La gestione di un focolaio di tubercolosi bovinain un allevamento promiscuo di capre e bovini

A. DI BLASIO1, L. IRICO1, S. ZOPPI1, D. DE SOMMA1, G. BARBERIS2, K. VARELLO1,M. MONNIER1, E. BOZZETTA1, P. VIGNETTA3, L. CHIAVACCI1, M. GORIA1, A. DONDO1

1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna 148, Torino2 Veterinario Libero Professionista - Torino3 Regione Piemonte - Direzione Sanità - Settore Prevenzione e Veterinaria

CASE REPORT

La tubercolosi bovina (bTB) è una malattia infettiva cronicae progressiva, sostenuta da Mycobacterium bovis (Mb). Al-l’interno del Mycobacterium tuberculosis complex, Mb è quel-lo dotato del più ampio spettro d’ospite, con il bovino comereservoir primario. A causa del potenziale zoonosico e dellegravi perdite economiche che conseguono ad un’infezione dibTB in allevamento, la malattia è soggetta in Europa a pro-grammi di eradicazione basati sul metodo test and slaughter1.In Italia molte regioni, tra cui il Piemonte2, hanno acquisitolo status di Officially bovine Tuberculosis Free (OTF), rag-giungendo e mantenendo i livelli di prevalenza richiesti dal-la normativa europea. Tra le cause che possono contribuirealla persistenza di bTB sul territorio è riconosciuta l’infezio-ne di specie sensibili allevate in promiscuità con bovini, qua-li ad esempio le capre, il cui ruolo nella trasmissione e man-tenimento dell’infezione in allevamento è documentato siain Italia che all’estero3,4,5,6. L’infezione nella specie caprinaevolve di solito in forme subcliniche o paucisintomatiche as-sociate tuttavia a quadri anatomopatologici gravi che favori-scono la disseminazione del patogeno nell’ambiente ester-no4,5,6. La peculiare patogenesi che le caratterizza rende le ca-

pre infette fonti di Mb per l’uomo e per le eventuali specieanimali conviventi con ripercussione negativa sul risultatodei programmi di eradicazione in atto. Tuttavia, la carenza didati ufficiali sul ruolo della capra nell’epidemiologia dellabTB è legata ad una legislazione che richiede un controllo deicaprini solo in condizioni particolari: la produzione di lattecrudo da animali conviventi con bovini (Reg. CE n. 853/2004del Parlamento Europeo) o il sospetto d’infezione (D.M. n.592 del 15/12/1995).Il presente lavoro descrive la gestione di un focolaio di bTBin un allevamento misto (bovini e caprini) piemontese po-nendo particolare attenzione all’indagine epidemiologicacondotta e all’iter diagnostico seguito per l’identificazione edeliminazione di tutte le fonti d’infezione presenti e capaci dicompromettere la risoluzione del focolaio.Nel giugno 2014, venivano segnalate lesioni riferibili a bTBin stadio avanzato in una bovina macellata di razza Frisonaproveniente da un’azienda genovese. Dato il riscontro discambi commerciali, l’indagine epidemiologica veniva estesaall’azienda piemontese di origine del capo. L’allevamento dacui proveniva il capo infetto era situato in provincia di Ales-sandria e certificato come Azienda Ufficialmente Indenne(AUI). L’azienda era stata controllata con test di intradermo-reazione con tubercolina (SIT), con esito sempre negativo,annualmente fino al 2008 e, successivamente, ogni due anni,secondo il Piano di eradicazione regionale. Nel registro distalla erano presenti 41 capi, in prevalenza di razza Piemon-

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N

Autore per la corrispondenza:Alessia Di Blasio (dib.alessia@gmail.com).

RIASSUNTOLa tubercolosi bovina (bTB) è una malattia infettiva cronica e progressiva, sostenuta da Mycobacterium bovis (Mb) ed è sog-getta in Europa a programmi di eradicazione. Tra le cause che possono contribuire alla persistenza di bTB sul territorio si ri-conosce l’infezione di specie sensibili allevate in promiscuità con bovini, quali ad esempio le capre, il cui ruolo nella trasmis-sione e mantenimento dell’infezione in allevamento è documentato sia in Italia che all’estero. La profilassi per la bTB nei ca-prini non è prevista dalle normative vigenti, se non in casi particolari e ciò spiega la carenza di dati ufficiali sul ruolo della ca-pra nei focolai di bTB. In questo report si descrive l’iter diagnostico adottato nella gestione di un focolaio di bTB in un alleva-mento piemontese, in cui l’estensione delle prove intra vitam alle capre allevate in promiscuità con i bovini ha permesso l’e-stinzione del focolaio. I risultati degli esami diagnostici hanno confermato l’ipotesi già avanzata con l’indagine epidemiologi-ca, riconoscendo come origine dell’infezione la movimentazione dei capi per attività commerciali con un coinvolgimento ac-cidentale dei caprini.L’indagine epidemiologica, puntuale ed approfondita, associata alla scelta di un adeguato iter diagnostico, hanno permesso diindividuare precocemente il caprino infetto e di estinguere il focolaio con l’abbattimento di entrambi i comparti, escludendoquindi una possibile fonte di reinfezione per gli animali di nuova introduzione, oltre che un rischio zoonosico per il persona-le di stalla.

PAROLE CHIAVETubercolosi bovina, capra, trasmissione interspecifica.

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tese con un’età media, escludendo i vitelli nati nell’anno, dicirca sei anni. L’azienda non praticava l’alpeggio, né il pasco-lo o la transumanza. Gli animali erano stabulati in un unicocapannone in box separati da un corridoio centrale. Adia-cente alla stalla bovina vi erano altri due box con otto capredi razza meticcia di circa cinque anni. Considerata la corre-lazione epidemiologica con l’allevamento ligure oggetto disegnalazione, veniva eseguito, presso l’azienda piemontese,un controllo straordinario con SIT da parte del Servizio Ve-terinario, con il riscontro di 7 capi positivi e 1 capo dubbio.Contestualmente, come indicato dal Reg. CE 1226/02 e dalDPGR n. 20 del 5/03/2001, al fine di incrementare la sensibi-lità diagnostica veniva eseguito un prelievo ematico su tutti icapi bovini di età superiore ai sei mesi (n=28) per l’esecu-zione del gamma interferon test (γIFN). Il γIFN (Bovigam®)adattato presso l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale (IZ-STO) di Torino7 rilevava 13 capi positivi. Dato lo stadioavanzato dell’infezione del bovino oggetto di segnalazione siprocedeva ad eseguire sui medesimi campioni di sangue untest ELISA indiretto (IDEXX M. bovis Ab Test) per la rileva-zione della risposta umorale, al fine di individuare possibilianimali in stato anergico, tipico degli stadi avanzati di bTB, eridurre così i falsi negativi8. Risultavano positivi 9 capi di cuisolo 1 negativo al γIFN.Secondo le normative nazionali e regionali vigenti, tutti glianimali SIT e/o γIFN positivi (n=13) venivano macellati, ri-scontrando lesioni ascrivibili a bTB su dieci capi: complessiprimari incompleti (CPI) caratterizzati da lesioni caseo-scle-ro-calcifiche dei linfonodi mediastinici (n=8) e generalizza-zione precoce acuta e protratta (n=2). In base agli esiti delleprove intra-vitam e ai riscontri anatomo-patologici indicati-vi di bTB la stalla veniva dichiarata infetta e la qualifica diAUI revocata.Data la presenza in allevamento di animali di altre speciesensibili alla bTB, il γIFN e l’ELISA venivano estesi anche aicaprini conviventi (n=8). L’unico capo risultato positivo alγIFN veniva macellato con il riscontro di un quadro anato-mo-patologico grave ascrivibile ad una tubercolosi post-pri-maria e caratterizzato da lesioni caseo-sclero-calcifiche a ca-rico dei linfonodi mediastinici, meseraici, epatici e prescapo-lari e da una polmonite caseosa diffusa e pleurite adesiva (Fi-gura 1). L’esame istologico confermava l’ipotesi diagnosticadi bTB evidenziando lesioni granulomatose caratterizzate davaste aree di necrosi e di calcificazione circondate da reazio-ne istio-linfocitaria con numerose cellule giganti multinu-cleate di Langhans e presenza di bacilli alcool-acido resisten-ti (Figura 2).Sugli organi prelevati in fase di macellazione, sottoposti adesame colturale per la ricerca di Micobatteri secondo meto-do normato9, Mb veniva isolato rispettivamente in 12 bovi-ni dopo circa 20 giorni (Tabella 1) e dalla capra dopo 12giorni. I ceppi identificati con Multiplex PCR, variazione“in house” dei metodi descritti da Kulski10 e da Sinclair11,sono stati caratterizzati mediante le tecniche di spoligoty-ping e VNTR typing12 evidenziando un unico profilo:SB0134 VNTR 54534. La Tabella 1 riassume i riscontri ana-tomo-patologici e gli esiti diagnostici dei 13 bovini positivialle prove intra-vitam.Infine, i ceppi di Mb sono stati sottoposti ad antibiogrammautilizzando molecole di prima e seconda linea impiegate perla cura della Tubercolosi umana. Il Sistema Liquido Versa-TREK/ESP Culture System II (©TREK Diagnostic Systems) è

stato impiegato come metodo qualitativo poiché capace didistinguere i ceppi sensibili da quelli resistenti a concentra-zioni standard di streptomicina (S), isoniazide (I), rifampici-na (R), etambutolo (E) e pirazinamide (PZ), mentre per ladeterminazione della minima concentrazione inibente sonostate utilizzate le piastre Trek Sensititre SLOWMYCO®. Tuttii ceppi risultavano sensibili agli antibiotici testati (Tabella 2)eccetto che per PZ, per la quale Mb dimostra una naturale re-sistenza. Tali risultati, oltre a confermare l’omologia tra ilceppo caprino e quelli bovini, permettevano l’esclusione difenomeni di resistenza spesso causati da trattamenti antibio-tici legali (S) e illegali (I).Data l’elevata prevalenza d’infezione, la gravità delle lesioniosservate e la presenza di trasmissione interspecifica dell’infe-zione, veniva emesso, nel settembre 2014, congiuntamente dalSettore Veterinario e dall’Osservatorio Epidemiologico Re-gionale, il parere favorevole all’abbattimento totale dei re-stanti bovini e caprini. Durante le ultime fasi di macellazionedegli animali negativi al γIFN test e alla SIT sono stati identi-ficati altri due bovini infetti da bTB, di cui uno positivo al te-st ELISA eseguito durante le prime indagini diagnostiche. Ta-li riscontri confermano come l’abbattimento totale sia statoun provvedimento decisivo per la risoluzione definitiva del

Figura 1 - Polmonite caseosa diffusa riscontrata in fase di macel-lazione dell’unico caprino risultato positivo al γIFN test.

Figura 2 - Polmone: lesione caratterizzata da centro necrotico-calcifico (stella nera) circondato da reazione linfoistiocitaria e gigan-tocellulare (freccia blu). Ematossilina-Eosina.

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focolaio. Infatti, la presenza in allevamento di soggetti anergi-ci e quindi negativi ai comuni test intra-vitam (γIFN test eSIT) che sfruttano l’immunità cellulo-mediata avrebbero po-tuto rappresentare una fonte occulta di infezione.L’iter diagnostico seguito ha confermato l’ipotesi di un coin-volgimento accidentale della capra, già formulato sulla basedell’indagine epidemiologica. In particolare, la presenza diun unico ceppo di Mb, l’esito negativo dei test intra-vitamottenuto nei caprini conviventi con la capra infetta e la rile-vazione di una risposta immunitaria umorale in nove bovini(indicativa di una fase avanzata dell’infezione) indicano chel’infezione dei bovini è da considerarsi antecedente a quelladella capra. L’introduzione di bTB mediante il commercio èun importante fattore di rischio per la diffusione della bTB14

e rappresenta la fonte d’infezione più probabile nel focolaiodescritto. L’indagine epidemiologica riferiva infatti frequentiscambi intra o extra-regionali di entità rilevante in rapportoalla consistenza dell’allevamento e il ceppo tipizzato risulta-va essere stato isolato frequentemente tra il 2003 e il 2014nell’Italia nord-occidentale.Una mancata identificazione del caprinoinfetto avrebbe potuto rappresentareun’importante fonte d’infezione in alle-vamento, soprattutto considerando lafrequenza con cui sviluppano formeaperte polmonari5 che associate ad unavita produttiva medio-lunga facilitano ladisseminazione di Mb nell’ambienteesterno.È pertanto comprensibile come il con-trollo di tutti gli animali sensibili presen-ti in un focolaio sia stato determinantenon solo per l’identificazione precocedegli capi infetti e l’estinzione del foco-laio, ma anche per scongiurare la tra-smissione dell’infezione all’allevamento

bovino di nuova costituzione dopo l’abbattimento totale.Un’indagine epidemiologica puntuale ed approfondita asso-ciata alla scelta di un iter diagnostico che contempli l’uso ditest ancillari come γIFN test ed ELISA, rappresentano il car-dine per tutte le azioni mirate all’eradicazione della bTB, so-prattutto in un contesto territoriale qualificato UI.

❚ Management of an outbreak ofbovine tuberculosis in a mixed goatand cattle herd

SUMMARYBovine tuberculosis (bTB) is a chronic contagious diseasecaused by Mycobacterium bovis (Mb), which have wide hostrange in mammalian species, man included. In Italy, bTB issubjected to eradication programs in cattle, that could leadmany regions to acquire Officially bovine Tuberculosis Freestatus (OTF), as recently occurred to Piedmont too [Execu-

*Valori di concentrazione critica raccomandati per i test di sensibilità13: Etambutolo: 5 µg/ml; Iso-niazide: 0.2-1 µg/ml; Rifampicina: 1 µg/ml; Streptomicina: 2-10 µg/ml.

Etambutolo sensibile sensibile 1 1- 4

Isoniazide sensibile sensibile < 0.25 < 0.25-1

Rifampicina sensibile sensibile 1 2

Streptomicina sensibile sensibile 2 2

γ IFN = gamma interferon test, SIT = test di intradermoreazione con tubercolina, ELISA = test ELISA indiretta, CPI = Complesso Primario Incompleto,ALV = Assenza di Lesioni Visibili, N.e. = Non eseguito

1 5 Positivo Positivo Positivo Positivo Generalizzazione

2 8 Positivo Positivo Positivo Positivo CPI

3 7 Positivo Negativo Negativo Negativo ALV

4 6 Positivo Negativo Positivo Positivo CPI

5 6 Positivo Positivo Negativo Positivo NVL

6 5 Positivo Positivo Negativo Positivo NVL

7 3 Positivo Positivo Positivo Positivo CPI

8 3 Positivo Negativo Negativo Positivo CPI

9 2 Positivo Positivo Positivo Positivo CPI

10 4 Positivo Negativo Positivo Positivo CPI

11 6 Positivo Dubbio Positivo Positivo CPI

12 9 Positivo Positivo Positivo Positivo Generalizzazione

13 7 Positivo Negativo Negativo Positivo CPI

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Tabella 1 - Riepilogo dei quadri anatomo-patologici evidenziati in fase di macellazione e degli esami diagnostici eseguiti sui 13 bovini ma-cellati in quanto positivi al γIFN e/o SIT.

Numero EsitoQuadro

progressivo Età (anni) Esito γIFN Esito SIT Esito ELISA esameanatomo-patologico

capo batteriologico

Tabella 2 - Risultati dei test di suscettibilità agli antibiotici di prima e seconda linea im-piegati in medicina umana per la cura della Tubercolosi eseguiti con Sistema Liquido Ver-saTREK/ESP Culture System II (©TREK Diagnostic Systems) e piastre Trek SensititreSLOWMYCO®. Per i bovini è stato riportato il range dei valori di MIC.

Sistema Liquido MIC*(metodo qualitativo) (metodo quantitativo)

Principio attivoCeppo Ceppi Ceppo Ceppicaprino Bovini (n=12) caprino Bovini (n=12)

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tion of Decision (EU) 2016/168 of the Commission of 5 Fe-bruary 2016]. Among the causes that may contribute to thepersistence of bTB in cattle it is recognized the infection ofother susceptible species such as goats, whose role in tran-smission and maintenance of infection in mixed herd is re-ported in many European Countries, including Italy. bTB in goats often occurs in subclinical forms, but it is asso-ciated to severe gross pathological lesions with a relative hi-gh risk of Mb environmental spread and negative impact onthe eradication programs.Surveillance in goats is not mandatory, except for raw milkproducers (Reg. CE n. 853/2004 del Parlamento Europeo) oroutbreak occurrence suspect (D.M. n. 592 del 15/12/1995)and this leads to a lack of data on the role of goat in the epi-demiology of bTB.This case report describes the diagnostic procedure adoptedfor the management of an outbreak of bTB in a Piedmontherd, in which both cattle and goats were reared. The dia-gnostic protocol included intra-vitam tests as gamma inter-feron tests (Bovigam®), Tuberculin Skin Test and indirectElisa (IDEXX M. bovis Ab Test) and post-mortem exams asgross pathology, histopathology, microbiology and molecu-lar tests (Spoligotyping and VNTR typing of isolatedstrains). On the basis of the intra-vitam test 13 cattle was de-clared infected and slaughtered highlighting typical lesionsin 10 animals.Gamma interferon testing was extended to goats allowing toidentify a positive animal that showed advanced lesions laterat slaughter. Spoligotyping and VNTR typing identified thesame strain type isolated from cattle (SB0134 VNTR 54534),confirming interspecific transmission.Due to high prevalence of infection, severity of observed le-sions and inter-species bTB transmission, stamping out pro-cedure was proposed and approved from Veterinary Servicesto extinguish the outbreak. Based on epidemiological analy-sis in this bTB outbreak, infection in small ruminants wasfortuitous, even if the goat could have been represented a po-tential source of infection. The decision to extend intra-vi-tam tests to goats resulted conclusive for the extinction of thebTB outbreak.Therefore an epidemiological investigation conjugated to anappropriate diagnostic management represent the best

ground for all actions targeted to the eradication of bTB out-breaks, especially in an area qualified as OTF.

KEY WORDSBovine tuberculosis, goat, interspecific transmission.

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