Determinação de

sensibilidade bacteriana

aos antimicrobianosProf. Adj. Ary Fernandes Junior

Departamento de Microbiologia e Imunologia

Instituto de Biociências – UNESP

Tel. 14 3880.0412/0413

ary@ibb.unesp.br

O diagnóstico laboratorial das doenças

infecciosas começa com a indicação clínica

adequada do exame microbiológico, o que

requer conhecimento da epidemiologia e da

fisiopatologia do processo infeccioso.

Diagnóstico microbiológico

requer o conhecimento e a colaboração

de vários profissionais

A coleta e o transporte da amostra são

etapas críticas na execução do exame

microbiológico.

A suspeita clínica do processo

infeccioso determinará o tipo de amostra

clínica que deve ser enviada ao

laboratório para confirmar, estabelecer ou

complementar o diagnóstico clínico

Representação esquemática do fluxograma da

amostra clínica enviada para o exame microbiológico

Identificação laboratorial de patógenos clínicos

(Fase analítica)

Antibiograma

Auxiliar o clínico com a escolha do

antimicrobiano a prescrever para o

paciente

pois verifica se a bactéria pesquisada é

sensível ou resistente aos antimicrobianos

testados.

Antibiograma (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI),

Princípio da Diluição Princípio da Difusão

1.Métodos baseados na diluição da

droga

Diluição em caldo Concentração

Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Bactericida Mínima (CBM)

Diluição em meio de cultura sólido

diluição em agar CIM

Macrodiluição em tubos (1 a 2 ml de meio)

Primeira a ser utilizada na avaliação da sensibilidade aos

agentes antimicrobianos e envolve a preparação de

diluições seriadas e logarítmicas de antimicrobianos (por

exemplo, 1, 2, 4 e 8 μg/mL) em um meio de cultura líquido,

o qual permitirá o crescimento bacteriano.

Determinação da CIM pelo método da diluição em

caldo. A CIM no exemplo abaixo é de 16µg/ml.

Microdiluição em Placas de Elisa (100 a 200µ l)

Apresentação de uma

placa utilizada no

teste de microdiluição,

após sua inoculação e

incubação.

1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 µg/mL

Controles

positivos

2.Métodos baseados na difusão da

droga

Princípio do método de Kirby - Bauer

Parâmetros a serem padronizados: meio

de cultura, discos, inoculação do germe

no meio, incubação das placas, leitura e

interpretação

a.Controle de qualidade

Meio de Cultura (Mueller-Hinton Meio Padrão)

Permite crescimento satisfatório da maioria dos

germes não fastidiosos;

Não interfere com a atividade da droga

(Ex.: peptonas – sulfas; Mg++ - gentamicina; Ca++,

Fe++, Mg++ - tetraciclinas)

São utilizadas placas de Petri (vidro ou plástico)

com camada do meio de 6 mm de espessura

Método de Kirby-Bauer

Inóculo (Padronizado)

Preparo: Transferir para um tubo com BHI

(Brain Heart Infusion) 5 colônias da bactéria

em estudo; incubar a 37oC; obter densidade

equivalente ao padrão de Mc Farland 0,5

(1,5 x 108 UFC/mL)

Obs. O padrão 0,5 de Mc Farland é o

correspondente a turvação mostrada em

solução contendo 0,5 mL de BaCl2 a 1% em

99,5 mL de solução de ácido sulfúrico a 1%)

0,5 1,0 2,0 3,0

Tubos da escala de McFarland

posicionados em frente do cartão de

Wickerham.Comparação da escala 0,5 de McFarland com

suspensão bacteriana

(E. coli ATCC 25922)

Semeadura: Swab estéril; retirar excesso

de caldo e semear na superfície do meio

uniformemente; secar em temperatura

ambiente por 3 a 5 minutos.

Importante: número de colônias

utilizadas (várias); material contaminado

com flora normal (não usar colônias

provenientes de meios de

enriquecimento); variações na densidade

do inóculo possibilitam variações também

no tamanho do halo de inibição

Discos

Aplicação: pressionar levemente contra a

superfície do meio e pelo menos 2 cm da

borda da placa e a pelo menos 3 cm um

do outro (evitar halos de inibição em

fusão); usar apenas um disco de cada

grupo de drogas (concentração única)

Características: papel de filtro adequado;

concentração de droga suficiente; prazo

de validade; controle de eficiência

Incubação das Placas

Em temperatura (37oC) e atmosfera

adequada para o crescimento da

bactéria (aerobiose, anaerobiose, 10%

de CO2)

Atmosfera influi na atividade das drogas:

tetraciclina, meticilina e novobiocina –

CO2; estreptomicina e canamicina -

anaerobiose

Leitura das Placas

Após 18-24 horas de incubação; usar

compasso ou régua para determinar o

diâmetro do halo de inibição; colônias

dentro do halo sugerem mutantes

resistentes ou contaminantes.

Halo de

leitura em

mm

Interpretação

resistente, moderadamente resistente ou

sensível, de acordo com o halo de

inibição;

há correlação inversa entre concentração

inibitória mínima e diâmetro do halo de

inibição.

Kirby e Bauer – Método dos discos

Halo de inibição (mm)

Resistente Intermediário Sensível

CIM

(µ

g/m

L)

Etest® ( teste da elipse = Episilometer test)

Apresentação do Etest® para avaliação da CIM após

incubação

Área de

Crescimento

bacteriano

Fita graduada

de material

impermeável

“Elipse de

inibição”

Concentração

Inibitória Mínima

(CIM)

--lactamaseslactamases do Grupo 1 (do Grupo 1 (AmpCAmpC))