 100

Figura 28. Anlise do padro isoquercitrina (MS) com deteco do pico m/z 463 [M-H]-. . 101

file:///C:/Users/Marineide/Documents/_UFAM/Mestrado/Dissertao/dissertao_corrigida.docx%23_Toc361672298file:///C:/Users/Marineide/Documents/_UFAM/Mestrado/Dissertao/dissertao_corrigida.docx%23_Toc361672298file:///C:/Users/Marineide/Documents/_UFAM/Mestrado/Dissertao/dissertao_corrigida.docx%23_Toc361672298

xv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Terpenos identificados em leos essenciais de Bauhinia sp. (Fonte: Duarte-

Almeida et al., (2004); Sartorelli e Correa, (2007)) .............................................................. 36

Tabela 2. Metablitos secundrios isolados do gnero Bauhinia. ......................................... 37

Tabela 3. Espcies de Bauhinia coletadas no Amazonas e catalogadas no INPA. (Acessado

em 06/01/12, http://brahms.inpa.gov.br/bol/INPA) ............................................................... 51

Tabela 4. Espcies de Bauhinia utilizadas no projeto, respectivos locais de coleta e as partes

da planta estudadas. ............................................................................................................. 73

Tabela 5. Extratos das amostras de Bauhinia e seus respectivos rendimentos....................... 74

Tabela 6. Resultado das anlises de DPPH qualitativo. ........................................................ 76

Tabela 7. Avaliao da atividade antioxidante quantitativa dos extratos metanlicos de

Bauhinia frente o radical livre DPPH., ABTS

.+ e O2

-. ........................................................... 78

Tabela 8. Resultados das CI50 enzimticas utilizando os extratos metanlicos de Bauhinia. . 80

Tabela 9. Resultado dos ensaios de toxicidade em Artemia salina a partir das solues de

extrato bruto de espcies de Bauhinia................................................................................... 81

Tabela 10. Percentual do potencial de inibio para extratos metanlicos de Bauhinia. ....... 82

Tabela 11. Linhas bacterianas testadas e inibio do antibitico para cada bactria. ............ 84

Tabela 12. Relao das fraes flavonodicas obtidas a partir dos extratos brutos de espcies

de Bauhinia. ......................................................................................................................... 85

Tabela 13. Relao das fraes alcalodicas obtidas a partir dos extratos brutos de espcies de

Bauhinia. ............................................................................................................................. 85

xvi

LISTA DE SIGLAS E ABREVIAES

Abs amostra = absorbncia da amostra;

Abs controle = absorbncia do controle;

Absfinal amostra = absorbncia final da amostra;

Absinicial da amostra = absorbncia inicial da amostra;

AbsT0 amostra = absorbncia inicial da amostra (em 0 minuto);

AbsT20 amostra = absorbncia final da amostra (em 20 minutos);

AbsT0 controle = absorbncia inicial do controle (em 0 minuto);

AbsT20 controle = absorbncia final do controle (em 20 minutos);

ABTS.+ = 2,2-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato);

ACN = acetonitrila

AcOEt = acetato de etila;

BuOH = butanol;

CCD = cromatografia em camada delgada

CI50 = concentrao inibitria 50%

CLAE = cromatografia lquida de alta eficincia

DCM = diclorometano;

DL50 = dose letal 50%;

DMSO = dimetilsufxido;

DPPH. = 2,2-difenil-1-picrilhidrazil;

EM = espectrometria de massas

EtOH = etanol;

IMP = imipenem;

L-DOPA = levodopa (dihidroxifenilalanina);

xvii

LOX = lipoxigenase;

MeOH = metanol;

NADH = nicotinamida adenina dinucleotdeo;

NBT = azul de nitrotetrazlio;

NP-PEG = revelador para flavonoides (soluo de difenilboriloxietilamina com

polietilenoglicol);

PMS = fenazina metassulfato;

RMN 1H = Ressonncia magntica nuclear de 1H

Tr = tempo de reteno;

: mdia da triplicata do controle;

xviii

SUMRIO

1. INTRODUO ........................................................................................................... 22

2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 25

3. REVISO BIBLIOGRFICA ..................................................................................... 26

3.1 Medicina tradicional e seu papel atual ........................................................................ 26

3.2 Plantas medicinais no Brasil ....................................................................................... 26

3.3 A famlia Fabaceae ..................................................................................................... 28

3.4 Flavonoides ................................................................................................................ 29

3.5 O gnero Bauhinia: utilizao e constituio qumica geral ........................................ 33

3.5.1 Flavonoides e Alcaloides em Bauhinia ................................................................. 45

3.5.2 Atividade hipoglicemiante ................................................................................... 46

3.5.3 Kaempferitrina: um marcador qumico dentro do gnero ..................................... 47

3.5.4 Aplicaes biotecnolgicas .................................................................................. 49

3.5.5 O gnero Bauhinia na Amaznia.......................................................................... 49

3.6 Anlises de atividades antioxidantes ........................................................................... 52

3.6.1 DPPH. ................................................................................................................. 53

3.6.2 ABTS.+

................................................................................................................ 54

3.6.3 Superxido .......................................................................................................... 54

3.7 Ensaios de inibio da atividade enzimtica................................................................ 55

3.7.1 Tirosinase ............................................................................................................ 55

xix

3.7.2 -amilase ............................................................................................................. 56

3.7.3 Lipase, lipoxigenase e -glicosidase .................................................................... 56

4. EXPERIMENTAL ....................................................................................................... 58

4.1 Coleta e preparo do material ....................................................................................... 58

4.2 Obteno dos extratos................................................................................................. 59

4.3 Anlise da atividade antioxidante ............................................................................... 59

4.3.1 Inibio do radical livre DPPH ............................................................................ 59

4.3.2 Inibio do radical livre ABTS.+

.......................................................................... 61

4.3.3 Inibio do radical livre O2- ................................................................................. 62

4.4 Atividade de inibio enzimtica ................................................................................ 63

4.4.1 Inibio da enzima tirosinase ............................................................................... 63

4.4.2 Inibio da enzima -amilase ............................................................................... 64

4.4.3 Atividade de inibio da enzima lipase ................................................................ 64

4.4.4 Atividade de inibio da enzima lipoxigenase ...................................................... 65

4.4.5 Atividade de inibio da enzima -glicosidase ..................................................... 66

4.5 Ensaio avaliativo de toxicidade em Artemia salina ..................................................... 67

4.6 Avaliao do potencial citotxico em clulas tumorais ............................................... 67

4.7 Anlises antimicrobianas ............................................................................................ 68

4.8 Fracionamento por extrao mltipla .......................................................................... 69

4.8.1 Flavonoides ......................................................................................................... 69

4.8.2 Alcaloides ............................................................................................................ 69

xx

4.9 Perfil Cromatogrfico utilizando Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) ........................................................... 70

4.9.1 Flavonoides ......................................................................................................... 70

4.9.2 Alcaloides ............................................................................................................ 71

4.9.3 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) .............................................. 71

4.10 Identificao por espectrometria de massas (EM) ..................................................... 72

5. RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................................. 73

5.1 Identificao e rendimento dos extratos ...................................................................... 73

5.2 Anlise da atividade antioxidante ............................................................................... 74

5.2.1 Anlise qualitativa da atividade antioxidante frente o radical DPPH. .................. 75

5.2.2 Anlise quantitativa das atividades antioxidantes frente os radicais DPPH., ABTS

.+

e O2- ............................................................................................................................. 77

5.3 Atividade de inibio enzimtica ................................................................................ 79

5.4 Ensaio avaliativo de toxicidade em Artemia salina ..................................................... 81

5.5 Avaliao do potencial citotxico em clulas tumorais ............................................... 82

5.6 Anlises antibacterianas ............................................................................................. 83

5.7 Fracionamento por extrao mltipla .......................................................................... 84

5.7.1 Flavonoides ......................................................................................................... 84

5.7.2 Alcaloides............................................................................................................ 85

5.8 Perfil cromatogrfico utilizando Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) ........................................................... 86

5.8.1 Flavonoides ......................................................................................................... 86

xxi

5.8.2 Alcaloides............................................................................................................ 91

5.8.3 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) .............................................. 92

5.9 Identificao por espectrometria de massas (EM) ....................................................... 97

6. CONCLUSO ........................................................................................................... 105

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................ 108

22

1. INTRODUO

A necessidade de estudos vinculados busca dos metablitos responsveis pelas aes

teraputicas de plantas medicinais nas ltimas dcadas vem sendo um dos principais alvos

dentro das indstrias farmacuticas, j que a utilizao de plantas medicinais relatada desde

os povos antigos, sendo o nico recurso teraputico para muitas comunidades e grupos tnicos

da poca (MACIEL et al, 2002). conhecido que ainda hoje grande parte da populao

mundial continua utilizando este recurso, sendo que em nosso pas grande influncia na

disseminao do conhecimento popular descende da unio de diferentes etnias e culturas de

imigrantes e indgenas, o que expandiu o conhecimento acerca das plantas medicinais

(LORENZI E MATOS, 2002). Com isso, pesquisas no intuito de conhecer as substncias

responsveis pelas relatadas aes fitoterpicas aumentam a cada dia e tornam-se alvo de

muitos pesquisadores no intuito de conhecer os constituintes qumicos responsveis pela

eficcia frente a certas enfermidades (ENGEL e FERREIRA, 2008).

No Brasil, o grande impulso para a pesquisa neste mbito foi o lanamento da Portaria

n. 212 do Ministrio da Sade, publicada em 11 de setembro de 1981, onde o estudo de

plantas medicinais se tornou prioridade dentro das pesquisas clnicas, sendo criado em 1982 o

Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais da Central de Medicamentos do Ministrio da

Sade (PPPM/Ceme). Com o Parecer n. 04/92 do Conselho Federal de Medicina, em 1992, a

fitoterapia foi reconhecida como um mtodo teraputico vlido, sendo somente em 1996,

atravs do Relatrio final da 10 Conferncia Nacional de Sade, impulsionada a ser

implementada na rede pblica de sade. Com a Resoluo da Diretoria Colegiada da Anvisa

(RDC/Anvisa) n 48 em 2004 foi permitido ento o registro de medicamentos fitoterpicos

(RODRIGUES et al, 2005).

23

Abrigando uma grande diversidade de plantas, a regio amaznica tornou-se destaque

para pesquisas com fins de avaliao do potencial farmacolgico de muitas espcies utilizadas

dentro do costume local, como por exemplo, o uso de mais de 200 espcies como j relatado

em Barcarena-PA, para fins medicinais (AMOROZO E GELY, 1988).

A partir da grande quantidade de plantas acessveis e deste conhecimento regional, a

comercializao de diversas partes de plantas para o preparo de chs e infuses muito

disseminada por todo o Brasil, sendo grande parte deste material no conhecido

cientificamente quanto a sua constituio qumica. Tal fato representa perigo para a populao

consumidora devido a possvel presena de compostos txicos, o que se torna um ponto

importante para o incentivo de mais pesquisas cientficas (CAPASSO et al, 2000; CALIXTO,

2000)

Em 2005, a Organizao Mundial de Sade (OMS), a partir do documento chamado

Poltica Nacional de Medicina Tradicional e Regulamentao de Medicamentos Fitoterpicos,

relacionou a medicina tradicional e o uso de fitoterpicos, a fim de que houvesse um controle

neste contexto. Neste documento foi includo o Brasil, j que o mesmo possui a maior

diversidade gentica do mundo, com cerca de 55.000 espcies catalogadas de um total

estimado entre 350.000 e 550.000 espcies alm do fato de ter uma grande tradio no uso

de plantas medicinais (RODRIGUES et al, 2005).

Desde o primeiro grupo de plantas medicinais para estudo clnico da Central de

Medicamentos do Ministrio da Sade, em 1982, a espcie Myrcia uniflora foi includa

devido ao seu potencial antidiabtico o ch de suas folhas, juntamente com a Bauhinia

forficata.

O gnero Bauhinia (Fabaceae) encontra-se neste perfil de medicina tradicional. As

espcies so conhecidas como pata-de-vaca ou unha-de-boi, e muito utilizada em nossa

regio, assim como em muitas outras localidades, como frica, sia e Amrica Central e do

24

Sul (ENGEL e FERREIRA, 2008), para tratamentos de processo inflamatrio, em distrbios

digestivos, reumatismo e principalmente antidiabtica (ALBUQUERQUE et al, 2005;

ALMEIDA et al, 2005). Possui grande variedade de espcies, cerca de 300, e em nosso pas

possvel encontrar aproximadamente 20% desse total (HAVER, 2002; SILVA E CECHINEL

FILHO, 2002).

Apesar do gnero ser estudado h dcadas no Brasil, as espcies da regio amaznica

so pouco estudadas, denotando a necessidade do conhecimento de nossa flora. Tal fato

contribuiria na verificao de compostos presentes nas espcies do gnero Bauhinia locais,

tornando-se uma pesquisa indita a fim de constatar a presena de flavonoides como a

kaempferitrina, que possam ser a causa da ao hipoglicemiante (SILVA, 2002; FUENTES,

2004; ENGEL e FERREIRA, 2008).

Estudos j realizados anteriormente no projeto de iniciao cientfica nos anos de 2009

a 2010 com as espcies locais B. coronata e B. purpurea, a fim de constatar presena de

substncias fenlicas, revelaram a possibilidade destas espcies conterem tais compostos a

partir da eluio em placa cromatogrfica usando agente revelador especfico para esta classe

(WAGNER, 1996). A verificao do potencial antioxidante, inibio enzimtica, potencial

citotxico e a elaborao de um perfil fitoqumico com os compostos majoritrios so passos

iniciais para o estudo deste gnero na Amaznia.

25

2. OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

- Estudar a composio qumica e atividades biolgicas de extratos das espcies de

Bauhinia da Amaznia.

OBJETIVOS ESPECFICOS

- Detectar os compostos majoritrios atravs de anlise dos extratos por CLAE, EM e

CCD;

- Verificar a presena de flavonoides considerados marcadores do gnero por CCD;

- Identificar flavonoides e alcaloides presentes por meio de tcnicas cromatogrficas e

espectromtricas;

- Verificar a atividade antioxidante frente aos radicais livres DPPH., ABTS

.+ e O2

-.;

- Analisar a citotoxicidade em modelo de Artemia salina e em clulas tumorais;

- Determinar o potencial antibacteriano;

- Calcular a atividade inibitria das enzimas lipoxigenase, -amilase, lipase, -

glicosidase e tirosinase.

26

3. REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 Medicina tradicional e seu papel atual

A necessidade da busca por plantas medicinais pelo homem datada desde tempos

antigos ao redor do mundo, onde essa procura tinha como objetivo sua prpria sobrevivncia

(RODRIGUES et al, 2005). Ao longo do tempo foram encontradas e evidncias que apontam

cada vez mais esse costume tradicional por muitos povos, como na medicina chinesa (QIAO

et al, 2002), indiana (HOWES e HOUGHTON, 2003), e at mesmo como relatado

recentemente o uso de plantas medicinais por Neandertais - os quais viveram h mais de

30.000 anos atrs diante de vestgios da presena destas na arca dentria de fsseis desses

primitivos, indicando uma antiga seleo natural por parte deles para uma automedicao

(HARDY et al, 2012).

O uso de medicamentos sintticos em geral, teve aumento e tornou-se mais

significativo do que o uso da medicina alternativa para os pases considerados desenvolvidos,

visto a viabilidade e segurana na medicao. Porm, pases que esto em desenvolvimento

ainda utilizam chs e infuses de plantas, e na maior parte das vezes esses so os principais

recursos no momento da medicao, j que a obteno destes medicamentos sintticos torna-

se muitas vezes invivel devido condio econmica existente (SOUZA-MOREIRA, 2010).

3.2 Plantas medicinais no Brasil

Aps a ocupao dos portugueses no Brasil, os relatos de plantas utilizadas para fins

medicinais foi efetivo, principalmente por impressionarem os novos ocupantes das terras com

a riqueza de espcies e sua utilidade dentre os indgenas, como relatado pelo botnico

francs Auguste de Saint-Hilaire, o qual foi o primeiro cientista a ter permisso de viajar pelo

territrio brasileiro com objetivo de pesquisar e relatar as espcies nativas, entre 1816 a 1822.

27

Cerca de 7.000 amostras de espcies foram depositadas no Musum national dHistoire

naturelle, em Paris, onde cerca de 4.500 eram desconhecidas naquela poca (BRANDO et

al, 2012).

Figura 1. Auguste de Saint-Hilaire e um manuscrito de seus trabalhos. Fonte: e

, ambos acessados em 18/10/12.

Documentos acerca das viagens e descobertas sobre a flora brasileira foram escritos

por Saint-Hilaire, como os livros Plantes usuelles des Brasiliens (SAINT-HILAIRE, 1824a),

Histoire des plantes les plus remarcables du Brsil et du Paraguay (SAINT-HILAIRE,

1824b), e Flora Brasiliae Meridionalis (SAINT-HILAIRE et al, 18251833)

Com toda a riqueza de diversidade de espcies de plantas e com a crescente chegada

de imigrantes, o conhecimento dos usos populares dos indgenas se associou ao dos

estrangeiros, sendo este disseminado de gerao em gerao ao longo do tempo, onde o uso

de plantas medicinais se tornou parte da cultura brasileira (ENGEL e FERREIRA, 2008).

A necessidade da criao de um controle frente a esse uso incontrolvel de muitas

espcies levou formao de polticas pblicas atravs do Ministrio da Sade, j que muitas

espcies no foram estudadas quanto sua composio e veracidade da ao teraputica

vinculada. A Anvisa um dos principais rgos neste mbito, responsvel pela

regulamentao e fiscalizao nas pesquisas de plantas medicinais (RODRIGUES et al,

2005).

28

Atualmente, os programas e fiscalizaes no so suficientes, principalmente na regio

amaznica, por conta do uso popular de plantas medicinais ser ainda maior devido o

isolamento de muitas comunidades ribeirinhas e pela condio econmica e dificuldade de

deslocamento para um atendimento pblico (AZEVEDO E SILVA, 2006). Indicativos deste

comportamento so as grandes feiras a cu aberto que vendem diversas partes de plantas para

chs ou infuses (LIMA et al, 2011).

Alguns desses locais so em Belm, no mercado Ver o Peso, e na feira da Manaus

Moderna, em Manaus, locais onde no h controle sobre a qualidade dos produtos vendidos,

como a adulterao do mesmo, por exemplo, um problema observado no s em nossa regio

mas em muitos outros lugares no mundo, onde no h fiscalizao ou verificao da

constituio dos produtos vendidos (CHOI et al, 2002; ABOU-ARAB et al,1999; ELVIN-

LEWIS, 2001; ZUCCOLOTTO et al, 1999)

Devido a grande diversidade de flora presente e o uso da medicina tradicional pela

populao regional, o estudo das espcies com relatos de efeitos teraputicos se tornou no

mais uma expectativa ou simplesmente um objeto de estudo, mas sim necessidade para

prevenir e alertar um possvel uso errneo de espcies que possam conter substncias txicas,

possvel contaminao ou adulterao no preparo do material (LANINI e DUARTE-

ALMEIDA, 2009).

3.3 A famlia Fabaceae

A famlia Fabaceae, tambm conhecida como Leguminosae, uma das maiores

famlias botnicas de interesse devido aos relatos de seus gneros serem utilizados na

medicina tradicional. Contempla cerca de 18.000 espcies em 619 gneros, ocupando o lugar

de terceira maior famlia. dividida em quatro grandes subfamlias: Caesalpinioideae,

Cercideae, Faboideae, Mimosoideae (WATSON, 1992; GUSSON, 2008),

29

No relato de Auguste de Saint-Hilaire durante a viagem pelo Brasil permitida pela

coroa portuguesa para averiguar as espcies nativas entre 1816 a 1822, das 53 famlias

descritas, Fabaceae representava 20 famlias, sendo considerada a famlia mais abundante

dentro do territrio explorado (BRANDO et al, 2012).

Principal famlia dentro dos tipos vegetacionais (LEWIS, 1987), em territrio

brasileiro possui cerca de 180 gneros e 3.170 espcies (BARROSO et al, 1991), o que

representa quase 20% do total de espcies do mundo, sendo que na regio amaznica esto

presentes 148 gneros, relativo a um tero do total da famlia e cerca de 21 gneros

provavelmente endmicos (SILVA E SOUZA, 2002).

Sendo alvo de muitos estudos, com raras excees, esta famlia a nica a apresentar

isoflavonas. Os benefcios como atividades antifngicas e antibacterianas, alm de inseticida,

apresentados pelas espcies de Fabaceae, so associados a essa classe (SIMES et al, 1999)

3.4 Flavonoides

Os flavonoides constituem o maior grupo de compostos fenlicos nas plantas,

abrangendo cerca de metade dos oito mil compostos fenlicos que ocorrem na natureza

(BALASUNDRAM, 2006).

Essas substncias so produzidas em diferentes espcies em prol de sua adaptao e

sobrevivncia em diferentes ambientes, desempenhando diversas funes, como de defesa

contra os fatores externos: parasitas, herbvoros ou outras plantas competidoras; de

sinalizao, para atrair agentes polinizadores ou dispersores de sementes; de proteo contra a

radiao ultravioleta (UV) ou de oxidantes (DAAYF E LATTANZIO, 2008); promovem o

crescimento do tubo polnico e a reabsoro de nutrientes minerais das folhas em senescncia

(ANDERSEN E MARKHAM, 2006).

30

Possuem extrema utilidade para as plantas, sendo encontradas nas angiospermas, as

quais investem quantidades significativas de energia metablica para a produo destes

compostos (ANDERSEN E MARKHAM, 2006). A estrutura qumica geral desta classe

representada na Figura 2. Diferentes compostos de cada classe podem ser formados a partir

das substituies nos anis aromticos. Estas substituies podem incluir oxigenao,

alquilao, glicosilao, acilao e sulfatao (BALASUNDRAM, 2006).

Figura 2. Esquema representativo da estrutura geral dos flavonoides, caracterizada pela presena de 2 anis

aromticos (A e B), ligados por uma ponte de 3 tomos de carbono que formam o anel heterocclico oxigenado

(C) (PIMPO, 2009; ROSS, 2002).

Os flavonoides so metablitos secundrios produzidos a partir de uma rota

biossinttica mista constituda das vias do chiquimato e acetato, como visto na figura 3 a

seguir (DEWICK, 2002).

A C

B

31

E1

E24-hidroxicinamoil-CoA

NADPH

E3

Claisen

NADPH

E3

E1E2aldol + hidrlise

ster

E2

descarboxilao

desidratao

enolizao

resveratrol

(estilbeno)

..

naringenina-chalcona

(chalcona)

enolizao(E1)

Ataque nucleoflico tipo-

Michael da OH na cetona

, - insaturada

isoliquiritigenina

(chalcona)

desidratao

enolizao

E4

naringenina

(flavanona)liquiritigenina

(flavanona)

E1: chalcona sintase

(naringenina-chalcona sintase)

E2: estilbeno sintase (resveratrol sintase)

E3: chalcona redutase

E4: chalcona isomerase

E1 Claisen

..

(E1)

E4

Figura 3. Rota biossinttica dos flavonoides. (DEWICK, 2002)

As classes majoritrias mais comuns deste grupo so apresentadas na figura 4 a seguir.

Muitas mudanas estruturais destes compostos so obtidas a partir das substituies por

glicosdeos, o que mais comum na natureza. Dentro dos flavonoides glicosilados,

geralmente so encontradas a incluso da D-glucose, L-rhamnose, galactose e arabinose,

sendo os flavonoides mais usuais na alimentao a rutina e robinina (figura 5), as quais so

absorvidas pelo organismo aps sua hidrlise no intestino (KIJHNAU, 1976; HAVSTEEN,

1983).

32

Flavonis Flavonas Flavanonas

Catequinas Antocianidinas

A

B

6'

5'

4'

3'

2'

2

3

4

5

6

Isoflavonas Dihidroflavonis Chalconas

Figura 4. Principais classes majoritrios dos flavonoides (COOK E SAMMAN, 1996).

Encontrados em plantas e integrantes da dieta humana (COOK e SAMMAN, 1996),

aps a descoberta dos benefcios dos flavonoides para a sade humana, as pesquisas procura

de fontes naturais destes compostos se tornaram importantes vertentes do mundo cientfico.

Alguns dos benefcios vinculados a esta classe so ligados s aes hepatoprotetiva,

antioxidante, antiinflamatrio e antineoplsicos (NARAYANA et al, 2001; HACKETT, 1986;

HOPE et al, 1983), alm de outras atividades biolgicas como ao antimicrobiana e antiviral

(NIJVELDT et al, 2001; HANASAKI et al, 1994).

33

Figura 5. Alguns flavonoides glicosilados: rutina e robinina.

Diversos setores da indstria, como a cosmtica e farmacutica, vem apresentando

maior interesse a cada nova descoberta dos benefcios destes compostos, fazendo com que

haja um estmulo maior nas pesquisas relacionadas a tais substncias fenlicas. Prova disso

que somente no perodo que compreende os anos de 2007 a 2009 houve um aumento de mais

de 30% nos estudos relacionados a este grupo de substncias, tornando esta classe um alto

interesse dentro dos produtos naturais (VEITCH E GRAYER, 2011).

3.5 O gnero Bauhinia: utilizao e constituio qumica geral

O gnero Bauhinia compreende cerca de 300 espcies distribudas no planeta (MAIA

NETO et al, 2008), sendo uma boa parte deste ndice podendo ser encontrada em nosso pas

(JOLY, 1993; POLHILL, 1981).

Sendo esta espcie natural da sia, a sua adaptao em territrio brasileiro foi muito

bem consolidada, apresentando fcil desenvolvimento em terras com clima tropical (Pepato et

al, 2002). Recebendo diversos nomes relacionados ao formato das folhas e do cip, a

Bauhinia conhecida por vrios nomes, como: pata-de-vaca, casco de vaca, unha de

boi, pata de boi (STASI e HIRUMA-LIMA, 2002), ceroula de homem, capa bobe,

34

escada de jabuti, moror, cip de escada, escada de macaco (ROSADO E ROSADO,

1960).

Alm do uso para fins alimentcios de suas sementes, que so fonte de vitamina A

(BALOGUN e FETUGA, 1989), so tambm utilizadas para fins ornamentais como

paisagismo de praas e ruas em alguns estados do Brasil (CARVALHO, 2003).

Muitos relatos medicinais so apresentados no gnero Bauhinia, como para ao anti-

infecciosa (SILVA e CECHINEL-FILHO, 2002), diurtica, hipoglicemiante, tnica,

depurativa, no combate elefantase (MARTINS, 1995), analgsica, antidiabtica,

antiinflamatria, antimicrobiana, adstrigente (GONZALEZ-MUJICA et al, 1998;

CARVALHO et al, 1999; WILLAIN FILHO, 1997), para o tratamento de inchaos e tumores

estomacais, diarria, lcera (KUMAR e CHANDRASHEKAR, 2011).

Em Juliani (1929, 1931), os estudos fitoqumicos relacionados espcie Bauhinia

forficata e sua atividade hipoglicemiante ganharam notoriedade e despertaram interesse de

pesquisadores j que em muitas partes do mundo essa planta administrada para diferentes

enfermidades. Como por exemplo, na sia e ndia, esse gnero tambm utilizado nas

chamadas doenas das mulheres, que inclui problemas menstruais e no tratamento de

leucorria (DAS et al, 2008).

No Brasil, as espcies do gnero Bauhinia (figura 6) utilizadas principalmente para

tratamento de diabetes, processos inflamatrios e dolorosos, em forma de ch ou infuso so

B. manca, B. rufescens, B.forficata, B. cheilantha e B. splendens. J as mais estudadas quanto

fitoqumica se localizam nas regies sul, sudeste e nordeste do Brasil, com destaque para B.

manca, B. glabra, B. rufa, B. candicans, B. uruguayensis, B. purpurea, B. forficata e B.

splendens (MACEDO, 2004; SOUSA, 1998; VIANA et al, 2000; SILVA e SOUSA, 2002).

35

Figura 6. Imagem do galho e folhas de Bauhinia sp.

.

Devido ao fcil reconhecimento da planta pelo formato das folhas e abundncia do

gnero em diferentes locais, a propagao do uso medicinal dentre as comunidades se tornou

muito comum, levando a um uso desordenado de muitas espcies sem o conhecimento

qumico prvio das substncias presentes dentro do material consumido (LANINI E

DUARTE-ALMEIDA, 2009).

Apesar de no ser documentado o incio do uso das espcies do gnero por parte dos

povos antigos, sua utilizao empregada ao longo do tempo por muitas comunidades

(SOUZA, 2003), seja em forma de ch, infuso ou partes individuais da planta aplicadas ao

local de enfermidade.

Destacam-se na constituio qumica de algumas espcies do gnero, compostos de

diferentes classes de compostos orgnicos com interesse medicinal, como lactonas,

flavonoides, terpenoides, taninos, quinonas (SILVA E CECHINEL FILHO, 2002) e

alcalides (MELO E NASCIMENTO, 2004; MAIA NETO et al, 2008).

Na espcie Bauhinia championii foi isolado o cido glico (CHIEN-CHIN et al,1985).

Muitos terpenos - classe pouco avaliada dentro da famlia Fabaceae - foram verificados nos

leos essenciais das espcies a seguir:

36

Tabela 1. Terpenos identificados em leos essenciais de Bauhinia sp. (Fonte: Duarte-Almeida et al., (2004);

Sartorelli e Correa, (2007))

Bauhinia forficata

-pineno, -copaeno, -elemeno, -cariofileno,

biciclogermacreno, -humuleno, com traos de -elemeno, -

pineno, -ocimeno

Bauhinia aculeata

-bourboneno, -elemeno, lepidozenol, eremofileno, e traos de

cis--bergamoteno, -cariofileno, aromadendreno, xido de

cariofileno, ledeno e valenceno

Bauhinia brevipes

-copaeno, -elemeno, germacreno D, -selineno, -elemeno, -

cadineno, viridifloral, -cadinol, -cadineno, traos de -

bourboneno, -humuleno

Bauhinia longiflia

-cariofileno, germacreno D, biciclogermacreno, -humuleno,

ismero de copaeno

Bauhinia pentandra

-cariofileno, -elemeno, xido de cariofileno, e traos de -

humuleno, -elemeno e cis--bergamoteno

Bauhinia rufa

-pineno, allo-aromadendreno, -amorfeno, germacreno D,

germacreno B, biciclogermacreno, -cadineno, viridiflorol, -

cadinol, com traos de -pineno, -fencheno, -gurjuneno

Bauhinia variegata

-copaeno, -elemeno, -cariofileno, isocariofileno, allo-

aromadendrene, germacreno D, -elemeno, -cadineno, ledeno, e

traos de -bourboneno, aromadendreno e -humuleno

Outra classe de metablitos de grande interesse que j foi detectada no gnero a dos

aminocidos, em Bauhinia purpurea, e oxepinas, classe muito rara de ser encontrada na

natureza, tambm isolada de Bauhinia purpurea, os quais foram vinculados a timas

atividades inibitrias contra o crescimento de clulas tumorais, atividade biolgica pouco

37

relatada com compostos isolados do gnero (VIJAYAKUMARI et al, 1997; IRIBARREN E

POMILIO, 1989; PETTIT et al, 2006).

Na tabela abaixo so encontrados os principais compostos isolados das espcies de

Bauhinia.

Tabela 2. Metablitos secundrios isolados do gnero Bauhinia.

Classe Composto Estrutura Espcie Referncia

Oxepinas Bauhinias-

tatinas1-4

Bauhinia

purpurea

Pettit et al,

2006; Kumar e

Chandrashekar,

2011

5,6b dihidro-

1,7-dihidro-1,7-

dihidroxi-3,4-

dimetxi-2-

metildibenzeno

Bauhinia

variegata

Reddy et al,

2003

Cromanos Pacharina

Bauhinia

racemosa

Prabhakar et al,

1994

Racemosol

Bauhinia

racemosa

Prabhakar et al,

1994

Lignanas

2,6-di(4,5-

dihidroxifenil)-

3,7-

dioxabiciclo[3.

3.0]octano-1-

hidroxi-5-O-

ramnopiranos

dio

Bauhinia

retusa

Semwal e

Sharma, 2011

Estilbenides Obtustireno

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

38

Esteroides

Estigmasta-

3,5-dieno-7-

ona

Bauhinia

candicans

Irribarren e

Pomilio, 1983

Sitosterol 3-

O--

glucosdio

Bauhinia

candicans; B.

manca

Irribarren e

Pomilio, 1983;

Cragg et al,

1997

Sitosterol -4-O-

-D-

xilopiranosdio

Bauhinia

uruguayensis;

Bauhinia manca

Iribarren e

Pomilio, 1989;

Iribarren e

Pomilio, 1984

Sitosterol -4-

O--D-

glucopiranos

dio

Bauhinia

uruguayensis

Iribarren e

Pomilio, 1989

Dihidrodibenzo

xepina

Bauhinoxepina

J

Bauhinia

purpurea

Boonphong et

al, 2007

Triterpenides Lupeol

Bauhinia

variegata

Gupta et al,

1980

cido

betunlico

Bauhinia

vahlii

Sultana et al,

1985

Flavonas 4-hidroxi-7-

metoxiflavona

Bauhinia

guianensis

Viana et al,

2000

Apigenina

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

Bausplendina

Bauhinia

splendens Laux et al, 1985

39

Agathisflavona

Bauhinia

vahlii

Sultana et al,

1985

Chrisoeriol

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

(2S)-7,4-Di-

hidroxiflavona

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

(2S)-7,3-

Dimetoxi-4-

hidroxi-

flavona

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

(2S)-3,4-

Dimetoxi-7-

hidroxi-

flavona

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

(2S)-7,4-

Dimetoxi-3-

hidroxi-

flavona

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

Chalconas Isoliquiritigeni

na

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

Echinatina

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

2-metoxi-

isoliquiritigeni-

na

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

4-metoxi-

isoliquiritigeni-

na

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

2,4-di-hidroxi-

4-metoxi-di-

hidrochalcona

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

40

Flavonoides e

derivado Kaempferol

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

Ombuina

Bauhinia

variegata

Yadava e

Reddy, 2003

5,3-dimetoxi-

luteolina

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

(+)-Catequina

Bauhinia

racemosa; B.

aurea; B.

championii

Sashidara et al,

2012; Shang et

al, 2007; Chen

et al, 1994

Flavonides

glicosilados Astragalina

Bauhinia

purpurea

Vijayakumari et

al, 1997

Kaempferitrina

Bauhinia

forficata

Silva e

Cechinel-Filho,

2002; Pizzolatti

et al, 2003;

Sousa et al,

2004

Rutina

Bauhinia vahlii;

B. tomentosa;

B. splendens;

B. retusa; B.

tomentosa; B.

purpurea

Sultana et al,

1985;

Subramanian e

Nair, 1963;

Cechinel Filho

et al, 1995;

Tiwari et al,

1978; Row et al,

1974; Abd-El-

Wahab et al,

1987

41

Isoquercitrina

Bauhinia

purpurea; B.

tomentosa; B.

retusa; B. vahlii;

B. racemosa

Ramachandran

e Joshi, 1967;

Subramanian e

Nair, 1963; Row

et al, 1954;

Tiwari et al,

1978

Kaempferol 3-

O--

rutinosdio

Bauhinia

candicans

Iribarren e

Pomilio, 1983

Vitexina

Bauhinia

microstachya

Bianco e

Santos, 2003

Quercetina -

3,7-O--L-

ramnopiranos

dio

Bauhinia

candicans

Iribarren e

Pomilio, 1989

Kaempferol -

5-O--L-

ramnopiranos

dio

Bauhinia

candicans

Iribarren e

Pomilio, 1989

42

Kaempferol-3-

galactosdio

Bauhinia

variegata;

Bauhinia

purpurea

Gupta et al,

1980; Rahman

e Begun, 1966;

Vijayakumari et

al, 1997

Kaempferol-

3,7-ramno-

glucosdio

Bauhinia

variegata

Gupta et al,

1980; Rahman

e Begun, 1966

Bauhiniasdeo

A

Bauhinia

glauca Wu et al, 2009

Astilbina

Bauhinia

megalandra

Gonzlez-

Mujica, 2011

Quercetina 3-

O--

ramnosdeo

Bauhinia

megalandra

Gonzlez-

Mujica, 2011

Quercetina 3-

O--(2-

galoil)ramnos

dio

Bauhinia

megalandra

Estrada et al,

2005;

Gonzlez-

Mujica, 2011

43

Kaempferol 3-

O--(2-

galoil)ramnos

deo

Bauhinia

megalandra

Estrada et al,

2005;

Gonzlez-

Mujica, 2011

Kaempferol-

3,7-O--

Diraminosdio

Bauhinia

forficata

Sousa et al,

1998

Hesperidina

Bauhinia

variegata

Yadava e

Reddy, 2003

5,6-di-hidroxi-

7-metoxi-

flavona-6-O-

-D-

xilopiranosdio

Bauhinia

variegata

Yadava e

Tripathi, 2000

5,7,5-tri-

hidroxi-2-O-

ramnosil-

flavona

Bauhinia

megalandra

Gonzalez-

Mujica et al,

2000

5,7,2-tri-

hidroxi-5-O-

ramnosil-

flavona

Bauhinia

megalandra

Gonzalez-

Mujica et al,

2000

44

Narigenina-

5,7-dimetoxi-

4-

ramnoglucos

dio

Bauhinia

variegata

Rahman e

Begun, 1966

Flavanona (2S)-

Narigenina

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

(2S)-

Eriodictiol

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

(2S)-

Liquiritigenina

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

7-metoxi-(2S)-

liquiritigenina

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

4-metoxi-(2S)-

liquiritigenina

Bauhinia

manca

Achenbach et

al, 1988

lcoois Triacontanol

Bauhinia

candicans

Iribarren e

Pomilio, 1983

Polilcoois D-pinitol

Bauhinia

candicans

Iribarren e

Pomilio, 1983

cidos graxos cido

esterico

Bauhinia

splendens Laux et al, 1985

Isofitol

Bauhinia

forficata

Sartorelli e

Correa, 2004

Glicosdios Bauhinina

Bauhinia

championii

Chien-Chin et

al, 1985

45

Quinonas Lapachol

Bauhinia

guianensis

Viana et al,

2000

Galactolipdeo

(2S)-1, 2-di-

O-linolenoil-3-

O-a-

galactopirano

sil-(1/6)-O-b-

galactopirano

sil glicerol

Bauhinia

racemosa

Sashidhara et

al, 2012

Alcaloides Trigonelina

Bauhinia

candicans

Iribarren e

Pomilio, 1987

Harmano

Bauhinia

ungulata

Maia Neto et al,

2008

Eleagnina

Bauhinia

ungulata

Maia Neto et al,

2008

Lactona Grifonilida

Bauhinia

variegata

Okwute e

Ndukwe, 1986

3.5.1 Flavonoides e Alcaloides em Bauhinia

O gnero Bauhinia apresenta como compostos majoritrios os flavonoides, o que pode

corresponder sua grande capacidade antioxidante j verificada em muitos estudos e que

podem contribuir para as aes teraputicas vinculadas ao gnero (GONZLEZ-MUJICA,

2011; PIZZOLATTI, 2003; ORTIZ, 2009; BRACA, 2001).

Entretanto, a presena de alcaloides neste gnero rara, visto que somente trs foram

isolados em duas espcies: na Bauhinia candicans, com o isolamento da trigonelina

(IRIBARREN E POMILIO, 1987), e em Bauhinia ungulata, os alcaloides harmano e

eleagnina (MAIA NETO et al, 2008).

46

Segundo Maia Neto et al (2008), os alcaloides harmano e eleagnina haviam sido

relatados somentes no gneros Acacia (Acacia baileyana e Acacia complanata) (REPKE et

al., 1973; JOHNS et al., 1966) e Prosopis (Prosopis nigra) (MORO et al., 1975) da famlia

Mimosaceae, Burkea (Burkea africana) (FERREIRA, 1973), Caesalpiniaceae; Desmodium

(Desmodium pulchellum) (GHOSAL et al, 1972), Desmodieae; e Petalostylis (Petalostylis

labicheoides) (BADGER E BEECHAM, 1951), Detarieae. Tal relato denota a pouca

frequncia desta classe em Fabaceae.

Figura 7. Alcaloides isolados do gnero Bauhinia. Da esquerda para direita: a partir de Bauhinia candicans

(trigonelina) e Bauhinia ungulata (harmano e eleagnina).

3.5.2 Atividade hipoglicemiante

A descoberta e insero de medicamentos para o tratamento da diabetes considerada

recente dentro da indstria farmacutica. Todavia, na medicina popular, a utilizao dos chs

de folhas das plantas Bauhinia forficata e tambm de Averrhoa carambola (carambola) para o

tratamento desta doena bastante comum, sendo este costume passado de gerao em

gerao (ALBUQUERQUE et al, 2005; ALMEIDA et al, 2005; ENGEL e FERREIRA, 2008;

ACHENBACH et al, 1988; TESKE E TRENTINI, 1995; WILLAIN FILHO et al, 1997;

GONZALEZ-MUJICA et al, 2003; TEIXEIRA et al, 2000).

Entre todas as aes teraputicas apresentadas pelo gnero Bauhinia, a que mais

relatada e investigada comumente na literatura a sua ao hipoglicemiante.

Porm, resultados contraditrios tambm foram encontrados, por Pepato et al (2010),

onde extratos etanlicos de Bauhinia forficata no demonstraram atividade hipoglicemiante

47

em ratos, sendo esta espcie considerada como a pata de vaca verdadeira por ter mais

estudos comprovando seu efeito hipoglicemiante (SILVA E CECHINEL-FILHO, 2002).

Assim, com os diferentes resultados apresentados desde os estudos iniciais, ao longo

do tempo foram sendo estudadas outras espcies de diferentes localidades utilizadas com o

mesmo propsito hipoglicemiante ou por apresentar relato de outros fins medicinais.

Como apresenta Gupta et al (1980), o extrato aquoso da espcie Bauhinia divaricata

mostrou um significativo efeito em ratos referente ao teste de atividade hipoglicmica. Com o

avano das anlises para verificao deste efeito, recentemente foi divulgada a anlise do

extrato de Bauhinia variegata, o qual apresentou atividade de secreo de insulina

(insulinotrpica) em linhagens de clulas testadas (FRANKISH et al, 2010).

A ao farmacolgica da espcie B. variegata a partir de seus extratos etanlico e

aquoso tambm foi confirmada a partir da diminuio da taxa glicmica, como tambm do

colesterol (THIRUVENKATASUBRAMANIAM e JAYAKAR, 2010; WAHAB et al, 1987).

Outras espcies tambm avaliadas, Bauhinia monandra, Bauhinia megalandra e

Bauhinia cheilantha apresentaram ao hipoglicemiante em ratos induzidos a diabetes, onde

foi verificado em alguns casos a reduo da produo heptica da glucose e a sua absoro

intestinal (GONZALEZ-MUJICA, 2011; MENEZES, 2007; ALMEIDA et al, 1997)

Alguns estudos exploram ainda mais a razo para tais atividades apresentadas, como

relatado em Estrada et al (2011): os flavonides isolados da espcie Bauhinia megalandra

no apresentaram atividade inibitria sobre a glucose-6-fosfatase, enzima responsvel pela

hidrlise da glucose, e sim sobre o tranportador desta enzima, propondo um novo meio ao

modo de atividade hipoglicemiante (FERNANDEZ-PENA, 2008).

3.5.3 Kaempferitrina: um marcador qumico dentro do gnero

A presena de um marcador facilita a identificao do material exposto no mercado, j

que h a fcil adulterao do material vegetal processado com outras espcies de Bauhinia ou

48

outros agentes, principalmente nos comrcios livres e feiras, o que exige uma verificao do

controle de qualidade. (SILVA et al., 2000; SILVA e CECHINEL-FILHO, 2002;

PIZZOLATTI et al, 2003; SOUSA et al, 2004; ENGEL e FERREIRA, 2008). Prova disso a

facilidade de encontrar a venda de produtos a base de Bauhinia at mesmo na Internet, o que

exige ateno mxima e fiscalizao da rotulagem, composio qumica e outras informaes

bsicas do produto (BRASIL, 2004).

A kaempferitrina, figura 8, um flavonoide isolado das folhas de B. forficata, a qual

foi vinculada a ao hipoglicemiante do extrato, tornando-o um marcador qumico para as

amostras comercializadas desta espcie e sendo at esse flavonoide considerado como uma

fonte natural de insulina para o controle de diabetes (SILVA et al, 2000; SILVA E

CECHINEL FILHO, 2002; PIZZOLATTI et al, 2003; LINO et al, 2004; MIYAKE et al,

1986; JORGE et al, 2004; DA CUNHA et al, 2010).

Porm nem todas as espcies possuem este flavonide e ainda assim apresentam a

mesma ao, o que permite dizer que diferentes compostos existentes em outras espcies do

gnero podem apresentar o mesmo efeito.

A procura por marcadores qumicos para espcies deste gnero no s uma

preocupao brasileira, em Ferreres et al (2012), a presena de miricetina em folhas de

Bauhinia longifolia serviu como marcador em comparao com amostras comerciais deste

gnero, j que este flavonoide est presente somente nas folhas desta espcie.

Figura 8. Estrutura qumica dos flavonoides kaempferitrina e miricetina.

49

3.5.4 Aplicaes biotecnolgicas

Diversos estudos a partir de substncias isoladas de espcies do gnero Bauhinia em

prol de aplicaes biotecnolgicas so cada vez mais comuns.

Por exemplo, a lectina isolada do extrato de B. monandra nomeada de BmoLL,

apresentou atividade cupimicida para a espcie Nasutitermes corniger, cupim endmico da

regio neotropical, que destri construes de madeiras, e tambm exibiu atividade

antifngica, chegando at a 30% de inibio contra o crescimento de Fusarium solani, F.

oxysporum, F. moniliforme, F. lateritium e F. decemcellulare (SOUZA et al, 2011).

Em diversas reas biotecnolgicas, a presena de flavonides como constituintes no

gnero, os quais possuem como caracterstica a ao antioxidante, desperta muito interesse.

Como por exemplo, no tratamento da catarata, onde o principal fator reconhecido para o

surgimento o dano oxidativo na lente ocular. Na catarata, h o deslocamento para o estresse

oxidativo no equilbrio natural de oxidao-antioxidao. Assim, o flavonide rhamnocitrina,

isolado da Bauhinia variegata, possui efeitos antioxidantes fortes, podendo ser utilizada com

grande utilidade para regular a catarata (Bodakhe et al, 2012).

A rea cosmtica tambm j foi avaliada como grande potencial para o gnero

Bauhinia. Em Takatori (1997), a verificao de uma quantidade favorvel de vitaminas em

extratos de Bauhinia variegata dita como um agente promovedor de crescimento e

fortalecimento dos cabelos, podendo ser utilizado em shampoos, tnicos ou cremes,

estabelecendo a variedade de aplicaes dos usos bio e tecnolgicos do material obtido a

partir de espcies do gnero Bauhinia.

3.5.5 O gnero Bauhinia na Amaznia

O uso popular mais comumente relatada neste gnero no Brasil a ao

hipoglicemiante obtida atravs dos chs das folhas de Bauhinia forficata, dita como a

50

verdadeira pata-de-vaca, sendo esta j comprovada e atribuda presena do flavonoide

glicosilado kaempferitrina, o qual considerado como um marcador qumico dentro do

gnero (JULIANI, 1931; SILVA e CECHINEL-FILHO, 2002; SILVA et al., 2000;

PIZZOLATTI et al., 2003).

Na regio amaznica o uso de espcies desse gnero no diferente, sendo descrito o

mesmo uso para o tratamento de diabetes no Acre, Amazonas e Par, e encontrado em muitas

feiras e comrcios a cu aberto material como folhas de Bauhnia para uso como ch para

obter a ao medicinal (MING, 2006; BORRS, 2003, BARBOSA et al, 2009). Tal fato

incentiva a necessidade de estudos acerca da verificao da presena do marcador

kaempferitrina, j que tal ao poderia estar vinculada a este marcador tambm nas espcies

locais.

Na Amaznia poucos estudos acerca da constituio fitoqumica das espcies de

Bauhinia foram realizados. Aparentemente sendo o nico relato, em Laux et al (1985),

relatado estudos a partir de Bauhinia splendens, onde isolada a bausplendina 5,6,3,4-

dimetilenodioxi-7-metoxiflavona, assim como outras substncias desta classe qumica, sem

apresentar outras caractersticas para tal espcie.

Em 1993, foi realizado um amplo trabalho de campo da rea de interesse biolgico

com a presena deste gnero dentro da rea amaznica, onde foram catalogadas as principais

espcies endmicas e tambm a sua rea de ocupao, expondo o risco das queimadas na

eliminao destas espcies e o consequente desconhecimento de muitas frente a esta

devastao e a grande rea abrangente ainda pouco explorada. Este estudo apontou a

necessidade de pesquisas voltadas para essa regio, a qual visada por muitos pesquisadores

internacionais, se tornando um alvo fcil de explorao e biopirataria (Vaz, 1993).

51

Atualmente, no catlogo do Instituto Nacional de Pesquisa da Amaznia INPA,

possvel consultar as espcies j coletadas e registradas por este rgo federal, sendo relatadas

21 espcies, apresentadas na tabela 1.

Tabela 3. Espcies de Bauhinia coletadas no Amazonas e catalogadas no INPA. (Acessado em 06/01/12,

http://brahms.inpa.gov.br/bol/INPA)

Espcie Local de coleta*

Bauhinia acreana Manacapuru

Bauhinia alata Itapiranga, Manaus, Presidente Figueiredo

Bauhinia altiscandens Manaus

Bauhinia cinnamomea Presidente Figueiredo, Itapiranga, Alvares

Bauhinia coronata Pau Drco

Bauhinia cupreonitens -

Bauhinia erythrantba Manaus

Bauhinia forficata Manaus, So Paulo de Olivena

Bauhinia glabra Coari, Humait

Bauhinia grandifolia Manaus

Bauhinia guianensis Barcelos, Fonte Boa, Novo Airo, Manaus

Bauhinia kunthiana Manaus

Bauhinia longicuspis Manaus, Manicor, Coari, Nova Olinda, Careiro-

Castanho

Bauhinia longipetala Barcelos, Careiro, Pauini, So Paulo de Olivena,

Careiro, Maus

Bauhinia monandra Manaus

Bauhinia platycalyx Coari, Manaus, Humait, Presidente Figueiredo

Bauhinia purpurea -

Bauhinia rutilans Manaus, Presidente Figueiredo, Humait

Bauhinia splendens Lbrea, Manaus, Barcelos, Itapiranga, Humait,

Novo Airo

Bauhinia ungulata Humait

* : espcies cuja cidade, ou comunidade, no foi mencionada, somente o estado.

52

Dentre estas, o hbito da populao em comumente fazer a utilizao das espcies B.

purpurea e B. coronata pde ser comprovado atravs dos relatos das prprias pessoas na

cidade de Manaus, sendo que no encontrado dentro da literatura o estudo fitoqumico para

estas espcies de Bauhinia da regio. Assim, a possibilidade da existncia de compostos

ativos vlida, j que a disseminao do uso ainda hoje repassada para outras pessoas uma

vez que foram obtidos bons resultados para fins teraputicos.

3.6 Anlises de atividades antioxidantes

O objetivo de quantificar a ao antioxidante de extratos e substncias so muito

comuns dentro da fitoqumica. Estas anlises esto relacionadas ao potencial de captura de

radicais livres expostos em um meio onde observado se o material apresenta ou no tal

inibio.

Radicais livres, ou espcies reativas de oxignio (EROs) e nitrognio (ERNs), so

gerados a partir de funes metablicas do organismo vivos (DOTAN et al, 2004). O

desequilbrio nesta taxa de formao com o aumento do nmero de espcies metabolizadas

implica em uma srie de malefcios, como estresse, cncer, artrite reumatide, doenas

hepticas, neurodegenerativas e pulmonares (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

O interesse por parte da comunidade cientfica na descoberta de espcies

antioxidantes, figura 9, provem do crescente nmero das doenas modernas desencadeadas

atravs da alta produo de radicais livres. A classe de substncias fenlicas vem ganhando

destaque dentro deste contexto por apresentar preveno de doenas relacionadas ao excesso

de radicais livres como o Mal de Alzheimer e retardo do envelhecimento, entre outros, devido

sua elevada capacidade antioxidante (CALABRESE et al, 2007; CHOE E MIN, 2006).

53

Quercetina cido ascrbico cido glico

Figura 9. Substncias com carter antioxidante usadas como padres para avaliao do potencial antioxidante.

Mtodos que se baseiam nas reaes de estabilizao de radicais livres, como 2,2-

difenil-1-picrilhidrazil (DPPH.) e 2,2-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS

.+),

so os mais viveis para uma avaliao inicial do comportamento inibitrio dos extratos, onde

a partir do clculo da CI50 (concentrao inibitria de 50%) obtida a concentrao da

amostra que captura 50% da quantidade total de radical existente no meio, demonstrando sua

capacidade antioxidante (SOUSA et al., 2007).

3.6.1 DPPH.

O teste baseado na reao do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH.), figura 10,

o qual possui colorao prpura, que ao receber um hidrognio de uma espcie doadora

(carter antioxidante), estabilizado e a molcula gerada, difenil-picril-hidrazil, possui

colorao amarelada, expressando visualmente o resultado da anlise antioxidante

(MOLYNEUX, 2004).

No mtodo quantitativo, a atividade antioxidante medida atravs da diferena na

absorbncia apresentada entre a absorbncia do prprio DPPH., o qual absorve em 517nm, e

as amostras aps reagir com o radical por 30 minutos. Esta taxa apresentada utilizada para o

clculo da ao antioxidante CI50, tendo como referncia um padro com alto carter de

inibio, como o flavonoide quercetina.

54

Figura 10. Reao e esquema representativo da reduo do DPPH. (MOLYNEUX, 2004; LEANDRO, 2010)

3.6.2 ABTS.+

Tendo o mesmo princpio do DPPH., o teste baseado na utilizao de um radical

livre, o 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS.+

), figura 11, o qual possui

colorao azul escuro, e que ao ser estabilizado por uma espcie doadora tem como

caracterstica a incolor (RE et al, 1999).

e

ABTS

ABTS.+

Figura 11. Formao do ction 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), ABTS.+ (VASCONCELOS et al,

2007).

3.6.3 Superxido

O radical superxido, O2.-, formado em vrios processos metablicos dos organismos

aerbicos e responsvel por ser fonte potencial de leses, j que pode agir diretamente sobre

mx. = 342 nm

mx. = 714 nm

55

alvos biolgicos ou indiretamente iniciando a produo de espcies altamente reativas de

oxignio, como por exemplo o radical hidroxila (VARGAS, 2008). Alm disso h relatos da

participao de superxidos em linhas de clulas relacionadas desordens neurolgicas, como

Mal de Alzheimer, Mal de Parkinson, cncer, entre outros (NOOR et al, 2002).

Figura 12. Estrutura do radical NBT+ (Nitro Blue Tetrazolium) (ALVES et al, 2010).

A atividade avaliada de acordo com a presena de antioxidante no meio, onde h

uma competio com o substrato NBT+ (colorao amarela), figura 12, pelo nion radical

superxido gerado. Assim, com a presena de substncias antioxidantes no extrato, a reduo

do NBT formazana (prpura) atravs do sequestro do radical diminuda, indicando o

potencial da amostra (ALVES et al, 2010).

3.7 Ensaios de inibio da atividade enzimtica

A avaliao inibitria dos extratos frente s enzimas possui como objetivo avaliar o

potencial dos mesmos para possveis aplicaes industriais, como a farmacutica, as quais

buscam novas fontes para o tratamento de doenas dermatolgicas, como no clareamento de

pele (SU, 1999) e digestivas, como a obesidade (PEREIRA et al, 2011).

3.7.1 Tirosinase

Essa enzima responsvel pela sntese da melanina, e no sistema nervoso participa da

sntese da dopamina, sendo implicada em doenas neurodegenerativas como a doena de

Parkson (SHIMIZU et al, 2003)

56

A hiperpigmentao da pele um fator bastante comum e que provem da disfuno de

sntese de melanina, sendo um perigoso problema esttico e necessitando de inibidores desta

enzima para o tratamento da doena (DE SOUZA, 2011).

A procura por compostos que inibam a enzima tirosinase visada para muitas

aplicaes tecnolgicas, principalmente na rea farmacutica, em prol da criao de produtos

cosmticos para o tratamento de clareamento e desordens dermatolgicas existentes

atualmente (KARIOTI et al, 2007).

3.7.2 -amilase

A inibio desta enzima visada pelas reas da medicina e farmacutica em prol da

diminuio do nvel de glicose no sangue, muito importante para o controle em pacientes com

diabetes do tipo 2, que necessitam monitorar tal taxa, uma vez que no possuem a capacidade

necessria para absoro do acar (ALI et al, 2006).

A busca de plantas que contenham inibidores desta enzima crescente, e dentro do

gnero Bauhinia j foram obtidos resultados positivos, como para as espcies

3.7.3 Lipase, lipoxigenase e -glicosidase

Dentro do estudo de produtos naturais uma das reas mais visadas a relacionada

farmacologia, com o intuito de promover novas possibilidades no tratamento de doenas

como obesidade e diabetes.

Inicialmente, testes inibitrios frente a enzimas direta ou indiretamente envolvidas no

processo de obteno destas doenas so avaliadas para determinar o potencial do material

estudado, como a inibio da lipase. Esta enzima responsvel pela degradao e absoro de

lipdeos no corpo humano, e novos frmacos que promovam a sua inibio so procurados,

principalmente para o tratamento da obesidade (PEREIRA et al, 2011).

57

Atividades inibitrias das enzimas lipoxigenase e -glicosidase esto envolvidas

diretamente com o processo de diabetes, pois as mesmas so responsveis pelo processamento

de carboidratos e amido atuando em suas quebras, assim como absoro do amido e

monossacardeos formados (GUYTON e HALL, 2002). Assim, com sua inibio h reduo

na taxa glicmica por no haver a absoro de glicose (PEREIRA et al, 2011).

58

4. EXPERIMENTAL

4.1 Coleta e preparo do material

As coletas do material botnico das quatro espcies do gnero Bauhinia foram

realizadas na Vila Olmpica e na Reserva Ducke, Bauhinia purpurea e Bauhinia coronata

respectivamente, em Manaus; na rea urbana de So Gabriel da Cachoeira, Bauhinia

purpurea; e nas comunidades interioranas de Bom Senhor Jesus e Nossa Senhora de Nazar,

no municpio de Manacapuru, Bauhinia acreana. A identificao das espcies foi realizada no

Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia INPA e no Herbrio da Universidade Federal

do Amazonas UFAM.

As partes da planta foram separadas em folhas e galhos/cip, limpas para retirada de

possveis fungos ou microorganismos e secas temperatura ambiente por sete dias, sendo em

seguida trituradas.

O procedimento geral exposto na figura 13 abaixo.

Figura 13. Esquema geral da metodologia empregada.

59

4.2 Obteno dos extratos

O mesmo padro para extrao foi adotado para as diferentes partes das espcies.

Aps o perodo de sete dias da adio de metanol destilado (MeOH) ao material macerado,

realizou-se a filtrao do material atravs de um papel filtro em funil, onde o material lquido

obtido foi extrado sob presso reduzida de em um banho com temperatura em torno de 40oC,

utilizando aparelho rotaevaporador.

Individualmente, o material concentrado em cada extrao foi armazenado,

identificado e pesado em balana analtica digital para calcular o rendimento para

posteriormente ser utilizado nos testes e prospeco. O solvente obtido aps a extrao

retornou ao recipiente com material vegetal, o qual permaneceu protegido da exposio luz

e aps 72h foi realizado o mesmo procedimento, pelo perodo de 45 dias.

4.3 Anlise da atividade antioxidante

Neste projeto os extratos brutos metanlicos de galhos e folhas de Bauhinia sp foram

submetidos a trs anlises para avaliao das atividades antioxidantes frente a trs radicais

livres: DPPH., ABTS

+. e O2

-. Tais anlises foram realizadas no Laboratrio de Estresse

Oxidativo e Aterognese da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade Federal do

Amazonas, sob superviso do Prof. Dr. Emerson Silva Lima.

4.3.1 Inibio do radical livre DPPH

A verificao da atividade inibidora foi determinada para todos os extratos a partir dos

testes qualitativos inicialmente (MONTENEGRO, 2006; SOLER-RIVAS, 2000) e de acordo

com os resultados positivos, realizada a tcnica quantitativa (MOLYNEUX, 2004).

60

4.3.1.1 Anlise qualitativa da atividade antioxidante

O teste consiste em aplicar 15L do extrato metanlico de Bauhinia sp com

concentrao de 10 mg/mL em uma placa de slica com dimenses de 2cm x 2cm para cada

rea destinada s amostras (figura 14). Alm do extrato tambm so aplicados o padro

quercetina e o branco (MeOH), para verificao da interferncia do mesmo no procedimento.

Figura 14. Placa para ensaio qualitativo da atividade antioxidante de DPPH..

Aps aplicar todas as amostras teste borrifada a soluo de DPPH 3mM em MeOH,

onde a placa fica com a colorao roxa caracterstica da soluo de DPPH. Foi observada a

atividade positiva ou negativa para as amostras evidenciadas pela presena de manchas

amarelas ou brancas decorrentes da reduo do DPPH, contra a colorao prpura de fundo,

indicando atividade positiva. A ausncia de manchas denota um resultado negativo.

4.3.1.2 Anlise quantitativa da atividade antioxidante

A atividade antioxidante de captura do radical DPPH. foi realizada conforme a

metodologia descrita por Molyneux (2004), com modificaes. Primeiramente foi realizado o

monitoramento da soluo de DPPH, 0,3 mM/mL, no aparelho leitor de microplaca modelo

DTX 800, Beckman, em comprimento de 492 nm at obter a absorbncia 1,00(0,1). Na

microplaca de 96 poos foram aplicados em triplicata, 270 L da soluo hidroalcolica de

DPPH e 30 L da amostra nas concentraes iniciais de 50, 100, 250, 500 e 1000 g/mL

(sendo estas minimizadas quando apresentavam alta atividade), sendo realizado o mesmo

procedimento tambm para o controle negativo, dimetilsufxido (DMSO).

61

Aps ser incubado por 30 minutos temperatura ambiente e na ausncia de luz, foi

realizada a leitura em 492 nm.

A substncia quercetina foi utilizada como padro referncia e o clculo do CI50 foi

obtido atravs da seguinte frmula utilizando-se o programa Microsoft Excel 2010 e

OriginPro8:

(

)

Onde abs amostra a absorbncia da amotra e abs controle a absorbncia do

controle.

4.3.2 Inibio do radical livre ABTS.+

A anlise foi realizada segundo Re et al.,(1999), com algumas modificaes. A

soluo catinica de ABTS (7 mM, 50% de soluo de ABTS, 50% soluo de persulfato de

potssio 5 mM) foi preparada e mantida em temperatura ambiente e com ausncia de luz.

Aps 12 horas, obtido o radical ABTS+

(colorao azul escura).

Aps a formao do radical foi realizado primeiramente o monitoramento da soluo,

sendo adicionados na microplaca: 270 L da soluo hidroalcolica de ABTS (diluio 1:7 da

soluo original) e 30L de etanol (EtOH). A leitura foi efetuada em comprimento de onda de

417 nm atravs do leitor de microplaca modelo DTX 800, Beckman. Ao obter absorbncia

aproximadamente 1,00 (0,1) foi realizado o ensaio em triplicata atravs da adio de 270 L

da soluo hidroalcolica de ABTS com 30 L da amostra em diferentes concentraes,

concentraes iniciais de 50, 100, 250, 500 e 1000 g/mL. Para o controle negativo foi

utilizado DMSO em concentrao nica e seguindo todo o procedimento restante. Aps

incubar por 15 minutos em temperatura ambiente e na ausncia de luz realizou-se a leitura no

leitor de microplaca em 417 nm.

62

A substncia trolox foi utilizada como padro referncia e o clculo do CI50 foi obtido

atravs da seguinte frmula utilizando-se o programa Microsoft Excel 2010 e OriginPro8:

(

)

4.3.3 Inibio do radical livre O2-

O procedimento foi descrito por Ewing e Janero (1995), baseada na reao entre

NADH (nicotinamida adenina dinucleotdeo), PMS (fenazina metassulfato) e NBT (azul de

nitrotetrazlio), onde formado o nion radical superxido. Assim, dois radicais superxido

doam, cada um, um eltron para o NBT, reduzindo e formando a formazana, a qual

monitorada em um comprimento de onda de 560 nm, em espectrofotmetro UV-Vis.

O ensaio foi realizado conforme ztrk (2007), com modificaes. So preparados

inicialmente os reagentes NBT (250 M), NADH (390 M) e PMS (10 M) em tampo Tris-

HCl (16 mM, pH=8,0). Em uma placa de 96 poos so adicionados 50 L de soluo dos

extratos metanlicos de Bauhinia sp nas concentraes de 10 a 1000 g/mL, 100 L de

NADH e 100 L de NBT. A absorbncia inicial obtida a partir da leitura da microplaca a